PT2437785E - Método de identificação de sítios para conjugação de igg - Google Patents

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PT2437785E
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immunoglobulin
percent
ninety
quot
residue
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Naresh Chennamsetty
Bernhard Helk
Bernhardt Trout
Veysel Kayser
Vladimir Voynov
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Novartis Ag
Massachusetts Inst Technology
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Description

DESCRIÇÃO
"MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS PARA CONJUGAÇÃO DE IgG" CAMPO DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se a imunoglobulinas e conjugados de imunoglobulina melhorados.
ANTECEDENTES
Os anticorpos monoclonais são de grande utilização laboratorial e terapêutica. Os derivados de anticorpos com propriedades de fluorescência ou ligação especificas de um sitio manipulados por engenharia foram desenvolvidos e têm sido utilizados desde há muitos anos. Mais recentemente, os anticorpos foram também desenvolvidos como agentes terapêuticos, correspondendo atualmente à classe de produtos farmacêuticos de crescimento mais rápido [1]. Os anticorpos são proteínas multidomínio de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas mantidas juntas por ligações dissulfureto. As regiões variáveis especificam a ligação a um antigénio particular, e parte das regiões constantes é responsável pelas funções efetoras através da ligação aos recetores de Fc na superfície de células imunitárias. Devido ao seu potencial na cura de várias doenças, os anticorpos constituem atualmente a classe de substâncias terapêuticas humanas de crescimento mais rápido (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6(5), 343). Desde 2001, a sua comercialização tem estado a aumentar a uma taxa de crescimento médio anual de 35%, a taxa mais alta entre todas as categorias de fármacos biotecnológicos (S. Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097). A manipulação por engenharia de conjugados de anticorpos aumentou ainda mais a versatilidade das aplicações de anticorpos. Em muitas técnicas laboratoriais, enzimas ou sondas fluorescentes são conjugadas com anticorpos para realizar uma função de doseamento, por exemplo quantificação da abundância de antigénios. Em casos de terapia dirigida, moléculas tóxicas pequenas são ligadas a anticorpos que ligam especificamente biomarcadores em células doentes [2-4]. Têm sido seguidas várias abordagens para a conjugação de anticorpos, por exemplo fixação às lisinas da superfície [5], aos hidratos de carbono de Fc [6] ou a dissulfuretos intercadeia parcialmente reduzidos [7] . A conjugação de anticorpos a cisteínas de superfície manipuladas por engenharia permanece uma opção muito atrativa porque a maioria dos anticorpos não têm cisteínas além daquelas utilizadas em ligações dissulfureto intra- e intercadeias. Moléculas pequenas podem ser ligadas ao sítio específico da substituição de cisteína através de química reativa de tiol, tal como as maleimidas [8-14] . A manipulação por engenharia dos domínios CH1 e CH3 tem sido favorecida para evitar interferência com a ligação ao antigénio das regiões variáveis e a função efetora de CH2. Têm sido considerados diferentes critérios para a conjugação bem-sucedida de anticorpos através de cisteínas manipuladas por engenharia. Por exemplo, o domínio de anticorpo onde se vai realizar a mutação, a exposição do sítio mutado, o aminoácido a ser substituído são algumas das variáveis a ter em consideração. Foi desenvolvida uma abordagem de triagem de alto rendimento para identificar sítios adequados para a manipulação e conjugação de cisteínas [15] . Dois dos problemas mais comuns associados a variantes de cisteína de anticorpos são a oligomerização e a marcação ineficiente. Até agora, não há uma ferramenta universal para prever se uma variante de cisteina de anticorpo será estável e eficientemente conjugada. Além disso, atualmente só existem variantes de cisteina para os domínios CL, CH1 e CH3 [8, 9, 11, 12, 15] .
Assim, há uma necessidade de variantes de cisteina de imunoglobulinas adicionais que possam ser utilizadas na geração de conjugados de imunoglobulina estáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um conjugado de imunoglobulina, compreendendo uma imunoglobulina possuindo pelo menos uma mutação no resíduo 7(VH) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteina, e um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é conjugado com o resíduo de cisteina. A invenção também proporciona um método de produção de um conjugado de imunoglobulina, compreendendo: (a) proporcionar uma imunoglobulina modificada ou isolada compreendendo pelo menos uma mutação no resíduo 7(VH) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteina; (b) reduzir o um ou mais resíduos de cisteina substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteina reduzidos; e (c) incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é reativo com os resíduos de cisteina reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina. A invenção também proporciona um método para reduzir a reticulação entre as cisteinas expostas na superfície de uma imunoglobulina numa formulação farmacêutica altamente concentrada de conjugados de imunoglobulina compreendendo: (a) proporcionar uma imunoglobulina; (b) substituir o resíduo 7(VH) , por um resíduo de cisteína, (c) reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos; (d) incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que a molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina; e (e) gerar uma formulação líquida, altamente concentrada do conjugado de imunoglobulina em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é, pelo menos, de 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL ou pelo menos 150 mg/mL. A invenção também proporciona a utilização do conjugado de imunoglobulina da invenção na preparação de um medicamento compreendendo uma formulação líquida altamente concentrada em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é, pelo menos, de 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL ou pelo menos 150 mg/mL, e em que pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado. A invenção também proporciona a utilização do conjugado de imunoglobulina da invenção como uma ferramenta de diagnóstico. A invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o conjugado de imunoglobulina da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO São aqui descritas imunoglobulinas e conjugados de imunoglobulina melhorados que exibem reticulação reduzida que satisfazem esta necessidade.
Assim, um aspeto inclui um conjugado de imunoglobulina compreendendo uma imunoglobulina possuindo pelo menos uma mutação num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7(Vh), 20 (VL), 22 (VL), 25 (VH), 125 (Chi) , 248 (CH2) , 254 (CH2) , 286 (CH2) , 298 (Ch2) e 326 (CH2) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína, e um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é conjugado com o resíduo de cisteína. Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) e 125 (CHi) . Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 248(CH2) e 326 (CH2) · Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 25 (VH) e 286 (Ch2)· Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é no resíduo selecionado do grupo consistindo em 254 (CH2) e 298 (VH) . Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o
conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o
conjugado de imunoglobulina compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o
conjugado de imunoglobulina compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende ainda uma molécula de ligação possuindo pelo menos dois sítios reativos, em que um primeiro sítio reativo é ligado ao resíduo de cisteína da imunoglobulina e um segundo sítio reativo é ligado ao átomo ou molécula. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores possuindo uma molécula de ligação, a molécula de ligação é selecionada do grupo consistindo em uma hidrazona, um dissulfureto, um péptido, um agente quelante, e uma maleimida. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula é selecionado do grupo consistindo em um radionuclídeo, um agente quimioterapêutico, uma toxina microbiana, uma toxina vegetal, um polímero, um hidrato de carbono, uma citocina, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador de enzima-substrato, uma enzima, um péptido, um peptidomimético, um nucleótido, um ARNsi, um microARN, um mimético de ARN, e um aptâmero. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula é λ λ ΊΡΊ ίρρ selecionado do grupo consistindo em Y, I, Cu; Lu, 213Bi, 211At, uma caliqueamicina, uma duocarmicina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da Difteria, ricina, polietileno glicol, hidroxietil-amido, e um resíduo de manosilo. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula reduz a imunogenicidade da imunoglobulina não mutada. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula aumenta a imunogenicidade da imunoglobulina não mutada. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende ainda uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é, pelo menos, de oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
Outro aspeto inclui uma imunoglobulina modificada ou isolada compreendendo pelo menos uma mutação num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) , 25 (VH) , 125 (Chi) r 248 (Ch2) r 254 (Ch2) r 286 (Ch2) e 326 (Ch2) r em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína. Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) e 125 (CHi) , Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 248(CH2) e 326 (CH2) · Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 25 (VH) e 286 (CH2) . Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é no resíduo 254 (CH2) · Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende ainda uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
Outro aspeto inclui polinucleótidos isolados ou recombinantes que codificam as imunoglobulinas do aspeto de imunoglobulina modificada anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores. Em certas formas de realização, o polinucleótido está num vetor. Em certas formas de realização, o vetor é um vetor de expressão. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, um promotor induzível é operacionalmente ligado ao polinucleótido. Outro aspeto inclui células hospedeiras com o vetor de qualquer uma das formas de realização anteriores. Em certas formas de realização, as células hospedeiras são capazes de expressar a imunoglobulina codificada pelo polinucleótido.
Outro aspeto inclui métodos de produção de uma imunoglobulina compreendendo proporcionar um meio de cultura que compreende a célula hospedeira do aspeto anterior e colocar o meio de cultura em condições nas quais a imunoglobulina é expressa. Em certas formas de realização, os métodos incluem um passo adicional de isolamento da imunoglobulina expressa.
Outro aspeto inclui métodos de produção de um conjugado de imunoglobulina compreendendo proporcionar a imunoglobulina do aspeto de imunoglobulina modificada anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores, reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos, e incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina.
Outro aspeto inclui métodos para reduzir a reticulação entre cisteínas expostas na superfície de uma imunoglobulina numa formulação farmacêutica altamente concentrada de conjugados de imunoglobulina compreendendo proporcionar uma imunoglobulina, substituir um resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) , e 125 (CHi) com um resíduo de cisteína, reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos, incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que a molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina, e gerar uma formulação líquida, altamente concentrada do conjugado de imunoglobulina em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
Outro aspeto inclui utilizações do aspeto de conjugado de imunoglobulina anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores na preparação de um medicamento compreendendo uma formulação líquida altamente concentrada em que o conjugado de imunoglobulina é pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de doenças autoimunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças neurológicas, e doenças oncológicas e neoplásicas, incluindo cancro. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva (CHF), vasculite, rosácea, acne, eczema, miocardite e outras condições do miocárdio, lúpus eritematoso disseminado, diabetes, espondilopatias, fibroblastos sinoviais, e estroma da medula óssea; perda óssea; doença de Paget, osteoclastoma; cancro da mama; osteopenia de desuso; desnutrição, doença periodontal, doença de Gaucher, histiocitose das células de Langerhans, lesão da medula espinal, artrite sética aguda, osteomalacia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrução periodontal e fraturas ósseas; sarcoidose; cancros ósseos osteolíticos, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do rim e cancro retal; metástase óssea, gestão da dor óssea, e hipercalcemia maligna humoral, espondilite anquilosante e outras espondilartropatias; rejeição de transplantes, infeções virais, neoplasias hematológicas e condições análogas a neoplasias, por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin (linfoma de Burkitt, pequeno linfoma linfocítico/leucemia linfocítica crónica, micose fungoides, linfoma das células do manto, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de zona marginal, leucemia de tricoleucitos e leucemia linfoplasmocitária), tumores das células precursoras de linfócitos, incluindo leucemia/linforna linfoblástico agudo de células B, e leucemia/ linfoma linfoblástico agudo de células T, timoma, tumores das células T e NK maduras, incluindo leucemias de células T periféricas, leucemia de células T / linfomas de células T do adulto e grande leucemia linfocítica granular, granulomatose de células de Langerhans, neoplasias mieloides tais como leucemias mieloides agudas, incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, e leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicas, e distúrbios mieloproliferativos crónicos, incluindo leucemia mieloide crónica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumores cerebrais (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma e retinoblastoma), tumores sólidos (cancro nasofaríngeo, carcinoma basocelular, cancro pancreático, cancro da via biliar, sarcoma de Kaposi, cancro testicular, cancros uterinos, vaginais ou cervicais, cancro do ovário, cancro do fígado ou cancro do endométrio primário, e tumores do sistema vascular (angiossarcoma e hemangiopericitoma), osteoporose, hepatite, HIV, SIDA, espondilartrite, artrite reumatoide, doenças inflamatórias do intestino (IBD), septicemia e choque sético, doença de Crohn, psoríase, esclerodermia, doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), rejeição de enxerto de ilhéus alogénicos, malignidades hematológicas, tais como mieloma múltiplo (MM), síndrome mielodisplásica (MDS) e leucemia mieloide aguda (AML), inflamação associada a tumores, lesão dos nervos periféricos ou doenças desmielinizantes. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de psoríase em placas, colite ulcerosa, linfoma não-Hodgkin, cancro da mama, cancro colorretal, artrite idiopática juvenil, degenerescência macular, vírus sincicial respiratório, doença de Crohn, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, osteoporose, perda óssea induzida por tratamento, metástases ósseas, mieloma múltiplo, doença de Alzheimer, glaucoma e esclerose múltipla. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o medicamento compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a formulação compreende pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina como monómero não oligomerizado. Em certas formas de realização, a percentagem de monómeros é medida por análise por SDS-PAGE não redutora.
Outro aspeto inclui utilizações do aspeto de conjugado de imunoglobulina anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores como um ingrediente ativo farmacêutico que não oligomeriza.
Outro aspeto inclui utilizações do aspeto de conjugado de imunoglobulina anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores como uma ferramenta de diagnóstico.
Outro aspeto inclui utilizações do aspeto de conjugado de imunoglobulina anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores como um padrão para proteínas de alto peso molecular. Outro aspeto inclui utilizações de um conjugado de imunoglobulina como um padrão para proteínas de alto peso molecular, em que o conjugado de imunoglobulina compreende uma imunoglobulina possuindo pelo menos uma mutação no resíduo 440 (CH3) r em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína, e um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é conjugado com o resíduo de cisteína.
Outro aspeto inclui composições farmacêuticas que incluem um conjugado de imunoglobulina do aspeto de conjugado de imunoglobulina anterior e qualquer uma e todas as combinações das formas de realização anteriores e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, o conjugado de imunoglobulina está a uma concentração de pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado.
Outro aspeto inclui métodos de seleção de um resíduo de uma imunoglobulina para mutação por cisteína que compreende calcular a Propensão para Agregação Espacial de um primeiro resíduo de aminoácido na superfície da imunoglobulina, calcular as Propensões para Agregação Espacial de uma multiplicidade de resíduos da imunoglobulina na proximidade imediata do primeiro resíduo, e selecionar o primeiro resíduo de aminoácido para mutação por cisteína, se a Propensão para Agregação Espacial do primeiro resíduo de aminoácido é igual ou está entre os valores de 0 e -0,11 e se a multiplicidade de resíduos têm Propensões para Agregação Espacial inferiores a 0. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 15 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 10 À do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 7,5 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 5 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o cálculo da Propensão para Agregação Espacial de um resíduo compreende calcular a
Propensão para Agregação Espacial para uma região esférica com um raio centrado num átomo do resíduo. Em certas formas de realização, o raio da região esférica é pelo menos 5 À.
Outro aspeto inclui imunoglobulinas modificadas ou isoladas compreendendo pelo menos uma mutação de um resíduo exposto na superfície por cisteína, em que a Propensão para Agregação Espacial do resíduo é igual ou está entre os valores de 0 e -0,11 e em que as Propensões para Agregação Espacial de uma multiplicidade de resíduos da imunoglobulina na proximidade imediata do primeiro resíduo têm Propensões para Agregação Espacial inferiores a 0. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 15 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 10 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 7,5 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 5 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a Propensão para Agregação Espacial é calculada para uma região esférica com um raio centrado num átomo do resíduo. Em certas formas de realização, o raio é, pelo menos, de 5 Ã.
Outro aspeto inclui métodos de seleção de um resíduo de uma imunoglobulina para mutação por cisteína compreendendo escolher uma multiplicidade de resíduos de aminoácidos da imunoglobulina, em que a multiplicidade de resíduos está exposta na superfície da imunoglobulina, mutar um resíduo da multiplicidade de resíduos por um resíduo de cisteína, conjugar o resíduo de cisteína com um átomo ou molécula para formar um conjugado de imunoglobulina, testar o conjugado de imunoglobulina quanto à propensão para reticulação e atribuir ao conjugado de imunoglobulina um valor de propensão para reticulação, e selecionar o resíduo para mutação por cisteína se o valor de propensão para reticulação é I ou II. Em certas formas de realização, o método compreende ainda atribuir ao conjugado de imunoglobulina um valor de propensão para reticulação de II se menos de 5% do conjugado de imunoglobulina formar dímeros e nenhum do conjugado de imunoglobulina formar trímeros em que a formação de dímeros e trímeros é medida por SDS-PAGE não redutora e redutora comparativas. Em certas formas de realização, o método compreende ainda atribuir ao conjugado de imunoglobulina um valor de propensão para reticulação de I se menos de 1% do conjugado de imunoglobulina formar dímeros em que a formação de dímeros é medida por SDS-PAGE não redutora e redutora comparativas.
Aspetos e formas de realização adicionais da invenção podem ser encontrados ao longo da descrição.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS A presente divulgação refere-se a imunoglobulinas e conjugados de imunoglobulina melhorados que exibem reticulação reduzida. Em certas formas de realização, as imunoglobulinas da divulgação são modificadas em resíduos específicos por substituição com cisteína. A divulgação proporciona imunoglobulinas modificadas e conjugados de imunoglobulina, métodos de preparação de tais imunoglobulinas e conjugados de imunoglobulina, moléculas multivalentes ou multiespecíficas compreendendo tais imunoglobulinas e composições farmacêuticas contendo as imunoglobulinas, conjugados de imunoglobulina ou moléculas biespecíficas da divulgação.
Definições 0 termo "anticorpo" ou "imunoglobulina" como aqui referido inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação ao antigénio (isto é, "porção de ligação ao antigénio") ou cadeias simples dos mesmos. Um "anticorpo" natural é uma glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada é constituída por uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é constituída por três domínios, CHi, CH2 e CH3 · Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve é constituída por um domínio, Cl. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é constituída por três CDRs e quatro FRs organizadas da extremidade amino para a extremidade carboxilo pela seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
Os termos "conjugado de anticorpo" ou "conjugado de imunoglobulina" como aqui referidos incluem qualquer imunoglobulina, fragmento de ligação ao antigénio ou cadeias simples dos mesmos ligados química ou biologicamente a um átomo ou molécula. Os átomos ou moléculas podem incluir, por exemplo, uma citotoxina; agente radioativo, fármaco antitumoral ou agente terapêutico. 0 conjugado de anticorpo retém a imunorreatividade da imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio, isto é, a imunoglobulina ou fragmento de ligação ao antigénio do conjugado de anticorpo tem pelo menos setenta por cento, pelo menos setenta e cinco por cento, pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina antes da conjugação com o átomo ou molécula. 0 termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de antigénio"), como aqui utilizado, refere-se à totalidade ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a aptidão para se ligar especificamente a um antigénio e pelo menos uma porção da região constante da cadeia pesada ou leve. Foi demonstrado que a função de ligação a antigénio de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo inteiro. Os exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "porção de ligação ao antigénio" de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, CL e CHi; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região charneira; um fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHi; e um fragmento Fv que consiste dos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo.
Além disso, apesar de os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, serem codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por uma unidade de ligação sintética que lhes permite serem produzidos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); ver, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples estão também abrangidos pelo termo "região de ligação ao antigénio" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas para os especialistas na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à sua utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.
Um anticorpo ou imunoglobulina "isolado", como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo ou imunoglobulina que está substancialmente isento de outros componentes nos quais tais anticorpos ou imunoglobulina estão naturalmente presentes. Além do mais, um anticorpo ou imunoglobulina isolado pode estar substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como aqui utilizado referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta tipicamente uma especificidade e afinidade de ligação únicas para um epítopo particular. 0 termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos possuindo regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e CDR são derivadas de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada dessas sequências humanas, por exemplo, sequências da linha germinal humana, ou versões mutadas das sequências da linha germinal humana ou sequências estruturais consenso contendo anticorpo derivadas da análise de sequências estruturais humanas como descrita em Knappik, et ai. (2000. J Mol Biol 296, 57-86) .
Os anticorpos humanos da divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagénese aleatória ou específica de um lócus in vitro ou por mutação somática in vivo) . No entanto, o termo "anticorpo humano", como aqui utilizado, não pretende incluir anticorpos nos quais sequências de CDR derivadas da linha germinal de outras espécies de mamíferos, tais como um rato, foram enxertadas em sequências estruturais humanas. O termo "domínio humano", como aqui utilizado, pretende incluir domínios da região constante de imunoglobulina derivados de sequências de origem humana, por exemplo, sequências da linha germinal humana, ou versões mutadas das sequências da linha germinal humana ou sequências estruturais consenso contendo anticorpo derivadas de análise de sequências estruturais humanas como descrito em Knappik, et ai. (2000. J Mol Biol 296, 57-86). O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, gerados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de um animal (por exemplo, um rato) que é transgénico ou transcromossómico para genes da imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir destes, anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados a partir de um biblioteca combinatória de anticorpos humanos, recombinantes, e anticorpos preparados, expressos, gerados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem excisão-união da totalidade ou uma porção de um gene da imunoglobulina humana, sequências para outras sequências de ADN. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões estruturais e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinal humana. No entanto, em certas formas de realização, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagénese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgénico para sequências de Ig humanas, mutagénese somática in vivo) e, deste modo, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinal humana, podem não existir naturalmente no reportório de linhas germinais de anticorpos humanos in vivo.
Um "anticorpo quimérico" é uma molécula de anticorpo na qual (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada para que o sítio de ligação de antigénio (região variável) esteja ligado a uma região constante de uma função efetora e/ou espécie de classe diferente ou alterada, ou a uma molécula completamente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormona, fator de crescimento, fármaco, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada por uma região variável possuindo uma especificidade de antigénio diferente ou alterada. Por exemplo, um anticorpo de rato pode ser modificado substituindo a sua região constante pela região constante de uma imunoglobulina humana compreendendo uma modificação como aqui divulgada. Devido à substituição com uma região constante humana, o anticorpo quimérico pode reter a sua especificidade, embora possuindo antigenicidade reduzida em humanos e, em termos gerais, agregação reduzida em comparação com o anticorpo de rato original ou um anticorpo quimérico sem a modificação como aqui divulgada.
Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo que retém a reatividade de um anticorpo não humano, embora seja menos imunogénico em humanos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, mantendo as regiões CDR não humanas e substituindo as restantes partes do anticorpo pelas suas homólogas humanas (isto é, a região constante bem como as porções estruturais da região variável). Ver, por exemplo, Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et ai., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Outros exemplos de tecnologia de manipulação humana por engenharia incluem, mas não se limitam à tecnologia Xoma divulgada na US 5,766,886. 0 termo "grupo de ligação", "Unidade de ligação", ou "ligação" como aqui utilizado refere-se a uma unidade química compreendendo uma ligação covalente ou uma cadeia de átomos que liga covalentemente um anticorpo a uma unidade de fármaco ou outra molécula. As unidades de ligação incluem um radical bivalente tal como um alquildiilo, um arileno, um heteroarileno, unidades tais como: - (CR2) n0 (CR2) n-, unidades estruturais de alquiloxilo (por exemplo polietilenoxilo, PEG, polimetilenoxilo) e alquilamino (por exemplo polietilenoamino, Jeffamine.TM.); e ésteres e amidas de diácidos incluindo succinato, succinamida, diglicolato, malonato e caproamida. 0 termo "marcador" como aqui utilizado refere-se a qualquer unidade que pode ser ligada covalentemente a um anticorpo e que funciona para: (i) proporcionam um sinal detetável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detetável proporcionado pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo FRET (transferência de energia por ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou aumentar a afinidade de ligação, com o antigénio ou ligando; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo mobilidade eletroforética, ou permeabilidade celular, através da carga, hidrofobicidade, forma ou outros parâmetros fisicos, ou (v) proporcionar uma unidade de captura, para modular a afinidade do ligando, ligação anticorpo/antigénio ou complexação iónica. 0 termo "Humanização" como aqui utilizado refere-se a um método para converter anticorpos não humanos em anticorpos humanos manipulados por engenharia (ver por exemplo, a tecnologia Humaneering ™ da KaloBios).
Como aqui utilizado, "isotipo" refere-se a qualquer classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgGl ou IgG2) que é proporcionada pelos genes da região constante da cadeia pesada que têm os motivos suscetíveis à agregação aqui divulgado (e, por conseguinte, são apropriados para as modificações aqui divulgadas que reduzem a agregação).
Como aqui utilizado, o termo "afinidade" refere-se à força de interação entre o anticorpo e o antigénio em sítios antigénicos únicos. Dentro de cada sítio antigénico, a região variável do "braço" do anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com o antigénio em numerosos sítios; quanto mais as interações, mais forte a afinidade. As modificações aqui divulgadas preferencialmente não reduzem a afinidade da imunoglobulina ou anticorpos aqui divulgados ou a afinidade é reduzida menos do que trinta por cento, menos do que vinte por cento, menos do que dez por cento, ou menos do que cinco por cento. Como aqui utilizado, quando se determina se as modificações aqui divulgadas reduzem a afinidade, a comparação é feita entre a imunoglobulina ou anticorpo com a modificação e a mesma imunoglobulina sem a modificação mas que inclui quaisquer mutações não relacionadas.
Como aqui utilizado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. 0 termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc. 0 termo "agente quimioterapêutico" como aqui utilizado refere-se a um composto químico útil no tratamento de cancro. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem Erlotinib (TARCEVA(TM), Genentech/OSI Pharm.), Bortezomib (VELCADE(TM), Millenium Pharm.), Fulvestrante (FASLODEX(TM), Astrazeneca), Sutente (SU11248, Pfizer), Letrozole (FEMARA(TM), Novartis), Mesilato de imatinib (GLEEVEC(TM), Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatina (Eloxatin(TM), Sanofi), 5-FU (5-fluorouracilo), Leucovorina, Rapamicina (Sirolímus, RAPAMUNE(TM), Wyeth), Lapatinib (GSK572016, GlaxoSmithKline), Lonafarnib (SCH 66336), Sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs.) e Gefitinib (IRESSA(TM), Astrazeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), agentes alquilantes tais como tiotepa e a ciclosfosfamida CYTOXAN(TM); sulfonatos de alquilo tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB 1-TMl); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato do óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracilo; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamall e caliqueamicina omegall (Angew Chem Inti. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como o cromóforo neocarzinostatina e cromóforos antibióticos da cromoproteína enediina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, antramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMICINA (TM) doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tais como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos tais como metotrexato e 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgénios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-glândulas supra-renais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; ansacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínica; 2-etil-hidrazida; procarbazina; PSK(TM) complexo de polissacárido (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel TAXOL(TM) (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulação de paclitaxel em nanopartículas manipuladas contendo albumina sem Cremofor ABRAXANETM (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.) e docetaxel TAXOTERE(TM) (Rhone-Poulenc Rorer,
Antony, França); cloranbucil; gencitabina GEMZAR(TM); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE (TM); novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinóico; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
Estão também incluídos nesta definição de "agente quimioterapêutico": (i) agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormonas em tumores tais como anti-estrogénios e moduladores seletivos do recetor de estrogénio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX(TM)), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e toremifeno FARESTON; (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogénios nas glândulas supra-renais, tal como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE(TM), exemestano AROMASIN(TM), formestanina, fadrozole, vorozole RIVISOR(TM), letrozole FEMARA(TM) e anastrozole ARIMIDEX(TM); (iii) antiandrogénios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserrelina; bem como troxacitabina (um nucleósido de 1,3-dioxolano análogo de citosina); (iv) inibidores de aromatase; (v) inibidores de proteína-cinases; (vi) inibidores de lípido-cinases; (vii) oligonucleótidos antimensageiros, em particular aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação aberrante de células, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Ralf e H-Ras;
(viii) ribozimas tais como um inibidor da expressão de VEGF (por exemplo, a ribozima ANGIOZYME(TM)) e um inibidor da expressão de HER2; (ix) vacinas tais como vacinas de terapia genética, por exemplo, vacina ALLOVECTIN(TM), vacina LEUVECTIN(TM) e vacina VAXID(TM); rIL-2 PROLEUKIN(TM); inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN(TM); rmRH ABARELIX(TM); (x) agentes antiangiogénicos tais como bevacizumab (AVASTIN(TM), Genentech); e (xi) sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.
Como aqui utilizado, o termo "citocina" é um termo genérico para as proteínas libertadas por uma população de células que atuam sobre outra célula como mediadores intercelulares. Os exemplos de tais citocinas são as linfocinas, monocinas e hormonas polipeptídicas tradicionais. Encontram-se incluídas entre as citocinas, as hormonas de crescimento tais como a hormona do crescimento humana, N-metionil-hormona do crescimento humana e hormona do crescimento bovina; hormona paratireoide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteicas tais como hormona estimulante de folículos (FSH), hormona tireoestimulante (TSH) e hormona luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogénio placentário; fator de necrose tumoral-α e -β; substância inibidora mulleriana; péptido associado à gonadotrofina de rato; inibina; activina; fator de crescimento do endotélio vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento de tecido nervoso tais como NGF-β; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento transformante (TGFs) tais como TGF-a e TGF-β; fator de crescimento análogo a insulina-I e -II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferões tais como interferão-α, -β e -γ; fatores de estimulação de colónias (CSFs) tais como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulócitos-macrófagos (GM-CSF); e CSF de granulócitos (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral tal como TNF-a ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos incluindo LIF e ligando de kit (KL) . Como aqui utilizado, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequências naturais.
Como aqui utilizado, o termo, "otimizada" significa que uma sequência de nucleótidos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos utilizando codões que são preferidos na produção de células ou organismos, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleótidos otimizada é manipulada por engenharia para reter completamente ou tanto quanto possível a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência de nucleótidos inicial, a qual é também conhecida como a sequência "parental". A expressão otimizada destas sequências noutras células eucarióticas é também aqui idealizada. As sequências de aminoácidos codificadas pelas sequências de nucleótidos otimizadas são também referidas como otimizadas.
Como aqui utilizado, o termo "atividade de ligação ao antigénio" refere-se à especificidade de ligação de uma imunoglobulina ou conjugado de imunoglobulina ao seu antigénio alvo. Por exemplo, a atividade de ligação ao antigénio pode ser medida por bioensaios à base de células (por exemplo, ensaios de gene repórter), ELISA, ressonância plasmónica superficial (Biacore) , ou quaisquer outras técnicas conhecidas para um especialista na técnica.
Como aqui utilizado, o termo "propensão para reticulação" (CLP) refere-se à propensão de uma imunoglobulina modificada ou conjugado de imunoglobulina contendo uma mutação que é uma substituição com cisteina para reticular com diferentes imunoglobulinas no resíduo de cisteina substituído. Por exemplo, a CLP pode ser determinada pelo nível de oligomerização como medido por SDS-PAGE não redutora, cromatografia de exclusão molecular, dispersão estática ou dinâmica de luz laser com cromatografia de exclusão molecular, ou quaisquer outras técnicas conhecidas para um especialista na técnica. A Classe I compreende variantes que são monoméricas e permanecem estáveis após marcação. As variantes de Classe II contêm uma pequena percentagem de dímeros antes e após marcação. As variantes de Classe III têm uma propensão mais acentuada para oligomerizar incluindo a formação de alguns trímeros. As variantes de Classe IV têm uma propensão ainda mais alta para oligomerizar como evidenciada pela presença de agregados maiores do que trímeros, especialmente após marcação. A classe V inclui variantes de alta propensão para oligomerização de forma semelhante à variante de Classe IV com anomalias estruturais adicionais tais como fragmentação ou coloração da amostra concentrada purificada. 0 termo "epítopo" significa um determinante proteico capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos consistem geralmente em agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares e têm geralmente características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais distinguem-se na medida em que a ligação do primeiro, mas não do último, é perdida na presença de solventes desnaturantes. 0 termo "variante modificada de forma conservadora" aplica-se tanto a sequências de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácidos nucleicos particulares, as variantes modificadas de forma conservadora referem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, para sequências essencialmente idênticas. Devido à degeneração do código genético, uma dada proteína é codificada por um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, em todas as posições em que uma alanina é especificada por um codão, o codão pode ser alterado para qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o polipéptido codificado. Tais variações do ácido nucleico são "variações silenciosas," que são uma espécie de variações modificadas de forma conservadora. Todas as sequências de ácido nucleico aqui que codificam um polipéptido também descrevem todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Um especialista reconhecerá que cada codão num ácido nucleico (exceto AUG, o qual é correntemente o único codão para metionina, e TGG, o qual é correntemente o único codão para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Por conseguinte, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido está implícita em cada sequência descrita.
Para as sequências polipeptídicas, as "variantes modificadas de forma conservadora" incluem substituições, supressões ou adições individuais a uma sequência polipeptídica que resultam na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. Tabelas de substituições conservadoras que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Tais variantes modificadas de forma conservadora são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos da divulgação. Os seguintes oito grupos contêm aminoácidos que são substituições conservadoras uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) , Valina (V); 6)
Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; e 8) Cisteina (C) , Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). 0 termo "idêntico" ou percentagem de "identidade," no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. Duas sequências são "substancialmente idênticas" se as duas sequências têm uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleótidos que são iguais (isto é, 60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade ao longo de uma região especificada, ou, quando não especificada, ao longo de toda a sequência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada como medida utilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleótidos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais preferencialmente ao longo de uma região que tem 100 a 500 ou 1000 ou mais nucleótidos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.
Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual são comparadas as sequências de ensaio. Quando se utiliza um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de ensaio e referência são introduzidas num computador, são designadas coordenadas de subsequências, se for necessário, e são designados os parâmetros do programa de algoritmo de sequências. Podem ser utilizados os parâmetros por defeito do programa, ou podem ser designados parâmetros alternativos. 0 algoritmo de comparação de sequências calcula em seguida a percentagem de identidades de sequência para as sequências de ensaio relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa. Quando se compara duas sequências em termos de identidade, não é necessário que as sequências sejam contígua, mas qualquer lacuna traz consigo uma penalização que reduz a percentagem de identidade global. Para o blastn, os parâmetros por defeito são a Penalização por abertura de lacuna=5 e Penalização por prolongamento de lacuna=2. Para o blastp, os parâmetros por defeito são Penalização por abertura de lacuna=ll e Penalização por prolongamento de lacuna=l.
Uma "janela de comparação", como aqui utilizada, inclui a referência a um segmento de qualquer número de posições contíguas incluindo, mas não se limitando a desde 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais geralmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas depois de as duas sequências terem sido idealmente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, pelo método de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipman, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA do Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Brent et ai., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (ringbou ed., 2003)).
Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e a semelhança de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respetivamente. O Software para realizar as análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve inicialmente a identificação de pares de sequências de pontuação alta (HSPs) identificando palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, as quais são condizentes ou satisfazem alguma pontuação limiar T de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra próxima (Altschul et al., supra) . Estes acertos de palavras próximas iniciais atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais compridos contendo-as. Os acertos de palavras são prolongados em ambas as direções ao longo de cada sequência enquanto a pontuação acumulativa de alinhamento puder ser aumentada. As pontuações acumulativas são calculadas utilizando, para as sequências de nucleótidos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos condizentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalização para resíduos não condizentes; sempre < 0) . Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é utilizada para calcular a pontuação acumulativa. O prolongamento dos acertos de palavras em cada direção é parado quando: a pontuação acumulativa de alinhamento cai por uma quantidade X a partir do valor máximo conseguido; a pontuação acumulativa desce até zero ou menos, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é atingido o final de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T, e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade de alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleótidos) utiliza como parâmetros por defeito um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as cadeias. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como parâmetros por defeito um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915, 1989), alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5787, 1993). Uma medida de semelhança proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), a qual proporciona uma indicação da probabilidade de acordo com a qual a coincidência entre duas sequências de nucleótidos ou aminoácidos ocorreria acidentalmente. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma numa comparação do ácido nucleico de ensaio com o ácido nucleico de referência é inferior a cerca de 0,2, mais preferencialmente inferior a cerca de 0,01 e muito preferencialmente inferior a cerca de 0,001.
Além da percentagem de identidade de sequência indicada acima, outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipéptidos são substancialmente idênticas é que o polipéptido codificado pelo primeiro ácido nucleico reage imunologicamente de forma cruzada com os anticorpos gerados contra o polipéptido codificado pelo segundo ácido nucleico, como descrito abaixo. Assim, tipicamente, um polipéptido é substancialmente idêntico a um segundo polipéptido, por exemplo, quando os dois péptidos diferem apenas por substituições conservadoras. Outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos hibridizam um com o outro sob condições restringentes, como descritas abaixo. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores podem ser utilizados para amplificar a sequência. O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleótidos (por exemplo, ADN) . Tipicamente, refere-se à relação funcional de uma sequência reguladora da transcrição com uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou intensificadora está operacionalmente ligada a uma sequência de codificação se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação numa célula hospedeira ou outro sistema de expressão apropriado. Em geral, as sequências reguladoras da transcrição promotoras que estão operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita estão fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, elas atuam em cis. No entanto, algumas sequências reguladoras da transcrição, tais como os intensificadores, não têm de estar fisicamente contíguas ou localizadas na proximidade das sequências de codificação cuja transcrição melhoram. 0 termo "vetor" pretende referir-se a uma molécula de polinucleótido capaz de transportar outro polinucleótido ao qual foi ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", o qual refere-se a uma volta de ADN de cadeia dupla circular na qual podem ser ligados segmentos adicionais de ADN. Outro tipo de vetor é um vetor virai, onde segmentos de ADN adicionais podem ser ligados ao genoma virai. Certos vetores são capazes de replicação autónoma numa célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos possuindo uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissómicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissómicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de coordenar a expressão de genes aos quais são operacionalmente ligados. Tais vetores são aqui referidos como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de ADN recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente descrição, "plasmídeo" e "vetor" podem ser utilizados indistintamente já que o plasmídeo é a forma de vetor mais geralmente utilizada. No entanto, a divulgação pretende incluir outras formas de vetores de expressão, tais como os vetores virais (por exemplo, retrovirus, adenovirus e vírus adenoassociados deficientes em termos de replicação), que têm funções equivalentes. 0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira") refere-se a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Deve ser entendido que tais termos pretendem referir-se não só à célula objeto particular, mas também à descendência dessa célula. Uma vez que podem ocorrer certas modificações nas gerações seguintes, devido a mutação ou influências ambientais, essa descendência pode, de facto, não ser idêntica à célula-mãe, mas está ainda incluída no âmbito do termo "célula hospedeira" como aqui utilizado. 0 termo "antigénio alvo" refere-se ao antigénio contra o qual a imunoglobulina parental foi criada ou gerada de outro modo (por exemplo, por apresentação em fagos). 0 termo "imunoglobulina não mutada" refere-se à imunoglobulina que não compreende a pelo menos uma mutação que é uma substituição com um resíduo de cisteína. Como aqui utilizada, a imunoglobulina não mutada pode ser uma construção hipotética para efeitos de comparação da propensão para a oligomerização ou da eficiência de conjugação da imunoglobulina com e sem a mutação. A título de exemplo, um anticorpo murídeo que inclui mutações humanizantes bem como mutações por cisteína para efeitos de conjugação não é a imunoglobulina não mutada. A imunoglobulina não mutada seria o anticorpo com as mutações humanizantes, mas sem as mutações por cisteína. Quando uma mutação pretende servir mais do que um efeito incluindo proporcionar sítios para conjugação, a imunoglobulina não mutada não inclui essa mutação. 0 termo "motivo de agregação" refere-se a um conjunto de resíduos agrupados em conjunto com base no seguinte processo. Primeiro, os resíduos com um SAP (5 Ã de raio) maior do que 0,15 são identificados. Em seguida, todos os resíduos dentro de 5 À de cada resíduo com um SAP (raio de 5 Ã) maior do que 0,15 são identificados. Um motivo é então o resíduo com um SAP (raio de 5 Ã) maior do que 0,15 e todos os resíduos com um SAP (raio de 5 Ã) maior do que 0,0 a 5 À do resíduo com um SAP (raio de 5 À) maior do que 0,15. Quaisquer motivos desse tipo que têm pelo menos um resíduo em comum são reiteradamente incorporados num motivo maior até não existirem motivos restantes com um resíduo em comum. Estes motivos ou conjuntos de resíduos restantes constituem motivos de agregação.
Nos casos em que os resíduos de imunoglobulina são aqui referidos por um número, o número do resíduo refere-se ao número de Kabat do resíduo correspondente na molécula de IgGl quando a sequência de imunoglobulina de interesse é alinhada com a imunoglobulina IgGl humana. A título de referência, os domínios constantes das IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas são alinhados:
Domínio CHi . .A. . volta . . . .B. . , . volta. .0. . . C'voita. . D. 120 130 140 150 160 170 I í ! I ! 1
IgGl ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF . . volta . . .E.....volta, , . ,F, . . volta , .G. . . . união 180 190 200 210 220 I I I ! i
IgGl · PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC IgG2 PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYXCNVDHKPSNTKVDKTVERKCC IgG4 PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG IgG3 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVEPKTP (IgGl = SEQ ED NO: 1; IgG2 = SEQ ID NO: 2; IgG4 = SEQ ID NO: 3; IgG3 = SEQ ID NO: 4)
Charneira superior média inferior 230
I
IgGl -DKTHT----------------CPPCP APELLGG (SEQ ID NO: 5)
IgG2 -VE------------ CPPCP AP-PVAG (SEQ ID NO: 6)
IgG4 -PP.......................—- CPSCP APEFLGG (SEQ ID NO: 7)
IgG3 LGTTHT CPRCPEPK******** CPRCP APELLGG (SEQ ID NO: 8)
Domínio CH2
..A.. volta ....B.... volta..C.. 0'volta... D 240 250 260 270 280 290 ! I I I i i
IgGl PSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVBNAKTKP
IgG2 PSWLFPPKPKDTLMISRXPEVXCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKXKP IgG4 PSVFLFPPKFKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP IgG3 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP . . .volta . . . .E. . . .volta. . . .F.....volta . ,G. . . uniãoC3 300 310 320 330 340
í I I I I
IgGl REEQYNSTYRWSVLXVXHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE XgG2 REEQFNSTFRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKXISKTKGQPRE IgG4 REEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE IgG3 REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKXKGQPRE (IgGl = SEQ ID NO: 9; IgG2 = SEQ ID NO: 10; IgG4 = SEQ ID NO: 11; IgG3 = SEQ ID NO: 12)
Domínio CH3 . .A. . volta . . . .B. . . . volta . ,C. . ,0'volta, .D. , . , 350 360 370 380 390 400
! i i i I I
IgGl PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS IgG2 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS IgG4 PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS IgG3 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYKTTPPVLDS volta. . . . . E . . , .volta, , . .F. , , volta . . . ,G. , . . 410 420 430 440 111!
IgGl DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG2 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK IgG4 DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK IgG3 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHFTQKSLSLSPGK (IgGl = SEQ ID NO: 13; lgG2 = SEQ ID NO: 14; lgG4 = SEQ ID NO: 15; IgG3 = SEQ ID NO: 16)
Domínio CL 11 12 13 14 15
0123456789012345678901234567890123456789 constante. KAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLXSDFYPGAVTVAWK constante · VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK 16 17 18 19
0123456789012345678901234567890123456789 constante . ADSSPVKAGVETTTPSKQS-NNKYAASSYLSLTPEQWKSH constante . VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH 20 21 01234567890123456789012345 constante . RSYSCQVTHEG—STVEKTVAPTECS {SEQ ID NO: 17} constante . KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 18)
Os alinhamentos dos domínios VH e VL podem ser encontrados em Ewert, Honegger e Pluchthun, Methods 34 (2004) 184-199.
Conjugados de Imunoglobulina da Invenção A invenção aqui refere-se o conjugados de imunoglobulina incluindo imunoglobulinas possuindo pelo menos uma mutação de um resíduo da superfície da imunoglobulina em que a mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína. O resíduo de cisteína substituído é conjugado com um átomo ou molécula, o qual pode ser, a título de exemplo, um agente citotóxico (por exemplo uma toxina tal como doxorrubicina ou toxina da tosse convulsa), um fluoróforo tal como um corante fluorescente como fluoresceina ou rodamina, um agente quelante para um metal de imagiologia ou radioterapêutico, um marcador de peptidilo ou não peptidilo ou marcador de deteção, ou um agente de eliminação-modificação tal como os vários isómeros de polietileno glicol, um péptido que se liga a um terceiro componente, ou outro hidrato de carbono ou agente lipófilo. Noutras formas de realização, a molécula pode ser uma enzima, um péptido, um peptidomimético, um nucleótido tal como uma molécula de ARN, incluindo ARNsi, microARN e miméticos de ARN, ou aptâmeros.
Conjugados de Imunoglobulina Marcados
Em certas formas de realização, as imunoglobulinas modificadas da invenção podem ser conjugadas com qualquer unidade marcadora que pode ser ligada covalentemente à imunoglobulina através de um grupo tiol reativo da cisteina (Singh et ai (2002) Anal. Biochem. 304:147-15; Harlow E. e Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla.) . 0 marcador ligado pode atuar, por exemplo, para: (i) proporcionar um sinal detetável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detetável proporcionado pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo para originar FRET (transferência de energia por ressonância de fluorescência); (iii) estabilizar interações ou aumentar a afinidade de ligação, com o antigénio ou ligando; (iv) afetar a mobilidade, por exemplo mobilidade eletroforética ou permeabilidade celular, pela carga, hidrofobicidade, forma, ou outros parâmetros físicos, ou (v) proporcionar uma unidade de captura, para modular a afinidade do ligando, ligação anticorpo/antigénio ou complexação iónica.
Os conjugados de imunoglobulina marcados podem ser úteis em ensaios de diagnóstico, por exemplo, para detetar a expressão de um antigénio de interesse em células especificas, tecidos ou soro. Para aplicações em diagnóstico, a imunoglobulina será tipicamente marcada com uma unidade detetável. Encontram-se disponíveis numerosos marcadores que podem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias ilustrativas: (a) Radioisótopos (radionuclídeos) , tais como 3H, nC, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, inIn, 123I, 124I, 125I, 131I,
Xe, Lu, At ou Bi. As ímunoglobulmas marcadas com radioisótopos são úteis em experiências de imagiologia dirigidas a recetores. A imunoglobulina pode ser marcada com reagentes ligandos que ligam, formam quelatos ou complexam de outro modo um metal radioisótopo, em que o reagente é reativo com o tiol de cisteína manipulada por engenharia da imunoglobulina, utilizando as técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. (1991). Os ligandos quelantes que podem complexar urn ião de metal incluem DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA e TETA (Macrocyclics, Dallas, Tex.). Os radionuclídeos podem ser visados por complexação com os conjugados de anticorpo-fármaco da invenção (Wu et al (2005) Nature Biotechnology 23 (9) :1137-1146) .
Os complexos de metal-quelato adequados como marcadores de imunoglobulina para experiências de visualização são divulgados em: Pat. U.S. N.os 5,342, 606; 5,428,155; 5,316,757; 5,480,990; 5,462,725; 5,428,139; 5,385,893; 5,739,294; 5,750,660; 5,834,456; Hnatowich et al (1983) J.
Immunol. Methods 65:147-157; Meares et al (1984) Anal. Biochem. 142:68-78; Mirzadeh et al (1990) Bioconjugate Chem. 1:59-65; Meares et al (1990) J. Cancer 1990, Supl. 10:21-26; Izard et al (1992) Bioconjugate Chem. 3:346-350; Nikula et al (1995) Nucl. Med. Biol. 22:387-90; Camera et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:955-62; Kukis et al (1998) J. Nucl. Med. 39:2105-2110; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Camera et al (1994) J. Nucl. Med. 21:640-646; Ruegg et al (1990) Cancer Res. 50:4221-4226; Verel et al (2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670; Lee et al (2001) Cancer Res. 61:4474-4482; Mitchell, et al (2003)J. Nucl. Med. 44:1105-1112; Kobayashi et al (1999) Bioconjugate Chem. 10:103-111; Miederer et al (2004) J. Nucl. Med. 45:129-137; DeNardo et al (1998) Clinical Cancer Research 4:2483-90; Blend et al (2003) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18:355-363; Nikula et al (1999) J. Nucl. Med. 40:166-76; Kobayashi et al (1998) J. Nucl. Med. 39:829-36; Mardirossian et al (1993) Nucl. Med. Biol. 20:65-74; Roselli et al (1999) Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 14:209-20. (b) Marcadores fluorescentes tais como quelatos de terras raras (quelatos de európio), tipos de fluoresceína incluindo FITC, 5-carboxifluoresceína, 6-carboxifluoresceína; tipos de rodamina incluindo TAMRA; dansilo; Lissamina; cianinas; ficoeritrinas; Vermelho do Texas; e seus análogos. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com imunoglobulinas utilizando as técnicas divulgadas, por exemplo, em Current Protocols in Immunology, supra. Os corantes fluorescentes e reagentes marcadores fluorescentes incluem aqueles que estão comercialmente disponíveis de Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Oreg.) e Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, III.) . c) Vários marcadores de enzima-substrato estão disponíveis ou são divulgados (Pat. U.S. N.° 4,275,149). A enzima geralmente catalisa uma alteração química de um substrato cromogénico que pode ser medida utilizando várias técnicas. Por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, a qual pode ser medida espetrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. As técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. 0 substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode em seguida emitir luz que pode ser medida (utilizando, por exemplo, um quimioluminómetro) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Os exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana; Pat. U.S. N.° 4,737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, malato-desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rábano-silvestre (HRP), fosfatase alcalina (AP), β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacárido-oxidases (por exemplo, glucose-oxidase, galactose-oxidase, e glucose-6-fosfato-desidrogenase), heterocíclico-oxidases (tais como uricase e xantina-oxidase), lactoperoxídase, microperoxídase, e semelhantes. As técnicas para conjugar enzimas com anticorpos são descritas em O'Sullivan et ai (1981) "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", em Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic Press, New York, 73:147-166.
Os exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo: (i) Peroxidase de rábano-silvestre (HRP) com peroxidase de hidrogénio como um substrato, em que a peroxidase de hidrogénio oxida um precursor de corante (por exemplo, ortofenilenodiamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB)); (ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenilo como substrato cromogénico; e (ill) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou substrato fluorogénico 4-metilumbeliferil^-D-galactosidase. Um grande número de outras combinações de enzima-substrato encontra-se disponível para os especialistas na técnica. Para uma revisão geral, ver Pat. U.S. N.° 4,275,149 e 4,318,980.
Um marcador pode ser indiretamente conjugado com as imunoglobulinas modificadas da invenção. Por exemplo, a imunoglobulina pode ser conjugada com biotina e qualquer uma das três grandes categorias de marcadores mencionados acima pode ser conjugada com avidina ou estreptavidina, ou vice-versa. A biotina liga-se seletivamente à estreptavidina e, assim, o marcador pode ser conjugado com a imunoglobulina desta maneira indireta. Alternativamente, para conseguir conjugação indireta do marcador com a variante de imunoglobulina, a variante de imunoglobulina é conjugada com um pequeno hapteno (por exemplo, digoxina) e um dos diferentes tipos de marcadores mencionados acima é conjugado com uma variante de polipéptido anti-hapteno (por exemplo, anticorpo anti-digoxina). Desse modo pode ser conseguida a conjugação indireta do marcador com a variante de imunoglobulina (Hermanson, G. (1996) in Bioconjugate Techniques Academic Press, San Diego).
Os conjugados de imunoglobulina modificada da presente invenção podem ser utilizados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ELISA, ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos e indiretos, ensaios de imunoprecipitação (Zola, (1987) Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p. 147-158, CRC Press, Inc.).
Um marcador de deteção pode ser útil para localizar, visualizar e quantificar uma ligação ou evento de reconhecimento. Os conjugados de imunoglobulina marcados da invenção podem detetar recetores da superfície celular. Outra utilização para os conjugados de imunoglobulina marcados de forma detetável é um método de imunocaptura baseado em esférulas compreendendo a conjugação de uma esférula com um anticorpo marcado com fluorescência e a deteção de um sinal de fluorescência após ligação de um ligando. Metodologias de deteção de ligação semelhantes utilizam o efeito de ressonância plasmónica superficial (SPR) para medir e detetar interações anticorpo-antigénio.
Os marcadores de deteção tais como corantes fluorescentes e corantes quimioluminescentes (Briggs et ai (1997) "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1:1051-1058) proporcionam um sinal detetável e são geralmente aplicáveis à marcação de imunoglobulinas, preferencialmente com as seguintes propriedades: (i) a imunoglobulina marcada deve produzir um sinal muito alto com fundo baixo para que quantidades pequenas de imunoglobulinas possam ser detetadas de forma sensível em ensaios isentos de células e baseados em células; e (ii) o anticorpo marcado deve ser fotoestável para que o sinal fluorescente possa ser observado, monitorizado e registado sem fotobranqueamento significativo. Para aplicações que envolvem a ligação na superfície de células de anticorpos marcados com membranas ou superfícies celulares, especialmente células vivas, os marcadores preferencialmente (iii) têm boa solubilidade em água para conseguir uma concentração efetiva de conjugado e sensibilidade de deteção e (iv) são não tóxicos para as células vivas de modo a não interromper os processos metabólicos normais das células ou originar morte celular prematura. A quantificação direta da intensidade de fluorescência celular e a enumeração de eventos marcados fluorescentemente, por exemplo ligação na superfície celular de conjugados de péptido-corante podem ser realizadas num sistema (FMAT(TM) 8100 HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.) que automatiza ensaios de mistura e leitura, não radioativos com células vivas ou esférulas (Miraglia, "Homogeneous cell- and bead-based assays for high throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) J. of Biomolecular Screening 4:193-204). As utilizações de imunoglobulinas marcadas incluem também ensaios de ligação de recetores da superfície celular, ensaios de imunocaptura, ensaios de imunoabsorção enzimática ligada a fluorescência (FLISA), ensaios de dissociação de caspase (Zheng, "Caspase-3 controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:618-23; Pat. U.S. N.° 6,372,907), apoptose (Vermes, "A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V" (1995) J. Immunol. Métodos 184:39-51) e citotoxicidade. Pode utilizar-se tecnologia de ensaios fluorimétricos em microvolume para identificar a regulação positiva ou negativa de uma molécula que é dirigida à superfície celular (Swartzman, "A homogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening using fluorometric microvolume assay technology", (1999) Anal. Biochem. 271:143-51).
Os conjugados de imunoglobulina marcados da invenção são úteis como biomarcadores e sondas de imagiologia para os vários métodos e técnicas de imagiologia biomédica e molecular tais como: (i) MRI (imagiologia por ressonância magnética); (ii) MicroCT (tomografia computorizada); (iii) SPECT (tomografia computorizada por emissão de fotão único); (iv) PET (tomografia por emissão de positrões) Chen et ai (2004) Bioconjugadte Chem. 15:41-49; (v) bioluminescência; (vi) fluorescência; e (vii) ultrassons. A imunocintigrafia é um procedimento de imagiologia no qual anticorpos marcados com substâncias radioativas são administrados a um doente animal ou humano e é tirada uma fotografia dos sítios no corpo em que o anticorpo se localiza (Pat. U.S. N.° 6,528,624). Os biomarcadores de imagiologia podem ser objetivamente medidos e avaliados como um indicador de processos biológicos normais, processos patogénicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores podem ser de vários tipos: Tipo 0 são marcadores da história natural de uma doença e correlacionam longitudinalmente com índices clínicos conhecidos, por exemplo avaliação MRI da inflamação sinovial na artrite reumatoide; os marcadores de Tipo I capturam o efeito de uma intervenção de acordo com um mecanismo de ação, ainda que o mecanismo possa não estar associado ao resultado clínico; os marcadores de Tipo II funcionam como critérios substitutos em que a alteração ou o sinal do biomarcador prevê um benefício clínico para "validar" a resposta pretendida, tal como a erosão óssea medida na artrite reumatoide por CT. Assim, os biomarcadores de imagiologia podem proporcionar informação terapêutica farmacodinâmica (PD) sobre: (i) a expressão de uma proteína alvo, (ii) ligação de uma substância terapêutica à proteína alvo, isto é, seletividade, e (iii) dados da farmacocinética de eliminação e semivida. As vantagens dos biomarcadores de imagiologia in vivo relativamente aos biomarcadores de base laboratorial incluem: tratamento não invasivo, avaliação quantificável de todo o corpo, administração e avaliação repetida, isto é, múltiplos pontos no tempo, e efeitos que podem ser potencialmente transferidos dos resultados pré-clínicos (animais pequenos) para clínicos (humanos). Para algumas aplicações, a bioimagiologia substitui ou minimiza o número de experiências com animais em estudos pré-clínicos.
Os marcadores de imagiologia à base de radionuclídeos incluem radionuclídeos tais como 3H, nC, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Ga, 86Y, 99Tc, inIn, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 9 Ί -I 9-10
At ou Bi. 0 ião metálico de radionuclideo pode ser complexado com uma unidade de ligação quelante tal como DOTA. Os reagentes da unidade de ligação tais como DOTA-maleimida (4-maleimidobutiramidobenzil-DOTA) podem ser preparados pela reação de aminobenzil-DOTA com ácido 4-maleimidobutírico (Fluka) ativado com cloroformato de isopropilo (Aldrich), seguindo o procedimento de Axworthy et ai (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1802-1807). Os reagentes de DOTA-maleimida reagem com os aminoácidos de cisteína livres das imunoglobulinas modificadas e proporcionam um ligando de complexação de metais no anticorpo (Lewis et ai (1998) Bioconj. Chem. 9:72-86). Os reagentes de marcação com unidade de ligação quelante tais como DOTA-NHS (mono(éster de N-hidroxissuccinimida) do ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetraacético) estão comercialmente disponíveis (MacroCyclics, Dallas, Tex.) . A imagiologia dirigida a recetores com anticorpos marcados com radionuclídeos pode proporcionar um marcador de ativação da via por deteção e quantificação da acumulação progressiva de anticorpos em tecido tumoral (Albert et ai (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210). Os radiometais conjugados podem permanecer intracelulares após degradação lisossómica.
Os métodos de marcação de péptidos são bem conhecidos. Ver Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2; Glazer et al (1975) Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York; Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGryter, Berlin and New York; e Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); De Leon-Rodriguez et al (2004) Chem. Eur. J. 10:1149-1155; Lewis et al (2001) Bioconjugate Chem. 12:320-324; Li et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:110-115; Mier et al (2005) Bioconjugate Chem. 16:240-237.
Os péptidos e proteínas marcados com duas unidades, um repórter fluorescente e um desativador suficientemente próximos sofrem transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET). Os grupos repórter são tipicamente corantes fluorescentes que são excitados pela luz a um certo comprimento de onda e transferem a energia para um grupo aceitador, ou desativador, com o desvio de Stokes apropriado para emissão em brilho máximo. Os corantes fluorescentes incluem moléculas com aromaticidade alargada, tais como fluoresceína e rodamina, e seus derivados. O repórter fluorescente pode ser parcial ou significativamente desativado pela unidade desativadora num péptido intacto. Após dissociação do péptido por uma peptidase ou protéase, pode ser medido um aumento detetável na fluorescência (Knight, C. (1995) "Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes", Methods in Enzymology, Academic Press, 248 :18-34) .
Os anticorpos marcados da invenção podem ser também utilizados como um agente de purificação por afinidade. Neste processo, o anticorpo marcado é imobilizado numa fase sólida tal como uma resina Sephadex ou papel de filtro, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. 0 anticorpo imobilizado é posto em contacto com uma amostra contendo o antigénio a ser purificado, e depois disso o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra exceto o antigénio a ser purificado, o qual está ligado à variante polipeptídica imobilizada. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que libertará o antigénio da variante polipeptídica.
Os reagentes de marcação têm tipicamente funcionalidades reativas que podem reagir (i) diretamente com um tiol de cisteína de uma imunoglobulina modificada para formar o anticorpo marcado, (ii) com um reagente de ligação para formar um intermediário unidade de ligação-marcador, ou (iii) com um anticorpo de ligação para formar o anticorpo marcado. A funcionalidade reativa dos reagentes de marcação inclui: maleimida, haloacetilo, éster de succinimidilo de iodoacetamida (por exemplo NHS, N-hidroxissuccinimida), isotiocianato, cloreto de sulfonilo, 2,6-diclorotriazinilo, éster de pentafluorofenilo, e fosforamidito, embora possam ser também utilizados outros grupos funcionais.
Um grupo funcional reativo ilustrativo é o éster de N-hidroxissuccinimidilo (NHS) de um substituinte grupo carboxilo de um marcador detetável, por exemplo biotina ou um corante fluorescente. O éster de NHS do marcador pode ser pré-preparado, isolado, purificado e/ou caracterizado, ou pode ser preparado in situ e feito reagir com um grupo nucleófilo de um anticorpo. Tipicamente, a forma carboxilo do marcador é ativada fazendo reagir com alguma combinação de um reagente de carbodiimida, por exemplo diciclo-hexilcarbodiimida, diisopropilcarbodiimida, ou um reagente de urónio, por exemplo TSTU (Tetrafluoroborato de 0- (N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametilurónio, HBTU (hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio) ou HATU (hexafluorofosfato de 0- (7-azabenzotriazol-l-il)-N,N,N',N'-tetrametilurónio) , um ativador, tal como 1-hidroxibenzotriazole (HOBt), e N-hidroxissuccinimida para dar o éster de NHS do marcador. Nalguns casos, o marcador e o anticorpo podem ser acoplados por ativação in situ do marcador e reação com o anticorpo para formar o conjugado de marcador-anticorpo num único passo. Outros reagentes de ativação e acoplamento incluem TBTU (hexafluorofosfato de 2-(lH-benzotriazo-l-il)-1-1,3,3-tetrametilurónio), TFFH (2-fluoro-hexafluorofosfato de N,N',N",N"'-tetrametilurónio) , PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazole-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfónio), EEDQ (2-etoxi-l-etoxicarbonil-1,2-di-hidro-quinolina) , DCC (diciclo-hexilcarbodiimida); DIPCDI (diisopropilcarbodiimida), MSNT (1-(mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-lH-l,2,4-triazole, e halogenetos de arilsulfonilo, por exemplo cloreto de triisopropilbenzenossulfonilo.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar utilizações dos conjugados de imunoglobulina como discutidas no parágrafo [0007] e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização como uma ferramenta de diagnóstico.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar utilizações dos conjugados de imunoglobulina como discutidas no parágrafo [0007] e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização como um padrão para proteínas de alto peso molecular.
Conjugados de Polímeros e Imunoglobulina
Noutras formas de realização, a presente invenção também considera conjugados de imunoglobulina, nos quais uma imunoglobulina é ligada a um polímero. Tipicamente, o polímero é solúvel em água para que o componente de imunoglobulina não precipite num meio aquoso, tal como um meio fisiológico. Um exemplo de um polímero adequado é um que foi modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilação, ou um aldeído para alquilação. Desta maneira, o grau de polimerização pode ser controlado. Um exemplo de um aldeído reativo é o propionaldeído de polietileno glicol, ou seus derivados de mono-alcoxilo (C1-C10) ou ariloxilo (ver, por exemplo, Harris, et al., Pat. U.S. N.° 5, 252,714). O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Além do mais, pode utilizar-se uma mistura de polímeros para produzir conjugados com componentes do anticorpo.
Os polímeros solúveis em água adequados incluem, sem limitação, polietileno glicol (PEG), monometoxi-PEG, mono-alcoxi (C1-C10) -PEG, ariloxi-PEG, poli- (N-vinilpirrolidona)PEG, tresli-monometoxi-PEG, propionaldeído de PEG, carbonato de bis-succinimidil-PEG, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de poli(óxido de propileno/óxido de etileno), polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), poli (álcool vinílico), dextrano, celulose, ou outros polímeros baseados em hidratos de carbono. O PEG adequado pode ter um peso molecular desde cerca de 600 a cerca de 60 000, incluindo, por exemplo, 5 000, 12 000, 20 000 e 25 000. Um conjugado pode compreender também uma mistura de tais polímeros solúveis em água.
Como uma ilustração, uma unidade de poli(óxido de alquilo) pode ser ligada à extremidade N-terminal de um componente de imunoglobulina. 0 PEG é um poli(óxido de alquilo) adequado. Por exemplo, uma imunoglobulina pode ser modificada com PEG, um processo conhecido como "PEGuilação." A PEGuilação de uma imunoglobulina pode ser realizada por qualquer uma das reações de PEGuilação conhecidas na técnica (ver, por exemplo, EP 0 154 316, Delgado et ai., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290 (1994), e Francis et al. , Int J Hematol 68:1 (1998)). Por exemplo, a PEGuilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou por uma reação de alquilação com uma molécula de polietileno glicol reativa. Numa abordagem alternativa, os conjugados de imunoglobulina são preparados condensando o PEG ativado, no qual um grupo hidroxilo ou amino terminal do PEG foi substituído por uma unidade de ligação ativada (ver, por exemplo, Karasiewicz et al., Pat. U.S. N.° 5,382,657). A PEGuilação por acilação requer tipicamente a reação de um derivado de éster ativo de PEG com uma imunoglobulina. Um exemplo de um éster de PEG ativado é PEG esterificado com N-hidroxissuccinimida. Como aqui utilizado, o termo "acilação" inclui os seguintes tipos de ligações entre uma imunoglobulina e um polímero solúvel em água: amida, carbamato, uretano e semelhantes. Os métodos de preparação de imunoglobulinas anti-BCMA-TACI PEGuiladas por acilação compreenderão tipicamente os passos de (a) fazer reagir uma imunoglobulina com PEG (tal como um éster reativo de um derivado de aldeído de PEG) sob condições em que um ou mais grupos de PEG se ligam à imunoglobulina, e (b) obter o(s) produto (s) de reação. Em geral, as reacionais ótimas para as reações de acilação serão determinadas com base em parâmetros conhecidos e resultados desejados. Por exemplo, o quanto maior a proporção de PEG: componente de anticorpo, maior a percentagem de produto com componente de anticorpo poliPEGuilado. 0 produto de PEGuilação por acilação é tipicamente um produto de imunoglobulina poliPEGuilada, em que os grupos ε-amino de lisinas são PEGuilados através de um grupo de ligação de acilo. Um exemplo de uma ligação de conexão é uma amida. Tipicamente, o componente de imunoglobulina resultante será pelo menos 95% mono-, di- ou tri-peguilado, embora se possam formar algumas espécies com graus de PEGuilação mais altos dependendo das condições reacionais. As espécies PEGuiladas podem ser separadas de componentes de imunoglobulina não conjugada utilizando métodos de purificação convencionais, tais como diálise, ultrafiltração, cromatografia de troca iónica, cromatografia de afinidade, e semelhantes. A PEGuilação por alquilação envolve geralmente a reação de um derivado aldeído terminal do PEG com um componente de imunoglobulina na presença de um agente de redução. Os grupos PEG podem ser ligados ao polipéptido através de um grupo -CH2-NH. A derivatização através de alquilação redutiva para produzir um produto monoPEGuilado tira partido da reatividade diferenciada dos diferentes tipos de grupos amino primários disponíveis para derivatização. Tipicamente, a reação é realizada a um pH que permite tirar partido das diferenças de pKa entre os grupos ε-amino dos resíduos de lisina e o grupo α-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através dessa derivatização seletiva, a ligação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reativo tal como um aldeído, a uma proteína é controlada. A conjugação com o polímero ocorre predominantemente na extremidade N-terminal da proteína sem modificação significativa de outros grupos reativos tais como os grupos amino da cadeia lateral da lisina. A alquilação redutiva para produzir uma população substancialmente homogénea da molécula de conjugado de componente de anticorpo com monopolímero pode compreender os passos de: (a) fazer reagir um componente de anticorpo com um PEG reativo sob condições de alquilação redutiva a um pH adequado para permitir a modificação seletiva do grupo α-amino na extremidade amino do componente de anticorpo, e (b) obter o(s) produto(s) de reação. 0 agente de redução utilizado para alquilação redutiva deve ser estável em solução aquosa e preferencialmente capaz de reduzir apenas a base de Schiff que se forma no processo inicial de alquilação redutiva. Os agentes de redução preferidos incluem boro-hidreto de sódio, cianoboro-hidreto de sódio, dimetilamina-borano, trimetilamina-borano, e piridina-borano.
Para uma população substancialmente homogénea de conjugados de imunoglobulina com monoplímero, as condições da reação de alquilação redutiva são aquelas que permitem a fixação seletiva da unidade de polímero solúvel em água à extremidade N-terminal da imunoglobulina. Tais condições reacionais proporcionam geralmente diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino na extremidade N-terminal. 0 pH afeta também a proporção de polímero para proteína a ser utilizada. Em geral, se o pH é mais baixo será desejado um grande excesso de polímero para proteína, porque quanto menos reativo for grupo α N-terminal, mais polímero é necessário para conseguir condições ótimas. Se o pH é mais alto, a polímero: componente de anticorpo não tem de ser tão grande porque estão disponíveis mais grupos reativos. Tipicamente, o pH situar-se-á na gama de 3 a 9, ou 3 a 6.
Os métodos gerais de produção de conjugados compreendendo unidades de um polipéptido e um polímero solúvel em água são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Karasiewicz et ai., Pat. U.S. N.° 5,382, 657, Greenwald et ai., Pat. U.S. N.° 5,738,846, Nieforth et al., Clin. Pharmacol. Ther. 59:636 (1996), Monkarsh et al., Anal Biochem. 247:434 (1997)) .
Conjugados de Imunoglobulina e Fármaco
Noutras formas de realização, a presente invenção inclui conjugados de imunoglobulina nos quais uma imunoglobulina é conjugada com uma unidade de fármaco ou citotóxica. A unidade de fármaco dos conjugados de imunoglobulina e fármaco pode incluir, por exemplo, qualquer composto, unidade ou grupo que possua um efeito citotóxico ou citostático. As unidades de fármaco incluem, sem limitação: (i) agentes quimioterapêuticos, os quais podem atuar como inibidores de microtubulina, inibidores da mitose, inibidores de topoisomerase ou agentes intercalantes de ADN; (ii) toxinas proteicas, as quais podem atuar enzimaticamente; e (iii) radioisótopos.
As unidades de fármaco ilustrativas incluem, mas não se limitam a, um maitansinoide, uma auristatina, uma dolastatina, um tricoteceno, CC1065, uma caliqueamicina e outros antibióticos de enediinea, um taxano, uma antraciclinaa, e seus estereoisómeros, isósteres, análogos ou derivados.
Os compostos de maitansina adequados para serem utilizados como unidades de fármaco maitansinoide são bem conhecidos na técnica, e podem ser isolados a partir de fontes naturais de acordo com métodos conhecidos, produzidos utilizando técnicas de engenharia (ver Yu et ai (2002) PROC. NAT. ACAD. SCI. (USA) 99:7968-7973), ou maitansinol e análogos de maitansinol preparados sinteticamente de acordo com métodos conhecidos.
As unidades de fármaco maitansinoide ilustrativas incluem aquelas que têm um anel aromático modificado, tais como: C-19-descloro (Pat. U.S. N.° 4,256,746) (preparada por redução da ansamitocina P2 com hidreto de alumínio lítio); C-20-hidroxilo (ou C-20-desmetilo) +/-C-19-descloro (Pat. U.S. N.° 4,361,650 e 4,307,016) (preparada por desmetilação utilizando Estreptomicetos ou Actinomicetos ou descloração utilizando LAH); e C-20-desmetoxilo, C-20-aciloxilo (-OCOR), +/-descloro (Pat. U.S. N.° 4,294,757) (preparada por acilação utilizando cloretos de acilo) e aquelas possuindo modificações noutras posições.
As unidades de fármaco maitansinoide ilustrativas incluem também aquelas que têm modificações tais como: C-9-SH (Pat. U.S. N.° 4,424,219) (preparada pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5) ; C-14-alcoximetil (desmetoxi/CH2 OR) (Pat. U.S. N.° 4,331,598); C-14-hidroximetilo ou aciloximetilo (CH2OH ou CH2OAc) (Pat. U.S. N.° 4,450,254) (preparada a partir de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxilo (Pat. U.S. N.° 4,364,866) (preparada pela conversão de maitansinol com Estreptomicetos); C-15-metoxilo (Pat. U.S. N.° 4,313,946 e 4,315,929) (isolada a partir de Trewia nudiflora); C-18-N-desmetilo (Pat. U.S. N.° 4,362,663 e 4,322,348) (preparada pela desmetilação de maitansinol com Estreptomicetos); e 4,5-desoxilo (Pat. U.S. N.° 4,371,533) (preparada pelo redução de maitansinol com tricloreto de titânio/LAH).
Conhece-se muitas posições nos compostos de maitansina que são úteis como a posição de ligação, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, para formar uma ligação éster, a posição C-3 possuindo um grupo hidroxilo, a posição C-14 modificada com hidroximetilo, a posição C-15 modificada com um grupo hidroxilo e a posição C-20 possuindo um grupo hidroxilo são todas adequadas.
Os compostos de maitansina inibem a proliferação de células por inibição da formação de microtúbulos durante a mitose através da inibição da polimerização da proteína da microtubulina, tubulina (Remillard et al (1975) Science 189:1002-1005). A maitansina e maitansinoides são altamente citotóxicos mas a sua utilização clínica na terapia do cancro tem sido muito limitada pelos seus efeitos secundários sistémicos graves atribuídos principalmente à sua má seletividade para os tumores. Os ensaios clínicos com maitansina foram descontinuados devido aos efeitos adversos graves no sistema nervoso central e sistema gastrointestinal (Issel et al (1978) Can. Treatment. Rev. 5:199-207).
As unidades de fármaco maitansinoide são unidades de fármaco atrativas em conjugados de imunoglobulina e fármaco porque são: (i) relativamente fáceis de preparar por fermentação ou modificação química, derivatização de produtos de fermentação, (ii) adequadas para derivatização com grupos funcionais adequados para conjugação através de unidades de ligação não dissulfureto com anticorpos, (iii) estáveis no plasma, e (iv) eficazes contra uma variedade de linhas de células tumorais (US 2005/0169933; WO 2005/037992; Pat. U.S. N.° 5,208,020).
Tal como com outras unidades de fármaco, todos os estereoisómeros da unidade de fármaco maitansinoide são considerados para os conjugados da invenção. A unidade de fármaco dos conjugados de imunoglobulina e fármaco incluem também dolastatinas e seus análogos e derivados peptídicos, as auristatinas (Pat. U.S. N.° 5,635,483; 5,780,588). Foi demonstrado que as dolastatinas e auristatinas interferem com a dinâmica dos microtúbulos, a hidrólise do GTP, e a divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e têm atividade anticancerígena (Pat. U.S. N.° 5,663,149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). Várias formas de uma unidade de fármaco de dolastatina ou auristatina podem ser ligadas covalentemente a um anticorpo através da extremidade N-terminal (amino) ou da extremidade C-terminal (carboxilo) da unidade de fármaco peptídico (WO 02/088172; Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784,-Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465).
As formas de realização de auristatina ilustrativas incluem as unidades de fármaco de monometilauristatina DE e DF ligadas à extremidade N-terminal, divulgadas em: WO 2005/081711; Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Número de Resumo 623, apresentado em 28 de março de 2004.
Tipicamente, as unidades de fármaco à base de péptidos podem ser preparadas formando uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos de péptido. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese em fase líquida (ver E. Schroder e K. Luibke, "The Peptides", volume 1, p 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de péptidos. A unidade de fármaco inclui a caliqueamicina, e seus análogos e derivados. A família de antibióticos de caliqueamicina é capaz de produzir quebras do ADN de cadeia dupla a concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família da caliqueamicina, ver Pat. U.S. N.° 5,712,374; 5,714,586; 5,739,116; 5,767,285; 5,770,701, 5,770,710; 5,773,001; 5,877,296. Os análogos estruturais da caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas não se limitam a, γι1, oç1, oq1, N-acetil- γι1, PSAG e Θ1! (Hinman et al Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et al Cancer
Research 58:2925-2928 (1998).
As toxinas proteicas incluem, por exemplo, a cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes da toxina da difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina (Vitetta et al (1987) Science, 238:1098), cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos (WO 93/21232). o o
Os radioisotopos terapêuticos incluem, por exemplo, P, 33,, 90v 125-, 131 τ , Q-,-, 153^ 186,, 188,, 211,, 212,,· P, Y, I, I, 13IIn, Sm, Re, Re, At, Bi, 212Pb, e isótopos radioativos de Lu. O radioisótopo ou outros marcadores podem ser incorporados no conjugado de formas conhecidas (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal
Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989). 0 ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietileno- triaminopentacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante ilustrativo para conjugação de um radionuclideo ao anticorpo (WO 94/11026).
Unidades de Ligação
Em certas formas de realização da presente invenção, o conjugado de imunoglobulina inclui uma molécula de ligação possuindo pelo menos dois sítios reativos. Um sítio reativo é ligado ao resíduo de cisteína substituído da imunoglobulina e o outro sítio reativo é ligado a um átomo ou molécula. Uma "unidade de ligação" é uma unidade bifuncional ou multifuncional que pode ser utilizada para unir uma ou mais unidades de fármaco e uma unidade de imunoglobulina para formar os conjugados de imunoglobulina. Os conjugados de imunoglobulina podem ser convenientemente preparados utilizando uma unidade de ligação possuindo funcionalidade reativa para se ligar ao fármaco ou outra molécula e à imunoglobulina. Um tiol de cisteína de uma imunoglobulina modificada com uma substituição por cisteína pode formar uma ligação com um grupo funcional de um reagente de ligação, uma unidade de fármaco ou intermediário fármaco-unidade de ligação.
Num aspeto, uma unidade de ligação tem um sítio reativo que tem um grupo eletrófilo que é reativo com uma cisteína nucleófila presente num anticorpo. O tiol de cisteína do anticorpo é reativo com um grupo eletrófilo on uma unidade de ligação e estabelece uma ligação covalente com uma unidade de ligação. Os grupos eletrófilo úteis incluem, mas não se limitam aos, grupos maleimida e haloacetamida.
As imunoglobulinas modificadas da invenção reagem com reagentes de ligação ou intermediários fármaco-unidade de ligação, com grupos funcionais eletrófilos tais como maleimida ou α-halocarbonilo, de acordo com o método de conjugação na página 766 de Klussman, et ai (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773. A unidade de ligação pode compreender resíduos de aminoácidos. A unidade de aminoácido, quando presente, liga a imunoglobulina à unidade de fármaco dos conjugados de imunoglobulina e fármaco da invenção. A unidade de ligação de aminoácidos pode ser, por exemplo, uma unidade de dipéptido, tripéptido, tetrapéptido, pentapéptido, hexapéptido, heptapéptido, octapéptido, nonapéptido, decapéptido, undecapéptido ou dodecapéptido. Os resíduos de aminoácidos que compreendem a unidade de aminoácido incluem aqueles que ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, tais como citrulina. A unidade de aminoácido pode ser enzimaticamente dissociada por uma ou mais enzimas, incluindo uma protéase associada a tumor, para libertar a unidade de fármaco.
Noutra forma de realização, a unidade de ligação pode ser uma unidade de ligação de tipo dendrítica para fixação covalente de mais do que uma unidade de fármaco através de uma unidade de ligação multifuncional ramificadora a um anticorpo (Sun et al (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun et al (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). As unidades de ligação dendríticas podem aumentar a proporção molar de fármaco para anticorpo, isto é, a carga, a qual está relacionada com a potência do conjugado de imunoglobulina e fármaco. Assim, nos casos em que uma imunoglobulina modificada tem apenas um grupo tiol de cisteína reativo, uma multiplicidade de unidades de fármaco podem ser ligadas através de uma unidade de ligação dendrítica.
Noutra forma de realização, a unidade de ligação pode estar substituída com grupos que modulam a solubilidade ou reatividade. Por exemplo, um substituinte carregado tal como sulfonato (-SO3-) ou amónio, pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente de ligação com a imunoglobulina ou a unidade de fármaco, ou facilitar a reação de acoplamento do intermediário imunoglobulina-unidade de ligação com a unidade de fármaco, ou do intermediário fármaco-unidade de ligação com a imunoglobulina, dependendo da via sintética utilizada para preparar o conjugado de imunoglobulina.
Os conjugados de imunoglobulina da invenção contemplam expressamente, mas não se limitam aos conjugados de imunoglobulina preparados com os reagentes de ligação: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC e sulfo-SMPB, e SVSB (4-vinilsulfona)benzoato de succinimidilo), e incluindo os reagentes de bis-maleimida: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3 e BM(PE0)4, os quais são comercialmente disponíveis de Pierce Biotechnology, Inc., Customer Service Department, P.0. Box 117, Rockford, III. 61105 E.U.A, E.U.A 1-800-874-3723, Internacional +815-968-0747. Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog. Os reagentes de bis-maleimida permitem a fixação do grupo tiol de um cisteína a uma unidade de fármaco, marcador ou intermediário de ligação contendo tiol, de uma maneira sequencial ou simultânea. Outros grupos funcionais, além da maleimida, que são reativos com um grupo tiol de uma cisteína, unidade de fármaco, marcador ou intermediário de ligação incluem, sem limitação, iodoacetamida, bromoacetamida, vinilpiridina, dissulfureto, dissulfureto de piridilo, isocianato e isotiocianato.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar conjugados de imunoglobulina compreendendo uma imunoglobulina possuindo pelo menos uma mutação no resíduo 7 (VH) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína, e um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é conjugado com o resíduo de cisteína. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende ainda uma molécula de ligação possuindo pelo menos dois sítios reativos, em que um primeiro sítio reativo é ligado ao resíduo de cisteína da imunoglobulina e um segundo sítio reativo é ligado ao átomo ou molécula. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores possuindo uma molécula de ligação, a molécula de ligação é selecionada do grupo consistindo em uma hidrazona, um dissulfureto, um péptido, um agente quelante e uma maleimida. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula é selecionado do grupo consistindo em um radionuclídeo, um agente quimioterapêutico, uma toxina microbiana, uma toxina vegetal, um polímero, um hidrato de carbono, uma citocina, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador de enzima-substrato, uma enzima, um péptido, um peptidomimético, um nucleótido, um ARNsi, um microARN, um mimético de ARN e um aptâmero. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula é Λ Λ ιοί 1 O'] selecionado do grupo consistindo em Y, I, Cu, Lu, 213Bi, 211At, uma caliqueamicina, uma duocarmicina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da Difteria, ricina, polietileno glicol, hidroxietil-amido, e um resíduo de manosilo. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula reduz a imunogenicidade da imunoglobulina não mutada. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o átomo ou molécula aumenta a imunogenicidade da imunoglobulina não mutada. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende ainda uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada. É um aspeto da presente divulgação descrever imunoglobulinas modificadas ou isoladas compreendendo pelo menos uma mutação num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) , 25 (VH) , 125 (CHi) , 2 4 8 (CH2) i 2 54 (CH2) i 286 (CH2) e 326 (CH2), em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína. Em certas formas de realização a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) e 125 (CHi) . Em certas formas de realização a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 248 (CH2) e 326 (CH2) · Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é num resíduo selecionado do grupo consistindo em 25 (VH) e 286 (CH2) · Em certas formas de realização, a pelo menos uma mutação é no resíduo 254 (CH2) · Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina modificada ou isolada compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende ainda uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
Preparação de Conjugados de Imunoglobulina e Fármaco
Num aspeto, a presente invenção inclui métodos de produção de conjugados de imunoglobulina. 0 conjugado de imunoglobulina e fármaco pode ser preparado por várias vias, utilizando reações, condições e reagentes de química orgânica conhecidos para os especialistas na técnica, incluindo: (1) reação de um grupo cisteína de uma imunoglobulina modificada com um reagente de ligação, para formar um intermediário imunoglobulina-unidade de ligação, através de uma ligação covalente, seguida de reação com uma unidade de fármaco ativado; e (2) reação de um grupo nucleófilo de uma unidade de fármaco com um reagente de ligação, para formar um intermediário fármaco-unidade de ligação, através de uma ligação covalente, seguida de reação com um grupo cisteína de uma imunoglobulina modificada. Os métodos de conjugação (1) e (2) podem ser utilizados com uma variedade de imunoglobulinas modificadas, unidades de fármaco e unidades de ligação para preparar os conjugados de imunoglobulina e fármaco da invenção.
Os grupos tiol de cisteína do anticorpo são nucleófilos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrófilos nos reagentes de ligação e intermediários fármaco-unidade de ligação incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres de NHS, ésteres de HOBt, haloformatos e halogenetos de ácido; (ii) halogenetos de alquilo e benzilo, tais como haloacetamidas; (iii) grupos aldeído, cetona, carboxilo e maleimida; e (iv) dissulfuretos, incluindo dissulfuretos de piridilo, através de troca de sulfureto. Os grupos nucleófilos numa unidade de fármaco incluem, mas não se limitam aos: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tio-semicarbazona, hidrazina carboxilato e aril-hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrófilos nas unidades de ligação e reagentes de ligação.
Por exemplo, a maitansina pode ser convertida em May-SSCH3, a qual pode ser reduzida ao tiol livre, May-SH, e feita reagir com um anticorpo modificado (Chari et al (1992) Cancer Research 52:127-131) para gerar um imunoconjugado de maitansinoide-anticorpo com uma unidade de ligação dissulfureto. Os conjugados de anticorpo-maitansinoide com unidades de ligação dissulfureto foram descritos (WO 04/016801; Pat. U.S. N.° 6,884,874; US 2004/039176 Al; WO 03/068144; US 2004/001838 Al; Pat. U.S. N.° 6,441,163, 5,208,020, 5,416,064; WO 01/024763). A unidade de ligação de dissulfureto SPP é construída com o reagente de ligação 4-(2-piridiltio)pentanoato de N-succinimidilo.
Sob certas condições, as imunoglobulinas modificadas podem ser tornadas reativas para conjugação com os reagentes de ligação por tratamento com um agente de redução tal como DTT (reagente de Cleland, ditiotreitol) ou TCEP (cloridrato de tris (2-carboxietil)fosfina; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, Massa.) ou outros agentes de redução conhecidos para um especialista na técnica.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar métodos de produção de conjugados de imunoglobulina proporcionando imunoglobulinas modificadas ou isoladas de acordo com a invenção e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização, reduzindo o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos, e incubando a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina.
Propensão para Agregação Espacial
Num aspeto, a invenção aqui refere-se a métodos para reduzir a reticulação de uma imunoglobulina modificada ou conjugado de imunoglobulina. A invenção pode ser aplicada para gerar imunoglobulinas e conjugados de imunoglobulina com propensão reduzida para reticulação, isto é, a imunoglobulina ou conjugado de imunoglobulina em solução concentrada permanece principalmente na forma monomérica em vez de multímeros agregados de ordem mais elevada. Os métodos aqui representam um avanço na capacidade dos métodos computacionais para avaliar a propensão de uma proteína para reticular. Em particular, os métodos baseiam-se, pelo menos em parte, no cálculo da SAA (Área Acessível ao Solvente) , a qual é conhecida na técnica para caracterizar a superfície de uma proteína. A SAA dá a área superficial de cada aminoácido ou estrutura de proteína que está em contacto com o solvente. A SAA pode ser tipicamente calculada determinando por computador a localização do centro de uma esfera de sondagem à medida que roda sobre a superfície da proteína, isto é, a superfície de um modelo estrutural da proteína. A esfera de sondagem tem o mesmo raio que o de uma molécula de água, R=l,4 À. Os métodos alternativos de cálculo da SAA, descritos abaixo, são conhecidos na técnica e são compatíveis com os métodos aqui descritos. Apesar de a SAA ser muito útil para caracterizar a superfície da proteína, não se constatou que fosse adequada para caracterizar as zonas hidrófobas na superfície da proteína que são potencialmente suscetíveis a agregação devido às seguintes insuficiências, 1. A SAA não distingue entre regiões hidrófobas e hidrófilas 2. A SAA não é diretamente proporcional à hidrofobicidade de um resíduo (por exemplo, a MET tem mais área superficial do que a LEU mas é menos hidrófoba) 3. A SAA não indica se existem vários resíduos hidrófobos próximos que poderiam aumentar, desse modo, a hidrofobicidade de uma certa região. Estes resíduos poderiam estar próximos na sequência primária ou na estrutura terciária ainda que estivessem afastados na sequência primária. De qualquer das formas, eles poderiam aumentar a hidrofobicidade de uma certa zona na superfície do anticorpo.
Uma medida que é aqui descrita, a SAA Efetiva, é gerada calculando a hidrofobicidade da fração do aminoácido que está exposta de acordo com a fórmula abaixo:
Uma outra forma de realização da SAA Efetiva compreende ainda somar a SAA Efetiva ao longo de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, etc.) resíduos de aminoácidos que estão adjacentes na sequência primária de proteína. Embora a SAA Efetiva represente uma melhoria em relação à SAA básica, ela carece contudo da capacidade de contabilizar completamente a estrutura da proteína dobrada e o facto de aminoácidos que não estão adjacentes na sequência de proteína poderem estar na proximidade uns dos outros na estrutura secundária, terciária ou quaternária dobrada de uma proteína. Essa dobragem da proteína pode formar regiões suscetíveis à agregação que não surgem na estrutura primária sozinha, ou que podem ser apenas detetadas de forma mais robusta analisando a estrutura da proteína dobrada. A presente divulgação descreve uma medida nova, mais avançada, denominada de Propensão para Agregação Espacial, que realçará a hidrofobicidade efetiva de uma certa zona ou região na superfície da proteína. A Propensão para Agregação Espacial é calculada para regiões espaciais definidas sobre ou próximas dos átomos de um modelo estrutural da proteína.
Neste contexto, uma "região espacial definida" é um espaço ou volume tridimensional escolhido para capturar uma estrutura física local e/ou ambiente químico sobre ou próximo da estrutura da proteína. Numa forma de realização particularmente preferida, a Propensão para Agregação Espacial é calculada para regiões esféricas com raio R centrados nos átomos de uma proteína (por exemplo, átomos num modelo estrutural da proteína). A Propensão para Agregação Espacial pode ser também calculada para regiões esféricas com raio R centradas sobre ligações químicas, ou posicionadas no espaço próximo do modelo estrutural. Por conseguinte, noutra forma de realização a SAP pode ser calculada para uma região espacial definida centrada próxima de um átomo, por exemplo, centrada sobre um ponto no espaço que está entre 1-10 À, 1-5 À ou 1-2 À do centro de um átomo ou ligação química particular.
Em certas formas de realização, o raio R escolhido está entre 1 Ã e 50 Ã. Em formas de realização particulares, o raio escolhido é, pelo menos, de 1 Ã, pelo menos 3 Ã, pelo menos 4 À, pelo menos 5 À, pelo menos 6 À, pelo menos 7 À, pelo menos 8 Ã, pelo menos 9 Ã, pelo menos 10 Ã, pelo menos 11 Ã, pelo menos 12 Ã, pelo menos 15 Ã, pelo menos 20 Ã, pelo menos 25 À, ou pelo menos 30 À. Em certas formas de realização, o raio escolhido é entre 5 Ã e 15 Ã, entre 5 Ã e 12 Ã, ou entre 5 Ã e 10 Ã. Em formas de realização específicas o raio escolhido é de 5 Ã ou 10 Ã.
Noutras formas de realização, a região para a qual é calculada a Propensão para Agregação Espacial não é esférica. A forma possível da região pode compreender ainda um cubo, um cilindro, um cone, um esferoide elíptico, uma pirâmide, uma semiesfera, ou qualquer outra forma que possa ser utilizada para encerrar uma porção do espaço. Nessas formas de realização, o tamanho da região pode ser escolhido utilizando medidas diferentes do raio, por exemplo, a distância do centro da forma a uma face ou vértice.
Numa certa forma de realização, a SAP pode ser utilizada para selecionar resíduos numa proteína, em particular um anticorpo ou imunoglobulina, que podem ser substituídos por cisteína sem aumentar a propensão da proteína para reticular. Prevê-se que a presente divulgação agilize o processo de identificação de resíduos que podem ser substituídos por cisteína sem aumentar a propensão para reticulação.
Assim, em termos gerais, um método para calcular a Propensão para Agregação Espacial de um átomo particular numa proteína compreende (a) identificar um ou mais átomos num modelo estrutural que representa a proteína, em que o um ou mais átomos estão dentro de uma região espacial definida centrada sobre ou próxima do átomo particular; (b) calcular, para cada um dos um ou mais átomos na região espacial definida, uma razão da área acessível ao solvente (SAA) dos átomos para a SAA dos átomos num resíduo idêntico que está completamente exposto; (c) multiplicar cada razão pela hidrofobicidade do átomo do um ou mais átomos; e (d) somar os produtos do passo (c); em que a soma é a SAP para o átomo particular.
Numa forma de realização relacionada, a SAP pode ser calculada de acordo com um método diferente compreendendo (a) identificar um ou mais resíduos de aminoácidos num modelo estrutural que representa a proteína, em que o um ou mais resíduos de aminoácidos têm pelo menos um átomo dentro de uma região espacial definida centrada sobre ou próxima do particular átomo; (b) calcular, para cada um dos um ou mais resíduos de aminoácidos identificados, uma razão da área acessível ao solvente (SAA) de átomos no aminoácido para a SAA de átomos num resíduo idêntico que está completamente exposto; (c) multiplicar cada razão pela hidrofobicidade do um ou mais resíduos de aminoácidos como determinada por uma escala de hidrofobicidade de aminoácidos; e (d) somar os produtos do passo (c); em que a soma é a SAP para o átomo particular. Em formas de realização preferidas, o modelo estrutural é processado antes do passo (a) permitindo que o modelo estrutural interaja com o solvente numa simulação de dinâmica molecular. Quando um aminoácido é identificado como tendo pelo menos um átomo dentro da região espacial definida, pode o pelo menos um átomo pode ser exigido como sendo exclusivamente um átomo numa cadeia lateral do aminoácido. Alternativamente, pode ser um átomo que seja exigido como sendo um átomo da cadeia principal.
Noutras formas de realização, este método pode compreender ainda realizar opcionalmente uma simulação de dinâmica molecular antes do passo (a) e repetir os passos (a)-(d), realizar de cada vez uma outra simulação de dinâmica molecular numa multiplicidade de passos de tempo, produzir desse modo múltiplas somas como no passo (d), e calcular a média das somas; em que a média calculada é a SAP para o átomo particular.
Um especialista na técnica aperceber-se-á que uma forma de realização da presente divulgação que utiliza a média dos valores calculados durante uma simulação de dinâmica molecular será computacionalmente mais intensiva. Nalguns casos, uma tal forma de realização também proporcionará um mapa mais exato ou altamente resolvido da Propensão para Agregação Espacial. No entanto, as experiências aqui discutidas mostraram que o método continua a ser altamente exato quando não se utiliza a média da dinâmica molecular. Numa forma de realização preferida, os valores da Propensão para Agregação Espacial podem ser calculados para todas as estruturas de proteínas numa base de dados, por exemplo, o Banco de Dados de proteínas (PDB), identificando desse modo rapidamente os resíduos e zonas hidrófobos em todas as estruturas de proteínas conhecidas. Este método permite um rastreio rápido de grandes conjuntos de proteínas para identificar potenciais regiões suscetíveis a agregação e/ou sítios de interação de proteínas.
Numa aplicação preferida, a Propensão para Agregação Espacial é descrita pela seguinte fórmula: SAP,. =Y (V ((SAA-R/SAA-fe)* átomo-hb) aromo ^^MédiadaSimulação t^^átomosdentradeR doátomo em que: 1) SAA-R é a SAA dos átomos da cadeia lateral dentro do raio R que é calculado em cada repetição da simulação. A SAA é preferencialmente calculada no modelo de simulação determinando por computador a localização do centro de uma esfera de sondagem à medida que roda sobre a superfície da proteína. A esfera de sondagem tem o mesmo raio que o de uma molécula de água, R=1,4A. Um especialista na técnica aperceber-se-á que outros métodos de cálculo da SAA seriam compatíveis com os métodos aqui descritos para calcular a SAP. Por exemplo, a SAA pode ser calculada apenas sobre átomos da cadeia lateral de aminoácidos. A SAA pode ser também calculada apenas sobre átomos da cadeia principal de aminoácidos (isto é, os átomos do esqueleto do péptido e hidrogénios associados). Alternativamente, a SAA pode ser calculada apenas sobre os átomos da cadeia principal de aminoácido com a exclusão dos hidrogénios associados; 2) SAA-fe é a SAA da cadeia lateral de resíduo completamente exposto (diga-se, o aminoácido 'X') que é obtida, numa forma de realização preferida, ao calcular a SAA das cadeias laterais do resíduo central na conformação completamente estendida do tripéptido 'Ala-X-Ala'; e 3) átomo-hb é a Hidrofobicidade do Átomo que é obtida como descrito acima utilizando a escala de hidrofobicidade de Black e Mould (Black e Mould, Anal. Biochem. 1991,193, 72-82) . A escala é normalizada de forma que a Glicina possua uma hidrofobicidade de zero. Por conseguinte, os aminoácidos que são mais hidrófobos do que a Glicina são positivos e menos hidrófobos do que a Glicina são negativos na escala hidrófoba.
Um resíduo que é "completamente exposto" é um resíduo, X, na conformação completamente estendida do tripéptido Ala-X-Ala. Um especialista na técnica aperceber-se-á que este arranjo é concebido de tal forma que um cálculo da SAA sobre esse resíduo, X, produzirá a área máxima disponível acessível ao solvente. Por conseguinte, considera-se que podem ser utilizados outros resíduos além da alanina no cálculo sem destruir ou alterar completamente os resultados.
Como descrito acima, os métodos da presente divulgação podem ser aplicados a qualquer modelo estrutural da proteína incluindo uma estrutura de raios X utilizando a mesma fórmula como acima.
De forma semelhante, se a estrutura de raios X não estiver disponível, o mesmo parâmetro de Propensão para Agregação Espacial pode ser aplicado à estrutura gerada através de modelação por homologia, e o parâmetro de SAP pode ser calculado utilizando a mesma fórmula como acima.
Em certas formas de realização a Propensão para Agregação Espacial é calculada para todos os átomos num modelo estrutural da proteína. Nalgumas formas de realização, pode calcular-se a média dos valores atómicos da Propensão para
Agregação Espacial de cada resíduo de proteína individual, ou de pequenos grupos de resíduos.
Utilizações da metodologia de SAP
Num aspeto, a presente divulgação pode ser utilizada como descrita acima para identificar resíduos de aminoácidos, regiões ou zonas hidrófobos numa proteína. Sem se pretender ficar limitado a valores limiares específicos, os átomos ou resíduos de aminoácidos possuindo uma Propensão para Agregação Espacial > 0 são considerados como sendo hidrófobos, ou como estando numa região suscetível a agregação. Dependendo do tipo de proteína, a estrutura particular, e o solvente no qual existe, pode ser desejável identificar átomos ou resíduos utilizando um corte que é ligeiramente abaixo de zero, por exemplo, escolher átomos ou resíduos que têm uma Propensão para Agregação Espacial maior do que -0,1, -0,15, -0,2, etc. Alternativamente, pode ser desejável utilizar um corte mais restringente, por exemplo, 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, etc., a fim de escolher os átomos, resíduos ou zonas mais fortemente hidrófobos. Além disso, como o algoritmo dá números mais altos aos resíduos no centro de uma zona, os resíduos dentro de 3A, 4A, 5A, 7,5A ou 10A do resíduo que satisfaz o corte podem ser também selecionados para mutação por resíduos menos hidrófobos para reduzir a agregação. Noutra forma de realização, pode ser vantajoso simplesmente selecionar átomos ou resíduos que têm uma Propensão para Agregação Espacial que é maior do que os átomos ou resíduos que estão próximos sequencialmente (isto é, ao longo da sequência da proteína) ou, numa forma de realização preferida, espacialmente (isto é, na estrutura tridimensional). Um método preferido para selecionar átomos ou resíduos numa zona hidrófoba consiste em mapear os valores de Propensão para Agregação Espacial calculados, por exemplo, utilizando um código de cor ou código numérico, sobre o modelo estrutural da proteína a partir do qual foram derivados, visualizando-se, desse modo, as diferenças na Propensão para Agregação Espacial ao longo da superfície da proteína e permitindo, assim, uma seleção fácil de zonas ou resíduos hidrófobos. Numa forma de realização particularmente preferida, os cálculos da Propensão para Agregação Espacial são realizados separadamente utilizando dois valores escolhidos para o raio, um de maior resolução, por exemplo, 5A, e um de menor resolução, por exemplo, 10A. Numa tal forma de realização, pode observar-se zonas hidrófobas maiores ou mais amplas sobre a estrutura da proteína com o mapa de menor resolução. Uma vez selecionadas as zonas hidrófobas de interesse no mapa de baixa resolução, aquelas zonas podem ser vistas em mais pormenor no mapa de maior resolução, o que, nalgumas formas de realização, pode permitir que um especialista na técnica escolha mais facilmente ou com maior exatidão os resíduos a mutar ou modificar. Por exemplo, quando se observa uma zona hidrófoba no mapa de maior resolução, pode ser desejável selecionar para mutação o resíduo que tem a pontuação SAP mais alta ou é o mais hidrófobo (por exemplo, o resíduo mais hidrófobo na zona de acordo com a escala de Black e Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-82).
Numa forma de realização específica, um método de identificação de uma região suscetível a agregação numa proteína compreende (a) mapear sobre o modelo estrutural a SAP como calculada de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos para átomos na proteína; e (b) identificar uma região dentro da proteína possuindo uma multiplicidade de átomos que tem uma SAP > 0; em que a região suscetível a agregação compreende os aminoácidos compreendendo a referida multiplicidade de átomos. Numa tal forma de realização, a SAP pode ser calculada para todos os átomos numa proteína ou para uma porção dos átomos. Considera-se que se pode calcular apenas a SAP para resíduos ou grupos de resíduos particulares que são de interesse.
Numa forma de realização semelhante, pode ser informativo representar graficamente as pontuações de SAP dos átomos (ou a pontuação de SAP média sobre os resíduos de aminoácidos). Uma tal representação gráfica que mostra a pontuação de SAP ao longo dos átomos ou resíduos de uma proteína permite a identificação fácil de picos, que podem indicar candidatos para substituição. Numa forma de realização particularmente preferida, as pontuações de SAP ao longo dos átomos ou resíduos na proteína são representadas graficamente num gráfico e a área sob a curva (AUC) é calculada para picos no gráfico. Numa tal forma de realização, os picos com uma maior AUC representam regiões suscetíveis a agregação maiores ou mais hidrófobas. Em formas de realização particulares, será desejável selecionar para substituição um ou mais resíduos que são identificados como existindo num pico, ou, mais preferencialmente, num pico com uma AUC grande.
Em formas de realização particulares, a presente invenção pode ser utilizada para selecionar um resíduo de uma imunoglobulina para mutação por cisteína. Como aqui utilizada, calcula-se o valor de SAP de um primeiro resíduo de aminoácido na superfície de uma imunoglobulina. Se o valor de SAP é igual ou está entre os valores de 0 e -0,11, o primeiro resíduo é selecionado para mutação por cisteína. Numa outra forma de realização, calcula-se os valores de SAP de uma multiplicidade de resíduos da imunoglobulina na proximidade imediata do primeiro resíduo. Se a multiplicidade de resíduos tem valores de SAP menores do que 0, o primeiro resíduo é selecionado para mutação por cisteína.
As variantes de imunoglobulina podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica incluindo mutagénese especifica de um lócus e outras tecnologias de ADN recombinante, por exemplo, ver Pat. US N.° 5284760; 5556747; 5789166; 6878531, 5932419; e 6391548.
Em formas de realização particulares, a presente divulgação pode ser utilizada para preparar uma variante de imunoglobulina que pode ser conjugada com um átomo ou molécula ao substituir pelo menos um resíduo de aminoácido exposto na superfície da imunoglobulina identificado por qualquer um dos métodos aqui descritos por um resíduo de aminoácido natural, um resíduo de aminoácido modificado, um resíduo de aminoácido invulgar, um resíduo de aminoácido não natural, ou um análogo ou derivado de aminoácido que pode ser utilizado para conjugar a imunoglobulina com um átomo ou molécula. Em formas de realização preferidas, o resíduo de aminoácido exposto na superfície da imunoglobulina é substituído por cisteína. Noutras formas de realização, o resíduo de aminoácido é substituído por lisina, aspartato ou pirorlisina. A síntese de aminoácidos não naturais é conhecida para os especialistas na técnica, e é ainda descrita, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. N.° 2003-0082575. Em geral, pode utilizar-se qualquer método conhecido na técnica para sintetizar ou incorporar aminoácidos não naturais, modificados ou invulgares em proteínas incluindo, mas não se limitando àqueles métodos descritos ou referenciados nas publicações Liao J. Biotechnol Prog. 2007 Jan-Feb; 23(1):28-31; Rajesh,e Iqbal. Curr Pharm Biotechnol. 2006 Aug; 7(4):247-59; Cardillo et ai. Mini Rev Med Chem. 2006 Mar; 6(3) :293-304,- Wang et ai. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006; 35:225-49; Chakraborty et ai., Glycoconj J. 2005 Mar; 22(3):83-93. Como um outro exemplo, a tecnologia Ambrx ReCODE™ pode ser utilizada para desenvolver e incorporar aminoácidos não naturais, ou aminoácidos invulgares em proteínas como indicado pelos métodos aqui descritos.
Os conjugados de imunoglobulina de acordo com a invenção podem apresentar estabilidade aumentada ou melhorada como determinado, por exemplo, por SDS-PAGE não redutora.
Por conseguinte, é um objetivo da presente divulgação proporcionar polinucleótidos isolados ou recombinantes que codificam imunoglobulinas modificadas como discutidas nos parágrafos [0008] e [0019] e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização. Em certas formas de realização, o polinucleótido está num vetor. Em certas formas de realização, o vetor é um vetor de expressão. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, um promotor induzível está operacionalmente ligado ao polinucleótido. Outro aspeto inclui células hospedeiras com o vetor de qualquer uma das formas de realização anteriores. Em certas formas de realização, as células hospedeiras são capazes de expressar a imunoglobulina codificada pelo polinucleótido.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar métodos de produção de uma imunoglobulina com uma propensão reduzida para reticulação que compreendem proporcionar um meio de cultura que compreende a célula hospedeira do parágrafo anterior e colocar o meio de cultura em condições nas quais a imunoglobulina é expressa. Em certas formas de realização, os métodos incluem um passo adicional de isolamento da imunoglobulina expressa.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar métodos de seleção de um resíduo de uma imunoglobulina para mutação por cisteína que compreendem calcular a Propensão para Agregação Espacial de um primeiro resíduo de aminoácido na superfície da imunoglobulina, calcular as Propensões para Agregação Espacial de uma multiplicidade de resíduos da imunoglobulina na proximidade imediata do primeiro resíduo, e selecionar o primeiro resíduo de aminoácido para mutação por cisteína se a Propensão para Agregação Espacial do primeiro resíduo de aminoácido é igual ou está entre os valores de 0 e -0,11 e se a multiplicidade de resíduos têm Propensões para Agregação Espacial inferiores a 0. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 15 À do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 10 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 7,5 À do primeiro resíduo. Em certas formas de realização, a multiplicidade de resíduos está dentro de 5 Ã do primeiro resíduo. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o cálculo da Propensão para Agregação Espacial de um resíduo compreende calcular a Propensão para Agregação Espacial de uma região esférica com um raio centrado num átomo do resíduo. Em certas formas de realização, o raio da região esférica é, pelo menos, de 5 Ã.
Nalgumas formas de realização, a invenção refere-se ainda a um código de computador para determinar a SAP de acordo com os métodos da invenção. Noutras formas de realização, a invenção refere-se a um computador, um supercomputador ou grupo de computadores dedicado à realização dos métodos da invenção. Ainda noutro aspeto, a invenção proporciona um serviço baseado na rede, baseado em servidor, ou baseado na internet para selecionar resíduos de uma proteína para serem mutados por cisteína, em que o serviço compreende aceitar dados sobre uma proteína (por exemplo, um modelo estrutural da proteína) a partir de um utilizador (por exemplo, na internet) ou recuperar essas dados a partir de uma base de dados de tal forma que o prestador de serviços pode gerar, recuperar ou aceder a uma estrutura estática da proteína, incluindo opcionalmente a modelação da dinâmica molecular da proteína para proporcionar uma estrutura dinâmica da proteína, determinar a SAP para átomos ou resíduos da proteína com base na estrutura estática ou dinâmica assim gerada, e reencaminhar os dados de SAP, por exemplo, como um modelo estrutural mapeado com os referidos dados de SAP pelo prestador de serviços, para um utilizador. Nalgumas formas de realização, o utilizador é uma pessoa. Noutras formas de realização o utilizador é um sistema de computador ou algoritmo de computador automatizado.
Nalgumas formas de realização a presente invenção proporciona um sistema de cálculo da SAP que compreende: um servidor de rede para proporcionar um serviço de rede para calcular a SAP para um terminal do utilizador através da Internet; uma base de dados para guardar a informação geral sobre o método de cálculo, hidrofobicidade de aminoácidos, etc., e um servidor de cálculo para realizar o cálculo da SAP com base na informação na base de dados e informação fornecida ou transmitida através da internet pelo utilizador.
Nalgumas formas de realização, o servidor de rede e o servidor de cálculo são o mesmo sistema de computador. Nalgumas formas de realização, o sistema de computador é um supercomputador, um grupo de computadores, ou uma única estação de trabalho ou servidor. Numa forma de realização relacionada, o servidor de rede do sistema de cálculo da SAP compreende ainda um controlador para controlar toda a operação, uma unidade de ligação à rede para ligação à Internet, e uma unidade de serviço de rede para proporcionar um serviço de rede para calcular a SAP para o terminal do utilizador ligado através da Internet.
Além disso, as formas de realização da presente invenção referem-se ainda a produtos de armazenamento em computador com um suporte legível por computador que contém o código do programa para realizar várias operações implementadas por computador, por exemplo, calcular a SAP para um modelo estrutural, calcular a SAA, calcular a SAA efetiva, manipular modelos estruturais, implementar simulações de dinâmica molecular, organizar e guardar dados relevantes, ou realizar outras operações aqui descritas. 0 meio legível por computador é qualquer dispositivo de armazenamento de dados que pode guardar dados que podem ser depois lidos por um sistema de computador. Os exemplos de meios legíveis por computador incluem, mas não se limitam a disco rígidos, disquetes, memórias USB, discos óticos (por exemplo, CDs, DVDs, HD-DVDs, discos Blu-Ray, etc.) e especialmente dispositivos de hardware configurados tais como circuitos integrados específicos de aplicação (ASICs) ou dispositivos lógicos programáveis (PLDs). 0 meio legível por computador pode ser também distribuído como um sinal de dados incorporado numa onda transportador numa rede de sistemas de computador acoplados pelo que o código legível por computador é armazenado e executado de uma maneira distribuída. Será entendido pelos especialistas na técnica que os elementos de hardware e software descritos acima são de conceção e construção convencionais. As formas de realização relacionadas com computador, internet, servidor e serviços descritas acima podem ser aplicadas à SAA e à SAA efetiva, bem como à SAP.
Composições Farmacêuticas que Contêm Imunoglobulinas e Conjugados de Imunoglobulina
Noutro aspeto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica, contendo um ou mais conjugados de imunoglobulina produzidos pelos métodos da invenção, formulados em conjunto com um veiculo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas da invenção podem ser também administradas em terapia de associação, isto é, associadas a outros agentes. Por exemplo, a terapia de associação pode incluir um conjugado de imunoglobulina da presente invenção associado a pelo menos um outro agente anticancerigeno.
Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis. Preferencialmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, a imunoglobulina ou sua variante da invenção, pode ser revestido num material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19) . Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fósforo e semelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanoicos substituídos com fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos e aromáticos e semelhantes. Os sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Uma composição farmacêutica da invenção pode incluir também um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Os exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbilo, hidroxianisole butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galhato de propilo, alfa-tocoferol e semelhantes; e (3) agentes quelantes de metais, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e semelhantes.
Os exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser utilizados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etilo. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pela utilização de tensioativos.
Estas composições podem conter também adjuvantes tais como conservantes, humectantes, emulsionantes e dispersantes. A prevenção de presença de microrganismos pode ser garantida por procedimentos de esterilização, e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e semelhantes. Pode ser também desejável incluir agentes isotónicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções estéreis ou dispersões aquosas e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, é considerada a sua utilização nas composições farmacêuticas da invenção. Nas composições podem ser também incorporados compostos ativos complementares.
As formulações ilustrativas compreendem pelo menos um conjugado de imunoglobulina da invenção e podem compreender concentrações mais baixas de agentes estabilizantes, os quais, além dos métodos aqui divulgados, podem ser utilizados para prevenir ou diminuir a reticulação de uma imunoglobulina. Por conseguinte, os métodos convencionais utilizados para prevenir a reticulação podem ser utilizados no desenvolvimento de composições farmacêuticas contendo os conjugados de imunoglobulina produzidos pelos métodos da presente invenção. Por exemplo, uma variedade de compostos estabilizantes ou desintegrantes pode ser incluída nas composições farmacêuticas da invenção dependendo da sua utilização pretendida e da sua toxicidade biológica. Tais compostos estabilizantes podem incluir, por exemplo, ciclodextrina e seus derivados (Pat. U.S. N.° 5730969), composições de alquilglicósido (Pedido Pat. U.S. N.° 11/474,049), a utilização de moléculas de chaperona (por exemplo, LEA (Goyal et ai., Biochem J. 2005, 388(Pt 1):151-7; os métodos da Pat. U.S. N.° 5688651), compostos de betaína (Xiao, Bum, Tolbert, Bioconjug Chem. 23 de maio de 2008 «) , tensioativos (por exemplo, Plurónico F127, Plurónico F68, Tween 20 (Wei et ai. International Journal of Pharmaceutics. 2007, 338(1-2):125-132)) e os métodos descritos nas Pat. U.S. N.° 5696090, 5688651 e 6420122.
Além disso, as proteínas e, em particular, os anticorpos, são estabilizados nas formulações utilizando associações de diferentes classes de excipientes, por exemplo, (1) os dissacáridos (por exemplo Sacarose, Trealose) ou polióis (por exemplo Sorbitol, Manitol) atuam como estabilizantes por exclusão preferencial e são também capazes de atuar como crioprotetores durante a liofilização, (2) os tensioativos (por exemplo Polissorbato 80, Polissorbato 20) atuam através da minimização das interações das proteínas em interfaces como as interfaces líquido/gelo, líquido/superfície do material e/ou líquido/ar e (3) os tampões (por exemplo fosfato, citrato, histidina) ajudam a controlar e manter o pH da formulação. Por conseguinte, tais dissacáridos, polióis, tensioativos e tampões podem ser utilizados para além dos métodos da presente invenção para estabilizar ainda mais as imunoglobulinas e prevenir a sua agregação.
Tipicamente, as composições terapêuticas têm de ser estéreis e estáveis nas condições de fabrico e conservação. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura organizada adequada à concentração alta de fármaco. 0 veiculo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol liquido, e semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões e pela utilização de tensioativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade necessária de um solvente apropriado com um ou uma combinação dos ingredientes enumerados acima, consoante necessário, seguida de microfiltração para esterilização. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo num veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo e secagem por congelação (liofilização) que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução dos mesmos, previamente esterilizada por filtração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma única forma de dosagem variará dependendo do indivíduo a ser tratado, e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma única forma de dosagem será geralmente aquela quantidade de composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, numa base de cem por cento, esta quantidade variará desde cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferencialmente desde cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, muito preferencialmente desde cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um veiculo farmaceuticamente aceitável.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar métodos para reduzir a reticulação entre cisteinas expostas na superfície de uma imunoglobulina numa formulação farmacêutica altamente concentrada de conjugados de imunoglobulina que compreendem proporcionar uma imunoglobulina, substituir o resíduo 7(VH) por um resíduo de cisteína, reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos, incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que a molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina, e gerar uma formulação líquida, altamente concentrada do conjugado de imunoglobulina em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é, pelo menos, de 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, a imunoglobulina é selecionada do grupo compreendendo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Em certas formas de realização, a imunoglobulina compreende uma IgGl. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CHi humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CH2 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CH3 humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio CL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio VH humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, a imunoglobulina compreende um domínio VL humano. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina compreende uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar formulações de imunoglobulina modificada que pode ser constituídas por conjugados de imunoglobulina da invenção e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização a uma concentração de pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, o conjugado de imunoglobulina está a uma concentração maior do que a concentração à qual um conjugado de imunoglobulina conhecido por ter uma alta propensão para oligomerização forma oligómeros numa solução liquida concentrada nas mesmas condições. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com qualquer uma das formas de realização anteriores, a formulação inclui um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com qualquer uma das formas de realização anteriores, a formulação de imunoglobulina compreende pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento de conjugado de imunoglobulina que é monómero não oligomerizado.
Por conseguinte, é um objetivo da presente divulgação proporcionar utilizações dos conjugados de imunoglobulina da invenção e de qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização como um ingrediente ativo farmacêutico que não oligomeriza.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar composições farmacêuticas que incluem um conjugado de imunoglobulina da invenção e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização, a imunoglobulina está a uma concentração de pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, o conjugado de imunoglobulina está a uma concentração maior do que a concentração à qual um conjugado de imunoglobulina conhecido por ter uma alta propensão para oligomerização forma oligómeros numa solução liquida concentrada nas mesmas condições. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com as formas de realização anteriores, pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com qualquer uma das formas de realização anteriores, a formulação de imunoglobulina compreende pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento de conjugado de imunoglobulina que é monómero não oligomerizado. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com formas de realização anteriores, a oligomerização é medida por SDS-PAGE não redutora.
Os regímenes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica) . Por exemplo, pode ser administrado um único bolus, podem ser administradas várias doses divididas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como determinado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular as composições parentéricas na forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. As especificações para as formas unitárias de dosagem da invenção são determinadas e diretamente dependentes das (a) características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser conseguido, e (b) limitações inerentes na técnica de formulação de um tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
Para administração do conjugado de imunoglobulina, a dosagem varia desde cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da gama de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento ilustrativo inclui a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez um mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada três a 6 meses. Os regímenes de dosagem preferidos para um conjugado de imunoglobulina da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, sendo o anticorpo administrado utilizando um dos seguintes planos de administração: (i) a cada quatro semanas durante seis doses, em seguida a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez, seguida de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
Alternativamente um conjugado de imunoglobulina da invenção pode ser administrado como uma formulação de libertação sustentada, em cujo caso é necessária uma administração menos frequente. A dosagem e frequência variam dependendo da semivida da substância administrada ao doente. Em geral, os anticorpos humanos apresentam a semivida mais longa, seguida dos anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Nas aplicações profiláticas, uma dose relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um intervalo de tempo longo. Alguns doentes continuam a receber tratamento durante o resto das suas vidas. Nas aplicações terapêuticas é por vezes necessária uma dose relativamente alta em intervalos relativamente curtos até a progressão da doença ser reduzida ou terminada, e preferencialmente até que o doente mostre uma melhoria parcial ou total dos sintomas da doença. Depois disso, pode administrar-se um regime profilático ao doente.
Os níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser modificados para se obter uma quantidade de ingrediente ativo que é eficaz para conseguir a resposta terapêutica desejada para um doente, composição e modo de administração particulares, sem que seja tóxica para o doente. 0 nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção utilizadas, ou do seu éster, sal ou amida, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular a ser utilizado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais utilizados em associação com as composições particulares utilizadas, a idade, género, peso, condição, saúde geral e história clínica anterior do doente a ser tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.
Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" do conjugado de imunoglobulina da invenção resulta preferencialmente numa diminuição da gravidade dos sintomas de doença, um aumento na frequência e duração dos períodos livres de sintomas de doença, ou uma prevenção da deficiência ou incapacidade devido à doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" inibe preferencialmente o crescimento celular ou crescimento tumoral em pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferencialmente em pelo menos cerca de 80% relativamente aos indivíduos não tratados. A aptidão de um composto para inibir o crescimento tumoral pode ser avaliada num sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a aptidão do composto para inibir, essa inibição in vitro através de ensaios conhecidos do médico especialista. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor ou, de outro modo, melhorar os sintomas num indivíduo. Um especialista com conhecimentos médios na matéria seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a gravidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou via de administração selecionada.
Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração utilizando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será entendido pelo especialista, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. As vias de administração preferidas para as unidades de ligação da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinal ou outras vias de administração parentérica, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parentérica" como aqui utilizada significa modos de administração diferentes da administração entérica e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, a injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinal, epidural e intraesternal.
Alternativamente, um conjugado de imunoglobulina da invenção pode ser administrado através de uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a libertação rápida, tal como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, tais como etileno-acetato de vinilo, polianidridos, poli(ácido glicólico), colagénio, poliortoésteres e poli(ácido láctico). Muitos métodos para a preparação destas formulações estão patenteados ou são geralmente conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, numa forma de realização preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tal como os dispositivos divulgados nas Patentes U.S. N.° 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ou 4,596,556. Os exemplos de implantes e módulos bem conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. N.° 4,487,603, a qual divulga uma micro-bomba de infusão implantável para a administração de medicação a uma velocidade controlada; Patente U.S. N.° 4,486,194, a qual divulga um dispositivo terapêutico de administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. N.° 4,447,233, a qual divulga uma bomba de infusão de medicação para a administração de medicação a uma velocidade de infusão exata; Patente U.S. N.° 4,447,224, a qual divulga um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a administração contínua de fármacos; Patente U.S. N.° 4,439,196, a qual divulga um sistema de administração osmótica de fármacos possuindo compartimentos de múltiplas câmaras; e Patente U.S. N.° 4,475,196, a qual divulga um sistema de administração osmótica de fármacos.
Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção proporcionar utilizações dos conjugados de imunoglobulina da invenção e qualquer uma e todas as combinações das suas formas de realização na preparação de um medicamento compreendendo uma formulação liquida altamente concentrada em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é, pelo menos, de 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de doenças autoimunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias, doenças neurológicas, e doenças oncológicas e neoplásicas incluindo cancro. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de insuficiência cardíaca congestiva (CHF), vasculite, rosácea, acne, eczema, miocardite e outras condições do miocárdio, lúpus eritematoso disseminado, diabetes, espondilopatias, fibroblastos sinoviais, e estroma da medula óssea; perda óssea; doença de Paget, osteoclastoma; cancro da mama; osteopenia de desuso; desnutrição, doença periodontal, doença de Gaucher, histiocitose das células de Langerhans, lesão da medula espinal, artrite sética aguda, osteomalacia, sindrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosa poliostótica, reconstrução periodontal, e fraturas ósseas; sarcoidose; cancros ósseos osteoliticos, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do rim e cancro retal; metástase óssea, gestão da dor óssea, e hipercalcemia maligna humoral, espondilite anquilosante e outras espondilartropatias; rejeição de transplantes, infeções vitais, neoplasias hematológicas e condições análogas a neoplasias por exemplo, linfoma de Hodgkin; linfoma não-Hodgkin (linfoma de Burkitt, pequeno linfoma linfocítico/leucemia linfocitica crónica, micose fungoides, linfoma das células do manto, linfoma folicular, linfoma de células B grandes difusas, linfoma de zona marginal, leucemia de tricoleucitos e leucemia linfoplasmocitária), tumores da células precursoras de linfócitos, incluindo leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células B, e leucemia/linfoma linfoblástico agudo de células T, timoma, tumores das células T e NK maduras, incluindo leucemias de células T periféricas, leucemia de células T do adulto/ linfomas de células T e grande leucemia linfocítica granular, granulomatose de células de Langerhans, neoplasias mieloides tais como leucemias mieloides agudas, incluindo AML com maturação, AML sem diferenciação, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, e leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicas, e distúrbios mieloproliferativos crónicos, incluindo leucemia mieloide crónica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumores cerebrais (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma, e retinoblastoma), tumores sólidos (cancro nasofaríngeo, carcinoma basocelular, cancro pancreático, cancro da via biliar, sarcoma de Kaposi, cancro testicular, cancros uterinos, vaginais ou cervicais, cancro do ovário, cancro do fígado ou cancro do endométrio primário, e tumores do sistema vascular (angiossarcoma e hemangiopericitoma), osteoporose, hepatite, HIV, SIDA, espondilartrite, artrite reumatoide, doenças inflamatórias do intestino (IBD), septicemia e choque sético, doença de Crohn, psoríase, esclerodermia, doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD), rejeição de enxerto de ilhéus alogénicos, malignidades hematológicas, tais como mieloma múltiplo (MM), síndrome mielodisplásica (MDS) e leucemia mieloide aguda (AML), inflamação associada a tumores, lesão dos nervos periféricos ou doenças desmielinizantes. Em certas formas de realização, a utilização do medicamento é para o tratamento de psoríase em placas, colite ulcerosa, linfoma não-Hodgkin, cancro da mama, cancro colorretal, artrite idiopática juvenil, degenerescência macular, vírus sincicial respiratório, doença de Crohn, artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, osteoporose, perda óssea induzida por tratamento, metástases ósseas, mieloma múltiplo, doença de Alzheimer, glaucoma, e esclerose múltipla. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com qualquer uma das formas de realização anteriores, a utilização do medicamento compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas formas de realização que podem ser combinadas com qualquer uma das formas de realização anteriores, o conjugado de imunoglobulina no medicamento mostra pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento de monómero não oligomerizado. Em certas formas de realização, a oligomerização é medida por SDS-PAGE não redutora.
EXEMPLOS
Os exemplos aqui descritos referem-se a formas de realização particulares, não limitativas da invenção.
Exemplo 1: Conceção, Expressão e Conjugação de Variantes de Cisteína de Anticorpos
Um conjunto de variantes de cisteina da IgGl foi concebido de forma que cada domínio de dobragem da imunoglobulina estivesse representado (Tabela 1) . As variantes 1-13 foram concebidas a partir da estrutura de raios X do anticorpo-1. A variante 14 foi selecionada da estrutura de outra IgGl, anticorpo-2, construída através de modelação por homologia em relação ao anticorpo-1. Todos os sítios foram expostos sobre a superfície do anticorpo. Os resíduos polares, tais como serina e treonina e arginina, ou resíduos carregados, tal como lisina, foram substituídos por cisteína. Os genes da cadeia leve e pesada foram subclonados no vetor gWIZ (Genlantis) e manipulados por engenharia para a expressão de proteína por transfeção transitória de células de mamíferos. As variantes de anticorpo foram sintetizadas de novo (GeneArt) ou geradas por PCR de mutagénese específica de um lócus e confirmadas por sequenciação. 0 anticorpo de tipo selvagem e as variantes foram expressas a níveis de 10-100 mg por transfeção transitória de células HEK 293 Freestyle (Invitrogen) com polietilenoimina (Polysciences) como o reagente de transfeção. O sobrenadante da cultura de células foi recolhido 7-10 dias após transfeção. Os anticorpos foram purificados numa coluna de proteína A (GE Healthcare), eluídos com tampão de citrato 50 mM, pH 3,5, e sujeitos a troca de tampão para tampão de Tris 100 mM, pH 7,0 para marcação de fluorescência.
Após expressão e purificação das variantes de anticorpo, as cisteínas da superfície manipuladas por engenharia estavam na sua maioria oxidadas. Por exemplo, a Variante 4 e 6 tinham menos de 0,3 tióis livres por molécula de anticorpo ao contrário dos antecipados 2,0 para os anticorpos com cisteínas de superfície manipuladas por engenharia. Nós comparamos o efeito de um agente de redução suave, TCEP (Cloridrato de tris[2-carboxietil]fosfina) e um agente de redução mais forte, DTT (ditiotreitol) numa variante da classe I e uma variante da classe IV. Inicialmente, a Variante 4 não oligomerizante mostrou 0,13 tióis livres por anticorpo, e a Variante 6 altamente oligomerizante tinha 0,25 tióis livres por anticorpo. Alíquotas de tipo selvagem, variante 4 e variante 6 foram tratadas em cinco condições diferentes: 1) sem agente de redução, 2) TCEP, ΙΟχ, 1 hora, 3) TCEP, 20x, 1 hora, 4) DTT, 5x, 15 minutos, e 5) DTT, lOx, 15 minutos. Após remoção do agente de redução as amostras foram resolvidas sobre PAGE não redutora e foram quantificadas em relação ao tiol livre. Uma comparação dos resultados para o tipo selvagem e as variantes indicou que o tratamento com TCEP foi suficiente para reduzir as cisteinas na forma não oligomerizada (Variante 4) com pouco efeito sobre o WT. No entanto, as cisteinas de oligómeros (Variante 6) foram reduzidas apenas após um tratamento mais violento. 0 tratamento com DTT mesmo a níveis baixos leva à fragmentação do anticorpo para o WT e ambas as variantes. Os sítios onde as cisteinas de superfície foram introduzidas tiveram um efeito profundo na aptidão para desbloquear as cisteinas manipuladas por engenharia para conjugação.
Foram experimentados diferentes métodos para a redução específica dos tióis de superfície manipulados antes da marcação. 0 TCEP e o DTT foram dois dos reagentes utilizados, e os níveis de tiol livre foram quantificados utilizando reagente de Ellman (Invitrogen). Nós constatamos que a L-cisteína funciona melhor nas nossas experiências de marcação específica de sítio, pelo que foi utilizado o seguinte protocolo de dois passos. Primeiro, as variantes foram incubadas com um excesso de 100-200 vezes de L-cisteína durante 4 h a 37 °C, seguida de troca de tampão para Tris 50 mM/EDTA. Segundo, as amostras foram incubadas com um excesso de 5-10 vezes de corante de maleimida Alexa488 (Invitrogen) durante 1 h à temperatura ambiente ou com um excesso de 10 vezes de corante de maleimida de Pireno (Invitrogen) durante 12 h à temperatura ambiente. Após remoção do corante livre, e troca de tampão para tampão de fosfato 50 mM, pH 7,0, a eficiência de marcação da proteína foi calculada como moles de corante por mole de proteína de acordo com os protocolos do fabricante (Invitrogen).
Exemplo 2: Caracterização das Variantes de Cisteína do Anticorpo Manipulado por Engenharia
Amostras de anticorpo não marcado e marcado foram analisadas por SDS-PAGE. Foram utilizados geles de 7,5%, 10% e 12% para análise não redutora. Foram utilizados geles de 12% para análise redutora de amostras aquecidas com DTT. Em geral, foram carregadas amostras de 5-10 yg por faixa. Foram capturados imagens fluorescentes sob luz UV, antes da revelação com Azul de Coomassie. A digestão do anticorpo foi realizada por GluC (1:20 em peso de enzima por peso de anticorpo, a 25 °C durante 12-24 h) e pronase (1:20 em peso de enzima por peso de anticorpo, a 37 °C durante 1 h).
Os geles não redutores mostraram monómeros bem como a presença de dimeros, trimeros e, nalguns casos, até mesmo oligómeros superiores. Os geles redutores mostram a marcação exclusiva da cadeia leve ou pesada dependendo de onde a cisteina de superfície foi manipulada. As variantes 1-6 marcadas e não marcadas foram também analisadas quanto à especificidade de ligação ao antigénio. As variantes retêm uma atividade dentro de 80% e 130% de tipo selvagem com alguma perda de atividade após marcação. A variante 1 não marcada reteve aproximadamente 110% da atividade de tipo selvagem, enquanto a variante 1 marcada reteve aproximadamente 80%. A variante 2 não marcada reteve aproximadamente 105% da atividade de tipo selvagem, enquanto a variante 2 marcada reteve ligeiramente menos de 100% atividade. A variante 3 não marcada e marcada retiveram ambas aproximadamente 110% da atividade de tipo selvagem. A variante 4 não marcada reteve aproximadamente 125% da atividade de tipo selvagem, enquanto a variante 4 marcado reteve aproximadamente 95% da atividade. A variante 5 não marcada reteve aproximadamente 120% da atividade de tipo selvagem, enquanto a variante 6 marcado reteve aproximadamente 100% da atividade. Finalmente, a variante 6 não marcada reteve aproximadamente 115% da atividade de tipo selvagem, enquanto a variante 6 marcada reteve aproximadamente 90% da atividade. De forma semelhante ao seu homólogo não marcado, a variante 6 marcada apresentou alta propensão para a oligomerização. A maioria das variantes foi marcada próximo da eficiência ótima de 2,0 moles de corante por mole de anticorpo (duas cisteinas idênticas por molécula de anticorpo). Uma eficiência de marcação superior a 2,0 não é desejável, já que sugeriria ruturas parciais e marcação de dissulfuretos de intracadeia. As variantes com alta propensão para a oligomerização tais como as Variante 6, Variante 11 e Variante 5 não sofreram marcação de forma tão eficiente. Mesmo entre as outras variantes, as condições de marcação tais como o tempo de reação e proporção de corante para proteína tiveram de ser otimizadas numa base individual porque nem todas as cisteinas manipuladas por engenharia eram igualmente suscetíveis a conjugação. As variantes 1-14 foram especificamente marcadas na cadeia que tem a cisteína manipulada por engenharia. O tratamento proteolítico das variantes com pronase produziu diferentes padrões de fluorescência para a maioria das variantes, mas padrões semelhantes para variantes com substituições vizinhas, tais como as Variantes 3 e 12. Assim, a maioria das variantes foi eficiente e especificamente marcada.
Distinguiram-se cinco classes de propensão para reticulação para este conjunto de variantes de cisteína (Tabela 1) . A classe I compreende variantes que eram monoméricas e permanecem estáveis após marcação. As variantes de classe II continham uma pequena percentagem de dímeros antes e após marcação. As variantes de classe III tinham uma propensão mais acentuada para oligomerizar, incluindo a formação de alguns trimeros. As variantes de classe IV tinham uma propensão ainda mais alta para oligomerizar, como evidenciado pela presença de agregados superiores ao trimero, especialmente após marcação. A classe V incluiu variantes de alta propensão para a oligomerização de forma semelhante à variante de classe IV com anomalias estruturais adicionais tais como fragmentação ou coloração da amostra concentrada purificada.
Exemplo 3: Aplicação das Variantes de Cisteína de Anticorpo Manipuladas por Engenharia
As variantes de cisteina com baixa propensão para reticulação (Variantes 1-4, 7, 10, 12-14) foram marcadas com alta especificidade e eficiência e pouca oligomerização. A marcação com corantes de maleimida é apenas um exemplo de conjugação especifica de um sitio nestas variantes de anticorpo. Podem ser também ligadas moléculas com muitas outras funcionalidades, tais como especificidade de ligação ou toxicidade. Assim, este conjunto de variantes expande-se no reportório de variantes de anticorpo para servir como veículos de transporte na terapia dirigida ou para análise de fluorescência in vitro e in vivo.
Para ilustrar a aplicação de fluorescência de uma das variantes, nós analisámos o padrão de emissão de variantes conjugadas com o fluoróforo pireno. Quando duas moléculas de pireno estão próximas uma da outra ocorre um aumento característico da emissão a 465 nm conhecido como fluorescência de excímero. Nós marcámos as Variantes 4 e 7 com maleimida de pireno e monitorizámos os espetros de emissão. Apesar da Variante 4 apresentar emissão de nível basal a 465 nm, a Variante 7 exibiu uma fluorescência de excímero forte. Ao considerar a posição da cisteína manipulada por engenharia no CH1 para a Variante 7, do lado interno dos domínios Fab, o resultado observado correlaciona com o conhecido efeito de tesoura dos Fab em relação ao Fc. Assim, esta variante pode ser utilizada na análise da dinâmica de domínios de anticorpos. A alta propensão para a oligomerização da Variante 6 sugeriu outra utilidade das variantes de cisteína de anticorpo que foi explorada em mais pormenor. A variante 6 marcada foi submetida a cromatografia de filtração em gel para separar o monómero dos oligómeros, as frações contendo proteína foram resolvidas num gel de SDS-PAGE não redutora a 7,5% e analisadas antes e após revelação com Azul de Coomasssie. A análise de filtração em gel da variante 6 indicou uma competição entre a marcação e reticulação: quanto maior a MM da espécie, menor a eficiência de marcação (indicada pelo nível de fluorescência). A espécie com MM mais alta teve uma eficiência de marcação de 0,5, enquanto a espécie monomérica teve uma eficiência de marcação de 1,0, com a amostra marcada original de eficiência de marcação 0,8. Uma variante de anticorpo com múltiplos oligómeros, a Variante 6 apresenta um excelente controlo para a oligomerização de anticorpo e um padrão adequado para proteínas de alto peso molecular, com a funcionalidade adicional de que pode ser marcada de forma específica em relação ao sítio.
Exemplo 4: Correlação entre a Propensão para Reticulação (CLP) e a Propensão para Agregação Espacial (SAP) das Variantes de Cisteína A propensão para reticulação (CLP) e a propensão para agregação espacial (SAP) foram comparadas para as variantes de cisteina onde aminoácidos específicos estão substituídos por cisteína. A cada variante foi atribuída uma CLP com base numa análise por SDS-PAGE não redutora. Os valores de SAP para os resíduos mutados são os resultados computacionais com um raio de 5 Ã. Nós sobrepusemos as variantes de cisteína manipuladas por engenharia sobre a estrutura do anticorpo-1 codificada por SAP.
Observou-se as seguintes correlações. Todos os aminoácidos substituídos com cisteínas são de valor de SAP negativo na gama desde -0,27 a 0,00. Isto é coerente com a escolha de aminoácidos polares ou carregados para substituição. Todas as variantes de classe I de CLP têm SAP entre 0,00 e -0,11 (Variantes 3, 4, 7, 10, 12), e todas as variantes de classe II de CLP têm SAP entre -0,12 e -0,23 (Variantes 1, 2, 13). No entanto, existem variantes com SAP naquelas gamas com CLP alta (Variantes 8, 9 e 11, por exemplo) . As variantes altamente reticulantes, Variante 8 e 11, estão próximas de sítios com SAP alta. A Variante 5 com CLP III está adjacente a sítios com SAP alta em CH2, enquanto a Variante 2 de CLP II não está. No entanto, não existe essa correlação entre a Variante 6 e a Variante 10 em CH3, e entre as Variantes 9 e 14 em VH.
Foi feita uma observação adicional da Variante 14. A variante 14 não expressa se há uma região de SAP alta na proximidade, mas expressa quando esta região de SAP alta é substituída por uma região de SAP baixa. Foi observado um rendimento 100 vezes mais alto da Variante 14 no anticorpo-2 estabilizado (35,6 mg/L de cultura) em comparação com o da Variante 14 na base de anticorpo-2 nativo (0,34 mg/L). O rendimento relativo da Variante 14 nas diferentes bases indicou um problema estrutural quando uma cisteina é introduzida na superfície de uma proteína próxima de uma região com valor de SAP alto. O problema foi resolvido quando dois aminoácidos hidrófobos na zona hidrófoba vizinha da cisteina manipulada por engenharia foram substituídos por lisinas.
Em resumo, existem correlações entre a estabilidade das variantes de cisteina e a SAP: 1) as variantes de cisteina com baixa propensão para reticulação têm SAP ligeiramente negativas (0,00 a -0,11), 2) as variantes de cisteina com SAP mais negativa (-0,12 a -0,23) são mais suscetíveis a reticulação, e 3) as variantes de cisteina na proximidade imediata de zonas de SAP alta têm maior probabilidade de reticular ou ter anomalias estruturais. As conclusões 1 e 2 são coerentes com a noção anteriormente definida de que resíduos completamente expostos podem ser mais suscetíveis a reticulação [9].
Exemplo 5 - Conclusão Nós concebemos um conjunto de variantes de cisteina de IgGl humano que estão amplamente distribuídas pela molécula de anticorpo com pelo menos uma variante por domínio de dobragem de imunoglobulina. A maioria destas variantes é estável, e pode ser conjugada eficiente e especificamente sem perda significativa de atividade de ligação ao antigénio. Assim, as variantes de anticorpo estáveis adicionam-se ao reportório de variantes para conjugação específica de um sítio de moléculas de transporte. Se se ligam fluoróforos às cisteínas manipuladas por engenharia, pode-se analisar a dinâmica de domínios particulares. As variantes altamente oligomerizantes são também vantajosas, já que os numerosos multímeros proporcionam um padrão conveniente para anticorpos agregados e para proteínas de alto peso molecular em geral.
Uma correlação entre a propensão para reticulação das variantes de cisteína de anticorpos aqui descritas e o método de SAP demonstra que a metodologia de SAP pode ser utilizada para selecionar sítios de conjugação com reticulação reduzida. A tecnologia de SAP baseia-se em computador, pelo que reduz o tempo e trabalho experimental na conceção de variantes. A comparação CLP/SAP mostrou que a substituição de aminoácidos parcialmente e não completamente expostos produz as variantes mais estáveis. Além do mais, a comparação mostrou que zonas hidrófobas vizinhas devem ser evitadas.
As variantes de cisteína de superfície de IgGl humana manipuladas por engenharia aqui descritas proporcionam novos sítios para conjugação específica de sítio de anticorpos terapêuticos e métodos de identificação de outras variantes. As variantes com pouca propensão para reticulação têm a maior utilidade no desenvolvimento de anticorpos para terapia dirigida. As variantes de cisteína aqui divulgadas incluem novos sítios em domínios anteriormente representados (CL, CH1, CH3) bem como em domínios anteriormente não representados (VL, VH, CH2).
Além do mais, as variantes marcadas podem ser utilizadas como um conjunto de marcadores de anticorpo fluorescentes específicos de sítio para investigação laboratorial in vitro e in vivo. Os produtos marcados de forma fluorescente podem ser comercializados através de empresas de biotecnologia (tais como Thermo Scientific Pierce, GE
Healthcare e Invitrogen) que fornecem a comunidade de investigação com anticorpos e outros reagentes proteicos. A variante 6 altamente reticulante é um padrão útil para gel de proteínas ou outras técnicas de cromatografia. Pode ser comercializada por empresas (por exemplo, Invitrogen, Bio-Rad e Pierce) que fornecem reagentes proteicos. A correlação entre CLP e SAP sugere ainda uma aplicação comercial da nossa tecnologia de SAP anteriormente descrita. A consideração da SAP pode melhorar a conceção de variantes de cisteína de anticorpo estáveis para conjugação específica de um sítio.
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LISTA DE SEQUÊNCIAS
<110> Novartis AG
Massachusetts Institute Of Technology CHENNAMSETTY, Naresh HELK, Bernard KAYSER, Veysel TROUT, Bernhardt VOYNOV, Vladimir
<12 0> MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE SÍTIOS PARA
CONJUGAÇÃO de IgG <130> 61967-20002.40 <140> Ainda Não Concedida <141> Simultaneamente com a Presente <150> 61/184,084 <151> 2009-06-04 <160> 18 <17Ο> FastSEQ para Windows Versão 4.0
<210> 1 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1
Ala Sec The Lys Gly Pro See Val Phe Pee Leu Ala Pro See See Lys 1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly The Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asa Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 €0
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asa Val Asa His Lys Pro Ser Asa Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys 100
<210> 2 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asa Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asa Phe Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asa Thr Lys val Asp Lys 85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 100 <210> 3 <211> 103
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Ala Ser The Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Lou Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 4S
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 SO
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr «5 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 100
<210> 4 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr 65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Thr Pro 100
<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 15 10 15
Gly
<210> 6 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 15 10
<210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Lou Gly Gly I S 10
<210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Lou Gly Thr Thr His Thr Cys Pro Atg Cys Pro Glu Pro Lys Cys Pro 15 10 15
Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 20 25
<210> 9 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Pro Sor Vai Phe teu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie l 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 85 SO 95
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 100 105
<210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met tie 15 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30
Asp Pro Glu Val Sin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg 50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys €5 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu 85 90 95
Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 100 105
<210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lye Asp The Leu Met lie 1 5 10 IS
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu 20 25 30
Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Slu Val His 35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg SO 55 €0
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu 85 90 95
Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu 100 105
<210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 1 5 10 15
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 20 25 30
Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 35 40 45
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 50 55 60
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 85 90 95
Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu 100 105
<210> 13 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 15 10 15
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He 20 25 30
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 50 55 60
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
€5 70 75 SO
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 85 90 95
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100
<210> 14 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn IS 10 15
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 20 25 30
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 50 SS SO
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys €5 70 75 80
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 85 90 95
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100
<210> 15 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn 15 10 15
Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie 20 25 30
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 50 55 60
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 65 70 75 80
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu 85 90 95
Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 <210> 16
<211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Pro Sin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr tvs Asm 15 10 15
Gin Val Ser leu Thr Cys Leu Val Lys Sly Phe Tyr Pro Sex Asp lie 20 25 30
Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 35 40 45
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
50 55 SO
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Tie Phe Ser Cys 65 70 75 80
Ser Val Met Bis Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Gin Lys Ser Leu 85 90 95
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100
<210> 17 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 17
Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15
Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30
Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 35 40 45
Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys Tyr Ala SO 55 60
Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser Bis Arg 65 70 75 80
Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95
Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100
<210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Vai Ala Ala Pro Sec Val Phe Xle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin leu 15 10 15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30
Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Sin Ser Gly 35 40 4S
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr SO 55 60
Ser leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His «5 00 75 80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 35
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
Lisboa, 30 de Março de 2015

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado de imunoglobulina, compreendendo uma imunoglobulina que tem pelo menos uma mutação no resíduo 7 (VH) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição com um resíduo de cisteína, e um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é conjugado com o resíduo de cisteína.
  2. 2. Conjugado de imunoglobulina da reivindicação 1, compreendendo ainda uma molécula de ligação que tem pelo menos dois sítios reativos, em que um primeiro sítio reativo é ligado ao resíduo de cisteína da imunoglobulina e um segundo sítio reativo é ligado ao átomo ou molécula.
  3. 3. Conjugado de imunoglobulina da reivindicação 2, em que a molécula de ligação é selecionada do grupo consistindo em uma hidrazona, um dissulfureto, um péptido, um agente quelante, e uma maleimida.
  4. 4. Conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o átomo ou molécula é selecionado do grupo consistindo em um radionuclídeo, um agente quimioterapêutico, uma toxina microbiana, uma toxina vegetal, um polímero, um hidrato de carbono, uma citocina, um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador de enzima-substrato, uma enzima, um péptido, um peptidomimético, um nucleótido, um ARNsi, um microARN, um mimético de ARN e um aptâmero.
  5. 5. Conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o átomo ou molécula é ΟΠ 1 οι ζζπ selecionado do grupo consistindo em Y, I, Cu, 177Lu, 213Bí, 211At, uma caliqueamicina, uma duocarmicina, um maitansinoide, uma auristatina, uma antraciclina, exotoxina A de Pseudomonas, toxina da Difteria, ricina, polietileno glicol, hidroxietil-amido, e um resíduo de manosilo.
  6. 6. Conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o conjugado de imunoglobulina compreende ainda uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
  7. 7. Método de produção de um conjugado de imunoglobulina, compreendendo: (a) proporcionar uma imunoglobulina modificada ou isolada compreendendo pelo menos uma mutação no resíduo 7 (VH) , em que a pelo menos uma mutação é uma substituição por um resíduo de cisteína; (b) reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos; e (c) incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que o átomo ou molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina.
  8. 8. Método para reduzir a reticulação entre cisteínas expostas na superfície de uma imunoglobulina numa formulação farmacêutica altamente concentrada de conjugados de imunoglobulina compreendendo: (a) proporcionar uma imunoglobulina; (b) substituir o resíduo 7(VH) , por um resíduo de cisteína, (c) reduzir o um ou mais resíduos de cisteína substituídos com um agente de redução para formar resíduos de cisteína reduzidos; (d) incubar a imunoglobulina com um átomo ou molécula, em que a molécula é reativa com os resíduos de cisteína reduzidos, para formar um conjugado de imunoglobulina; e (e) gerar uma formulação líquida, altamente concentrada do conjugado de imunoglobulina em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL ou pelo menos 150 mg/mL.
  9. 9. Método da reivindicação 8 em que o conjugado de imunoglobulina compreende uma atividade de ligação ao antigénio e a atividade é pelo menos oitenta por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos cem por cento, pelo menos cento e dez por cento, pelo menos cento e vinte por cento, ou pelo menos cento e trinta por cento da atividade de ligação ao antigénio da imunoglobulina não mutada.
  10. 10. Utilização do conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-6 na preparação de um medicamento compreendendo uma formulação líquida altamente concentrada em que a concentração do conjugado de imunoglobulina é pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL, e em que pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado.
  11. 11. Utilização do conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-6 como uma ferramenta de diagnóstico.
  12. 12. Composição farmacêutica compreendendo o conjugado de imunoglobulina de qualquer uma das reivindicações 1-6 e um excipiente farmaceuticamente aceitável, em que pelo menos oitenta por cento, pelo menos oitenta e cinco por cento, pelo menos noventa por cento, pelo menos noventa e cinco por cento, pelo menos noventa e seis por cento, pelo menos noventa e sete por cento, pelo menos noventa e oito por cento, ou pelo menos noventa e nove por cento do conjugado de imunoglobulina é monómero não oligomerizado.
  13. 13. Composição farmacêutica da reivindicação 12 em que o conjugado de imunoglobulina está numa concentração de pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, ou pelo menos 150 mg/mL. Lisboa, 30 de Março de 2015
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