JP6718560B1 - 抗cd137抗原結合分子およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
腫瘍免疫に重要な役割を持つT細胞の活性化は、1)主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI分子により提示された抗原ペプチドに対するT細胞レセプター(TCR)の結合および活性化;2)抗原提示細胞上のそのリガンドに対するT細胞表面上の共刺激分子の結合と活性化、の二つのシグナルによりなされると理解されている。さらには、T細胞表面上のCD137(4-1BB)をはじめとする腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリー(TNFRSF)に属する副刺激分子の活性化がT細胞活性化に重要であることも述べられている(非特許文献4)。
CD137アゴニスト抗体が抗腫瘍効果を示すことは既にマウスモデルにおいて実証されており、それが主にCD8陽性T細胞とNK細胞の活性化に依るものであることがマウスモデルで実験的に示されている(非特許文献6)。しかしながら、臨床ならびに非臨床においてCD137アゴニスト抗体の非特異的な肝毒性による副作用が問題となっており、薬剤の開発は思うように進んでいない(非特許文献7、非特許文献8)。この副作用の主たる原因としては、抗体定常領域を介したFcγレセプターへの結合が関与した肝臓など腫瘍以外の非免疫組織における免疫細胞の活性化が示唆されている(非特許文献9)。他方で、TNF受容体スーパーファミリーに属する受容体のアゴニスト抗体が生体内でアゴニスト活性を示すためにはFcγレセプター発現細胞(FcγRII発現細胞)による抗体の架橋が必要であることが報告されている(非特許文献10)。すなわち、CD137アゴニスト抗体の抗腫瘍効果の薬効と肝毒性等の副作用は共に抗体のFcγレセプターへの結合が関与していることから、抗体のFcγレセプターの結合を上昇させれば薬効の向上は期待されるが肝毒性の副作用も増大し、抗体とFcγレセプターの結合を低減させれば、副作用は低減するものの薬効も低減してしまうと考えられ、これまで薬効と副作用を分離したCD137アゴニスト抗体は報告されていない。さらには、臨床においてはCD137アゴニスト抗体の抗腫瘍効果そのものについても決して強いものではなく、毒性の回避と同時に更なる薬効の増大が望まれている。したがって、こうした副作用を抑えつつ抗腫瘍免疫応答を誘導することが可能な新たな薬剤の開発が望まれている。
即ち本開示は、具体的には、以下に例示的に記載する抗CD137抗原結合分子、その使用方法、薬学的製剤、等を提供するものである。
〔1〕
低分子化合物に依存したCD137結合活性を有する、抗CD137抗原結合分子。
〔2〕
10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対する結合活性と比べて、2倍以上高い、〔1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.1〕
10μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対する結合活性と比べて、2倍以上高い、〔1〕または〔2〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.2〕
10μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するKD値が、5x10-7M以下である、〔1〕乃至〔2.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.3〕
低分子化合物の非存在下でのCD137に対するKD値が、1x10-6M以上である、〔1〕乃至〔2.2〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.4〕
低分子化合物の濃度が10μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するKD値が5x10-7M以下であり、かつ低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するKD値が1x10-6M以上である、〔1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.5〕
低分子化合物の濃度が10μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するKD値、および低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するKD値が、それぞれ、当該溶液中でCD137と抗CD137抗原結合分子を接触させた後24時間以内にBiacoreアッセイによって測定される、〔1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.6〕
低分子化合物およびCD137とともに三者複合体を形成する、〔1〕乃至〔2.5〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.7〕
ヒトおよびサル由来のCD137に結合する、〔1〕乃至〔2.6〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.8〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔1〕乃至〔2.7〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔2.9〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔1〕乃至〔2.8〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔3〕
以下の(a)から(k)より選択されるいずれかのHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3の組合せを含む、〔1〕乃至〔2.9〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子:
(a) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(b) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:9のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(c) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(d) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:11のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(e) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(f) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(g) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(h) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(i) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3;
(j) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:16のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3;および
(k) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3。
〔3.1〕
以下の(a)から(g)より選択されるいずれかのHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3の組合せを含む、〔1〕乃至〔3〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子:
(a) 配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(b) 配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(c) 配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(d) 配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:29のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(e) 配列番号:23のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(f) 配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;および
(g) 配列番号:25のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
〔4〕
以下の(a)から(m)より選択されるいずれかのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3の組合せを含む、抗CD137抗原結合分子:
(a) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(b) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:9のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(c) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(d) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:11のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(e) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(f) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(g) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:29のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(h) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:23のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(i) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(j) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:25のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(k) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:16のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:25のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(l) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;および
(m) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3。
〔5〕
(a) 配列番号:43乃至53のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH;または
(b) 配列番号:54乃至60のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVLを含む、抗CD137抗原結合分子。
〔5.1〕
以下の(a)から(m)より選択されるいずれかのVHおよびVLの組合せを含む、抗CD137抗原結合分子:
(a) 配列番号:43のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:54のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(b) 配列番号:44のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:55のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(c) 配列番号:45のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:55のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(d) 配列番号:46のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:54のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(e) 配列番号:47のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:54のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(f) 配列番号:48のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:56のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(g) 配列番号:49のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:57のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(h) 配列番号:50のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:58のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(i) 配列番号:51のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(j) 配列番号:51のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:60のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL:
(k) 配列番号:52のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:60のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;
(l) 配列番号:50のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:59のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL;および
(m) 配列番号:53のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVH、および配列番号:54のアミノ酸配列と少なくとも95%の配列同一性を有するVL。
〔5.2〕
以下の(a)から(m)より選択されるいずれかのVHおよびVLの組合せを含む、〔抗CD137抗原結合分子:
(a) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL;
(b) 配列番号:44のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:55のアミノ酸配列を含むVL;
(c) 配列番号:45のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:55のアミノ酸配列を含むVL;
(d) 配列番号:46のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL;
(e) 配列番号:47のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL;
(f) 配列番号:48のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:56のアミノ酸配列を含むVL;
(g) 配列番号:49のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:57のアミノ酸配列を含むるVL;
(h) 配列番号:50のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:58のアミノ酸配列を含むVL;
(i) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL;
(j) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL:
(k) 配列番号:52のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL;
(l) 配列番号:50のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL;および
(m) 配列番号:53のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL。
〔5.3〕
〔10μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性(結合量)〕/〔当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対する結合活性(結合量)〕の値が、参照抗原結合分子と同じかそれより大きい、抗CD137抗原結合分子であって、 ここで、参照抗原結合分子が、配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;の組合せを含む抗CD137抗原結合分子である、抗CD137抗原結合分子。
〔5.4〕
前記参照抗原結合分子が、配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVLの組合せを含む抗CD137抗原結合分子である、〔5.3〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.5〕
〔1μMの低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性(KD)〕/〔10μM以上の当該低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性(KD)〕の値が、参照抗原結合分子と同じかそれより大きい、抗CD137抗原結合分子であって、
ここで、参照抗原結合分子が、配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;の組合せを含む抗CD137抗原結合分子である、抗CD137抗原結合分子。
〔5.6〕
前記参照抗原結合分子が、配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、および配列番号:54のアミノ酸配列を含むVLの組合せを含む抗CD137抗原結合分子である、〔5.5〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.7〕
10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、または250μM以上の低分子化合物の存在下で、CD137への結合に関して、〔3〕乃至〔5.2〕に記載のいずれかの抗原結合分子と競合する、当該低分子化合物依存したCD137結合活性を有する抗CD137抗原結合分子。
〔5.8〕
10μM以上、50μM以上、100μM以上、150μM以上、200μM以上、または250μM以上の低分子化合物の存在下で、〔3〕乃至〔5.2〕に記載のいずれかの抗原結合分子によって結合されるのと同じCD137のエピトープに結合する、当該低分子化合物に依存したCD137結合活性を有する抗CD137抗原結合分子。
〔5.8A〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔5.3〕乃至〔5.8〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.8B〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔5.3〕乃至〔5.8A〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.9〕
モノクローナル抗体またはその抗原結合断片である、〔1〕乃至〔5.8B〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.10〕
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体またはその抗原結合断片である、〔1〕乃至〔5.9〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.11〕
全長IgG1抗体である、〔1〕乃至〔5.10〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.12〕
少なくとも一つのアミノ酸が改変された改変Fc領域を含み、当該改変Fc領域が、当該アミノ酸改変を含まない親Fc領域と比較して、FcγRIIbに対する結合活性が上昇している、〔1〕乃至〔5.11〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.13〕
前記改変FcのFcγRIIbに対する結合活性が参照Fc領域と同じかそれより高く、ここで参照Fcが、EUナンバリングに基づくG236N/H268D/A330Kのアミノ酸置換の組合せを含むヒトIgG1 Fc領域である、〔5.12〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.14〕
参照Fc領域が配列番号:153のアミノ酸配列を含む、〔5.12〕または〔5.13〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.15〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づくG236N、H268DおよびA330Kからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である、〔5.12〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.16〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づくG236N/H268D/A330Kのアミノ酸置換の組合せである、〔5.12〕または〔5.15〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.17〕
前記親Fc領域が、ヒトIgG1 Fc領域に由来する、〔5.12〕乃至〔5.16〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.18〕
少なくとも一つのアミノ酸が改変された改変Fc領域を含み、当該アミノ酸改変を含まない親Fc領域を含む親抗CD137抗原結合分子と比較して等電点(pI)が上昇している、〔1〕乃至〔5.17〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.19〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、親Fc領域の表面に露出し得るアミノ酸残基の改変である、〔5.18〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.20〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、
(i) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に負の電荷を有するアミノ酸残基を、側鎖に電荷を有さないアミノ酸残基へ置換する改変、
(ii) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に電荷を有さないアミノ酸残基を、側鎖に正の電荷を有するアミノ酸残基へ置換する改変、および/または、
(iii) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に負の電荷を有するアミノ酸残基を、側鎖に正の電荷を有するアミノ酸残基へ置換する改変、
である、〔5.18〕または〔5.19〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.21〕
前記少なくとも1つのアミノ酸改変が、複数のアミノ酸置換の組合せであり、かつ、当該複数のアミノ酸置換が互いに立体構造的に近接した位置に存在する、〔5.18〕乃至〔5.20〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.22〕
改変Fc領域のFcγ受容体(FcγR)への結合活性が、親Fc領域と比較して実質的に低下していない、〔5.18〕乃至〔5.21〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.23〕
前記Fcγ受容体(FcγR)が、FcγRIIbである、〔5.22〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.24〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づくQ311R、P343R、およびD413K、からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である、〔5.18〕乃至〔5.23〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔5.25〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づく(i) P343Rのアミノ酸置換、(ii) Q311R/P343Rのアミノ酸置換、または、(iii) Q311R/D413Kのアミノ酸置換の組合せである、〔5.18〕乃至〔5.24〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔6〕
改変Fc領域を含み、当該改変Fc領域が、EUナンバリングに基づく、以下から選択されるいずれか1つのアミノ酸改変の組合せを含む、〔1〕乃至〔5.25〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子:
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K;
L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K;
L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K;
L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R;
K214R/G236N/H268D/A330K/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K;および
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R。
〔6.1〕
前記改変Fc領域が、ヒトIgG1 Fc領域に由来する、〔1〕乃至〔6〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔6.2〕
前記改変Fc領域が、さらに、EUナンバリングに基づく446位と447位の欠失を含む、〔1〕乃至〔6.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔7〕
配列番号64乃至85のいずれかひとつのアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、〔1〕乃至〔6.2〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔7.1〕
以下の(i)乃至(xxxviii)より選択されるいずれかのVH、VL、CHおよびCLの組合せを含む、抗CD137抗原結合分子:
(i) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:64のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(ii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:66のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(iii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:67のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(iv) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:68のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(v) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:69のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(vi) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:70のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(vii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:71のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(viii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:73のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(ix) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:75のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(x) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:78のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xi) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:80のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:82のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xiii) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:84のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xiv) 配列番号:43のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:85のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:54のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xv) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:65のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xvi) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:72のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xvii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:74のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xviii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:75のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xix) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:77のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xx) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:78のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxi) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:79のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:80のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxiii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:81のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxiv) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:82のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxv) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:83のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxvi) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:84のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:59のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxvii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:72のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxviii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:74のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxix) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:75のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxx) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:77のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxi) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:78のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:79のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxiii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:80のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxiv) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:81のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxv) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:の82アミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxvi) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:の83アミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;
(xxxvii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:84のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL;および
(xxxviii) 配列番号:51のアミノ酸配列を含むVH、配列番号:85のアミノ酸配列を含むCH、配列番号:60のアミノ酸配列を含むVL、および配列番号:63のアミノ酸配列を含むCL。
〔8〕
〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子をコードする、単離された核酸。
〔9〕
〔8〕に記載の核酸を含むベクター。
〔10〕
〔8〕に記載の核酸、または〔9〕に記載のベクターを含む、宿主細胞。
〔11〕
抗CD137抗原結合分子を製造する方法であって、抗CD137抗原結合分子が製造されるように〔10〕に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
〔12〕
〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子および細胞傷害剤を含む、イムノコンジュゲート。
〔13〕
〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子若しくは〔12〕に記載のイムノコンジュゲート;および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
〔14〕
医薬品としての使用のための、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子または〔12〕に記載のイムノコンジュゲート。
〔14.1〕
腫瘍の治療における使用のための、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、〔12〕に記載のイムノコンジュゲート、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔14.2〕
腫瘍が、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および/またはCD8陽性T細胞が浸潤している固形腫瘍である、〔14.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子、イムノコンジュゲート、または薬学的製剤。
〔14.3〕
腫瘍が、制御性T(Treg)細胞が浸潤している固形腫瘍である、〔14.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子、イムノコンジュゲート、または薬学的製剤。
〔15〕
免疫細胞の活性化における使用のための、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、〔12〕に記載のイムノコンジュゲート、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔15.1〕
前記免疫細胞が、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および/またはT細胞である、〔15〕に記載の抗CD137抗原結合分子、イムノコンジュゲート、または薬学的製剤。
〔15.2〕
腫瘍組織における免疫細胞の活性化のための、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔15.3〕
前記免疫細胞が、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および/またはT細胞である、〔15.2〕に記載の抗CD137抗原結合分子、または薬学的製剤。
〔15.4〕
細胞の傷害における使用のための、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、〔12〕に記載のイムノコンジュゲート、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔16〕
低分子化合物に依存したCD137結合活性を有しない抗CD137抗原結合分子と比較して、非腫瘍組織における免疫の活性化のレベルが低い、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、〔12〕に記載のイムノコンジュゲート、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔16.1〕
前記非腫瘍組織が、リンパ節、脾臓、および/または肝臓である、〔16〕に記載の抗CD137抗原結合分子、イムノコンジュゲート、または薬学的製剤。
〔16.2〕
非腫瘍組織に発現しているCD137に実質的に結合しない、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子または〔12〕に記載のイムノコンジュゲート。
〔16.3〕
低分子化合物に依存したCD137結合活性を有しない抗CD137抗原結合分子と比較して、血中半減期が伸長している、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子または〔12〕に記載のイムノコンジュゲート。
〔17〕
低分子化合物に依存したCD137結合活性を有しない抗CD137抗原結合分子と比較して、副作用のレベルが低い、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子、〔12〕に記載のイムノコンジュゲート、または〔13〕に記載の薬学的製剤。
〔17.1〕
副作用が、AST増加、ALT増加、熱、吐き気、急性肝炎、肝障害、脾腫(splenomegaly)、腸炎、皮膚の化膿性炎症、好中球減少、リンパ球減少、血小板減少、トランスアミノアーゼの発現、および/または高ビリルビン血症(hyperbilirubinemia)である、〔17〕に記載の抗CD137抗原結合分子、イムノコンジュゲート、または薬学的製剤。
〔18〕
低分子化合物に依存したCD137アゴニスト活性を有する、抗CD137抗原結合分子。
〔18.1〕
10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔18〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.2〕
10μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔18〕または〔18.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.3〕
50μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔18〕または〔18.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.4〕
250μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔18〕または〔18.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.5〕
前記CD137に対するアゴニスト活性が、CD137発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価される、〔18〕乃至〔18.4〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.6〕
前記CD137発現細胞が、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞である、〔18.5〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.7〕
前記CD137に対するアゴニスト活性が、レポーター遺伝子アッセイにより評価される、〔18〕乃至〔18.4〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.8〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でCD137に対するアゴニスト活性を示し、かつ当該低分子化合物を添加しない溶液中でCD137に対するアゴニストを実質的に示さない、〔18〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.9〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および当該低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性が、それぞれ、当該溶液中でCD137発現細胞と抗CD137抗原結合分子を接触させた後72時間以内に測定されるIL-2、IFN-γ、および/またはIL-6の産生量により評価される、〔18.8〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.10〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および当該低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性が、それぞれ、NF-kappaB-ルシフェラーゼレポーター構築物及びCD137を発現するT細胞と抗CD137抗原結合分子を接触させた後6時間以内に測定されるルシフェラーゼ発光シグナルにより評価される、〔18.8〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.11〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔18〕乃至〔18.10〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔18.12〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔18〕乃至〔18.11〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19〕
低分子化合物に依存したCD137アゴニスト活性を有する、〔1〕乃至〔7.1〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.1〕
10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔19〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.2〕
10μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔19〕または〔19.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.3〕
50μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔19〕または〔19.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.4〕
250μM以上の低分子化合物の存在下でのCD137に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔19〕または〔19.1〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.5〕
前記CD137に対するアゴニスト活性が、CD137発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価される、〔19〕乃至〔19.4〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.6〕
前記CD137発現細胞が、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞である、〔19.5〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.7〕
前記CD137に対するアゴニスト活性が、レポーター遺伝子アッセイにより評価される、〔19〕乃至〔19.4〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.8〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でCD137に対するアゴニスト活性を示し、かつ当該低分子化合物を添加しない溶液中でCD137に対するアゴニストを実質的に示さない、〔19〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.9〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および当該低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性が、それぞれ、当該溶液中でCD137発現細胞と抗CD137抗原結合分子を接触させた後72時間以内に測定されるIL-2、IFN-γ、および/またはIL-6の産生量により評価される、〔19.8〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.10〕
低分子化合物の終濃度が50μM以上となるように調製された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および当該低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性が、それぞれ、NF-kappaB-ルシフェラーゼレポーター構築物及びCD137を発現するT細胞と抗CD137抗原結合分子を接触させた後6時間以内に測定されるルシフェラーゼ発光シグナルにより評価される、〔19.8〕に記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.11〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔19〕乃至〔19.10〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔19.12〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔19〕乃至〔19.11〕のいずれかに記載の抗CD137抗原結合分子。
〔20〕
改変Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子であって、当該改変Fc領域が、親Fc領域を含む親アゴニスト抗原結合分子と比較して等電点(pI)の上昇をもたらす少なくとも一つのアミノ酸改変を含み、親アゴニスト抗原結合分子と比較してアゴニスト活性が上昇している、アゴニスト抗原結合分子。
〔20.1〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、親Fc領域の表面に露出し得るアミノ酸残基の改変である、〔20〕に記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.2〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、
(i) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に負の電荷を有するアミノ酸残基を、側鎖に電荷を有さないアミノ酸残基へ置換する改変、
(ii) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に電荷を有さないアミノ酸残基を、側鎖に正の電荷を有するアミノ酸残基へ置換する改変、および/または、
(iii) 親Fc領域の少なくとも一つの側鎖に負の電荷を有するアミノ酸残基を、側鎖に正の電荷を有するアミノ酸残基へ置換する改変、
である、〔20〕または〔20.1〕に記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.3〕
前記少なくとも1つのアミノ酸改変が、複数のアミノ酸置換の組合せであり、かつ、当該複数のアミノ酸置換が互いに立体構造的に近接した位置に存在する、〔20〕乃至〔20.2〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.4〕
改変Fc領域のFcγ受容体への結合活性が、親Fc領域と比較して実質的に低下していない、〔20〕乃至〔20.3〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.5〕
前記Fcγ受容体が、FcγRIIbである、〔20.4〕に記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.6〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づく、Q311R、P343R、およびD413Kからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸置換である、〔20〕乃至〔20.4〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.7〕
前記少なくとも一つのアミノ酸改変が、EUナンバリングに基づく、(i)P343R/D413K、(ii)Q311R/P343R、(iii)P343R、(iv)D413K、(v)Q311R、または(vi)Q311R/D413Kのアミノ酸改変またはその組み合わせである〔20〕乃至〔20.6〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.8〕
抗CD137抗原結合分子である、〔20〕乃至〔20.7〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔20.9〕
抗CD137抗体である、〔20〕乃至〔20.8〕のいずれかに記載のアゴニスト抗原結合分子。
〔21〕
改変Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子を製造する方法であって、
親Fc領域に、親Fc領域を含む親アゴニスト抗原結合分子と比較して等電点(pI)の上昇をもたらす少なくとも一つのアミノ酸改変を導入することを含み、
改変Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子のアゴニスト活性が、親アゴニスト抗原結合分子と比較して上昇している、方法。
〔21.1〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔21〕に記載の方法。
〔21.2〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔21〕または〔21.1〕に記載の方法。
〔21.3〕
アゴニスト抗原結合分子の、50μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔21〕または〔21.1〕に記載の方法。
〔21.4〕
アゴニスト抗原結合分子の、250μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔21〕または〔21.1〕に記載の方法。
〔21.5〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、抗原発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価される、〔21〕乃至〔21.4〕のいずれかに記載の方法。
〔21.6〕
前記抗原発現細胞が、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞である、〔21.5〕に記載の方法。
〔21.7〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、レポーター遺伝子アッセイにより評価される、〔21〕乃至〔21.4〕のいずれかに記載の方法。
〔21.8〕
さらに、
(i)〔21〕乃至〔21.7〕のいずれかに記載の方法で作製された前記アゴニスト抗原結合分子をコードする遺伝子と作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを取得し、
(ii) 当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して前記アゴニスト抗原結合分子を生産させ、
(iii) 宿主細胞培養物から前記アゴニスト抗原結合分子を回収する、
ことを含む、〔21〕乃至〔21.7〕のいずれかに記載の方法。
〔21.9〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗原結合分子である、〔21〕乃至〔21.8〕のいずれかに記載の方法。
〔21.10〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗体である、〔21〕乃至〔21.9〕のいずれかに記載の方法。
〔21.11〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔21.1〕乃至〔21.10〕のいずれかに記載の方法。
〔21.12〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔21.1〕乃至〔21.11〕のいずれかに記載の方法。
〔22〕
Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子のアゴニスト活性を上昇させる方法であって、当該Fc領域に、親Fc領域を含む親アゴニスト抗原結合分子と比較して等電点(pI)の上昇をもたらす少なくとも一つのアミノ酸改変を導入することを含む、方法。
〔22.1〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔22〕に記載の方法。
〔22.2〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔22〕または〔22.1〕に記載の方法。
〔22.3〕
アゴニスト抗原結合分子の、50μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔22〕または〔22.1〕に記載の方法。
〔22.4〕
アゴニスト抗原結合分子の、250μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔22〕または〔22.1〕に記載の方法。
〔22.5〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、抗原発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価される、〔22〕乃至〔22.4〕のいずれかに記載の方法。
〔22.6〕
前記抗原発現細胞が、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞である、〔22.5〕に記載の方法。
〔22.7〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、レポーター遺伝子アッセイにより評価される、〔22〕乃至〔22.4〕のいずれかに記載の方法。
〔22.8〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗原結合分子である、〔22〕乃至〔22.7〕のいずれかに記載の方法。
〔22.9〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗体である、〔22〕乃至〔22.8〕のいずれかに記載の方法。
〔22.10〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔22.1〕乃至〔22.9〕のいずれかに記載の方法。
〔22.11〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔22.1〕乃至〔22.10〕のいずれかに記載の方法。
〔23〕
Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子のアゴニスト活性を上昇させるための、少なくとも一つのアミノ酸改変の使用であって、当該アミノ酸可変が親Fc領域を含む親アゴニスト抗原結合分子と比較して等電点(pI)の上昇をもたらすものである、方法。
〔23.1〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMの低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔23〕に記載の方法。
〔23.2〕
アゴニスト抗原結合分子の、10μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔23〕または〔23.1〕に記載の方法。
〔23.3〕
アゴニスト抗原結合分子の、50μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔23〕または〔23.1〕に記載の方法。
〔23.4〕
アゴニスト抗原結合分子の、250μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、当該低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上高い、〔23〕または〔23.1〕に記載の方法。
〔23.5〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、抗原発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価される、〔23〕乃至〔23.4〕のいずれかに記載の方法。
〔23.6〕
前記抗原発現細胞が、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞である、〔23.5〕に記載の方法。
〔23.7〕
前記抗原に対するアゴニスト活性が、レポーター遺伝子アッセイにより評価される、〔23〕乃至〔23.4〕のいずれかに記載の方法。
〔23.8〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗原結合分子である、〔23〕乃至〔23.7〕のいずれかに記載の方法。
〔23.9〕
前記アゴニスト抗原結合分子が、抗CD137抗体である、〔23〕乃至〔23.8〕のいずれかに記載の方法。
〔23.10〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔23.1〕乃至〔23.9〕のいずれかに記載の方法。
〔23.11〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔23.1〕乃至〔23.10〕のいずれかに記載の方法。
〔24〕
低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法であって、
(a) 低分子化合物の存在下において、融合パートナー分子1単位あたり、2単位以上の抗原が融合した融合分子に、抗原結合ドメイン若しくは抗原結合分子またはそれらのライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で該融合分子中の抗原と結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含む、スクリーニング方法。
〔24.1〕
前記融合パートナー分子が、二量体のFc領域である、〔24〕に記載の方法。
〔24.2〕
前記Fc領域が、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットを含み、前記抗原が、第一及び第二のFcサブユニットに一つずつ融合されている、〔24.1〕に記載の方法。
〔24.3〕
前記抗原が、第一及び第二のFcサブユニットのN末端に一つずつ融合されている、〔24.1〕または〔24.2〕に記載の方法。
〔24.4〕
前記抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のライブラリが、ファージライブラリである、〔24〕乃至〔24.3〕のいずれかに記載の方法。
〔24.5〕
前記ファージライブラリに含まれるファージが、2以上の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をその表面に提示するファージである、〔24〕乃至〔24.4〕のいずれかに記載の方法。
〔24.6〕
前記ファージライブラリに含まれるファージが、ヘルパーファージ由来pIII遺伝子に欠損を有するファージである、〔24〕乃至〔24.5〕のいずれかに記載の方法。
〔25〕
2以上の異なる低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法であって、
(a) 第1の低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメイン若しくは抗原結合分子またはそれらのライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該第1の低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する工程、
(d) 前記工程(c)で単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を、第2の低分子化合物の存在下において、前記抗原に接触させ、
(e) 前記工程(d)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該第2の低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、
(f) 前記工程(e)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含み、
ここで、前記(c)および(d)の間に、前記(c)で単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をコードする遺伝子を増幅することを含まない、
スクリーニング方法。
〔25.1〕
前記抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のライブラリが、ファージライブラリである、〔25〕に記載の方法。
〔26〕
低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法であって、
(a) 低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のナイーブライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含み
ここで、前記ナイーブライブラリが、2以上の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をその表面に提示するファージを含むファージライブラリである、スクリーニング方法。
〔27〕
低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法であって、
(a) 低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含み、
ここで、前記ライブラリが、ヘルパーファージ由来pIII遺伝子に欠損を有するファージを含むライブラリである、スクリーニング方法。
〔28〕
低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法であって、
(a) 低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該低分子化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含み、
ここで、前記ライブラリが、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の発現を、該抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の発現を制御しているプロモーターからの発現量を上昇させる低分子添加物によって増大させて調製されたファージを含むライブラリである、スクリーニング方法。
〔28.1〕
前記低分子添加物が、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)またはarabinoseである、〔28〕に記載のスクリーニング方法。
〔28.2〕
前記低分子化合物が、アデノシン含有化合物である、〔24〕乃至〔28.1〕のいずれかに記載の方法。
〔28.3〕
前記低分子化合物が、ATPである、〔24〕乃至〔28.2〕のいずれかに記載の方法。
〔29〕
腫瘍組織特異的化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有する抗原結合分子であって、100 μMの当該化合物の存在下における抗原結合活性が、当該化合物の非存在下における抗原結合活性と比べて、2倍以上高い、抗原結合分子。
〔29.1〕
100 μMの当該化合物の存在下におけるKD値が5×10-7 M以下である、〔29〕に記載の抗原結合分子。
〔29.2〕
当該化合物の非存在下におけるKD値が1×10-6 M以上である、〔29〕または〔29.1〕に記載の抗原結合分子。
〔29.3〕
抗原に対して中和活性を有する、〔29〕から〔29.2〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔29.4〕
抗原を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有する、〔29〕から〔29.3〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔29.5〕
抗原が、腫瘍組織における腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞のいずれかが発現または分泌する抗原である、〔29〕から〔29.4〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔29.6〕
当該化合物が、アデノシン含有化合物である、〔29〕から〔29.5〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔29.7〕
Fc領域を含む、〔29〕から〔29.6〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔29.8〕
Fc領域がアミノ酸改変を含む変異Fc領域であって、当該変異Fc領域が天然型Fc領域に比べて、FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIaからなる群より選択される少なくとも一つのFcγ受容体に対する結合活性が増強している、〔29.7〕に記載の抗原結合分子。
〔29.9〕
抗原結合分子が抗体または抗体断片である、〔29〕から〔29.8〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔30〕
〔29〕から〔29.9〕のいずれかに記載の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
〔30.1〕
腫瘍の治療における使用のための、〔30〕に記載の薬学的製剤。
〔30.2〕
対照となる抗原結合分子を含む薬学的製剤と比較して、非腫瘍組織における細胞傷害活性が低い、〔30.1〕に記載の薬学的製剤。
〔30.3〕
対照となる抗原結合分子を含む薬学的製剤と比較して、副作用のレベルが低い、〔30.1〕または〔30.2〕に記載の薬学的製剤。
〔30.4〕
対照となる抗原結合分子が、腫瘍組織特異的化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有していない抗原結合分子である、〔30.2〕または〔30.3〕に記載の薬学的製剤。
〔31〕
腫瘍の治療における使用のための抗原結合分子を製造する方法であって、100 μMの腫瘍組織特異的化合物の存在下における抗原結合活性が、当該化合物の非存在下における抗原結合活性と比べて、2倍以上高い抗原結合分子を選択する工程を含む、方法。
〔32〕
腫瘍の治療における使用のための薬学的製剤を製造する方法であって、〔29〕から〔29.9〕のいずれかに記載の抗原結合分子を、薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、方法。
〔33〕
標的組織特異的化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有する抗原結合分子であって、1 μMの当該化合物の存在下における抗原結合活性が、十分量の当該化合物の存在下における抗原結合活性と比べて、2倍以上低い、抗原結合分子。
〔33.1〕
1 μMの当該化合物の存在下におけるKD値が2×10-7 M以上である、〔33〕に記載の抗原結合分子。
〔33.2〕
十分量の当該化合物の存在下におけるKD値が1×10-7 M以下である、〔33〕または〔33.1〕に記載の抗原結合分子。
〔33.3〕
当該化合物が腫瘍組織特異的化合物である、〔33〕から〔33.2〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔33.4〕
当該化合物がアデノシン含有化合物である、〔33.3〕に記載の抗原結合分子。
〔33.5〕
対照の抗原結合分子と比較して、高い血漿中滞留性を有する、および/または低い血漿中抗原蓄積能を有する、〔33〕から〔33.4〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔33.6〕
対照の抗原結合分子が、標的組織特異的化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有していない抗原結合分子である、〔33.5〕に記載の抗原結合分子。
〔33.7〕
抗原結合分子が抗体または抗体断片である、〔33〕から〔33.6〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔34〕
〔33〕から〔33.7〕のいずれかに記載の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤。
〔35〕
対照の抗原結合分子と比較して、高い血漿中滞留性を有する、および/または低い血漿中抗原蓄積能を有する抗原結合分子を製造する方法であって、(a) 標的組織特異的化合物の濃度が高まるにつれて抗原結合活性が増大する抗原結合分子を製造する工程、および(b) (a)で製造された抗原結合分子の血漿中滞留性、および/または血漿中抗原蓄積能を測定する工程を含む、方法。
〔35.1〕
1 μMの標的組織特異的化合物の存在下における抗原結合活性が、十分量の当該化合物の存在下における抗原結合活性と比べて、2倍以上低い抗原結合分子を選択する工程を含む、〔35〕に記載の方法。
〔35.2〕
対照の抗原結合分子が、標的組織特異的化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有していない抗原結合分子である、〔35〕または〔35.1〕に記載の方法。
〔36〕
薬学的製剤を製造する方法であって、〔33〕から〔33.7〕のいずれかに記載の抗原結合分子を、薬学的に許容される担体と混合する工程を含む、方法。
〔37〕
溶液中におけるATP濃度を測定する方法であって、(i) P2Y11を発現するsplit Luc/HEK293細胞を当該溶液に接触させる工程、および (ii) 当該細胞内のルシフェラーゼ活性を測定する工程を含む、方法。
〔37.1〕
ルシフェラーゼ基質を含む溶液を当該細胞に接触させる工程をさらに含む、〔37〕に記載の方法。
〔37.2〕
溶液がin vivoの組織中における細胞間液である、〔37〕または〔37.1〕に記載の方法。
〔37.3〕
組織が腫瘍組織である、〔37.2〕に記載の方法。
〔37.4〕
工程(i)が、P2Y11を発現するsplit Luc/HEK293細胞をin vivoの組織中に移植する工程である、〔37.2〕または〔37.3〕に記載の方法。
従って、例えば、抗原が、CD137の場合には、斯かるアゴニスト作用を有する抗原結合分子または抗体を、それぞれ「CD137アゴニスト抗原結合分子」または「CD137アゴニスト抗体」と称する。同様に、例えば、抗原が、CD3の場合には、斯かるアゴニスト作用を有する抗原結合分子または抗体を、それぞれ「CD3アゴニスト抗原結合分子」または「CD3アゴニスト抗体」と称する。
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。また、本明細書において、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)、および当該残基におけるアミノ酸改変または置換は、Kabatナンバリングシステムとアミノ酸との組合せによって表されうる。例えば、N99は、Kabatナンバリング99位のアスパラギン(Asn)を表し、N99Aは、Kabatナンバリング99位のアスパラギン(Asn)のアラニン(Ala)への置換を表す。
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある%アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる)は、次のように計算される:分率X/Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの%アミノ酸配列同一性は、BのAへの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての%アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。
CD137は、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのメンバーである。その代替の名称は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9(TNFRSF9)、4-1BB、ILAである。活性化されたCD4+およびCD8+T細胞上でのその発現に加えて、CD137はまた、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー(NK)およびNK-T細胞、マクロファージ、単球、好中球、CD4+CD25+制御性T細胞、および血管内皮細胞において発現される。癌細胞においても発現されることも示されている(Labianoら、Oncoimmunology、24巻:e1062967(2015年))。その天然のリガンドであるCD137Lは、B細胞、単球/マクロファージ、および樹状細胞などの抗原提示細胞上に示している(Wattsら、Annu.Rev.Immunol.、23巻:23-68頁(2005年))。そのリガンドとの相互作用において、CD137は、TCR誘導性のT細胞増殖の増加、サイトカイン産生、機能的成熟、アポトーシスの抑制、および長期のCD8+T細胞生存をもたらす(Namら、Curr.Cancer Drug Targets、5巻:357-363頁(2005年)、Wattsら、Annu.Rev.Immunol.、23巻:23-68頁(2005年))。
一局面において、本開示は、抗CD137アゴニスト抗原結合分子、およびそれらの使用一部基づくものである。特定の態様において、CD137に結合する抗体が提供される。本開示の抗体は、免疫細胞の活性化作用、細胞傷害活性、または抗腫瘍活性を発揮し得ることから、例えば、がんの診断または治療のために、有用である。
一局面において、本開示はCD137に結合する、単離された抗原結合分子または抗体を提供する。特定の態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、
・低分子化合物に依存したCD137結合活性を有する;
・CD137の細胞外領域に結合する;
・低分子化合物およびCD137とともに三者複合体を形成する;
・ヒトおよびサル由来のCD137に結合する;
・CD137活性のアゴニストである;
・低分子化合物の存在下で、CD137に対するアゴニスト活性を示す;
・低分子化合物の非存在下で、CD137に対するアゴニスト活性が低い;および/または
・低分子化合物の非存在下で、CD137に対するアゴニスト活性を実質的に示さない。
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子または抗体の結合活性(binding activity)は、低分子化合物の存在下において、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM(例えば、10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9M以下、10-10M以下、例えば10-6M 〜10-10M、10-7M〜10-9M例えば、10-7M 〜10-8M)の解離定数 (KD) を有する。
一局面において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、低分子化合物に依存したCD137結合活性を有する。非限定の一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、当該低分子化合物の非存在下でのCD137の結合活性と比べて高い。異なる一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、高濃度低分子化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、低濃度の当該低分子化合物化合物の存在下でのCD137の結合活性と比べて高い。好ましい一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、低分子化合物化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、当該低分子化合物化合物の非存在下でのCD137の結合活性の、2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、30倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、500倍以上、1×103倍以上、2×103倍以上、上、3×103倍以上、5×103倍以上、1×104倍以上、2×104倍以上、3×104倍以上、5×104倍以上、または1×105倍以上である。異なる好ましい一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、低分子化合物化合物の存在下でのCD137に対する結合活性が、当該低分子化合物化合物の非存在下でのCD137の結合活性の、2倍より高い、3倍より高い、5倍より高い、10倍より高い、15倍より高い、20倍より高い、25倍より高い、30倍より高い、50倍より高い、100倍より高い、200倍より高い、300倍より高い、500倍より高い、1×103倍より高い、2×103倍より高い、上、3×103倍より高い、5×103倍より高い、1×104倍より高い、2×104倍より高い、3×104倍より高い、5×104倍より高い、または1×105倍より高い。
ここで、「実質的な濃度がセロ」とは、例えば、低分子化合物が存在するものの、現在の技術ではその濃度を検出することができない程度の極めて微量な濃度を挙げることができる。
(1)アデノシン(ADO)、アデノシン3リン酸(ATP)、アデノシン2リン酸(ADP)、アデノシン1リン酸(AMP)、イノシン等のプリン環構造を有するヌクレオシド、
(2)アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、
(3)キヌレニン、アントラニル酸、3-ヒドロキシキヌレニン、キヌレン酸等のアミノ酸の代謝産物、
(4)プロスタグランジンE2等のアラキドン酸の代謝産物、
(5)乳酸、コハク酸、クエン酸等の解糖系またはクレブス回路の一次代謝産物、ならびに
(6)1−メチルニコチンアミド等のニコチンアミドの代謝産物。
腫瘍細胞が細胞死すると、細胞内の大量のATPが細胞外に漏出することが知られている。そのため、腫瘍組織におけるATP濃度は正常組織と比較して著しく高い(PLoS One. (2008) 3, e2599)。AMPは細胞外-5'-ヌクレオチダーゼ(eco-5'-nucleotidase)(CD73)のような細胞表面の酵素によって代謝される(RestaおよびThompson(Immunol. Rev. (1998) 161, 95-109)ならびにSadejら(Melanoma Res. (2006) 16, 213-222))。アデノシンは低濃度で細胞外環境に構成的に存在するプリンヌクレオシドであるが、固形腫瘍で見出される低酸素組織では細胞外アデノシン濃度の顕著な増加が報告されている(BlayおよびHoskin(Cancer Res. (1997) 57, 2602-2605))。CD73は腫瘍および免疫細胞の表面に発現しており(Kobieら(J. Immunol. (2006) 177, 6780-6786))、乳癌(Canbolatら(Breast Cancer Res. Treat. (1996) 37, 189-193))、胃癌(Durakら(Cancer Lett. (1994) 84, 199-202))、膵臓癌(FlockeおよびMannherz(Biochim. Biophys. Acta (1991) 1076, 273-281))およびグリオブラストーマ(Bardotら(Br. J. Cancer (1994) 70, 212-218))において活性の上昇が見出されている。腫瘍組織におけるアデノシンの蓄積は、細胞質の5'-ヌクレオチダーゼによってAMPの脱リン酸化が増加することに起因している可能性が提唱されている(HeadrickおよびWillis(Biochem. J. (1989) 261, 541-550))。さらに腫瘍組織に浸潤している制御性T細胞もATP分解酵素を発現しており、アデノシンを産生している(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(35), 13132-13137、Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223)。産生されたアデノシンは、A2Aレセプター等のアデノシンレセプターを介して腫瘍組織を免疫抑制的な環境にしていると考えられている(Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223)。以上のことから、プリンヌクレオチドの代謝によって腫瘍組織において高濃度に蓄積していると考えられるATP、ADP、AMP、またはアデノシン等が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物の例として挙げられる。さらにアデノシンは、adenosine deaminaseによってイノシンに分解されるため、イノシンが高濃度に蓄積する。
さらには、特定の態様において、プリン環構造を有するヌクレオシドには、ADPbetaS(Sigma社)等、市販されているプリン環構造を有するヌクレオシドも含まれる。
腫瘍細胞では、生体内における窒素運搬体として作用するグルタミンの細胞内への取込み速度が上昇しており、こうしたグルタミンの取込みとその結果起こるグルタミン酸および乳酸への変換(グルタミン分解(glutaminolysis))は、腫瘍細胞の特徴であると考えられている(MazurekおよびEigenbrodt(Anticancer Res. (2003) 23, 1149-1154、ならびにMazurekら(J. Cell. Physiol. (1999) 181, 136-146))。癌患者では、血漿中のグルタミンレベルが減少している一方、グルタミン酸濃度が増大しており(Drogeら(Immunobiology (1987) 174, 473-479))、また、肺癌組織の13C放射標識されたグルコースの代謝研究によって、13C標識コハク酸、13C標識アラニン、13C標識グルタミン酸、および13C標識クエン酸の濃度間で相関が観察された。以上のことから、グルタミン分解等によって腫瘍組織において高濃度に蓄積していると考えられるアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物の例として挙げられる。
インドールアミン2, 3-ジオキシゲナーゼ(IDO)はメラノーマ、結腸癌、および腎臓癌等の多くの癌で高発現しているトリプトファン代謝酵素であり(Uyttenhoveら(Nat. Med. (2003) 9, 1269-1274))、IDOはトリプトファンのキヌレニンへの変換を触媒する。また、IDOを発現しないグリオーマでは肝臓のトリプトファン2, 3-ジオキシゲナーゼ(TDO)によって、トリプトファンからキヌレニンが生成する(Opitzら(Nature (2011) 478(7368), 197-203))。またIDOは腫瘍組織に浸潤している樹状細胞にも発現しており、樹状細胞もキヌレニンを産生する(J. Immunol. (2008) 181, 5396-5404)。また、IDOは腫瘍組織の骨髄由来抑制細胞(MDSC)にも発現しており、MDSCもキヌレニンを産生する(Yuら(J. Immunol. (2013) 190, 3783-3797))。キヌレニンはキヌレニダーゼによってアントラニル酸に、およびキヌレニン3-ヒドロキシラーゼによって3-ヒドロキシキヌレニンに変換される。アントラニル酸、および3-ヒドロキシキヌレニンはともにNADの前駆体となる3-ヒドロキシアントラニル酸に変換される。キヌレニンはキヌレニンアミノトランスフェラーゼによってキヌレン酸に変換される。以上のことから、キヌレニン、ならびにその代謝産物である、アントラニル酸、3-ヒドロキシキヌレニン、およびキヌレン酸等が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物、特に腫瘍細胞特異的代謝産物の例として挙げられる。
プロスタグランジンE2(PGE2)は結腸癌細胞の増殖を促進し、そのアポトーシスを抑制する(Shengら(Cancer Res. (1998) 58, 362-366))。 PGE2合成酵素のうち、COX-1はほぼすべての組織において構成的に発現しているのに対して、COX-2は腫瘍においてある種の炎症性サイトカインおよび癌遺伝子によって誘導されることが主に見出されている(WarnerおよびMitchell(FASEB J. (2004) 18, 790-804))。COX-2の過剰発現は乳癌の予後の悪さ(Denkertら(Clin. Breast Cancer (2004) 4, 428-433))、および卵巣癌の急速な疾患の進行(Denkerら(Mod. Pathol. (2006) 19, 1261-1269))と関連性があることも報告されている。また腫瘍組織に浸潤している制御性T細胞もPGE2を産生している(Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223)。以上のことから、PGE2等のアラキドン酸の代謝産物が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物、特に腫瘍細胞特異的代謝産物や腫瘍組織に浸潤している免疫細胞特異的代謝産物の例として挙げられる。PGE2以外にも、トロンボキサンA2(TXA2)が大腸癌等の腫瘍組織で産生が亢進している(J. Lab. Clin. Med. (1993) 122, 518-523)。
ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、および乳酸脱水素酵素(LDH)等の解糖系(Embden−Myerhof経路)酵素の上方調節(アップレギュレーション)として特徴付けられる解糖系表現型は、Warburg効果として固形腫瘍の特徴であることが従来から知られている。解糖系の最終産物である乳酸、クレブス回路によって生成されるコハク酸およびクエン酸が、腫瘍組織において蓄積していることが知られている(Teresaら(Mol. Cancer (2009) 8, 41-59))。以上のことから、解糖系によって生成される一次代謝産物である、乳酸、コハク酸、クエン酸等が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物、特に腫瘍細胞特異的代謝産物の例として挙げられる。また、細胞死により細胞内に高濃度で存在するコハク酸が細胞外に漏出することが知られている(Nature Immunology, (2008) 9, 1261-1269)。そのため、細胞死が頻繁に起こっている腫瘍組織において、コハク酸の濃度が上昇していると考えられる。
複数のヒト腫瘍組織において、ニコンチンアミドN-メチルトランスフェラーゼが高発現していることが知られている。本酵素によるニコチンアミドの安定的な代謝産物である1-メチルニコチンアミドは、腫瘍細胞の細胞外に分泌されることが知られている(Yamadaら(J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2010) 56, 83-86))。以上のことから、ニコチンアミドの代謝によって腫瘍組織において高濃度に蓄積していると考えられる1-メチルニコチンアミド等が、本開示で使用される腫瘍組織特異的化合物の例として挙げられる。
一局面において、本開示は、(a)配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1;(b)配列番号:8、9、10、11、12、13、14、15、および16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含むHVR-H2;および、(c)配列番号:17、18、19、または20から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含むHVR-H3より選択される、少なくとも1つ、少なくとも2つ、または3つすべてのVH HVR配列を含む、抗CD137抗原結合分子または抗体を提供する。一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、(a)配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1と;(b)配列番号:8、9、10、11、12、13、14、15、および16から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含むHVR-H2と;(c)配列番号:17、18、19、または20から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
-HVR-H2(配列番号:30)において:ポジション5、6、7、10、13、14、および/または17
-HVR-H3(配列番号:31)において:ポジション3、および/または6
-HVR-L1(配列番号:32)において:ポジション4、5、9、および/または11
-HVR-L3(配列番号:33)において:ポジション6、7、および/または8。
-HVR-H2(配列番号:8)において:K5HまたはS; S6G; T7S; E10Y; D13E; S14Q; V17GまたはL
-HVR-H3(配列番号:17)において:A3P、KまたはI; F6E
-HVR-L1(配列番号:21)において:R4S; Y5T; Y9F; E11N
-HVR-L3(配列番号:27)において:E6P; H7A; Q8I
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:43および 配列番号:54のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:44および 配列番号:55のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:45および 配列番号:55VHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:46および 配列番号:54のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:47および 配列番号:54のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:48および 配列番号:56のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:49および 配列番号:57のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:50および 配列番号:58のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:51および 配列番号:59のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:51および 配列番号:60のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:52および 配列番号:60のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:50および 配列番号:59のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
・一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体はそれぞれ配列番号:53および 配列番号:54のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。
上述の翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖N末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。
別の局面において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、定常領域を含む。定常領域は、重鎖定常領域(Fc領域を含む)、軽鎖定常領域、あるいはその両者であってもよい。さらなる局面において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、Fc領域を含む。いくつかの態様において、定常領域は、天然型配列の定常領域である。天然型抗体に由来する例示的な重鎖定常領域として、例えばヒトIgG1(配列番号:61、62)、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4などの重鎖定常領域を挙げることができる。また、天然型抗体に由来する例示的な軽鎖定常領域として、例えばヒトκ鎖、ヒトλ鎖(例えば配列番号:63)を挙げることができる。
(1)位置235、236、268、295、326、330、343、および413;
(2)位置214、235、236、268、295、326、330、343、および413;
(3)位置234、238、250、264、307、330、343、および413;
(4)位置234、238、264、330、343、および413;
(5)位置234、237、238、250、307、330、343、および413;
(6)位置234、237、238、330、343、および413;
(7)位置235、236、268、295、326、330、311、および343;
(8)位置234、238、250、264、307、330、311、および343;
(9)位置234、238、264、330、311、および343;
(10)位置234、237、238、250、307、330、311、および343;
(11)位置234、237、238、330、311、および343;
(12)位置235、236、268、295、326、330、および343;
(13)位置214、235、236、268、295、326、330、および343;
(14)位置235、236、268、295、326、330、および413;
(15)位置214、236、268、330、および343;
(16)位置214、235、236、268、330、および343;
(17)位置214、236、268、330、および413;
(18)位置214、236、268、330、343、および413;
(19)位置214、235、236、268、330、343、および413;
(20)位置214、236、268、330、および311;
(21)位置214、235、236、268、330、および311;
(22)位置214、236、268、330、311、および343;
(23)位置214、235、236、268、330、311、および343;
(24)位置214、236、268、330、311、および413;
(25)位置214、235、236、268、330、311、および413;
(26)位置214、235、236、268、295、326、330、および311。
A548/B256、および/またはA549/B167を含む抗CD137抗原結合分子または抗体と競合する。
特定の態様において、本開示における抗CD137抗原結合分子または抗体は、CD137アゴニスト活性を有する。CD137シグナル伝達は、NK細胞のIFN-γ分泌及び増殖を刺激するだけでなく(Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998)、それらの生存の増加並びにサイトカインの分泌及び共刺激分子の上方制御によって示されるDC活性化を促進することが知られている(Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002)。しかし、CD137は、T細胞のCD4+サブセット及びCD8+サブセットの両方においてTCR誘導活性化を調節する共刺激分子として最もよく特徴づけられる。TCR誘発と組み合わせて、抗CD137アゴニスト抗体は、T細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化誘導細胞死に対するTリンパ球の感受性を低下させる(Snell et al., 2011に総説される)。これらの現象のうち、T細胞上でのCD137シグナル伝達の後に観察される生理現象は、CD137シグナルにより活性化する下流シグナルであるTRAF2、TRAF1、特にNF-kappaB、JNK、Erk、Akt、survivin、Bcl-XL、および/またはBcl-2等によって媒介される(Ward-Kavanaghら、Immunity、44巻:1005頁(2016年))。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、および scFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994);加えて、WO93/16185;ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号;および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域)およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
本開示の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554;Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004);およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、CD137に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原へのものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、CD137の異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、CD137を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合アフィニティおよび/または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および/または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および/または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴(例えば、抗原結合性)を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表1の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表1の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持/改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
(1) 疎水性:ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile);
(2) 中性の親水性:システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln);
(3) 酸性:アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu);
(4) 塩基性:ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg);
(5) 鎖配向に影響する残基:グリシン (Gly)、プロリン (Pro);
(6) 芳香族性:トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体(または「改変Fc領域」と呼称することもある。)を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域)を含んでもよい。
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体(例えば、「thioMAbs」)を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分(薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など)にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい:軽鎖のV205(Kabatナンバリング);重鎖のA118(EUナンバリング);および重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ1,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも)、および、デキストランまたはポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗CD137抗原結合分子または抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/または重鎖)をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む(例えば、形質転換されている)。一態様において、宿主細胞は、真核性である(例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞)またはリンパ系の細胞(例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞))。一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から回収することを含む、抗CD137抗原結合分子または抗体を作製する方法が提供される。
本明細書で提供される抗CD137抗原結合分子または抗体は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的/化学的特性および/または生物学的活性について明らかにされてもよい。
一局面において、本開示の抗原結合分子または抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。
一局面において、生物学的活性を有する抗CD137抗原結合分子または抗体のそれを同定するための測定法が提供される。生物学的活性は、例えば、CD137アゴニスト活性;血漿中半減期;抗腫瘍活性;および、低いまたは抑制された腫瘍以外の組織での全身反応を含んでよい。また、このような生物学的活性をインビボおよび/またはインビトロで有する抗原結合分子または抗体が、提供される。
一態様において、CD137に対するアゴニスト活性は、低分子化合物が添加された、または添加されていない溶液中で、CD137発現細胞と抗CD137抗原結合分子または抗体を接触させることにより、測定される。一態様において、低分子化合物が添加された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性は、それぞれ、当該溶液中でCD137発現細胞と抗CD137抗原結合分子または抗体を接触させた後、18時間、24時間、36時間、48時間または72時間以内に測定されるサイトカイン産生量(例えば、IL-2、IFN-γ、および/またはIL-6産生量)により評価される。一態様において、低分子化合物が添加された溶液は、調整後の低分子化合物濃度が、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMとなるように調整される。さらなる一態様において、前記CD137発現細胞は、単離されたヒト抹消血単核細胞(PBMC)、または単離されたヒトPBMCから拡大培養されたT細胞が用いられる。
例示的な、ヒトPBMCを用いたCD137アゴニスト活性の測定法の詳細を以下に述べる。なお、以下の例では、低分子化合物として、ATPを例示的に用いているが、他の低分子化合物を排除するものではない。一態様において、単離されたヒトPBMCは、培地(5%ヒト血清(SIGMA)、95%AIM-V(Thermo Fischer Scientific)にて細胞密度5x106 /mLに希釈される。その後、当該単離されたヒトPBMCは、抗ヒトCD3ε抗体および/または抗ヒトCD28抗体と接触させられる。これにより、ヒトPBMCにCD137発現が誘導される。好ましくは、当該単離されたヒトPBMC(細胞密度5x106/mLで100μL)に、培地で希釈された0.04μg/mL抗ヒトCD3ε抗体(BD社製、クローンSP34)および20μg/mL抗ヒトCD28抗体(BD、クローン:CD28.2)が50μL添加される。
(i)〔抗CD137抗原結合分子または抗体を添加した場合の、低分子化合物の非存在下でのサイトカイン産生量〕/〔陰性コントロール抗体を添加した場合の、低分子化合物の非存在下でのサイトカイン産生量〕
(ii)〔抗CD137抗原結合分子または抗体を添加した場合の、低分子化合物の存在下でのサイトカイン産生量〕/〔陰性コントロール抗体を添加した場合の、当該低分子化合物の存在下でのサイトカイン産生量〕
一態様において、CD137に対するアゴニスト活性は、低分子化合物が添加された、または添加されていない溶液中で、レポーター遺伝子アッセイにより評価される。一態様において、低分子化合物が添加された溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性、および低分子化合物を添加しない溶液中でのCD137に対するアゴニスト活性は、それぞれ、当該溶液中でそれぞれ、NF-kappaB-ルシフェラーゼレポーター構築物及びCD137を発現するT細胞と抗CD137抗原結合分子を接触させた後、一定時間静置された後に測定されるルシフェラーゼ発光シグナルにより評価される。一態様において、低分子化合物が添加された溶液は、調整後の低分子化合物濃度が、10μM、50μM、100μM、150μM、200μM、または250μMとなるように調整される。NF-kappaB-ルシフェラーゼレポーター構築物及びCD137を発現するT細胞は、好ましくは、GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega, CS196004)である。
一態様において、本開示の抗CD137抗原結合分子または抗体の血中動態は、ヒトCD137ノックインマウスを用いて測定および/または比較される。ヒトCD137ノックインマウスは、例えば、マウス胚性幹細胞(ES細胞)へのヒトCD137遺伝子置換ベクターの導入により、マウスCD137遺伝子をヒトCD137遺伝子に置換して作製される。一態様において、本開示のCD137抗原結合分子または抗体は、ヒトCD137ノックインマウスに単回静脈内投与され、投与直後から、約5日、10日、15日、20日、25日または30日後まで、経時的に複数回血液が採取される。好ましい一態様において、本開示のCD137抗原結合分子または抗体は、ヒトCD137ノックインマウスに単回静脈内投与され、投与後5分後から28日後にわたり、経時的に複数回血液が採取される。採取された血液からは速やかに血漿が分離され、血漿中の抗体濃度が電気化学発光(ECL)法で測定される。一態様において、血漿中の抗体濃度は、実施例6-3-2を参照に記載の方法で測定することができる。
一局面において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、インビボで細胞成長または増殖を阻害するその能力に関して試験される。特定の態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体は、インビボで腫瘍成長を阻害するその能力に関して試験される。同種移植モデル、または異種移植モデルなどのインビボモデルシステムが、そのような試験に使用され得る。例示的な異種移植システムにおいて、ヒト腫瘍細胞を、適切に免疫不全化された非ヒト動物、例えば無胸腺「ヌード」マウスに導入する。本開示の抗体を、この動物に投与する。腫瘍成長を阻害するまたは減少させる抗体の能力を測定する。上記の異種移植システムの特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、ヒト患者由来の腫瘍細胞である。そのような異種移植モデルは、Oncotest GmbH(Frieberg, Germany)から市販されている。特定の態様において、ヒト腫瘍細胞は、皮下注射によってまたは乳房脂肪パッドなどの適切な部位への移植によって、適切に免疫不全化された非ヒト動物に導入される。
一態様において、本開示の抗CD137抗原結合分子または抗体の抗腫瘍活性は、上記のヒトCD137ノックインマウスを用いた同系腫瘍細胞移植モデルを用いて測定および/または比較される。試験に用いる癌細胞株は適宜選択されて良いが、好ましくは、マウス大腸がん細胞株MC38細胞株である。一態様において、MC38細胞株はマウスの腹部皮下に移植され、腫瘍体積がおよそ50-300 mm3になった時点でモデル成立とする。モデル成立後、MC38細胞株移植マウスは群分けが実施されたのちに、各種抗CD137抗原結合分子または抗体が投与される。一態様において、抗腫瘍活性評価のため、腫瘍体積測定は週1-2回の頻度で実施される。また、腫瘍体積は次の計算式にて算出される:腫瘍体積=長径×短径×短径/2。一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体の抗腫瘍活性は、実施例6-4に記載の方法で試験および評価することができる。
一態様において、本開示の抗CD137抗原結合分子または抗体の全身反応は、上記のヒトCD137ノックインマウスを用いた同系腫瘍細胞移植モデルを用いて測定および/または比較される。全身反応を測定するための臓器は、適宜選択されてよいが、好ましくは、肝臓、脾臓および/またはリンパ節である。一態様において、全身反応の評価は、抗CD137抗原結合分子または抗体投与後の適切なタイミングで、ヒトCD137ノックインマウスから、肝臓、脾臓、および/またはリンパ節を摘出することにより行われる。摘出される臓器が脾臓および/またはリンパ節の場合、これら臓器の重量測定および/またはリンパ球画分の細胞数測定が実施される。このとき、好ましくは、脾臓については溶血後のリンパ球画分を、リンパ節についてはすりつぶされて得られたリンパ球画分を用いる。摘出される臓器が肝臓の場合、Liver dissociation kit, mouse(Milteny Biotec)を用いて得られたリンパ球画分の細胞数測定が実施される。さらに、各種臓器(肝臓、脾臓、および/またはリンパ節)のリンパ球画分を用いて、フローサイトメトリ―(FCM)を使ったT細胞解析を行っても良い。FCM解析においては、例えばCD8α陽性 T細胞でのGranzyme B発現またはPD-1発現またはICOS発現、もしくはCD45陽性細胞に対するCD8α陽性T細胞の割合が用いられる。一態様において、抗CD137抗原結合分子または抗体の全身反応は実施例6-4に記載の方法で試験および評価することができる。
本開示はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤(例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素(例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片)または放射性同位体)にコンジュゲートされた本明細書の抗CD137抗原結合分子または抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
特定の態様において、本明細書で提供される抗CD137抗原結合分子または抗体のいずれも、生物学的サンプルにおけるCD137抗原結合分子またはの存在を検出するのに有用である。本明細書で用いられる用語「検出」は、定量的または定性的な検出を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織を含む。
本明細書に記載の抗CD137抗原結合分子または抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む:リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤;保存料(オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール;メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン類;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);および/またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)(例えば、rHuPH20 (HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質)などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は(rHuPH20を含む)、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
本明細書で提供される抗CD137抗原結合分子または抗体のいずれも、治療的な方法において使用されてよい。
一局面において、本開示においては、医薬品としての使用のための、抗CD137抗原結合分子または抗体が提供される。本開示においては、該医薬品は、具体的には、抗CD137抗原結合分子または抗体が、T細胞等の免疫細胞上に発現するCD137へ結合することによる細胞の活性化を介して、抗腫瘍作用、例えば、腫瘍内の血管新生の阻害、腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍性B細胞枯渇、などを誘導するためのものを一例として挙げることができる。さらなる局面において、本開示においては、腫瘍の治療における使用のための、抗CD137抗原結合分子または抗体が提供される。特定の態様において、治療方法における使用のための、抗CD137抗原結合分子または抗体が提供される。特定の態様において、本開示は、腫瘍を有する個体を治療する方法であって、当該個体に抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗CD137抗原結合分子または抗体を提供する。さらなる態様において、本開示においては、該腫瘍は、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、CD8陽性T細胞および/または制御性T細胞(Treg細胞)が浸潤している固形腫瘍を一例として挙げることができる。
さらなる局面において、本開示は、個体において免疫細胞の活性化のための方法であって、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および/またはCD8陽性T細胞等の免疫細胞(より具体的には腫瘍組織に浸潤しているこれらの免疫細胞)を活性化するために当該個体に抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための、抗CD137抗原結合分子または抗体を提供する。
さらなる局面において、本開示は、個体において細胞(例えば、腫瘍細胞)の傷害のための方法であって、当該個体に抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を投与する工程を含む方法における使用のための抗CD137抗原結合分子または抗体を提供する。特定の態様において、該腫瘍は、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、CD8陽性T細胞および/または制御性T細胞(Treg細胞)が浸潤している固形腫瘍を一例として挙げることができる。上記態様の任意のものによる「個体」は、好適にはヒトである。
さらなる局面において、本開示は、個体において免疫細胞の活性化のための方法を提供する。一態様において、該方法は、個体に抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を投与する工程を含む方法を含む。さらなる態様において、本開示においては、該免疫細胞は、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および/またはCD8陽性T細胞等の免疫細胞(より具体的には腫瘍組織に浸潤しているこれらの免疫細胞)を挙げることができる。
さらなる局面において、本開示は、個体において細胞(具体的には、腫瘍細胞)を傷害するための方法を提供する。一態様において、該方法は、個体に抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を投与する工程を含む方法を含む。特定の態様において、該腫瘍は、B細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、CD8陽性T細胞および/または制御性T細胞(Treg細胞)が浸潤している固形腫瘍を一例として挙げることができる。上記態様の任意のものによる「個体」は、ヒトであってもよい。
一態様において、該非腫瘍組織は、リンパ節、脾臓、および/または肝臓を挙げることができる。
さらなる態様において、上述した治療方法、治療における使用、医薬品にもちいるための抗CD137抗原結合分子または抗体を含む薬学的製剤は、非腫瘍組織に発現しているCD137に実質的に結合しない抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を含むことができる。
さらなる態様において、上述した治療方法、治療における使用、医薬品にもちいるための抗CD137抗原結合分子または抗体を含む薬学的製剤は、低分子化合物に依存したCD137結合活性を有しない抗CD137抗原結合分子と比較して、血中半減期が伸長している抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を含むことができる。
さらなる態様において、上述した治療方法、治療における使用、医薬品にもちいるための抗CD137抗原結合分子または抗体を含む薬学的製剤は、低分子化合物に依存したCD137結合活性を有しない抗CD137抗原結合分子と比較して、副作用のレベルが低い、抗CD137抗原結合分子または抗体の有効量を含むことができる。
さらなる態様において、該副作用は、AST増加、ALT増加、熱、吐き気、急性肝炎、肝障害、脾腫(splenomegaly)、腸炎、皮膚の化膿性炎症、好中球減少、リンパ球減少、血小板減少、トランスアミノアーゼの発現、および/または高ビリルビン血症(hyperbilirubinemia)を挙げることができる。
一態様において、本開示における抗CD137抗原結合分子は、副作用が少ないことから、副作用の懸念無く投与量を増加することができ、結果としてより強い薬効(細胞傷害活性または抗腫瘍活性)を発揮することが可能である。
本開示の別の局面において、上述の障害の治療、予防、および/または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい(例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本開示の抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状を治療するために使用されるものであることを示す。本開示のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の(または第三の)容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
一局面において、本開示は、等電点(pI)上昇変異Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子または抗体、およびその使用方法を提供する。いくつかの態様において、pIが上昇した変異Fc領域を含むポリペプチドは、親Fc領域において少なくとも1つのアミノ酸改変を含む。さらなる態様において、当該アミノ酸改変のそれぞれは、親Fc領域と比較して、変異Fc領域の等電点(pI)を上昇させる。特定の理論に拘束されることなく、生体液(例えば血漿)のpHは中性のpH範囲内にあると考えられる。生体液において、pIが上昇した抗原結合分子または抗体の正味の正電荷は、上昇したpIに起因して増加しており、その結果、当該抗原結合分子または抗体は、pIが上昇していない抗原結合分子または抗体と比べて、物理化学的クーロン相互作用によって、正味の負電荷を有する内皮細胞表面により強く引き付けられる。これにより、アゴニスト抗原結合分子(または抗体)、もしくは抗原に結合したアゴニスト抗原結合分子(または抗体)が、Fcγ受容体発現細胞表面により近づき、抗原結合分子または抗体のFcγ受容体発現細胞への結合が上昇され得る。Fcγ受容体への結合活性がアゴニスト活性に寄与するアゴニスト抗原結合分子または抗体においては、pIを上昇させるアミノ酸改変によってFcγ受容体発現細胞への結合が上昇したアゴニスト抗原結合分子または抗体が、当該pIを上昇させるアミノ酸改変を含まないアゴニスト抗原結合分子または抗体と比較して、より高いアゴニスト活性を示すことが可能である。一態様において、アゴニスト抗原結合分子は、抗CD137抗原結合分子、または抗CD3抗原結合分子である。更なる態様において、アゴニスト抗原結合分子は、抗CD137抗体、または抗CD3抗体である。
(1)位置235、236、268、295、326、330、343、および413;
(2)位置214、235、236、268、295、326、330、343、および413;
(3)位置234、238、250、264、307、330、343、および413;
(4)位置234、238、264、330、343、および413;
(5)位置234、237、238、250、307、330、343、および413;
(6)位置234、237、238、330、343、および413;
(7)位置235、236、268、295、326、330、311、および343;
(8)位置234、238、250、264、307、330、311、および343;
(9)位置234、238、264、330、311、および343;
(10)位置234、237、238、250、307、330、311、および343;
(11)位置234、237、238、330、311、および343;
(12)位置235、236、268、295、326、330、および343;
(13)位置214、235、236、268、295、326、330、および343;
(14)位置235、236、268、295、326、330、および413;
(15)位置214、236、268、330、および343;
(16)位置214、235、236、268、330、および343;
(17)位置214、236、268、330、および413;
(18)位置214、236、268、330、343、および413;
(19)位置214、235、236、268、330、343、および413;
(20)位置214、236、268、330、および311;
(21)位置214、235、236、268、330、および311;
(22)位置214、236、268、330、311、および343;
(23)位置214、235、236、268、330、311、および343;
(24)位置214、236、268、330、311、および413;
(25)位置214、235、236、268、330、311、および413;
(26)位置214、235、236、268、295、326、330、および311。
斯かる本開示の方法は、一態様において、親Fc領域に、親Fc領域を含む親アゴニスト抗原結合分子と比較して等電点(pI)の上昇をもたらす少なくとも一つのアミノ酸改変(上述したとおり)を導入し、その結果得られる改変Fc領域を含むアゴニスト抗原結合分子のアゴニスト活性が、親アゴニスト抗原結合分子と比較して上昇しているアゴニスト抗原結合分子を同定、単離することを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法は、斯様にして同定、単離された前記アゴニスト抗原結合分子をコードする遺伝子と作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを取得し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養して前記アゴニスト抗原結合分子を生産させ、宿主細胞培養物から前記アゴニスト抗原結合分子を回収することを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法により、10μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、または90倍以上高い、アゴニスト抗原結合分子を製造することができる。
一態様において、斯かる本開示の方法により、50μM以上の低分子化合物の存在下での抗原に対するアゴニスト活性が、低分子化合物の非存在下での抗原に対するアゴニスト活性と比べて、2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、または90倍以上高い、アゴニスト抗原結合分子を製造することができる。
一態様において、斯かる方法において、アゴニスト抗原結合分子抗原に対するアゴニスト活性は、抗原発現細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価することができる。
一態様において、斯かる方法において、アゴニスト抗原結合分子抗原に対するアゴニスト活性は、単離されたヒト末梢血単核細胞(PBMC)またはヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞によるIL-2および/またはIFN-γ産生量により評価することができる。
一態様において、斯かる方法において、アゴニスト抗原結合分子抗原に対するアゴニスト活性は、レポーター遺伝子アッセイにより評価することができる。
一局面において、本発明は、低分子化合物の濃度に応じて抗原結合活性が変化する抗原結合分子を提供する。本分子は、低分子化合物依存的な(低分子化合物の濃度に依存した抗原結合活性を有する)抗原結合分子と言い換えることもできる。いくつかの局面において、抗原結合分子は抗体である。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、低分子化合物の濃度が高まるにつれて抗原結合活性が増大する。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子は、低分子化合物の濃度が高まるにつれて抗原結合活性が減少する。一態様において、低分子化合物の存在下における抗原結合分子の結合活性と、低分子化合物の非存在下における抗原結合分子の結合活性を比較した場合、一方の値がもう一方の値より高い。別の態様において、高濃度の低分子化合物の存在下における抗原結合分子の結合活性と、低濃度の低分子化合物の存在下における抗原結合分子の結合活性を比較した場合、一方の値がもう一方の値より高い。特定の態様において、本発明における低分子化合物は、標的組織特異的化合物である。さらなる態様において、本発明における低分子化合物は、腫瘍組織特異的化合物である。
本明細書において、「抗原」は、本発明の抗原結合分子が結合するエピトープを含む限りその構造は特に限定されない。抗原は無機物であってもよいし、有機物であってもよい。いくつかの態様において、抗原としては、17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ-V/ベータ-1 アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP-2a、BMP-3 オステオゲニン(Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原(CEA)、癌関連抗原、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67タンパク質)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、galectin-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子(Decay accelerating factor)、des(1-3)-IGF-I(脳IGF-1)、Dhh、ジゴキシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF-3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(ミオスタチン)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン(NP-capまたはNIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子(HGF)、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、単純ヘルペスウイルス(HSV) gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、ヒト成長ホルモン(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、インターフェロン(INF)-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンアルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5(アルファV)、インテグリンアルファ5/ベータ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス-Y抗原、ルイス-Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受容体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン(Muc1)、MUC18、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子(NGF)、NGFR、NGF-ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス(RSV)F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(腫瘍関連糖タンパク質-72)、TARC、TCA-3、T細胞受容体(例えば、T細胞受容体アルファ/ベータ)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI(ALK-5)、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2リガンド、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド)、TNFSF12(TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEMリガンド、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITRリガンド AITRリガンド、TL6)、TNFSF1A(TNF-a コネクチン(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40リガンド gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド)、TNFSF7(CD27リガンド CD70)、TNFSF8(CD30リガンド CD153)、TNFSF9(4-1BBリガンド CD137リガンド)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL-R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-Cadherin、VE-cadherin-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL、PCSK9、prekallikrein、RON、TMEM16F、SOD1、Chromogranin A、Chromogranin B、tau、VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、factor B、factor D、factor H、properdin、sclerostin、fibrinogen、fibrin、prothrombin、thrombin、組織因子、factor V、factor Va、factor VII、factor VIIa、factor VIII、factor VIIIa、factor IX、factor IXa、factor X、factor Xa、factor XI、factor Xia、factor XII、factor XIIa、factor XIII、factor XIIIa、TFPI、antithrombin III、EPCR、トロンボモデュリン、TAPI、tPA、plasminogen、plasmin、PAI-1、PAI-2、GPC3、Syndecan-1、Syndecan-2、Syndecan-3、Syndecan-4、LPA、S1Pなどが挙げられる。いくつかの態様において、抗原としては、ホルモンおよび成長因子のための受容体などが挙げられる。特定の態様において、抗原は、腫瘍組織に含まれる細胞(例え
ば腫瘍細胞、免疫細胞、間質細胞など)が発現または分泌する抗原である。
一態様において、本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、抗体依存性細胞貪食活性(antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP)、補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性、およびT細胞による細胞傷害活性等が挙げられる。CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方、ADCC活性とは、標的細胞の細胞表面に存在する抗原に抗原結合分子が結合し、さらに当該抗原結合分子にエフェクター細胞が結合することによって、当該エフェクター細胞が標的細胞に傷害を与える活性を意味する。目的の抗原結合分子がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定され得る(例えば、Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans、Coliganら編(1993)等)。
<ATP濃度を測定する方法>
(1) 多価な抗原を利用した分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法
一局面において、本開示は、1分子(1単位)の融合パートナー分子に、2分子(2単位)以上の抗原をを融合させて得られる融合分子を用いて、分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を高効率、高精度にスクリーニング、同定、取得する方法を提供する。
一態様において、本開示の方法は、分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法は、
(a) 低分子化合物の存在下において、融合パートナー分子1単位あたり2単位以上の抗原を融合した融合分子に、抗原結合ドメイン若しくは抗原結合分子またはそれらのライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で該融合分子中の抗原と結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含むことを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該Fc領域は、第一のFcサブユニット及び第二のFcサブユニットを含み、第一及び第二のFcサブユニットのそれぞれに抗原一つずつ融合されていることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該抗原は、第一及び第二のFcサブユニットのN末端に一つずつ融合されていることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のライブラリが、ファージライブラリであることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該ファージライブラリに含まれるファージは、2以上の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をその表面に提示するファージであることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該ファージライブラリに含まれるファージは、ヘルパーファージ由来pIII遺伝子に欠損を有するファージであることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、Fc領域(Fcサブユニット)と抗原との融合は、上述したとおりの遺伝子組み換え技術を用いて常法により作製することができる。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、抗原(例えば、Fc領域と抗原との融合分子)の、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のファージライブラリーへの接触、抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の単離、単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の低分子化合物の存在下または非存在下でのアッセイは、上述した方法および以下の実施例に記載される方法に従い、本願発明の属する技術分野で公知の方法を参照しながら行うことができる。
一態様において、斯かる本開示の方法は、実施例2に記載される方法を挙げることができる。
一局面において、本開示は、2以上の異なる低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。
一態様において、本開示の方法は、
(a) 第1の低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメイン若しくは抗原結合分子またはそれらのライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該第1の化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する工程、
(d) 前記工程(c)で単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を、第2の低分子化合物の存在下において、前記抗原に接触させ、
(e) 前記工程(d)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該第2の化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、
(f) 前記工程(e)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含み、前記(c)および(d)の間に、前記(c)で単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をコードする遺伝子を増幅することを含まない、
ことを特徴とする
一態様において、斯かる本開示の方法においては、抗原は、上述したとおりの任意の抗原であっても良く、好ましくは膜型抗原(例えば、CD137、CTLA4、CD40、OX40、RANK、GITR、ICOSなどの副刺激分子)を挙げることができる。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該低分子化合物は、上述したとおりの種々の化合物(例えば、アデノシン(ADO)、アデノシン3リン酸(ATP)、アデノシン2リン酸(ADP)、アデノシン1リン酸(AMP)、イノシン等のプリン環構造を有するヌクレオシド、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、キヌレニン、アントラニル酸、3-ヒドロキシキヌレニン、キヌレン酸等のアミノ酸の代謝産物、プロスタグランジンE2等のアラキドン酸の代謝産物、乳酸、コハク酸、クエン酸等の解糖系またはクレブス回路の一次代謝産物、1−メチルニコチンアミド等のニコチンアミドの代謝産物、等の腫瘍組織特異的化合物)を挙げることができる。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、抗原の、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のファージライブラリーへの接触、抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の単離、単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の第1の低分子化合物の存在下または非存在下でのアッセイ、および第2の低分子化合物の存在下または非存在下でのアッセイは、上述した方法および以下の実施例に記載される方法に従い、本願発明の属する技術分野で公知の方法を参照しながら行うことができる。
一態様において、斯かる本開示の方法は、実施例9に記載される方法を挙げることができる。
一局面において、本開示は、抗原刺激を受けたことのないヒトリンパ球(例えば、ヒトPBMC)から作製した互いに異なるヒト抗体配列の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子(例えば、Fabドメイン)を提示する複数のファージからなるナイーブライブラリ(naive library)を用いて、低分子化合物に依存した抗原結合活性を有する抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のスクリーニング方法を提供する。
一態様において、本開示の方法は、
(a) 低分子化合物の存在下において、抗原に、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のナイーブライブラリを接触させ、
(b) 前記工程(a)で抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を当該化合物の非存在下または低濃度存在下に置き、および
(c) 前記工程(b)で解離した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子を単離する、
ことを含むことを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該ナイーブライブラリは、2以上の抗原結合ドメインまたは抗原結合分子をその表面に提示するファージを含むファージライブラリであることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該ナイーブライブラリは、ヘルパーファージ由来pIII遺伝子に欠損を有するファージを含むライブラリであることを特徴とする
一態様において、斯かる本開示の方法においては、該低分子添加物は、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)またはarabinoseであることを特徴とする。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、抗原は、上述したとおりの任意の抗原であっても良く、好ましくは膜型抗原(例えば、CD137、CTLA4、CD40、OX40、RANK、GITR、ICOSなどの副刺激分子)を挙げることができる。
一態様において、斯かる本開示の方法においては、抗原の、抗原結合ドメインまたは抗原結合分子のファージライブラリへの接触、抗原に結合した抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の単離、単離された抗原結合ドメインまたは抗原結合分子の低分子化合物の存在下または非存在下でのアッセイは、上述した方法および以下の実施例に記載される方法に従い、本願発明の属する技術分野で公知の方法を参照しながら行うことができる。
一態様において、斯かる本開示の方法は、実施例10に記載される方法を挙げることができる。
(1-1) ヒトCD137細胞外領域の調製
ヒトCD137細胞外領域(hCD137とも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流にヒスチジンタグをコードする遺伝子断片とビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:86)をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外領域、ヒスチジンタグとAvitagが連結されたタンパク質(ヒトCD137またはhCD137-HisBAP、配列番号:87)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子を含むプラスミドベクターが同時に導入された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、目的のタンパク質(ヒトCD137細胞外領域)が培養上清中に分泌された。この細胞培養液が0.22μmフィルターでろ過され、培養上清が得られた。
培養上清はHisTrap-HP(GE healthcare)にアプライされ、ヒトCD137細胞外領域がカラムに結合された。20mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、500mMイミダゾール、pH7.5溶液を用いてヒトCD137細胞外領域が溶出された。次に、Superdex 200 26/600 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体が除去され、精製ヒトCD137細胞外領域が得られた。
ヒトCD137の濃度は、配列番号:87から推測されるシグナルシークエンスを除いたアミノ酸配列(配列番号:183)をもとにPaceらの方法で算出した。(Pace, C.N., et al. Protein Science 1995; 4; 2411-2423)
ヒトCD137細胞外領域(hCD137(FXa digested)とも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流にFactor Xa切断配列をコードする遺伝子断片と抗体の定常領域をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外領域、FactorXa切断配列と抗体定常領域が連結されたタンパク質(hCD137-F-Fc、配列番号:89)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子を含むプラスミドベクターが同時に導入された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、hCD137-F-Fcが培養上清中に分泌された。この細胞培養液は0.22μmフィルターでろ過され、培養上清が回収された。
ビオチン化Fc融合型ヒトCD137(「ビオチン化hCD137-Fc」または「bio-hCD137-Fc」、hCD137-Fc-Bioとも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片とビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:86)をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外領域、抗体の定常領域とAvitagが連結されたタンパク質(Fc融合型ヒトCD137、配列番号:90)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:91)を発現する遺伝子が同時に導入され、さらにFc融合型ヒトCD137をビオチン化する目的でビオチンが添加された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、目的のタンパク質(ビオチン化Fc融合型ヒトCD137)が培養上清中に分泌された。この細胞培養液は0.22μmフィルターでろ過され、培養上清が得られた。
培養上清はProtein A(MabSelect SuRe、GEヘルスケア)が充填されているカラムにアプライされ、ビオチン化Fc融合型ヒトCD137がカラムに結合された。50mM酢酸溶液を用いてビオチン化Fc融合型ヒトCD137が溶出された。次に、Superdex 200、26/600 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体が除去され、精製ビオチン化Fc融合型ヒトCD137が得られた。
Fc融合型ヒトCD137(hCD137-Fcとも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片とビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:86)をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外領域、抗体の定常領域とAvitagが連結されたタンパク質(Fc融合型ヒトCD137、配列番号:90)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターは293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293F細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子を発現する遺伝子が同時に導入された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、目的のタンパク質(Fc融合型ヒトCD137)が培養上清中に分泌された。この細胞培養液は0.22μmフィルターでろ過され、培養上清が得られた。
培養上清はProtein A(MabSelect SuRe、GEヘルスケア)が充填されているカラムにアプライされ、Fc融合型ヒトCD137がカラムに結合された。50mM酢酸溶液を用いてFc融合型ヒトCD137が溶出された。次に、Superdex 200、26/600 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体が除去され、精製Fc融合型ヒトCD137が得られた。
ビオチン化Fc融合型サルCD137(「cyCD137-Fc-BAP」とも呼ぶ)は当業者公知の方法で調製された。具体的には、サルCD137の細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片とビオチンが付加される特異的な配列(AviTag配列、配列番号:86)をコードする遺伝子断片が連結された。サルCD137の細胞外領域、抗体の定常領域とAvitagが連結されたタンパク質(Fc融合型サルCD137、配列番号:92)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。
構築されたプラスミドベクターが、293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:91)を発現する遺伝子が同時に導入され、さらにFc融合型サルCD137をビオチン標識する目的でビオチンが添加された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、目的のタンパク質(ビオチン化Fc融合型サルCD137)が培養上清中に分泌された。この細胞培養液は0.22μmフィルターでろ過され、培養上清が得られた。
培養上清はProtein A(MabSelect SuRe、GEヘルスケア)が充填されているカラムにアプライされ、ビオチン化Fc融合型サルCD137がカラムに結合された。50mM酢酸溶液を用いてビオチン化Fc融合型サルCD137が溶出された。次に、Superdex 200 increase 10/300 (GE healthcare)を用いたゲルろ過クロマトグラフィーによって会合体が除去され、精製ビオチン化Fc融合型サルCD137が得られた。
(2-1) ATPを利用したラショナルデザインライブラリからの、低分子に依存的な抗原結合活性を有する抗体(低分子スイッチ抗体)の取得(1)
(2-1-1) パンニング
先行特許WO2015/083764において構築されたラショナルデザイン抗体ファージディスプレイライブラリから、アデノシン3リン酸(adenosine 5'-triphosphate; ATP)存在下で抗原に対する結合活性を示す抗体が取得された。なお、低分子依存的な抗原(例えばCD137)結合活性を有する抗体は、「スイッチ抗体」または「低分子スイッチ抗体」と呼称され、ATP依存的な抗原(例えばCD137)結合活性を有する抗体は「スイッチ抗体」または「ATPスイッチ抗体」と呼称されることがある。取得のために、ATP存在下でビーズに捕捉された抗原に対して結合活性を示す抗体を提示しているファージが回収された。その後、ATPの非存在下でビーズから溶出された溶出液からファージが回収された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)を用いて、回収された培養上清が限外ろ過された。培養上清各100μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離(4,500 g、45分間)することによってフロースルーが除去された。100 μLのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離(4,500 g、30分間)によって洗浄された。最後にTBS 100 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージ液が回収された。
パンニングRound 4および5後のクローンを用いたファージELISAの結果を表9に示した。
ここで、ATP存在下での吸光度が0.2以上であり、かつ抗原の存在下/非存在下における吸光度のS/N比が2より高いクローンが陽性クローンと判定された。さらに、当該陽性クローンのうち、ATPの存在下/非存在下における吸光度のS/Nが2.より高いクローンがATPに依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)と判定された。
ファージELISAの結果、ATPに依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)から特異的なプライマーpBAD-F, G1seq-Rを用いて増幅された遺伝子の塩基配列が解析された。解析の結果、解析の結果、ATP存在下でヒトCD137に結合し、ATP非存在下ではヒトCD137に結合しないと判断されたクローンの塩基配列が取得された。
(2-2-1) パンニング
先行特許WO2015/083764において構築されたラショナルデザイン抗体ファージディスプレイライブラリから、ATP存在下で抗原に対する結合活性を示す抗体が取得された。取得のために、ATP存在下で抗原に対して結合活性を示す抗体を提示しているファージが回収され、その後ATPの非存在下でビーズから溶出された溶出液からファージが回収された。
上記の方法によって得られた各Round後の大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)を用いて、回収された培養上清が限外ろ過された。培養上清各100 μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離(4,500 g、45分間)することによってフロースルーが除去された。100μLのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離(4,500 g、30分間)によって洗浄された。最後にTBS 100 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージ液が回収された。
その結果、bio-hCD137またはhCD137-Fc-Bio に対して、ATP存在下と非存在下で結合活性が変化する抗体が複数確認された。
例示として、パンニングRound5後のクローンを用いたファージELISAの結果を表10に示した。
ここで、ATPの存在下における吸光度が0.2以上で、かつ抗原の存在下/非存在下における吸光度のS/N比が2より高いクローンが陽性クローンと判定された。さらに、当該陽性クローンのうち、ATPの存在下/非存在下における吸光度のS/N比が2より高いものがATPに依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)と判定された。
ファージELISAの結果、ATPに依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)から特異的なプライマー pBAD-F, G1seq-Rを用いて増幅された遺伝子の塩基配列が解析された。解析の結果、ATP存在下でヒトCD137に結合し、ATP非存在下ではヒトCD137に結合しないと判断されたクローンの塩基配列が取得された。
実施例2-1-3及び2-2-3の解析の結果取得された、ATPに依存的な抗原結合活性を有すると判断されたクローンの中から17検体が選抜され、表11に記載の通りクローン名が再付与された。
ラショナルデザインファージライブラリから取得された、表11に記載の抗体の可変領域をコードする遺伝子は、ヒトIgG1/Lambdaの動物発現用プラスミドへ挿入された。以下の方法を用いて抗体が発現された。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に1.33 x 106細胞/mLの細胞密度で懸濁されて、6well plateの各ウェルへ3 mLずつ播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入された。CO2インキュベーター(37℃、8 %CO2, 90 rpm)で4日間培養された培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)を用いて当業者公知の方法で抗体が精製された。分光光度計を用いて、精製された抗体溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗体の濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
(2-5-1) ATPおよびその代謝物の有無によって抗原に対する結合が変化するスイッチ抗体の発現と精製
ヒトラショナルデザインファージライブラリから取得された抗体の可変領域をコードする遺伝子は改変ヒトIgG1(P253)(配列番号:93)の下流にGlyとLysをコードする遺伝子が融合された重鎖定常領域、および軽鎖定常領域であるLambda鎖Lamlib(配列番号:63)を有する動物発現用プラスミドへ挿入された。表12にクローン名と配列番号が記された。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、抗CD137抗体とhCD137(FXa digest)との抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法でProtein G(CALBIOCHEM)が適当量固定化されたSensor chip CM3(GE Healthcare)に抗CD137抗体を捕捉させ、実施例1-2で調製されたhCD137(FXa digest)を相互作用させた。ランニングバッファーには20mM ACES, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20 (pH7.4)が用いられ、再生溶液としては10 mM Glycine-HCl (pH 1.5)が用いられた。
TBSに懸濁した抗CD137抗体が捕捉された後に、500 nMのhCD137(FXa digest)が各flow cellに流速10 μL/minで3分間インジェクトされた。この3分間がhCD137(FXa digest)の結合相とされ、結合相終了後、ランニングバッファーに切り替えられた2分間がhCD137(FXa digest)の解離相とされた。解離相終了後、再生溶液が流速30 μl/minで30秒間インジェクトされた。以上が抗CD137抗体の結合活性測定サイクルとされた。結合相で抗CD137抗体に相互作用したhCD137(FXa digest)の結合量は捕捉された抗体量に対して補正された。Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0を用いてcapture ligand 1RUあたりのbinding量(RU)を表示させ、抗体捕捉量(捕捉された抗体量)、抗原結合量の数値が得られた。抗原結合量が表13に示された。抗原結合量は結合活性を反映することから、低分子なしの値と比較し、低分子(ATP、ADPあるいはAMP)が存在するときの値が高い場合に、各低分子依存性が認められるといえる。特に差が大きいほど低分子依存性が高いと言える。
取得された抗体がサルCD137に結合するかELISAで評価された。はじめに、実施例1で調製されたcyCD137-Fc-BAPがStreptawellマイクロタイタープレートに固相化された。当該プレートの各ウェルをWash bufferにて洗浄することによってプレートへ結合していない抗原が除かれた後、当該ウェルがBlocking Buffer(2%BSAを含むTBS) 150 μLにて1時間以上ブロッキングされた。Blocking Bufferが除かれた各ウェルに、終濃度1 mM ADPを含むTBSまたは終濃度1 mM ADPを含むTBSで希釈された精製抗体が各ウェル100μL添加された。抗体が添加された当該プレートは600rpmで1時間振盪された。終濃度1 mM ADPを含むWash Buffer(0.1%Tween20を含むTBS)にて洗浄された後に、終濃度1 mM ADPを含むTBSによって希釈されたAP結合抗ヒトラムダ抗体(BETHYL)が各ウェルに添加された。1時間インキュベートされたのち終濃度1 mM ATPを含むWash Bufferにて洗浄後、BluePhos phosphate substrate(KPL)が添加された。600 nmの吸光度によって当該発色が測定された。抗体濃度が0μg/mLのときの吸光度に対する増加率が表14に示されている。濃度依存的に吸光度の比が上昇しているサンプルは、サルのCD137に結合しているといえる。
In vitro抗体活性測定にはGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega)が用いられた。384ウェルプレートの各ウェルに、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに濃度を調製されたFcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega) が10μLずつ加えられた。続いて、ADPを含む抗体溶液またはATPを含む抗体溶液またはATPあるいはADPを含まない抗体溶液がそれぞれのウェルに10μL加えられた。次に、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell lineが各ウェルに対して10 μL加えられた。ADPは最終濃度50μM、ATPは最終濃度50μMである。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが30μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をLuminescence foldとし、各抗体の活性を評価する指標とした。
得られた結果を図1および図2に示す。図1および図2より、ノンスイッチ抗体であるNS1-P253を除くすべての抗体が、ATPおよびADP依存的にヒトCD137アゴニスト活性を示すことが確認された。
(2-6-1) ヒトT細胞の拡大培養
健常なボランティア採血より単離したヒト末梢血単核細胞が用いられた。50 mLの血液に0.5 mLのヘパリンが混和され、さらに50 mLのPBSで希釈された。ヒト末梢血単核細胞は次の2ステップで単離された。第1ステップはFicoll-Paque PLUS(GE Healthcare)を添加されたLeucosep(greiner bio-one)が1000xg、1分間、室温にて遠心されたのちにPBSで希釈された血液を添加され、400xg、30分間、室温にて遠心が行われた。第2ステップでは遠心後のチューブよりバフィーコートが採取された後に、60 mLのPBS(Wako)により洗浄された。その後T cell activation/ expansion kit/ human(MACS Miltenyi biotec)を用いてT細胞の拡大培養が行なわれた。
ヒト末梢血単核細胞由来T細胞2x104個及びREC-1細胞2x104個が、コントロール抗体であるIC17HdK-hIgG1/IC17L-k0、ATP非依存的なヒトCD137結合活性を有する抗体(実施例を通じて「ノンスイッチ抗体」または「ノンスイッチCD137抗体」と呼称することがある。)であるNS1-P253、もしくは表12に記載のクローンのいずれか;及び、30 U/mLヒトIL-2(SIGMA)、10 ng/mL PMA(SIGMA)、0.5 μg/mL Ionomycin、500 μM ADPbetaS(Sigma)、10% FBS (Sigma)を含むRPMI1640培地100 μLに懸濁され、96 ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き(Corning)に播種された。NS1-P253、IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0、及び表12に記載のクローンは10 μg/mLが評価された。ADPbetaSを含まない培地中でのIFN-γ産生も評価された。プレートは振盪されたのちに5%CO2インキュベーター内にて37℃で72時間静置された。その後、培養上清を回収し、培養上清中に含まれるIFN-γ量がHuman IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)を用いて定量された。ELISAはキット製造業者(PeproTech)の指示に従い実施した。吸光度の測定はEnVision(PerkinElmer)にて行われた。
結果を図3に示す。
dBBAT007-P253、dBBAT013-P253、dBBAT015-P253、dBBAT019-P253、dBBAT021-P253、dBBAT025-P253、dBBAT031-P253、dBBAT042-P253、dBBAT056-P253、dBBAT118-P253、dBBAT121-P253、dBBAT122-P253、dBBAT119-P253はADPbetaS依存的にヒトCD137アゴニスト活性を示すことが確認された。ADPbetaSは、ADPと比べ加水分解を受けにくいADPのアナログである。このことから、これらのヒトCD137スイッチ抗体は、ATP、ADP、AMPなどの低分子依存的にヒトCD137アゴニスト活性を示す可能性が示された。
ヒト末梢血単核細胞由来T細胞2x104個及びREC-1細胞2x104個が、NS1-P253(ノンスイッチ抗体)もしくはdBBAT119-P253のいずれか;及び、30 U/mLヒトIL-2(SIGMA)、10 ng/mL PMA(SIGMA)、0.5 μg/mL Ionomycin、500 μM ADPbetaS(Sigma)、10% FBS (Sigma)を含むRPMI1640培地100 μLに懸濁され、96 ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き(Corning)に播種された。NS1-P253及びdBBAT119-P253は10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032, 0.00064 μg/mLが評価された。プレートは振盪されたのちに5%CO2インキュベーター内にて37℃で72時間静置された。その後、培養上清を回収し、培養上清中に含まれるIFN-γ量がHuman IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)を用いて定量された。ELISAはキット製造業者(PeproTech)の指示に従い実施した。吸光度の測定はEnVision(PerkinElmer)にて行われた。
結果を図4に示す。
dBBAT119-P253はADPβS存在下においてヒトCD137アゴニスト活性を示すことが確認された。このことから、dBBAT119-P253は、ATP、ADP、AMPなどの低分子依存的にヒトCD137アゴニスト活性を示す可能性が示された。
(3-1) ラショナルデザイン軽鎖ライブラリを使用した結合活性向上用ライブラリの構築
実施例2-2-1において回収された、ATPに依存的な抗原結合活性を有する抗体が多数含まれる抗体ライブラリについて、再度抗体軽鎖をライブラリ化することにより結合活性の向上が実施された。
先行特許WO2015/083764において構築されたラショナルデザイン抗体ファージディスプレイライブラリの軽鎖領域および重鎖領域が結合活性向上のための抗体軽鎖ライブラリ及び抗体重鎖ライブラリを構築するために使用された。上記軽鎖ライブラリまたは実施例2-2-1において回収されたファージミドベクターライブラリの軽鎖領域または重鎖領域に導入され、大腸菌ER2738株にエレクトロポレーションにより導入された。
構築されたファージディスプレイ用ファージミドを保持する大腸菌からファージが一般的な方法で産生された。具体的には、構築されたファージミドベクターを保持する大腸菌に対して、M13KO7TC(WO2015/046554)もしくはM13KO7ΔpIII(ハイパーファージ)(PROGEN Biotechnik)を感染させ、30℃で一晩培養した上清からファージが回収された。ファージ産生が行われた大腸菌の培養液に2.5 M NaCl/10 %PEGを添加することによって沈殿させたファージの集団をTBSにて希釈することによってファージライブラリ液が得られた。次に、当該ファージライブラリ液に終濃度4%となるようにBSAが添加された。磁気ビーズに固定化された抗原を用いてパンニングが実施された。磁気ビーズとして、NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated)、NeutrAvidin beads(TAMAGAWA SEIKI)もしくはDynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)が用いられた。抗原として、ビオチン化hCD137-Fcが使用された。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。その後、実施例2-2-2に記載の方法により、ATPの存在下および非存在下におけるヒトCD137への結合活性がファージELISAにより確認された。
その結果を図5に示す。
抗原の存在下/非存在下における吸光度のS/N比が2より高く、かつ、ATPの存在下/非存在下における吸光度のS/N比が2より高い、ATPに依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)と判定されるクローンが多数取得された。
(4-1) dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLibの改変による結合活性の上昇
実施例2-4で取得された抗CD137抗体(クローン名:dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib)の重鎖可変領域であるdBBAT119H、軽鎖可変領域であるdBBAT119Lの改変体がPCR等当業者公知の方法により作製された。重鎖可変領域では、dBBAT119HのD10(10位(Kabat番号)のアスパラギン酸(Asp)を指す。)およびG17(17位(Kabat番号)のグリシン(Gly)を指す。)をそれぞれグリシン(Gly)およびセリン(Ser)に置換したdBBAT119H010のN99(99位(Kabat番号)のアスパラギン(Asn)を指す。)、M100a(100a位(Kabat番号)のメチオニン(Met)を指す。)、およびN100b(100b位(Kabat番号)のアスパラギン(Asn)を指す。)を他のアミノ酸に置換した改変体が作製された。軽鎖可変領域では、dBBAT119L のF87(87位(Kabat番号)のフェニルアラニン(Phe)を指す。)をチロシン(Tyr)に置換したdBBAT119L010のD27b(27b位(Kabat番号)のアスパラギン酸(Asp)を指す。)、N31(31位(Kabat番号)のアスパラギン(Asn)を指す。)、およびD94(94位(Kabat番号)のアスパラギン酸(Asp)を指す。)を、他のアミノ酸に置換した改変体が作製された。
これら重鎖改変体および軽鎖改変体を組み合わせた当該改変体をdBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLibと略称する(重鎖可変領域配列番号:132、軽鎖可変領域配列番号:133、重鎖定常領域配列番号:93、軽鎖定常領域配列番号:63)
なお、本明細書における抗体は、以下の規則に従い命名されている;(重鎖可変領域)−(重鎖定常領域)/(軽鎖可変領域)−(軽鎖定常領域)。
例えば、dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLibという抗体名であれば、本抗体の重鎖可変領域はdBBAT119H、重鎖定常領域はP253、軽鎖可変領域はdBBAT119L、軽鎖定常領域はLamLibであることを意味する。
(4-2-1) ヒトT細胞の拡大培養
実施例2-6-1に記載の方法でヒトT細胞が拡大培養された。
(4-2-2) ヒトT細胞を用いたin vitroにおけるCD137アゴニスト活性の評価
実施例2-6-2に記載の方法で、NS1-P253(ノンスイッチ抗体)もしくはdBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLibもしくはdBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLibもしくはコントロール抗体であるIC17HdK-hIgG1/IC17L-k0それぞれ10, 2, 0.4, 0.08, 0.016 μg/mL存在下におけるIFN-γ産生が評価された。ADPbetaSを含まない培地中でのIFN-γ産生も評価された。
合わせて結果を図7に示す。
改変されたdBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLibは、dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLibよりも強いADPbetaS依存的なアゴニスト活性を示した。このことからdBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLibは、dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLibよりも強いATP、ADP、AMPなどの低分子依存的なヒトCD137アゴニスト活性を示す可能性が示された。
(5-1) 網羅的改変の導入による結合活性を上昇させる改変の探索
より優れた抗CD137抗体を作製するため、実施例4-1において作製された抗CD137抗体の重鎖可変領域であるdBBATk119H024および軽鎖可変領域であるdBBATk119L020に対してアミノ酸改変が網羅的に導入された。PCR等当業者公知の方法により、dBBATk119H024およびdBBATk119L020のCDRを構成する全アミノ酸残基の各々に対して、システインを除く全18アミノ酸へ置換した改変体が各々作製された。作製された約1200個の改変体のヒトCD137への結合測定がBiacore4000を用いて実施された。Series S Sensor Chip CM3 (GEヘルスケア)にProtein G (CALBIOCHEM)を固定化したチップに対して、改変体の培養上清を相互作用させて抗体が捕捉された。次に低分子(ATP) が添加されたヒトCD137溶液、あるいは低分子が添加されていないヒトCD137溶液を相互作用させ、低分子存在下、および低分子非存在下での抗体のヒトCD137に対する結合活性が評価された。ランニングバッファーとして20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.02% Tween20, 2 mM MgCl2, pH7.4にCaCl2を添加された溶液が使用され、25℃で測定が行われた。
重鎖可変領域としてdBBATk119H024(配列番号:132)を有し、重鎖定常領域としてヒトIgG1に対してS267E/L328Fの改変が導入され、且つC末端のGlyおよびLysを除去したP253 (配列番号:93)を有するdBBATk119H024-P253 の遺伝子に対して、実施例5-1で見出された低分子存在下でのヒトCD137に対する結合活性を上昇させる改変を組み合わせて、抗体重鎖遺伝子A002-P253 (配列番号:134) が作製された。また、軽鎖可変領域としてdBBATk119L020(配列番号:133)を有し、軽鎖定常領域としてヒトλ鎖Lamlib (配列番号:63) を有する抗体軽鎖dBBATk119L020-Lamlibに対して、実施例5-1で見出された低分子存在下でのヒトCD137に対する結合活性を上昇させる改変を組み合わせて、抗体軽鎖遺伝子B040-Lamlib(配列番号:135) が作製された。これらの遺伝子を組み合わせて当業者公知の方法で抗体が発現、精製され、目的とする抗CD137抗体、A002-P253/B040-Lamlibが作製された。A002-P253/B040-Lamlibの重鎖可変領域はA002(配列番号:136)、軽鎖可変領域はB040(配列番号:137)、重鎖定常領域はP253(配列番号:93)、軽鎖定常領域はヒトλ鎖Lamlib(配列番号:63)である。
本項目において作製されたA002-P253/B040-Lamlibの重鎖可変領域に対して、ATP結合活性を上昇させることを目的として、Kabat番号における53番目、54番目または55番目のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された各種改変体が作製された。表15は作製された抗体の重鎖可変領域における、A002からのアミノ酸改変(Kabat番号)を示す。
ATPに対する結合活性の測定は、ランニングバッファーとして20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05 % Tween20が用いられ、37℃で実施された。まずSeries S Sensor Chip CM3 (GE Healthcare) にSure Protein A (GE Healthcare) を固定化したチップに対して、ランニングバッファーで調製した抗体溶液を相互作用させることで、抗体が捕捉された。次にランニングバッファーで調製されたATP溶液を相互作用させることで、抗体との結合活性が評価された。チップは25 mM NaOH と 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) を用いて再生され、繰り返し抗体を捕捉して測定が行われた。各抗体のATPに対する結合量は、ATPを100 nMの濃度でインジェクトした際の結合量をチップ表面に捕捉した抗体の量で補正することで、単位抗体量あたりのATPの結合量が算出された。
表16はこれらの測定結果を示す。
より優れた抗CD137抗体を作製するため、実施例5-1で見出された低分子存在下でのヒトCD137に対する結合活性を上昇させる改変、および低分子が存在しない条件下でのヒトCD137に対する結合を低減する改変、および実施例5-2で見出されたATPへの結合活性を上昇させ、ヒトCD137への結合速度定数を増加する改変が組み合わされ、より優れたプロファイルを示す抗ヒトCD137抗体が作製された。重鎖可変領域としてA002(配列番号:136)を有し、重鎖定常領域としてヒトIgG1に対してK214R/Q419Eの改変が導入され、且つC末端のGlyおよびLysを除去したG1T3 (配列番号:138) を有する抗体重鎖A002-G1T3の遺伝子に対して実施例5-1および5-2で見出された改変を組み合わせた抗体重鎖遺伝子が作製された。また軽鎖可変領域としてB040(配列番号:137)を有し、軽鎖定常領域としてヒトλ鎖Lamlibを有する抗体軽鎖B040-Lamilibに対して実施例5-1で見出された改変を組み合わせた抗体軽鎖遺伝子が作製された。
これらの遺伝子を組み合わせて当業者公知の方法で抗体が発現、精製され、目的とする抗CD137抗体が作製された。表17は作製された抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域、軽鎖定常領域、および超可変領域 (Hyper Variable Region; HVRまたはCDRともいう。) の配列番号の一覧である。
表18はこれらの測定結果を示す。
作製された改変体のIn vitro活性測定には、GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega, CS196004)が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により5×104/mLに濃度を調製したFcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega) が200 μLずつ加えられ、5% CO2インキュベーター内にて37℃で一晩静置された。培地にはCHO culture medium (90% Ham’s F12, 10% FBS)が用いられた。次に、培地がすべて吸引除去されたのち、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell lineが各ウェルに対して25 μL加えられた。続いて、最終濃度が0、0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mLとなるようにAssay mediumで希釈された各抗体溶液がそれぞれ25μL加えられ、最後に最終濃度が0、250 μMとなるようにAssay mediumで希釈されたATP溶液が25μL加えられた。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値を相対発光量(Fold induction)とし、各抗体のCD137アゴニスト活性を評価する指標とした。
結果を図8に示す。
(5-5-1) ヒト末梢血単核細胞の単離
実施例2-6-1に記載の方法で、出願人社内の健常なボランティア採血より単離したヒト末梢血単核細胞(PBMC)が単離された。その後、培地(5%ヒト血清(SIGMA)、95%AIM-V(Thermo Fischer Scientific)にて細胞密度5x106 /mLに希釈された。
ヒト末梢血単核細胞は細胞密度5x106/mLに調整され、100 μLずつ96 ウェルマルチプルウェルプレート平底フタ付き(Corning)に播種された。その後、培地で希釈された0.04 μg/mL抗ヒトCD3ε抗体(BD社製、クローンSP34)および20 μg/mL抗ヒトCD28抗体(BD、クローン:CD28.2)が50 μL添加された。プレートは振盪されたのちに5%CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置された。その後各ウェルに培地で希釈した2 mM ATP(SIGMA)もしくはATPを含まない培地のみ25 μLと40 μg/mLの各抗体25 μLが添加され、プレートが振盪されたのちに5%CO2インキュベーター内にて37℃で18時間静置された。その後、培養上清を一部回収し、培養上清を用いて培養上清中に含まれるIL-2量がHuman IL-2 DuoSetELISAキット(R&D systems)もしくはHuman IL-2 ELISA Set (BD Biosciences)を用いて定量された。培養上清を回収した後のプレートは再び5%CO2インキュベーター内にて37℃で24時間静置された。その後、培養上清が一部回収され、培養上清中に含まれるIFN-γ量がHuman IFN-γ DuoSetELISAキット(R&D systems)もしくはHuman IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)を用いて定量された。ELISAは基本的にキット付属のプロトコルに従い、実施された。Human IL-2 DuoSetELISAキット(R&D systems)およびHuman IFN-γ DuoSetELISAキット(R&D systems)に関しては、H2O2およびtetramethylbenzidineを含むsubstrate solution(R&D systems)および1N H2SO4(Wako)を用いて、プロトコルに従い発色と発色停止が行われた。Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences)に関しては、1N H2SO4(Wako)を用いて発色停止が行われた。IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)関してはTMB Chromogen Solution(Thermo Fischer Scientific)および1N H2SO4(Wako)を用いて発色と発色停止が行われた。その後吸光度の測定がEnVision(PerkinElmer)にて行われた。
結果を実施例5-5-3以下で詳述する。
実施例5-5-1および実施例5-5-2に記載の、ヒト末梢血単球を用いたin vitro評価により、重鎖定常領域のFcγRIIbへの結合活性を様々に上昇させたP587、MY518、TT14、TT16を用いることによるCD137アゴニスト活性への影響が評価された。
評価された抗体は表19の通りである。
表19に記載された抗体の作製は、実施例7-1に記載されている。250 μM ATP存在条件下にて、陰性コントロール抗体(IC17HdK-MY518/IC17L-k0、IC17HdK-G4d/IC17L-k0)を添加した場合の培養上清中のIL-2およびIFN-γの量と比較して、当該抗体の添加により培養上清中のIL-2の量が1.05倍以上上昇かつIFN-γの量が1.15倍以上上昇させたことが確認された抗体に関して、CD137アゴニスト活性が示されたと判断された。なお、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いたアゴニスト活性測定は、血液試料の提供者(ドナー)毎に差異が生じうる。この点を考慮し、複数のドナーから単離されたヒトPBMCの一部又は過半数についてCD137アゴニスト活性が示されなかった抗体については、他の一部のヒトPBMCにおいてアゴニスト活性の基準に合致していても、CD137アゴニスト活性が示されたと判断しないことができるものとした。
実施例5-5-1および実施例5-5-2に記載の、ヒト末梢血単球を用いたin vitro評価により、重鎖定常領域P587およびP253に様々な可変領域を組み合わせ、各可変領域のATP依存的なCD137アゴニスト活性が評価された。
評価された抗体は表20の通りである。表20に記載された抗体の作製は、実施例7-1に記載されている。250 μM ATP存在条件下にて、陰性コントロール抗体(IC17HdK-P253/IC17L-k0、IC17HdK-P587/IC17L-k0)を添加した場合の培養上清中のIL-2およびIFN-γの量と比較して、当該抗体の添加により培養上清中のIL-2の量が1.05倍以上上昇かつIFN-γの量が1.15倍以上上昇させたことが確認された抗体に関して、CD137アゴニスト活性が示されたと判断された。なお、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いたアゴニスト活性測定は、血液試料の提供者(ドナー)毎に差異が生じうる。この点を考慮し、複数のドナーから単離されたヒトPBMCの一部又は過半数についてCD137アゴニスト活性が示されなかった抗体については、他の一部のヒトPBMCにおいてアゴニスト活性の基準に合致していても、CD137アゴニスト活性が示されたと判断しないことができるものとした。ATP 250 μM存在条件下でCD137アゴニスト活性を示すと判断された抗体は表20の通りである(図11、図12、図13、図14および図15)。
これらのことから、可変領域については、(重鎖可変領域/軽鎖可変領域)の組み合わせとして、(A375/B167)、(A356/B040)、(A372/B040)、(A486/B167)、(A488/B226)、(A489/B223)、(A551/B256)、(A548/B256)、および(A551/B379)がATP依存的にCD137アゴニスト活性を示すことが確認された。
実施例5-5-1および実施例5-5-2に記載の、ヒト末梢血単球を用いたin vitro評価により、様々にFcγRIIbへの結合活性が上昇した重鎖定常領域に対して、重鎖定常領域のpIを上昇させる各種アミノ酸改変を導入した際の、CD137アゴニスト活性への影響が評価された。重鎖定常領域TT16、MY518、TT14へpIを上昇させるアミノ酸改変が導入された重鎖定常領域TT16+P343R/D413K (SCF028)、TT16+Q311R/P343R(SCF033)、MY518+P343R/D413K (SCF025)、MY518+Q311R/P343R (SCF030)、TT14+P343R/D413K (SCF027)、TT14+Q311R/P343R (SCF032)が作製された。pIを上昇させるアミノ酸改変が導入された評価された抗体の名称および対応するpIを上昇させるアミノ酸改変が導入される前の抗体の名称は表21の通りである。表21に記載された抗体の作製は、実施例7-2に記載されている。
実施例5-5-1および実施例5-5-2に記載の、ヒト末梢血単球を用いたin vitro評価により、重鎖定常領域MY201aPhおよびMY518にpIを上昇させるための各種アミノ酸改変を導入し、当該アミノ酸改変がCD137アゴニスト活性に与える影響が評価された。重鎖定常領域MY518およびMY518aおよびMY201aPhにpIを上昇させるアミノ酸改変を導入した、MY518+P343R/D413K (SCF025)、MY518+Q311R/P343R (SCF030)、MY518+P343R (SCF039)、MY518+D413K (SCF040)、MY518a+Q311R (SCF060a)、MY201aPh+P343R (SCF041aPh)、MY201aPh+P343R/D413K (SCF043aPh)、MY201aPh+Q311R (SCF056aPh)、MY201aPh+Q311R/P343R (SCF057aPh)、MY201aPh+Q311R/D413K (SCF059aPh)が作製された。pIを上昇させるアミノ酸改変が導入された評価された抗体の名称および対応するpIを上昇させるアミノ酸改変が導入される前の抗体の名称は表23の通りである。表23に記載された抗体の作製は、実施例7-2に記載されている。
実施例5-5-1および実施例5-5-2に記載の、ヒト末梢血単球を用いたin vitro評価により、上述で作製された各可変領域と、pIを上昇させる重鎖定常領域を組み合わせて作製された抗ヒトCD137抗体の、ATP依存的なCD137アゴニスト活性が評価された。評価された抗体は表25の通りである。
250 μM ATP存在条件下にて、陰性コントロール抗体(IC17HdK-MY518a/IC17L-k0、IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0、IC17HdK-MY201/IC17L-k0、IC17HdK-G4d/IC17L-k0、IC17HdK-MY518/IC17L-k0、またはIC17HdK-TT16/IC17L-k0)を添加した場合の培養上清中のIL-2およびIFN-γの量と比較して、当該抗体の添加により培養上清中のIL-2の量が1.05倍以上上昇かつIFN-γの量が1.15倍以上上昇させたことが確認された抗体に関して、CD137アゴニスト活性が示されたと判断された。なお、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を用いたアゴニスト活性測定は、血液試料の提供者(ドナー)毎に差異が生じうる。この点を考慮し、複数のドナーから単離されたヒトPBMCの一部又は過半数についてCD137アゴニスト活性が示されなかった抗体については、他の一部のヒトPBMCにおいてアゴニスト活性の基準に合致していても、CD137アゴニスト活性が示されたと判断しないことができるものとした。ATP 250 μM存在条件下でCD137アゴニスト活性を示すと判断された抗体は表25の通りである(図16、図17、図18、図19、図20、図21、図22および図23)。
(6-1) ヒトCD137 ノックインマウス投与試験のための抗体の作製
ヒトCD137ノックインマウス投与試験のために、マウス定常領域を有する抗ヒトCD137スイッチ抗体およびノンスイッチ抗体が作製された。具体的には、抗ヒトCD137ノンスイッチ抗体 (20H4.9-mIgG1/20H4.9LC-mk0 略名:NS1-mIgG1、20H4.9-MB110/20H4.9LC-mk0 略名:NS1-MB110、20H4.9-MB492/20H4.9LC-mk0 略名:NS1-MB492、MOR-7480.1H-MB110/MOR-7480.1L-ml0r 略名:NS2-MB110、MOR-7480.1H-MB492/MOR-7480.1L-ml0r 略名:NS2-MB492)、および抗ヒトCD137スイッチ抗体 (A375-mIgG1/B167-ml0r、A372-mIgG1/B040-ml0r、A372-MB110/B040-ml0r、A372-MB492/B040-ml0r、A356-MB110/B040-ml0r、A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r、A489-MB492/B223-ml0r、A551-mIgG1/B256-ml0r、A551-MB110/B379-ml0r、およびA548-mIgG1/B256-ml0r) が作製された。
(i) マウスIgG1の重鎖定常領域であるmIgG1 (配列番号:144)、
(ii) WO2014030750に記載のMB110 (配列番号:145) 、または
(iii) WO2014030750に記載のMB492 (配列番号:146)
のいずれかを組み合わせた抗体重鎖の遺伝子が作製された。すなわち、20H4.9-mIgG1、20H4.9-MB110、および20H4.9-MB492の遺伝子が作製された。
NS1-mIgG1、NS1-MB110およびNS1-MB492抗体の軽鎖は、軽鎖可変領域20H4.9LC (配列番号:140) に、軽鎖定常領域としてマウスκ鎖mk0 (配列番号:147)を組み合わせた抗体軽鎖20H4.9LC-mk0の遺伝子が作製された。これら重鎖及び軽鎖の遺伝子を組み合わせることで当業者公知の方法により各抗体が発現、精製された。
(ii) MB492 (配列番号:146)
のいずれかを組み合わせた抗体重鎖の遺伝子が作製された。すなわち、MOR-7480.1H-MB110およびMOR-7480.1H-MB492の遺伝子が作製された。
NS2-MB110 およびNS2-MB492抗体の軽鎖は、軽鎖可変領域MOR-7480.1L (配列番号:143) に軽鎖定常領域としてマウスλ鎖ml0r (配列番号:148)を組み合わせた抗体軽鎖MOR-7480.1L-ml0r の遺伝子が作製された。これら重鎖及び軽鎖の遺伝子を組み合わせることで当業者公知の方法により各抗体が発現、精製された。
抗CD137スイッチ抗体は、下記表26および表27の抗体重鎖および抗体軽鎖の遺伝子が作製され、これらの遺伝子を組み合わせることで当業者公知の方法により各抗体が発現、精製された。
実施例6-1で作製された抗ヒトCD137ノンスイッチ抗体および抗CD137スイッチ抗体の、ヒトCD137に対する結合活性が評価された。ヒトCD137に対する結合測定は、ランニングバッファーとして20 mM ACES (pH 7.4), 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05 % Tween20が用いられ、37℃で実施された。まずSeries S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare) にRabbit Anti-Mouse IgG (Thermo Scientific) を固定化したチップに対して、ランニングバッファーで調製した抗体溶液を相互作用させることで、抗体が捕捉された。次に目的濃度になるようにATPが添加されたランニングバッファーで調製されたヒトCD137溶液、あるいはATPを含まないランニングバッファーで調製されたヒトCD137溶液を相互作用させることで、ATP存在下、およびATP非存在下でのヒトCD137との結合活性が評価された。抗原であるヒトCD137は実施例(1-2)で調製されたhCD137(FXa digested)を使用し、抗原濃度0, 15.625, 62.5, 250, 1000nMで測定が実施された。チップは25 mM NaOH と 10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) を用いて再生され、繰り返し抗体を捕捉して測定が行われた。各抗体のヒトCD137に対する解離定数(KD)は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0 を用いて算出された。具体的には、測定により得られたセンサーグラムを1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka(L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s) が算出され、それらの値から解離定数KD (mol/L) が算出された。
表28はこれらの測定結果を示す。
(6-3-1) ヒトCD137ノックインマウスの作製
マウス胚性幹細胞(ES細胞)へのヒトCD137遺伝子置換ベクターの導入により、マウスCD137遺伝子をヒトCD137遺伝子に置換したヒトCD137ノックインマウスを作製した。このマウスをhCD137 KIマウスと記載する。
実施例6-3-1のhCD137KIマウス作製後、表29のとおり、各抗体がhCD137KIマウスに単回静脈内投与された。表29のうち、NS1-mIgG1, NS1-MB110, NS1-MB492はいずれもノンスイッチ抗体、その他はスイッチ抗体である。投与後5分後から28日後にわたり、経時的に複数回血液が採取された。得られた血液は遠心され、血漿が分離された。血漿は測定まで-20℃以下に設定されたフリーザーに保存された。
表29に示した各抗体のうち、FcがmIgG1である抗体(ノンスイッチ抗体としてNS1-mIgG1、スイッチ抗体としてA375-mIgG1/B167-ml0r、A372-mIgG1/B040-ml0r、A548-mIgG1/B256-ml0r、およびA551-mIgG1/B256-ml0r)の、hCD137 KIマウスにおける平均血漿中濃度の推移を表したのが図24である。FcがMB110である抗体(ノンスイッチ抗体としてNS1-MB110、スイッチ抗体としてA356-MB110/B040-ml0r、A372-MB110/B040-ml0r、およびA551-MB110/B379-ml0r)の、hCD137 KIマウスにおける平均血漿中濃度の推移を表したのが図25である。FcがMB492である抗体(ノンスイッチ抗体としてNS1-MB492、スイッチ抗体としてA372-MB492/B040-ml0r、A486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r、およびA489-MB492/B223-ml0r)の、hCD137 KIマウスにおける平均血漿中濃度の推移を表したのが図26である。なお、図26において、A488-MB492/B226-ml0rについては、1例でADAによるものと疑われる血漿中濃度推移の急激な減少が確認されたので2例の平均値とした。
(6-4-1) 細胞株および同系腫瘍移植マウスモデルの作製、ならびに、抗腫瘍効果および全身反応の評価方法
各種試験にはアメリカ国立がん研究所からライセンス供与されたマウス大腸がん細胞株MC38細胞と実施例6-3-1に記載されたhCD137 KIマウスが使用された。MC38細胞株はマウスの腹部皮下に移植され、腫瘍体積がおよそ50-300 mm3になった時点でモデル成立とした。モデル成立後、MC38細胞株移植マウスは群分けが実施されたのちに、各種抗CD137抗体が投与された。
腫瘍体積(mm3)=長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)/2
なお、各種試験には実施例6-1(ヒトCD137 ノックインマウス投与試験のための抗体の作製)にて作製された抗体が用いられた。
摘出された脾臓、リンパ節は重量測定もしくはリンパ球画分の細胞数測定が実施された。また、肝臓での活性化評価にはLiver dissociation kit, mouse(Milteny Biotec)を用いて得られたリンパ球画分が使用された。脾臓での活性化評価は溶血後のリンパ球画分が用いられ、リンパ節での活性化評価はすりつぶされて得られたリンパ球画分が用いられた。
FCMによる活性化マーカー評価にはCD8α陽性 T細胞でのGranzyme B発現またはPD-1発現またはICOS発現、もしくはCD45陽性細胞に対するCD8α陽性T細胞の割合が用いられた。このためFCM解析では蛍光標識された抗Granzyme B抗体、抗PD-1抗体、抗ICOS抗体、抗CD8α抗体および抗CD45抗体等が用いられた。測定はBD LSRFortessa(商標)X-20(BD Biosciences)にて行われた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表30に示された用量で、Vehicle及びA375-mIgG1/B167-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け4日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表31に示された通りにVehicle、NS1-mIgG1(ノンスイッチ抗体)及びA375-mIgG1/B167-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計二回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後5日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓、リンパ節においては3匹分の臓器がpoolされ、実施例6-4-3(各種臓器のリンパ球画分を用いたFCM解析)に示される方法でFCM解析がなされた。
また、FCM評価によるT細胞活性化評価の結果、PD-1, ICOS, Granzyme BいずれのマーカーにおいてもNS1-mIgG1投与時には0.3 mg/kgにて発現上昇が観察された。一方で、A375-mIgG1/B167-ml0r投与時には1.5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 37.5 mg/kgいずれの投与量においてもPD-1, ICOS, Granzyme B全てのマーカーで顕著な発現抑制が認められた(図29、図30)。なお、A375-mIgG1/B167-ml0rの結果より、リンパ節と脾臓においては臓器重量とT細胞活性化マーカーが相関する結果が示されたため、以降の抗体評価ではリンパ節および脾臓由来免疫細胞活性化の指標として、臓器重量を主に用いた。
以上より、当該スイッチ抗体は、同量のノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓および肝臓においてT細胞の活性化を抑制させた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表32に示された用量でVehicle及びA356-MB110/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表33に示された通りにVehicle、NS2-MB110(ノンスイッチ抗体)及びA356-MB110/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与7日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓、リンパ節は臓器重量測定のみ実施された。
また、肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、NS2-MB110投与時には0.3 mg/kg投与時にもCD8α陽性細胞におけるPD-1発現の上昇が観察された。一方で、A356-MB110/B040-ml0r投与時には7.5 mg/kgでPD-1発現抑制、2.5 mg/kg投与時には顕著な発現抑制が認められた。CD8α陽性細胞におけるICOS発現ではNS2-MB110抗体 0.3 mg/kg投与時にもわずかな上昇が観察された。一方で、A356-MB110/B040-ml0r投与時には2.5 mg/kg投与時にはVehicle程度の発現に抑制されている事が観察された(図34)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓および肝臓においてT細胞の活性化を抑制させた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表34に示された用量でVehicle及びA372-mIgG1/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け4日後、7日後、10日後の計4回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表35に示された通りにVehicle及びA372-mIgG1/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後後、6日後の計3回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後7日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓は臓器重量のみ実施され、リンパ節は3匹のものをpoolしたのち、リンパ球画分の細胞数測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、A372-mIgG1/B040-ml0r投与時にはVehicle群と同程度のGranzyme B発現レベルであった(図37)。
以上より、当該スイッチ抗体は、リンパ節、脾臓および肝臓においてT細胞の活性化抑制が確認された。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表36に示された用量でVehicle及びA372-MB110/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け4日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表37に示された通りにVehicle、NS2-MB110(ノンスイッチ抗体)及びA372-MB110/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後7日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示されるように肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓、リンパ節は重量測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、PD-1はNS2-MB110投与時には発現上昇が観察された。これはA372-MB110/B040-ml0r投与時にも同様にみられていた(図40)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓においてはT細胞の活性化抑制が確認された。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表38に示された用量でVehicle及びA372-MB492/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表39に示された通りにVehicle、NS1-MB492(ノンスイッチ抗体)及びA372-MB492/B040-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後8日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓は臓器重量測定のみ、リンパ節はリンパ球画分調製後の細胞数測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、NS1-MB492、A372-MB492/B040-ml0r投与時ともVehicleと比較してGranzyme Bの発現上昇が観察された(図43)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓においてはT細胞の活性化抑制が確認された。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表40に示された用量でVehicle及びA486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0rが投与された。細胞移植後10日後に群分けが実施され、抗体投与は細胞移植後11日後、15日後、18日後、22日後の計4回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表41に示された通りにVehicle、NS1-MB492(ノンスイッチ抗体)及びA486-MB492/B167-ml0r及びA488-MB492/B226-ml0rが投与された。細胞移植後10日後に群分けが実施され、抗体投与は細胞移植後11日後、15日後、18日後、22日後の計4回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後13日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓は臓器重量測定、リンパ節はリンパ球画分細胞数測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、NS1-MB492及びA486-MB492/B167-ml0r、A488-MB492/B226-ml0r投与時ともVehicleと比較してCD8α陽性細胞の割合上昇が観察された(図46)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓においてはT細胞の活性化抑制が確認された。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表42に示された用量でVehicle及びA489-MB492/B223-ml0rが投与された。抗体は群分け翌日と群分け4日後、7日後、10日後の計4回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表43に示された通りにVehicle、NS1-MB492(ノンスイッチ抗体)及びA489-MB492/B223-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後、6日後の計3回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後7日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓、リンパ節はリンパ球画分調製後の細胞数測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、NS1-MB492、A489-MB492/B223-ml0r投与時ともVehicleと比較してCD8α陽性細胞の割合上昇が観察された(図49)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓においてはT細胞の活性化抑制が確認された。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表44に示された用量でVehicle及びA548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表45に示された通りにVehicle、NS1-mIgG1(ノンスイッチ抗体)及びA548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後5日後に実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出された。なお、脾臓、リンパ節は臓器重量測定のみ実施された。
肝臓におけるT細胞活性化評価の結果、Granzyme B , PD-1いずれもNS1-mIgG1投与時には0.3 mg/kgにて発現上昇が観察された。一方で、A548-mIgG1/B256-ml0r 、A551-mIgG1/B256-ml0r投与時には1.5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 37.5 mg/kg, 100 mg/kgいずれの投与量においても発現抑制が認められた(図52)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓および肝臓においてT細胞の活性化を抑制させた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表46に示された用量でVehicle及びA551-MB110/B379-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路より実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
実施例6-4-1のMC38移植マウスモデル作製後、表47に示された通りにVehicle、NS1-mIgG1(ノンスイッチ抗体)及びA551-MB110/B379-ml0rが投与された。抗体投与は群分け当日と群分け3日後の計2回、尾静脈経路から実施された。Vehicleには0.05% Tween-20含有PBSが用いられた。
初回投与後5日後に(実施例6-4-2(MC38細胞株移植マウスからの各種臓器の摘出とリンパ球画分の調製)に示される方法で肝臓、リンパ節、脾臓が摘出され、実施例6-4-3(各種臓器のリンパ球画分を用いたFCM解析)に示される方法でFCM解析がなされた。
肝臓におけるT細胞活性化評価では、NS1-mIgG1投与時にはPD-1, ICOSいずれも7.5 mg/kgにて発現上昇が観察された。一方で、A551-MB110/B379-ml0r投与時には0.83 mg/kg, 2.5 mg/kgにおいてVehicleレベルまで発現抑制が認められ、7.5 mg/kg投与時にもNS1-mIgG1よりも発現増加が抑制された(図56)。
以上より、当該スイッチ抗体は、ノンスイッチ抗体と比較して、リンパ節、脾臓および肝臓においてT細胞の活性化を抑制させた。
(7-1) FcγRへの結合活性を上昇させた改変体の作製
WO2017104783に記載されているFcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域TT14(配列番号:182のアミノ酸配列を含むFc領域において、T250V/T307Pのアミノ酸改変、およびFcγRIIbへの結合活性を上昇させるアミノ酸改変としてL234Y/P238D/V264I/A330Kを含む重鎖定常領域である(改変位置はいずれもEU番号)。)(配列番号:149)、WO2017104783に記載されているFcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域TT11(配列番号:182のアミノ酸配列を含むFc領域において、T250V/T307Pのアミノ酸改変、およびFcγRIIbへの結合活性を上昇させる改変としてL234Y/P238D/A330Kを含む重鎖定常領域である(改変位置はいずれもEU番号)。)にG237Dのアミノ酸変異が導入されたTT16(配列番号:150)、WO2014163101に記載されているFcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域P587(配列番号:151)、および既存のFcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域であるP253(配列番号:93)が、スイッチ抗体の重鎖可変領域(A375、A372、A356、A486、A488、A489、A548、およびA551)、あるいは陰性コントロール抗体の重鎖可変領域(IC17HdK(配列番号:152))とが組み合わせられた。これにより、次のとおり各定常領域と各重鎖可変領域とを組み合わせた遺伝子が作製された。
WO2017046994に記載されているFcγRへの結合活性を大きく変化させることなくpIを上昇させるアミノ酸変異であるQ311R、P343R、D413Kを実施例7-1で作製されたFcγRへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域と組み合わせた重鎖定常領域が作製された。
具体的には、下記のとおり各抗体重鎖定常領域の遺伝子にアミノ酸変異を導入した重鎖定常領域の遺伝子が作製された。
・MY518a(配列番号:156) にP343R/D413Kを導入:SCF025a(配列番号:65)
・TT14(配列番号:149) にP343R/D413Kを導入:SCF027(配列番号:66)
・TT16(配列番号:150) にP343R/D413Kを導入:SCF028(配列番号:67)
・MY518(配列番号:154) にQ311R/P343Rを導入:SCF030(配列番号:68)
・TT14(配列番号:149) にQ311R/P343Rを導入:SCF032(配列番号:69)
・TT16(配列番号:150) にQ311R/P343Rを導入:SCF033(配列番号:70)
・MY518(配列番号:154) にP343Rを導入:SCF039 (配列番号:71)
・MY518a(配列番号:156) にP343Rを導入:SCF039a (配列番号:72)
・MY518(配列番号:154) にD413Kを導入:SCF040 (配列番号:73)
・MY201a(配列番号:155) にP343Rを導入:SCF041a (配列番号:74)
・MY201aPh(配列番号:157) にP343Rを導入:およびSCF041aPh (配列番号:75)
・MY201a(配列番号:155) にD413Kを導入:SCF042a (配列番号:76)
・MY201a(配列番号:155) にP343R/D413Kを導入:SCF043a(配列番号:77)
・MY201aPh(配列番号:157) にP343R/D413Kを導入:SCF043aPh(配列番号:78)
・MY201a(配列番号:155) にQ311Rを導入:SCF056a (配列番号:79)
・MY201aPh(配列番号:157) にQ311Rを導入:SCF056aPh (配列番号:80)
・MY201a(配列番号:155) にQ311R/P343Rを導入:SCF057a(配列番号:81)
・MY201aPh(配列番号:157) にQ311R/P343Rを導入:SCF057aPh(配列番号:82)
・MY201a(配列番号:155) にQ311R/D413Kを導入:SCF059a (配列番号:83)
・MY201aPh(配列番号:157) にQ311R/D413Kを導入:SCF059aPh (配列番号:84)
・MY518a(配列番号:156) にQ311Rを導入:SCF060a (配列番号:85)
アゴニスト活性の比較対照用のコントロール抗体として実施例7-1で作製されたIC17HdK(配列番号:152)を重鎖可変領域に持つ抗体(IC17HdK-MY201/IC17L-k0、IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0、IC17HdK-MY518/IC17L-k0、IC17HdK-MY518a/IC17L-k0、IC17HdK-P253/IC17L-k0、IC17HdK-P587/IC17L-k0、IC17HdK-TT16/IC17L-k0)が作製された。また、重鎖可変領域IC17HdK(配列番号:152)の遺伝子と、ヒトIgG4の重鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去したG4d(配列番号:159)の遺伝子が組み合わせられることで作製された抗体重鎖IC17HdK-G4dと、抗体軽鎖IC17L-k0(可変領域の配列番号:158、定常領域の配列番号:141)の遺伝子を組み合わせることで当業者公知の方法により目的とする抗体(IC17HdK-G4d/IC17L-k0)が発現、精製された。これらのコントロール抗体は、実施例5において使用された。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、各ヒトFcγ受容体(以下FcγRと示す)に対する結合活性が評価された。測定用緩衝液として50 mMリン酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20、pH7.4が用いられ、25℃で実施された。リガンド捕捉用分子としてCaptureSelect(商標)Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(ThermoFisher scientific)を固相化したセンサーチップを用いて抗体を約1000 RU捕捉させた。ヒトFcγRは測定用緩衝液でFcγRIaは8nMに、それ以外のFcγRは1000nMに希釈し、捕捉させた抗体に相互作用させた。各抗体の各FcγRに対する結合活性は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用いて単位抗体量当たりのFcγR結合量(RU)を算出することにより評価された。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、ヒトFcRnに対する結合活性が評価された。測定用緩衝液として50 mMリン酸、150 mM NaCl、0.05 w/v%-P20, pH6.0が用いられ、25℃で実施された。本測定に用いたヒトFcRnタンパク質はWO2010107110に記載の手法で調製された。リガンド捕捉用分子としてCaptureSelect(商標)Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(ThermoFisher scientific)を固相化したセンサーチップを用いて抗体を約400RU捕捉させたのち、測定用緩衝液で希釈されたヒトFcRnを結合させた。各抗体のFcRnに対する結合活性は、Biacore T200 Evaluation Software 2.0を用いてSteady stateモデルによりKD(mol/L)を算出することにより評価された。定常領域のpIを上昇させるアミノ酸改変の有無でKD値は同程度であった。表54にヒトFcRnと各抗体のKD(mol/L)を示す。
(8-1) ラショナルデザイン抗体ライブラリからのキヌレニンに依存的なヒトCD137結合活性を有する抗体の取得
国際公開WO2015/083764号に記載の方法で構築された、キヌレニンに対するパンニングを利用したキヌレニンスイッチ抗体取得用ラショナルデザイン抗体ファージディスプレイライブラリ(キヌレニンライブラリ)から、キヌレニン存在下でヒトCD137に対する結合活性を示し、キヌレニン非存在下で結合活性を示さない抗体が取得された。取得のために、キヌレニン存在下でファージが結合したビオチン化抗原がビーズに捕捉され、キヌレニン存在下で抗原に対して結合活性を示す抗体を提示しているファージが回収された。その後、ビーズから溶出された溶出液からファージが回収された。
(8-2-1) hCD137p12-FX-Fc-Bioの調製
hCD137p12-FX-Fc-Bioは当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137細胞外部分領域をコードする遺伝子断片の下流にFactor Xa切断配列をコードする遺伝子断片と抗体の定常領域をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外部分領域、FactorXa切断配列と抗体定常領域が連結されたタンパク質(hCD137p12-FX-Fc-Bio、配列番号:160)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときBirAとEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子を含むプラスミドベクターが同時に導入された。培養中にビオチンが添加された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、hCD137p12-FX-Fc-Bio が培養上清中に分泌された。この培養上清が回収された。培養上清からプロテインAを用いてhCD137p12-FX-Fc-Bioが精製された。
Round4のパンニングでは、Round3のパンニングと同様の条件によるパンニングが実施された。 ただし、磁気ビーズはDynabeads MyOne Streptavidin T1が用いられた。
(8-3-1) hCD137p12-FX-Fcの調製
hCD137p12-FX-Fcは当業者公知の方法で調製された。具体的には、ヒトCD137細胞外部分領域をコードする遺伝子断片の下流にFactor Xa切断配列をコードする遺伝子断片と抗体の定常領域をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外部分領域、FactorXa切断配列と抗体定常領域が連結されたタンパク質(hCD137p12-FX-Fc、配列番号:160)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターが293フェクチン(Invitrogen)を用いてFreeStyle293細胞 (Invitrogen)に導入された。このときEBNA1(配列番号:88)を発現する遺伝子を含むプラスミドベクターが同時に導入された。前述の手順に従って遺伝子が導入された細胞が37℃、8% CO2で培養され、hCD137p12-FX-Fc-Bio が培養上清中に分泌された。この細胞培養上清からプロテインAを用いてhCD137p12-FX-Fc-Bioが精製された。
低分子存在下で抗原結合活性を示す低分子スイッチ抗体を取得する際に、ジスルフィド結合(SS結合)有するリンカーを介してビオチン化(SSビオチン化)した抗原を用い、磁性ビーズで抗原に結合した抗体ディスプレイファージをキ捕捉した後に、dithiothreitol (DTT) などを用いて還元条件でSS結合を切断することで、抗原に結合した抗体ディスプレイファージのみをビーズから溶出できると考えられた。国際公開WO2015/083764号に記載の方法で構築されたキヌレニンライブラリから、キヌレニンが存在する条件下で抗原に対する結合活性を示す抗体のスクリーニングが行われた。スクリーニングのために、まず抗体ファージディスプレイライブラリを、キヌレニン非存在下でビオチン標識抗原−磁気ビーズと接触させ、キヌレニン非存在下でも抗原に対して結合活性を有する抗体を提示しているファージが除去された。それに続き、キヌレニンの存在する条件下で同様にパンニングを行うことによって、キヌレニンが存在する条件下でのみ抗原に対して結合活性を有する抗体のスクリーニングが実施された。 本取得方法では、抗原として実施例1-4記載の方法で調製されたhCD137-Fcまたは(8-3-1)で調製されたhCD137p12-FX-FcをEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて添付のプロトコルに従いビオチン標識した抗原(SSビオチン化抗原)が用いられた。なお、ネガティブセレクションには実施例1-3の方法で調製されたhCD137-Fc-Bioまたは(8-2-1)で調製されたhCD137p12-FX-Fc-Bioが用いられた。
Round1のパンニングでは、ネガティブセレクション法を利用したキヌレニン存在下でのみ抗原に対して結合可能なファージの濃縮が行われた。具体的には、予めStreptavidin (Roche)とインキュベートされたスキムミルクでブロッキングされたSera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coatedに800 pmolのhCD137-Fc-Bioまたは hCD137p12-FX-Fc-Bioを加え、室温で15分間結合させた。TBSTで3回洗浄されたビーズに対して、BSAにてブロッキングが行われたファージライブラリ液0.8 mLを加え室温にて1時間結合させた。磁気スタンドを用いてビーズを分離することによって、抗原およびビーズに結合しないファージが回収された。
Round5のパンニングでは、Round3のパンニングと同様の条件によるパンニングが実施された。
(8-4-1) キヌレニンの存在/非存在によって抗原に対する結合が変化するスイッチ抗体の発現と精製
本明細書に記載のキヌレニンライブラリから取得された抗体の可変領域をコードする遺伝子はヒトIgG1または改変ヒトIgG1(P253)、Kappa鎖を有する動物発現用プラスミドへ挿入された。表55にクローン名と配列番号が記された。
Biacore T200(GE Healthcare)を用いて、抗CD137抗体とhCD137-His-BAP(配列番号:87)との抗原抗体反応の相互作用が解析された。アミンカップリング法でSure protein Aが適当量固定化されたSensor chip CM3(GE Healthcare)に抗CD137抗体を捕捉させ、実施例1-1で調製されたhCD137-His-BAPを相互作用させた。ランニングバッファーにはTBSが用いられ、再生溶液としては10 mM Glycine-HCl (pH 1.5) と25mM NaOHが用いられた。
TBSに懸濁した抗CD137抗体が捕捉された後に、500 nMのhCD137-His-BAPが各flow cellに流速10 μL/minで3分間インジェクトされた。この3分間がhCD137-
His-BAPの結合相とされ、結合相終了後、ランニングバッファーに切り替えられた5分間がhCD137-His-BAPの解離相とされた。解離相終了後、再生溶液が流速30 μl/minで10秒間インジェクトされた。以上が抗CD137抗体の結合活性測定サイクルとされた。Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0で解析された、結合相で抗CD137抗体に相互作用したhCD137-His-BAPの結合量が表56に示された。
(8-4-3-1) CD137の部分配列を有する抗原の調製
CD137の部分配列を有する抗原は当業者公知の方法で調製した。具体的には、ヒトCD137の細胞外領域の一部をコードする遺伝子断片の下流に抗体定常領域をコードする遺伝子断片が連結された。ヒトCD137の細胞外領域部分配列と抗体定常領域が連結されたタンパク質(表57)をコードする遺伝子断片が動物細胞発現用ベクターに組み込まれた。構築されたプラスミドベクターはExpiFectamine293(Invitrogen)を用いて Expi293細胞 (Invitrogen)に導入され、目的のタンパク質を培養上清中に分泌させた。培養液上清からプロテインAを用いて、目的タンパク質が精製された。
取得された抗体がCD137の部分配列を有する抗原に結合するかどうかがELISAで評価された。はじめに、実施例1または実施例8-4-3-1で調製された各種抗原がMaxisorp 384マイクロタイタープレートに固相された。当該プレートの各ウェルをWash bufferにて洗浄することによってプレートへ結合していない抗原が除かれた後、当該ウェルがBlocking Buffer(BlockAceを含むTBS) 50μLにて1時間以上ブロッキングされた。Blocking Bufferが除かれた各ウェルに、終濃度500μM L-キヌレニンを含むTBSまたは終濃度500μM キヌレニンを含むTBSで10 μg/mLに調製された精製抗体が各ウェル10 μL添加され、1時間静置された。終濃度500μM キヌレニンを含むWash Buffer(0.1%Tween20を含むTBS)にて洗浄された後に、終濃度500μM キヌレニンを含むTBSによって希釈されたAP結合抗ヒトKappa抗体(BIOSOURCE)が各ウェルに添加された。1時間インキュベートされたのち終濃度500μM キヌレニンを含むWash Bufferにて洗浄後、BluePhos phosphate substrate(KPL)が添加された。各ウェル中の溶液の発色反応が、BluePhos Stop Solutionの添加により停止された後、620 nmの吸光度によって当該発色が測定された。抗体濃度が0μg/mLのウェルの値を1としたときの吸光度の比を示した。比が2以上の場合に結合していると判定すると、評価したクローンの中に異なる結合特性を示す抗体が含まれることが示された。
In vitro抗体活性測定にはGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega)が用いられた。384ウェルプレートの各ウェルに、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに濃度を調製されたFcγRIIB CHO-K1 Cellsが10μLずつ加えられた。キヌレニンを含む抗体溶液またはキヌレニンを含まない抗体溶液がそれぞれのウェルに10 μL加えられた。次に、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell lineが各ウェルに対して10 μL加えられた。キヌレニンは最終濃度500μMである。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが30 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をLuminescence foldとし、各抗体の活性を評価する指標とした。
得られた結果を図57に示す。
L-キヌレニンの濃度が500μMである時にLuminescence foldが0μMである時よりも高いことから、キヌレニンの濃度あるいは存在によりアゴニスト活性が変化したことが示された。
(9-1) Double round selection法を利用したラショナルデザインライブラリからのATP及びAMP存在下においてそれぞれ抗原に結合する抗体の取得
これまでに特定の低分子存在下において抗原に対して結合活性を示す抗体が取得されているが、複数の異なる低分子について、それぞれの存在下において抗原に対して結合活性を示す抗体の取得については報告されたことが無い。この課題を解決するための方法の一つとして、パニングラウン毎に使用される低分子、例えばATPとAMP、を変える交互パニングが考えられるが、この場合、各ラウンド毎にそれぞれの低分子に対する選択圧がかけられるため、同時に両方の低分子に対する選択圧を等しくかけることが出来ないという課題が存在する。この課題を解決するために、Double round selection法を実施した。Double round selection法とは、パニング1ラウンド内で一つの抗原に対して2回パニングが繰り返される手法である(J Mol Biol. 1992 Aug 5;226(3):889-96.)。ここで1ラウンドとは、例えばファージディスプレイ法の場合、大腸菌からファージを回収してから、パニング後のファージを再度大腸菌に感染させるまでのステップのことを指し、例えばリボソームディスプレイ法の場合はin vitro転写からPCRによる遺伝子増幅までのステップのことを指す。これまでに、一種類の抗原に対するdouble round selectionは報告されていたが低分子依存性抗体の取得に応用された報告はなく、当然複数の異なる低分子に依存性を示す抗体の取得に応用された報告もない。しかし我々は、double round selection法を改変し、1ラウンドにおいてATPとAMPの双方に対する選択圧をかけることによって、より効率的にATP及びAMPに依存的に抗原結合活性を示す抗体を取得することが出来ると考えた。
表59において、ATPとはATPを使用したパニング、AMPとはAMPを使用したパニング、Doubleとはdouble round selectionを使用したパニングがそれぞれ実施されたことを示している。
次に、当該ファージライブラリ液に終濃度4%となるようにBSAが添加された。磁気ビーズに固定化された抗原を用いてパンニングが実施された。磁気ビーズとして、NeutrAvidin beads(TAMAGAWA SEIKI)もしくはDynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)が用いられた。
上記の方法によって得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)を用いて、回収された培養上清が限外ろ過された。培養上清各100 μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離(4,500g、45分間)することによってフロースルーが除去された。100 μlのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離(4,500g、30分間)によって洗浄された。最後にTBS 100 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージ液が回収された。
ファージELISAの結果を表60に示した。
また、得られたクローンについて、特異的なプライマーpBAD-F, G1seq-Rを用いて増幅された抗体重鎖遺伝子の塩基配列が解析された。
その結果、Double round selectionが実施された条件3においては、ATPのみで実施された条件1の3倍、ATPとAMPが交互に使用されて実施された条件2と比べても約1.5倍も多くの、ATPとAMPの双方に依存的なhuman CD137結合を示す抗体重鎖配列が得られていた。このことより、複数の異なる低分子に依存的な抗原結合活性を示す抗体を取得する際に、double round selectionがより有用な手法であることが示された。
(10-1) ビーズパンニングによるナイーブヒト抗体ライブラリからの低分子存在下においてマウスCTLA4に結合する抗体の取得
ヒトPBMCから作成したポリA RNAや、市販されているヒトポリA RNAなどを鋳型として当業者に公知な方法に従い、互いに異なるヒト抗体配列のFabドメインを提示する複数のファージからなるヒト抗体ファージディスプレイライブラリが構築された。
具体的には、調製されたファージライブラリ液にビオチン化mCTLA4と終濃度1 mMのATP及びATP代謝物が加え、室温で60分間反応させた。ブロッキングされた磁気ビーズをファージと抗原の反応液に加え室温で15分反応させた。ビーズは1 mM ATPを含むTBS/0.1%Tween20 bufferにて2回もしくは3回、及び1 mM ATPを含むTBSにて1回もしくは2回洗浄された。その後、Round1においては最終濃度1 mg/mLのトリプシンが、Round2以降においてはTBSが加えられたビーズが室温で懸濁され、磁気スタンドを用いて分離されたビーズからファージ溶液が回収された。TBSが使用された場合はこの作業が2回繰り返された後、溶出されたファージ溶液が混合され、回収されたファージ溶液に最終濃度1mg/mLのトリプシンが加えられた。回収されたファージが、対数増殖期(OD600が0.4-0.7)となった10mLの大腸菌株ER2738に添加された。37℃で1時間上記大腸菌の撹拌培養を行うことによって、ファージを大腸菌に感染させた。大腸菌は225 mm x 225 mmのプレートへ播種された。回収された大腸菌に対してM13KO7TC(WO2015046554A1)もしくはM13KO7ΔpIII(ハイパーファージと呼称される)(PROGEN Biotechnik)を感染させ、30℃で一晩培養した上清からファージが回収された。培養の際には、lac promoterからのFab遺伝子の発現誘導をかけるために、100 μM IPTGを添加した条件、及び添加していない条件が用いられた。この作業が4回繰り返された。
実施例10-1で得られた大腸菌のシングルコロニーから、常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に習い、ファージ含有培養上清が回収された。NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL)を用いて回収された培養上清が限外濾過された。培養上清各100 μLがNucleoFast 96の各ウェルにアプライされ、4,500g, 45分間遠心分離を行いフロースルーが除去された。H2O 100 μLを加え、再度4,500g, 30分間遠心分離による洗浄が行われた。その後、TBS 100 μLを加え、室温で5分間静置した後、上清に含まれるファージ液が回収された。
ファージELISAの結果を表61に示した。
ここで、ATP存在下における吸光度が0.2より高いクローンが陽性と判定され、ATP存在下/非存在下における吸光度の比が2より高いものがATP依存的な抗原結合活性を有するクローン(スイッチクローン)と判定された。
実施例7−2(表52)において作製された改変体のIn vitro活性測定には、GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega, CS196004)が用いられた。384ウェルプレートの各ウェルに、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で4×105/mLに濃度を調製されたFcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega) が10μLずつ加えられる。続いて、ADPを含む抗体溶液またはATPを含む抗体溶液またはATPあるいはADPを含まない抗体溶液がそれぞれのウェルに10μL加えられる。次に、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell lineが各ウェルに対して10 μL加えられる。ADPは最終濃度10μM、ATPは最終濃度10μMである。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが30μLずつ加えられる。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値を相対発光量(Fold induction)とし、各抗体のCD137アゴニスト活性を評価する指標とした。
結果を図58に示す。図58よりA375-P587/B167-LamLib、A551-P587/B256-LamLib、A551-P587/B379-LamLib、A375-SCF041aPh/B167-LamLib、A551-SCF041aPh/B256-LamLib、A551-SCF041aPh/B379-LamLib、A375-SCF043aPh/B167-LamLib、A551-SCF043aPh/B256-LamLib、A551-SCF043aPh/B379-LamLib、A375-SCF057aPh/B167-LamLib、A551-SCF057aPh/B256-LamLib、A551-SCF057aPh/B379-LamLibはATPおよびADP依存的にヒトCD137アゴニスト活性を示すことが確認された。
ATPスイッチ型抗体はATP存在下において標的分子に結合し薬効を示す。腫瘍組織部位における細胞外ATPレベルの評価をP2Y11 split Luc/HEK293細胞を用いて行った。本細胞は、ProbeX社にて同社保有のスプリットルシフェラーゼ技術を用いて作製され、ATPをリガンドとするプリンレセプターP2Y11(Accession No. AF030335)を結合したルシフェラーゼのC末端タンパクとβ-arrestin-2 isoform 1(Accession No. NM_004313)を結合したルシフェラーゼN末端タンパクを発現しており、ATP刺激により細胞内で2つに分かれていたルシフェラーゼ断片が会合することで活性を持つルシフェラーゼが生成され、ルシフェリンを基質とした発光を得ることができる。
P2Y11 split Luc/HEK293細胞は、10% 牛胎児血清、0.8 mg/mL G418 (GeneticinTM)、および0.05 mg/mLフレオマイシンD1 (ZeocinTM)を含むダルベッコ改変イーグル培地 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose : D5796 / Sigma-Aldrich)にて培養、継代維持した。P2Y11 split Luc/HEK293細胞を96 well microplate(μCLEAR(登録商標), WHITE, CELLSTAR(登録商標) / Greiner Bio-One)に30000 cells/well で播き一晩培養した後、各ウェルより培養液を取り除き、ルシフェリン(VivoGloTM Luciferin, In Vivo Grade / Promega)を0.5 mg/mLで含む培養液0.18 mLと交換した。最終濃度が0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 mMになるようにアデノシン、AMP、ADP、もしくは、ATPの各溶液0.02 mLを加え、CO2インキュベーター(37℃、5% CO2)にて30分間培養した後、プレートリーダーEnVision (Perkin Elmer) にて発光値の測定をした。
図59はその結果を示す。P2Y11 split Luc/HEK293細胞は、ATP特異的にリガンド濃度依存性に発光値を増加させた。
P2Y11 split Luc/HEK293細胞はCell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS(Thermo Fisher Scientific)にて培養フラスコよりはがし、HBSSで洗浄後、HBSSの細胞懸濁液とし、in vivo細胞外ATPレベル測定に用いた。
既定濃度のATP、1 mg/mL ルシフェリン(VivoGlo, Promega)、および、1.0×107 cells/mLのP2Y11 split Luc/HEK293細胞を含む細胞懸濁液の0.2 mLをC3H/HeNマウスの腹側部皮下に移植し、20分後イソフルラン麻酔下in vivoイメージング装置IVIS spectrum CTにて発光イメージング測定を行った。取得したイメージング画像をLiving Image Softwareにて解析し、算出された発光値と添加したATP濃度よりin vivo測定条件でのATP検量線を作製した。
図60はその結果を示す。P2Y11 split Luc/HEK293細胞は、C3H/HeNマウス皮下に移植したin vivo条件でもATP濃度に依存した発光を示し、in vivoでATPレベル評価ができる検量線とすることができた。
1 mg/mL ルシフェリン(VivoGlo, Promega)と1.0×107 cells/mLのP2Y11 split Luc/HEK293細胞を含む細胞懸濁液の0.2 mLをFM3A担癌マウスの腫瘍部皮下に移植し(腫瘍体積が200〜300 mm3)、20分後イソフルラン麻酔下in vivoイメージング装置IVIS spectrum CTにて発光イメージング測定を行った。取得したイメージング画像をLiving Image Softwareにて解析し、腫瘍部の発光値よりATPレベルをin vivo ATP検量線を用いて算出し、腫瘍部位における細胞外ATPレベルとした。
発光イメージング測定の結果を図61に、ATPの検量線から算出された、腫瘍部位における細胞外ATPレベルを表62に示す。バックグラウンド(正常部位)に比べ、腫瘍組織部位(FM3A tumor bearing mouse)における発光レベルは高く、FM3A移植モデルでの腫瘍組織部位の細胞外ATPレベルは作製したin vivo ATP検量線より平均で1.31 mMと算出された。
(13−1)ATP依存的な結合特性を有する抗hIL6R抗体の作製
WO2015/083764およびWO2013/180200に記載の方法を参考に、取得された抗体を最適化し、ATP依存的な結合特性を有する抗ヒトインターロイキン6受容体(hIL6R)抗体を作製した。表63に示されたように重鎖と軽鎖が組み合わされて、当業者公知の方法で抗hIL6R抗体が発現および精製された。
表63に記載の抗体を用いて、Biacore T200を用いて0, 1, 10, 100 μMの各ATP濃度存在下でのhIL6Rに対するaffinity解析を行った。測定は流速10 μL/min、相互作用時間1分、解離時間1分、single cycle kineticsで37℃で行い、バッファーは異なる濃度(0, 1, 10, 100 μM)のATPをそれぞれ含む20 mM ACES, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0.05% Tween20, pH 7.4を用いた。解析にはBiacore T200付属のBiacore Evaluation Softwareを用い、fitting modelには1:1 Langmuir binding modelを用いた。その解析結果を表64、図62に示す。
以降では、MRAH-G4T1/MRAL-k0のようにその抗原に対する結合活性がATP濃度に依存しない抗体をnon-switch抗体と表記し、H0002-G4T1/L1058-lam1、H0041-G4T1/L1088-lam1、H0052-G4T1/L1083-lam1のようにその抗原に対する結合活性がATP濃度に依存する抗体をswitch抗体と表記する場合がある。
次に表63に記載の抗体を用いて、Biacore T200を用いて上述の条件に従ってATPの代わりに10, 100 μMの各ADP、AMP濃度存在下でのhIL6Rに対するaffinity解析を行った。ADPを用いた測定の解析結果を表65、図63に、AMPを用いた測定の解析結果を表66、図64に示した。なお、測定時に10 RU以下の反応しかない抗体については解析不能と判断し、N.D.と表記した。
次に、これらの抗体の重鎖定常領域を、mIgG2aにFcγRIVに対する結合を増強する改変を加えてADCC活性を増強したmFa55(配列番号:184)に変更し、軽鎖定常領域をヒトからマウスに変更した抗体が表67のように当業者公知の方法で調製された。また、合わせて陰性コントロールとしてKLH-mFa55(IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1)が用意された。
得られた結果を図65に示す。図中では、Fold inductionを相対発光量(RLU)と表記する。
各抗体のADCCが確認されたことから、以下の方法に従ってhIL6R-Hepa1-6をC57BL/6マウスに担癌させたマウスモデルを使って、これらの抗体のin vivoでの抗腫瘍活性を評価する試験を行った。
得られた結果を図66に示す。
ATP依存的結合特性を有する抗hIL6R抗体の正常組織における作用を評価するために、正常マウス (C57BL/6) およびhIL6Rを全身に過剰発現させたトランスジェニックマウス (以下hIL6R-tgm) (Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23; 92(11): 4862-4866.) が用いられて抗体の血漿中動態を評価した。この評価のために、表67に記載された抗体が、正常マウス (C57BL/6) およびhIL6R-tgm に投与され、血漿中動態が比較された。hIL6R-tgmにおいてはhIL6Rに結合する通常の抗体は全身に発現する膜型hIL6Rに結合した結果、膜型hIL6Rを介して消失することが報告されている(Nature Biotechnology volume 28, pages 1203-1207 (2010))。
その一方で、switch抗体であるH0002-mFa55/L1058-ml0、H0041-mFa55/L1088-ml0、H0052-mFa55/L1083-ml0の場合は、non-switch抗体のように、正常マウスと比較したときにhIL6R-tgmにおいては著しく速い抗体濃度の消失は観察されなかった。この結果は、non-switch抗体の結果とは対照的に、switch抗体は全身に発現する膜型hIL6Rに結合せず、hIL6Rを介した消失も生じないことを示唆している。
Switch抗体であるH0002-mFa55/L1058-ml0、H0041-mFa55/L1088-ml0、H0052-mFa55/L1083-ml0を比較すると、低いATP濃度でのより強い結合を示すH0052-mFa55/L1083-ml0でのみ正常マウスと比較してhIL6R-tgmにおいて抗体の消失の加速が観察された。
これらの結果は、正常組織における細胞外ATP濃度はswitch抗体がhIL6Rに結合するには低い濃度であることを示唆している。
その一方で、switch抗体であるH0002-mFa55/L1058-ml0、H0041-mFa55/L1088-ml0、H0052-mFa55/L1083-ml0が投与されたマウスでは、non-switch抗体のような抗原の顕著な蓄積は観察されなかった。Switch抗体であるH0002-mFa55/L1058-ml0、H0041-mFa55/L1088-ml0、H0052-mFa55/L1083-ml0が比較されると、低いATP濃度でのより強い結合を示す抗体の方が抗原を蓄積する傾向が観察された。
これらの結果は、正常組織や血液中における細胞外ATP濃度はswitch抗体が膜型、可溶型のhIL6Rに結合するには低い濃度であることを示唆している。
腫瘍存在下でのATP依存的結合特性を有する抗hIL6R抗体の全身作用を評価するために、抗腫瘍作用と全身作用が同時に評価された。この評価のために、hIL6R-Hepa1-6をhIL6R-tgmに移植したモデルを用い、表67に記載の抗体が投与された。
また上記実験において、イソフルラン麻酔下で上記群分けされたhIL6R-tgmから眼窩採血により血液が、初回の抗体液投与から1時間後、及び1, 2, 3, 7日目に採取された。採取された血液は個体番号毎に8連チューブに移し、氷上で静置された。8連チューブは1900×g、4℃で10分遠心された後、遠心後の上清は血漿成分として取得して別の8連チューブに個体番号毎に移され-30℃で保管された。
血漿中の各抗体濃度は電気化学発光 (ECL) 法で測定された。hIL6R溶液がMULTI-ARRAY PR Plate (Meso Scale Diagnostics, LLC) に添加され、37℃、1時間静置されhIL6Rはプレートに固相された。検量線としてMRAH-mFa55/MRAL-mk0、H0041-mFa55/L1088-ml0は血漿中濃度として8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 μg/mL で、H0002-mFa55/L1058-ml0は血漿中濃度として64, 32, 16, 8, 4, 2, 1 μg/mL に調製された。hIL6R 固相プレート に0.05% Tween20, 1% BSA含有1 M Tris-HCl溶液 pH 8.0 が添加された後、速やかに0.3 M 酢酸溶液で250倍希釈された血漿サンプルならびに検量線試料が添加され、さらにATP溶液が添加され混和された。室温で1時間静置された後、ビオチンラベル抗マウスIgG抗体 (Southern Biotechnology Associates, Inc)が添加され、室温で1時間静置された。その後、Streptavidin SULFO-TAG Labeled (Meso Scale Diagnostics, LLC) が添加され室温で1時間静置された後、Read buffer T (Meso Scale Diagnostics, LLC) が加えられてSECTOR Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics, LLC) で測定された。SOFTmax PRO (Molecular Devices)が用いられてマウス血漿中の各抗体濃度が算出された。
また上記実験において、イソフルラン麻酔下で上記群分けされたhIL6R-tgmから眼窩採血により血液が、初回の抗体液投与から1時間後、及び3, 7日目に採取された。採取された血液は個体番号毎に8連チューブに移され、氷上で静置された。8連チューブは1900×g、4℃で10分遠心された後、遠心後の上清は血漿成分として取得され別の8連チューブに個体番号毎に移され-30℃で保管された。
血漿中の各抗体濃度は電気化学発光 (ECL) 法で測定された。hIL6R溶液はMULTI-ARRAY PR Plate (Meso Scale Diagnostics, LLC) に添加され、37℃、1時間静置され、hIL6Rはプレートに固相された。検量線として、MRAH-mFa55/MRAL-mk0、H0041-mFa55/L1088-ml0、H0052-mFa55/L1083-ml0は血漿中濃度として8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 μg/mL に調製された。hIL6R 固相プレート に0.05% Tween20, 1% BSA含有1 M Tris-HCl溶液 pH 8.0 が添加された後、速やかに0.3 M 酢酸溶液で250倍希釈された血漿サンプルならびに検量線試料が添加され、さらにATP溶液が添加され混和された。室温で1時間静置された後、ビオチンラベル抗マウスIgG抗体 (Southern Biotechnology Associates, Inc) が添加され、室温で1時間静置された。その後、Streptavidin SULFO-TAG Labeled (Meso Scale Diagnostics, LLC) が添加され室温で1時間静置された後、Read buffer T (Meso Scale Diagnostics, LLC) が加えられてSECTOR Imager 6000 (Meso Scale Diagnostics, LLC) で測定された。SOFTmax PRO (Molecular Devices)を用いてマウス血漿中の各抗体濃度は算出された。
また、H0002-mFa55/L1058-ml0投与群では可溶型hIL6Rの蓄積は観察されなかった。H0041-mFa55/L1083-ml0投与群ではMRAH-mFa55/MRAL-mk0投与群より少ない量しか可溶型IL6Rが蓄積しなかった(図74)。
また、MRAH-mFa55/MRAL-mk0と比較して、H0052-mFa55/L1083-ml0はより少ない量しか可溶型IL6Rを蓄積しなかった(図77)。
表68に示すように重鎖と軽鎖を組み合わせて、当業者公知の方法で抗PD-1抗体を発現し精製した。
初めに抗原としてmPD1-G1CH2(配列番号:209)および mPDL1-G1dCH2His(配列番号:210)が遺伝子合成され、動物発現用プラスミドへ挿入された。抗原タンパク質は以下の方法を用いて発現、精製された。FreeStyle 293 Expression Medium培地(Invitrogen)に適切な細胞密度で懸濁されて、フラスコに播種されたヒト胎児腎細胞由来FreeStyle 293-F株(Invitrogen)に対して、調製されたプラスミドがリポフェクション法により導入された。CO2インキュベーター(37℃、8% CO2, 125 rpm)で4日間培養された培養上清から、当業者公知の方法で抗原が精製された。分光光度計を用いて、精製された抗原溶液の280 nmでの吸光度が測定された。得られた測定値からPACE法により算出された吸光係数を用いて精製された抗原の濃度が算出された(Protein Science (1995) 4, 2411-2423)。
同ATP濃度条件下での、抗体未添加ウェルの吸光度の値をPD1-PDL1結合率100%とし、抗体添加でその結合率がどの程度低下するかを評価した。その結果を図78、図79に示す。
各AMP濃度条件下での各ウェルの発光の値を、抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体のPD-1/PDL-1の相互作用に対する中和活性を評価する指標とした。その結果を図80に示した。図中では、Fold inductionを相対発光量(RLU)と表記する。
各ATP濃度条件下での各ウェルの発光の値を、抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をFold inductionとし、各抗体のPD-1/PDL-1の相互作用に対する中和活性を評価する指標とした。その結果を図81に示した。図中では、Fold inductionを相対発光量(RLU)と表記する。
表69に示したように重鎖と軽鎖を組み合わせて、当業者公知の方法で抗PD-1抗体を発現し精製した。
実施例13で取得された、ATPをスイッチとするヒトIL6レセプター (hIL6R) 結合抗体H0041L1088のFab断片とATP、hIL6R細胞外ドメイン(shIL6R)との複合体のX線結晶構造解析が行われた。
ヒトIgG1フォーマットをもつH0041L1088全長抗体(VH; 配列番号:194、CH; 配列番号:217、VL; 配列番号:195、CL; 配列番号:189)の調製及び精製は、当業者公知の方法により行われた。
H0041L1088全長抗体サンプルは、Papain (SIGMA-ALDRICH, 10108014001)を用いて、35℃、約18時間の条件でFabとFcに断片化され、次にHiTrap SP HP 1 mL (GE Healthcare)、およびHiTrap MabSelect SuRe 1 mL (GE Healthcare)によるカラム精製とHiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare)によるSEC精製を経て、Fabサンプルが調製された。
UniProtKB: P08887 (IL6RA_HUMAN)のアミノ酸配列(配列番号:213)をもとに、そのドメイン2および3(アミノ酸111-320)が遺伝子合成され、発現用ベクターへ組み込まれた。遺伝子合成にあたっては、N末端に分泌発現のためのシグナル配列、C末端に精製のためのFLAGタグ + His×8タグが付加され、さらにドメイン1の除去に由来するCys-Cysペアの不完全化への対応のため、C193S改変が導入された。得られた発現プラスミドを用い、Kifunensine [Santa Cruz Biotechnology]存在下、Expi293TM Expression System (Thermo Fisher Scientific)によるタンパク発現がおこなわれ、目的タンパクを含む発現培養上清が得られた。そこから、cOmpleteTM His-Tag Purification Column 5 mL (SIGMA-ALDRICH)によるアフィニティー精製ならびにHiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare)によるSEC精製を経て、shIL6Rサンプルが調製された。
shIL6Rサンプルに対し、N型糖鎖切断のためのEndoglycosidase F1(Endo F1)とHis×8タグ切断のためのEnterokinase (SIGMA-ALDRICH, 11334115001)が加えられ、室温にて1日静置したのち、HisTrap EXCEL 1 mL (GE Healthcare)スルー処理とSuperdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)によるSEC精製が実施された。得られた精製フラクションは、H0041L1088 Fabサンプルを加えたのち、限外濾過により濃縮され、20 mM HEPES pH 7.3, 100 mM NaCl, 0.5 mM ATPをバッファーとして用いたSuperdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)によるSEC精製を経て、複合体(Complex)サンプルが調製された。得られた精製フラクションから限外濾過濃縮により結晶化用Complexサンプルが調製された。
結晶化用Complexサンプルを用いて、21℃条件下、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化がおこなわれ、60 mM Tris pH 7.5, 12.0 %w/v ポリエチレングリコール1500(Polyethylene glycol 1,500), 60 mM 硫酸アンモニウム(Ammonium sulfate)のリザーバー条件で、X線結晶構造解析に適した結晶が得られた。
得られた結晶は、68 mM Tris pH 7.5, 13.6 %w/v ポリエチレングリコール1500(Polyethylene glycol 1,500), 68 mM硫酸アンモニウム(Ammonium sulfate), 14.6 % エチレングリコール(Ethylen Glycol), 0.375 mM ATPの溶液に浸漬されたのち、液体窒素にて凍結され、高エネルギー加速器研究機構放射光施設フォトンファクトリーBL-17AにてX線回折データが測定された。測定中、結晶は常に−178℃の窒素流下に置くことで、凍結状態が維持された。得られた回折画像は、autoPROC(Acta Cryst. D67: 293-302 (2011))を用いて処理され、分解能2.76Åまでの回折強度データが取得された。
得られたX線回折強度データを用い、既知のFabの結晶構造とPDB ID=1N26のshIL6Rの結晶構造を探索モデルとして、Phaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)を用いた分子置換法を実施し、初期構造が決定された。その後、coot(Acta Cryst. D66: 486-501 (2010))、refmac5(Acta Cryst. D67: 355-367 (2011))ならびにphenix.refine(Acta Cryst. D68: 352-367 (2012))によるモデル構築と精密化が繰り返され、最終的な精密化座標が得られた。その結晶学的統計値は表70に示される。なお、結晶構造座標中、Fabのアミノ酸の残基番号はKabat番号付けスキームに基づいて付与され、抗原であるshIL6Rのアミノ酸の残基番号はUniProtKB: P08887 (IL6RA_HUMAN)のアミノ酸の残基番号と一致するよう付与された。本結晶の非対称単位には2つのcomplexが存在するが、shIL6Rのドメイン2においてドメインスワッピングと呼ばれる特殊なダイマー形成が観察された。このようなダイマーは、PDB ID=1N26のshIL6Rの結晶構造には見られず、ここで用いたshIL6Rコンストラクトに特有の構造となっている。
図84に示すように、ATPは、主に当該抗体の重鎖によって認識されている。具体的には、ATPのアデニン環部分は、当該抗体の重鎖CDR1:T33、CDR3:Y95、L98、N100B、W100Cの各側鎖、ならびにG96、L100A、W100Cの各主鎖により認識される。特に、G96ならびにL100Aの主鎖のカルボニル酸素とATPの6位NH2との間、W100Cの主鎖アミドNH基とATPの1位Nとの間で水素結合を形成されるとともに、Y95、L98、W100Cの各側鎖とアデニン環部分との間で、CH-π、π-πといった相互作用が形成されており、当該抗体はATPのアデニン環部分を強固に認識している。リボース部分は重鎖CDR1:T33、CDR2:H56、Y58の各側鎖とのファンデルワールス相互作用により認識される。また、3リン酸基部分は重鎖CDR2:S52、S52A、Y55、H56の各側鎖、ならびにS52A、Q53の主鎖によって認識される。特に、S52側鎖、S52A側鎖、ならびに主鎖NH基、Q53主鎖NH基は、3リン酸基部分と強固な水素結合ネットワークを形成しており、3リン酸基部分の認識に重要な役割を果たしている。
今回の結晶構造をもとに、H0041L1088 FabあるいはATPのいずれかから4.2Å以内の距離に位置する非水素原子を1個以上含むshIL6Rのアミノ酸残基がエピトープ残基として選ばれ、それをshIL6Rのアミノ酸配列上に示した(図85)。これらエピトープ残基と当該抗体との相互作用の詳細は図86および図87に示され、これらエピトープ残基は、当該抗体の軽鎖CDR1:D27B、G28、D29、A31、Y32、CDR3:R91、S92、P93、G94、P95や重鎖CDR2:H56、Y58、CDR3:L98、Y99、N100B、W100Cといった残基とファンデルワールス相互作用や水素結合、静電相互作用等を形成し、当該抗体と強固に結合している。
また、図86および図87に示すように、H0041L1088 FabとshIL6Rとの結合においては、H0041L1088 Fabに結合するATPとshIL6RのF298との間で大きな分子間接触が形成されている。ATP非結合状態では本相互作用は失われることから、このH0041L1088 Fab に結合するATPと抗原との直接の相互作用が、ATP依存的結合の大きな要因と推測される。また、構造的にみて、ATPは重鎖CDR3残基との水素結合やファンデルワールス相互作用を介して、重鎖CDR3の構造安定化に寄与していると考えられる。ATP結合により重鎖CDR3構造が抗原との結合型に安定化されることは、重鎖CDR3:L98やY99等とshIL6Rとの直接相互作用の実質的な強化につながり、ATP依存的結合の要因になっていると考えられる。
(19-1) 評価用抗体の調製
FcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域に、pIを上昇させるための各種アミノ酸改変を導入した場合における、当該アミノ酸改変の、CD137アゴニスト活性への影響、およびhCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90マウスにおける血漿中動態と薬効への影響が評価された。まず、実施例7-1、実施例7-2および実施例7-3に記載の通り、A375-MY201aPh/B167-Lamlib、A375-SCF041aPh/B167-Lamlib、A375-SCF057aPh/B167-LamlibおよびIC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0が調製された。
FcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域に、pIを上昇させるための各種アミノ酸改変を導入した場合における、当該アミノ酸改変がCD137アゴニスト活性に与える影響を評価するため、A375-MY201aPh/B167-Lamlib、A375-SCF041aPh/B167-Lamlib、A375-SCF057aPh/B167-Lamlib、およびIC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0のCD137アゴニスト活性が評価された。
作製された抗体のIn vitro活性測定には、GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega, CS196004)が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により5×104/mLに濃度が調製されたFcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega) が200 μLずつ加えられ、5% CO2インキュベーター内にて37℃で一晩静置された。培地にはCHO culture medium (90% Ham’s F12, 10% FBS)が用いられた。次に、培地がすべて吸引除去されたのち、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたGloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell lineが各ウェルに対して25 μL加えられた。続いて、最終濃度が0、0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mLとなるようにAssay mediumで希釈された各抗体溶液がそれぞれ25μL加えられた。最後に、最終濃度が250 μMとなるようにAssay mediumで希釈されたATP溶液が25μL加えられた。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値が相対発光量とされ、各抗体のCD137アゴニスト活性を評価する指標とされた。
結果を図88に示す。この結果より、pIを上昇させるための各種アミノ酸改変を導入することにより、CD137アゴニスト活性が上昇することが示された。
(19-3-1)hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90マウスの作製
まず、マウス胚性幹細胞(ES細胞)へ、マウスCd137を標的とするZinc Finger Nuclease(ZFN)とともにヒトCD137遺伝子置換ベクターを導入することにより、マウスCd137遺伝子をヒトCD137遺伝子に置換したヒトCD137ノックインマウスが作製された。次に、マウスFcgr2b遺伝子をターゲットとするZFN mRNAをマウス受精卵に顕微注入して、標的領域に変異が導入された個体を選別することによって、マウスFcgr2b ノックアウトマウスが作製された。さらに、ヒトFCGR2B遺伝子がクローニングされたBAC vectorをマウス受精卵に顕微注入し、これにより得られた個体よりヒトFCGR2B遺伝子ゲノム領域が導入された個体を選抜することによって、ヒトFCGR2Bトランスジェニックマウスが作製されたた(Iwayanagi. et al., J Immunol, 2015, 195, 3198-3205)。
これら3系統のマウスを交雑することにより、ヒトCD137ノックインFcgr2bノックアウト・ヒトFCGR2Bトランスジェニックマウスが樹立された。このマウスをhCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90マウスと記載する。
CD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90マウスに、各抗ヒトCD137抗体が、表71のとおり単回静脈内投与された。投与後5分後から28日後にわたり、経時的に複数回血液が採取された。得られた血液は遠心され、血漿が分離された。血漿は測定まで-20℃以下に設定されたフリーザーに保存された。
結果を図89に示す。A375-SCF041aPh/B167-Lamlibは、A375-MY201aPh/B167-Lamlibよりも早い消失を示した。これは、A375-SCF041aPh/B167-Lamlibの重鎖定常領域にpIを上昇させるアミノ酸改変が導入されているためであると考えられた。
(19-4-1)細胞株および同系腫瘍株移植マウスモデルの作製
細胞は、マウス肺癌細胞由来細胞株LLC1[LL/2 (別名:LLC1),販売元:ATCC,カタログ番号:CRL-1642]に対して、ニワトリovalbumin (OVA) の発現プラスミド及びヒトGlypican-3 (GPC3) の発現プラスミドを導入したLLC1/OVA/GPC3 clone C5 (LLC1/OVA/GPC3) 細胞株が使用された。マウスは、上記 (19-3-1) に記載されたhCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90マウス(11週齢、雌)が使用された。LLC1/OVA/GPC3細胞株は9.8% Fetal Bovine Serum (Sigma-Aldrich, Co. LLC.)、0.44 mg/mL G418 (Nacalai Tesque, Inc.) 及び0.88 mg/mL Zeocin (Thermo Fisher Scientific, Inc.) を含むRPMI1640培地 (Sigma-Aldrich, Co. LLC.) にて維持継代された。LLC1/OVA/GPC3細胞株はマウスの腹部皮下に移植され、腫瘍体積がおよそ250-500 mm3になった時点でモデル成立とした。モデル成立後、LLC1/OVA/GPC3細胞株移植マウスは群分けが実施されたのちに、Vehicle及び各抗ヒトCD137抗体が投与された。
LLC1/OVA/GPC3細胞株移植モデルに対し、表72に示された用量となるように0.05% Tween 20含有PBSによって調製された、A375-MY201aPh/B167-Lamlib またはA375-SCF041aPh /B167-Lamlibが、腫瘍移植後11日目および14日目に投与された。Vehicle群には、0.05% Tween 20含有PBSが投与された。調製した投与液は、10 mL/kgの用量で尾静脈より投与された。
腫瘍体積 (mm3) = 長径 (mm) × 短径 (mm) × 短径 (mm) /2
以上の結果から、重鎖定常領域にpIを上昇させるアミノ酸改変を導入することにより、本マウスモデルにおいて、抗ヒトCD137抗体の抗腫瘍効果が向上することが示された。
FcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域に、pIを上昇させるためのアミノ酸改変を組み合わせることによる、抗CD3抗体のアゴニスト活性の向上が検討された。
実施例7-1で作製されたFcγRIIbへの結合活性を上昇させた重鎖定常領域である、MY201aPhおよびMY201aPhに対して、pIを上昇させるためのアミノ酸改変であるQ311R/P343Rを導入したSCF057aPhが用いられた。また、天然型ヒトIgG1の定常領域としてG1T6 (配列番号:223)が用いられた。抗ヒトCD3抗体の重鎖可変領域としてTR01H113(配列番号:224)を、重鎖定常領域としてMY201aPh, SCF057aPh, またはG1T6を、軽鎖としてL0011-k0(配列番号:225)を有する、各抗ヒトCD3抗体が作製された。陰性対照としてはIC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0が用いられた。
作製された抗体のIn vitro活性測定には、T cell activation Bioassay (NFAT) (Promega, CS176401)が用いられた。96ウェルプレートの各ウェルに、培地により5×104/mLに濃度を調製したFcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega) が200 μLずつ加えられ、5% CO2インキュベーター内にて37℃で一晩静置された。培地にはCHO culture medium (90% Ham’s F12, 10% FBS)が用いられた。次に、培地がすべて吸引除去されたのち、Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106/mLに調製されたNFAT-RE-Luc2 cellsが各ウェルに対して25 μL加えられた。続いて、最終濃度が0、0.0001、 0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mLとなるようにAssay mediumで希釈された各抗体溶液がそれぞれ25μL加えられた。プレートは5% CO2インキュベーター内にて37℃で6時間静置されたのち、室温で15分静置され、各ウェルにBio-Glo reagentが75 μLずつ加えられた。Bio-Glo reagentにはBio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)が使用された。その後、各ウェルの発光量がプレートリーダーで測定された。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値を相対発光量とし、各抗体のCD3アゴニスト活性を評価する指標とした。
結果を図91に示す。天然型ヒトIgG1の定常領域を有するTR01H113-G1T6/L0011-k0と比較してFcγRIIbへの結合が増強されたTR01H113-MY201aPh/L0011-k0はより高いCD3アゴニスト活性を示した。またpIを上昇させるアミノ酸改変を導入したTR01H113-SCF057aPh/L0011-k0はアミノ酸改変導入前のTR01H113-MY201aPh/L0011-k0と比較してより高いCD3アゴニスト活性を示した。
Claims (8)
- 以下の(a)から(i)より選択されるいずれかのHVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3の組合せを含む、抗CD137抗体:
(a) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:8のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(b) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:9のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(c) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:10のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:17のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:22のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(d) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:11のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(e) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:12のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:28のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(f) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:13のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:18のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:21のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:29のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(g) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;
(h) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:15のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:20のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:25のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3;および
(i) 配列番号:7のアミノ酸配列を含むHVR-H1、配列番号:14のアミノ酸配列を含むHVR-H2、配列番号:19のアミノ酸配列を含むHVR-H3、配列番号:24のアミノ酸配列を含むHVR-L1、配列番号:26のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および配列番号:27のアミノ酸配列を含むHVR-L3。 - ヒト抗体、ヒト化抗体、若しくはキメラ抗体、またはその抗原結合断片である、請求項1に記載の抗CD137抗体。
- 配列番号64乃至85のいずれかひとつのアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む、請求項1または2に記載の抗CD137抗体。
- 請求項1乃至3のいずれか一項に記載の抗CD137抗体をコードする、単離された核酸。
- 請求項4に記載の核酸が導入されたベクター。
- 請求項4に記載の核酸、または請求項5に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 抗CD137抗体を製造する方法であって、抗CD137抗体が製造されるように請求項6に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
- 請求項1乃至3のいずれか一項記載の抗CD137抗体および細胞傷害剤を含む、イムノコンジュゲート。
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