TW202204895A - 預測多肽免疫性的基於細胞之方法 - Google Patents

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Abstract

本文所揭露之標的提供確定多肽或其片段 (例如抗體或其片段) 誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向之方法及進行此等方法之套組。

Description

預測多肽免疫性的基於細胞之方法
本揭露內容涉及確定多肽誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向之方法及進行此等方法之套組。
基於多肽的治療劑 (例如抗體) 極大地改善了對越來越多的嚴重且難治疾病之治療。遺憾的是，此等治療劑當投予患者時可能會誘發抗藥物抗體 (ADA) 的產生。ADA 可對治療劑產生中和效果。這些中和效果可包括限制治療劑的活性、增加治療劑的廓清率、以及潛在降低歸因於治療劑投予的總體臨床反應。在某些情況下，ADA 的產生也與患者發生嚴重不良事件的同時發生，包括過敏反應和嚴重反應。
在藥物開發的臨床前階段了解基於多肽的治療劑的免疫性，可改善治療劑在後續臨床階段成功的可能性。雖然免疫性抗原決定基通常使用電腦模擬 工具來預測，但已開發了數種基於細胞的技術，以確定臨床前治療候選藥物的免疫性潛力。一種此類技術稱之為第 II 類主要組織相容性複體 (MHC) 相關胜肽蛋白體學 (MAPP)。MAPP 涉及將例如 樹突細胞之抗原呈現細胞 (APC) 群與基於多肽的所關注治療劑一起培育。APC 會將治療劑內化並加工成短胜肽。胜肽被加載到第 II 類 MHC 分子上並呈現在 APC 的表面上。經由液相層析質譜術 (LC/MS) 對這些 MHC-胜肽複合物進行免疫沉澱和分析，可鑑別基於多肽的治療劑中潛在的免疫性抗原決定基。另一種確定臨床前治療候選藥物的免疫性潛力的技術是 T 細胞增殖檢定。T 細胞增殖檢定涉及在與 APC（例如 樹突細胞）共培養後偵測 T 細胞增殖，這些 APC 已與所關注之基於多肽的治療劑一起培育。然而，這些技術是人力密集、耗時、並且需要許多高成本設備。因此，本技術領域中需要確定基於多肽的治療劑誘發產生 ADA 的傾向的更省時且更具成本效益之方法。
本揭露提供確定多肽或其片段相對於已知參考物誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向之方法。在某些實施例中，本文所揭露之方法可包括 (a) 使抗原呈現細胞 (APC) 與該多肽或其片段接觸；(b) 測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量；(c) 測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量；(d) 藉由從 (c) 中所測量的與 APC 締合的多肽或其片段之總量減去 (b) 中所測量的與該 APC 之外表面上結合的多肽或其片段的量來計算內化指數值；以及將 (d) 中的該內化指數與參考內化指數比較，該參考內化指數指示已知的誘發產生 ADA 的傾向。在某些實施例中，與該 APC 締合的多肽或其片段之總量，包括存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量和存在於該 APC 內的多肽或其片段的量。在某些實施例中，當 (d) 中的內化指數值大於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更大的引起 ADA 的傾向。在某些實施例中，當 (d) 中的內化指數值小於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更小的誘發 ADA 的傾向。
在某些實施例中，該多肽或其片段是胜肽。在某些實施例中，該多肽或其片段是重組蛋白。在某些實施例中，該多肽或其片段 是抗體或其片段，例如 ，人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施例中，該多肽或其片段，例如 ，抗體或其片段，是單域抗體。在某些實施例中，該多肽或其片段，例如，抗體或其片段，是抗體-藥物結合物 (ADC)。
在某些實施例中，該 APC 是選自由樹突細胞、巨噬細胞、單核球和 B 細胞所組成之群組。在某些實施例中，該 APC 是樹突細胞。例如但不限於，該樹突細胞是未成熟樹突細胞。在某些實施例中，該未成熟樹突細胞是藉由分化從例如 人供體之供體所分離之單核球而產生的。在某些實施例中，該經分離之單核球是在介白素-4 (IL-4) 和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF) 中的一或多者存在下分化以產生未成熟樹突細胞。
在某些實施例中，該 APC 是在劑的存在下與該多肽或其片段接觸。例如，但不作為限制，該劑是選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。發炎細胞激素的非限制性實例包括 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。在某些實施例中，該劑是 LPS。
在某些實施例中，測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量可包括 (i) 透化該 APC，(ii) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合，和 (iii) 確定與存在於該 APC 之外表面上和該 APC 內的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量。在某些實施例中，測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量可包括 (i) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合和 (ii) 確定與存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段之量，其中在使該 APC 與該偵測劑接觸之前，該 APC 是未經透化的。在某些實施例中，該偵測劑是抗體，例如 ，結合至螢光團之抗體。在某些實施例中，該抗體是抗 IgG 抗體。 在某些實施例中，確定與該多肽或其片段結合的偵測劑之量是藉由流式細胞分析技術來進行。
本揭露進一步提供用於進行本文所揭露之任何一種方法之套組。在某些實施例中，該套組包括以下之一或多者：APC；劑；偵測劑；和透化劑。在某些實施例中，該劑是選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。在某些實施例中，該發炎細胞激素是選自由 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。在某些實施例中，該劑是 LPS。在某些實施例中，該偵測劑是抗體，例如 ，結合至螢光團之抗體。在某些實施例中，該偵測劑是抗 IgG 抗體。在某些實施例中，該透化劑是皂素。
相關申請的交叉引用
本申請案主張 2020 年 7 月 13 日所申請之美國臨時申請案第 63/051,157 號及 2020 年 8 月 28 日所申請之美國臨時申請案第 63/071,535 號之優先權，彼等之各者內容是以引用方式全部併入本文中，並主張彼等之各者優先權。
為求清楚，但不作為限制，將本揭露之標的的詳細描述分為以下小節： I.   定義； II.  方法； III. 多肽； IV. 套組；和 V.  例示性實施例。I. 界定
除非另有定義，否則本文所用之全部技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之含義相同的含義。下列參考文獻提供技術人員本發明中所使用的許多術語的一般定義：Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger 等人 (eds.), Springer Verlag (1991)；及 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文所使用，除非另有說明，否則以下術語具有賦予其等下文之含義。
如本文所用，當「一」或「一種」一詞的使用與請求項及/或說明書中的術語「包含」結合使用時，其可意指「一個」，但亦與「一個或多個」、「至少一個」和「一個或大於一個」的含義一致。更進一步，術語「具有」、「包括」、「含有」及「包含」是可互換的，且本技術領域中具有通常知識者認識到這些術語是開放式術語。
如本文所使用，術語「約」或「大約」可意指特定值處於本技術領域中具有通常知識者所確定之可接受的誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或確定該值，例如 ，取決於測量系統的局限性。例如，按照給定值的相關實務，「約」可意指 1 倍或 1 倍以上的標準偏差。在申請案和申請專利範圍中描述特定值的情況下，除非另有說明，否則術語「約」可表示特定值的可接受誤差範圍，例如由術語「約」修飾的值的 ±10%。
本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋多種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體 (例如 ，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合抗原之完整抗體的一部分。抗體片段的實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab’)2 ；雙體；線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 ，scFv)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
「結合」所關注抗原的抗體是以足夠的親和力結合抗原的抗體，使得該抗體可用作檢定試劑，例如 用作偵測抗體。通常，此等抗體不會與其他多肽發生顯著的交叉反應。關於多肽與標靶分子的結合，術語「特異性結合」或「與...特異性結合」或「特異於」特定多肽或特定多肽標靶上的抗原決定基，意指可測量地不同於非特異性交互作用之結合。可以例如透過相比於對照分子的結合確定標靶分子的結合來測量特異性結合，該對照分子通常是不具有結合活性的相似結構的分子。
「親和力」指代分子 (例如，抗體) 之單一結合位點與其結合配偶體 (例如，抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力 (binding affinity)」是指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對於其搭配物 Y 之親和力通常可藉由解離常數 (Kd ) 來表示。可以藉由本領域已知的常規方法測量親和力，包括彼等本文所述之方法。下面描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施例。
術語"嵌合"抗體是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「類別 (class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG、及 IgM，且彼等中之幾種可進一步分為亞類 (同型 (isotype))，例如 IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及 IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。
如本文所使用之術語「細胞毒性劑」是指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素 (例如，At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素)；化學治療劑或藥物 (例如，胺甲喋呤、阿黴素、長春花屬生物鹼 (長春新鹼、長春鹼、依托泊苷 (etoposide))，阿黴素 (doxorubicin)、黴法蘭、絲裂黴素 C、氮芥苯丁酸、道諾黴素或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核酸酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及下文所揭露之各種抗腫瘤或抗癌劑。
如本文所用，「偵測抗體」是指特異性結合樣品中的標靶分子的抗體。在一定條件下，偵測抗體與標靶分子形成複合物。偵測抗體能夠直接透過可被偵測的標記或間接偵測，例如 透過使用被標記及結合偵測抗體的另一種抗體。對於直接標記，偵測抗體通常與可透過某些方式偵測的部分結合，例如，包括但不限於螢光團。
術語「偵測」在本文中用於包括標靶分子或其加工形式的定性和定量測量。在某些實施例中，偵測包括鑑定標靶分子的單純的存在情況以及確定的標靶分子是否以可偵測的量存在。
「效用功能 (effector function)」，係指歸因於抗體的 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效用功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)；Fc 受體結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性 (ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體 (例如 B 細胞受體) 的下調；以及 B 細胞活化。
本文中的術語「Fc 區域」，用於定義包含至少一部分恆定區域的免疫球蛋白重鏈的 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異體 Fc 區域。在某些實施例中，人 IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈的羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區域或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (也稱為 EU 指數) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) (另見上文)。
「骨架 (framework)」或「FR」係指除高度可變區 (hypervariable region) (CDR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：  FR1、FR2、FR3、及 FR4。因此，CDR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：  FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，係指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體或具有含有本文定義的 Fc 區域的重鏈之抗體。
「人抗體 (human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人或人體細胞產生或自利用人抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人抗體編碼序列之非人來源衍生之抗體之胺基酸序列。人抗體的該定義特定地排除包含非人抗原結合殘基之人源化抗體。
「人共通骨架」是代表一系列人免疫球蛋白 VL 或 VH 骨架序列中最常見的胺基酸殘基的骨架。通常，人免疫球蛋白 VL 或 VH 序列的選擇來自可變域序列的次群組。通常，序列的亞組是如 Kabat 等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest (第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD (1991)，第 1-3 卷) 中所述之亞組。 在某些實施例中，對於 VL，亞群為如上述 Kabat 等人之文獻中的亞組 κI。在某些實施例中，對於 VH，亞群為如上述 Kabat 等人之文獻中的亞組 III。
「人源化 (humanized)」抗體係指包含來自非人 CDR 之胺基酸殘基及來自人 FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 CDR (例如 CDR) 對應於非人抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如 非人抗體) 之「人源化形式 (humanized form)」係指已經歷人源化之抗體。
如本申請所用，術語「高度可變區」或「CDR」係指抗體可變域的每個區域，該區域在序列中是個高度可變的 (本文也稱為「互補性決定區」或「CDR」) 及/或形成結構上定義的環 (「高度可變環」) 及/或包含抗原接觸殘基 (「抗原接觸處」)。除非另有說明，否則可變域中之 CDR 殘基及其他殘基 (例如，FR 殘基) 在本文中係根據前述 Kabat 等人文獻中之編號。通常，抗體包括六個 CDR：三個在 VH 中 (H1、H2、H3)，及三個在 VL 中 (L1、L2、L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2) 及 95-102 (H3) (Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest ，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 抗原接觸處存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2) 及 93-101 (H3) (MacCallum 等人，J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b) 及/或 (c) 之組合，包括 CDR 胺基酸殘基 46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3) 及 94-102 (H3)。
「免疫結合物」係指與一個或多個異源分子結合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。
本文中的「個體」、「受試者」或「供體」是脊椎動物，諸如人或非人動物，例如哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人、非人靈長類動物、農場動物、競賽動物、囓齒動物和寵物。非人動物受試者的非限制性實例包括囓齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；兔；犬；貓；綿羊；豬；山羊；牛；馬；及非人靈長類動物，如猿和猴。在某些實施例中，該個體、受試者或供體為人。
如本文所用，術語「活體外 」涉及人工環境及在人工環境內發生的過程或反應。活體外 環境例如為試管和細胞培養物，但不以此為限。
如本文所用，術語「活體內 」涉及自然環境 (例如 ，動物或細胞) 及在自然環境中發生的過程或反應，諸如胚胎發育、細胞分化、神經管形成等。
「分離的」抗體是從其自然環境的組分中分離出來之抗體。在某些實施例中，將抗體純化至大於 95% 或 99% 純度，藉由 (例如) 電泳 (例如，SDS-PAGE、等電位聚焦 (IEF)、毛細管電泳) 或層析 (例如，離子交換或反相 HPLC) 來測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參見例如 Flatman 等人，J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。
如本文所用，術語「標記」或「可偵測標記」係指可與待偵測或定量的物質例如 抗體連接的任何化學基團或部分。標記是可偵測標記，適用於對物質進行靈敏偵測或定量。可偵測標記的非限制性實例包括但不限於發光標記，例如 螢光、磷光、化學發光、生物發光和電化學發光標記、放射性標記、酶、顆粒、磁性物質、電活性物質等。或者，可偵測標記可以透過參與特異性結合反應來發出訊號表示其存在。此等標記的非限制性實例包括不全抗原、抗體、生物素、鏈黴親和素、his-標籤、氮基三醋酸、麩胱甘肽 S-轉移酶、麩胱甘肽等。
如本文所用的術語「單株抗體」是指獲自實質上同質抗體群體之抗體，即群體中包含的個別抗體是相同的且/或結合相同抗原決定基，但不包括，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變體抗體，此等變體通常是以少量存在。與通常包括針對不同決定位 (抗原決定基) 之不同抗體之多株抗體製劑相反，單株抗體製劑之每個單株抗體係針對於抗原上的單一決定位。因此，修飾詞「單株」表示抗體之特徵係獲自實質上同質之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。例如，待根據本文所揭露之標的使用的單株抗體可藉由多種技術來製造，其包括但不限於融合瘤方法、重組 DNA 方法、噬菌體展示方法、及利用包含全部或部分人免疫球蛋白基因座之基因轉殖動物之方法，本文描述此等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法。
「天然抗體」係指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，Ig 天然 IgG 抗體為約 150,000 道耳頓、由二條相同的輕鏈及二條相同的重鏈經二硫鍵鍵合所構成之異四聚體糖蛋白。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著係三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著係輕鏈恆定 (CL) 域。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。
術語「核酸分子」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。在本文中，術語核酸分子包括：去氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如 ，互補 DNA (cDNA) 和基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更複數個這些分子的混合聚合物。核酸分子可為線性或環狀的。此外，術語核酸分子包括有義股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子亦包括適於在活體外及/或活體內，例如，在宿主或患者體內直接表現本揭露之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。該等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可為未修飾的或經修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表達，從而將 mRNA 注入受試者以產生活體內抗體 (參見例如 Stadler 等人，Nature Medicine 2017，線上揭露於 2017 年 6 月 12 日：10.1038/nm.4356 或 EP 2 101 823 B1)。
如本文所用，「純化的」多肽 (例如 ，抗體) 係指這樣的多肽，其純度已增加，使得其以比其天然環境中和/或最初合成及/或在實驗室條件下擴增時更純的形式存在。純度是一個相對術語，並不一定意味著絕對純度。
如本文所用，術語「藥品仿單」係指通常包含在商業包裝中的說明，其中包含有關包裝的組分之使用資訊。
相對於參考多肽序列所述之「百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在排列序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守性置換作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸序列同一性百分比之目的而進行的比對可透過本領域中技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN 或 Megalign (DNASTAR) 軟件。本領域之技術人員可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大比對所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生 ％ 胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司 (Genentech，Inc.) 編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司 (Genentech，Inc.) 公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統（包括數位 UNIX V4.0D）上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。
在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性（其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性）計算如下： 100 乘以分數 X/Y 其中 X 是序列比對程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式比對中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 是 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 ％ 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 ％ 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 ％ 胺基酸序列同一值。
術語「多肽」及「蛋白質」在本文可互換使用，係指任何長度之胺基酸殘基之聚合物。聚合物可以是線性或分支的，它可以包含修飾的胺基酸，並且它可以被非胺基酸中斷。該術語還包括經過天然或干預修飾的胺基酸聚合物；例如，雙硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，例如與標記組分結合。定義中還包括例如含有一種或多種胺基酸類似物 (包括例如非天然胺基酸等) 的多肽，以及本領域已知的其他修飾。如本文所用，術語「多肽」和「蛋白質」具體包括抗體。
如本文中所用，術語「重組蛋白」通常係指已經過基因操作之胜肽及蛋白質。在某些實施例中，此等重組蛋白是「異源的」，即 對於所利用的細胞是外來的。
如本文所用，「樣品」是指大量材料的一小部分。在某些實施例中，樣品包括但不限於培養物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物流體 (例如 ，血液、血漿、血清、糞便、尿液、淋巴液、腹水、導管灌洗液、唾液和腦脊液) 及組織樣品。樣品來源可以是固體組織 (例如 ，來自新鮮、冷凍及/或保藏的器官、組織樣品、       活體組織切片或抽吸物)、血液或任何血液成分、體液 (例如，例如 尿液、淋巴液、腦脊髓液、羊水、腹膜液或間質液) 或來自個體的細胞，包括循環細胞。
術語「可變區 (variable region)」或「可變域 (variable domain)」係指參與抗體與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈之域。天然抗體之重鏈及輕鏈（分別為 VH 及 VL）之可變域通常具有類似的結構，且每個結構域均包含四個保守性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (CDR)。(參見，例如，Kindt 等人，Kuby Immunology ，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁，2007 年。)  單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可以使用 VH 或 VL 域從結合抗原的抗體中分離結合特定抗原的抗體，以分別篩選互補 VL 或 VH 域的文庫。參見，例如，Portolano 等人，J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson 等人，Nature 352:624-628 (1991)。II. 方法
本文所揭露之標的提供確定治療劑 (例如多肽或其片段) 誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向的方法。在某些實施例中，本文所揭露的方法可用於確定抗體或其片段或抗體-藥物結合物 (ADC) 誘發產生 ADA 的傾向。本揭露部分基於以下發現：抗原呈現細胞 (APC) 對抗體的內化與先前報導的抗體的臨床 ADA 率相關。本揭露還提供用於執行本文揭露的方法之套組。
在某些實施例中，本揭露的方法可用於鑑定與親代多肽例如親代抗體相比具有減低的誘發產生 ADA 的傾向的多肽變異體，例如抗體變異體。在某些實施例中，本文揭露的方法可用於分析新開發的多肽，例如 抗體。例如，但不作為限制，本文揭露的方法可用於鑑定具有從與相同抗原特異性結合的較大多肽庫中誘發 ADA 的較低傾向的多肽，例如抗體。可替代地及/或另外地，本文揭露的方法可用於鑑定與結合至相同抗原的可商購的或臨床測試的多肽 (例如抗體) 相比具有較低的誘發 ADA 的傾向的多肽 (例如抗體)。在某些實施例中，本揭露的方法可用於在臨床研究之前確定新開發的多肽例如 抗體的免疫性潛力。在某些實施例中，本文所揭露的方法可用於確定多肽 (例如抗體) 的聚集體的免疫性潛力。在某些實施例中，本文所揭露的方法可用於分析抗體的序列變異體的免疫性，例如 ，在抗體的製造及/或生產過程中可能出現的那些。
在某些實施例中，本揭露的方法可以包括使 APC 與多肽或包含該多肽的組成物接觸。在某些實施例中，將 APC 與多肽一起培養足以使多肽內化的時間量。例如，但不作為限制，APC 可以在多肽存在下培養，例如約 1 至約 72 小時。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 12 至約 72 小時、約 12 至約 60 小時、約 12 小時至約 48 小時、約 12 小時至約 24 小時、約 24 小時至約 72 小時、約 24 小時至約 60 小時、約 24 小時至約 48 小時、約 48 小時至約 72 小時或約 48 小時至約 60 小時。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 24 至約 48 小時。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 72 小時或更短時間。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 60 小時或更短時間。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 48 小時或更短時間。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 36 小時或更短時間。在某些實施例中，APC 可以在多肽存在下培養約 24 小時或更短時間。
在某些實施例中，本文揭露的方法中使用的 APC 的數量可以是從約 1x105 至約 1x107 個細胞，例如約 1x106 個細胞。例如，但不作為限制，使用的 APC 的數量可以是從約 2x105 至約 9x106 個細胞、從約 3x105 至約 8x106 個細胞、從約 3x105 至約 7x106 個細胞、從約 4x105 至約 6x106 個細胞、從約 5x105 至約 5x106 個細胞、從約 6x105 至約 4x106 個細胞、從約 7x105 至約 3x106 個細胞、從約 8x105 至約 2x106 個細胞、從約 9x105 至約 2x106 個細胞或從約 9x105 至約 1x106 個細胞。在某些實施例中，使用約 1x106 個細胞的 APC。
在某些實施例中，多肽可以以從約 25 µg/ml 至約 200 µg/ml，例如從約 25 µg/ml 至約 100 µg/ml 的濃度使用。例如，但不作為限制，多肽可以以從約 30 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 35 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 40 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 45 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 50 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 55 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 60 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 65 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 70 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 75 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 80 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 85 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 90 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 95 µg/ml 至約 100 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 95 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 90 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 85 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 80 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 75 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 70 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 65 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 60 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 55 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 50 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 45 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 40 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 35 µg/ml、從約 25 µg/ml 至約 30 µg/ml、從約 30 µg/ml 至約 90 µg/ml、從約 40 µg/ml 至約 80 µg/ml 或從約 50 µg/ml 至約 70 µg/ml 的濃度使用。
用於本文所揭露的方法中的 APC 包括任何可以在其表面展示與主要組織相容性複體 (MHC) 複合的抗原的細胞。例如，但不作為限制，APC 可以是樹突細胞、巨噬細胞、單核球、嗜中性球和 B 細胞。在某些實施例中，APC 為樹突細胞。在某些實施例中，樹突細胞可以是未成熟樹突細胞。在某些實施例中，未成熟樹突細胞可以是從單核球分化的。單核球的非限制性來源包括從供體分離的單核細胞株和原代單核球。在某些實施例中，單核球從供體的樣品中分離，例如 ，從供體的血液樣品中分離。可以藉由本領域已知的任何方法，例如藉由密度梯度，例如 Ficoll 密度梯度，從供體的樣品中分離單核球。在某些實施例中，周邊血單核細胞 (PBMC) 最初從供體的樣品中分離，然後經過 CD14+ 選擇以分離單核球。在某些實施例中，分離的單核球係在分化因子例如介白素-4 (IL-4) 及/或顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF) 的存在下分化，以產生未成熟樹突細胞用於本文所揭露的方法。例如，但不作為限制，分離的單核球可以是在約 0.1 ng/ml 至約 10 ng/ml IL-4，例如約 3 ng/ml 的 IL-4，及/或在約 1 ng/ml 至約 100 ng/ml 的 GM-CSF，例如約 50 ng/ml 的 GM-CSF 存在下分化的。可替代地，用於本文所揭露方法的樹突細胞，例如未成熟樹突細胞，可以是從幹細胞或 iPSC 細胞分化的。參見，例如，Li 等人, World J. Stem Cells 6(1):1-10 (2014)，其內容藉由引用整體併入本文。
在某些實施例中，APC 在劑的存在下與多肽接觸。在某些實施例中，可以在誘導未成熟 APC 成熟為成熟 APC 的劑的存在下使 APC 與多肽接觸。例如，但不作為限制，可以在誘導未成熟樹突細胞成熟為成熟樹突細胞的劑的存在下使未成熟樹突細胞與多肽接觸。在某些實施例中，該劑是細胞激素，例如 發炎細胞激素。發炎細胞激素的非限制性實例包括 TNFα、IL-6 和 IL-1β。Turner 等人, Biochimica et Biophysica Acta 1843(11):2563-2582 (2014) 中提供了發炎細胞激素的其他非限制性實例，該文獻的內容藉由引用整體併入本文。可替代地或另外地，該劑是由發炎細胞激素例如前列腺素 E2 (PGE2) 誘導的或誘導發炎細胞激素例如脂多醣 (LPS) 表現的蛋白質及/或化合物。在某些實施例中，該劑為脂多醣。在某些實施例中，所述藥劑可以以從約 0.001 ng/ml 至約 1,000 ng/ml，例如從約 0.01 ng/ml 至約 1,000 ng/ml、從約 0.1 ng/ml 至約 1,000 ng/ml、從約 1 ng/ml 至約 1,000 ng/ml、從約 10 ng/ml 至約 1,000 ng/ml、從約 100 ng/ml 至約 1,000 ng/ml、從約 0.001 ng/ml 至約 100 ng/ml、從約 0.001 ng/ml 至約 10 ng/ml、從約 0.001 ng/ml 至約 1 ng/ml、從約 0.001 ng/ml 至約 0.1 ng/ml 或從約 0.001 ng/ml 至約 0.01 ng/ml 的濃度使用。在某些實施例中，該劑，例如 LPS，可以以約 1 µg/ml 的濃度使用。在某些實施例中，在多肽存在下，APC 不與該劑例如 LPS 接觸。在某些實施例中，APC 是尚未在該劑例如 LPS 存在下培養的未成熟樹突細胞。
在某些實施例中，該方法可進一步包括測量存在於 APC 之外表面上的多肽的量。例如，但不作為限制，該方法可以包括測量與 APC 之表面例如質膜結合的多肽的量。在某些實施例中，多肽可以與 APC 之表面上的主要組織相容性複體 (MHC) 分子締合，例如結合。在某些實施例中，多肽可以與 APC 之表面上的 MHC II 類 (MHCII) 分子締合，例如結合。在某些實施例中，測量存在於 APC 之外表面上的多肽的量可以包括 (i) 使 APC 與結合至多肽的偵測劑接觸及 (ii) 確定與存在於 APC 之外表面上的多肽結合的偵測劑的量。在某些實施例中，在使 APC 與偵測劑接觸之前 APC 未經透化，以防止偵測 APC 內的多肽，例如存在於 APC 內的細胞內結構內的多肽。
在某些實施例中，該方法可進一步包括測量與 APC 締合的多肽的總量。在某些實施例中，與 APC 締合的多肽總量包括存在於 APC 之外表面上的多肽的量和存在於 APC 內的多肽的量。在某些實施例中，測量與 APC 締合的多肽的總量包括 (i) 透化 APC，(ii) 使 APC 與結合至多肽的偵測劑接觸，及 (iii) 確定與存在於 APC 之外表面上的和 APC 內的多肽結合的偵測劑的量。透化 APC 允許偵測存在於 APC 內例如存在於 APC 內的細胞內結構內的多肽。在某些實施例中，透化允許偵測存在於 APC 內的內體和胞溶體結構內的多肽。在某些實施例中，APC 可以使用本領域已知的任何技術進行透化，包括但不限於使用清潔劑或有機溶劑。透化技術的非限制性實例揭露於 Jamur 和 Oliver, Methods Mol. Biol. 588:63-66 (2010) 中，內容據此藉由引用整體併入本文。在某些實施例中，藉由使 APC 與透化劑接觸而透化 APC。例如，但不作為限制，透化劑可以是清潔劑，例如 皂素。
在某些實施例中，可在 APC 與多肽初始接觸後的約 4 小時至約 72 小時之間測量存在於 APC 之外表面上的多肽的量及/或與 APC 締合的多肽的總量。例如，但不作為限制，可在 APC 與多肽初始接觸後的約 4 小時至約 48 小時之間、約 4 小時至約 24 小時之間、約 4 小時至約 12 小時之間或約 4 小時至約 8 小時之間測量存在於 APC 之外表面上的多肽的量及/或與 APC 締合的多肽的總量。在某些實施例中，可在 APC 與多肽初始接觸後的約 4 小時測量存在於 APC 之外表面上的多肽的量及/或與 APC 締合的多肽的總量。
在某些實施例中，用於本文揭露的方法中的偵測劑是抗體 (本文也稱為「偵測抗體」)。在某些實施例中，偵測劑與藉由揭露的方法分析的多肽特異性結合，例如 ，偵測劑與多肽或其片段上存在的抗原決定基特異性結合。在某些實施例中，偵測劑是與特定類別或亞類抗體結合的抗體。例如，但不作為限制，如果藉由本文揭露的方法分析 IgG 抗體，則偵測抗體可以是抗 IgG 抗體。在某些實施例中，本文揭露的檢定方法中使用的偵測劑可以以從約 1 µg/ml 至約 50 µg/ml、從約 1 µg/ml 至約 40 µg/ml、從約 1 µg/ml 至約 30 µg/ml、從約 1 µg/ml 至約 20 µg/ml 或約 1 µg/ml 至約 10 µg/ml 的濃度使用。在某些實施例中，偵測劑以約 1 µg/ml 至約 10 µg/ml，例如約 6 µg/ml 的濃度使用。
在某些實施例中，可標記用於所揭露方法中的偵測劑，例如 偵測抗體。標記包括但不限於直接偵測的標記或部分 (例如螢光、發色、電子緻密、化學發光和放射性標記)，以及間接偵測 (例如，透過酶促反應或分子交互作用) 的部分，諸如酶或配位體。標記的例示性實例包括：放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；螢光團，例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物；鹼性蕊香紅及其衍生物；丹磺醯基；繖形酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶 (參見美國專利第 4,737,456 號)；螢光素；2,3-二氫鄰苯二甲二酮；辣根過氧化物酶 (HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖 6-磷酸脫氫酶；雜環氧化酶，例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶，與採用過氧化氫氧化染料前驅物 (例如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶) 的酶偶合使用；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基等。在某些實施例中，偵測劑，例如 抗體，用螢光團來標記。
在某些實施例中，藉由能夠偵測偵測劑的任何方法來確定與多肽結合的偵測劑的量。在某些實施例中，可以透過監測偵測劑的標記例如 螢光標記對偵測劑進行偵測。例如，但不作為限制，與多肽或其片段結合的偵測劑的量係透過對偵測劑的螢光進行偵測來確定。在某些實施例中，透過流式細胞分析技術來執行對與多肽或其片段結合的偵測劑的量的確定。
在某些實施例中，該方法進一步包括確定藉由 APC 內化的多肽的量。例如，但不作為限制，該方法可以包括計算內化指數值 (本文也稱為「標準化 MFI」)，其與藉由 APC 內化的多肽或其片段的量相關。在某些實施例中，藉由從與 APC 締合的多肽的總量中減去與 APC 之外表面結合的多肽的量來確定內化指數值。
在某些實施例中，該方法可以進一步包括將多肽的內化指數與指示誘發產生 ADA 的已知傾向的參考內化指數進行比較，例如在臨床環境中。在某些實施例中，當多肽的內化指數值大於參考內化指數時，該多肽比參考物具有更大的誘發產生 ADA 的傾向，例如在臨床環境中。可替代地，當多肽的內化指數值小於參考內化指數時，與參考相比，多肽具有比參考物更小的誘發產生 ADA 的傾向，例如在臨床環境中。
在某些實施例中，參考內化指數可以是已證明誘發產生 ADA 的多肽 (例如，參考多肽) 的內化指數。例如，但不作為限制，參考多肽可以是已證明在臨床環境中誘發產生 ADA 的抗體。在某些實施例中，具有較高內化指數值的參考多肽在臨床環境中具有較高水平的 ADA/免疫性。在某些實施例中，具有較低內化指數值的參考多肽在臨床環境中具有降低的 ADA/免疫性。在某些實施例中，參考多肽可以是圖 3 至圖 8 中任一項中揭露的抗體。在某些實施例中，參考多肽可以是已證明在臨床環境中以低水平誘發產生 ADA 的抗體，例如依洛珠單抗 (evolocumab)、RG7652 和 AVASTIN®。在某些實施例中，參考多肽可以是已證明在臨床環境中以高水平誘發產生 ADA 的抗體，例如伯考賽珠單抗。可替代地或另外地，在抗體變異體的情況下，參考內化指數可以是親代抗體的內化指數。在某些實施例中，在聚集體的情況下，參考內化指數可以是未聚集的相同抗體的內化指數。在某些實施例中，參考內化指數可以是與使用本文揭露的方法分析的抗體結合相同抗原的抗體的內化指數。
在某些實施例中，該方法可以包括用從多於一個供體取得的樹突細胞來分析多肽。在某些實施例中，本揭露的方法可包括透過將來自個別供體的樹突細胞，例如未成熟樹突細胞，單獨地與所關注多肽一起培養來分析多肽誘發產生 ADA 的傾向，並分析每個個別供體的樹突細胞的內化指數。在某些實施例中，可以確定和分析個別供體中之各者的內化指數值以確定多肽誘發產生 ADA 的傾向。在某些實施例中，內化指數值可以是每個供體的內化指數值的平均值。在某些實施例中，可以將來源於至少 2 個或更多個、至少 3 個或更多個、至少 4 個或更多個、至少 5 個或更多個、至少 6 個或更多個、至少 7 個或更多個、至少 8 個或更多個、至少 9 個或更多個、至少 10 個或更多個、至少 15 個或更多個、至少 20 個或更多個、至少 25 個或更多個、至少 30 個或更多個、至少 35 個或更多個、或至少 40 個或更多個個別供體的樹突細胞單獨地與所關注多肽一起培養。在某些實施例中，可將來自約 10 個至約 50 個個別供體的樹突細胞單獨地與所關注多肽一起培養。例如，但不作為限制，可以將來自約 15 個至約 45 個個別供體、來自約 20 個至約 40 個個別供體、來自約 25 個至約 35 個個別供體或來自約 30 個個別供體的樹突細胞單獨地與所關注多肽一起培養。III. 多肽
本揭露提供確定多肽誘發產生 ADA 的傾向的方法。下文提供可以透過所揭露的方法分析的此等多肽的非限制性實例。例如，但不作為限制，使用本文揭露的任何方法檢定的多肽可以是多肽例如 胜肽的片段。在某些實施例中，多肽可以是重組蛋白。在某些實施例中，多肽是抗體或其片段，例如 人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施例中，抗體可以是抗體-藥物結合物 (ADC)。在某些實施例中，抗體可以是單域抗體。1. 抗體或其片段
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽是抗體或其片段，例如 單株抗體及其片段。例如，但不作為限制，本揭露的方法可用於確定新開發及/或鑑定的抗體或其片段的免疫學潛力。
抗體片段包括但不限於 Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 、Fv 和 scFv 片段以及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，參見例如 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies ，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合抗原決定基殘基且具有增加的活體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國專利號 5,869,046。抗體片段可藉由多種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如，大腸桿菌或噬菌體) 之產生。
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是雙功能抗體。雙功能抗體為包含兩個抗原結合位點 (其可係二價或雙特異性的) 之抗體片段。參見例如 EP 404097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat. Med. 9:129-134 (2003) 中亦描述了三功能抗體及四功能抗體，其可由揭露的方法分析。
在某些實施例中，藉由揭露的方法分析的抗體可以是單域抗體。單域抗體為包含抗體之重鏈可變域之全部或部分或抗體之輕鏈可變域之全部或部分之抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國專利第 6,248,516 B1 號)。單域抗體的其他非限制性實例揭露於 Iezzi 等人，Front Immunol. 9:273 (2018)，其內容藉由引用整體併入本文。在某些實施例中，抗體是雜交體 (Hybrigenics Services, Cambridge, MA)。2. 嵌合、人源化及人抗體
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽為嵌合抗體，例如 人源化抗體。例如，但不作為限制，本文所揭露的方法可用於鑑定抗體的嵌合形式，抗體的該等嵌合形式與親代抗體或抗體的其他嵌合形式相比，具有低的或較低的誘發產生 ADA 的傾向。可替代地或另外地，本揭露的方法可用於鑑定具有低的誘發產生 ADA 的傾向的嵌合抗體。
本領域的某些嵌合抗體描述於例如美國專利第 4,816,567 號；及 Morrison 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851-6855 (1984) 中。在某些實施例中，嵌合抗體包含非人可變區 (例如，來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人靈長類動物 (諸如猴) 之可變區) 及人恆定區。在又一個實例中，嵌合抗體可以是「類別轉換」抗體，其中類或子類相比於其親代抗體已發生變更。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體可以是人源化抗體。通常，非人抗體為人源化抗體以降低對人的免疫原性，同時保留親代非人抗體之特異性及親和力。一般而言，人源化抗體包含一個或多個可變域，其中 CDR，例如 CDR (或其部分) 來源於非人抗體，且 FR (或其部分) 來源於人抗體序列。人源化抗體視情況將包含人恆定區之至少一部分。在某些實施例中，人源化抗體中之一些 FR 殘基經來自非人抗體（例如 衍生 CDR 殘基之抗體）之對應殘基取代，例如 以恢復或提高抗體特異性或親和性。
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是人抗體。例如，但不作為限制，本文所揭露的方法可用於鑑定具有低的或較低的誘發產生人抗體的傾向的抗體的嵌合形式，該等人抗體具有低的或較低的誘發產生 ADA 的傾向。3. 來源於文庫之抗體
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是藉由篩選具有所需活性的抗體的組合文庫而分離的抗體或其片段。例如，但不作為限制，本揭露的方法可用於鑑定例如與具有所需結合特性及/或與相同抗原結合的其他來源於文庫之抗體相比具有低的或較低的誘發產生 ADA 的傾向的來源於文庫之抗體。
從人抗體庫分離的抗體或抗體片段在本文中被視作人抗體或人抗體片段。4. 多特異性抗體
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是多特異性抗體，例如 雙特異性抗體。多特異性抗體是對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性的單株抗體。雙特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。例如，但不作為限制，本文所揭露的方法可用於鑑定例如與結合相同抗原決定基的其他多特異性抗體相比具有低的或更低的誘發產生 ADA 的傾向的多特異性抗體。可替代地或另外地，本揭露的方法可用於鑑定具有低的誘發產生 ADA 的傾向的多特異性抗體。
還可由揭露的方法分析具有三個或更多個功能性抗原結合位點之工程化抗體，包括「章魚抗體」(Octopus antibodies) (參見例如 US 2006/0025576A1)。5. 免疫結合物
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是免疫結合物，例如，包含與一種或多種細胞毒性劑結合的抗體的免疫結合物，諸如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素 (例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或其片段) 或放射性同位素。例如，抗體或抗原結合部分可以功能性連結 (例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式) 至一個或多個其他結合分子，諸如另一抗體、抗體片段、胜肽或結合模擬物。
在某些實施例中，免疫結合物是一種抗體-藥物結合物 (ADC)，其中抗體與一種或多種藥物結合，該一種或多種藥物包括但不限於美登木素生物鹼 (maytansinoid) (參見美國專利號 5,208,020 和 5,416,064 及歐洲專利 EP 0 425 235)；澳瑞他汀 (auristatin) 諸如單甲基澳瑞他汀藥物部分 DE 和 DF (MMAE 和 MMAF) (參見美國專利號 5,635,483、5,780,588 和 7,498,298)；尾海兔素 (dolastatin)；加利車黴素 (calicheamicin) 或其衍生物 (參見美國專利號 5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001 和 5,877,296；Hinman 等人，Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及 Lode 等人，Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；蒽環類藥物，諸如道諾黴素 (daunomycin) 或阿黴素 (doxorubicin) (參見 Kratz 等人，Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey 等人，Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov 等人，Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik 等人，Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King 等人，J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；及美國專利號 6,630,579)；胺甲喋呤 (methotrexate)；長春地辛 (vindesine)；紫杉烷類，諸如多西紫杉醇 (docetaxel)、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、拉洛紫杉醇 (larotaxel)、特賽紫杉醇 (tesetaxel) 及奧他紫杉醇 (ortataxel)；單端孢黴烯 (trichothecene)；及 CC1065。
在某些實施例中，免疫結合物包含結合至酶活性毒素或其片段的抗體，該酶活性毒素或其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於銅綠假單胞菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈、莫迪素 A 鏈、α-八疊球菌、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜抑制因子、薑黃素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯族毒素。
在某些實施例中，免疫結合物包含結合至放射性原子以形成放射性結合物的抗體。在另一個實施例中，多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。非限制性實例包括 At211 、I131 、I125 、Y90 、Re186 、Re188 、Sm153 、Bi212 、P32 、Pb212 和 Lu 的放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，它可包括用於閃爍顯像研究之放射性原子 (例如 tc99m 或 I123) 或用於核磁共振 (NMR) 成像 (也稱為磁共振成像，mri) 之自旋標記，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體和細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白耦聯劑進行製備，該雙功能蛋白耦聯劑諸如 N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯 (SMCC)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物（諸如己二酸二甲酯鹽酸鹽）、活性酯（諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸）、醛（諸如戊二醛）、雙疊氮化合物（諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺）、雙重氮衍生物（諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯 2,6-二異氰酸酯）和雙活性氟化合物（諸如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按照 Vitetta 等人 (Science 238:1098 (1987)) 所述的方法進行製備。用於將放射性核苷酸結合至抗體的一種示例性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸根合芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。參見 WO94/11026。連接子可以為促進細胞中細胞毒性藥物釋放的「可切割連接子」。例如，可使用酸不穩定之連接子、對肽酶敏感之連接子、光不穩定之連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子（Chari 等人，Cancer Res. 52:127-131 (1992)；美國專利號 5,208,020）。
在某些實施例中，免疫結合物包括但不限於此等用交聯劑製得之結合物，該交聯劑包括但不限於可商購獲得 (例如從 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL., U.S.A) 商購獲得) 的 BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC 和磺基-SMPB 以及 SVSB (琥珀醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)。6. 抗體變異體
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的多肽可以是先前揭露的抗體的抗體變異體。例如，本揭露的方法可用於鑑定作為先前揭露的抗體的變異體的抗體，該等抗體具有比親代抗體更低的誘發產生 ADA 的傾向。在某些實施例中，可以將胺基酸取代引入所關注抗體中，並且可以藉由使用揭露的方法篩選抗體變異體的免疫性。
在某些實施例中，抗體變異體可以是例如 藉由將適當的修飾導入編碼抗體的核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備的抗體之胺基酸序列變異體。此等修飾包括但不限於抗體之胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。此等變異的所關注位點包括但不限於 CDR 和 FR。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終抗體 (即經修飾之抗體) 具有所需之特性，例如 抗原結合特性。
在某些實施例中，抗體變異體可以是已被改變以增加或減少抗體發生醣基化之程度的抗體。例如，但不作為限制，可藉由改變胺基酸序列從而產生或移除一個或多個醣基化位點來達成抗體醣基化位點的添加或缺失。
在某些實施例中，藉由本文揭露的方法分析的抗體是 Fc 區變異體。Fc 區變異體可包含人 Fc 區序列 (例如，人 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區)，該序列在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。
在某些實施例中，抗體變異體可以是半胱胺酸工程化抗體，例如 「thioMAb」，其中抗體的一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在某些實施例中，取代的殘基出現在抗體之可進入的位點。透過用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團由此被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：  輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。半胱胺酸工程化抗體可按照例如美國第 7,521,541 號專利所述之方法產生。IV. 套組
本文所揭露之標的進一步提供包含可用於執行本文揭露的方法的材料之套組。在某些實施例中，本揭露的套組包括含有 APC 或單核球的容器及/或含有一種或多種偵測劑的容器。合適容器的非限制性實例包括瓶子、試管、小瓶和微量滴定盤。容器可由各種材料諸如玻璃或塑料形成。
在某些實施例中，套組可包括一個或多個含有一個或多個 APC 或單核球的容器。APC 的非限制性實例包括樹突細胞、巨噬細胞、單核球和 B 細胞。在某些實施例中，套組可包括至少一個含有樹突細胞的容器。例如，但不作為限制，套組可包括至少一個含有未成熟樹突細胞的容器。在某些實施例中，本揭露的套組在一個或多個容器中包括來源於一個或多個供體的 APC。例如，但不作為限制，來源於每個個別供體的 APC 被提供在單獨的容器中。在某些實施例中，本揭露的套組可包括來自約 10 至約 40 個個別供體的 APC。在某些實施例中，本揭露的套組可進一步包括一種或多種偵測劑。例如，但不作為限制，偵測劑可以是與被分析的多肽特異性結合的抗體，例如，如果正在分析 IgG 抗體，則為抗 IgG 抗體。
在某些實施例中，本揭露的套組可進一步在一個或多個容器中包括一種或多種用於誘導未成熟樹突細胞成熟的劑。在某些實施例中，一種或多種劑可包括發炎細胞激素、PGE2 和脂多醣。
在某些實施例中，套組進一步包括提供使用該套組中提供的組分的說明的藥品仿單。例如，本揭露的套組可以包括藥品仿單，其提供在揭露的方法中使用 APC、單核球及/或偵測劑的說明。
可替代地或另外地，該套組可以包括從商業和使用者的角度期望的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑和過濾劑。在某些實施例中，套組可包括用於收集及/或處理血液樣品，例如，以從血液樣品中分離 PBMC 及/或單核球的材料。在某些實施例中，套組可包括用於將單核球分化成未成熟樹突細胞的試劑。在某些實施例中，用於將單核球分化成未成熟樹突細胞的一種或多種劑可以是 IL-4 及/或 GM-CSF。在某些實施例中，套組可進一步包括能夠透化 APC 的劑，例如皂素。V. 例示性實施例
A.    在某些非限制性實施例中，本文所揭露之標的提供確定多肽或其片段相對於已知參考物誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向之方法，其包含： (a) 使抗原呈現細胞 (APC) 與該多肽或其片段接觸； (b) 測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量； (c) 測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量，其中與 APC 締合的多肽或其片段之總量包含存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量和存在於該 APC 內的多肽或其片段的量； (d) 藉由從 (c) 中所測量的與該 APC 締合的多肽或其片段之總量減去 (b) 中所測量的與該 APC 之外表面結合的多肽或其片段的量來計算內化指數值；以及 (e) 將 (d) 中的該內化指數與參考內化指數比較； 其中，當 (d) 中的該內化指數值大於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更大的誘發該 ADA 的傾向，而當 (d) 中的該內化指數值小於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更小的誘發該 ADA 的傾向。
A1、如 A 之方法，其中該多肽或其片段是胜肽。
A2、如 A 之方法，其中該多肽或其片段是重組蛋白。
A3、如 A 之方法，其中該多肽或其片段是抗體或其片段。
A4、如 A3 之方法，其中該抗體或其片段為人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
A5、如 A3 或 A4 之方法，其中該抗體或其片段是單域抗體。
A6、如 A 之方法，其中該多肽是抗體-藥物結合物 (ADC)。
A7、如 A 至 A6 中任一項之方法，其中該 APC 係選自由樹突細胞、巨噬細胞、單核球和 B 細胞所組成之群組。
A8、如 A7 之方法，其中該 APC 是樹突細胞。
A9、如 A8 之方法，其中該樹突細胞是未成熟樹突細胞。
A10、如 A9 之方法，其中該未成熟樹突細胞是藉由分化從供體所分離之單核球而產生的。
A11、如 A10 之方法，其中經分離之單核球是在介白素-4 (IL-4) 和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF) 中的一或多者存在下分化以產生該未成熟樹突細胞。
A12、如 A 至 A11 中任一項之方法，其中該 APC 是在劑的存在下與該多肽或其片段接觸。
A13、如 A12 之方法，其中該劑係選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。
A14、如 A13 之方法，其中該發炎細胞激素係選自由 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。
A15、如 A13 之方法，其中該劑是 LPS。
A16、如 A 至 A15 中任一項之方法，其中 (c) 測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量包含： (i) 透化該 APC； (ii) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合；以及 (iii) 確定與存在於該 APC 之外表面上和該 APC 內的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量。
A17、如 A 至 A16 中任一項之方法，其中 (b) 測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量包含： (i) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合；以及 (ii) 確定與存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段之量， 其中在使該 APC 與該偵測劑接觸之前，該 APC 是未經透化的。
A18、如 A16 或 A17 之方法，其中該偵測劑是抗體。
A19、如 A16 至 A18 中任一項之方法，其中該偵測劑是結合至螢光團之抗體。
A20、如 A18 或 A19 之方法，其中該抗體是抗 IgG 抗體。
A21、如 A16 至 A20 中任一項之方法，其中確定與該多肽或其片段結合的偵測劑之量係藉由流式細胞分析技術來進行。
B. 在某些非限制性實施例中，本文所揭露之標的提供一種執行 A 至 A21 中任一項之方法的套組。
B1、如 B 之套組，其中該套組包含以下中之一或多者： (a) APC； (b) 劑； (c) 偵測劑；及 (d) 透化劑。
B2、如 B1 之套組，其中該劑係選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。
B3、如 B1 之套組，其中該發炎細胞激素係選自由 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。
B4、如 B1 或 B2 之套組，其中該劑是 LPS。
B5、如 B1 至 B4 中任一項之套組，其中該偵測劑是抗體。
B6、如 B1 至 B5 中任一項之套組，其中該偵測劑是結合至螢光團之抗體。
B7、如 B5 或 B6 之套組，其中該抗體是抗 IgG 抗體。
B8、如 B1 至 B7 中任一項之套組，其中該透化劑是皂素。
以下實例僅為對本文所揭露之標的之說明，不應被視為以任何方式進行限制。 實例 1 ：基於抗原呈現細胞之檢定
基於多肽的治療劑具有誘發產生 ADA 的免疫性潛力。特別地，此等基於多肽的治療劑可以被抗原呈現細胞例如樹突細胞吸收及加工以呈現與其表面上的第 II 類 MHC 分子複合的基於多肽的治療劑的片段。T 細胞隨後與抗原呈現細胞表面上呈現的片段相互作用，以誘發免疫反應，使 B 細胞產生 ADA。
本文已經開發了一種確定抗體誘發產生 ADA 的傾向的方法。此等方法在藥物開發過程中是非常有價值的工具，因為它可用於預測新開發藥物在臨床前開發階段的免疫性潛力。圖 1 提供該方法的實驗細節的示意圖。如圖 1 所示，使用 Ficoll 梯度從供體的血液中分離出 PBMC。經由 CD14+ 珠 (Miltenyi Biotec，按照製造商的說明) 從 PBMC 中分離出單核球，隨後藉由將單核球與 3 ng/mL IL-4 和 50 ng/mL GM-CSF (R&D Systems) 一起培養，分化成未成熟樹突細胞。在分離的單核球初始植入和隨後的單核球分化後的第 5 天，在 1 µg/mL 脂多醣 (LPS) 的存在下，使未成熟樹突細胞與 100 µg/mL 的所關注抗體接觸，以促進未成熟樹突細胞的成熟。在第 6 天，根據圖 2 至圖 4 中提供的細節對成熟樹突細胞進行染色和分析。圖 2 展示確定與 APC 之表面結合的抗體的量和與 APC 締合的總抗體的量的技術。為了確定與 APC 之表面結合的抗體的量，用 6 µg/mL 的抗人 IgG 抗體對 APC 進行染色，該抗體與 AlexaFluor 647 結合 (圖 2)。為了確定與 APC 締合的總抗體的量，在使用與 AlexaFluor 647 結合的抗人 IgG 抗體染色之前，將 APC 固定和透化 (Becton Dickinson 固定和透化緩衝劑，依照製造商的說明) (圖 2)。APC 的透化允許螢光團結合的抗體進入細胞並與存在於細胞內結構 (例如內體) 內的抗體結合。藉由流式細胞分析技術確定與 APC 締合的總抗體的量相比與 APC 之表面結合的抗體的量。圖 3 揭露用於流式細胞分析技術的圈選策略。為了確定內化指數 (本文也稱為「標準化 MFI」)，從與 APC 締合的所關注抗體的總量中減去與 APC 結合的所關注抗體的量 (圖 4)。如圖 4 所示，與已顯示出具有較低臨床 ADA 率的 AVASTIN® 相比，已顯示出具有高臨床 ADA 率的抗體伯考賽珠單抗產生了更多量的與 APC 締合的總抗體。這些結果表明伯考賽珠單抗將具有比 AVASTIN® 更高的內化指數。
許多抗 PCSK9 抗體的分析證實內化指數與臨床 ADA 率相關 (圖 5)。藉由上述方法分析了抗 PCSK9 抗體，阿利羅庫單抗、伯考賽珠單抗、依洛珠單抗和 RG7652。這 4 種不同的抗 PCSK9 抗體在臨床中顯示出不同水平的免疫性。特別是，伯考賽珠單抗已顯示出具有 46% 的臨床 ADA 率，依洛珠單抗已顯示出具有 0.1% 的臨床 ADA 率，阿利羅庫單抗具有 5.1% 的臨床 ADA 率，且 RG7652 具有 3.3% 的臨床 ADA 率。如圖 5 所示，伯考賽珠單抗的內化指數顯著高於任何其他抗 PCSK9 抗體，這與觀察到的不同抗體的臨床 ADA 率有關。
許多抗 TNF 抗體的分析展示了類似的結果 (圖 6)。分析了抗 TNF 抗體 Enbrel® (依那西普)、Humira® (阿達木單抗) 和 Remicade® (英夫利昔單抗)。Enbrel®、Humira® 和 Remicade® 的臨床 ADA 率分別為 8.7%、26% 和 10%。如圖 6 所示，與 Enbrel® 和 Remicade® 相比，具有最高臨床 ADA 的 Humira® 也具有最高的內化指數 (即標準化 MFI)。
對一些其他抗體的進一步分析表明，該方法可以區分具有高免疫性的抗體和具有較低免疫性的抗體。如圖 6 所示，與具有低內化指數的 HERCEPTIN® 相比，具有高 ADA 率的伯考賽珠單抗、HA33 和布雷努單抗 (briakinumab) 產生高內化指數。羅利珠單抗 (rontalizumab) 和 HERCEPTIN® 的 ADA 率分別為 0.6% 和 10-15%。還分析了均靶向 IL-17a 的蘇金單抗和伊凱珠單抗 (ixekizumab)。在臨床上，蘇金單抗的免疫性率低 (低於 1%)，而伊凱珠單抗的免疫性率較高，為 5-22%。如圖 6 所示，伊凱珠單抗的內化程度高於蘇金單抗。這些資料表明，在臨床中表現出高免疫性 (即較高臨床 ADA 率) 的分子的內化指數較高，而在臨床中表現出低免疫性 (即較低臨床 ADA 率) 的分子的內化指數較低。此外，已知影響抗體的免疫性的抗體聚集可以藉由所揭露的方法測量。如圖 6 所示，抗體羅利珠單抗的聚集體 (稱為「羅利珠單抗...」和「羅利珠單抗聚集體」) 比羅利珠單抗具有更高的內化指數。
進行了其他實驗以確定伯考賽珠單抗、阿達木單抗和貝伐珠單抗的內化指數如何隨時間變化。伯考賽珠單抗和阿達木單抗的 ADA 率如上文所述，貝伐珠單抗的 ADA 率為 0.6%。如圖 7A 所示，在未成熟樹突細胞與抗體接觸後 4 小時，最大量的抗體被內化。48 或 72 小時後，未觀察到抗體內化的進一步增加 (圖 7A)。進行了進一步分析以確定內化抗體的量是否視樹突細胞是未成熟的還是成熟的而定。如圖 7B 所示，與用 LPS 刺激成熟的樹突細胞 (mDC) 相比，在未成熟樹突細胞 (iDC) 中觀察到抗體內化的最小差異。
樹突細胞內化抗體的機制是藉由在細胞鬆弛素、阻斷所有 FcγR 的抗體混合物（也稱為 Fc 受體阻斷劑）、或兩者存在下分析伯考賽珠單抗的內化指數來確定的，該抗體混合物由抗 FcγRIA 抗體、抗 FcγRIIa 抗體和抗 FcγRIIIA 抗體所構成的抗體混合物。如圖 8 所示，與對照或單獨使用 Fc 受體阻斷劑相比，單獨使用細胞鬆弛素或與 Fc 受體阻斷劑組合使用，抑制伯考賽珠單抗的內化。這些資料表示，藉由樹突細胞的抗體內化是由巨胞飲、而不是透過 Fc 受體介導的內化所驅動的。
資料顯示，所揭露之方法可用於確定抗體的免疫性，因為它可再現地區分具有高臨床免疫性的抗體和具有低臨床免疫性的抗體。所揭露之方法亦具有成本效益並且不需要太多設備來進行。
除所描繪和要求保護的各種實施例之外，本文所揭露之標的還涉及具有本文所揭露和要求保護的特徵的其他組合的其他實施例。因此，本文所呈現之特定特徵可在本文所揭露之標的範圍內以其他方式彼此組合，使得本文所揭露之標的包括本文所揭露之特徵的任何合適的組合。出於說明和描述的目的，已經提供了本文所揭露之標的的特定實施例的前述描述。其並非旨在窮舉或將本文所揭露之標的限制為所揭露的那些實施例。
對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者所顯而易見的是，在不脫離本文所揭露之標的的精神或範圍的情況下，可以對本文所揭露之標的的組成和方法進行各種修改和變型。因此，本文所揭露之標的旨在包括在所附申請專利範圍及其等同形式的範圍內的修改和變型。
本文引用了各種出版物、專利和專利申請，這些文獻以引用方式整體併入本文。
圖 1 展示確定多肽誘發產生 ADA 的傾向之方法的非限制性實施例的示意圖。 圖 2 展示偵測與抗原呈現細胞 (APC) 表面結合的抗體量和與該 APC 締合的總抗體量的示意圖。 圖 3 展示確定與 APC 結合的抗體的量和與該 APC 締合的總抗體的量的流式細胞分析技術圈選策略的示意圖。 圖 4 展示的圖，顯示相較於抗體伯考賽珠單抗 (bococizumab) 和 AVASTIN® 的 APC 總染色的 APC 外部染色。 圖 5 展示在臨床環境下具有不同免疫性程度的不同抗 PCSK9 抗體的內化指數值。 圖 6 展示在臨床環境下具有高免疫性的抗體和具有低免疫性的抗體的內化指數值，包括 Enbrel® （依那西普 (etanercept)）、Humira®（阿達木單抗 (adalimumab)）和Remicade®（英夫利昔單抗 (infliximab)），以及抗體聚集體的內化指數值。 圖 7A 展示抗體伯考賽珠單抗、阿達木單抗和貝伐珠單抗 (bevacizumab) 在 72 小時的期間的內化指數值。 圖 7B 展示使用未成熟樹突細胞 (iDC) 和用 LPS 刺激而成熟的樹突細胞 (mDC) 對抗體伯考賽珠單抗、阿達木單抗和貝伐珠單抗的內化指數值。 圖 8 展示在細胞鬆弛素、Fc 受體阻斷劑或兩者的組合存在下的伯考賽珠單抗的內化率。

Claims (31)

  1. 一種確定多肽或其片段相對於已知參考物誘發產生抗藥物抗體 (ADA) 的傾向之方法，其包含： (a) 使抗原呈現細胞 (APC) 與該多肽或其片段接觸； (b) 測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量； (c) 測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量，其中與 APC 締合的多肽或其片段之總量包含存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量和存在於該 APC 內的多肽或其片段的量； (d) 藉由從 (c) 中所測量的與該 APC 締合的多肽或其片段之總量減去 (b) 中所測量的與該 APC 之外表面結合的多肽或其片段的量來計算內化指數值；以及 (e) 將 (d) 中的該內化指數與參考內化指數比較； 其中，當 (d) 中的該內化指數值大於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更大的誘發該 ADA 的傾向，而當 (d) 中的該內化指數值小於該參考內化指數時，該多肽或其片段具有比該參考物更小的誘發該 ADA 的傾向。
  2. 如請求項 1 之方法，其中該多肽或其片段是胜肽。
  3. 如請求項 1 之方法，其中該多肽或其片段是重組蛋白。
  4. 如請求項 1 之方法，其中該多肽或其片段是抗體或其片段。
  5. 如請求項 4 之方法，其中該抗體或其片段是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。
  6. 如請求項 4 或 5 之方法，其中該抗體或其片段是單域抗體。
  7. 如請求項 1 之方法，其中該多肽是抗體-藥物結合物 (ADC)。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中該 APC 係選自由樹突細胞、巨噬細胞、單核球和 B 細胞所組成之群組。
  9. 如請求項 8 之方法，其中該 APC 是樹突細胞。
  10. 如請求項 9 之方法，其中該樹突細胞是未成熟樹突細胞。
  11. 如請求項 10 之方法，其中該未成熟樹突細胞是藉由分化從供體所分離之單核球而產生的。
  12. 如請求項 11 之方法，其中經分離之單核球是在介白素-4 (IL-4) 和顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子 (GM-CSF) 中的一或多者存在下分化以產生該未成熟樹突細胞。
  13. 如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該 APC 是在劑的存在下與該多肽或其片段接觸。
  14. 如請求項 13 之方法，其中該劑係選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。
  15. 如請求項 14 之方法，其中該發炎細胞激素係選自由 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。
  16. 如請求項 14 之方法，其中該劑是 LPS。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中 (c) 測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量包含： (i) 透化該 APC； (ii) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合；以及 (iii) 確定與存在於該 APC 之外表面上和該 APC 內的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量與該 APC 締合的多肽或其片段之總量。
  18. 如請求項 1 至 17 中任一項之方法，其中 (b) 測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段的量包含： (i) 使該 APC 與偵測劑接觸，該偵測劑與該多肽或其片段結合；以及 (ii) 確定與存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段結合的偵測劑之量，以測量存在於該 APC 之外表面上的多肽或其片段之量， 其中在使該 APC 與該偵測劑接觸之前，該 APC 是未經透化的。
  19. 如請求項 17 或 18 之方法，其中該偵測劑是抗體。
  20. 如請求項 17 至 19 中任一項之方法，其中該偵測劑是結合至螢光團之抗體。
  21. 如請求項 19 或 20 之方法，其中該抗體是抗 IgG 抗體。
  22. 如請求項 17 至 21 中任一項之方法，其中確定與該多肽或其片段結合的偵測劑之量係藉由流式細胞分析技術來進行。
  23. 一種進行如請求項 1 至 22 中任一項之方法之套組。
  24. 如請求項 23 之套組，其中該套組包含以下中之一或多者： a)  APC； b) 劑； c)  偵測劑；及 d) 透化劑。
  25. 如請求項 24 之套組，其中該劑係選自由發炎細胞激素、前列腺素 E2 (PGE2)、脂多醣 (LPS) 及其組合所組成之群組。
  26. 如請求項 25 之套組，其中該發炎細胞激素係選自由 TNFα、IL-6、IL-1β 及其組合所組成之群組。
  27. 如請求項 25 之套組，其中該劑是 LPS。
  28. 如請求項 24 至 27 中任一項之套組，其中該偵測劑是抗體。
  29. 如請求項 24 至 28 中任一項之套組，其中該偵測劑是結合至螢光團之抗體。
  30. 如請求項 28 或 29 之套組，其中該抗體是抗 IgG 抗體。
  31. 如請求項 24 至 30 中任一項之套組，其中該透化劑是皂素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
AU767394C (en) 1999-12-29 2005-04-21 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising modified doxorubicins and daunorubicins and their therapeutic use
JP2003531588A (ja) 2000-04-11 2003-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 多価抗体とその用途
BR122018071808B8 (pt) 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
NZ580115A (en) 2004-09-23 2010-10-29 Genentech Inc Cysteine engineered antibody light chains and conjugates
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
CN108578690A (zh) * 2018-05-16 2018-09-28 淮安诺康生物科技有限公司 一种tlr5激活剂用于激活抗原提呈细胞进而增强肿瘤细胞疫苗免疫原性的用途

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