MX2015001407A - Inmunoconjugados y anticuerpos anti-etbr. - Google Patents

Inmunoconjugados y anticuerpos anti-etbr.

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etbr
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Suzanna Clark
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Abstract

La invención proporciona inmunoconjugados y anticuerpos anti-ETBR y métodos para usarlos.

Description

INMUNOCONJUGADOS Y ANTICUERPOS ANTI-ETBR CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-ETBR y métodos para usarlos.
ANTECEDENTES El melanoma es una forma agresiva de cáncer de piel que ha experimentado recientemente un aumento alarmante de la incidencia. A pesar de que pueden lograrse curas con resección quirúrgica de lesiones locales, las etapas avanzadas de melanoma son escasamente sensibles a las actuales terapias aprobadas. La tasa de supervivencia de 5 años para melanoma metastásico en etapa IV es de aproximadamente 10%. Actualmente nuevos enfoques terapéuticos, que incluyen antisentido a Bcl2, anticuerpos a CTLA4, inhibidores de cinasa de molécula pequeña RAF, e inmunoterapia adoptiva, están sometidos a pruebas clínicas para detectar melanoma metastásico. Los resultados de algunos de estos recientes estudios parecen ser alentadores, pero un impacto duradero en la supervivencia general requerirá probablemente combinaciones terapéuticas que incluyen nuevos agentes adicionales.
Más de 20 años atrás, se aisló endotelina-1 (ET-1) de células endoteliales aórticas y se encontró que tenía una potente actividad vasoconstrictora. Los receptores de endotelinas se clonaron poco después y su expresión en varios tipos de células, que incluyen melanocitos y células de melanoma, señaló funciones independientes de su papel en el endotelio. Actualmente se reconoce que el receptor de endotelina B (ETBR, EDNBR) es crítico para la derivación fiel de células melanocíticas que emanan de la cresta neural durante el desarrollo embrionario. Los precursores de melanocitos dependen de la actividad de ETBR para proliferar y migrar del tubo neural a sus destinos finales. Los ratones con codificación de genes defectuosos para ETBR o endotelina-3 (ET-3) exhiben un déficit de pigmentación en su pelaje y una escasez de células ganglionares entéricas, también derivada de la cresta neural. Estas características se parecen mucho a las asociadas con la variante WS4 del síndrome de Waardenburg en humanos, que se atribuyó a mutaciones de línea germinal en ET-3 o ETBR. Una variante adicional de este síndrome, WS2, se mapeó a mutaciones heredables en el factor de transcripción asociado con microftalmia (MITF), un regulador clave del desarrollo de melanocitos y un protooncogén de melanoma.
La fuerte evidencia genética que vincula la actividad de ETBR con el destino de los melanoblastos subraya un papel potencial de este receptor en la evolución del melanoma. Se informó que la expresión del ARNm ETBR y la protelna aumentaban durante la evolución de la enfermedad desde nevos displásicos a melanoma metastásico. El bloqueo de la actividad ETBR por 2 inhibidores de molécula pequeña independientes interfirió con el crecimiento y supervivencia de células de melanoma y xenoinjertos de tumores. Estos estudios preclínicos implican que ETBR es un potencial accionador de la evolución del melanoma.
En la téenica se necesitan agentes que se dirijan a ETBR para el diagnóstico y tratamiento de afecciones asociadas con ETBR, tal como el cáncer. La invención cumple esa necesidad y proporciona otros beneficios.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona inmunoconjugados y anticuerpos anti-ETBR y métodos para usarlos.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ETBR unido de forma covalente a un agente citotóxico, donde el anticuerpo se une a un epítopo en los aminoácidos 64 a 101 de la SEQ ID NO: 10. En algunas modalidades, el agente citotóxico es un derivado de nemorubicina.
En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (i) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, (ii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, y (iii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, y (iii) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende: a) una secuencia VH que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; o b) una secuencia VL que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; o c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b). En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 o la SEQ ID NO: 9. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo IgGl, IgG2a o IgG2b.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ETBR unido de forma covalente a un agente citotóxico, donde el anticuerpo comprende (a) una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, y donde el agente citotóxico es un derivado de nemorubicina.
En algunas modalidades, el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab-(L-D)p, donde: (a) Ab es el anticuerpo; (b) L es un enlazador; (c) D es el agente citotóxico; y (d) p varía de 1-8.
En algunas modalidades, D es un derivado de nemorubicina. En algunas de dichas modalidades, D tiene una estructura que se selecciona de: En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un enlazador que es escindible por una proteasa. En algunas de dichas modalidades, el enlazador comprende un dipéptido val-cit o un dipéptido Phe-homoLys. En algunas modalidades, el inmunoconjugado comprende un enlazador que es lábil al ácido.
En algunas modalidades, el inmunoconjugado tiene una fórmula que se selecciona de donde Ri y R2 se seleccionan independientemente de H y alquilo 0c-06. En algunas modalidades, p varía de 1-3.
En algunas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado, donde el inmunoconjugado tiene una fórmula que se selecciona de: _ - donde Ab es un anticuerpo que comprende (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, (iii) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, (iv) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, (v) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (vi) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17; y donde p varía de l a 8, o l a 7, o l a 6, o la 5, o 1 a 4, o 1 a 3. En algunas de dichas modalidades, el anticuerpo comprende una secuencia VH de la SEQ ID NO: 8 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 6 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 5.
En cualquiera de las modalidades descritas en la presente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo puede ser un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a ETBR. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a ETBR humano. En algunas de dichas modalidades, el ETBR humano tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 10 o la SEQ ID NO: 11.
En algunas de tales modalidades, se proporcionan las formulaciones farmacéuticas, donde la formulación comprende un inmunoconjugado descrito en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la formulación farmacéutica comprende un agente terapéutico adicional.
En algunas modalidades, se proporcionan los métodos para tratar a un individuo que tiene un cáncer positivo para ETBR. En algunas modalidades, un método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado descrito en la presente. En algunas modalidades, el cáncer positivo para ETBR se selecciona de melanoma y mieloma múltiple. En algunas modalidades, el método comprende adicionalmente administrarle al individuo un agente terapéutico adicional. En algunas de dichas modalidades, el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo que se une a PMEL17. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 unido de forma covalente a un agente citotóxico.
En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar a un individuo que tiene cáncer positivo para ETBR, donde el cáncer positivo para ETBR es resistente a un primer agente terapéutico. En algunas modalidades, el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado descrito en la presente. En algunas modalidades, el cáncer positivo para ETBR es melanoma. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no es ETBR. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no es ETBR y un primer agente citotóxico. En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a un antígeno que se selecciona de proteína de melanocitos PMEL17, proteína 1 relacionada con tirosinasa (TYRP1), antígeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4) y glicoproteína NMB (GPNMB). En algunas modalidades, el primer agente terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a ETBR. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a ETBR y un primer agente citotóxico. En algunas modalidades, el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado descrito en la presente son diferentes. En algunas modalidades, el primer agente citotóxico es MMAE.
En algunas modalidades, se proporciona ion método para tratar un individuo con cáncer positivo para ETBR, donde el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un primer inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17. En algunas modalidades, el anticuerpo que se une a PMEL17 comprende un HVR H1 que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 21, una HVR H2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 22, una HVR H3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23, una HVR L1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 24, una HVR L2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25, y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 26. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende un agente citotóxico que se selecciona de una auristatina, una pirrolobenzodiazepina y un derivado de nemorubicina. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende una auristatina o una pirrolobenzodiazepina. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende MMAE. En algunas de dichas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende una parte de enlazador-fármaco que comprende MC-val-cit-PAB-MMAE. En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende un dímero PBD que tiene la estructura: donde la línea ondulada indica la unión a un enlazador.
En algunas modalidades, el segundo inmunoconjugado comprende un enlazador que comprende MC-val-cit-PAB. En cualquiera de las modalidades anteriores, el cáncer positivo para ETBR puede ser melanoma. En algunas modalidades, el cáncer positivo para ETBR es también positivo para PMEL17.
En algunas modalidades, se proporciona un método para inhibir la proliferación de una célula positiva para ETBR. En algunas de dichas modalidades, el método comprende exponer la célula al inmunoconjugado descrito en la presente en condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado a ETBR en la superficie de la célula, inhibiendo así la proliferación de la célula. En algunas modalidades, la célula es una célula de melanoma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa del anticuerpo monoclonal 5E9 de murino (SEQ ID NO: 1) y la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal 5E9 de murino (SEQ ID NO: 3).
La Figura 2 muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa del anticuerpo monoclonal 5E9 de murino (SEQ ID NO: 2) y la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal 5E9 de murino (SEQ ID NO: 4).
La Figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa del anticuerpo hu5E9.vl humanizado (SEQ ID NO: 5) y la cadena ligera variable del anticuerpo hu5E9.vl humanizado (SEQ ID NO: 7).
La Figura 4 muestra las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa del anticuerpo hu5E9.vl humanizado (SEQ ID NO: 6) y la cadena pesada variable del anticuerpo hu5E9.vl humanizado (SEQ ID NO: 8).
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable del anticuerpo humanizado hu5E9.v2 (SEQ ID NO: 9).
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos de un ejemplo de proteína ETBR humana (SEQ ID NO:10) y varias características de la proteína.
La Figura 7A-7D muestra las estructuras de varios conjugados de anticuerpo-fármaco, que incluyen (Fig.7A) Ab-MC-val-cit-PAB-MMAE; (Fig.7B) Ab-MC-acetal-PNU-159682; (Fig.7C) Ab-MC-val-cit-PAB-PNU-159682; y (Fig.7D) Ab-PNU-159682.
La Figura 8A-8B muestra (Fig.8A) el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones inoculados con células de melanoma UACC-257X2.2 y a los que se les administró dosis variables de anti-ETBR-vc-MMAE ( "5E9vl-vcE"), y (Fig.8B) células UACC-257X2.2 parentales y resistentes cultivadas in vitro en presencia de concentraciones crecientes de anti-ETBR-vc-MMAE ADC, tal como se describe en el Ejemplo B.
La Figura 9A-9B muestra la expresión de ETBR (también denominado "EDNRB") en células UACC-257X2.2 parenterales y resistentes derivadas in vivo (Fig.9A) e in vitro (Fig.9B), tal como se describe en el Ejemplo B.
DESCRIPCIÓN DETALLADA I. DEFINICIONES Un "marco humano aceptor" a efectos de la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o de un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano, tal como se define a continuación. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o de un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de este, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas modalidades, la cantidad de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas modalidades, el marco humano aceptor de VL es idéntico en secuencia a la secuencia de marco de inmunoglobulina humana VL o secuencia de marco de consenso humana.
"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ej., un anticuerpo) y su compañero de unión (por ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre los miembros de un par de unión (por ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X con su compañera Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede calcularse usando métodos comunes conocidos en la téenica, que incluyen los descritos en la presente. A continuación se describen ejemplos de modalidades especificas e ilustrativas para calcular la afinidad de unión.
Un anticuerpo de "afinidad madura" hace referencia a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVR), en comparación con un anticuerpo original que no posee tales alteraciones, las cuales tienen como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno.
Los términos "anticuerpo anti-ETBR" y "un anticuerpo que se une a ETBR" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unir ETBR con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a ETBR. En una modalidad, el alcance de la unión de un anticuerpo anti-ETBR a una proteína no-ETBR no relacionada es menor que alrededor de 10% de la unión del anticuerpo a ETBR tal como se calculó, por ej., mediante un radioinmunoensayo (RIA). En determinadas modalidades, un anticuerpo que se une a ETBR tiene una constante de disociación (Kd) de £ ImM, < 100 nM, < 10 nM, , £ 5 Nm, , < 4 nM, , £ 3 nM, , £ 2 nM, £ 1 nM, £ 0.1 nM, £ 0.01 nM, o £ 0.001 nM (por ej., 108 M o menos, por ej. de lO8 M a 1013 M, por ej., de 1CT9 M a 1013 M). En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-ETBR se une a un epítopo de ETBR que se conserva entre ETBR de diferentes especies.
El término "anticuerpo" se usa en la presente en el sentido más amplio y comprende varias estructuras de anticuerpo, que incluyen de modo no taxativo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ej., anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad deseada de unión al antígeno.
Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no es un anticuerpo intacto que comprende una parte de un anticuerpo intacto y que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen de modo no taxativo, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena simple (por ej., scFv),- y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más, y en cambio, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más. En la presente se proporciona un ejemplo de ensayo de competición.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen las condiciones fisiológicas en mamíferos que se caracterizan típicamente por un crecimiento/proliferación celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, de modo no taxativo, melanoma, carcinoma, linfoma (por ej., linfomas de Hodgkin y no Hodgkin), blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer microcítico de pulmón, cáncer no microcítico de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros trastornos linfoproliferativos, y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello.
El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una parte de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Existen cinco clases importantes de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ej., igGi, lgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, g y m, respectivamente.
El término "agente citotóxico" tal como se usa en la presente, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca destrucción o muerte celular. Los agentes citotóxicos incluyen, de modo no taxativo, isótopos radiactivos (por ej., At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ej., metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalán, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de estos, tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, que incluyen fragmentos y/o variantes de estos; y los diversos agentes antitumorales o anticáncer descritos a continuación.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes, tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN ); alquilsulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas, incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL ); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (que incluye el análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR), acetilcamptotecina, scopolectina y 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (que incluyen sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (que incluyen los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos, tales como antibióticos de enediina (por ej., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (véase, por ej., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, que incluye dinemicina A; un esperamicina; así como también cromóforo neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteínas relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (que incluye morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y desoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de drornostañolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; antiadrenales tales como aminoglutatimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diazicuona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mo idanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2 ,2',2 "-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, • F roridina A y anguidma) ; uretano; vindesina (ELDISINE r FILDESIN*); dacarbazina; manomustina; mitobronitol,-mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ej., paclitaxel (TAXOL ; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ libre de Cremofor, formulación de paclitaxel de nanopartículas modificadas con albúmina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y doxetaxel (TAXOTERE ; Rhóne-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucilo; gemcitabina (GEMZAR ); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®),· platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina,-ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina (XELODA®); sales, ácidos farmacéuticamente aceptables o derivados de cualquiera de los anteriores; así como también combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona; CVP, abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, vincristina y prednisolona; y FOLFOX, abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovorina.
Las "funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente de complementos (CDC); unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); fagocitosis; regulación por disminución de receptores de la superficie celular (por ej., receptor de las células B); y activación de las células B.
Una "cantidad eficaz" de un agente, por ej., una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
El término "epítopo" se refiere al sitio particular en una molécula de antígeno a la cual se une un anticuerpo.
El término "región Fe" en la presente se usa para definir una región de extremo C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una parte de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia natural y regiones Fe variantes. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina en el extremo C (Lys447) de la región Fe puede estar presente o no. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante se realiza de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado índice EU, como se describe en Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Marco" o "FR" se refiere a residuos del dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR) o los residuos de la región determinante de complementariedad (CDR). El FR de un dominio variable generalmente consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe tal como se define en la presente.
El término "formas glicosiladas de ETBR" se refiere a formas de ETBR de origen natural que se modifican de forma postraduccional mediante la adición de residuos de carbohidratos.
Los términos "célula hospedadora", "línea de células hospedadoras" y "cultivo de células hospedadoras" se usan de manera intercambiable y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, que incluye la progenie de dichas células. Las células hospedadoras incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula primaria transformada y progenie derivada de esta sin importar la cantidad de pasajes. Es posible que la progenie no sea completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula original, pero puede contener mutaciones. En la presente se incluye progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica examinada o seleccionada en la célula originalmente transformada.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivada de un origen no humano que utiliza repertorios de anticuerpo humano u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente al anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos de origen más común en una selección de secuencias de marco VL o VH de inmunoglobulina humana. Generalmente, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana se realiza a partir de un subgrupo de secuencias de dominio variable. Generalmente, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et ál, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, publicación N1H 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. En una modalidad, para VL, el subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et ál, mencionado anteriormente. En una modalidad, para VH, el subgrupo es un subgrupo III según Kabat et ál, mencionado anteriormente.
Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanos. En determinadas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos un, y típicamente dos, dominios variables, en el cual todas o sustancialmente todas las HVR (por ej., las CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano y todos o sustancialmente todas las FR corresponden a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una parte de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ej., un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.
El término "región hipervariable" o "HVR", tal como se usa en la presente, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos naturales de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3). Las HVR generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDR), siendo la última de más alta variabilidad de secuencia y/o que participa en el reconocimiento de antígeno. Los ejemplos de bucles hipervariables se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (Ll), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987).) Los ejemplos de CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3) se producen en residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de Hl, 50-65 de H2 y 95-102 de H3. (Kabat et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). A excepción de CDR1 en VH, las CDR generalmente comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos determinantes de especificidad" o "SDR", que son residuos que se ponen en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos dentro de regiones de las CDR denominadas CDR abreviadas o a-CDR. Los ejemplos de a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 y 95-102 de H3. (Véase Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se especifique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ej., residuos de FR) se enumeran en la presente de acuerdo con Kabat et ál., mencionado anteriormente.
Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado con una o más moléculas heterólogas, que incluyen de modo no taxativo, un agente citotóxico.
Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, de modo no taxativo, animales domesticados (por ej., vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ej., humanos y primates no humanos, por ej., monos), conejos y roedores (por ej., ratones y ratas). En determinadas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.
Un "anticuerpo aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su entorno natural. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica hasta más del 95 ¾ o el 99 % de pureza como se determina, por ejemplo, por electroforesis (por ej., SDS-PAGE, centrado isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ej., HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos de evaluación de la pureza de un anticuerpo, véase, por ej., Flatman et ál, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
Un "ácido nucleico aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su entorno natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en las células que comúnmente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural. "Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-ETBR" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo (o fragmentos de estas), que incluyen dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en un único vector o vectores separados y dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico presente(s) en una o más ubicaciones en una célula hospedadora.
El término "ETBR," tal como se usa en la presente, se refiere a cualquier ETBR natural de cualquier fuente vertebrada, que incluye mamíferos tales como primates (por ej., seres humanos, mono cynomolgus (cyno)) y roedores (por ej., ratones y ratas), a menos que se especifique lo contrario. El término comprende ETBR "de longitud completa" no procesado, así como cualquier forma de ETBR que resulte del procesamiento en la célula. El término también comprende las variantes de ETBR de origen natural, por ej., variantes de empalme, variantes alélicas e isoformas. La secuencia de aminoácidos de un ejemplo de precursor de ETBR humano (con secuencia de señal) se muestra en la SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos de un ejemplo de precursor de ETBR humano (sin secuencia de señal) se muestra en la SEQ ID NO: 11.
El término "cáncer positivo para ETBR" se refiere a un cáncer que comprende células que expresan ETBR en su superficie.
El término "célula positiva para ETBR" se refiere a una célula que expresa ETBR en su superficie.
El término "anticuerpo monoclonal", tal como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por los anticuerpos variantes posibles, por ej., que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades mínimas. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no se debe interpretar que requiere la producción del anticuerpo a través de ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se utilizarán de acuerdo con la presente invención se pueden hacer a través de diversas téenicas incluso, de modo no taxativo, el método de hibridoma, métodos de ADN recombinantes, métodos de visualización de fagos y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte del locus de la inmunoglobulina humana, dichos métodos y otros métodos ejemplares para realizar anticuerpos monoclonales se describen en la presente.
Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado con un resto heterólogo (por ej., un resto citotóxico) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
"Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG naturales son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por enlace disulfuro. Del extremo N al extremo C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada un dominio variable pesado o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al extremo C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también denominada un dominio variable ligero o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (K) y lambda (l), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
El término "prospecto del envase" se usa para referirse a las instrucciones que se suelen incluir en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referente al uso de dichos productos terapéuticos.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación a efectos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse de varias maneras conocidas por el experto en la téenica, por ejemplo, usando software informático disponible al público, tales como los software BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias comparadas. A efectos de la presente, sin embargo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos se generan usando el programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa informático de comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc. y el código fuente se presentó con documentación del usuario en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde se encuentra registrada con el Registro de Derechos de Autor No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público por Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede compilarse a partir del código fuente. El programa ALIGN-2 debería compilarse para su uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital.
Todos los parámetros de comparación de las secuencias están establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.
En las situaciones en las que se usa ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que se puede escribir alternativamente como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula como se indica a continuación: 100 veces la fracción X/Y donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos marcados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación del programa de A y B, donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A para B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B para A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos usados aquí se obtienen como se describe en el párrafo anterior usando el programa informático ALIGN-2.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que es de forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido allí sea eficaz, y que no contiene ningún componente adicional que sea inaceptablemente tóxico para un sujeto al cual se le administraría la formulación.
Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, diferente de un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, de modo no taxativo, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
Tal como se usa en la presente, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales como "tratar" o "se trata") se refiere a una intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se está tratando y se puede realizar ya sea para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseados del tratamiento incluyen, de modo no taxativo, evitar la aparición o la recurrencia de una enfermedad, aliviar los síntomas, disminuir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, evitar la metástasis, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad y remisión o mejora en el pronóstico. En algunas modalidades, los inmunoconjugados de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o para ralentizar el avance de una enfermedad.
El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que participa en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural tienen generalmente estructuras similares, donde cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ej., Kindt et ál. Kuby Immunology, 6ta ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un único dominio VH o VL puede ser suficiente para lograr especificidad de unión al antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una biblioteca de dominio VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ej ., Portolano et ál., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et ál., Nature 352:624-628 (1991).
El término "vector", tal como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede propagar otro ácido nucleico al cual está unida. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico auto-replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula hospedadora en la cual se ha introducido. Determinados vectores pueden dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están unidos de forma operativa. Dichos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión".
"Alquilo" es hidrocarburo Ci-Ci8 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos. Los ejemplos son metilo (Me, -CH3), etilo (Et, -CH2CH3), 1-propilo (n-Pr, n-propilo, -CH2CH2CH3), 2-propilo (i-Pr, i-propilo, -CH(CH3)2), 1-butilo (n-Bu, n-butilo, CH CH CH CH ) , 2-metil-l-propilo (i-Bu, i-butilo, CH2CH(CH3)2) , 2 -butilo (s-Bu, s-butilo, -CH (CH3) CH2CH3) , 2-metil- 2 -propilo (t-Bu, t-butilo, -C(CH3)3) , 1-pentilo (n-pentilo, -CH2CH2CH2CH2CH3) , 2-pentilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH3) , 3-pentilo ( - CH (CH2CH3) 2) , 2-metil-2-butilo ( -C (CH3) 2CH2CH3) , 3-metil-2-butilo ( -CH (CH3) CH (CH3) 2) , 3-metil-l-butilo (- CH2CH2CH(CH3)2) , 2 -metil-1 -butilo ( -CH2CH (CH3) CH2CH3 ) , 1-hexilo (-CH2CH2CH2CHCH2CH3) , 2-hexilo ( -CH (CH3) CH2CH2CH2CH3) , 3-hexilo (-CH(CH2CH3) (CH2CH2CH3) ) , 2-metil-2-pentilo (-C(CH3)2CH2CH2CH3) , 3-metil-2-pentilo ( -CH (CH3 ) CH (CH3 ) CH2CH3) , 4-metil- 2 -pentilo ( - CH (CH3) CH2CH (CH3) 2) , 3 -metil-3 -pentilo (- C(CH3) (CH2CH3)2) , 2 -metil-3 -pentilo (-CH (CH2CH3) CH (CH3) 2) , 2 , 3 -dimetil-2 -butilo ( -C (CH3) 2CH (CH3) 2) , 3 , 3-dimetil-2-butilo (-CH(CH3)C(CH3)3.
El término "alquilo C1-C3", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Los grupos "alquilo Ci-C8" representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo, -n-hexilo, -n-heptilo, -n-octilo, -n-nonilo y -n-decilo; mientras que los alquilos Cj.-C8 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec-butilo, isobutilo, -tere-butilo, -isopentilo, 2-metilbutilo, los alquilos Ci-C8 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo, -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, -acetilenilo, -propinilo, -1-butinilo, -2-butinilo, -1-pentinilo, -2-pentinilo, -3-metil-l butinilo. Un grupo alquilo Ci-C8 puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos que incluyen, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8 , -O-(alquilo Ci-Cg), -arilo, -C(O)R', -0C(O)R', -C(0)0R', - C(0)NH2 , -C(O)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S03R', S ( O )2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ch-Cg y arilo.
El término "alquilo Ci-C3", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos "alquilo Ci-C6" representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n-propilo, n-butilo, -n-pentilo y -n-hexilo; mientras que los alquilos Ci-C6 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, isopentilo y 2-metilbutilo; los alquilos Cx-C6 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo y -isobutilenilo, -1-pentenilo, -2-pentenilo, -3-metil-1-butenilo, -2-metil-2-butenilo, -2,3-dimetil-2-butenilo, 1-hexilo, 2-hexilo y 3-hexilo. Un grupo alquilo Ci-Cg puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos, tal como se describe anteriormente para el grupo alquilo Cx-C8.
El término "alquilo <2c-C4", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo saturado o insaturado de cadena lineal o ramificada, que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Los grupos "alquilo Cx-C4" representativos incluyen, de modo no taxativo, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo; mientras que los alquilos Cx-C4 ramificados incluyen, de modo no taxativo, -isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, terc-butilo; los alquilos Cx-C4 insaturados incluyen, de modo no taxativo, -vinilo, -alilo, -1-butenilo, -2-butenilo e -isobutilenilo. Un grupo alquilo Cx-C4 puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos, tal como se describe anteriormente para el grupo alquilo Cx-C8.
"Alcoxi" es un grupo alquilo unido individualmente a un oxígeno. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, de modo no taxativo, metoxi (-0CH3) y etoxi (-OCH2CH3). Un "alcoxi Ci-C5" es un grupo alcoxi con 1 a 5 átomos de carbono. Los grupos alcoxi pueden estar no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos, tal como se describe anteriormente para los grupos alquilo.
"Alquenilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace doble sp2, carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo: etileno o vinilo (-CH=CH2), alilo (-CH2CH=CH2), ciclopentenilo (-C5H7) y 5-hexenilo (-CH2 CH2CH2CH2CH=CH2). Un "alquenilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un doble enlace sp2, carbono-carbono.
"Alquinilo" es un hidrocarburo C2-C18 que contiene átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace triple sp, carbono-carbono. Los ejemplos incluyen, de modo no taxativo: acetilénico (-CºCH) y propargilo (-CH2CºCH). Un "alquinilo C2-C8" es un hidrocarburo que contiene de 2 a 8 átomos de carbono normales, secundarios, terciarios o cíclicos con al menos un sitio de insaturación, es decir, un triple enlace sp, carbono-carbono.
"Alquileno" se refiere a un radical de hidrocarburo cíclico o de cadena ramificada o lineal saturada de 1 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alcano original. Los radicales de alquileno típicos incluyen, de modo no taxativo: metileno (-CH2-) 1,2-etilo (-CH2CH2-), 1,3-propilo (-CH2CH2CH2-), 1,4-butilo (-CH2CH2CH2CH2-), y similares.
Un "alquileno C1.-C10" es un grupo de hidrocarburos saturados de cadena recta de la fórmula -(CH2)i-i0-. Los ejemplos de un alquileno Ci-Ci0 incluyen metileno, etileno, propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno y decaleno.
"Alquenileno" se refiere a un radical de hidrocarburo cíclico o de cadena ramificada o lineal saturada de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados de la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alqueno base. Los radicales alquenileno típicos incluyen, de modo no taxativo: 1,2-etileno (-CH=CH-).
"Alquinileno" se refiere a un radical de hidrocarburo cíclico o de cadena ramificada o lineal saturada de 2 a 18 átomos de carbono y que tiene dos centros radicales monovalentes derivados por la eliminación de dos átomos de hidrógeno del mismo átomo de carbono o de dos átomos de carbono diferentes de un alquino original. Radicales alquinileno típicos incluyen, de modo no taxativo, acetileno (-C—C—), propargilo (-CH2CºC-) y 4-pentinilo (-CH2CH2CH2CºC-).
"Arilo" se refiere a un grupo aromático carbocíclico. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo aromático carbocíclico o un grupo aromático heterocíclico puede estar no sustituido o sustituido con uno o más grupos que incluyen, de modo no taxativo, alquilo -Cx-C8, -O-(alquilo Ci-C8), -arilo, -C(O)R', -0C(O)R', -C(O)0R', -C(0)NH2 , -C(0)NHR', - C(0)N(R')2 -NHC(0)R', -S(O)2R', -S(O)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
Un "arilo C5-C20" es un grupo arilo de 5 a 20 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo C5-C20 incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-C20 puede estar sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo. Un "arilo C5-C14" es un grupo arilo de 5 a 14 átomos de carbono en los anillos aromáticos carbocíclicos. Los ejemplos de grupos arilo C5-Ci4 incluyen, de modo no taxativo, fenilo, naftilo y antracenilo. Un grupo arilo C5-Ci4 puede estar sustituido o no sustituido como se describió anteriormente para los grupos arilo.
Un "arileno" es un grupo arilo que tiene dos enlaces covalentes y puede estar en las configuraciones orto, meta o para como se muestra en las siguientes estructuras: en las cuales el grupo fenilo puede estar no sustituido o sustituido con hasta cuatro grupos que incluye, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8, -O-(alquilo Ci-C8), -arilo, -C(O)R', -0C(O)R', -C (0)0R', -C(O)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2 NHC(0)R', -S(O)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, - NH(R'), -N(R')2 y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
"Arilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono del extremo o sp3, se remplaza con un radical arilo. Los grupos arilalquilo típicos incluyen, de modo no taxativo, bencilo, 2-feniletan-1-ilo, 2-fenileten-1-ilo, naftilmetilo, 2-naftiletan-l-ilo, 2-naftileten-l-ilo, naftobencilo, 2-naftofeniletan-l-ilo y similares. El grupo arilalquilo comprende de 6 a 20 átomos de carbono, por ejemplo, el resto alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo arilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y la porción arilo es de 5 a 14 átomos de carbono.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical alquilo acíclico en el cual uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal sp3, es remplazado por un radical heteroarilo. Los grupos heteroarilalquilo típicos incluyen, de modo no taxativo, 2-bencimidazolilmetilo, 2-furiletilo y similares. Los grupos heteroarilalquilo comprenden de 6 a 20 átomos de carbono, por ej., el resto alquilo, incluso los grupos alcanilo, alquenilo o alquinilo, del grupo heteroarilalquilo es de 1 a 6 átomos de carbono y el resto heteroarilo es de 5 a 14 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan de N, O, P y S. El resto heteroarilo del grupo heteroarilalquilo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan de N, O, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
"Alquilo sustituido", "arilo sustituido" y "arilalquilo sustituido" significan alquilo, arilo y arilalquilo respectivamente, en los cuales uno o más átomos de hidrógeno se remplazan independientemente por un sustituyente. Los sustituyentes típicos incluyen, de modo no taxativo, -X, -R, -0, -0R, -SR, -S, -NR2, -NR3, =NR, -CX3f -CN, -OCN, -SCN, -N=C=0, -NCS, -NO, -NO2, =N2, -N3, NC(=0)R, -C(=0)R, -C(=0)NR2, -S03, -S03H, -S(=0)2R, 0S(=0)20R, -S(=0)2NR, -S(=0)R, -0P(=0)(0R)2 -P(=0)(0R)a, -PO 3, -PO3H2, -C(=0)R, -C(=0)X, -C(=S)R, -CO2R, -C02 , -C(=S)OR, -C(=0)SR, -C(=S)SR, -C(=0)NR2, -C(=S)NR2, -C(=NR)N R2, donde cada X es independientemente un halógeno: F, Cl, Br, o í; y cada R es independientemente -H, alquilo C2-Ci8, arilo C6-C20, heterociclo C3-Ci4, grupo protector o resto de profármaco. Los grupos alquileno, alquenileno y alquinileno como se describió anteriormente también se pueden sustituir de manera similar.
"Heteroarilo" y "heterociclo" se refieren a un sistema de anillos en los cuales uno o más átomos de los anillos son un heteroátomo, por ej., nitrógeno, oxígeno y azufre. El radical heterociclo comprende de 3 a 20 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan de N, O, P y S. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros del anillo (de 2 a 6 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan de N, O, P y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros del anillo (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 3 heteroátomos que se seleccionan de N, 0, P y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6].
Los ejemplos de heterociclos se describen, por ej., en Paquette, Leo A., "Principies of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamín, Nueva York, 1968), particularmente en los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7 y 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wilcy & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566.
Los ejemplos de heterociclos incluyen a modo de ejemplo y de modo no taxativo, piridilo, dihidroipiridilo, tetrahidropiridilo (piperidilo), tiazolilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo azufre oxidado, pirimidinilo, furanilo, tienilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tetrazolilo, benzofuranilo, tianaftalenilo, indolilo, indolenilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, piperidinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, 2-pirrolidonilo, pirrolinilo, tetrahidrofuranilo, bis-tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, bis-tetrahidropiranilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, decahidroquinolinilo, octahidroisoquinolinilo, azocinilo, triazinilo. 6H-1,2,5-tiadiazinilo, 2H,6H-1,5,2-ditiazinilo, tienilo, tiantrenilo, piranilo, isobenzofuranilo, cromenilo, xantenilo, fenoxatinilo, 2H-pirrolilo, isotiazolilo, isoxazolilo, pirazinilo, piridazinilo, indolizinilo, isoindolilo, 3H-indolilo, IH-indazolilo, purinilo, 4H-quinolizinilo, ftalazinilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, 4aH-carbazolilo, carbazolilo, b-carbolinilo, fenantridinilo, acridinilo, pirimidinilo, fenantrolinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, furazanilo, fenoxazinilo, isocromanilo, cromanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, indolinilo, isoindolinilo, quinuclidinilo, morfolinilo, oxazolidinilo, benzotriazolilo, bencisoxazolilo, oxindolilo, benzoxazolinilo e isatinoilo.
A modo de ejemplo y de forma no taxativa, los heterociclos unidos por carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5 o 6 de una piridina, la posición 3, 4, 5 o 6 de una piridazina, la posición 2, 4, 5 o 6 de una pirimidina, la posición 2, 3, 5 o 6 de una pirazina, la posición 2, 3, 4 o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, la posición 2, 4 o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, la posición 3, 4 o 5 de un isoxazol, pirazol o isotiazol, la posición 2 o 3 de una aziridina, la posición 2, 3 o 4 de una azetidina, la posición 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una quinolina o la posición 1, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de una isoquinolina. Aun más típicamente, los heterociclos unidos por carbono incluyen 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 5-piridilo, 6-piridilo, 3-piridazinilo, 4-piridazinilo, 5-piridazinilo, 6-piridazinilo, 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo, 6-pirimidinilo, 2-pirazinilo, 3-pirazinilo, 5-pirazinilo, 6-pirazinilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo o 5-tiazolilo.
A modo de ejemplo y no taxativamente, los heterociclos unidos por nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, IH-indazol, la posición 2 de un isoindol o isoindolina, la posición 4 de una morfolina y la posición 9 de un carbazol o b-carbolina. Aun más típicamente, los heterociclos unidos por nitrógeno incluyen 1-aziridilo, 1-azetedilo, 1-pirrolilo, 1-imidazolilo, 1-pirazolilo y 1-piperidinilo.
Un "heterociclo c3-C8" se refiere a un carbociclo C3-C8 aromático o no aromático en el cual de uno a cuatro átomos de carbono del anillo se remplazan independientemente por un heteroátomo del grupo que consiste en O, S y N. Ejemplos representativos de un heterociclo C3-C8 incluyen, de modo no taxativo, benzofuranilo, benzotiofeno, indolilo, benzopirazolilo, coumarinilo, isoquinolinilo, pirrolilo, tiofenilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, quinolinilo, pirimidinilo, piridinilo, piridonilo, pirazinilo, piridazinilo, isotiazolilo, isoxazolilo y tetrazolilo. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con hasta siete grupos incluso, de modo no taxativo, alquilo -Ci-C8, -O-(alquilo -Ci-C8), -arilo, -C(0)R', -0C(0)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(0)N(R')a NHC(O)R', -S(O)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo -Ci-C8 y arilo.
"Heterociclo C3-C8" se refiere a un grupo heterociclo C3-C8 definido anteriormente en donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo heterociclo se remplaza por un enlace. Un heterociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con hasta seis grupos incluso, de modo no taxativo, -alquilo Ci- C8, -O-(alquilo C-Ce), -arilo, -C(O)R', -0C(O)R', -C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR', -C(0)N(R')2-NHC(0)R', -S(O)2R', -S(O)R', - OH, -halógeno, -N3, -NH2, -NH(R'), -N(R')2 y -CN; en donde cada R' se selecciona independientemente de H, alquilo 0c-08 y arilo.
"Carbociclo" significa un anillo saturado o insaturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono como un monociclo o de 7 a 12 átomos de carbono como un biciclo. Los carbociclos monocíclicos tienen de 3 a 6 átomos del anillo, aún más típicamente 5 o 6 átomos del anillo. Los carbociclos bicíclicos tienen de 7 a 12 átomos del anillo, por ej., dispuestos como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6] o [6,6] o 9 o 10 átomos del anillo dispuestos como un sistema biciclo [5,6] o [6,6]. Ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, l-ciclopent-2-enilo, l-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-l-enilo, l-ciclohex-2-enilo, l-ciclohex-3-enilo, cicloheptilo y ciclooctilo.
Un "carbociclo C3-C8" es un anillo carbocíclico no aromático saturado o insaturado de 3, 4, 5, 6, 7 u 8 miembros. Los carbociclos C3-C8 representativos incluyen, de modo no taxativo, -ciclopropilo, -ciclobutilo, -ciclopentilo, -ciclopentadienilo, -ciclohexilo, -ciclohexenilo, -1,3-ciclohexadienilo, -1,4-ciclohexadienilo, -cicloheptilo, -1,3-cicloheptadienilo, -1,3,5-cicloheptatrienilo, -ciclooctilo y -ciclooctadienilo. Un grupo carbociclo C3-C8 puede ser no sustituido o sustituido con uno o más grupos incluyendo, de modo no taxativo, -alquilo Ci-C8 -O-(alquilo Ci-C8), -arilo, -C(O)R', -OC(0)R', -C(O)OR', -C(O)NH2, -C(O)NHR', -C(0)N(R')2 -NHC(O)R', -S(O)2R', -S(0)R', -OH, -halógeno, -N3 , -NH, -NH(R'), -N(R') 2 Y -CN; donde cada R' se selecciona independientemente de H, -alquilo Ci-C8 y arilo.
Un "carbociclo C3-C8" se refiere a un grupo carbociclo C3-C8 definido anteriormente donde uno de los átomos de hidrógeno del grupo carbociclo está remplazado por un enlace.
"Enlazador" se refiere a un resto químico que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que une covalentemente un anticuerpo a un resto de fármaco. En diversas modalidades, los enlazadores incluyen un radical divalente tal como un alquildiilo, un arildiilo, un heteroarildiilo, restos tales como: -(CR2)nO(CR2)n-, unidades de repetición de alquiloxi (por ej., polietilenoxi, PEG, polimetilenoxi) y alquilamino (por ej., polietilenamino, Jeffamine™); y éster diácido y amidas incluyendo succinato, succinamida, diglicolato, malonato y caproamida. En diversas modalidades, los enlazadores pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos, tales como valina, fenilalanina, lisina y homolisina.
El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no superponerse al compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" hace referencia a moléculas que son superponibles a su compañero de imagen especular.
El término "estereoisómeros" se refiere a compuestos que tienen una constitución química idéntica, pero difieren en cuanto a la disposición de los átomos o grupos en el espacio.
"Diastereómero" se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, por ej., puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales y reactividades. Las mezclas de diastereómeros se pueden separar en procedimientos analíticos de alta resolución tales como electroforesis y cromatografía.
"Enantiómeros" se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones y convenciones estereoquímicas utilizadas en la presente siguen en general a S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York y Eliel, E. y Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wilcy & Sons, Inc., Nueva York. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de girar el plano de la luz polarizada plana. En la descripción de un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S se utilizan para denotar la configuración absoluta de la molecula alrededor de su centro o centros quirales. Los prefijos d y l o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación de luz polarizada plana por el compuesto, donde (-) o 1 significa que el compuesto es levógiro. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dexógiro.
Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos, con la excepción de que son imágenes especulares entre sí. También se puede hacer referencia a un estereoisómero específico como un enantiómero y una mezcla de tales isómeros a menudo se denomina mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica o racemato, que puede ocurrir donde no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos "mezcla racémica" y "racemato" hacen referencia a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, sin actividad óptica.
"Grupo saliente" se refiere a un grupo funcional que puede estar sustituido por otro grupo funcional. Determinados grupos salientes se conocen en la téenica y los ejemplos incluyen, de modo no taxativo, un haluro (por ej., cloruro, bromuro, yoduro), metansulfonilo (mesilo), p-toluensulfonilo (tosilo), trifluorometilsulfonilo (triflato) y trifluorometilsulfonato.
El término "grupo protector" se refiere a un sustituyente que comúnmente se emplea para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras hace reaccionar otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo protector de amino" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen, de modo no taxativo, acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para ver una descripción general de grupos protectores y su uso, véase T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wilcy & Sons, Nueva York, 1991, o una edición posterior.
II. COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en anticuerpos que se unen a ETBR e inmunoconjugados que comprenden dichos anticuerpos. Los anticuerpos e inmunoconjugados de la invención son útiles, por ejemplo, para el diagnóstico o tratamiento de cánceres positivos para ETBR.
?. Ejemplos de anticuerpos Anti-ETBR En algunas modalidades, se proporcionan anticuerpos aislados que se unen a ETBR. ETBR es un receptor acoplado a proteína G expresado en melanocitos.
Un ejemplo de secuencia precursora de ETBR humana de origen natural, con secuencia de señal (aminoácidos 1 a 26) se proporciona en la SEQ ID NO: 10 y la secuencia de ETBR madura correspondiente se muestra en la SEQ ID NO: 11 (correspondiente a los aminoácidos 27 a 442 de la SEQ ID NO: 10).
En determinadas modalidades, un anticuerpo anti-ETBR se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 64 a 101 de la SEQ ID NO: 10. Los ejemplos no taxativos de dichos anticuerpos incluyen 5E9 y versiones humanizadas de este. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-ETBR se une a ETBR humano. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-ETBR se une a ETBR humano y ETBR de mono cynomolgus.
En algunas modalidades, un anticuerpo anti-ETBR se une a ETBR humano con una afinidad de £ 10 nM, o £ 7 nM, o £ 6 nM, o £ 5 nM o £ 4 nM y opcionalmente ³ 0.0001 nM, o ³ 0.001 nM o ³ 0.01 nM. Ejemplos no taxativos de dichos anticuerpos incluyen mu5E9 y hu5E9.vl, que se unen a ETBR humano con una afinidad de 5 nM y 3.7 nM, respectivamente.
Ensayos Para determinar si un anticuerpo anti-ETBR "se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 64 a 101 de la SEQ ID NO: 10," los polipéptidos ETBR con eliminaciones en los extremos N y C se expresan en células de mamíferos (tales como células CHO o células 293) y la unión del anticuerpo a los polipéptidos truncados se evalúa mediante FACS. Una reducción significativa (reducción ³ 70%) o eliminación de la unión del anticuerpo a un polipéptido truncado con respecto a la unión al ETBR de longitud completa expresado en células indica que el anticuerpo no se une a ese polipéptido truncado. De manera alternativa, en algunas modalidades, si un anticuerpo anti-ETBR "se una a un epítopo dentro de los aminoácidos 64 a 101 de SEQ ID NO: 10" se determina usando un ensayo ELISA. Una reducción significativa (reducción ³ 70%) o eliminación de la unión del anticuerpo a un polipéptido truncado con respecto a la unión a una parte más larga de ETBR, tal como el dominio extracelular, indica que el anticuerpo no se une a ese polipéptido truncado.
Se puede determinar si un anticuerpo anti-ETBR "se une con una afinidad de" £ 10 nM, o £ 7 nM, o £ 6 nM, o £ 5 nM, o £ 4 nM, mediante el uso de células de mamíferos (tales como células CHO o células 293) que expresan ETBR en la superficie en un ensayo de competición utilizando un anticuerpo anti-ETBR no etiquetado y diluido serialmente. La afinidad de unión, KD, de los anticuerpos se puede determinar de acuerdo con análisis Scatchard estándar realizados utilizando un programa de ajuste de curva no lineal (véase, por ejemplo, Munson et ál., Anal Biochem, 107: 220-239, 1980). En algunas modalidades, se puede determinar si un anticuerpo anti-ETBR "se une con una afinidad de" £ 10 nM, o £ 7 nM, o £ 6 nM, o £ 5 nM, o £ 4 nM, mediante el uso de resonancia de plasmones superficiales, tal como ensayo Biacore™ a o ensayo de exclusión cinética (KinExA®, Sapidyne Instruments, Boise, ID).
Anticuerpo 5E9 y otras modalidades En algunas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo anti-ETBR o inmunoconjugado que comprende al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVR que se seleccionan de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH que se seleccionan de (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En una modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14. En otra modalidad, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. En una modalidad adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL que se seleccionan de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL que se seleccionan de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En una modalidad, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: En otro aspecto, un anticuerpo de la invención o inmunoconjugado comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH que se seleccionan de (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 14; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL que se seleccionan de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En otro aspecto, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VH que se seleccionan de (i) HVR-H1 que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de la SEQ ID NO: 14; y (b) un dominio VL que comprende al menos una, al menos dos o las tres secuencias de HVR de VL que se seleccionan de (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En cualquiera de las modalidades que anteceden, un anticuerpo anti-ETBR es humanizado. En una modalidad, un anticuerpo anti-ETBR comprende HVR como en cualquiera de las modalidades que anteceden, y comprende adicionalmente un marco aceptor humano, por ejemplo un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. En determinadas modalidades, el marco aceptor humano es el marco VL kappa 1 (VLKi) humano y/o el marco VHm de VH. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-ETBR comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17. En algunas modalidades, un anticuerpo humanizado anti-ETBR comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 12; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: En otro aspecto, un anticuerpo anti-ETBR comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada (VH) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 8. En determinadas modalidades, una secuencia de VH que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-ETBR que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a ETBR. En determinadas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 8. En determinadas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEQ ID NO: 8. En determinadas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en regiones que se encuentran fuera de las HVR (es decir, en las FR).
Opcionalmente, el anticuerpo anti-ETBR comprende una secuencia de VH que se selecciona de la SEQ ID NO: 4, 8 y 9, incluyendo modificaciones postraduccionales de esa secuencia. En una modalidad particular, la VH comprende una, dos o tres HVR que se seleccionan de: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
En algunas modalidades, se proporciona un anticuerpo anti-ETBR, donde el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 7. En determinadas modalidades, una secuencia de VL que tiene al menos un 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 contiene sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras), inserciones o eliminaciones con respecto a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-ETBR que comprende esa secuencia conserva la capacidad de unirse a ETBR. En determinadas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 10 aminoácidos en la SEQ ID NO: 7. En determinadas modalidades, se sustituyó, insertó y/o eliminó un total de 1 a 5 aminoácidos en la SEQ ID NO: 7. En determinadas modalidades, las sustituciones, inserciones o eliminaciones suceden en las regiones fuera de las HVR (es decir, en las FR). Opcionalmente, el anticuerpo anti-ETBR comprende la secuencia de VL de la SEQ ID No.: 3 o la SEQ ID NO: 7, que incluye las modificaciones postraduccionales de esta secuencia. En una modalidad particular, la VL comprende una, dos o tres HVR que se seleccionan de (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-ETBR, donde el anticuerpo comprende una VH como en cualquiera de las modalidades que se proporcionan anteriormente y una VL como en cualquiera de las modalidades que se proporcionan anteriormente. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEQ ID NO: 8 y en la SEQ ID NO: 7, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL en la SEQ ID NO: 9 y en la SEQ ID NO: 7, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera en la SEQ ID NO: 6 y en la SEQ ID NO: 5, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera en la SEQ ID NO: 6 y en la SEQ ID NO: 18, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera en la SEQ ID NO: 19 y en la SEQ ID NO: 5, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende las secuencias de cadena pesada y de cadena ligera en la SEQ ID NO: 20 y en la SEQ ID NO: 5, respectivamente, que incluye las modificaciones postraduccionales de esas secuencias.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-ETBR que se proporciona en la presente. Por ejemplo, en determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo o inmunoconjugado que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-ETBR que comprende una secuencia de VH de la SEQ ID NO: 8 y una secuencia VL de la SEQ ID NO: 7. En determinadas modalidades, se proporciona un anticuerpo que se une a un epítopo de la SEQ ID NO: 10 desde, dentro de, o que se superpone a los aminoácidos 64 a 101.
En un aspecto adicional de la invención, un anticuerpo anti-ETBR de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-ETBR es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento de Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo o F(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo considerablemente de longitud completa, por ejemplo, un anticuerpo IgGl u otra clase o isótopo de anticuerpo tal como se define en la presente.
En cualquiera de los inmunoconjugados descritos anteriormente, el anticuerpo puede conjugarse a un resto de fármaco. En algunas modalidades, el anticuerpo se conjuga a un agente citotóxico. En algunas de estas modalidades, el agente citotóxico es una derivado de nemorubicina, tal como PNU-159682. Varios ejemplos no taxativos de dímeros de nemorubicina se discuten en la presente.
En un aspecto adicional, un anticuerpo o inmunoconjugado anti-ETBR de acuerdo con cualquiera de las modalidades que anteceden puede incorporar cualquiera de las características, solas o combinadas, tal como se describe en las Secciones 1-7 más adelante. 1. Afinidad de anticuerpos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 mM, £ 100 nM, £ 10 nM, < 1 nM, £ 0.1 nM, £ 0.01 nM, o £ 0.001 nM, y opcionalmente es ³ 1013 M, (por ejemplo, 108 M o menos, por ejemplo, de 108 M a 1013M, por ejemplo, de 10~sM a 1013 M).
En una modalidad, la Kd se mide mediante un ensayo de unión de antígenos radiomarcados (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión de una solución de Fabs con un antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de un antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de un antígeno no marcado, capturando luego al antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpos anti-Fab (véase, por ejemplo, Chen et ál., J. Mol . Biol . 293:865-881(1999). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de múltiples pocilios MICROTITER* (Thermo Scientific) durante la noche con 5 mg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6), y luego se bloquean con albúmina de suero bovino al 2% (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de antígeno
[1251] se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistentes con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et ál., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba a continuación durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período de tiempo mayor (por ejemplo, alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para la incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 (TWEEN-20) al 0.1% en PBS. Cuando se hayan secado las placas, se añaden 150 ml/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard, y se cuentan las placas en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que producen menos o el equivalente de 20% de la unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva.
Según otra modalidad, la Kd se mide utilizando ensayos de resonancia de plasmones superficiales utilizando un BIACORE*-2000 o un BIACORE *-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) con clorhidrato de (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8, a 5 mg/l (-0.2 mM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto para conseguir aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Tras la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cineticas, se inyectaron diluciones en serie dos veces de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™)(PBST) al 0.05% a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 ml/min. Las velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (kCff) se calculan utilizando un modelo de unión simple de Langmuir uno a uno ((BIACORE Evaluation Software versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación koff/kon. Véase, por ejemplo, Chen et ál., J. Mol . Biol . 293:865-881 (1999). Si la velocidad de asociación supera 106 M1 s1 mediante el ensayo de resonancia de plasmones superficiales que antecede, entonces la velocidad de asociación se puede determinar usando una téenica de desactivación fluorescente que mide el aumento o disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones en aumento de antígeno como se midió en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo interrumpido (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro de 8000 series SLM-AMINCO ™ (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación. 2. Fragmentos de anticuemos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, de modo no taxativo, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 Fv y scFv, y otros fragmentos que se describen más adelante. Para tener una reseña sobre determinados fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et ál. Nat . Med. 9:129-134 (2003). Para tener una reseña sobre fragmentos scFv, véase, por ej., Pluckthün en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185 y patente estadounidense Nos.5,571,894 y 5,587,458. Para obtener una discusión sobre fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopo de unión del receptor de salvamento y que tienen una semivida aumentada in vivo, véase la patente estadounidense No.5,869,046.
Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et ál., Nat . Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos se describen también en Hudson et ál., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden todo o una parte del dominio variable de cadena pesada o todo o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase, por ej., patente estadounidense No. 6,248,516 Bl).
Los fragmentos de anticuerpos pueden elaborarse mediante varias téenicas, incluyendo, de modo no taxativo, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como también la producción mediante células hospedadoras recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), tal como se describe en la presente. 3. Anticuerpos quiméricos y humanizados En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo quimérico. Se describen ciertos anticuerpos quiméricos en, por ejemplo, en la patente estadounidense No.4,816,567; y en Morrison et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con conmutación de clase" en el que la clase o subclase ya no es aquella del anticuerpo original. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmentos de unión a antígenos de estos.
En determinadas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Normalmente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir la inmunogenicidad en humanos, mientras que mantiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano original. Generalmente, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los que las HVR, por ejemplo, las CDR, (o partes de estas) derivan de un anticuerpo no humano y las FR (o partes de estas) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado también comprenderá, opcionalmente, al menos una parte de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual derivan los residuos de las HVR), por ejemplo, para reparar o mejorar la especificidad o afinidad de un anticuerpo.
Los anticuerpos humanizados y los métodos para elaborarlos se resumen en, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008), y se describen más detalladamente en, por ejemplo, Riechmann et ál., Nature 332:323-329 (1988); Queen et ál., Proc . Nat 'l Acad. Sci . USA 86:10029-10033 (1989); patentes estadounidenses No. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 y 7,087,409; Kashmiri et ál . , Methods 36:25-34 (2005) (que describe el transplante de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol . Inmuno 1. 28:489-498 (1991) (que describe el " resur f acing" ) ; Dall'Acqua et ál., Methods 36:43-60 (2005) (que describe la "mezcla de FR"); y Osbourn et ál., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et ál., Br . J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque de "selección orientada" para mezclar FR).
Las regiones marco humanas que pueden utilizarse para la humanización incluyen, pero de modo no taxativo: regiones marco seleccionadas utilizando el método de "ajuste óptimo" (véase, por ejemplo, Sims et ál. J. Immunol. 151:2296 (1993)); las regiones marco derivadas de una secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena pesada o ligera (véase, por ejemplo, Cárter et ál. Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:4285 (1992); y Presta et ál. J. Immunol ., 151:2623 (1993)); regiones marco humanas maduras (mutadas de forma somática) o regiones marco de línea germinal humanas (véase, por ejemplo, Almagro y Fransson, Front . Biosci . 13:1619-1633 (2008)); y regiones marco derivadas del cribado de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et ál., J. Biol . Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et ál., J. Biol . Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos humanos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas téenicas conocidas en la técnica. En términos generales, se describen los anticuerpos humanos en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Phar acol . 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin . Inmuno 1.20:450-459 (2008).
Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos intactos humanos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta a una prueba de antígenos. Tales animales contienen, normalmente, todo o parte de locus de inmunoglobulina humana, los cuales remplazan los locus de inmunoglobulina endógena o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente a los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos, en general, se han desactivado los locus de inmunoglobulina endógena. Por resúmenes de métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase Lonberg, Na t . Biotech. 23:1117-1125 (2005). Véase también, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 6,075,181 y 6,150,584 que describen la teenología XENOMOUSE™; la patente estadounidense No. 5,770,429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente estadounidense No.7,041,870 que describe la tecnología K-M MOUSE® y la solicitud de patente estadounidense No. US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden modificarse de forma adicional mediante, por ejemplo, una combinación con una región constante humana diferente. anticuerpos humanos pueden obtenerse también mediante métodos basados en hibridomas. Se describieron las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma humano/ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Iimunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et ál., Monoclonal Antibody Production Techniqu.es and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et ál., J. Immunol., 147: 86 (1991).) También se describen anticuerpos humanos generados mediante teenología de hibridoma de células B humanas en Li et ál., Proc. Nati . Acad. Sci . USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen aquellos descritos en, por ejemplo, la patente estadounidense No. 7,189,826 (que describe la producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano/humano). También se describe la tecnología de hibridoma humano (tecnología de trioma) en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
Los anticuerpos humanos pueden generarse también mediante el aislamiento de las secuencias de dominio variable del clon de Fv seleccionadas de bibliotecas de exhibición de fagos derivados de humanos. Tales secuencias de dominios variables pueden luego combinarse con un dominio constante humano deseado. Las téenicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos derivados de bibliotecas Se puede aislar los anticuerpos al explorar bibliotecas combinatorias en busca de anticuerpos con la actividad o actividades deseadas. Por ejemplo, se conoce en la técnica una variedad de métodos para generar bibliotecas de exhibición de fagos y explorar tales bibliotecas en busca de anticuerpos que posean las características de unión deseadas. Se puede encontrar una reseña de tales métodos en, por ejemplo, Hoogenboom et ál. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y descritos en más detalle en, por ejemplo, McCafferty et ál., Nature 348:552-554; Clackson et ál., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et ál., J. Mol . Biol . 222: 581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et ál., J.
Mol . Biol . 338(2): 299-310 (2004); Lee et ál., J. Mol . Biol . 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nati . Acad. Sci .
USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et ál., J. Immunol .
Methods 284(1-2): 119-132(2004).
En ciertos métodos de exhibición de fagos, se clonan los repertorios de genes de VH y VL por separado mediante reacción en cadena de la polierasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos que pueden explorarse luego en busca de fagos de unión a antígenos tal como se describe en Winter et ál., Ann. Rev. Immunol . , 12: 433-455 (1994). Típicamente los fagos presentan fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos de cadena simple de Fv (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas para fuentes inmunizadas proporcionan al inmunógeno anticuerpos de alta afinidad sin que sea necesaria la construcción de hibridomas. De manera alternativa, el repertorio sin inmunización puede clonarse (por ejemplo, de un humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos a una amplia gama de xenoantígenos y autoantígenos sin ningún tipo de inmunización tal como se describe en Griffiths et ál., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas sin inmunización también se pueden elaborar de forma sintética clonando segmentos génicos V sin reorganización de células madre, y utilizando cebadores PCR que contienen secuencias aleatorias para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reorganización in vitro, tal como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol . Biol . , 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: la patente estadounidense No.5,750,373, y las publicaciones de patentes estadounidenses No.2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de bibliotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos de la presente. 6. Anticuerpos multiespecíficos En determinadas modalidades, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para al menos dos sitios diferentes. En determinadas modalidades, una de las especificidades de unión es para ETBR y la otra es para cualquier otro antígeno. En determinadas modalidades, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de ETBR. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse para localizar agentes citotóxicos a células que expresan ETBR. Los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.
Las téenicas para generar anticuerpos multiespecíficos incluyen, pero de modo no taxativo, la coexpresión recombinante de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et ál., EMBO J. 10: 3655 (1991)), y ensamblaje "botón en ojal" (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5,731,168). Los anticuerpos multiespecíficos también pueden generarse al diseñar efectos de direccionamiento electroestático para crear moléculas heterodiméricas de Fe de anticuerpos (WO 2009/089004A1); reticular dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No.4,676,980, y Brennan et ál., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (véase, por ejemplo, Kostelny et ál., J. Iimunol . , 148(5):1547-1553 (1992)); utilizando tecnología de "diacuerpo" para generar fragmentos de anticuerpo biespecíficos (véase, por ejemplo, Hollinger et ál., Proc . Nati . Acad. Scí . EUA, 90:6444-6448 (1993)); y utilizando dímeros Fv de cadena simple (sFv) (véase, por ejemplo, Gruber et ál., J. Immunol . , 152:5368 (1994)); y preparando anticuerpos triespecífíeos tal como se describe en, por ejemplo, Tutt et ál. J. Immunol . 147: 60 (1991).
También se incluyen en la presente anticuerpos modificados genéticamente con tres o más sitios de unión a antígenos funcionales, que incluyen los "anticuerpos pulpo," (véase, por ejemplo, US 2006/0025576A1).
El anticuerpo o fragmento descrito en la presente incluye también un "FAb de doble acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a ETBR así como otro antígeno diferente (véase, por ejemplo, US 2008/0069820). 7. Variantes de anticuerpos En determinadas modalidades, se contemplan las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, puede que sea deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo se pueden preparar al introducir modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica al anticuerpo o mediante síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, eliminaciones de residuos y/o inserciones en estos y/o sustituciones de estos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígenos.
A) Variantes de sustitución, inserción y eliminación En determinadas modalidades, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis sustitucional incluyen las HVR y las FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 con el título "sustituciones preferidas". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 con el título "ejemplos de sustituciones," y tal como se describe más adelante con respecto a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo de interés y analizar los productos para una actividad deseada, por ejemplo, mantenimiento/mejora de unión a antígenos, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejorados .
TABLA 1 Se pueden agrupar los aminoácidos de acuerdo con propiedades comunes de cadena lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro; (6 ) aromático: Trp, Tyr, Phe .
Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.
Un tipo de variante sustitucional implica la sustitución de uno o más residuos de regiones hipervariables de un anticuerpo original (por ej., un anticuerpo humano o humanizado). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para estudios más detallados tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en determinadas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad aumentada, inmunogenicidad disminuida) en comparación con el anticuerpo original y/o mantendrán sustancialmente determinadas propiedades biológicas del anticuerpo original. Un ejemplo de variante sustitucional es un anticuerpo madurado por afinidad, el cual puede generarse de manera conveniente, por ejemplo, mediante el uso de téenicas de maduración por afinidad basada en la exhibición de fagos tales como aquellas que se describen en la presente. Brevemente, se mutan uno o más residuos de HVR y se exhiben los anticuerpos variantes en fagos y se realiza un análisis en busca de una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de unión).
Se pueden generar alteraciones (por ejemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo, para mejorar la afinidad de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" de HVR es decir, residuos codificados por codones que sufren una mutación en una frecuencia alta durante el proceso de mutación somática (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol . Biol . 207:179-196 (2008)), y/o SDR (a-CDR), donde se prueba la afinidad de unión de la variante de VH o VL resultante. Se describe la maduración por afinidad mediante la construcción y reselección de bibliotecas secundarias en, por ejemplo, Hoogenboom et ál. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et ál., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) En algunas modalidades de la maduración por afinidad, se introduce la diversidad en los genes variables elegidos para maduración mediante cualesquiera variados métodos (por ejemplo, PCR susceptible a errores, mezcla de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos). Luego se crea una segunda biblioteca. Luego se examina la biblioteca para identificar cualesquiera variantes de anticuerpos con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad implica enfoques dirigidos por HVR, en los que se distribuyen de forma aleatoria varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez). Los residuos HVR implicados en la unión al antígeno pueden identificarse específicamente, por ejemplo, mediante la utilización de mutagénesis por barrido de alanina o modelado. En particular CDR-H3 y CDR-L3 son elegidos como diana.
En determinadas modalidades, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o eliminaciones dentro de una o más HVR siempre que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse a un antígeno. Por ejemplo, las alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras que se proporcionan en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión pueden generarse en HVR. Tales alteraciones pueden encontrarse fuera de los "puntos calientes" de HVR o SDR. En determinadas modalidades de las secuencias de VH y VL variantes que se proporcionaron anteriormente, cada HVR o bien se encuentra sin alteraciones o contiene no más de uno, dos o tres sustituciones de aminoácidos.
Un método útil para identificar residuos o regiones de un anticuerpo al que se puede dirigir la mutagénesis se llama "mutagénesis de barrido de alanina" tal como se describe en Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) son identificados y remplazados por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Pueden introducirse sustituciones adicionales en las ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. De manera alternativa o adicional, se utiliza una estructura de cristal de un complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Tales residuos de contacto y residuos limitantes pueden elegirse como dianas o eliminarse como candidatos para sustitución. Se pueden analizar las variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.
Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de extremos amino y/o carboxilo que varían en cuanto a longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones entre las secuencias de un único o de múltiples residuos de aminoácidos. Los ejemplos de inserciones de extremos incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo de extremo N. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión a los extremos N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la semivida del anticuerpo en suero.
B) Variantes de glicosilación En determinadas modalidades, se modifica un anticuerpo que se proporciona en la presente para aumentar o disminuir el punto hasta el cual se puede glicosilar un anticuerpo. La adición o eliminación de sitios de glicosilación a un anticuerpo se puede lograr convenientemente modificando la secuencia de aminoácidos de modo tal que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.
En los casos en que el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato unido al mismo puede modificarse. Los anticuerpos naturales producidos por células mamíferas comprenden, normalmente, un oligosacárido ramificado de dos antenas que normalmente se encuentra unido mediante un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Véase, por ej., Wright et ál. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetilglucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como también una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido de dos antenas. En algunas modalidades, las modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo pueden generarse para crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.
En una modalidad, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, en comparación con la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alta mañosa) tal como se mide mediante espectrómetro de masas MALDI-TOF, tal como se describe en, por ejemplo, WO 2008/077546. Asn297 hace referencia al residuo de asparagina ubicado alrededor de la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de los residuos de la región Fe); sin embargo, Asn297 también puede ubicarse alrededor de ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores en anticuerpos. Tales variantes de fucosilación pueden haber mejorado la función de ADCC. Véase, por ejemplo, las publicaciones de patentes estadounidenses No. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionados con variantes de anticuerpos "defucosilados" o "deficientes de fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; W02005/053742; W02002/031140; Okazaki et ál. J. Mol . Biol . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et ál. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células CHO Lecl3 con deficiencia en fucosilación proteica (Ripka et ál. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de patente estadounidense No. US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et ál ., especialmente en el Ejemplo 11) y líneas celulares desactivadas, tales como el gen alfa- 1,6-fucosiltransferasa, FUT8 , células CHO desactivadas (véase, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et ál. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et ál., Biotechnol . Bioeng. , 94(4):680-688 (2006); y W02003/085107).
Además se proporcionan variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, donde un oligosacárido con dos antenas unido a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Los ejemplos de dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et ál.); patente estadounidense No. 6.602.684 (Umana et ál); y US 2005/0123546 (Umana et ál). También se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen en, por ejemplo, WO 1997/30087 (Patel et ál); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).
C) Variantes de la región Fe En determinadas modalidades, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en la presente, generando así una variante de la región Fe. La variante de la región Fe puede comprender una secuencia de la región Fe humana (por ejemplo, una región Fe de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ejemplo, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.
En determinadas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que lo convierten en un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la semivida del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo determinadas funciones efectoras (tales como el complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden realizar ensayos de citotoxicidad in vitro o in vivo para confirmar la reducción/pérdida de las de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, los ensayos de unión al receptor Fe (FcR) se pueden realizar para garantizar que el anticuerpo carece de unión a FcyR (por lo tanto, probablemente carece de actividad ADCC), pero mantiene la capacidad de unión a FcRn. Las células primarias para mediar la ADCC, células NK, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Im unol. 9:457-492 (1991). Se describen los ejemplos no taxativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés en la patente estadounidense No.5,500,362 (véase, por ejemplo, Hellstrom, I. et ál. Proc. Nat 'l Acad. Sci . EUA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et ál., Proc. Nat 'l Acad. Sci . EUA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (véase Bruggemann, M. et ál., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). De manera alternativa, se pueden emplear métodos de ensayos no radiactivos (véase, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radiactivo ACTI™ para la citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad CytoTox 96 no radiactivo (Promega, Madison, WI). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células destructoras naturales (NK). Alternativamente, o adicionalmente, se puede evaluar in vivo la actividad ADCC de la molécula de interés, por ejemplo, en un modelo animal tal como el descrito en Clynes et ál. Proc. Nat 'l Acad. Sci . USA 95:652-656 (1998). También se pueden llevar a cabo ensayos de unión a Clq para confirmar que el anticuerpo no se puede unir a Clq y, por lo tanto, carece de actividad CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de unión a Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación de complementos, se puede realizar un ensayo con CDC (véase, por ejemplo, Gazzano-Santoro et ál, J. Inmunol . Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et ál., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También se puede realizar la unión a FcRn y las determinaciones in vivo de eliminación/semivida utilizando métodos conocidos en la téenica (véase, por ejemplo, Petkova, S.B. et ál., Int 'l . Immunol . 18(12):1759-1769 (2006)).
Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen los que tienen sustitución de uno o más residuos de la región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (patente estadounidense No. 6,737,056). Dichos mutantes Fe incluyen los mutantes Fe con sustituciones en dos o más posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, que incluye el mutante Fe también denominado "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 con alanina (patente estadounidense No.7,332,581).
Se describen determinadas variantes de anticuerpos con unión a FcR mejorada o disminuida. (Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 6,737,056; WO 2004/056312, and Shields et ál., J. Biol . Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En determinadas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región Fe con una o más sustituciones de aminoácidos que mejoran ADCC, por ejemplo, sustituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos).
En algunas modalidades, se realizan modificaciones en la región Fe que dan como resultado la unión a Clq modificada (es decir, ya sea mejorada o disminuida) y/o citotoxicidad dependiente de complementos (CDC), por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense No. 6,194,551, WO 99/51642, e Idusogie et ál. J. Inmuno 1. 164: 4178-4184 (2000).
Los anticuerpos con semividas aumentadas y unión mejorada al receptor Fe neonatal (FcRn), que es responsable de la transferencia de IgG maternal al feto (Guyer et ál., J. Inmuno 1. 117:587 (1976) y Kim et ál., J. Inmuno 1. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et ál.). Esos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones en ella que mejoran la unión de la región Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen las que tienen sustituciones en uno o más de los residuos de la región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, sustitución del residuo de la región Fe 434 (patente estadounidense No.7,371,826).
Véase también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente estadounidense No. 5,648,260; patente estadounidense No.5,624,821; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de la región Fe.
D) Variantes_ de anticuerpos_ modificados genéticamente con cisteína En determinadas modalidades, puede ser deseable crear anticuerpos modificados genéticamente con cisteína, por ejemplo, "thioMAb", en los cuales uno o más residuos de un anticuerpo se sustituyen con residuos de cisteína. En modalidades particulares, los residuos sustituidos se producen en sitios accesibles del anticuerpo. Al sustituir esos residuos con cisteína, se ubican grupos tiol reactivos en sitios accesibles del anticuerpo y se pueden utilizar para conjugar el anticuerpo a otros restos, por ejemplo restos de fármacos o restos fármaco-enlazadores, para crear un inmunoconjugado, tal como se describe adicionalmente en la presente. En determinadas modalidades, uno cualquiera o más de los siguientes residuos se puede sustituir con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena ligera; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Se muestran ejemplos no taxativos de cadenas pesadas y cadenas ligeras modificadas genéticamente de cisteína de anticuerpos anti-ETBR en SEQ ID NOs: 18, 19 y 20. Los anticuerpos modificados genéticamente con cisteína pueden generarse como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense No.7,521,541.
E) Derivados de anticuerpos En determinadas modalidades, se puede modificar adicionalmente un anticuerpo proporcionado en la presente para contener restos no proteináceos adicionales que se conocen en la téenica y se encuentran fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivación del anticuerpo incluyen, de modo no taxativo, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no taxativos de polímeros solubles en agua incluyen, de modo no taxativo, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímeros de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), polivinilalcohol y sus mezclas. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar y si hay más de un polímero unido, pueden ser las mismas moléculas o moléculas diferentes. En general, la cantidad y/o tipo de polímeros utilizados para la derivación se pueden determinar en base a consideraciones que incluyen, de modo no taxativo, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se mejorará, ya sea que el derivado de anticuerpo se utilice en un tratamiento en condiciones definidas, etc.
En otra modalidad, se proporcionan los conjugados de un anticuerpo y resto no proteináceo que se puede calentar de forma selectiva mediante la exposición a la radiación. En una modalidad, el resto no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et ál., Proc. Nati . Acad. Sel . USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda e incluye, de modo no taxativo, longitudes de onda que no dañan las células comunes, pero que calientan el resto no proteináceo a una temperatura en la cual las células próximas al resto no proteináceo del anticuerpo se destruyen.
B. Composiciones y métodos recombinantes Los anticuerpos se pueden producir utilizando composiciones y métodos recombinantes, por ejemplo, tales como se describen en la patente estadounidense No.4,816,567. En una modalidad, se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-ETBR descrito en la presente. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo). En otra modalidad, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una modalidad adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico. En dicha realización, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH el anticuerpo. En una modalidad, la célula hospedadora es eucariota, por ejemplo, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20). En una modalidad, se proporciona un método para realizar un anticuerpo anti-ETBR, donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, como se describió anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo y, opcionalmente, recuperar el anticuerpo de la célula hospedadora (o medio de cultivo de células hospedadoras).
Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-ETBR, se aísla un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, tal como se describió anteriormente, y se inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Tal ácido nucleico puede aislarse y secuenciarse fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo).
Las células hospedadoras adecuadas para clonar o para la expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen células procariotas o eucariotas descritas en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden producir en bacterias, en particular cuando la glicosilación y la función efectora de Fe no se necesitan. Para la expresión de fragmentos y polipéptidos de anticuerpos en bacterias, véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses No. 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Véase también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli) . Después de la expresión, el anticuerpo se puede aislar de la pasta de células bacteriana en una fracción soluble y se puede purificar adicionalmente.
Además de los procariotas, los microbios eucariotas tales como los hongos filamentosos o la levadura son hospedadores de clonación o de expresión adecuados para los vectores que codifican anticuerpos, incluyendo cepas de hongos y levadura cuyas vías de glicosilación se han "humanizado", dando lugar a la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o completamente humano. Véase Gerngross, Nat . Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et ál., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus que se pueden utilizar junto con células de insectos, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda .
También se pueden utilizar como hospedadores los cultivos celulares vegetales. Véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses No.5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978 y 6,417,429 (que describen la teenología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).
También se pueden utilizar como hospedadoras las células de los vertebrados. Por ejemplo, pueden ser útiles las líneas celulares de mamíferos que se adaptan para crecer en suspensión. Otros ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles son las líneas de células CV1 de riñón de mono transformadas por SV40 (COS-7); líneas embrionarias humanas de riñón (293 o células 293 como se describe, por ejemplo, en Graham et ál., J. Gen Vi rol .36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK); células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo, en Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1); células de riñón de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma de cuello uterino humano (HELA); células de riñón canino (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humano (W138); células de hígado humano (Hep G2); tumor de mama de ratón (MMT 060562); células TRI, como se describe, por ejemplo, en Mather et ál., Annals N. Y. Acad. Sci . 383:44-68 (1982); células MRC 5 y células FS4. Otras líneas celulares hospedadoras de mamíferos útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), que incluyen células DHFR CHO (Urlaub et ál., Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NS0 y Sp2/0. Para una reseña de determinadas líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp.255-268 (2003).
C. Ensayos Los anticuerpos anti-ETBR proporcionados en la presente se pueden identificar, evaluar o caracterizar para conocer sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas a través de diversos ensayos conocidos en la téenica.
En un aspecto, se evalúa un anticuerpo para conocer su actividad de unión al antígeno, por ejemplo, a través de métodos conocidos, tales como ELISA, BIACore, FACS o análisis de transferencia Western.
En otro aspecto, se pueden utilizar ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente por unirse a ETBR. En determinadas modalidades, tal anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ejemplo, un epítopo lineal o conformacional) que está unido por un anticuerpo descrito en la presente. Los ejemplos de métodos detallados para apear un epítopo al cual se une un anticuerpo se proporcionan en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", en Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).
En un ensayo de competición de ejemplo, se incuba el ETBR inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo etiquetado que se une a ETBR (por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente) y un segundo anticuerpo sin etiquetar que se está evaluando para determinar su capacidad de competir con el primer anticuerpo para la unión a ETBR. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridomas. Como control, se incuba ETBR inmovilizado en una solución que comprende el primer anticuerpo etiquetado pero no el segundo anticuerpo sin etiquetar. Después de la incubación en condiciones que permitan la unión del primer anticuerpo a ETBR, se elimina el exceso de anticuerpo no unido y se mide la cantidad de etiqueta asociada al ETBR inmovilizado. Si la cantidad de etiqueta asociada al ETBR inmovilizado se ve sustancialmente reducida en la muestra de prueba en comparación con la muestra de control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo para la unión a ETBR. Véase Harlow y Lañe (1988) Antibodies A Laboratory Manual cap.14 (Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY).
D. Inmunoconjugados La invención también proporciona inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-ETBR conjugado en la presente con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, toxinas de proteínas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de estas) o isótopos radiactivos (es decir, un radioconjugado).
Los inmunoconjugados permiten la administración dirigida de un resto de fármaco a un tumor y, en algunas modalidades, la acumulación intracelular allí, donde la administración sistemática de fármacos no conjugados puede dar como resultado niveles inaceptables de toxicidad en células normales (Polakis P. (2005) Current Opini n in Pharmacology 5:382-387).
Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) son moléculas quimioterapéuticas dirigidas que combinan las propiedades de ambos, anticuerpos y fármacos citotóxicos, al dirigir fármacos citotóxicos potentes a células tumorales que expresan antígeno (Teicher, B.A. (2009) Current Cáncer Drug Targets 9:982-1004), mejorando de esta forma el índice terapéutico al maximizar la eficacia y minimizar la toxicidad no específica (Cárter, P.J. y Senter P.D. (2008) The Cáncer Jour. 14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res. 41:98-107.
Los compuestos ADC de la invención incluyen aquellos que tienen actividad contra el cáncer. En algunas realizaciones, los compuestos ADC incluyen un anticuerpo conjugado, es decir, unido covalentemente, al resto del fármaco. En algunas modalidades, el anticuerpo está unido covalentemente al resto de fármaco a través de un enlazador. Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) de la invención administran selectivamente una dosis eficaz de un fármaco a un tejido de tumor, por lo que se puede lograr mayor selectividad, es decir, una menor dosis eficaz, mientras se aumenta el índice terapéutico ("ventana terapéutica"). resto de fármaco (D) de los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) pueden incluir cualquier compuesto, resto o grupo que tenga un efecto citotóxico o citostático. Los ejemplos de restos de fármaco incluyen, de modo no taxativo, nemorubicina y sus derivados, tales como PNU-159682, que tienen actividad citotóxica. Los ejemplos no taxativos de dichos inmunoconjugados se presentan más detalladamente a continuación. 1. Ejemplos de conjugados de anticuerpo- fármaco Un ejemplo de modalidad de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que se dirige a una célula tumoral, un resto de fármaco (D) y un resto enlazador (L) que une Ab con D. En algunas modalidades, el anticuerpo se une al resto enlazador (L) a través de uno o más residuos de aminoácidos, tales como U sina y/o cisteína.
Un ejemplo de ADC tiene la Fórmula I: Ab- (L—D)p I donde p es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, la cantidad de restos de fármaco que se pueden conjugar con un anticuerpo está limitada por la cantidad de residuos de cisteína libres. En algunas modalidades, los residuos de cisteína libres se introducen en la secuencia de aminoácidos del anticuerpo mediante los métodos descritos en la presente. Los ejemplos de ADC de Fórmula I incluyen, de modo no taxativo, anticuerpos que tienen 1, 2, 3 o 4 aminoácidos de cisterna modificados (Lyon, R. et ál. (2012) Methods in Enzym. 502:123-138). En algunas modalidades, uno o más residuos de cisteína libres ya están presentes en un anticuerpo, sin el uso de modificación genética, en cuyo caso se pueden usar residuos de cisteína libres existentes para conjugar el anticuerpo con un fármaco. En algunas modalidades, se expone un anticuerpo a condiciones de reducción antes de la conjugación del anticuerpo para generar uno o más residuos de cisteína libres.
A) Ejemplos de enlazadores Un "enlazador" (L) es un resto bifuncional o multifuncional que se puede usar para unir uno o más restos de fármaco (D) a un anticuerpo (Ab) para formar un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de Fórmula I. En algunas modalidades, se pueden preparar conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) usando un enlazador que tiene funcionalidades reactivas para unirse de forma covalente al fármaco y al anticuerpo. Por ejemplo, en algunas modalidades, un tiol de cisteína de un anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional reactivo de un enlazador o un intermedio de fármaco-enlazador para producir un ADC.
En un aspecto, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con una cisteína libre presente en un anticuerpo para formar un enlace covalente. Los ejemplos no taxativos de dichos funcionalidades reactivas incluyen maleimida, haloacetamidas, a-haloacetilo, esteres activados tales como ásteres de succinimida, ásteres de 4-nitrofenilo, ásteres de pentafluorofenilo, ásteres de tetrafluorofenilo, anhídridos, cloruros de ácido, cloruros de sulfonilo, isocianatos e isotiocianatos. Véase, por ej., el método de conjugación de la página 766 de Klussman, et ál (2004), Bioconjuga te Chemistry 15(4):765-773, y los Ejemplos de la presente.
En algunas modalidades, un enlazador tiene una funcionalidad que es capaz de reaccionar con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los ejemplos de dichos grupos electrófilos incluyen, de modo no taxativo, grupos carbonilo de aldehidos y cetonas. En algunas modalidades, un heteroátomo de la funcionalidad reactiva del enlazador puede reaccionar con un grupo electrófilo de un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad del anticuerpo. Los ejemplos no taxativos de dichas funcionalidades reactivas incluyen, de modo no taxativo, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida.
Un enlazador puede comprender uno o más componentes enlazadores. Los ejemplos de componentes enlazadores incluyen 6-maleimidocaproilo ("MC"), maleimidopropanoilo ( "MP"), valina-citrulina ("val-cit" o "ve") alanina-fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenciloxicarbonilo (un "PAB"), 4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidilo ("SPP") y 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 carboxilato ( "MCC"). Se conocen varios componentes enlazadores en la téenica, algunos de los cuales se describen a continuación.
Un enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de un fármaco. Los ejemplos no taxativos de enlazadores escindibles incluyen enlazadores lábiles al ácido (por ej., que comprenden hidrazona), enlazadores sensibles a proteasa (por ej., sensibles a peptidasa), enlazadores fotolábiles o enlazadores que contienen disulfuro (Chari et ál., Cáncer Research 52:127-131 (1992); US 5208020).
En determinadas modalidades, un enlazador tiene la siguiente Fórmula II: -Aa— ww— Yy- donde A es una "unidad extensora", y a es un entero de 0 a 1; W es una "unidad de aminoácido", y w es un entero de 0 a 12; Y es una "unidad espaciadora", e y es 0, 1 o 2. Un ADC que comprende el enlazador de Fórmula II tiene la Fórmula 1(A): Ab-(Aa-Ww-Yy-D)p, donde Ab, D y p son como se definen anteriormente para la Fórmula I. Los ejemplos de modalidad de dichos enlazadores se describen en la patente estadounidense No. 7,498,298, la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una "unidad extensora" (A) que une un anticuerpo con otro componente enlazador o con un resto de fármaco. A continuación se muestran ejemplos no taxativos de unidades extensoras (donde la línea ondeada indica los sitios de unión covalente con un anticuerpo, fármaco u otros componentes enlazadores adicionales): En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una "unidad de aminoácido" (W). En algunas de dichas modalidades, la unidad de aminoácido permite la escisión del enlazador a traves de una proteasa, facilitando así la liberación del fármaco del inmunoconjugado tras la exposición a las proteasas intracelulares, tales como las enzimas lisosómicas (Doronina et ál. (2003) Na t . Biotechnol . 21:778-784). Los ejemplos de unidades de aminoácido incluyen, de modo no taxativo, dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos. Los ejemplos de dipéptidos incluyen, de modo no taxativo, valina-citrulina (ve o val-cit), alanina-fenilalanina (af o ala-phe); fenilalanina-lisina (fk o phe-lys); fenilalanina-homolisina (phe-homolys); y N-metil-valina-citrulina (Me-val-cit). Los ejemplos de tripéptidos incluyen, de modo no taxativo, glicina-valina-citrulina (gly-val-cit) y glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Una unidad de aminoácido puede comprender residuos de aminoácidos de origen natural y/o aminoácidos menores y/o análogos de aminoácidos de origen no natural, tales como la citrulina. Las unidades de aminoácidos pueden diseñarse y optimizarse para la escisión enzimática mediante una enzima en particular, por ejemplo, una proteasa asociada a un tumor, catepsina B, C y D, o una proteasa plasmina.
Normalmente, los enlazadores de tipo peptídicos pueden prepararse mediante la formación de un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos de péptidos. Dichos enlaces peptídicos pueden prepararse, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (por ejemplo, E. Schróder y K. Lübke (1965) "The Peptides", tomo 1, pp 76-136, Academic Press).
En algunas modalidades, un componente enlazador comprende una "unidad espadadora" (Y) que une el anticuerpo con un resto de fármaco, ya sea directamente o a través de una unidad extensora y/o una unidad de aminoácido. Una unidad espaciadora puede ser "autodestructiva" o "no autodestructiva". Una unidad espaciadora "no autodestructiva" es una unidad en la cual parte o toda la unidad espaciadora permanece unida al resto de fármaco tras la escisión del ADC. Los ejemplos de unidades espadadoras no autodestructivas incluyen, de modo no taxativo, una unidad espaciadora de glicina y una unidad espaciadora de glicina-glicina. En algunas modalidades, la escisión enzimática de un ADC que contiene una unidad espaciadora glicina-glicina mediante una proteasa asociada a una célula tumoral, provoca la liberación de un resto glicina-glicina-fármaco del resto del ADC. En algunas de dichas modalidades, el resto glicina-glicina-fármaco se somete a una etapa de hidrólisis en la célula tumoral, escindiendo así la unidad espaciadora glicina-glicina del resto de fármaco.
Una unidad espadadora "autodestructiva" permite la liberación del resto de fármaco. En determinadas modalidades, una unidad espadadora de un enlazador comprende una unidad de p-aminobencilo. En algunas de dichas modalidades, un alcohol p-aminobencílico se une a una unidad de aminoácido a través de un enlace amida y se forma un carbamato, metilcarbamato o carbonato entre el alcohol bencílico y el fármaco (Hamann et ál. (2005) Exper t Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). En algunas modalidades, la unidad espad adora comprende p-aminobenciloxicarbonilo (PAB). En algunas modalidades, un ADC que comprende un enlazador autodestructivo tiene la estructura: donde Q es alquilo -Ci-C8, -O-(alquilo Ci-Cs), halógeno, -nitro o -ciano; m es un entero que varía de 0 a 4; X puede ser una o más unidades espaciadoras adicionales o puede estar ausente; y p varía de 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, p varía de 1 a 10, de l a 7, de l a 5 o de 1 a 4. Los ejemplos no taxativos de unidades espaciadoras X incluyen: donde Ri y R2 se seleccionan independientemente de H y alquilo Ci-C6. En algunas modalidades, R1 y R2 son cada uno -CH3.
Otros ejemplos de espaciadores autodestructivos incluyen, de modo no taxativo, compuestos aromáticos que son electrónicamente similares al grupo PAB, tales como derivados de 2-aminoimidazol-5-metanol (patente estadounidense No. 7.375.078; Hay et ál. (1999) Bioorg . Med. Chem. Lett . 9:2237) y orto- o para-aminobencilacetales. En algunas modalidades, se pueden usar espaciadores que sufren cielización luego de la hidrólisis del enlace amida, tales como amidas de ácido 4-aminobutírico sustituidas y no sustituidas (Rodrigues y et ál. (1995) Chemistry Biology 2:223), sistemas de anillos biciclo[2.2.1] y biciclo[2.2.2] adecuadamente sustituidos (Storm et ál (1972) J. Amer. Chem. Soc.94:5815) y amidas de ácido 2-aminofenilpropiónico (Amsberry, et ál (1990) J. Org. Chem. 55:5867). El enlace de un fármaco al oí-carbono de un residuo de glicina es otro ejemplo de un espaciador autodestructivo que puede ser útil en ADC (Kingsbury et ál. (1984) J. Med. Chem. 27:1447).
En algunas modalidades, el enlazador L puede ser un enlazador de tipo dendrítico para la unión covalente de más de un resto de fármaco a un anticuerpo a través de un resto enlazador multifuncional ramificado (Sun et ál. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et ál. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Los enlazadores dendríticos pueden aumentar la relación molar de fármaco con respecto a anticuerpo, es decir, la carga, que está relacionada con la potencia del ADC. Por lo tanto, cuando un anticuerpo tiene solo un grupo tiol de cisterna reactivo, se pueden unir muchos restos de fármaco a través de un enlazador dendrítico.
A continuación, se muestran ejemplos no taxativos de enlazadores en el contexto de un ADC de Fórmula I: val-cit - - - - e Ri y R2 se seleccionan independientemente de H y alquilo Ci- C6. En algunas modalidades, R1 y R2 son cada uno -CH3.
Phe-homoLys-PAB-Ab; donde n es 0 a 12. En algunas modalidades, n es 2 a 10 En algunas modalidades, n es 4 a 8.
Ejemplos no taxativos adicionales de ADC incluyen las estructuras: l donde X es: cada R es independientemente H o alquilo Ci-C6; y n es 1 a 12.
En algunas modalidades, se sustituye un enlazador por grupos que modulan la solubilidad y/o reactividad. Como ejemplo no taxativo, un sustituyente cargado, tal como sulfonato (-SCV ) o amonio, puede aumentar la solubilidad en agua del reactivo del enlazador y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo del enlazador con el anticuerpo y/o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L (intermedio de anticuerpo-enlazador) con D o D-L (intermedio de fármaco-enlazador) con Ab, dependiendo de la vía de síntesis utilizada para preparar el ADC. En algunas modalidades, una parte del enlazador está acoplada al anticuerpo y una parte del enlazador está acoplada al fármaco, y luego el Ab-(parte enlazadora)a está acoplada al fármaco-(parte enlazadora)b para formar el ADC de Fórmula I.
Los compuestos de la invención contemplan expresamente, de modo no taxativo, el ADC preparado con los siguientes reactivos de enlazadores: bis-maleimido-trioxietilenglicol (BMPEO), áster de N-(b-maleimidopropiloxi)-N-hidroxi succinimida (BMPS), áster de N-(e-maleimidocaproiloxi) succinimida (EMCS), áster de N- [g-maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS), 1,6-hexan-bis-vinilsulfona (HBVS), 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxi-(6-amidocaproato) de succinimidilo (LC-SMCC), áster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), hidrazida de ácido 4- (4-N-Maleimidofenil)butírico (MPBH), 3- (bromoacetamido)propionato de succinimidilo (SBAP), yodoacetato de succinimidilo (SIA), (4-yodoacetil)aminobenzoato de succinimidilo (SIAB), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP), 4-(N- maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC), 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimidilo (SMPB), 6-[(beta-maleimidopropionamido)hexanoato] de succinimidilo (SMPH), iminotiolano (IT), sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC y sulfo-SMPB y succinimidil-(4-vinilsulfon)benzoato (SVSB) e incluidos los reactivos bis-maleimida: ditiobismaleimidoetano (DTME), 1,4-Bismaleimidobutano (BMB), 1,4 Bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bismaleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE), BM(PEG)2 (se muestra a continuación) y BM(PEG)3 (se muestra a continuación); derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCl de dimetil adipimidato), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazonio (como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). En algunas modalidades, los reactivos bis-maleimida permiten la unión del grupo tiol de una cisteína en el anticuerpo a un resto de fármaco, enlazador o intermedio de enlazador-fármaco que contiene tiol. Otros grupos funcionales que son reactivos a grupos tiol incluyen, de modo no taxativo, yodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, disulfuro, disulfuro de piridilo, isocianato e isotiocianato.
BM(PEG)2 BM(PEG)3 Se pueden obtener determinados reactivos de enlazadores útiles de varias fuentes comerciales, tales como Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL), Molecular Biosciences Inc.(Boulder, CO) o se pueden sintetizar de acuerdo con los procedimientos descritos en la téenica; por ejemplo, en Toki et ál. (2002) J. Org. Chem. 67:1866-1872; Dubowchik, et ál. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch et ál (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6214345; WO 02/088172; US 2003130189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; y WO 04/032828.
El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminpentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14 es un ejemplo de un agente quelante para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, WO94/11026.
B)Ejemplos de restos de fármaco En algunas modalidades, un ADC comprende una antracielin . Las antraciclinas son compuestos antibióticos que exhiben actividad citotóxica. Sin pretender limitarse a ninguna teoría en particular, los estudios han indicado que las antraciclinas pueden funcionar para destruir células mediante una cantidad de mecanismos diferentes, que incluyen: 1) intercalamiento de las moléculas de fármaco en el ADN de la célula inhibiendo así la síntesis de ácido nucleico dependiente de ADN; 2) producción mediante el fármaco de radicales libres que luego reaccionan con macromoléculas celulares para causar daño a las células, y/o 3) interacciones de las moléculas de fármaco con la membrana celular (véase, por ej., C. Peterson et ál., "Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia" en Anthracycline Antibiotics In Cáncer Therapy; N.R. Bachur, "Free Radical Damage" id. en las páginas 97-102). Debido a su potencial citotóxico, las antraciclinas se han usado en el tratamiento de varios cánceres, tal como leucemia, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de ovario y sarcomas (véase, por ej., P.H-Wiernik, in Anthracycline: Current Status And New Developments p 11) Los ejemplos no taxativos de antracielinas incluyen doxorubicina, epirubicina, idarubicina, daunorubicina, nemorubicina y derivados de estas. Los inmunoconjugados y profármacos de daunorubicina y doxorubicina se han preparado y estudiado (Kratz et ál. (2006) CurrenC Med. Chem. 13:477- 523; Jeffrcy et ál. (2006) Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362; Torgov et ál. (2005) Bioconj . Chem. 16:717-721; Nagy et ál. (2000) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 97:829-834; Dubowchik et ál. (2002) Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532; King et ál. (2002) J. Med. Chem. 45:4336-4343; EP 0328147; US 6630579). El conjugado de anticuerpo-fármaco BR96-doxorubicina reacciona específicamente con el antígeno asociado a tumores Lewis-Y y se ha evaluado en estudios de fase I y fase II (Saleh et ál. (2000) J. Clin. Oncology 18:2282-2292; Ajani et ál. (2000) Cáncer Jour. 6:78-81; Tolcher et ál. (1999) J. Clin. Oncology 17:478-484).
PNU-159682 es un metabolito potente (o derivado) de nemorubicina (Quintieri, et ál. (2005) Clinical Cáncer Research 11(4):1608-1617). La nemorubicina es un análogo sintético de doxorubicina con un grupo 2-metoximorfolino en el amino glicósido de doxorubicina y ha sido sometido a evaluación clínica (Grandi et ál. (1990) Cáncer Treat . Rev. 17:133; Ripamonti et ál (1992) Brit . J. C ncer 65:703; ), que incluye ensayos en fase II/III para el carcinoma hepatocelular (Sun et ál. (2003) Proceedings of t he American Society for Clinical Oncology 22, Absl448; Quintieri (2003) Proceedings of the American Association of Cáncer Research, 44:1a Ed, Resumen 4649; Pacciarini et ál. (2006) Jour. Clin.
Oncology 24:14116).
Un ejemplo no taxativo de ADC que comprende nemorubicina derivados de nemorubicina, se muestra en la Fórmula la: donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi Ci-C5; o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; Li y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en la presente; T es un anticuerpo (Ab) como se describe en la presente; y m es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, m es de 1 a 10, la 7, la 5 o la 4.
En algunas modalidades, ¾ y R2 son ambos metoxi (-OMe).
Un ejemplo no taxativo adicional de ADC que comprende nemorubicina derivados de nemorubicina, se muestra en la Fórmula Ib: - donde Ri es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxi o metoxi y R2 es un grupo alcoxi Ci-C5; o una sal farmacéuticamente aceptable de estos; L2 y Z juntos son un enlazador (L) como se describe en la presente; T es un anticuerpo (Ab) como se describe en la presente; y m es 1 a alrededor de 20. En algunas modalidades, m es de 1 a 10, la 7, la 5o la 4.
En algunas modalidades, Ri y R2 son ambos metoxi (-OMe) En algunas modalidades, el componente de nemorubicina del ADC que contiene nemorubicina es PNU-159682. En algunas de estas modalidades, la parte de fármaco del ADC puede tener vina de las siguientes estructuras: donde la línea ondulada indica la unión al enlazador (L).
Las antracielinas, que incluyen PNU-159682, se pueden conjugar con anticuerpos a través de varios sitios de unión y de una variedad de enlazadores (US 2011/0076287; W02009/099741; US 2010/0034837; WO 2010/009124), incluyendo los enlazadores descritos en la presente.
Los ejemplos de ADC que comprenden una nemorubicina y un enlazador incluyen, de modo no taxativo: PNU- 159682 -val -cit-PAB-Ab - - - p ( ) , Ri y R2 se seleccionan independientemente de H alquilo(Ci-C6); y PNU-159682-maleimida-Ab.
El enlazador de PNU-159682 maleimida acetal-Ab es lábil al ácido, mientras que los enlazadores de PNU-159682-val-cit-PAB-Ab, PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador-Ab y PNU-159682-val-cit-PAB-espaciador(R1!^2)-Ab son escindibles por proteasa C) Carga de fármaco La carga de fármaco está representada por p, la cantidad promedio de restos de fármaco por anticuerpo en una molécula de la Fórmula I. La carga de fármaco puede estar en el intervalo de 1 a 20 restos de fármaco (D) por anticuerpo. Los ADC de la Fórmula I incluyen grupos de anticuerpos conjugados con una gama de restos de fármaco, de 1 a 20. La cantidad promedio de restos de fármaco por anticuerpo en las preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación puede caracterizarse mediante medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo de ELISA y HPLC. También puede determinarse la distribución cuantitativa de ADC en función de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneos donde p es cierto valor de ADC con otras cargas de fármaco puede lograrse a través de medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis.
Para algunos conjugados anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por la cantidad de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, donde la unión es un tiol de cisteína, tal como en determinados ejemplos de modalidades mencionadas anteriormente, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales puede estar unido el enlazador. En determinadas modalidades, una carga mayor de fármaco, por ej., p>5, puede provocar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de la permeabilidad celular de ciertos conjugados anticuerpo-fármaco. En determinadas modalidades, la carga promedio de fármaco para un ADC está en el intervalo de 1 a alrededor de 8; de 2 a alrededor de 6; o de 3 a alrededor de 5. De hecho, se ha demostrado que para ciertos ADC, la relación óptima de restos de fármaco por anticuerpo puede ser menor que 8 y puede ser de alrededor de 2 a alrededor de 5 (US 7498298).
En determinadas modalidades, menos del máximo teórico de restos de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el intermedio fármaco-enlazador o un reactivo de enlazador, como se indica a continuación. Por lo general, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan estar enlazados a un resto de fármaco, de hecho, la mayoría de los residuos tiol de cisteína en anticuerpos existen como puentes disulfuros. En determinadas modalidades, un anticuerpo puede reducirse con un agente de reducción tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP) en condiciones de reducción parciales o totales, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas modalidades, un anticuerpo está sujeto a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleofílicos reactivos tales como Usina o cisteína .
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de diferentes maneras, por ejemplo, mediante: (i) limitar el exceso molar del intermedio de fármaco-enlazador o del reactivo de enlazador en relación con el anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de reacción de conjugación, y (iii) parcializar o limitar las condiciones reductoras para la modificación de tiol cisteína.
Se entenderá que donde más de un grupo nucleofílico reaccione con un intermedio fármaco-enlazador o reactivo de enlazador, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más restos de fármaco ligados a un anticuerpo. La cantidad promedio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo de anticuerpos ELISA dual, el cual es específico para anticuerpos y específico para el fármaco. Las moléculas ADC individuales se puede identificar en la mezcla mediante espectroscopia de masas y separar mediante HPLC, por ej., cromatografía de interacción hidrofóbica (véase, por ej., McDonagh et ál. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett et ál. (2004) Clin. Cáncer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., et ál. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjúgate," Resumen No. 624, American Association for Cáncer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, actas de la AACR, Volumen 45, marzo 2004; Allcy, S.C., et ál. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Resumen No. 627, American Association for Cáncer Research, encuentro anual de 2004, 27-31 de marzo de 2004, actas de la AACR, Volumen 45, marzo 2004). En determinadas modalidades, un ADC homogéneo con un valor de carga único puede aislarse de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
D) Determinados_ métodos_ para_ preparar inmunoconjugados Un ADC de la Fórmula 1 puede prepararse por varias vías, empleando reacciones, condiciones y reactivos de la química orgánica conocidos por los expertos en la téenica, que incluyen: (1) la reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo de unión bivalente para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con un resto de fármaco D; y (2) la reacción de un grupo nucleofílico de un resto de fármaco con un reactivo de unión bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con un grupo nucleofílico de un anticuerpo. Los ejemplos de métodos para preparar un ADC de la Fórmula I por medio de la última vía se describen en US 7498298, que se incorporan expresamente a la presente mediante esta referencia.
Los grupos nucleofílicos o anticuerpos incluyen, de modo no taxativo: (i) grupos amina del extremo N, (ii) grupos amina de cadena lateral, por ej. lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ej., cisteína y (iv) grupos amino o hidroxilo del azúcar donde el anticuerpo está glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son neuclofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en restos de enlazador y reactivos de enlazador que incluyen: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (iii) grupos aldehidos, cetonas, maleimido y carboxilo. Determinados anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reducidles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos de enlazador mediante el tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol) o tricarboniletilfosfino (TCEP), de manera que el anticuerpo se reduzca total o parcialmente. Cada puente de cisteína formará así, en teoría, dos nucleófilos de tiol reactivos. Pueden introducirse grupos nucleofílíeos adicionales en anticuerpos a través de la modificación de los residuos lisina, por ej., mediante la reacción de los residuos lisina con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando como resultado la conversión de una amina en un tiol. Pueden introducirse también grupos tiol reactivos en un anticuerpo, mediante la introducción de uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ej., mediante la preparación de anticuerpos variantes que comprenden uno o más residuos de aminoácidos de cisteína no naturales).
Los conjugados de anticuerpo-fármaco de la invención también pueden producirse mediante la reacción entre un grupo electrofílico en un anticuerpo, tal como un grupo aldehido o carbonil cetona, con un grupo nucleofílico en un reactivo enlazador o fármaco. Los grupos nucleofílicos útiles en un reactivo enlazador incluyen, de modo no taxativo, hidrazida, oxima, amino, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. En una modalidad, se modifica un anticuerpo para introducir restos electrofílicos que son capaces de reaccionar con sustituyentes nucleofílíeos en el reactivo enlazador o fármaco. En otra modalidad, los azúcares de anticuerpos glicolisados pueden oxidarse, por ej. con reactivos oxidantes de periodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de restos de fármaco o reactivos enlazadores. Los grupos de base Schiff de imina resultantes pueden formar una unión normal o pueden reducirse, por ej., mediante reactivos de borohidruro para formar enlaces de amina estables. En una modalidad, la reacción de la parte de carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con una oxidasa de galactosa o meta-periodato de sodio puede proporcionar grupos carbonilo (aldehido o cetona) en el anticuerpo que puede reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Hermanson, Bioconjugate Techniques). En otra modalidad, los anticuerpos que contienen residuos de treonina o serina del extremo N pueden reaccionar con meta-periodato de sodio, dando como resultado la producción de un aldehido en lugar del primer aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Dicho aldehido puede hacerse reaccionar con un resto de fármaco o nucleófilo enlazador.
Los ejemplos de grupos nucleofílíeos en un resto de fármaco incluyen, de modo no taxativo: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxia, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida que son capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos o restos enlazadores y reactivos enlazadores que incluyen: (i) ásteres activos tales como ásteres NHS, ásteres HOBt, haloformiatos y haluros de ácido; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; (iii) grupos aldehidos, cetonas, maleimido y carboxilo.
Los ejemplos no taxativos de reactivos de reticulación que pueden usarse para preparar ADC se describen en la presente en la sección titulada "Ejemplos de enlazadores". Los métodos para usar dichos reactivos de reticulación para unir dos restos, incluyendo un resto proteináceo y un resto químico, son conocidos en la téenica. En algunas modalidades, una proteína de fusión que comprende un anticuerpo y un agente citotóxico puede realizarse, por ej ., mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. Una molécula de ADN recombinante puede comprender regiones que codifican el anticuerpo y partes citotóxicas del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separadas por una región que codifica un péptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas de1 conjugado.
En aun otra modalidad, un anticuerpo puede conjugarse a un "receptor" (tal como estreptavidina) para el uso en la pre-selección del objetivo tumoral donde el conjugado receptor-anticuerpo se administra al paciente, seguido por la eliminación de un conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y luego la administración de un "ligando" (por ej., avidina) que se conjuga a un agente citotóxico (por ej., un fármaco o radionucleótido).
E.Métodos y composiciones para el diagnóstico y detección En determinadas modalidades, cualquiera de los anticuerpos anti-ETBR proporcionados en la presente es útil para detectar la presencia de ETBR en una muestra biológica. El término "detectar" tal como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. Una "muestra biológica" comprende, por ej., una célula o tejido (por ej., material de biopsia, que incluye tejido epitelial canceroso o potencialmente canceroso, que incluye tejido de sujetos que tienen o se sospecha tienen melanoma).
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo anti-ETBR para su uso en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de ETBR en una muestra biológica. En determinadas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-ETBR como se describe en la presente en condiciones que permitan la unión del anticuerpo anti-ETBR con ETBR, y detectar si se formó un complejo entre el anticuerpo anti-ETBR y ETBR en la muestra biológica. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, se usa un anticuerpo anti-ETBR para seleccionar sujetos que son susceptibles a la terapia con un anticuerpo anti-ETBR, por ej., donde ETBR es un biomarcador para la selección de pacientes. En una modalidad adicional, la muestra biológica es una célula o tejido (por ej., tejido epitelial canceroso o potencialmente canceroso, que incluye tejido de sujetos que tienen o se sospecha tienen melanoma).
En una modalidad adicional, se usa un anticuerpo anti-ETBR in vivo para detectar, por ej., mediante imagenología in vivo, un cáncer positivo para ETBR en un sujeto, por ej., para fines de diagnóstico, pronóstico y etapa del cáncer, determinar el curso de terapia apropiado o monitorear la respuesta de un cáncer a la terapia. Un método conocido en la téenica para la detección in vivo es la inmuno-tomografía por emisión de positrones (inmuno-PET), como se describe en, por ej., van Dongen et ál., The Oncologist 12:1379-1389 (2007) y Verel et ál., J. Nucí . Med. 44:1271-1281 (2003). En dichas modalidades, se proporciona un método para detectar un cáncer positivo para ETBR en un sujeto, el método comprende administrar un anticuerpo anti-ETBR etiquetado al sujeto que tiene o se sospecha que tiene un cáncer positivo para ETBR, y detectar el anticuerpo anti-ETBR etiquetado en el sujeto, donde la detección del anticuerpo anti-ETBR etiquetado indica un cáncer positivo para ETBR en el sujeto. En algunas de dichas modalidades, el anticuerpo anti-ETBR etiquetado comprende un anticuerpo anti-ETBR conjugado con un emisor de positrones, tales como 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr y 124I. En una modalidad particular, el emisor de positrones es 89Zr.
En modalidades adicionales, un método de diagnóstico o detección comprende poner en contacto un primer anticuerpo anti-ETBR inmovilizado con un sustrato con una muestra biológica para analizar la presencia de ETBR, exponer el sustrato a un segundo anticuerpo anti-ETBR y detectar si el segundo anti-ETBR está unido a un complejo entre el primer anticuerpo anti-ETBR y el ETBR de la muestra biológica. Un sustrato puede ser cualquier medio de soporte, por ej., vidrio, metal, cerámica, perlas poliméricas, láminas, lascas y otros sustratos. En determinadas modalidades, una muestra biológica comprende una célula o tejido (por ej., material de biopsia, que incluye tejido epitelial canceroso o potencialmente canceroso, que incluye tejido de sujetos que tienen o se sospecha tienen melanoma). En determinadas modalidades, el primer o segundo anticuerpo anti-ETBR es cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente.
Los ejemplos de trastornos que pueden diagnosticarse o detectarse de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores incluyen cánceres positivos para ETBR, tales como melanoma positivo para ETBR. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) anti-ETBR mayor que "0," que corresponde a una tinción muy baja o nula en >90% de las células tumorales. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR expresa ETBR en un nivel de 1+, 2+ o 3+, donde 1+ corresponde a tinción baja en >50% de las células neoplásicas, 2+ corresponde a tinción moderada en >50% de las células neoplásicas y 3+ corresponde a tinción fuerte en >50% de las células neoplásicas. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR es un cáncer que expresa ETBR de acuerdo con un ensayo de hibridación in situ (ISH). En algunas de dichas modalidades, se usa un sistema de puntaje similar al usado para la IHC. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR es un cáncer que expresa ETBR de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de ETBR. En algunas modalidades, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativa.
En determinadas modalidades, se proporcionan anticuerpos anti-ETBR etiquetados. Las etiquetas incluyen, de modo no taxativo, etiquetas o restos que se detectan directamente (tales como etiquetas fluorescentes, cromofóricas, electrodensas, quimioluminiscentes y radiactivas), así como restos, tal como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ejemplo, a través de reacción enzimática o de interacción molecular. Los ejemplos de etiquetas incluyen, de modo no taxativo, los radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H y 131I, fluoróforos tales como quelatos tórreos poco comunes o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, peroxidasa de rábano picante (HRP), fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas sacáridas, por ej., oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas, tal como uricasa y oxidasa xantina, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de salto, etiquetas bacteriófagas, radicales libres estables y similares. En otra modalidad, la etiqueta es un emisor de positrones. Los emisores de positrones incluyen, de modo no taxativo, 68Ga, 18F, 64Cu, 86Y, 76Br, 89Zr y 124I. En una modalidad particular, un emisor de positrones es 89Zr.
F.Formulaciones farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR como se describe en la presente se preparan mediante la mezcla de dicho anticuerpo o inmunoconjugado, que tiene el grado de pureza deseado, con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales {Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables generalmente no son tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen, de modo no taxativo: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol de butilo o bencilo; alquilparabenos, tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol y m-cresol),- polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbítol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos (por ej., complejos de proteína Zn) y/o tensioactivos no- iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables de la presente incluyen adicionalmente agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas hialouronidasa activa neutral soluble (sHASEGP), por ejemplo, glicoproteínas hialouronidasa PH-20 humanas solubles, tales como rHuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Determinados ejemplos de sHASEGPs y métodos de uso, que incluyen rHuPH20, se describen en las patentes estadounidenses No.2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, un sHASEGP se combina con una o más glicoaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.
Los ejemplos de formulaciones de anticuerpo o inmunoconjugado liofilizado se describen en la patente estadounidense No.6,267,958. Las formulaciones de anticuerpo o inmunoconjugado acuoso incluyen aquellas descritas en la patente estadounidense No. 6,171,586 y W02006/044908, las formulaciones de esta última incluyen un amortiguador histidina-acetato.
La formulación de la presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí.
Los ingredientes activos pueden estar contenidos en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por téenicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de liberación de fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington 's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980).
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo o inmunoconjugado, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, por ej., películas o microcápsulas.
Las formulaciones que se usan para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilización se logra fácilmente, por ej., mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
G.Composiciones y métodos terapéuticos Cualquiera de los inmunoconjugados o anticuerpos anti-ETBR proporcionados en la presente pueden usarse en los métodos, por ej., métodos terapéuticos.
En un aspecto, un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR proporcionado en la presente se usa en un método para inhibir la proliferación de una célula ETBR positiva, el método comprende exponer la célula al inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR en condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR a ETBR en la superficie de la célula, inhibiendo así la proliferación de la célula. En determinadas modalidades, el método es un método in vitro o in vivo. En algunas modalidades, la célula es una célula de melanoma.
La inhibición de la proliferación celular in vitro se puede analizar usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™, que se encuentra comercialmente disponible de Promega (Madison, I). Ese ensayo determina el número de células viables en un cultivo basado en la cuantificación del ATP presente, lo cual es indicativo de las células metabólicamente activas. Véase Crouch et ál. (1993) J. Immunol . Meth. 160:81-88, patente estadounidense No. 6,602,677. El ensayo puede llevarse a cabo en un formato de 96 o 384 pocilios, lo cual lo hace adecuado para un ensayo automático de alto rendimiento (HTS). Véase Cree et ál. (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404. El procedimiento de ensayo involucra agregar un único reactivo (reactivo CellTiter-Glo ) directamente a las células cultivadas. Esto da como resultado la lisis celular y la generación de una señal luminiscente producida por una reacción de luciferasa. La señal luminiscente es proporcional a la cantidad de ATP presente, la cual es directamente proporcional al número de células viables presentes en el cultivo. Los datos pueden registrarse por medio de un luminómetro o dispositivo de imagenología por cámara CCD. La salida de luminiscencia está expresada como unidades relativas de luz (RLU).
En otro aspecto, se proporciona un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR para su uso como un medicamento. En aspectos adicionales, se proporciona un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR para su uso en un metodo de tratamiento. En determinadas modalidades, se proporciona un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR para su uso en el tratamiento de un cáncer positivo para ETBR. En determinadas modalidades, la invención proporciona un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR para su uso en un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer positivo para ETBR, el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ej., como se describe más adelante.
En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR en la fabricación o preparación de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para el tratamiento de un cáncer positivo para ETBR. En una modalidad adicional, el medicamento es para su uso en un método para tratar un cáncer positivo para ETBR, el método comprende administrarle a un individuo que tiene un cáncer positivo para ETBR una cantidad eficaz del medicamento. En una de estas modalidades, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ej., como se describe más adelante.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar un cáncer positivo para ETBR. En una modalidad, el método comprende administrarle a un individuo que tiene dicho cáncer positivo para ETBR una cantidad eficaz de un inmunoconjugado o anticuerpo anti-ETBR. En una modalidad, el método comprende adicionalmente administrar al individuo una cantidad eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, como se describe más adelante.
Un cáncer positivo para ETBR de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser, por ej., melanoma. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR es un cáncer que recibe un puntaje de inmunohistoquímica (IHC) anti-ETBR o hibridación in situ (ISH) mayor que "0," que corresponde a una tinción muy baja o nula en >90% de las células tumorales. En otra modalidad, un cáncer positivo para ETBR expresa ETBR en un nivel de 1+, 2+ o 3+, donde 1+ corresponde a tinción baja en >50% de las células neoplásicas, 2+ corresponde a tinción moderada en >50% de las células neoplásicas y 3+ corresponde a tinción fuerte en >50% de las células neoplásicas. En algunas modalidades, un cáncer positivo para ETBR es un cáncer que expresa ETBR de acuerdo con un ensayo de PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) que detecta el ARNm de ETBR. En algunas modalidades, el RT-PCR es RT-PCR cuantitativa.
En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo que tiene cáncer positivo para ETBR, donde el cáncer positivo para ETBR es resistente a un primer agente terapéutico. En algunas modalidades, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ETBR. En algunas modalidades, el cáncer positivo para ETBR es melanoma. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no es ETBR. En algunas modalidades, el primer agente terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no es ETBR y un primer agente citotóxico. En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a un antígeno que se selecciona de proteína de melanocitos PMEL17, proteína 1 relacionada con tirosinasa (TYRP1), antigeno 4 de linfocito T citotóxico (CTLA-4) y glicoproteína NMB (GPNMB). En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a PMEL17. En algunas modalidades, el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a ETBR son diferentes. En algunas de dichas modalidades, el primer agente citotóxico se selecciona de MMAE, una caliqueamicina y una pirrolobenzodiazepina. En algunas de dichas modalidades, el primer agente citotóxico es MMAE y el agente citotóxico del inmunoconjugado comprende un anticuerpo que se une a ETBR es un derivado de nemorubicin .
En algunas modalidades, el primer anticuerpo se une a ETBR. En algunas de dichas modalidades, el primer agente citotóxico se selecciona de MMAE, una caliqueamicina y una pirrolobenzodiazepina y el agente citotóxico del inmunoconjugado descrito en la presente es un derivado de nemorubicina. En algunas modalidades, el primer agente citotóxico es MMAE y el agente citotóxico del inmunoconjugado descrito en la presente es un derivado de nemorubicina.
En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar a un individuo con cáncer, donde el cáncer es resistente a un primer agente terapéutico. En algunas modalidades, el primer terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo unido a un primer agente citotóxico a través de un primer enlazador. En algunas modalidades, un método para tratar a un individuo con cáncer que es resistente a un primer terapéutico (tal como un primer inmunoconjugado) comprende administrarle un segundo inmunoconjugado que comprende un segundo anticuerpo unido a un segundo agente citotóxico a través de un segundo enlazador. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son iguales o diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos que están presentes en al menos algunas de las mismas células. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a los mismos antígenos y el primer agente citotóxico y el segundo agente citotóxico son diferentes. En cualquiera de las modalidades anteriores, el primer enlazador y el segundo enlazador pueden ser iguales o diferentes. En algunas modalidades, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se unen a diferentes antígenos, el primer y el segundo enlazador son diferentes, y el primer y el segundo agente citotóxico son diferentes.
Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano.
En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los inmunoconjugados o anticuerpos anti-ETBR provistos en la presente, por ej., para su uso en cualquiera de los métodos terapéuticos mencionados anteriormente. En una modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados o anticuerpos anti-ETBR provistos en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los inmunoconjugados o anticuerpos anti-ETBR provistos en la presente y al menos un agente terapéutico adicional, por ej., como se describe más adelante.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse ya sea solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede administrarse conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional.
En algunas modalidades, los métodos de tratamiento del cáncer comprenden administrar un inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a un antígeno seleccionado de proteína de melanocitos PMEL17, proteína relacionada con tirosinasa 1 (TYRP1), antígeno linfocito T citotóxico 4 (CTLA-4) y glicoproteína NMB (GPNMB). En algunas de dichas modalidades, el agente citotóxico del segundo inmunoconjugado se selecciona de MMAE, una caliqueamicina, un derivado de nemorubicina y una pirrolobenzodiazepina. En algunas de dichas modalidades, el agente citotóxico del segundo inmunoconjugado se selecciona de MMAE, una caliqueamicina y una pirrolobenzodiazepina. En algunas modalidades, el agente citotóxico del segundo inmunoconjugado es MMAE. En la Figura 7A se muestra un ejemplo de estructura MMAE. La parte de enlazador de inmunoconjugado que contiene MMAE puede ser el enlazador MC-val-cit-PAB que se muestra en la Figura 7A, o puede ser un enlazador diferente, tal como cualquiera de los descritos en la presente. En algunas modalidades, el agente citotóxico del segundo inmunoconjugado es una pirrolobenzodiazepina. Los ejemplos no taxativos pirrolobenzodiazepinas incluyen un dímero PBD con la siguiente estructura: dímero PBD; donde la línea ondulada indica la unión al enlazador (L). Véanse, por ej., WO 2009/016516; US 2009/304710; US 2010/047257; US 2009/036431; US 2011/0256157 y WO 2011/130598. La parte enlazadora del inmunoconjugado que contiene PBD puede, en algunas modalidades, ser un enlazador descrito en la presente. En algunas modalidades, el enlazador comprende MC-val-cit-PAB, tal como, por ejemplo, en la siguiente estructura: En algunas modalidades, los métodos de tratamiento del cáncer comprenden administrar un inmunoconjugado descrito en la presente en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17. En algunas de dichas modalidades, el cáncer es un cáncer positivo para ETBR y también un cáncer positivo para PMEL17. La determinación de si el cáncer es también positivo para PMEL17 puede llevarse a cabo mediante cualquier método, incluyendo, de modo no taxativo, los métodos descritos en la presente para determinar si un cáncer es positivo para ETBR, y los métodos descritos en la publicación estadounidense No. US 2011/0206702. En algunas modalidades, el anticuerpo que se une a PMEL17 comprende un HVR H1 que comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 21, una HVR H2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 22, una HVR H3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23, una HVR L1 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 24, una HVR L2 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 25, y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 26.
La administración "en combinación" comprende la administración combinada (donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma formulación o en formulaciones separadas), y la administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo o inmunoconjugado de la invención puede ocurrir antes, simultáneamente y/o después de la administración del agente terapéutico adicional (tal como el inmunoconjugado anti-PMEL17) y/o adyuvante. En algunas modalidades, la administración del inmunoconjugado anti-ETBR y la administración del inmunoconjugado anti-PMEL17 ocurren dentro de alrededor de un mes, o dentro de alrededor de una, dos o tres semanas, o dentro de alrededor de uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis días entre sí. Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención pueden usarse también en combinación con terapia de radiación.
Un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede administrarse mediante cualquier medio adecuado, que incluye la administración parenteral, intrapulmonar e intranasal, y, si se desea el tratamiento local, administración intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier vía adecuada, por ej., mediante inyecciones, tal como por vía intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. En la presente se contemplan varios cronogramas de dosificación, que incluyen, de modo no taxativo, administraciones simples o múltiples durante varios momentos, administración por bolo e infusión por pulso.
Los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención se formulan, dosifican y administran de una manera coherente con la buena práctica médica. Los factores que deberán considerarse en este contexto incluyen el trastorno particular que se esté tratando, el mamífero particular que se esté tratando, la afección médica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de liberación del agente, el método de administración, el cronograma de administración y otros factores conocidos para los médicos. El anticuerpo o inmunoconjugado se formula opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión, aunque no es necesario. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo o inmunoconjugado presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores mencionados anteriormente. Estos se usan generalmente en las mismas dosificaciones y con las vías de administración como se describe en la presente, o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones descritas en la presente, o en cualquier dosificación y por cualquier vía que se determine de forma empírica/clínica adecuada.
Para la prevención o tratamiento de enfermedades, la dosis adecuada de un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención (cuando se usa solo o en combinación con uno o más agentes terapeuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de anticuerpo o inmunoconjugado, la gravedad y ciclo de la enfermedad, si el anticuerpo o inmunoconjugado se administra con fines preventivos o terapéuticos, terapia anterior, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo o inmunoconjugado y el criterio del médico tratante. El anticuerpo o inmunoconjugado se administra de forma adecuada al paciente una vez o durante una serie de tratamientos. En función del tipo y gravedad de la enfermedad, una posible dosis inicial puede ser de aproximadamente 1 mg/kg a 15 mg/kg (por ej., 0.1 mg/kg-10 mg/kg) de anticuerpo o inmunoconjugado para la administración al paciente ya sea, por ejemplo, en una o más administraciones separadas o por infusión continua. Una dosificación diaria típica puede variar de alrededor de 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, en función de los factores anteriores. Para las administraciones repetidas durante varios días o más, según la afección, el tratamiento se mantiene generalmente hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Un ejemplo de dosificación del anticuerpo o inmunoconjugado está generalmente en el intervalo de alrededor de 0.05 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg. Por lo tanto, pueden administrarse al paciente una o más dosis de alrededor de 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de estas). Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ej., cada semana o cada tres semanas (por ej., de manera que el paciente reciba desde alrededor de dos a alrededor de veinte, por ej., alrededor de seis dosis del anticuerpo). Se puede administrar una dosis de carga inicial mayor seguida por una o más dosis menores. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. La evolución de esta terapia se monitorea fácilmente mediante téenicas y ensayos convencionales.
Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo usando tanto un inmunoconjugado de la invención y un anticuerpo anti-ETBR.
H. Artículos de fabricación En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto en o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, por sí misma o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar el trastorno y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón que pueda perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica). Al menos un agente activo en la composición es un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención. La etiqueta o prospecto indica que la composición se utiliza en el tratamiento de la afección elegida. Además, el artículo de fabricación puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en este, donde la composición comprende un anticuerpo o inmunoconjugado de la invención y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en este, donde la composición comprende otro agente citotóxico o de otro modo terapéutico. El artículo de fabricación en esta modalidad de la invención puede comprender adicionalmente un prospecto indicando que las composiciones pueden usarse para tratar una afección particular. De manera alternativa o adicional, el artículo de fabricación puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
III. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Debe entenderse que pueden llevarse a la práctica otras modalidades diferentes, dada la descripción general provista anteriormente.
A. Producción de conjugados de fármacos de anticuerpos anti-ETBR El conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) anti-ETBR se produjo conjugando hu5E9.vl (SEQ ID NOs: 5 y 6) o ch5E9 (SEQ ID NOs: 27 y 28) con el resto de enlazador-fármaco MC-vc-PAB-MMAE, que se ilustra en la presente. Por razones de conveniencia, el resto fármaco-enlazador MC-vc-PAB-MMAE se denomina a veces en estos Ejemplos y en las Figuras "vcMMAE" o "VCE. " Antes de la conjugación, el anticuerpo se redujo parcialmente con TCEP utilizando métodos estándares de acuerdo con la metodología descrita en WO 2004/010957 A2. El anticuerpo reducido parcialmente se conjugó con el resto fármaco-enlazador usando métodos estándar de acuerdo con la metodología descrita en, por ejemplo, Doronina et ál. (2003) Nat . Biotechnol . 21:778-784 y US 2005/0238649 Al. En resumen, el anticuerpo parcialmente reducido se combinó con el resto fármaco-enlazador para permitir la conjugación del resto fármaco-enlazador a residuos de cisteína reducidos del anticuerpo. La reacción de conjugación se inactivó mediante la adición de N-acetil-cisteína en exceso para que reaccionara con cualquier resto enlazador-fármaco libre y el ADC se purificó. La estructura de anti-ETBR-vc-MMAE (también denominada anti-ETBR-MC-val-cit-PAB-MMAE) se muestra en la Figura 7A. Véase también, publicación estadounidense No. US 2011/0206702.
El conjugado fármaco-anticuerpo (ADC) anti-ETBR que comprende un enlazador val-cit escindióle mediante proteasa y el fármaco PNU-159682 se produjo mediante la conjugación de ch5E9 al resto fármaco-enlazador MC-vc-PAB-PNU-159682, sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de anti-ETBR-MC-val-cit-PAB-PNU-159682 se muestra en la Figura 7C.
El conjugado fármaco-anticuerpo (ADC) anti-ETBR que comprende un enlazador de acetal lábil al ácido y el fármaco PNU-159682 se produjeron mediante la conjugación de ch5E9 al resto fármaco-enlazador MC-acetal-PNU-159682, sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de anti-ETBR- C-acetal-PNU-159682 se muestra en la Figura 7B.
El conjugado fármaco-anticuerpo (ADC) anti-ETBR que comprende un enlazador no escindióle y el fármaco PNU-159682 se produjeron mediante la conjugación de ch5E9 con el resto fármaco-enlazador MC-PNU-159682, sustancialmente como se describió anteriormente. La estructura de anti-ETBR- PNU-159682 se muestra en la Figura 7D.
B. Eficacia de inmunoconjugados Anti-ETBR que comprenden un derivado de nemorubicina en células de melanoma UACC-257X2.2 resistentes a anti-ETBR-vc-MMAE Para determinar la eficacia de un inmunoconjugado anti-ETBR que comprende un derivado de nemorubicina en melanoma que ha desarrollado resistencia a anti-ETBR-vc-MMAE, se desarrollaron células de melanoma UACC-257X2.2 que son resistentes a anti-ETBR-vc-MMAE (también denominado anti-EDNRB-vc-MMAE, anti-ETBR-MC-val-cit-PAB-MMAE, etc.; véase, por ej., publicación estadounidense No. US 2011/0206702) in vivo e in vi tro.
Para la resistencia desarrollada in vivo, ratones lampiños NCr (Taconic, Hudson, NY) fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco dorsal derecho con 5 millones de células UACC-257X2.2 en HBSS con Matrigel. Las células UACC-257X2.2 se obtuvieron a partir de células UACC-257 (Instituto Nacional de Cáncer) y se optimizaron para el crecimiento in vivo como sigue. Células UACC-257 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones lampiños NCr hembras para inducir el crecimiento tumoral. Un tumor se extrajo y cultivó in vitro (denominado línea celular UACC-257X1.2). La línea UACC-257X1.2 se volvió a inyectar por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones lampiños NCr hembras para mejorar el crecimiento de la línea celular in vivo. Un tumor de la segunda ronda de inyección se recogió y se volvió a adaptar para el cultivo in vitro, a efectos de generar UACC-257X2.2. La línea celular UACC-257X2.2 y tumores derivados de esta línea expresan ETBR en niveles comparables a la línea celular original UACC-257.
Diez ratones inoculados con células UACC-257X2.2 se dosificaron con 3 mg/kg de hu5E9.vl-MC-vc-PAB-MMAE intravenosamente el día 0. Para determinar cuándo se tendría que volver a administrar una dosis a los ratones, y qué dosis, se tomaron en cuenta los siguientes factores: si los tumores volvieron a crecer luego del tratamiento inicial o no (es decir, tumores que volvieron a crecer hasta alcanzar el tamaño de volumen de tumor inicial el día 0) y el índice de recrecimiento. La frecuencia de las dosis administradas varió en el tiempo pero no excedió las 2 dosis/semana. Las dosis intravenosas no excedieron los 300 pL. El intervalo de dosis administradas fue 3 mg/kg, 6 mg/kg, 8 mg/kg y 10 mg/kg. La dosificación se discontinuó una vez que un tumor dejó de responder (es decir, mostró resistencia) a una serie de dosis en aumento.
Como se muestra en la Figura 8A, el tumor UACC-257X2.2 #359 desarrolló resistencia a anti-ETBR-ve-MMAE luego de alrededor de 120 días, mientras que el tumor #368 desarrolló resistencia más lentamente. El tumor #359 se cosechó y las células se disociaron para su crecimiento in vitro (denominado en la presente células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo) .
Para la resistencia desarrollada in vitro, las células UACC-257X2.2 se adaptaron a concentraciones en aumento de anti-ETBR-ve-MMAE en bandejas de cultivo durante el curso de dos meses. La Figura 8B muestra la línea celular UACC-257X2.2 resistente derivada in vitro (denominadas en la presente células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro) que, relativamente, no se vio afectada por concentraciones de anti-ETBR-ve-MMAE de hasta al menos 10 mg/ml. La Figura 8B también muestra las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro incubadas con un ADC de control, a-gD-vc- MMAE, y las células UACC-257X2.2 originales incubadas con a-ETBR-vc-MMAE.
La expresión de ETBR en la superficie de las células UACC-257 resistentes derivadas in vitro e in vivo y las células UACC-257 originales se determinó luego mediante FACS. Las células se tiñeron con un anticuerpo anti-ETBR (hu5E9.vl o ch5E9) seguido de un conjugado de anticuerpo Alexa 488 anti-humano. Como se muestra en las Figura 9A y 9B, tanto las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro como las derivadas in vivo tuvieron una menor expresión de ETBR en la superficie de las células en relación con la línea celular original. El pico de control en cada figura muestra la tinción solo con anticuerpo secundario.
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se analizaron luego para determinar su sensibilidad a concentraciones en aumento de anti-ETBR-ve-MMAE.
Se evaluó la proliferación celular in vitro de las líneas celulares en presencia de los inmunoconjugados. Se colocaron células en placas a 1,500 células por pocilio en 50 mL de medio de cultivo normal en placas de fondo transparente de 96 pocilios. Veinticuatro horas después, se agregaron 50 pL adicionales de medio de cultivo con diluciones en serie de inmunoconjugados (ch5E9-vc-MMAE o anti-gD-vc-MMAE de control) para triplicar los pocilios. Cinco días después, se determinó la supervivencia celular usando reactivo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (G7572, Promega Corporation, Madison, WI), utilizando un Lector de etiquetas múltiples EnVision 2101 (Perkin-Elmer, Waltham, MA).
La Tabla 2 muestra la EC50 observada para anti-ETBR-vc- MMAE y enlazador-fármaco (sin anticuerpo) para cada una de las líneas celulares.
Tabla 2: Las EC50 de anti-ETBR-vc-MMAE en células UACC-257X2.2 sensibles y resistentes * Destrucción celular por anti-ETBR-vc-MMAE se pudo comparar a la destrucción por un ADC de control, anti-gD-vc-MMAE.
Los resultados de este experimento sugieren que al menos parte de la resistencia se desarrolla a la parte de fármaco del ADC, lo que sugiere que el remplazo del fármaco con un fármaco diferente puede restaurar parte de la sensibilidad en células resistentes.
Para determinar si parte de la sensibilidad se puede restaurar cambiando la parte de fármaco del ADC, las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vivo e in vitro se analizaron para determinar su sensibilidad a ADC con diferentes enlazadores y diferentes fármacos que los utilizados para desarrollar las células resistentes. El ADC evaluado en este experimento fue anti-ETBR unido a PNU-159682 a través de un enlazador no escindible (ch5E9-PNU). Véase la Figura 7D. La Tabla 3 muestra las EC50 observadas para anti-ETBR-PNU y enlazador-fármaco (sin anticuerpo) para cada una de las líneas celulares.
Tabla 3: Las EC50 de anti-ETBR-PNU en células UACC-257X2.2 sensibles y resistentes Los resultados de este experimento demuestran que al menos parte de la sensibilidad se puede restaurar en las células resistentes mediante el remplazo de la parte de fármaco del ADC.
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se analizaron para determinar su sensibilidad a anti-ETBR unido a PNU-159682 a través de un enlazador acetal lábil al ácido (ch5E9-acetal-PNU). Véase la Figura 7B. La Tabla 4 muestra las EC50 observadas para anti-ETBR-acetal-PNU y enlazador-fármaco (sin anticuerpo) para cada una de las líneas celulares.
Tabla 4: Las EC50 de anti-ETBR-acetal-PNU en celulas UACC- 257X2.2 sensibles y resistentes Tal como se muestra anteriormente, los resultados de este experimento demuestran que al menos parte de la sensibilidad se puede restaurar en las células resistentes mediante el remplazo de la parte de fármaco del ADC.
Las células UACC-257X2.2 resistentes derivadas in vitro e in vivo se analizaron para determinar su sensibilidad a anti-ETBR unido a PNU-159682 a través del enlazador ve utilizado en el inmunoconjugado MMAE (ch5E9-vc-PNU). Véase la Figura 7C. La Tabla 5 muestra las EC50 observadas para anti- ETBR-vc-PNU y enlazador-fármaco (sin anticuerpo) para cada una de las líneas celulares.
Tabla 5: Las EC50 de anti-ETBR-vc-PNU en células UACC-257X2.2 sensibles y resistentes Tal como se muestra anteriormente, los resultados de este experimento demuestran que al menos parte de la sensibilidad se puede restaurar en las células resistentes mediante el remplazo de la parte de fármaco del ADC. Además, los resultados sugieren que parte de la resistencia también se debe a la parte de enlazador del ADC. Comparar las EC50 para determinar las células resistentes derivadas in vitro para anti-ETBR-PNU y anti-ETBR-acetal-PNU con anti-ETBR-vc- PNU.
Pese a que la invención anterior ha sido descrita en detalle a modo ilustrativo y de ejemplo con fines de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como que limitan el alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y bibliografía científica citada en la presente se incorporan expresamente a modo de referencia en su totalidad.
Tabla de secuencias

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Se reivindica lo Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que une ETBR unido covalentemente a un agente donde el anticuerpo se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 64 a 101 de la SEQ ID y donde el agente citotóxico es un derivado de El inmunoconjugado de la reivindicación donde el anticuerpo comprende que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID El inmunoconjugado de la reivindicación 1 o de la reivindicación donde el anticuerpo comprende que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID El inmunoconjugado de la reivindicación donde el anticuerpo comprende que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a donde el anticuerpo comprende que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a donde el anticuerpo una secuencia VH que tiene al menos un de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID O una secuencia VL que tiene al menos un de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID o una secuencia como en y una secuencia VL como en El inmunoconjugado de la reivindicación que comprende una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 8 o la SEQ ID El inmunoconjugado de la reivindicación que comprende una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que une ETBR covalentemente a un agente donde el anticuerpo comprende una secuencia VH que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID 8 y una secuencia VL que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y donde el agente citotóxico es un derivado de El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a donde el anticuerpo es un anticuerpo IgG2a o Un inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a donde el inmunoconjugado tiene la fórmula Ab es el L es un D es el agente y p varía entre El inmunoconjugado de la reivindicación donde D es un derivado de El inmunoconjugado de la reivindicación donde D tiene una estructura que se selecciona El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11 a donde el enlazador es escindible por una El inmunoconjugado de la reivindicación donde el enlazador comprende un dipéptido o un dipéptido El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11 a donde el enlazador es lábil al El inmunoconjugado de la reivindicación donde el enlazador comprende El inmunoconjugado de la reivindicación que tiene la fórmula que se selecciona donde Ri y R2 se seleccionan independientemente de H y alquilo El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11 a donde p varía entre Un inmunoconjugado que tiene una fórmula que se selecciona donde Ab es un anticuerpo que comprende que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID y donde p varía de 1 a El inmunoconjugado de la reivindicación donde el anticuerpo comprende una secuencia VH de la SEQ ID 8 y una secuencia VL de la SEQ ID El inmunoconjugado de la reivindicación donde el anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEQ ID 6 y una cadena ligera de la SEQ ID El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones donde el anticuerpo es un anticuerpo El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a El inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones donde el anticuerpo se une a ETBR El inmunoconjugado de la reivindicación donde el ETBR humano tiene la secuencia de la SEQ ID 10 o la SEQ ID Una formulación farmacéutica que comprende el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente La formulación farmacéutica de la reivindicación que comprende adicionalmente un agente terapéutico Un método para tratar un individuo que tiene cáncer positivo para donde el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a El método de la reivindicación donde el cáncer positivo para ETBR es melanoma El método de la reivindicación que comprende adicionalmente administrar un agente terapéutico adicional al El método de la reivindicación donde el agente terapéutico adicional comprende un anticuerpo que se une a El método de la reivindicación donde el agente terapéutico adicional es un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a PMEL17 de forma covalente a un agente Un método para inhibir la proliferación de una célula positiva para el método comprende exponer la célula al inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 bajo condiciones que permitan la unión del inmunoconjugado a ETBR en la superficie de la inhibiendo así la proliferación de la El método de la reivindicación donde la célula es una célula de Un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer positivo para donde el cáncer positivo para ETBR es resistente a un primer donde el método comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a El método de la reivindicación donde el cáncer positivo para ETBR es El método de la reivindicación 37 o de la reivindicación donde el primer terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no sea El método de la reivindicación donde el primer terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a un antígeno que no sea ETBR y un primer agente El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación donde el primer anticuerpo se une a un antígeno que se selecciona de proteína 1 relacionada con la tirosinasa antígeno 4 del linfocito T citotóxico y glicoproteína NMB El método de la reivindicación donde el primer anticuerpo se une a El método de la reivindicación 37 o de la reivindicación donde el primer terapéutico comprende un primer anticuerpo que se une a El método de la reivindicación donde el primer terapéutico es un primer inmunoconjugado que comprende un primer anticuerpo que se une a ETBR y un primer agente El método de cualquiera de las reivindicaciones 40 a donde el primer agente citotóxico y el agente citotóxico del inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 son El método de la reivindicación donde el primer agente citotóxico es Un método para tratar a un individuo con cáncer positivo para que comprende administrarle al individuo una cantidad eficaz de un primer inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 en combinación con un segundo inmunoconjugado que comprende un anticuerpo que se une a El método de la reivindicación donde el anticuerpo que se une a PMEL17 comprende una HVR H1 que comprende una secuencia de la SEQ ID una HVR H2 que comprende una secuencia de SEQ ID una HVR H3 que comprende una secuencia de SEQ ID una HVR L1 que comprende una secuencia de SEQ ID una HVR L2 que comprende una secuencia de SEQ ID y una HVR L3 que comprende una secuencia de SEQ ID El método de la reivindicación 47 o la reivindicación donde el segundo inmunoconjugado comprende un agente citotóxico que se selecciona de una una pirrolobenzodiazepina y un derivado de El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el segundo inmunoconjugado comprende una auristatina o una El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el segundo inmunoconjugado comprende El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el segundo inmunoconjugado comprende un dímero de PBD que tiene la donde la línea ondulada indica la unión a un El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el segundo inmunoconjugado comprende una parte que comprende El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a 50 y donde el segundo inmunoconjugado comprende un enlazador que comprende El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el cáncer positivo para ETBR es El método de cualquiera de las reivindicaciones 47 a donde el cáncer positivo para ETBR también es positivo para RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona inmunoconjugados y anticuerpos y métodos para insufficientOCRQuality
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