KR20200091340A - 항cd137 항원 결합 분자 및 그의 사용 - Google Patents

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Abstract

본 개시는, 면역 세포의 활성화 작용, 세포 상해 활성, 또는 항종양 활성을 가지면서, 정상 조직 등의 비종양 조직에 대한 작용이 낮아, 부작용이 적은 항CD137 항원 결합 분자, 및 그들을 사용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
표적 조직에 있어서의 각종의 물질(예를 들어, 저분자 화합물)에 의존하여 CD137에 대한 결합 활성이 변화하는 CD137 항원 결합 분자를 발견하여, 제조하는 것에 의해, 면역 세포의 활성화 작용, 세포 상해 활성, 또는 항종양 활성을 가지면서, 정상 조직 등의 비종양 조직에 대한 작용이 낮아, 부작용이 적은 항CD137 항원 결합 분자를 제공함과 함께, 그의 사용 방법, 약학적 제제 등을 제공한다.
본 개시는 또한, 항원 결합 활성이 저분자 화합물에 의존하여 변화하는 항원 결합 분자, 그의 제조 방법, 및 그의 사용을 제공한다.

Description

항CD137 항원 결합 분자 및 그의 사용
본 개시는, 항CD137 항원 결합 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
암은, 일부를 제외하고는 근치가 어려운 치사적 질병 중 하나이다. 주된 치료법인 화학요법제를 이용한 치료 성적도 결코 높다고는 할 수 없다. 암의 치료를 곤란하게 하고 있는 요인으로서, 암 세포 그 자체의 불균일성뿐만 아니라 종양 미소 환경이 큰 역할을 하고 있음이 시사되고 있다(비특허문헌 1). 근년, 면역 응답을 억제하는 CTLA-4의 기능을 억제하여 T 세포의 활성화를 촉진시키는 항CTLA-4 항체에 의해, 절제 불능인 악성 흑색종 등의 치유의 가능성이 나타났다(비특허문헌 2). 2011년에는 항인간 CTLA-4 모노클로날 항체(이필리무맙)가 미국 Food and Drug Asministration(FDA, 식품 의약품국)으로부터 세계 최초의 면역 활성화 항체 의약으로서 승인을 받았다. 또한, CTLA-4 이외의 면역 체크 포인트 분자인 PD-1이나 PD-L1에 대해서도, 그 저해 항체의 치료 효과가 보고되어 있고(비특허문헌 3), FDA에 의해 승인을 받고 있다.
종양 면역에 중요한 역할을 가지는 T 세포의 활성화는, 1) 주요 조직 적합 유전자 복합체(MHC) 클래스 I 분자에 의해 제시된 항원 펩티드에 대한 T 세포 리셉터(TCR)의 결합 및 활성화; 2) 항원 제시 세포 상의 그 리간드에 대한 T 세포 표면상의 공자극 분자의 결합과 활성화의 2개의 시그널에 의해 이루어진다고 이해되고 있다. 더욱이, T 세포 표면 상의 CD137(4-1BB)을 비롯한 종양괴사 인자 리셉터 슈퍼패밀리(TNFRSF)에 속하는 부자극 분자의 활성화가 T 세포 활성화에 중요함도 기술되어 있다(비특허문헌 4).
TNFRSF에는, CD137, CD40, OX40, RANK, GITR 등과 같은 분자가 포함된다. CD137은 T 세포 표면뿐만 아니라 수상 세포(DC), B 세포, NK 세포, 매크로파지, 호중구 등 다른 면역 세포 표면에도 발현하고 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 5).
CD137 아고니스트 항체가 항종양 효과를 나타냄은 이미 마우스 모델에 있어서 실증되어 있고, 그것이 주로 CD8 양성 T 세포와 NK 세포의 활성화에 의한 것임이 마우스 모델로 실험적으로 나타나고 있다(비특허문헌 6). 그렇지만, 임상 및 비임상에 있어서 CD137 아고니스트 항체의 비특이적인 간 독성에 의한 부작용이 문제가 되고 있어, 약제의 개발은 생각과 같이 진행되고 있지 않다(비특허문헌 7, 비특허문헌 8). 이 부작용의 주된 원인으로서는, 항체 정상 영역을 개재시킨 Fcγ 리셉터에의 결합이 관여한 간장 등 종양 이외의 비면역 조직에 있어서의 면역 세포의 활성화가 시사되고 있다(비특허문헌 9). 다른 한편으로, TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 수용체의 아고니스트 항체가 생체 내에서 아고니스트 활성을 나타내기 위해서는 Fcγ 리셉터 발현 세포(FcγRII 발현 세포)에 의한 항체의 가교가 필요하다는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 10). 즉, CD137 아고니스트 항체의 항종양 효과의 약효와 간 독성 등의 부작용은 모두 항체의 Fcγ 리셉터에의 결합이 관여하고 있으므로, 항체의 Fcγ 리셉터의 결합을 상승시키면 약효의 향상은 기대되지만 간 독성의 부작용도 증대하고, 항체와 Fcγ 리셉터의 결합을 저감시키면, 부작용은 저감되지만 약효도 저감되어 버린다고 생각되어, 지금까지 약효와 부작용을 분리한 CD137 아고니스트 항체는 보고되어 있지 않다. 더욱이, 임상에 있어서는 CD137 아고니스트 항체의 항종양 효과 그 자체에 대해서도 결코 강한 것은 아니고, 독성의 회피와 동시에 더한 약효의 증대가 요망되고 있다. 따라서, 이러한 부작용을 억제하면서 항종양 면역 응답을 유도하는 것이 가능한 새로운 약제의 개발이 요망되고 있다.
치료용 항체를 생체 내에 투여했을 경우, 그 표적이 되는 항원이 병변 부위에만 특이적으로 발현하고 있는 것이 바람직하지만, 많은 경우, 비병변 부위인 정상 조직에도 동일한 항원이 발현하고 있어, 그것이 치료의 관점에서는 바람직하지 않은 부작용의 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 종양 항원에 대한 항체는, ADCC 등에 의해 종양 세포에 대한 상해 활성을 나타낼 수 있는 한편으로, 정상 조직에도 동일한 항원이 발현하고 있었을 경우, 정상 세포도 상해해 버릴 가능성이 있다. 상기와 같은 문제를 해결하기 위해서, 표적이 되는 조직(예를 들어 종양 조직)에 특정의 화합물이 다량으로 존재하는 현상에 주목하여, 그와 같은 화합물의 농도에 따라서 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자를 수색하는 기술이 개발되었다(예를 들어, 특허문헌 1).
국제 공개 WO2013/180200호 공보
Hanahan, Cell, 2011, 144, 646-74 Prieto, Clin Cancer Res. 2012, 18, 2039-47 Hamid, Expert Opin. Biol. Ther., 2013, 6, 847-61 Summers, Nat Rev Immunol, 2012, 12, 339-51 Vinay, Cellular & Molecular Immunology, 2011, 8, 281-284 Houot, Blood, 2009, 114, 3431-8 Ascierto, Semin Oncol, 2010, 37, 508-16 Dubrot, Cancer Immunol Immunother, 2010, 59, 1223-33 Schabowsky, Vaccine, 2009, 28, 512-22 Li, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013, 110(48), 19501-6
본 개시는, 항CD137 항원 결합 분자 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
본 개시는, 면역 세포의 활성화 작용, 세포 상해 활성, 또는 항종양 활성을 가지면서, 정상 조직 등의 비종양 조직에 대한 작용이 낮아, 부작용이 적은 항CD137 항원 결합 분자, 및 그들을 사용하는 방법을 제공하기 위해, 표적 조직(예를 들어, 종양 조직)에 있어서의 각종의 물질(예를 들어, 저분자 화합물)에 의존하여 CD137에의 결합 활성이 변화하는 특징을 구비하는 항CD137 항원 결합 분자를 제공함과 함께, 그의 사용 방법, 약학적 제제 등을 제공하는 것이다. 일 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 항CD137 항원 결합 분자는, 부작용이 적으므로, 부작용의 염려 없이 투여량을 증가시킬 수 있어, 결과적으로 보다 강한 약효(세포 상해 활성 또는 항종양 활성)를 발휘하는 것이 가능하다.
즉 본 개시는, 구체적으로는, 이하에 예시적으로 기재하는 항CD137 항원 결합 분자, 그의 사용 방법, 약학적 제제 등을 제공하는 것이다.
〔1〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는, 항CD137 항원 결합 분자.
〔2〕
10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.1〕
10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.2〕
10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 KD치가, 5x10-7M 이하인, 〔1〕 내지 〔2.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.3〕
저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 KD치가, 1x10-6M 이상인, 〔1〕 내지 〔2.2〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.4〕
저분자 화합물의 농도가 10μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 KD치가 5x10-7M 이하이고, 또한 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 KD치가 1x10-6M 이상인, 〔1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.5〕
저분자 화합물의 농도가 10μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 KD치, 및 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 KD치가, 각각, 당해 용액 중에서 CD137과 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후 24시간 이내에 Biacore 어세이에 의해 측정되는, 〔1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.6〕
저분자 화합물 및 CD137과 함께 3자 복합체를 형성하는, 〔1〕 내지 〔2.5〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.7〕
인간 및 원숭이 유래의 CD137에 결합하는, 〔1〕 내지 〔2.6〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.8〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔1〕 내지 〔2.7〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔2.9〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔1〕 내지 〔2.8〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔3〕
이하의 (a) 내지 (k)로부터 선택되는 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3의 조합을 포함하는, 〔1〕 내지 〔2.9〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(b) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(c) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(e) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(f) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(g) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(h) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
(j) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
(k) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
〔3.1〕
이하의 (a) 내지 (g)로부터 선택되는 어느 하나의 HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 조합을 포함하는, 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(c) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(e) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(f) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(g) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
〔4〕
이하의 (a) 내지 (m)으로부터 선택되는 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(b) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(c) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(e) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(f) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(g) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(h) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(j) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(k) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
(l) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
(m) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
〔5〕
(a) 서열 번호: 43 내지 53 중 어느 1개의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH; 또는
(b) 서열 번호: 54 내지 60 중 어느 1개의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.1〕
이하의 (a) 내지 (m)으로부터 선택되는 어느 하나의 VH 및 VL의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(g) 서열 번호: 49의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(h) 서열 번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(i) 서열 번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(j) 서열 번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL:
(k) 서열 번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL;
(l) 서열 번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL; 및
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL.
〔5.2〕
이하의 (a) 내지 (m)으로부터 선택되는 어느 하나의 VH 및 VL의 조합을 포함하는, 〔항CD137 항원 결합 분자:
(a) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(b) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(c) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(d) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(e) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(f) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(g) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열함VL;
(h) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(i) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(j) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL:
(k) 서열 번호: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL;
(l) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL; 및
(m) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL.
〔5.3〕
〔10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕/〔당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕의 값이, 참조 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자로서, 여기에서, 참조 항원 결합 분자가, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3의 조합을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자인, 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.4〕
상기 참조 항원 결합 분자가, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 조합을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자인, 〔5.3〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.5〕
〔1μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕/〔10μM 이상의 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕의 값이, 참조 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자로서,
여기에서, 참조 항원 결합 분자가, 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3의 조합을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자인, 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.6〕
상기 참조 항원 결합 분자가, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 조합을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자인, 〔5.5〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.7〕
10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서, CD137에의 결합에 관해서, 〔3〕 내지 〔5.2〕에 기재된 어느 하나의 항원 결합 분자와 경합하는, 당해 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.8〕
10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서, 〔3〕 내지 〔5.2〕에 기재된 어느 하나의 항원 결합 분자에 의해 결합되는 것과 동일한 CD137의 에피토프에 결합하는, 당해 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.8A〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔5.3〕 내지 〔5.8〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.8B〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔5.3〕 내지 〔5.8A〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.9〕
모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 〔1〕 내지 〔5.8B〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.10〕
인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 〔1〕 내지 〔5.9〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.11〕
전장(全長) IgG1 항체인, 〔1〕 내지 〔5.10〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.12〕
적어도 하나의 아미노산이 개변된 개변 Fc 영역을 포함하고, 당해 개변 Fc 영역이, 당해 아미노산 개변을 포함하지 않는 친(親)Fc 영역과 비교하여, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 상승되어 있는, 〔1〕 내지 〔5.11〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.13〕
상기 개변 Fc의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 참조 Fc 영역과 같거나 그보다 높고, 여기에서 참조 Fc가, EU 넘버링에 기초하는 G236N/H268D/A330K의 아미노산 치환의 조합을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역인, 〔5.12〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.14〕
참조 Fc 영역이 서열 번호: 153의 아미노산 서열을 포함하는, 〔5.12〕 또는 〔5.13〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.15〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는 G236N, H268D 및 A330K로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환인, 〔5.12〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.16〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는 G236N/H268D/A330K의 아미노산 치환의 조합인, 〔5.12〕 또는 〔5.15〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.17〕
상기 친Fc 영역이, 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는, 〔5.12〕 내지 〔5.16〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.18〕
적어도 하나의 아미노산이 개변된 개변 Fc 영역을 포함하고, 당해 아미노산 개변을 포함하지 않는 친Fc 영역을 포함하는 친항CD137 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)이 상승되어 있는, 〔1〕 내지 〔5.17〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.19〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, 친Fc 영역의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기의 개변인, 〔5.18〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.20〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이,
(i) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기를, 측쇄에 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기로 치환하는 개변,
(ii) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기를, 측쇄에 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 개변, 및/또는,
(iii) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기를, 측쇄에 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 개변
인, 〔5.18〕 또는 〔5.19〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.21〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, 복수의 아미노산 치환의 조합이며, 또한, 당해 복수의 아미노산 치환이 서로 입체 구조적으로 근접한 위치에 존재하는, 〔5.18〕 내지 〔5.20〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.22〕
개변 Fc 영역의 Fcγ 수용체(FcγR)에의 결합 활성이, 친Fc 영역과 비교하여 실질적으로 저하되지 않는, 〔5.18〕 내지 〔5.21〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.23〕
상기 Fcγ 수용체(FcγR)가, FcγRIIb인, 〔5.22〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.24〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는 Q311R, P343R, 및 D413K로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환인, 〔5.18〕 내지 〔5.23〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔5.25〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는 (i) P343R의 아미노산 치환, (ii) Q311R/P343R의 아미노산 치환, 또는 (iii) Q311R/D413K의 아미노산 치환의 조합인, 〔5.18〕 내지 〔5.24〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔6〕
개변 Fc 영역을 포함하고, 당해 개변 Fc 영역이, EU 넘버링에 기초하는, 이하로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 개변의 조합을 포함하는, 〔1〕 내지 〔5.25〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자:
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K;
L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K;
L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K;
L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R;
L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R;
K214R/G236N/H268D/A330K/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K;
K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K; 및
K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R.
〔6.1〕
상기 개변 Fc 영역이, 인간 IgG1 Fc 영역에서 유래하는, 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔6.2〕
상기 개변 Fc 영역이, 추가로 EU 넘버링에 기초하는 446위와 447위의 결실을 포함하는, 〔1〕 내지 〔6.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔7〕
서열 번호 64 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역을 포함하는, 〔1〕 내지 〔6.2〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔7.1〕
이하의 (i) 내지 (xxxviii)로부터 선택되는 어느 하나의 VH, VL, CH 및 CL의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
(i) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(ii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(iii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(iv) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(v) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(vi) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(vii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(viii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(ix) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(x) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xi) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xiii) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xiv) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xv) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xvi) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xvii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xviii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xix) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xx) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxi) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxiii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxiv) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxv) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 83의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxvi) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxvii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxviii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxix) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxx) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxi) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxiii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxiv) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxv) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 의 82 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxvi) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 의 83 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL;
(xxxvii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL; 및
(xxxviii) 서열 번호: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 서열 번호: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CH, 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CL.
〔8〕
〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자를 코딩하는, 단리된 핵산.
〔9〕
〔8〕에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
〔10〕
〔8〕에 기재된 핵산, 또는 〔9〕에 기재된 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
〔11〕
항CD137 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 항CD137 항원 결합 분자가 제조되도록 〔10〕에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
〔12〕
〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 및 세포 상해제를 포함하는, 이뮤노컨주게이트.
〔13〕
〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 혹은 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 제제.
〔14〕
의약품으로서의 사용을 위한, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트.
〔14.1〕
종양의 치료에 있어서의 사용을 위한, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔14.2〕
종양이, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, 및/또는 CD8 양성 T 세포가 침윤하고 있는 고형 종양인, 〔14.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 이뮤노컨주게이트, 또는 약학적 제제.
〔14.3〕
종양이, 제어성 T(Treg) 세포가 침윤하고 있는 고형 종양인, 〔14.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 이뮤노컨주게이트, 또는 약학적 제제.
〔15〕
면역 세포의 활성화에 있어서의 사용을 위한, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔15.1〕
상기 면역 세포가, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, 및/또는 T 세포인, 〔15〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 이뮤노컨주게이트, 또는 약학적 제제.
〔15.2〕
종양 조직에 있어서의 면역 세포의 활성화를 위한, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔15.3〕
상기 면역 세포가, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, 및/또는 T 세포인, 〔15.2〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 또는 약학적 제제.
〔15.4〕
세포의 상해에 있어서의 사용을 위한, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔16〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 비종양 조직에 있어서의 면역의 활성화의 레벨이 낮은, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔16.1〕
상기 비종양 조직이, 림프절, 비장, 및/또는 간장인, 〔16〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 이뮤노컨주게이트, 또는 약학적 제제.
〔16.2〕
비종양 조직에 발현하고 있는 CD137에 실질적으로 결합하지 않는, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트.
〔16.3〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 혈중 반감기가 신장되어 있는, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트.
〔17〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 부작용의 레벨이 낮은, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 〔12〕에 기재된 이뮤노컨주게이트, 또는 〔13〕에 기재된 약학적 제제.
〔17.1〕
부작용이, AST 증가, ALT 증가, 열, 구토, 급성 간염, 간 장애, 비종(splenomegaly), 장염, 피부의 화농성 염증, 호중구 감소, 림프구 감소, 혈소판 감소, 트랜스아미노아제의 발현, 및/또는 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)인, 〔17〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자, 이뮤노컨주게이트, 또는 약학적 제제.
〔18〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 아고니스트 활성을 갖는, 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.1〕
10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔18〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.2〕
10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔18〕 또는 〔18.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.3〕
50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔18〕 또는 〔18.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.4〕
250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔18〕 또는 〔18.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.5〕
상기 CD137에 대한 아고니스트 활성이, CD137 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가되는, 〔18〕 내지 〔18.4〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.6〕
상기 CD137 발현 세포가, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포인, 〔18.5〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.7〕
상기 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가되는, 〔18〕 내지 〔18.4〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.8〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서 CD137에 대한 아고니스트를 실질적으로 나타내지 않는, 〔18〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.9〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 각각, 당해 용액 중에서 CD137 발현 세포와 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후 72시간 이내에 측정되는 IL-2, IFN-γ, 및/또는 IL-6의 산생량에 의해 평가되는, 〔18.8〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.10〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 각각, NF-kappaB-루시페라제 리포터 구축물 및 CD137을 발현하는 T 세포와 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후 6시간 이내에 측정되는 루시페라제 발광 시그널에 의해 평가되는, 〔18.8〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.11〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔18〕 내지 〔18.10〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔18.12〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔18〕 내지 〔18.11〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19〕
저분자 화합물에 의존한 CD137 아고니스트 활성을 갖는, 〔1〕 내지 〔7.1〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.1〕
10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔19〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.2〕
10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔19〕 또는 〔19.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.3〕
50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔19〕 또는 〔19.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.4〕
250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔19〕 또는 〔19.1〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.5〕
상기 CD137에 대한 아고니스트 활성이, CD137 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가되는, 〔19〕 내지 〔19.4〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.6〕
상기 CD137 발현 세포가, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포인, 〔19.5〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.7〕
상기 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가되는, 〔19〕 내지 〔19.4〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.8〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서 CD137에 대한 아고니스트를 실질적으로 나타내지 않는, 〔19〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.9〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 각각, 당해 용액 중에서 CD137 발현 세포와 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후 72시간 이내에 측정되는 IL-2, IFN-γ, 및/또는 IL-6의 산생량에 의해 평가되는, 〔19.8〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.10〕
저분자 화합물의 종농도가 50μM 이상이 되도록 조제된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 당해 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성이, 각각, NF-kappaB-루시페라제 리포터 구축물 및 CD137을 발현하는 T 세포와 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후 6시간 이내에 측정되는 루시페라제 발광 시그널에 의해 평가되는, 〔19.8〕에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.11〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔19〕 내지 〔19.10〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔19.12〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔19〕 내지 〔19.11〕 중 어느 하나에 기재된 항CD137 항원 결합 분자.
〔20〕
개변 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자로서, 당해 개변 Fc 영역이, 친Fc 영역을 포함하는 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)의 상승을 가져오는 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함하고, 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 아고니스트 활성이 상승되어 있는, 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.1〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, 친Fc 영역의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기의 개변인, 〔20〕에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.2〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이,
(i) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기를, 측쇄에 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기로 치환하는 개변,
(ii) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 전하를 갖지 않는 아미노산 잔기를, 측쇄에 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 개변, 및/또는,
(iii) 친Fc 영역의 적어도 하나의 측쇄에 음의 전하를 갖는 아미노산 잔기를, 측쇄에 양의 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 개변
인, 〔20〕 또는 〔20.1〕에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.3〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, 복수의 아미노산 치환의 조합이며, 또한, 당해 복수의 아미노산 치환이 서로 입체 구조적으로 근접한 위치에 존재하는, 〔20〕 내지 〔20.2〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.4〕
개변 Fc 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성이, 친Fc 영역과 비교하여 실질적으로 저하되지 않는, 〔20〕 내지 〔20.3〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.5〕
상기 Fcγ 수용체가, FcγRIIb인, 〔20.4〕에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.6〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는, Q311R, P343R, 및 D413K로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 치환인, 〔20〕 내지 〔20.4〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.7〕
상기 적어도 1개의 아미노산 개변이, EU 넘버링에 기초하는, (i) P343R/D413K, (ii) Q311R/P343R, (iii) P343R, (iv) D413K, (v) Q311R, 또는 (vi) Q311R/D413K의 아미노산 개변 또는 그의 조합인 〔20〕 내지 〔20.6〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.8〕
항CD137 항원 결합 분자인, 〔20〕 내지 〔20.7〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔20.9〕
항CD137 항체인, 〔20〕 내지 〔20.8〕 중 어느 하나에 기재된 아고니스트 항원 결합 분자.
〔21〕
개변 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서,
친Fc 영역에, 친Fc 영역을 포함하는 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)의 상승을 가져오는 적어도 1개의 아미노산 개변을 도입하는 것을 포함하고,
개변 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자의 아고니스트 활성이, 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 상승되고 있는, 방법.
〔21.1〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔21〕에 기재된 방법.
〔21.2〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔21〕 또는 〔21.1〕에 기재된 방법.
〔21.3〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔21〕 또는 〔21.1〕에 기재된 방법.
〔21.4〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔21〕 또는 〔21.1〕에 기재된 방법.
〔21.5〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 항원 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가되는, 〔21〕 내지 〔21.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.6〕
상기 항원 발현 세포가, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포인, 〔21.5〕에 기재된 방법.
〔21.7〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가되는, 〔21〕 내지 〔21.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.8〕
추가로,
(i) 〔21〕 내지 〔21.7〕 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제작된 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 취득하고,
(ii) 당해 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 당해 숙주 세포를 배양하여 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 생산시키고,
(iii) 숙주 세포 배양물로부터 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 회수하는
것을 포함하는, 〔21〕 내지 〔21.7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.9〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항원 결합 분자인, 〔21〕 내지 〔21.8〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.10〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항체인, 〔21〕 내지 〔21.9〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.11〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔21.1〕 내지 〔21.10〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21.12〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔21.1〕 내지 〔21.11〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22〕
Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자의 아고니스트 활성을 상승시키는 방법으로서, 당해 Fc 영역에, 친Fc 영역을 포함하는 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)의 상승을 가져오는 적어도 1개의 아미노산 개변을 도입하는 것을 포함하는, 방법.
〔22.1〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔22〕에 기재된 방법.
〔22.2〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔22〕 또는 〔22.1〕에 기재된 방법.
〔22.3〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔22〕 또는 〔22.1〕에 기재된 방법.
〔22.4〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔22〕 또는 〔22.1〕에 기재된 방법.
〔22.5〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 항원 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가되는, 〔22〕 내지 〔22.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22.6〕
상기 항원 발현 세포가, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포인, 〔22.5〕에 기재된 방법.
〔22.7〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가되는, 〔22〕 내지 〔22.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22.8〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항원 결합 분자인, 〔22〕 내지 〔22.7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22.9〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항체인, 〔22〕 내지 〔22.8〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22.10〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔22.1〕 내지 〔22.9〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔22.11〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔22.1〕 내지 〔22.10〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23〕
Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자의 아고니스트 활성을 상승시키기 위한, 적어도 1개의 아미노산 개변의 사용으로서, 당해 아미노산 가변이 친Fc 영역을 포함하는 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)의 상승을 가져오는 것인, 방법.
〔23.1〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔23〕에 기재된 방법.
〔23.2〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔23〕 또는 〔23.1〕에 기재된 방법.
〔23.3〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔23〕 또는 〔23.1〕에 기재된 방법.
〔23.4〕
아고니스트 항원 결합 분자의, 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 〔23〕 또는 〔23.1〕에 기재된 방법.
〔23.5〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 항원 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가되는, 〔23〕 내지 〔23.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23.6〕
상기 항원 발현 세포가, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포인, 〔23.5〕에 기재된 방법.
〔23.7〕
상기 항원에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가되는, 〔23〕 내지 〔23.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23.8〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항원 결합 분자인, 〔23〕 내지 〔23.7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23.9〕
상기 아고니스트 항원 결합 분자가, 항CD137 항체인, 〔23〕 내지 〔23.8〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23.10〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔23.1〕 내지 〔23.9〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23.11〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔23.1〕 내지 〔23.10〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔24〕
저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 융합 파트너 분자 1단위당, 2단위 이상의 항원이 융합한 융합 분자에, 항원 결합 도메인 혹은 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 해당 융합 분자 중의 항원과 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하는, 스크리닝 방법.
〔24.1〕
상기 융합 파트너 분자가, 2량체의 Fc 영역인, 〔24〕에 기재된 방법.
〔24.2〕
상기 Fc 영역이, 제 1의 Fc 서브유닛 및 제 2의 Fc 서브유닛을 포함하고, 상기 항원이, 제 1 및 제 2의 Fc 서브유닛에 1개씩 융합되어 있는, 〔24.1〕에 기재된 방법.
〔24.3〕
상기 항원이, 제 1 및 제 2의 Fc 서브유닛의 N말단에 1개씩 융합되어 있는, 〔24.1〕 또는 〔24.2〕에 기재된 방법.
〔24.4〕
상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리가, 파지 라이브러리인, 〔24〕 내지 〔24.3〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔24.5〕
상기 파지 라이브러리에 포함되는 파지가, 2 이상의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 그 표면에 제시하는 파지인, 〔24〕 내지 〔24.4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔24.6〕
상기 파지 라이브러리에 포함되는 파지가, 헬퍼 파지 유래 pIII 유전자에 결손을 갖는 파지인, 〔24〕 내지 〔24.5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔25〕
2 이상의 상이한 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서,
(a) 제 1의 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 혹은 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 제 1의 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를, 제 2의 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 상기 항원에 접촉시키고,
(e) 상기 공정(d)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 제 2의 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고,
(f) 상기 공정(e)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하고,
여기에서, 상기 (c) 및 (d)의 사이에, 상기 (c)에서 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자를 증폭하는 것을 포함하지 않는,
스크리닝 방법.
〔25.1〕
상기 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리가, 파지 라이브러리인, 〔25〕에 기재된 방법.
〔26〕
저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 나이브 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하고,
여기에서, 상기 나이브 라이브러리가, 2 이상의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 그 표면에 제시하는 파지를 포함하는 파지 라이브러리인, 스크리닝 방법.
〔27〕
저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하고,
여기에서, 상기 라이브러리가, 헬퍼 파지 유래 pIII 유전자에 결손을 갖는 파지를 포함하는 라이브러리인, 스크리닝 방법.
〔28〕
저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 저분자 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하고,
여기에서, 상기 라이브러리가, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 발현을, 해당 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 발현을 제어하고 있는 프로모터로부터의 발현량을 상승시키는 저분자 첨가물에 의해 증대시켜 조제된 파지를 포함하는 라이브러리인, 스크리닝 방법.
〔28.1〕
상기 저분자 첨가물이, 아이소프로필-β-싸이오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 arabinose인, 〔28〕에 기재된 스크리닝 방법.
〔28.2〕
상기 저분자 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔24〕 내지 〔28.1〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔28.3〕
상기 저분자 화합물이, ATP인, 〔24〕 내지 〔28.2〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔29〕
종양 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자로서, 100μM의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 항원 결합 분자.
〔29.1〕
100μM의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 KD치가 5×10-7M 이하인, 〔29〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.2〕
당해 화합물의 비존재하에 있어서의 KD치가 1×10-6M 이상인, 〔29〕 또는 〔29.1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.3〕
항원에 대해서 중화 활성을 갖는, 〔29〕 내지 〔29.2〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.4〕
항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 갖는, 〔29〕 내지 〔29.3〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.5〕
항원이, 종양 조직에 있어서의 종양 세포, 면역 세포, 간질 세포의 어느 것인가가 발현 또는 분비하는 항원인, 〔29〕 내지 〔29.4〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.6〕
당해 화합물이, 아데노신 함유 화합물인, 〔29〕 내지 〔29.5〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.7〕
Fc 영역을 포함하는, 〔29〕 내지 〔29.6〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.8〕
Fc 영역이 아미노산 개변을 포함하는 변이 Fc 영역이고, 당해 변이 Fc 영역이 천연형 Fc 영역에 비해, FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 증강되어 있는, 〔29.7〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔29.9〕
항원 결합 분자가 항체 또는 항체 단편인, 〔29〕 내지 〔29.8〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔30〕
〔29〕 내지 〔29.9〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 제제.
〔30.1〕
종양의 치료에 있어서의 사용을 위한, 〔30〕에 기재된 약학적 제제.
〔30.2〕
대조가 되는 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 제제와 비교하여, 비종양 조직에 있어서의 세포 상해 활성이 낮은, 〔30.1〕에 기재된 약학적 제제.
〔30.3〕
대조가 되는 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 제제와 비교하여, 부작용의 레벨이 낮은, 〔30.1〕 또는 〔30.2〕에 기재된 약학적 제제.
〔30.4〕
대조가 되는 항원 결합 분자가, 종양 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자인, 〔30.2〕 또는 〔30.3〕에 기재된 약학적 제제.
〔31〕
종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 100μM의 종양 조직 특이적 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 당해 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함하는, 방법.
〔32〕
종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 약학적 제제를 제조하는 방법으로서, 〔29〕 내지 〔29.9〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 공정을 포함하는, 방법.
〔33〕
표적 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자로서, 1μM의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 충분량의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 낮은, 항원 결합 분자.
〔33.1〕
1μM의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 KD치가 2×10-7M 이상인, 〔33〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.2〕
충분량의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 KD치가 1×10-7M 이하인, 〔33〕 또는 〔33.1〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.3〕
당해 화합물이 종양 조직 특이적 화합물인, 〔33〕 내지 〔33.2〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.4〕
당해 화합물이 아데노신 함유 화합물인, 〔33.3〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.5〕
대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 높은 혈장중 체류성을 갖는, 및/또는 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는, 〔33〕 내지 〔33.4〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.6〕
대조의 항원 결합 분자가, 표적 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자인, 〔33.5〕에 기재된 항원 결합 분자.
〔33.7〕
항원 결합 분자가 항체 또는 항체 단편인, 〔33〕 내지 〔33.6〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자.
〔34〕
〔33〕 내지 〔33.7〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 제제.
〔35〕
대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 높은 혈장중 체류성을 갖는, 및/또는 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 표적 조직 특이적 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 공정, 및 (b) (a)에서 제조된 항원 결합 분자의 혈장중 체류성, 및/또는 혈장중 항원 축적능을 측정하는 공정을 포함하는, 방법.
〔35.1〕
1μM의 표적 조직 특이적 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 충분량의 당해 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함하는, 〔35〕에 기재된 방법.
〔35.2〕
대조의 항원 결합 분자가, 표적 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자인, 〔35〕 또는 〔35.1〕에 기재된 방법.
〔36〕
약학적 제제를 제조하는 방법으로서, 〔33〕 내지 〔33.7〕 중 어느 하나에 기재된 항원 결합 분자를, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 공정을 포함하는, 방법.
〔37〕
용액 중에 있어서의 ATP 농도를 측정하는 방법으로서, (i) P2Y11을 발현하는 split Luc/HEK293 세포를 당해 용액에 접촉시키는 공정, 및 (ii) 당해 세포 내의 루시페라제 활성을 측정하는 공정을 포함하는, 방법.
〔37.1〕
루시페라제 기질을 포함하는 용액을 당해 세포에 접촉시키는 공정을 추가로 포함하는, 〔37〕에 기재된 방법.
〔37.2〕
용액이 in vivo의 조직 중에 있어서의 세포간액인, 〔37〕 또는 〔37.1〕에 기재된 방법.
〔37.3〕
조직이 종양 조직인, 〔37.2〕에 기재된 방법.
〔37.4〕
공정(i)이, P2Y11을 발현하는 split Luc/HEK293 세포를 in vivo의 조직 중에 이식하는 공정인, 〔37.2〕 또는 〔37.3〕에 기재된 방법.
도 1은 Jurkat 세포를 이용하여 시험한 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 각종의 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 상대 발광량을 나타낸다.
도 2는 Jurkat 세포를 이용하여 시험한 ADP 존재하 또는 비존재하에서의 각종의 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 상대 발광량을 나타낸다.
도 3은 인간 T 세포를 이용하여 시험한 ADPbetaS 존재하 또는 비존재하에서의 각종의 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면.
도 4는 인간 T 세포를 이용하여 시험한 ADPbetaS 존재하 또는 비존재하에서의 dBBAT119-P253/dBBAT119L-LamLib(저분자 스위치 항CD137 항체) 또는 NS1-P253(논스위치 항CD137 항체)의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 IFNγ 산생량(ng/mL)을 나타낸다.
도 5는 파지 ELISA에 의해 시험한, 각종의 항CD137 항체(결합 활성이 향상된 스위치 항CD137 항체)의 ATP 의존적인 항원 결합 활성을 나타내는 도면. Y축은, ATP 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비를, X축은, 항원 존재하/비존재하에서의 S/N비를 나타낸다.
도 6은 항CD137 항체(dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib)의 각종 개변체의 ATP 존재하 또는 비존재하에 있어서의 인간 CD137에의 결합 활성을 나타내는 도면. 상단은, ATP 비존재하에서의 인간 CD137에의 결합 활성을, 하단은, ATP 존재하에서의 인간 CD137에의 결합 활성을 나타낸다.
도 7은 인간 T 세포를 이용하여 시험한 ADPbetaS 존재하 또는 비존재하에서의 dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib, dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib, IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0(컨트롤), 또는 NS1-P253(논스위치 항CD137 항체)의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. 분도(A)는, ADPbetaS 비존재하에서의 시험 결과를, 분도(B)는, ADPbetaS 존재하에서의 시험 결과를 나타낸다. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 IFNγ 산생량(ng/mL)을 나타낸다.
도 8은 4-1BB Jurkat 리포터 진 어세이를 이용하여 시험한 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 각종 스위치 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. 분도(A)는, ATP 비존재하에서의 시험 결과를, 분도(B)는, ATP 존재하에서의 시험 결과를 나타낸다.
도 9는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 10은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승, 또는 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 11은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 12는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 13은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 14는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 15는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 16은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 17은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 18은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 19는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 20은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 21은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 22는 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 pI의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 23은 인간 말초혈 단핵구 세포를 이용하여 시험한, 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성의 상승에 의한, 각종 스위치 항CD137 항체의 ATP 존재하 또는 비존재하에서의 아고니스트 활성의 증강을 나타내는 도면. 분도(A)는, IL-2 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을, 분도(B)는, IFN-γ의 산생량을 지표로 측정한 아고니스트 활성을 나타낸다.
도 24는 인간 CD137 노크인 마우스를 이용하여 시험한, 각종 스위치, 논스위치 항CD137 항체의 혈장중 항체 농도를 나타내는 도면. Fc는 모두 mIgG1이다.
도 25는 인간 CD137 노크인 마우스를 이용하여 시험한, 각종 스위치, 논스위치 항CD137 항체의 혈장중 항체 농도를 나타내는 도면. Fc는 모두 MB110이다.
도 26은 인간 CD137 노크인 마우스를 이용하여 시험한, 각종 스위치, 논스위치 항CD137 항체의 혈장중 항체 농도를 나타내는 도면. Fc는 모두 MB492이다.
도 27은 MC38 세포를 이식한 마우스 모델에 있어서의 A375-mIgG1/B167-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군(n=5)의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 28은 MC38 세포를 이식한 마우스 모델에 있어서의 항체(NO1-mIgG1, 또는 A375-mIgG1/B167-ml0r)의 투여에 의한 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의, 분도(B)는, 비장의 중량을 나타낸다.
도 29는 MC38 세포를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NO1-mIgG1, 또는 A375-mIgG1/B167-ml0r의 투여에 의한 림프절에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 ICOS 양성 T 세포의 비율을, 분도(C)는, CD8 양성 T 세포의 GranzymeB 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 30은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NO1-mIgG1, 또는 A375-mIgG1/B167-ml0r의 투여에 의한 비장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 ICOS 양성 T 세포의 비율을, 분도(C)는, CD8 양성 T 세포의 GranzymeB 양성 T의 비율을 나타낸다.
도 31은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NO1-mIgG1, 또는 A375-mIgG1/B167-ml0r의 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 GranzymeB 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 32는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A356-MB110/B040-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군(n=5)의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 33은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS2-MB110, 또는 A356-MB110/B040-ml0r 투여에 의한 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의, 분도(B)는, 비장의 중량을 나타낸다.
도 34는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS2-MB110, 또는 A356-MB110/B040-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 ICOS 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 35는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A372-mIgG1/B040-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군 n=5의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 36은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A372-mIgG1/B040-ml0r 투여에 의한 림프절의 세포수(분도(A)), 및 비장의 중량(분도(B))을 나타낸다.
도 37은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의 A372-mIgG1/B040-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도(CD8 양성 T 세포의 GranzymeB 양성 T 세포의 비율)를 나타내는 도면.
도 38은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의 A372-MB110/B040-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군 n=5의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 39는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS2-MB110, 또는 A372-MB110/B040-ml0r 투여에 의한 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의, 분도(B)는, 비장의 중량을 나타낸다.
도 40은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS2-MB110, 또는 A372-MB110/B040-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도(CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율)를 나타내는 도면.
도 41은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의 A372-MB492/B040-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군(n=5)의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 42는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, 또는 A372-MB492/B040-ml0r 투여에 의한 림프절의 세포수, 및 비장의 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의 세포수를, 및 분도(B)는, 비장의 장기 중량을 나타낸다.
도 43은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, 또는 A372-MB492/B040-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도(CD8 양성 T 세포의 GranzymeB 양성 T 세포의 비율)를 나타내는 도면.
도 44는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A486-MB492/B167-ml0r 또는 A488-MB492/B226-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군(n=5)의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 45는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, A486-MB492/B167-ml0r 또는 A488-MB492/B226-ml0r 투여에 의한 림프절 1개당의 세포수 및 비장 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절 1개당의 세포수를, 또한 분도(B)는, 비장 중량을 나타낸다.
도 46은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, A486-MB492/B167-ml0r 또는 A488-MB492/B226-ml0r 투여에 의한 간장에서의 이펙터 세포의 침윤 레벨(CD45 양성 T 세포 중의 CD3 양성 CD8 양성 T 세포 등의 비율)을 나타내는 도면.
도 47은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A489-MB492/B223-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군(n=5)의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 48은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, 또는 A489-MB492/B223-ml0r 투여에 의한 림프절의 세포수 및 비장의 림프구 획분의 세포수를 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의 세포수를, 및 분도(B)는, 비장의 림프구 획분의 세포수를 나타낸다
도 49는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-MB492, 또는 A489-MB492/B223-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도(CD45 양성 T 세포의 CD8 양성 T 세포의 비율)를 나타내는 도면.
도 50은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의 A548-mIgG1/B256-ml0r 및 A551-mIgG1/B256-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면. 분도(A)는, A548-mIgG1/B256-ml0r의 항종양 효과를, 및 분도(B)는, A551-mIgG1/B256-ml0r의 항종양 효과를 나타낸다.
도 51은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-mIgG1, A548-mIgG1/B256-ml0r 또는 A551-mIgG1/B256-ml0r 투여에 의한 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의, 분도(B)는, 비장의 중량을 나타낸다.
도 52는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-mIgG1, A548-mIgG1/B256-ml0r, 또는 A551-mIgG1/B256-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 Granzyme B 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 53은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, A551-MB110/B379-ml0r의 항종양 효과를 나타내는 도면.
도 54는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-mIgG1 또는 A551-MB110/B379-ml0r 투여에 의한 장기 중량을 나타내는 도면. 분도(A)는, 림프절의, 분도(B)는, 비장의 중량을 나타낸다.
도 55는 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-mIgG1 또는 A551-MB110/B379-ml0r 투여에 의한 비장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 ICOS 양성 T 세포의 비율을, 분도(C)는, CD8 양성 T 세포의 Granzyme B 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 56은 MC38 세포주를 이식한 마우스 모델에 있어서의, NS1-mIgG1 또는 A551-MB110/B379-ml0r 투여에 의한 간장에서의 T 세포 활성화의 정도를 나타내는 도면. 분도(A)는, CD8 양성 T 세포의 PD-1 양성 T 세포의 비율을, 분도(B)는, CD8 양성 T 세포의 ICOS 양성 T 세포의 비율을, 분도(C)는, CD8 양성 T 세포의 Granzyme B 양성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 57은 Jurkat 세포를 이용하여 시험한 L-키누레닌 존재하 또는 비존재하에서의 각종의 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 상대 발광량을 나타낸다.
도 58은 4-1BB Jurkat 세포를 이용하여 시험한 저분자 화합물(ATP 또는 ADP) 존재하 또는 비존재하에서의 각종의 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면. X축은 항체의 농도(μg/mL), Y축은 상대 발광량을 나타낸다.
도 59는 세포외 ATP 레벨의 측정용으로 제작된 P2Y11 split Luc/HEK293 세포의 ATP 응답성(ATP 농도에 의존한 루시페린 발광)을 나타내는 도면이다.
도 60은 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 마우스의 피하에 이식했을 때의 in vivo에서의 ATP 응답성(ATP 농도에 의존한 루시페린 발광)을 나타내는 도면이다.
도 61은 기정 농도의 ATP 및 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 피하에 이식한 마우스, 및 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 피하에 이식한 FM3A 담암 마우스의 발광 이미징 측정의 결과를 나타내는 도면이다. 마우스의 복측부에 있어서의 마크가 검출된 발광을 나타낸다.
도 62는 항hIL6R 항체인 MRAH-G4T1/MRAL-k0(컨트롤 항체), H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, 및 H0052-G4T1/L1083-lam1(모두 스위치 항체)의 ATP 농도에 의존한 hIL6R에 대한 결합 활성(KD치)을 나타내는 도면이다.
도 63은 항hIL6R 항체인 MRAH-G4T1/MRAL-k0(컨트롤 항체), H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, 및 H0052-G4T1/L1083-lam1(모두 스위치 항체)의 ADP 농도에 의존한 hIL6R에 대한 결합 활성(KD치)을 나타내는 도면이다.
도 64는 항hIL6R 항체인 MRAH-G4T1/MRAL-k0(컨트롤 항체), H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, 및 H0052-G4T1/L1083-lam1(모두 스위치 항체)의 AMP 농도에 의존한 hIL6R에 대한 결합 활성(KD치)을 나타내는 도면이다.
도 65는 항hIL6R 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, 및 H0052-mFa55/L1083-ml0(모두 스위치 항체)의 ATP 농도에 의존한 ADCC 활성을 나타내는 도면이다.
도 66은 항hIL6R 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, 및 H0052-mFa55/L1083-ml0(모두 스위치 항체)의 in vivo에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1은 음성 컨트롤 항체이다.
도 67은 항hIL6R 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체)의 정상 마우스 및 hIL6R 트랜스제닉 마우스에서의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 68은 항hIL6R 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0(스위치 항체)의 정상 마우스 및 hIL6R 트랜스제닉 마우스에서의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 69는 항hIL6R 항체인 H0041-mFa55/L1088-ml0(스위치 항체)의 정상 마우스 및 hIL6R 트랜스제닉 마우스에서의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 70은 항hIL6R 항체인 H0052-mFa55/L1083-ml0(스위치 항체)의 정상 마우스 및 hIL6R 트랜스제닉 마우스에서의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 71은 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, 및 H0052-mFa55/L1083-ml0(모두 스위치 항체)을 각각 투여한 후의 hIL6R 트랜스제닉 마우스에 있어서의 항원의 축적을 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 가용형 hIL6R의 혈장중 농도를 나타낸다. 음성 컨트롤 항체로서 IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1(도 중에서는 KLH-mFa55로 표기)이 이용되고 있다.
도 72는 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, 및 H0041-mFa55/L1088-ml0(모두 스위치 항체)의 in vivo에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1은 음성 컨트롤 항체이다.
도 73은 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, 및 H0041-mFa55/L1088-ml0(모두 스위치 항체)의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 74는 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, 및 H0041-mFa55/L1088-ml0(모두 스위치 항체)을 각각 투여한 후의 항원의 축적을 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 가용형 hIL6R의 혈장중 농도를 나타낸다. 음성 컨트롤 항체로서 IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1(도 중에서는 KLH-mFa55로 표기)이 이용되고 있다.
도 75는 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0041-mFa55/L1088-ml0, 및 H0052-mFa55/L1083-ml0(모두 스위치 항체)의 in vivo에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1은 음성 컨트롤 항체이다.
도 76은 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0052-mFa55/L1083-ml0(스위치 항체)의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 77은 항hIL6R non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0(컨트롤 항체), 항hIL6R switch 항체인 H0052-mFa55/L1083-ml0(스위치 항체)을 각각 투여한 후의 항원의 축적을 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 가용형 hIL6R의 혈장중 농도를 나타낸다. 음성 컨트롤 항체로서 IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1(도 중에서는 KLH-mFa55로 표기)이 이용되고 있다.
도 78은 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mF18/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체)과 H5029-mFa31/L3021-ml0(스위치 항체)의 ATP 농도에 의존한 PD-1/PDL-1 결합 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 79는 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mF18/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체)과 H5041-mFa31/L3021-ml0(스위치 항체)의 ATP 농도에 의존한 PD-1/PDL-1 결합 저해 활성을 나타내는 도면이다.
도 80은 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mF18/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체), H5029-mFa31/L3021-ml0, H5041-mFa31/L3021-ml0(모두 스위치 항체)의 AMP 농도에 의존한 in vitro에서의 중화 활성을 나타내는 도면이다.
도 81은 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mF18/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체), H5029-mFa31/L3021-ml0, H5041-mFa31/L3021-ml0(모두 스위치 항체)의 ATP 농도에 의존한 in vitro에서의 중화 활성을 나타내는 도면이다.
도 82는 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mFa55/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체), H5041-mFa55/L3023-ml0(스위치 항체)의 in vivo에 있어서의 항종양 활성을 나타내는 도면이다. IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1은 음성 컨트롤 항체이다.
도 83은 항PD1 항체인 mPD1F2VH-mFa55/mPD1F2VL-mk1(컨트롤 항체), H5041-mFa55/L3023-ml0(스위치 항체)의 (A) 종양 및 (B) 비장에서의 PD-1 발현 세포의 제거 활성을 나타내는 도면이다. 도 중의 표기로서, isotype는 음성 컨트롤 항체(IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1)를 나타낸다.
도 84는 항hIL6R 스위치 항체인 H0041L1088 Fab 단편과 ATP의 결합의 양식을 나타내는 도면이다. 도 중, ATP를 공-막대 모델로 나타내고, ATP와 상호작용을 형성하는 아미노산 잔기를 스틱 모델로 나타냈다. 파선은, 당해 항체와 ATP 사이의 수소 결합을 나타낸다.
도 85는 항hIL6R 스위치 항체인 H0041L1088의 에피토프를, hIL6R 세포외 도메인(shIL6R)의 아미노산 서열 상에 매핑한 도면이다. 도 중, 회색으로 망점넣기한 아미노산 잔기는, 결정 구조에 있어서 H0041L1088 Fab 혹은 ATP의 어느 것으로부터 4.2Å 이내의 거리에 위치하는 비수소 원자를 1개 이상 포함하는 shIL6R의 아미노산 잔기(에피토프 잔기)를 나타낸다.
도 86은 ATP가 결합한 H0041L1088 Fab 단편과 shIL6R의 결합의 상세를 나타내는 도면이다. 도 중, 당해 항체의 중쇄를 흑색, 경쇄를 회색, shIL6R을 백색으로 묘화했다. 도 중, ATP는 공 모델로 나타내고, 당해 항체 혹은 ATP로부터 4.2Å 이내에 있는 shIL6R의 에피토프 잔기와, 에피토프 잔기로부터 4.2Å 이내에 있는 당해 항체의 파라토프 잔기를 스틱 모델로 나타냈다. 또한, 파선은 당해 항체와 shIL6R 사이의 수소 결합을 나타낸다. 한편, shIL6R의 F298만 공 모델로 나타내어, ATP와의 상호작용의 양상을 알기 쉽게 했다.
도 87은 상기 도 86의 구조를 180도 회전했을(안쪽으로부터 봤을) 경우의 구조를 나타내는 도면이다.
도 88은 4-1BB Jurkat 리포터 진 어세이를 이용하여 시험한 ATP 존재하에서의 각종 스위치 항CD137 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면.
도 89는 항CD137 스위치 항체인 A375-SCF041aPh/B167-Lamlib 및 A375-MY201aPh/B167-Lamlib의 각각의 혈장중 동태의 비교를 나타내는 도면이다. 그래프의 세로축은 항체의 혈장중 농도를 나타낸다.
도 90은 LLC1/OVA/GPC3 세포주를 hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스에 이식하여 제작한 마우스 모델에 있어서의, A375/B167-SCF041aPh 및 A375/B167-MY201aPh의 각각의 항종양 효과를 나타내는 도면. 각 점은 1군 n=5의 종양 체적의 평균치를 나타낸다.
도 91은 T cell activation Bioassay(NFAT)를 이용한 리포터 진 어세이에 의해 시험한 ATP 존재하에서의 각종 스위치 항CD3 항체의 아고니스트 활성을 나타내는 도면.
I. 정의
용어 「결합 활성(binding activity)」은, 분자(예를 들어, 항체)의 1개 또는 그 이상의 결합 부위와, 분자의 결합 파트너(예를 들어, 항원)의 사이의, 비공유 결합적인 상호작용의 합계의 강도를 말한다. 여기에서, 「결합 활성(binding activity)」은, 어느 결합쌍의 멤버(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용으로 엄밀하게 한정되지 않는다. 예를 들어, 결합쌍의 멤버가 1가에서의 1:1 상호작용을 반영하는 경우, 이 결합 활성을 특히, 고유의 결합 어피니티(「어피니티」)라고 부른다. 결합쌍의 멤버가, 1가에서의 결합 및 다가에서의 결합의 양방이 가능한 경우, 결합 활성은, 이들 결합력의 총합이 된다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 결합 활성은, 일반적으로, 해리 상수(KD) 또는 「단위 리간드량당의 애널라이트 결합량」(이하 「결합량」이라고 부르는 경우가 있다)에 의해 나타낼 수 있다. 일반적으로, 해리 상수(KD)는, 그 수치가 낮을수록 결합 활성은 높아지고, 「단위 리간드량당의 애널라이트 결합량」 또는 「결합량」은, 그 수치가 높을수록 결합 활성이 높아짐이 당업자에게 이해될 것이다. 결합 활성은, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 통상의 방법에 따라 측정될 수 있다. 결합 활성을 측정하기 위한 구체적인 실례가 되는 및 예시적인 태양에 대해서는, 아래에서 기술한다.
「결합 활성 성숙」 항원 결합 분자 또는 항체, 혹은, 「결합 활성 상승(증강)」 항원 결합 분자 또는 항체는, 개변을 구비하고 있지 않은 친항원 결합 분자 또는 친항체와 비교하여, 1개 또는 복수의 초가변 영역(hypervariable region: HVR) 중에 항원 결합 분자 또는 항체의 항원에 대한 결합 활성의 개선을 가져오는 1개 또는 복수의 개변을 수반하는, 항체를 말한다.
용어 「항CD137 항원 결합 분자」 「항CD137 항체」 또는 「CD137에 결합하는 항원 결합 분자」 「CD137 결합하는 항체」는, 충분한 결합 활성으로 CD137과 결합할 수 있는 항원 결합 분자 또는 항체이며, 그 결과 그 항원 결합 분자 또는 항체가 CD137을 표적화했을 때에 진단제 및/또는 치료제로서 유용한, 항원 결합 분자 또는 항체를 말한다. 특정의 태양에 있어서, 항CD137 항체는, 상이한 종으로부터의 CD137 사이에서 보존되고 있는 CD137의 에피토프에 결합한다.
용어 「저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는」 항CD137 항원 결합 분자 또는 항CD137 항체는, 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성과 비교하여 높은 항원 결합 분자 또는 항체를 말한다. 일 태양에 있어서, 「저분자 화합물의 존재하」란, 당해 저분자 화합물이, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상 존재하는 조건하를 말한다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물의 존재하에 있어서의, 무관계한 비CD137 단백질에 대한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성의 정도는, (예를 들어, 방사 면역 측정법(radioimmunoassay: RIA) 또는 표면 플라즈몬 공명 분석법(surface plasmon resonance: SPR)에 의해) 측정했을 때, 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137에의 결합의 약 10% 미만이다. 특정의 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물의 존재하에 있어서, ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM, 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 예를 들어 10-6M∼10-10M, 10-7M∼10-9M 예를 들어, 10-7M∼10-8M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
본 명세서에서 용어 「항원 결합 분자」는, 그 가장 넓은 의미에 있어서 사용되고, 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 가리킨다. 일 태양에 있어서, 항원 결합 분자는, 항체, 항체 단편, 또는 항체 유도체이다.
본 명세서에서 이용되는 「아고니스트 항원 결합 분자」 또는 「아고니스트 항체」는, 그것이 결합하는 항원(예를 들어, CD137, CD3)의 생물학적 활성을 유의하게 유도 또는 증강시키는 항원 결합 분자 또는 항체이다.
따라서, 예를 들어, 항원이, CD137인 경우에는, 이러한 아고니스트 작용을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체를, 각각 「CD137 아고니스트 항원 결합 분자」 또는 「CD137 아고니스트 항체」라고 칭한다. 마찬가지로, 예를 들어, 항원이, CD3인 경우에는, 이러한 아고니스트 작용을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체를, 각각 「CD3 아고니스트 항원 결합 분자」 또는 「CD3 아고니스트 항체」라고 칭한다.
본 명세서에서 용어 「항체」는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 항체 단편을 포함하는, 여러 가지 항체 구조를 포함한다.
「항체 단편」은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
참조 항원 결합 분자 또는 참조 항체와 「동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자」 또는 「동일한 에피토프에 결합하는 항체」는, 경합 어세이에 있어서 그 참조 항체 또는 참조 항원 결합 분자가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 저지하는 항체 또는 항원 결합 분자를 말하고, 또한 반대로 말하면, 참조 항체는, 경합 어세이에 있어서 전술한 항체가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 저지한다. 예시적인 경합 어세이가, 본 명세서에서 제공된다. 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자 또는 참조 항체가, 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 경우, 경합 어세이는, 당해 저분자 화합물의 존재하에 있어서 행해진다.
용어 「키메라」 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 다른 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 말한다.
항체의 「클래스」는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 말한다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 어느 것인가는 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
「이펙터 기능」은, 항체의 Fc 영역에 기인하는, 항체의 아이소타입에 따라서 상이한 생물학적 활성을 말한다. 항체의 이펙터 기능의 예에는 다음의 것이 포함된다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포 상해(complement dependent cytotoxicity: CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC); 탐식 작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체)의 하방 제어; 및, B 세포 활성화.
「세포 상해 활성」은, 세포의 기능을 저해하거나 또는 방해하는, 및/또는 세포의 죽음 또는 파괴를 야기하는 활성을 말한다. 세포 상해 활성은, 예를 들어 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성, 및 T 세포에 의한 세포 상해 활성 등이어도 되고, 이뮤노컨주게이트 등과 같이, 세포 상해제(예를 들어, 방사성 동위체나 화학요법제 등)에 의해 야기되는 것이어도 된다.
본 명세서에서 용어 「Fc 영역」은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불림)에 따른다.
본 명세서에서 용어 「변이 Fc 영역」은, 적어도 1개의 아미노산 수식, 바람직하게는 1개 또는 복수의 아미노산 치환에 의해 천연형 서열 Fc 영역의 그것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이 Fc 영역은, 천연형 서열 Fc 영역 또는 친폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여, 천연형 서열 Fc 영역 중 또는 친폴리펩티드의 Fc 영역 중에 적어도 1개의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1∼약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1∼약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서의 변이 Fc 영역은, 바람직하게는, 천연형 서열 Fc 영역 및/또는 친폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 그들과 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 그들과 적어도 약 95%의 상동성을 구비한다.
본 명세서에 있어서, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 개변 또는 치환은, EU 넘버링 시스템과 아미노산과의 조합에 의해 표시될 수 있다. 예를 들어, S424N은, EU 넘버링 424위의 세린(Ser)의 아스파라긴(Asn)으로의 치환을 나타낸다. 또한, EU424N은, 424위의 아미노산(종류를 묻지 않음)의 아스파라긴(Asn)으로의 치환을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 「Fc 영역 함유 항체」는, Fc 영역을 포함하는 항체를 말한다. Fc 영역의 C말단 리신(EU 넘버링 시스템에 따르면 잔기 447) 또는 Fc 영역의 C말단 글리신-리신(잔기 446-447)은, 예를 들어 항체의 정제 동안에 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, 본 개시에 의한 Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은, G446-K447을 수반하는 항체, G446을 수반하고 K447을 수반하지 않는 항체, G446-K447이 완전하게 제거된 항체, 또는 상기 3개의 타입의 항체의 혼합물을 포함할 수 있다.
용어 「전장 항체」, 「완전 항체」, 및 「전부 항체」는, 본 명세서에서는 서로 교환 가능하게 이용되고, 천연형 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나, 또는 본 명세서에서 정의하는 Fc 영역 또는 변이 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.
「인간 항체」는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼터리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를, 명확하게 제외하는 것이다.
「프레임워크」 또는 「FR」은, 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
본 명세서의 취지에서의 「억셉터 인간 프레임워크」는, 아래에서 정의하는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 유래하는, 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는, 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 「유래하는」 억셉터 인간 프레임워크는, 그들의 동일한 아미노산 서열을 포함해도 되고, 또는 아미노산 서열의 변경을 포함하고 있어도 된다. 몇 가지 태양에 있어서, 아미노산의 변경의 수는, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇 가지 태양에 있어서, VL 억셉터 인간 프레임워크는, VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
「인간 컨센서스 프레임워크」는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통하여 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 일 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 일 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
「인간화」 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 말한다. 어느 태양에서는, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 「인간화된 형태」는, 인간화를 거친 항체를 말한다.
용어 「가변 영역」 또는 「가변 도메인」은, 항체를 항원에 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 것이다. 더욱이, 어느 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하여, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본 명세서에서 이용되는 용어 「초가변 영역」 또는 「HVR」은, 서열에 있어서 초가변이고(「상보성 결정 영역」 또는 「CDR」(complementarity determining region)), 및/또는 구조적으로 정해진 루프(「초가변 루프」)를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기(「항원 접촉」)를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 통상, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 HVR은, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에서 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에서 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에서 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
특별히 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 번호 붙여진다. 또한, 본 명세서에 있어서, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기), 및 당해 잔기에 있어서의 아미노산 개변 또는 치환은, Kabat 넘버링 시스템과 아미노산의 조합에 의해 표시될 수 있다. 예를 들어, N99는, Kabat 넘버링 99위의 아스파라긴(Asn)을 나타내고, N99A는, Kabat 넘버링 99위의 아스파라긴(Asn)의 알라닌(Ala)으로의 치환을 나타낸다.
「이뮤노컨주게이트」는, 1개 또는 복수의 이종의 분자에 컨주게이트된 항체이다(이종의 분자는, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 세포 상해제를 포함한다).
본 명세서에서 말하는 용어 「세포 상해제」는, 세포의 기능을 저해하거나 또는 방해하는, 및/또는 세포의 죽음 또는 파괴의 원인이 되는 물질을 말한다. 세포 상해제는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 방사성 동위체(예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체); 화학요법제 또는 화학요법약(예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카알칼로이드류(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 마이토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신, 또는 다른 인터캘레이트제); 증식 저해제; 핵산 분해 효소 등의 효소 및 그 단편; 항생 물질; 예를 들어, 저분자 독소 또는 세균, 진균류, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소(그 단편 및/또는 변이체를 포함한다) 등의 독소; 및, 이하에 개시되는, 여러 가지 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
「단리된」 항체는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 몇 가지 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 분리법(isoelectric focusing: IEF), 캐필러리 전기영동) 또는 크로마토그래프(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 측정하여, 95% 또는 99%를 초과하는 순도까지 정제된다. 항체의 순도의 평가를 위한 방법의 총설로서, 예를 들어, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조할 것.
「단리된」 핵산은, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
본 명세서에서 이용되는 용어 「벡터」는, 그것이 연결된 또 하나의 핵산을 증가시킬 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 「발현 벡터」라고도 칭해진다.
「항CD137 항원 결합 분자를 코딩하는 코딩된 핵산」은, 항원 결합 분자를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말한다. 「항CD137 항체를 코딩하는 단리된 핵산」은, 항체의 중쇄 및 경쇄(또는 그 단편)를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말하고, 1개의 벡터 또는 별개의 벡터에 실려 있는 핵산 분자, 및 숙주 세포 중의 하나 또는 복수의 위치에 존재하고 있는 핵산 분자를 포함한다.
용어 「숙주 세포」, 「숙주 세포주」, 및 「숙주 세포 배양물」은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 세포(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)를 말한다. 숙주 세포는 「형질 전환체」 및 「형질 전환 세포」를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 의하지 않고 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전하게 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되었을 때 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
본 명세서에서 말하는 용어 「모노클로날 항체」는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체는, 생길 수 있는 변이 항체(예를 들어, 자연히 생기는 변이를 포함하는 변이 항체, 또는 모노클로날 항체 조제물의 제조 중에 발생하는 변이 항체. 그와 같은 변이체는 통상 약간량 존재하고 있다.)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과는 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각 모노클로날 항체는, 항원 상의 단일한 결정기에 대한 것이다. 따라서, 수식어 「모노클로날」은, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 것이라고 하는 항체의 특징을 나타내고, 어떠한 특정의 방법에 의한 항체의 제조를 요구하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 개시에 따라 이용되는 모노클로날 항체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마법, 재조합 DNA법, 파지 디스플레이법, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하는, 다양한 수법에 의해 작성되어도 되고, 모노클로날 항체를 제작하기 위한 그와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법은, 본 명세서에 기재되어 있다.
「나(裸)항체」는, 이종의 부분(예를 들어, 세포 상해 부분) 또는 방사성 표지에 컨주게이트되어 있지 않은 항체를 말한다. 나항체는, 약학적 제제 중에 존재하고 있어도 된다.
「천연형 항체」는, 천연에 생기는 다양한 구조를 수반하는 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연형 IgG 항체는, 다이설파이드 결합하고 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150,000돌턴의 헤테로4량체 당단백질이다. N말단으로부터 C말단을 향해, 각 중쇄는, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, 추가로 3개의 정상 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 계속된다. 마찬가지로, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 경쇄는, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는, 2개의 타입의 하나에 귀속되어도 된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 「퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성」은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의, 백분율비로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정할 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(주식회사 제네틱스) 등의, 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨테크사의 저작이며, 그 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)에 사용자용 서류와 함께 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨테크사(Genentech, Inc., South San Francisco, California)로부터 공적으로 입수 가능하고, 소스 코드로부터 컴파일해도 된다. ALIGN-2 프로그램은, Digital UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX operating system 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변동하지 않는다.
아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 소여의 아미노산 서열 A의, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 소여의 아미노산 서열 B에의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한, 어느 %아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소여의 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은, 다음과 같이 계산된다: 분율 X/Y의 100배. 여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B에의 %아미노산 서열 동일성은, B의 A에의 %아미노산 서열 동일성과 동일하지 않음이, 이해될 것이다. 별반 특별하게 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성치는, 직전의 단락에서 기술한 대로 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻어지는 것이다.
용어 「약학적 제제」는, 그 중에 포함된 유효 성분의 생물학적 활성이 효과를 발휘할 수 있는 형태로 있는 조제물이며, 또한 제제가 투여되는 피험체에 허용할 수 없는 정도로 독성이 있는 추가의 요소를 포함하지 않는, 조제물을 말한다.
「약학적으로 허용되는 담체」는, 피험체에 대해서 무독인, 약학적 제제 중의 유효 성분 이외의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
어느 제(예를 들어, 약학적 제제)의 「유효량」은, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해서 유효한, 필요한 용량에 있어서의 및 필요한 기간에 걸쳐서의, 양을 말한다.
「개체」 또는 「피험체」는 포유동물이다. 포유동물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사육 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이 등의 비인간 영장류), 토끼, 및, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정의 태양에서는, 개체 또는 피험체는, 인간이다.
본 명세서에서 말하는 용어 「CD137」은, 특별히 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 등의 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연형 CD137을 말한다. 이 용어는, 「전장」의 프로세싱을 받고 있지 않은 CD137도, 세포 중에서의 프로세싱의 결과 생기는 어떠한 형태의 CD137도 포함한다. 이 용어는 또한, 자연스럽게 생기는 CD137의 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체나 대립 유전자 변이체도 포함한다. 예시적인 인간 CD137의 전장 아미노산 서열을, 서열 번호: 1(NCBI Reference Sequence: NP_001552.2), 예시적인 인간 CD137의 세포외 영역의 아미노산 서열을, 서열 번호: 2에 나타냈다. 예시적인 마우스 CD137의 전장 아미노산 서열을, 서열 번호: 3(NCBI Reference Sequence: NP_035742.1), 예시적인 마우스 CD137의 세포외 영역의 아미노산 서열을, 서열 번호: 4에 나타냈다. 예시적인 원숭이 CD137의 전장 아미노산 서열을, 서열 번호: 5(NCBI Reference Sequence: ABY47575.1), 예시적인 원숭이 CD137의 세포외 영역의 아미노산 서열을, 서열 번호: 6에 나타냈다.
CD137은, 종양괴사 인자(TNF) 수용체 패밀리의 멤버이다. 그의 대체 명칭은, 종양괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9(TNFRSF9), 4-1BB, ILA이다. 활성화 된 CD4+ 및 CD8+T 세포 상에서의 그 발현에 더하여, CD137은 또한, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러(NK) 및 NK-T 세포, 매크로파지, 단구, 호중구, CD4+CD25+ 제어성 T 세포, 및 혈관 내피 세포에 있어서 발현된다. 암 세포에 있어서도 발현됨도 나타나고 있다(Labiano 등, Oncoimmunology, 24권: e1062967(2015년)). 그 천연의 리간드인 CD137L은, B 세포, 단구/매크로파지, 및 수상 세포 등의 항원 제시 세포 상에 나타내고 있다(Watts 등, Annu. Rev. Immunol., 23권:23-68페이지(2005년)). 그 리간드와의 상호작용에 있어서, CD137은, TCR 유도성의 T 세포 증식의 증가, 사이토카인 산생, 기능적 성숙, 아포토시스의 억제, 및 장기의 CD8+T 세포 생존을 가져온다(Nam 등, Curr. Cancer Drug Targets, 5권:357-363페이지(2005년), Watts 등, Annu. Rev. Immunol., 23권:23-68페이지(2005년)).
용어 「암」 및 「암성」은, 조절되지 않는 세포 성장/증식에 의해 전형적으로 특징지어지는 포유동물에 있어서의 생리학적 상태를 말하거나 또는 설명하는 것이다.
용어 「종양」은, 악성인지 양성인지에 상관 없이, 모든 신생 물성 세포 성장 및 증식, 및 모든 전(前)암성 및 암성 세포 및 조직을 말한다. 용어 「암」, 「암성」, 「세포 증식성 장애」, 「증식성 장애」 및 「종양」은, 본 명세서에서 말하는 경우, 서로 배타적이지 않다.
용어 「세포 증식성 장애」 및 「증식성 장애」는, 일정 정도의 이상한 세포 증식에 관련하는 장애를 말한다. 일 태양에 있어서, 세포 증식성 장애는, 암이다.
본 명세서에서 이용되는 「치료」(및, 그 문법상의 파생어, 예를 들어 「치료한다」, 「치료하는 것」 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해(寬解) 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 본 개시의 항체는, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 늦추기 위해서 이용된다.
II. 조성물 및 방법(항CD137 아고니스트 항원 결합 분자)
일 국면에 있어서, 본 개시는, 항CD137 아고니스트 항원 결합 분자, 및 그들의 사용에 일부 기초하는 것이다. 특정의 태양에 있어서, CD137에 결합하는 항체가 제공된다. 본 개시의 항체는, 면역 세포의 활성화 작용, 세포 상해 활성, 또는 항종양 활성을 발휘할 수 있으므로, 예를 들어, 암의 진단 또는 치료를 위해서, 유용하다.
A. 예시적 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체
일 국면에 있어서, 본 개시는 CD137에 결합하는, 단리된 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는,
· 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는다;
· CD137의 세포외 영역에 결합한다;
· 저분자 화합물 및 CD137과 함께 3자 복합체를 형성한다;
· 인간 및 원숭이 유래의 CD137에 결합한다;
· CD137 활성의 아고니스트이다;
· 저분자 화합물의 존재하에서, CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다;
· 저분자 화합물의 비존재하에서, CD137에 대한 아고니스트 활성이 낮다; 및/또는
· 저분자 화합물의 비존재하에서, CD137에 대한 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는다.
［항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성］
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성(binding activity)은, 저분자 화합물의 존재하에 있어서, ≤1μM, ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-6M 이하, 10-7M 이하, 10-8M 이하, 10-9M 이하, 10-10M 이하, 예를 들어 10-6M∼10-10M, 10-7M∼10-9M 예를 들어, 10-7M ∼10-8M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
일 태양에 있어서, 항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성(binding activity)은, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 따라 측정되고, KD로 표시된다. 일 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체의 Fab 버전 및 그 항원을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 어피니티는, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합한 항원을 항Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)를 참조). 측정 조건을 구축하기 위해서, MICROTITER(등록상표) 멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중 5μg/ml의 포착용 항Fab 항체(Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2∼5시간, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블로킹한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM의 [125I]- 항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 단계 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조하면, 150μl/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20(상표), Packard)를 첨가하고, TOPCOUNT(상표) 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
일 태양에 있어서, 항체의 결합 활성(binding activity)은 표면 플라즈몬 공명 분석법을 측정 원리로 하는 예를 들어 BIACORE(상표 등록) T200 또는 BIACORE(상표 등록) 4000(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용한 리간드 포착법이 이용된다. 기기 조작에는 BIACORE(상표 등록) Control Software가 이용된다. 일 태양에 있어서 아민 커플링 키트(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)을 공급원의 지시에 따라 사용하여, 카복시메틸 덱스트란을 코팅한 센서 칩(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)에 리간드 포착용 분자, 예를 들어 항태그 항체, 항IgG 항체, 프로틴 A 등을 고상화한다. 리간드 포착 분자는 적절한 pH의 10mM 아세트산 나트륨 용액을 이용하여 희석되어 적절한 유속 및 주입 시간에 주입된다. 결합 활성 측정은 0.05% 폴리소르베이트 20(그 외의 명칭으로서 Tween(상표 등록)-20) 함유 완충액을 측정용 완충액으로서 사용하고, 유속은 10-30μL/분, 측정 온도는 바람직하게는 25℃나 37℃에서 측정된다. 리간드 포착용 분자에 항체를 리간드로서 포착시켜 측정을 실시하는 경우는, 항체를 주입하여 목적량을 포착시킨 후, 측정용 완충액을 이용하여 조제된 항원 및 또는 Fc 수용체의 단계 희석물(애널라이트)이 주입된다. 리간드 포착용 분자에 항원 및 또는 Fc 수용체를 리간드로서 포착시켜 측정을 실시하는 경우는, 항원 및 또는 Fc 수용체를 주입하여 목적량을 포착시킨 후, 측정용 완충액을 이용하여 조제된 항체의 단계 희석물(애널라이트)이 주입된다.
일 태양에 있어서, 측정 결과는 BIACORE(등록상표) Evaluation Software를 이용하여 해석된다. 속도론적 파라미터(kinetics parameter) 산출은 1:1 Binding의 모델을 이용하여, 결합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 실시되고, 결합 속도(kon 혹은 ka), 해리 속도(koff 혹은 kd), 평형 해리 상수(KD)가 계산될 수 있다. 결합 활성이 약하고, 특히 해리가 빨라 속도론적 파라미터 산출이 곤란한 경우는 Steady state 모델을 이용하여 평형 해리 상수(KD)를 계산해도 된다. 결합 활성의 다른 파라미터로서는, 특정의 농도의 애널라이트의 결합량(resonance unit: RU)을 리간드의 포착량(RU)으로 나누어 「단위 리간드량당의 애널라이트 결합량」도 산출될 수 있다.
［저분자 화합물에 의존한 결합 활성］
일 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는다. 비한정의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137의 결합 활성과 비교하여 높다. 다른 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 고농도 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 저농도의 당해 저분자 화합물 화합물의 존재하에서의 CD137의 결합 활성과 비교하여 높다. 바람직한 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물 화합물의 비존재하에서의 CD137의 결합 활성의, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 20배 이상, 25배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 더욱이, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다. 다른 바람직한 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물 화합물의 비존재하에서의 CD137의 결합 활성의, 2배보다 높고, 3배보다 높고, 5배보다 높고, 10배보다 높고, 15배보다 높고, 20배보다 높고, 25배보다 높고, 30배보다 높고, 50배보다 높고, 100배보다 높고, 200배보다 높고, 300배보다 높고, 500배보다 높고, 1×103배보다 높고, 2×103배보다 높고, 더욱이, 3×103배보다 높고, 5×103배보다 높고, 1×104배보다 높고, 2×104배보다 높고, 3×104배보다 높고, 5×104배보다 높고, 또는 1×105배보다 높다.
저분자 화합물의 농도로서는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성에 차이가 검출되는 한, 임의의 농도를 선택할 수 있다. 일 태양에 있어서, 「저분자 화합물의 존재하」 및/또는 「고농도 저분자 화합물의 존재하」에 있어서의 저분자 화합물의 농도로서는, 예를 들어, 100nM 이상, 500nM 이상, 1μM 이상, 3μM 이상, 5μM 이상, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 250μM 이상, 300μM 이상, 400μM 이상, 500μM 이상, 또는 1mM 이상의 농도를 들 수 있다. 혹은, 각각의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 최대의 결합 활성을 나타내는 충분량을 여기에서의 농도로 할 수도 있다. 또한, 일 태양에 있어서, 「저농도 저분자 화합물의 존재하」에 있어서의 저분자 화합물의 농도로서는, 예를 들어, 500μM 이하, 250μM 이하, 200μM 이하, 150μM 이하, 100μM 이하, 50μM 이하, 10μM 이하, 1μM 이하, 500nM 이하, 100nM 이하, 50nM 이하, 10nM 또는 1nM 이하의 농도를 들 수 있다. 저분자 화합물의 농도가 제로 또는 실질적인 농도가 제로인 경우를, 저농도의 일 태양으로서 선택할 수도 있다.
여기에서, 「실질적인 농도가 제로」란, 예를 들어, 저분자 화합물이 존재하지만, 현재의 기술에서는 그 농도를 검출할 수 없을 정도의 극히 미량인 농도를 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성은, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성의, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상, 또는 20배 이상이다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성의, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상, 또는 20배 이상이다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 100μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성의, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 15배 이상, 16배 이상, 17배 이상, 18배 이상, 19배 이상, 또는 20배 이상이다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, 9x10-7M 이하, 8x10-7M 이하, 7x10-7M 이하, 6x10-7M 이하, 5x10-7M 이하, 또는 4x10-7M 이하의 해리 상수(KD)이며, 바람직하게는, 5x10-7M 이하의 해리 상수(KD)이다. 추가의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이(KD)가, Biacore로는 계산 불가능할 정도로 크거나(결합 활성이 약하다), 1x10-7M 이상, 5x10-7M 이상, 7x10-7M 이상, 8x10-7M 이상, 9x10-7M 이상, 1x10-6M 이상, 2x10-6M 이상, 3x10-6M 이상, 또는 4x10-6M 이상의 해리 상수(KD)이며, 바람직하게는, 1x10-6M 이상의 해리 상수(KD)이다. 다른 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 100μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, 9x10-7M 이하, 8x10-7M 이하, 7x10-7M 이하, 6x10-7M 이하, 5x10-7M 이하, 4x10-7M 이하, 3x10-7M 이하, 2x10-7M 이하, 또는 1x10-7M 이하의 해리 상수(KD)이며, 바람직하게는, 2x10-7M 이하의 해리 상수(KD)이다. 추가의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 더욱이 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, Biacore로는 계산 불가능할 정도로 크거나(결합 활성이 약하다), 1x10-7M 이상, 5x10-7M 이상, 7x10-7M 이상, 8x10-7M 이상, 9x10-7M 이상, 1x10-6M 이상, 2x10-6M 이상, 3x10-6M 이상, 또는 4x10-6M 이상의 해리 상수(KD)이며, 바람직하게는, 1x10-6M 이상의 해리 상수(KD)이다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, 8x10-8M 이하의 해리 상수(KD)이며, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, Biacore로는 계산 불가능할 정도로 크다(결합 활성이 약하다). 다른 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 100μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, 2x10-8M 이하의 해리 상수(KD)이며, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)이, Biacore로는 계산 불가능할 정도로 크다(결합 활성이 약하다).
일 국면에 있어서, 본 개시는, 〔10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕/〔당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕의 값이, 참조 항CD137 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 다른 일 국면에 있어서, 본 개시는, 〔100μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕/〔당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)〕의 값이, 참조 항CD137 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 상기 어느 국면에 있어서도, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167에 포함되는, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체로부터 선택할 수 있다.
일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, A375/B167에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 A375/B167을 포함하는 항CD137 항체이다. 다른 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, A551/B379에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 A551/B379를 포함하는 항CD137 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 인간 유래의 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역(예를 들어, 중쇄 정상 영역으로서 G1T3(서열 번호: 138), 경쇄 정상 영역으로서 인간 λ쇄 Lamlib(서열 번호: 63))을 포함한다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)이 참조 항CD137 항원 결합 분자와 같거나 그보다 낮고, 또한, 10μM 이상의 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)이, 동일 조건하에서의 참조 항CD137 항원 결합 분자의 CD137에 대한 결합 활성과 같거나 그보다 높은, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 다른 일 국면에 있어서, 본 개시는, 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이 참조 항CD137 항원 결합 분자와 같거나 그보다 낮고, 또한, 10μM 이상의 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)이, 동일 조건하에서의 참조 항CD137 항원 결합 분자의 CD137에 대한 결합 활성(결합량)과 같거나 그보다 높은, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 상기 어느 국면에 있어서도, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167에 포함되는, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체로부터 선택할 수 있다.
일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167의 아미노산 서열을 포함하는 항CD137 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, A375/B167에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, A375/B167을 포함하는 항CD137 항체이다. 다른 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, A551/B379에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, A551/B379를 포함하는 항CD137 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 인간 유래의 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역(예를 들어, 중쇄 정상 영역으로서 G1T3(서열 번호: 138), 경쇄 정상 영역으로서 인간 λ쇄 Lamlib(서열 번호: 63))을 포함한다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 〔1μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕/〔10μM 이상의 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕의 값이, 참조 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 다른 일 국면에 있어서, 본 개시는, 〔1μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕/〔100μM 이상의 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성(KD)〕의 값이, 참조 항원 결합 분자와 같거나 그보다 큰, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 상기 어느 국면에 있어서도, 참조 항원 결합 분자는, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167에 포함되는, HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항체로부터 선택할 수 있다.
일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, A375/B167에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, A375/B167을 포함하는 항체이다. 다른 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, A551/B379에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, A551/B379를 포함하는 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 항원 결합 분자는, 인간 유래의 중쇄 정상 영역 및 경쇄 정상 영역(예를 들어, 중쇄 정상 영역으로서 G1T3(서열 번호: 138), 경쇄 정상 영역으로서 인간 λ쇄 Lamlib(서열 번호: 63))을 포함한다.
일 태양에 있어서, 저분자 화합물의 존재하, 비존재하, 고농도 존재하 및/또는 저농도 존재하에 있어서의, 항CD137 항체의 CD137에 대한 결합 활성은, 표면 플라즈몬 공명 분석법을 측정 원리로 하는, 예를 들어 BIACORE(상표 등록) T200을 이용한 리간드 포착법에 의해 측정된다.
예시적인, 항CD137 항체의 CD137에 대한 결합 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항체의 CD137에 대한 결합 활성은, BIACORE(상표 등록) T200으로 평가된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 이 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시된다. 일 태양에 있어서, 본 측정에서는, 리간드 포착용 분자에 항체를 리간드로서 포착시켜 측정을 실시한다. 구체적으로는, 우선, Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)에 Sure Protein A(GE Healthcare)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 적당량(예를 들어 100RU, 200RU, 300RU, 400RU, 또는 500RU정도)의 항체가 포착된다.
바람직한 일 태양에 있어서, 약 100∼500RU, 바람직하게는 약 250∼400RU의 항체가 포착된다. 다음에, 목적 농도(예를 들어, 1μM, 10μM, 50μM 또는 100μM)가 되도록 저분자 화합물이 첨가된 러닝 버퍼로 조제된 CD137 용액, 혹은 당해 저분자 화합물을 포함하지 않는 러닝 버퍼로 조제된 CD137 용액을 상호작용시킴으로써, 저분자 화합물 존재하, 및 당해 저분자 화합물 비존재하에서의 CD137과의 결합 활성이 평가된다. CD137 용액 중의 CD137의 농도는 적절히 결정될 수 있지만, 예를 들어, hCD137-HisBAP(실시예 1-1 참조)를 항원으로서 이용하는 경우, 항원 농도는 0nM, 15.625nM, 62.5nM, 250nM, 및 1000nM에서 각각 측정이 실시된다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항체의 인간 CD137에 대한 해리 상수(KD)는, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 산출된다. 구체적으로는, 측정에 의해 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합 속도 상수 ka(L/mol/s), 해리 속도 상수 kd(1/s)가 산출되고, 그 값으로부터 해리 상수 KD(mol/L)가 산출된다.
추가적인 예시적인, 항CD137 항체의 CD137에 대한 결합 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 항CD137 항체의, 인간 CD137에 대한 결합이 Biacore T200으로 평가된다. 인간 CD137에 대한 결합 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시되었다. 우선 Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)에 Sure Protein A(GE Healthcare)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 250∼400RU 정도의 항체가 포착된다. 다음에 목적 농도(예를 들어, 1μM, 10μM, 50μM 또는 100μM)가 되도록 ATP가 첨가된 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액, 혹은 ATP를 포함하지 않는 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액을 상호작용시킴으로써, ATP 존재하, 및 ATP 비존재하에서의 인간 CD137과의 결합 활성이 평가된다. 항원인 인간 CD137은 실시예 (1-1)의 방법으로 조제되는 hCD137-HisBAP를 사용하여, 항원 농도 0nM, 15.625nM, 62.5nM, 250nM, 및 1000nM에서 각각 측정이 실시된다. 칩은 25mM NaOH와 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 이용하여 재생되고, 반복하여 항체를 포착하여 측정이 행해진다. 각 항체의 인간 CD137에 대한 해리 상수는, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 산출된다. 구체적으로는, 측정에 의해 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합 속도 상수 ka(L/mol/s), 해리 속도 상수 kd(1/s)가 산출되고, 그 값으로부터 해리 상수 KD(mol/L)가 산출된다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항체의 CD137(바람직하게는 인간 CD137)에 대한 결합 활성은, 「단위 항체량당의 CD137 결합량」으로 나타낼 수도 있다. 구체적으로는, 전술한 BIACORE(상표 등록) T200을 이용한 측정법에 의해 얻어진 센서그램을 이용하여, CD137의 항체에의 결합량(RU)을 항체의 포착량(RU)으로 나누는 것에 의해, 「단위 항체량당의 CD137 결합량」이 산출된다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항체의 CD137(바람직하게는 인간 CD137)에 대한 결합 활성은, 실시예 5-3 또는 6-2에 기재된 방법으로 측정할 수도 있다.
본 명세서 중의 용어 「저분자」, 「저분자 화합물」은, 생체에 존재하는 「생체 고분자」 이외의 천연 유래의 화학 물질 또는 비천연 유래의 화학 물질을 말한다. 바람직하게는, 표적 조직 특이적인 화합물 또는 비천연 화합물이지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 일 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 「저분자 화합물」은, 「암조직 특이적 화합물」 또는 「암조직 특이적 대사 산물」이다. 본 개시에 있어서의 용어 「암조직 특이적인 화합물(암조직 특이적 화합물)」이란, 비암조직과 비교하여 암조직 중에 차시적(差示的)으로 존재하는 화합물을 말한다. 본 명세서에 있어서, 「암」이라고 하는 용어는, 일반적으로, 악성 신생물을 나타내기 위해서 이용되고, 그것은, 전이성 또는 비전이성이어도 된다. 용어 「대사」는, 생물의 조직 내에서 발생하는 화학 변화를 말하고, 「동화」 및 「이화」가 포함된다. 동화란, 분자의 생합성 또는 축적을 말하고, 이화는 분자의 분해를 말한다. 「대사 산물」은, 물질 대사에 기인하는 중간체 또는 생성물이다.
용어 「표적 조직」이란, 본 발명의 항원 결합 분자가 송달되는 것을 목적으로 하는 생체 내의 임의의 조직을 의미한다. 표적 조직은, 각종 장기 등의 조직학적으로 구별되는 조직이어도 되고, 건상(健常)한 조직과 질환 상태에 있는 조직 등의 병리학적으로 구별되는 조직이어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 표적 조직은 종양 조직이다. 한편, 「비표적 조직」이란, 생체 내에 있어서의 표적 조직 이외의 조직을 의미한다.
용어 「종양 조직」이란, 적어도 하나의 종양 세포를 포함하는 조직을 의미한다. 종양 조직은, 통상, 종양의 주체를 이루는 종양 세포의 집단(실질)과, 이들 사이에 존재하여 종양을 지지하는 결합 조직이나 혈관(간질)으로 성립되어 있다. 양자의 구별이 분명한 것도 있다면, 양자가 뒤섞여 있는 것도 있다. 종양 조직 내에는 면역 세포 등이 침윤하고 있는 경우도 있다. 한편, 「비종양 조직」이란, 생체 내에 있어서의 종양 조직 이외의 조직을 의미한다. 질환 상태가 아닌 건상 조직/정상 조직은 비종양 조직의 대표적인 예이다.
본 개시에서 사용되는 암조직 특이적 화합물, 또는 암조직 특이적 대사 산물의 비한정적인 일 태양으로서 이하에 상술하는 화합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 적합하게 들 수 있다. 적어도 하나의 화합물이란, 후술하는 동일한 항원 결합 도메인에 의한 항원에 대한 결합 활성이, 1종의 암조직 특이적 화합물, 또는 암조직 특이적 대사 산물에 의존적인 외에, 복수의 종류의 암조직 특이적 화합물, 또는 암조직 특이적 대사 산물에 의존적인 경우를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서 중에서 이용되는, 용어 「표적 조직 특이적 화합물」이란, 비표적 조직과 비교하여 표적 조직 중에 차시적으로 존재하는 화합물을 말한다. 몇 가지 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은, 표적 조직에 존재하지만 비표적 조직에는 존재하지 않는, 또는 비표적 조직에 존재하지만 표적 조직에는 존재하지 않는 등의 정성적인 표적 조직 특이성으로 규정되는 화합물일 수 있다. 다른 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은, 비표적 조직과 비교하여 상이한 농도(예를 들어, 고농도 또는 저농도)로 표적 조직에 존재하는 등의 정량적인 표적 조직 특이성으로 규정되는 화합물일 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은, 비표적 조직에 비해, 예를 들어 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.3배 이상, 1.35배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상, 1.55배 이상, 1.6배 이상, 1.65배 이상, 1.7배 이상, 1.75배 이상, 1.8배 이상, 1.85배 이상, 1.9배 이상, 1.95배 이상, 2배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상, 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 103배 이상, 104배 이상, 105배 이상, 106배 이상, 또는 그 이상 높은 농도로, 표적 조직에 존재한다. 다른 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은, 표적 조직에 비해, 예를 들어 1.05배 이상, 1.1배 이상, 1.15배 이상, 1.2배 이상, 1.25배 이상, 1.3배 이상, 1.35배 이상, 1.4배 이상, 1.45배 이상, 1.5배 이상, 1.55배 이상, 1.6배 이상, 1.65배 이상, 1.7배 이상, 1.75배 이상, 1.8배 이상, 1.85배 이상, 1.9배 이상, 1.95배 이상, 2배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상, 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 103배 이상, 104배 이상, 105배 이상, 106배 이상, 또는 그 이상 높은 농도로, 비표적 조직에 존재한다. 특정의 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은, 비표적 조직에 비해, 통계적으로 유의하게 높은 또는 낮은 농도(즉, 웰치의 t 검정 또는 윌콕슨의 순위화 검정의 어느 것인가를 이용하여 결정되는 바와 같이, p치는 0.05 미만 및/또는 q치는 0.10 미만)로, 표적 조직에 존재한다. 특정의 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물은 종양 조직 특이적 화합물이다.
특정의 태양에 있어서, 종양 조직 특이적 화합물은, 종양 세포에 특이적인 대사에 의해 생성되는 대사 산물이다. 대사 산물은, 생명 활동에 필수의 대사에 의해 생성되는 산물(1차 대사 산물)이어도 되고, 생명 활동에 반드시 필요하지는 않는 대사에 의해 생성되는 산물(2차 대사 산물)이어도 된다. 1차 대사 산물의 예로서는, 당, 단백질, 지질, 핵산 등을 들 수 있다. 2차 대사 산물의 예로서는, 항생 물질이나 색소 등을 들 수 있다. 대사 산물은, 생체 고분자여도 되고, 저분자여도 된다. 특정의 태양에 있어서, 생체 고분자는, 1종류 이상의 반복 단위로 이루어지는 분자량 대략 5000 이상의 분자이며, 예를 들어 다당류, 폴리펩티드, 및 폴리뉴클레오티드 등이 포함된다. 특정의 태양에 있어서, 저분자는, 분자량 대략 500 이하의 분자이며, 생체 내에 존재하는 화학 물질이다. 추가적인 태양에 있어서, 종양 조직 특이적 화합물은, 종양 세포에 있어서 특이적으로 생성되는 저분자 대사 산물이다(Eva Gottfried, Katrin Peter and Marina P. Kreutz, From Molecular to Modular Tumor Therapy (2010) 3 (2), 111-132). 추가적인 태양에 있어서, 종양 조직 특이적 화합물은, 종양 조직에 침윤하는 세포(예를 들어, 면역 세포 등)나 종양 조직 내에 존재하는 간질 세포(암간질 섬유아세포(CAF) 등)가 특이적으로 생성하는 대사 산물이다. 종양 조직에 침윤하는 면역 세포로서는, 수상 세포, 억제성 수상 세포, 제어성 T 세포(regulatory T cell), 피폐 T 세포(exhausted T cell), 골수 유래 억제 세포(myeloma derived suppressor cell, MDSC) 등이 예시된다. 추가적인 태양에 있어서, 종양 조직 내에 존재하는 세포(예를 들어, 종양 세포, 면역 세포, 간질 세포 등)가 생성하는 대사 산물로서, 그들 세포가 아포토시스나 네크로시스 등에 의해 세포사되었을 때에 세포 외로 방출되는 대사 산물도, 본 개시의 종양 조직 특이적 화합물에 포함될 수 있다.
종양 조직 특이적 화합물을 동정하기 위해, 트랜스크립톰 레벨에서의 해석(예를 들어, Dhanasekaran 등(Nature (2001) 412, 822-826), Lapointe 등(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2004) 101, 811-816), 또는 Perou 등(Nature (2000) 406, 747-752)이 예시된다) 혹은 프로테옴 레벨에서의 해석(예를 들어, Ahram 등(Mol. Carcinog. (2002) 33, 9-15), Hood 등(Mol. Cell. Proteomics (2005) 4, 1741-1753)) 외, 대사학적 프로파일링을 중심으로 하는 대사학(메타볼로믹스) 해석이, 적절히 사용된다. 즉, 피험 시료 중의 대사 산물을 동정하기 위해서, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 핵자기 공명(NMR)(Brindle 등(J. Mol. Recognit. (1997) 10, 182-187)), 질량분석법(GC/MS 및 LC/MS)(Gates 및 Sweeley(Clin. Chem. (1978) 24, 1663-1673)) 및 ELISA 등을 단독으로 및/또는 조합하여 이용하는 대사학적 프로파일링이 적절히 사용될 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 종양 조직 특이적 화합물은, 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드, 아미노산 및 그 대사 산물, 지질 및 그 대사 산물, 당 대사의 1차 대사 산물, 및 니코틴아마이드 및 그 대사 산물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 종양 조직 특이적 화합물은, 이하의 (1)∼(6)으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물이다:
(1) 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 이노신 등의 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드,
(2) 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산,
(3) 키누레닌, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 키누렌산 등의 아미노산의 대사 산물,
(4) 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사 산물,
(5) 락트산, 석신산, 시트르산 등의 해당계(解糖系) 또는 크렙스 회로의 1차 대사 산물, 및
(6) 1-메틸니코틴아마이드 등의 니코틴아마이드의 대사 산물.
(1) 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 이노신 등의 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드
종양 세포가 세포사하면, 세포 내의 대량의 ATP가 세포 외로 누출됨이 알려져 있다. 그 때문에, 종양 조직에 있어서의 ATP 농도는 정상 조직과 비교하여 현저하게 높다(PLoS One.(2008) 3, e2599). AMP는 세포외-5'-뉴클레오티다제(eco-5'-nucleotidase)(CD73)와 같은 세포 표면의 효소에 의해 대사된다(Resta 및 Thompson(Immunol. Rev. (1998) 161, 95-109) 및 Sadej 등(Melanoma Res. (2006) 16, 213-222)). 아데노신은 저농도로 세포외 환경에 구성적으로 존재하는 퓨린 뉴클레오티드이지만, 고형 종양에서 발견되는 저산소 조직에서는 세포외 아데노신 농도의 현저한 증가가 보고되고 있다(Blay 및 Hoskin(Cancer Res. (1997) 57, 2602-2605)). CD73은 종양 및 면역 세포의 표면에 발현하고 있고(Kobie 등(J. Immunol. (2006) 177, 6780-6786)), 유방암(Canbolat 등(Breast Cancer Res. Treat. (1996) 37, 189-193)), 위암(Durak 등(Cancer Lett. (1994) 84, 199-202)), 췌장암(Flocke 및 Mannherz(Biochim. Biophys. Acta (1991) 1076, 273-281)) 및 글리오블라스토마(Bardot 등(Br. J. Cancer (1994) 70, 212-218))에 있어서 활성의 상승이 발견되고 있다. 종양 조직에 있어서의 아데노신의 축적은, 세포질의 5'-뉴클레오티다제에 의해 AMP의 탈인산화가 증가하는 것에 기인하고 있을 가능성이 제창되고 있다(Headrick 및 Willis(Biochem. J. (1989) 261, 541-550)). 더욱이 종양 조직에 침윤하고 있는 제어성 T 세포도 ATP 분해 효소를 발현하고 있어, 아데노신을 산생하고 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(35), 13132-13137, Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). 산생된 아데노신은, A2A 리셉터 등의 아데노신 리셉터를 개재시켜 종양 조직을 면역 억제적인 환경으로 하고 있다고 생각되고 있다(Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). 이상으로부터, 퓨린 뉴클레오티드의 대사에 의해 종양 조직에 있어서 고농도로 축적하고 있다고 생각되는 ATP, ADP, AMP, 또는 아데노신 등을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물의 예로서 들 수 있다. 더욱이 아데노신은, adenosine deaminase에 의해 이노신으로 분해되기 때문에, 이노신이 고농도로 축적된다.
특정의 태양에 있어서, 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드는, 아데노신 함유 화합물을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 아데노신 함유 화합물로서는, 예를 들어, 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 환상 아데노신 1인산(cAMP), 데옥시아데노신(dADO), 데옥시아데노신 3인산(dATP), 데옥시아데노신 2인산(dADP), 데옥시아데노신 1인산(dAMP), 아데노신 γ싸이오3인산(ATPγS) 등을 들 수 있다. 다른 태양에 있어서, 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드는, 아데노신의 대사 산물인 이노신을 포함한다.
더욱이, 특정의 태양에 있어서, 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드에는, ADPbetaS(Sigma사) 등, 시판되고 있는 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드도 포함된다.
(2) 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산
종양 세포에서는, 생체 내에 있어서의 질소 운반체로서 작용하는 글루타민의 세포 내로의 취입 속도가 상승되어 있어, 이러한 글루타민의 취입과 그 결과 일어나는 글루타민산 및 락트산으로의 변환(글루타민 분해(glutaminolysis))은, 종양 세포의 특징이라고 생각되고 있다(Mazurek 및 Eigenbrodt(Anticancer Res. (2003) 23, 1149-1154, 및 Mazurek 등(J. Cell. Physiol. (1999) 181, 136-146)). 암환자에서는, 혈장 중의 글루타민 레벨이 감소하고 있는 한편, 글루타민산 농도가 증대하고 있고(Droge 등(Immunobiology (1987) 174, 473-479)), 또한, 폐암 조직의 13C 방사 표지된 글루코스의 대사 연구에 의해, 13C 표지 석신산, 13C 표지 알라닌, 13C 표지 글루타민산, 및 13C 표지 시트르산의 농도간에 상관이 관찰되었다. 이상으로부터, 글루타민 분해 등에 의해 종양 조직에 있어서 고농도로 축적하고 있다고 생각되는 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물의 예로서 들 수 있다.
(3) 키누레닌, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 키누렌산 등의 아미노산의 대사 산물
인돌아민 2,3-다이옥시제나제(IDO)는 멜라노마, 결장암, 및 신장암 등의 많은 암에서 고발현하고 있는 트립토판 대사 효소이며(Uyttenhove 등(Nat. Med. (2003) 9, 1269-1274)), IDO는 트립토판의 키누레닌으로의 변환을 촉매한다. 또한, IDO를 발현하지 않는 글리오마에서는 간장의 트립토판 2,3-다이옥시제나제(TDO)에 의해, 트립토판으로부터 키누레닌이 생성된다(Opitz 등(Nature (2011) 478(7368), 197-203)). 또한 IDO는 종양 조직에 침윤하고 있는 수상 세포에도 발현하고 있어, 수상 세포도 키누레닌을 산생한다(J. Immunol. (2008) 181, 5396-5404). 또한, IDO는 종양 조직의 골수 유래 억제 세포(MDSC)에도 발현하고 있어, MDSC도 키누레닌을 산생한다(Yu 등(J. Immunol. (2013) 190, 3783-3797)). 키누레닌은 키누레니다제에 의해 안트란일산으로, 및 키누레닌 3-하이드록시라제에 의해 3-하이드록시키누레닌으로 변환된다. 안트란일산, 및 3-하이드록시키누레닌은 함께 NAD의 전구체가 되는 3-하이드록시안트란일산으로 변환된다. 키누레닌은 키누레닌아미노트랜스페라제에 의해 키누렌산으로 변환된다. 이상으로부터, 키누레닌, 및 그 대사 산물인, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 및 키누렌산 등을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물, 특히 종양 세포 특이적 대사 산물의 예로서 들 수 있다.
(4) 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2) 등의 아라키돈산의 대사 산물
프로스타글란딘 E2(PGE2)는 결장암 세포의 증식을 촉진하고, 그 아포토시스를 억제한다(Sheng 등(Cancer Res. (1998) 58, 362-366)). PGE2 합성 효소 중, COX-1은 거의 모든 조직에 있어서 구성적으로 발현하고 있는 데 반해, COX-2는 종양에 있어서 어떤 종의 염증성 사이토카인 및 암 유전자에 의해 유도됨이 주로 발견되고 있다(Warner 및 Mitchell(FASEB J. (2004) 18, 790-804)). COX-2의 과잉 발현은 유방암의 예후의 나쁨(Denkert 등(Clin. Breast Cancer (2004) 4, 428-433)), 및 난소암의 급속한 질환의 진행(Denker 등(Mod. Pathol. (2006) 19, 1261-1269))과 관련성이 있음도 보고되어 있다. 또한 종양 조직에 침윤하고 있는 제어성 T 세포도 PGE2를 산생하고 있다(Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). 이상으로부터, PGE2 등의 아라키돈산의 대사 산물을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물, 특히 종양 세포 특이적 대사 산물이나 종양 조직에 침윤하고 있는 면역 세포 특이적 대사 산물의 예로서 들 수 있다. PGE2 이외에도, 트롬복세인 A2(TXA2)가 대장암 등의 종양 조직에서 산생이 항진하고 있다(J. Lab. Clin. Med. (1993) 122, 518-523).
(5) 락트산, 석신산, 시트르산 등의 해당계 또는 크렙스 회로의 1차 대사 산물
피루브산 키나제, 헥소키나제, 및 락트산 탈수소산소(LDH) 등의 해당계(Embden-Myerhof 경로) 효소의 상방 조절(업 규제)로서 특징지을 수 있는 해당계 표현형은, Warburg 효과로서 고형 종양의 특징임이 종래부터 알려져 있다. 해당계의 최종 산물인 락트산, 크렙스 회로에 의해 생성되는 석신산 및 시트르산이, 종양 조직에 있어서 축적하고 있음이 알려져 있다(Teresa 등(Mol. Cancer (2009) 8, 41-59)). 이상으로부터, 해당계에 의해 생성되는 1차 대사 산물인, 락트산, 석신산, 시트르산 등을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물, 특히 종양 세포 특이적 대사 산물의 예로서 들 수 있다. 또한, 세포사에 의해 세포 내에 고농도로 존재하는 석신산이 세포 외로 누출됨이 알려져 있다(Nature Immunology, (2008) 9, 1261-1269). 그 때문에, 세포사가 빈번하게 일어나고 있는 종양 조직에 있어서, 석신산의 농도가 상승되어 있다고 생각된다.
(6) 1-메틸니코틴아마이드 등의 니코틴아마이드의 대사 산물
복수의 인간 종양 조직에 있어서, 니코틴아마이드 N-메틸트랜스페라제가 고발현하고 있음이 알려져 있다. 본 효소에 의한 니코틴아마이드의 안정적인 대사 산물인 1-메틸니코틴아마이드는, 종양 세포의 세포 외로 분비됨이 알려져 있다(Yamada 등(J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2010) 56, 83-86)). 이상으로부터, 니코틴아마이드의 대사에 의해 종양 조직에 있어서 고농도로 축적하고 있다고 생각되는 1-메틸니코틴아마이드 등을, 본 개시에서 사용되는 종양 조직 특이적 화합물의 예로서 들 수 있다.
본 개시의 「항원 결합 분자」는 「항원 결합 도메인」을 포함한다. 「항원 결합 도메인」은, 목적으로 하는 항원에 결합하는 한, 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 도메인으로서는, 예를 들어, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역, 생체 내의 다양한 세포막 단백에 포함되는 35 아미노산 정도의 모듈(A 도메인)을 포함하는 Avimer(국제 공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 fibronectin 중의 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(국제 공개 WO2002/032925), Protein A의 58 아미노산으로 이루어지는 IgG 결합 도메인을 scaffold로 하는 Affibody(국제 공개 WO1995/001937), 33 아미노산의 반복 서열인 안키린 반복(ankyrin repeat: AR)을 골격으로서 포함하는 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제 공개 WO2002/020565), 호중구 젤라티나제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린을 골격으로서 포함하는 Anticalin(국제 공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템에 있어서 기능하는 단백질로, 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈을 포함하는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))(국제 공개 WO2008/016854) 등을 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 도메인은, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 도메인으로서는, 예를 들어 scFv(single chain Fv), 단쇄 항체(single chain antibody), Fv, scFv2(single chain Fv2), Fab, 또는 F(ab')2 등을 들 수 있다.
［HVR 및 가변 영역］
일 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및, (c) 서열 번호: 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택되는, 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모든 VH HVR 서열을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 또는 A549/B167의 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자는, A375/B167에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다. 추가의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, A375/B167을 포함하는 항CD137 항체이다. 다른 바람직한 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자는, A551/B379에 포함되는 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3의 아미노산 서열과 동일한 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3을 포함하는 항CD137 항체이다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; 및 (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 21, 22, 23, 24, 및 25로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 번호: 27, 28 및 29로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는, 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모든 VL HVR 서열을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 21, 22, 23, 24, 및 25로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (c) 서열 번호: 27, 28 및 29로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (c) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (a) VH 도메인으로서, (i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (ii) 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및, (iii) 서열 번호: 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택되는, 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모든 VH HVR 서열을 포함하는, VH 도메인과; (b) VL 도메인으로서, (i) 서열 번호: 21, 22, 23, 24, 및 25로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (iii) 서열 번호: 27, 28 및 29로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는, 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모든 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; 및 (f) 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1과; (b) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2와; (c) 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3과; (d) 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (e) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (f) 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
특정의 태양에 있어서, 이하의 HVR 포지션의 장소에서, 전술한 항CD137 항체의 임의의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환되고 있다:
-HVR-H2(서열 번호: 30)에 있어서: 포지션 5, 6, 7, 10, 13, 14, 및/또는 17
-HVR-H3(서열 번호: 31)에 있어서: 포지션 3, 및/또는 6
-HVR-L1(서열 번호: 32)에 있어서: 포지션 4, 5, 9, 및/또는 11
-HVR-L3(서열 번호: 33)에 있어서: 포지션 6, 7, 및/또는 8.
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 치환은, 보존적 치환이다. 특정의 태양에 있어서, 이하의 어느 1개 또는 복수의 치환이, 임의의 조합으로 행해져도 된다:
-HVR-H2(서열 번호: 8)에 있어서: K5H 또는 S; S6G; T7S; E10Y; D13E; S14Q; V17G 또는 L
-HVR-H3(서열 번호: 17)에 있어서: A3P, K 또는 I; F6E
-HVR-L1(서열 번호: 21)에 있어서: R4S; Y5T; Y9F; E11N
-HVR-L3(서열 번호: 27)에 있어서: E6P; H7A; Q8I
전술한 치환의 가능한 모든 조합은, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1 및 HVR-L3에 관해서 각각, 서열 번호 30, 31, 32 및 33의 컨센서스 서열에 포함된다.
전술한 태양의 임의의 것에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 인간화되어 있다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 HVR을 포함하고, 또한 추가로, 억셉터 인간 프레임워크(예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크)를 포함한다. 다른 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 HVR을 포함하고, 또한 추가로, 프레임워크(FR) 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 또는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다. 일 태양에 있어서, 중쇄 가변 영역의 FR1은 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함한다. 일 태양에 있어서, 경쇄 가변 영역의 FR1은 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하고, FR2는 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하고, FR3은 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하고, FR4는 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 서열 번호: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 또는 53의 아미노산 서열에 대해서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은, 참조 서열에 대해서, 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 당해 서열을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, CD137에 결합하는 능력을 유지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 서열 번호: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 또는 53에 있어서, 치환, 삽입, 및/또는 결실된다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 생긴다. 임의로, 항CD137 항체는, 서열 번호: 서열 번호: 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 또는 53에 있어서의 VH 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 어느 특정의 태양에서는, VH는, (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및, (c) 서열 번호: 17, 18, 19, 또는 20으로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택되는, 1개, 2개, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60의 아미노산 서열에 대해서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은, 참조 서열에 대해서, 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 당해 서열을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, CD137에 결합하는 능력을 유지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개 내지 10개의 아미노산이, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60에 있어서, 치환, 삽입, 및/또는 결실된다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 생긴다. 임의로, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 서열 번호: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60에 있어서의 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다. 어느 특정의 태양에서는, VL은, (a) 서열 번호: 21, 22, 23, 24, 및 25로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1과; (b) 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2와; (c) 서열 번호: 27, 28 및 29로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택되는, 1개, 2개, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 VH, 및 전술한 태양의 임의의 것에 있어서의 VL을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 43 및 서열 번호: 54의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 44 및 서열 번호: 55의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 45 및 서열 번호: 55 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 46 및 서열 번호: 54의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 47 및 서열 번호: 54의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 48 및 서열 번호: 56의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 49 및 서열 번호: 57의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 50 및 서열 번호: 58의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 51 및 서열 번호: 59의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 51 및 서열 번호: 60의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 52 및 서열 번호: 60의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 50 및 서열 번호: 59의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
· 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 각각 서열 번호: 53 및 서열 번호: 54의 VH 및 VL 서열을, 당해 서열의 번역 후 수식을 포함하는 것도 포함하여, 포함한다.
전술한 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 개시의 바람직한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 이들 HVR1, 2, 및 3의 아미노산 해열(解列)과, 서열 번호의 대응을 이하의 일람표에 나타낸다.
Figure pct00001
본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄 N말단의 아미노산이 글루타민인 경우, 당해 아미노산은 글루타민산으로 치환되어도 된다. 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항체의 중쇄 또는 경쇄 N말단의 아미노산이 글루타민산인 경우, 당해 아미노산은 글루타민으로 치환되어도 된다.
바람직한 일 태양에 있어서, 전술되는 HVR, 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 모두, 전술되는 저분자 화합물에 의존한 CD137에 대한 결합 활성을 갖는다.
［정상 영역］
다른 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 정상 영역을 포함한다. 정상 영역은, 중쇄 정상 영역(Fc 영역을 포함한다), 경쇄 정상 영역, 혹은 그 양자여도 된다. 추가적인 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, Fc 영역을 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 정상 영역은, 천연형 서열의 정상 영역이다. 천연형 항체에서 유래하는 예시적인 중쇄 정상 영역으로서, 예를 들어 인간 IgG1(서열 번호: 61, 62), 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 등의 중쇄 정상 영역을 들 수 있다. 또한, 천연형 항체에서 유래하는 예시적인 경쇄 정상 영역으로서, 예를 들어 인간 κ쇄, 인간 λ쇄(예를 들어 서열 번호: 63)를 들 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 「친정상 영역」 또는 「친Fc 영역」이란, 본 명세서에 기재된 아미노산 개변의 도입 전의 정상 영역 또는 Fc 영역을 가리킨다. 또한, 「친항원 결합 분자」란, 친정상 영역 또는 친Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자를 가리킨다. 몇 가지 태양에 있어서, 친Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역(혹은 천연형 항체의 Fc 영역)이다. 항체는, 예를 들어, IgA(IgA1, IgA2), IgD, IgE, IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), 및 IgM 등을 포함한다. 항체는, 인간 또는 원숭이(예를 들어, 필리핀원숭이, 히말라야원숭이, 마모셋, 침팬지, 또는 비비)에서 유래할 수 있다. 천연형 항체는, 천연에 존재하는 변이를 포함하고 있어도 된다. 유전자다형에 의한 IgG의 복수의 알로타이프 서열이, 「Sequences of proteins of immunological interest」, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있지만, 그 모두, 본 개시에 있어서 사용될 수 있다. 일 태양에 있어서, 친Fc 영역은, 서열 번호: 61, 62 또는 182의 인간 IgG1 중쇄 정상 영역에서 유래하는 Fc 영역이다.
일 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 천연형 서열의 Fc 영역 또는 친Fc 영역을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 등전점(pI)이 상승되어 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 변이 Fc 영역은, 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 아미노산 개변은, 친Fc 영역과 비교하여, 변이 Fc 영역의 등전점(pI)을 상승시킨다. 특정의 이론에 구속되지 않고, 생체액(예를 들어 혈장)의 pH는 중성의 pH 범위 내에 있다고 생각된다. 생체액에 있어서, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체의 알짜 양전하는, 상승된 pI에 기인하여 증가하고 있고, 그 결과, 당해 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이것에 의해, 아고니스트 항원 결합 분자(또는 항체), 혹은 항원에 결합한 아고니스트 항원 결합 분자(또는 항체), Fcγ 수용체 발현 세포 표면에 보다 가까워져, 항원 결합 분자 또는 항체의 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승될 수 있다. Fcγ 수용체에의 결합 활성이 CD137 아고니스트 활성에 기여하는 항CD137 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, pI를 상승시키는 아미노산 개변에 의해 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승된 항CD137 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체가, 당해 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 포함하지 않는 항CD137 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 보다 높은 CD137 아고니스트 활성을 나타내는 것이 가능하다.
본 개시에 있어서, pI는 이론 pI여도 실측 pI여도 된다. pI의 값은, 예를 들어, 당업자에게 공지의 등전점 분리법에 따라 측정할 수 있다. 이론 pI의 값은, 예를 들어, 유전자 및 아미노산의 서열 해석 소프트웨어(Genetyx 등)를 이용하여 산출할 수 있다. 그 때, 항체의 특성을 계산식에 반영해도 된다. 예를 들어, (i) 통상, 항체 내에 있어서 보존되고 있는 Cys는 다이설파이드 결합을 형성하고, 측쇄의 전하를 가지지 않는다. 그와 같은 Cys는 계산으로부터는 제외하고, 다이설파이드 결합을 형성하고 있지 않는 프리형의 Cys만을 계산에 더해도 된다. 또한, (ii) 항체에 관해서는, 번역 후 수식에 의해 하전 상태, 즉 등전점이 변화하는 경우가 있을 수 있다. 이와 같은 번역 후 수식을 고려하여, 다음과 같이 계산식을 개변해도 된다: (a) 중쇄의 N말단이 Q(글루타민)인 경우는, 파이로글루타밀화가 일어나는 것으로 하여, N말단의 아미노기는 계산으로부터 제외하고, (b) 중쇄의 C말단이 K(리신)인 경우는, 절단이 일어나는 것으로 하여, K(1잔기분)를 계산으로부터 제외하고, 및, (c) 일반적으로 보존되고 있는 개소의 C(시스테인)는 모두, 분자 내에서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는 것으로 하여, 이들 C의 측쇄는 계산으로부터 제외한다. 바람직한 일 태양에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)의 양방을 계산식에 반영해도 된다.
일 태양에 있어서, pI치는, 개변 전과 비교하여, 예를 들어 적어도 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 혹은 그 이상, 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 혹은 그 이상, 적어도 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 혹은 그 이상, 또는 적어도 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0 혹은 그 이상, 상승될 수 있다.
일 태양에 있어서, pI 상승에 관한 아미노산 개변, 및 항원 결합 분자 또는 항체의 pI를 상승시키기 위한 방법은, 본 명세서의 III. 조성물 및 방법(등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자)에 상술되어 있다. III. 조성물 및 방법(등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자)에 기재된 임의의 아미노산 개변 및 pI를 상승시키기 위한 방법을, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체에 적용 가능하다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 pI가 상승된 변이 Fc 영역을 갖고, 당해 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
추가적인 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는 pI가 상승된 변이 Fc 영역을 갖고, 당해 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 311, 343, 및 413으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 311, 343, 또는 413에 있어서의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 이하 (1)∼(3)의 어느 1개의 아미노산 개변을 포함하는, pI가 상승된 변이 Fc 영역을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다: EU 넘버링으로 표시되는, (1) 위치 311 및 343; (2) 위치 311 및 413; 및 (3) 위치 343 및 413. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 하기 표 2에 기재되는 아미노산 개변을 포함하는, 변이 Fc 영역을 포함한다.
Fc 영역의 pI를 상승시키는 아미노산 개변
Figure pct00002
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 천연형 서열의 Fc 영역에 아미노산 개변을 가하여 제작된 변이 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 변이 Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역 또는 친Fc 영역에 비해, FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 상승되어 있다. 바람직하게는, 변이 Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역 또는 친Fc 영역에 비해, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 상승되어 있다. FcγRIIb에 대한 결합 활성이 상승된 변이 Fc 영역을 포함하는 항CD137 항체는, 천연형 서열의 Fc 영역을 포함하는 항CD137 항체와 비교하여, 아고니스트 활성이 상승됨이 보고되어 있다. 일 태양에 있어서, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 상승되는 아미노산 개변은, 예를 들어, WO2012/115241, WO2014/030728, WO2014/163101 및/또는 WO2017/104783에 기재되어 있는 아미노산 개변을 이용해도 된다. 바람직한 일 태양에 있어서, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 상승시키는 개변은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 234, 235, 236, 237, 238, 264, 268, 295, 326, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 위치에 있어서의 아미노산 개변이다.
「Fcγ 수용체」(본 명세서에 있어서, Fcγ 수용체, FcγR, 또는 FcgR이라고 칭한다)이란, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 모노클로날 항체의 Fc 영역에 결합할 수 있는 수용체를 가리키고, Fcγ 수용체 유전자에 코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 멤버를 사실상 의미한다. 인간에서는, 이 패밀리에게는, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 아이소폼 FcγRIIa(알로타이프 H131(H형)와 R131(R형)을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1과 FcγRIIb-2를 포함한다), 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및, 아이소폼 FcγRIIIa(알로타이프 V158과 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타이프 FcγRIIIb-NA1과 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 더욱이, 미발현의 모든 인간 FcγR, FcγR 아이소폼 또는 알로타이프가 포함되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. FcγRIIb1 및 FcγRIIb2는, 인간 FcγRIIb의 스플라이싱 변이체로서 보고되어 있다. 더욱이, FcγRIIb3이라고 칭하는 스플라이싱 변이체가 보고되어 있다(J Exp Med, 1989, 170: 1369-1385). 이들 스플라이싱 변이체에 더하여, 인간 FcγRIIb는, NCBI에 등록된 AAI46679.1, 및 NCBI에 등록된 모든 스플라이싱 변이체, NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, 및 NP_003992.3을 포함한다. 더욱이, 인간 FcγRIIb는, FcγRIIb에 더하여, 과거에 보고된 모든 유전적다형(Arthritis Rheum. 48: 3242-3252(2003); Kono et al., Hum. Mol. Genet. 14: 2881-2892(2005); 및 Kyogoju et al., Arthritis Rheum. 46: 1242-1254(2002))과, 장래 보고될 것인 모든 유전적다형을 포함한다.
FcγRIIa에는 2개의 알로타이프가 존재하고, 한쪽은, FcγRIIa의 위치 131의 아미노산이 히스티딘이며(H형), 다른 쪽은, 위치 131의 아미노산이 아르기닌으로 치환되어 있다(R형)(Warrmerdam, J. Exp. Med. 172: 19-25(1990)).
FcγR은, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이 유래의 FcγR을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니고, 임의의 생물체에서 유래해도 된다. 마우스 FcγR은, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및, 임의의 마우스 FcγR 또는 FcγR 아이소폼을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 이하 (1)∼(8)의 어느 1개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 상승된 변이 Fc 영역을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다: EU 넘버링으로 표시되는, (1) 위치 234, 238, 264, 및 330; (2) 위치 234, 238, 및 330; (3) 위치 234, 237, 238, 및 330; (4) 위치 236, 268, 및 330; (5) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 및 330;
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 하기 표 3에 기재되는 아미노산 개변을 포함하는, 변이 Fc 영역을 포함한다. 추가의 일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 표 2(Fc의 pI 상승을 수반하는 아미노산 개변)에 기재되는 아미노산 개변에 더하여, 추가로 하기 표 3에 기재되는 어느 하나의 아미노산 개변의 조합을 포함하는, 변이 Fc 영역을 포함한다.
Fc 영역의 FcγRIIb 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변
Figure pct00003
일 태양에 있어서, 본 개시는, 적어도 하나의 아미노산이 개변된 개변 Fc 영역을 포함하고, 당해 개변 Fc 영역의 FcgammaRIIb에 대한 결합 활성이, 참조 Fc 영역과 같거나 그보다 높은, 개변 Fc 영역을 제공한다. 일 태양에 있어서, 참조 Fc 영역은, 상기 표 3에 기재되는 어느 하나의 아미노산 개변의 조합을 포함하는 Fc 영역이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 Fc 영역은, 중쇄 정상 영역인 TT14(서열 번호: 149), TT16(서열 번호: 150), MY201(서열 번호: 153) 또는 MY518(서열 번호: 154)에 포함되는 Fc 영역이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 참조 Fc 영역은, 중쇄 정상 영역인 MY201(서열 번호: 153) 또는 MY518(서열 번호: 154)에 포함되는 Fc 영역이다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb) 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 단리된 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 기재되는 변이 Fc 영역은, 친Fc 영역에 있어서 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함한다. 전술한 대로, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이로부터, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)에 대한 결합 활성이 아고니스트 활성에 기여하는 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)를 상승시키는 아미노산 개변과 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 조합하는 것에 의해, 당해 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성을 상승시키는 것이 가능하다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 전술한, Fcγ 수용체(예를 들어 FcγRIIb)에 대한 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변, 및 등전점(pI)을 상승시키는 아미노산 개변의 양방을 포함하는, 변이 Fc 영역을 포함한다. 전술한 대로, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이로부터, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)에 대한 결합 활성이 CD137 아고니스트 활성에 기여하는 항CD137 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)를 상승시키는 아미노산 개변과 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 조합하는 것에 의해, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성을 상승시키는 것이 가능하다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, (a) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 234, 235, 236, 237, 238, 264, 268, 295, 326, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변과, (b) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 311, 343, 및 413으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 위치의 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함하는 적어도 3개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 이하 (1)∼(26)의 어느 1개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: EU 넘버링으로 표시되는,
(1) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 343, 및 413;
(2) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 343, 및 413;
(3) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 330, 343, 및 413;
(4) 위치 234, 238, 264, 330, 343, 및 413;
(5) 위치 234, 237, 238, 250, 307, 330, 343, 및 413;
(6) 위치 234, 237, 238, 330, 343, 및 413;
(7) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 311, 및 343;
(8) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 330, 311, 및 343;
(9) 위치 234, 238, 264, 330, 311, 및 343;
(10) 위치 234, 237, 238, 250, 307, 330, 311, 및 343;
(11) 위치 234, 237, 238, 330, 311, 및 343;
(12) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 343;
(13) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 343;
(14) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 413;
(15) 위치 214, 236, 268, 330, 및 343;
(16) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 및 343;
(17) 위치 214, 236, 268, 330, 및 413;
(18) 위치 214, 236, 268, 330, 343, 및 413;
(19) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 343, 및 413;
(20) 위치 214, 236, 268, 330, 및 311;
(21) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 및 311;
(22) 위치 214, 236, 268, 330, 311, 및 343;
(23) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 311, 및 343;
(24) 위치 214, 236, 268, 330, 311, 및 413;
(25) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 311, 및 413;
(26) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 311.
일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 하기 표 4에 기재되는 어느 1개의 아미노산 개변의 조합을 포함한다.
Figure pct00004
일 태양에 있어서, 상기 표 4에 기재되는 어느 하나의 아미노산 개변의 조합을 포함하는 변이 Fc 영역은, EU 넘버링에 기초하는 447위의 아미노산이 결실되어 있다. 바람직한 일 태양에 있어서, 상기 표 4에 기재되는 어느 하나의 아미노산 개변의 조합을 포함하는 변이 Fc 영역은, EU 넘버링에 기초하는 446위와 447위의 아미노산이 결실되어 있다.
상기에서 예시되는 개변 외에, 예를 들어 WO2013/047752, WO2013/125667, WO2014/030728, WO2014/163101, 또는 WO2017104783에 기재되거나 또는 시사되는, 친Fc 영역과 비교하여 FcγRIIb를 포함하는 FcγR에의 결합 활성을 상승시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 및 예를 들어 WO2017/104783, WO2017/046994에 기재되거나 또는 시사되는, 친Fc 영역과 비교하여 pI를 상승시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 및 그들의 아미노산 개변의 조합이 이용될 수 있음이, 당업자에게 이해될 것이다.
더욱이, 다른 목적을 위해서 실시되는 아미노산 개변을, 본 명세서에 기재된 변이 Fc 영역에 있어서 조합할 수 있다. 예를 들어, FcRn 결합 활성을 상승시키는 아미노산 치환(Hinton et al., J. Immunol. 176(1): 346-356 (2006); Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem. 281(33): 23514-23524 (2006); Petkova et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769(2006); Zalevsky et al., Nat. Biotechnol. 28(2): 157-159 (2010); WO2006/019447; WO2006/053301; 및 WO2009/086320), 및, 항체의 헤테로제니티 또는 안정성을 개선하기 위한 아미노산 치환(WO2009/041613)을 가해도 된다. 혹은, WO2011/122011, WO2012/132067, WO2013/046704, 또는 WO2013/180201에 기재되는 항원 클리어런스를 촉진하는 특성을 갖는 폴리펩티드, WO2013/180200에 기재되는 표적 조직에의 특이적 결합 특성을 갖는 폴리펩티드, WO2009/125825, WO2012/073992, 또는 WO2013/047752에 기재되는 복수의 항원 분자에 대해서 반복하여 결합하는 특성을 갖는 폴리펩티드를, 본 명세서에 기재된 변이 Fc 영역과 조합할 수 있다. 혹은, 다른 항원에 대한 결합 활성을 부여할 목적으로, EP1752471 및 EP1772465에 개시된 아미노산 개변을, 본 명세서에 기재된 변이 Fc 영역의 CH3에 있어서 조합해도 된다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 서열 번호: 64∼85로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 서열을 포함하는, 중쇄 정상 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 서열 번호: 75 또는 82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역을 포함한다.
바람직한 일 태양에 있어서, 전술되는 변이 Fc 영역을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 전술되는 저분자 화합물에 의존한 CD137에 대한 결합 활성을 갖는다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 다음의 가변 영역 및 정상 영역을 포함한다: 전술한 HVR, 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 가변 영역과; 전술한 변이 Fc 영역. 바람직한 일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 표 52에 기재되는 항체로부터 선택되는 어느 하나의 항CD137 항체여도 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 저분자 화합물의 존재하(예를 들어, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하)에서, 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 동일한 CD137의 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 및/또는 A549/B167을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 항원(예를 들어, CD137)과 저분자 화합물(예를 들어, ATP)의 복합체에 의해 형성되는 에피토프를 인식한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 저분자 화합물의 존재하(예를 들어, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하)에서, CD137에의 결합에 관해서, 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 경합하는 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, CD137에의 결합 위치에 관해서, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 및/또는 A549/B167을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 경합한다.
본 개시의 추가적인 국면에 있어서, 전술한 태양의 임의의 것에 의한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 포함하는, 모노클로날 항체이다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항체는, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아보디, 또는 F(ab')2 단편 등의, 항체 단편이다. 다른 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 완전 IgG1 항체나, 본 명세서에서 정의된 다른 항체 클래스 또는 아이소타입의, 전장 항체이다.
추가적인 국면에 있어서, 전술한 태양의 임의의 것에 의한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 단독 또는 조합으로, 이하의 항목 1∼7에 기재된 임의의 특징을 거둬들여도 된다.
1. 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성
특정의 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, CD137 아고니스트 활성을 갖는다. CD137 시그널 전달은, NK 세포의 IFN-γ 분비 및 증식을 자극할 뿐만 아니라(Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998), 그들의 생존의 증가 및 사이토카인의 분비 및 공자극 분자의 상방 제어에 의해 나타나는 DC 활성화를 촉진함이 알려져 있다(Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002). 그러나, CD137은, T 세포의 CD4+서브세트 및 CD8+서브세트의 양방에 있어서 TCR 유도 활성화를 조절하는 공자극 분자로서 가장 잘 특징지어진다. TCR 유발과 조합하여, 항CD137 아고니스트 항체는, T 세포의 증식을 증강하고, 림포카인 분비를 자극하고, 활성화 유도 세포사에 대한 T 림프구의 감수성을 저하시킨다(Snell et al., 2011에 총설된다). 이들 현상 중, T 세포 상에서의 CD137 시그널 전달 후에 관찰되는 생리 현상은, CD137 시그널에 의해 활성화되는 하류 시그널인 TRAF2, TRAF1, 특히 NF-kappaB, JNK, Erk, Akt, survivin, Bcl-XL, 및/또는 Bcl-2 등에 의해 매개된다(Ward-Kavanagh 등, Immunity, 44권: 1005페이지(2016년)).
일 태양에 있어서, 「항CD137 아고니스트 항원 결합 분자」 또는 「항CD137 아고니스트 항체」는, CD137에 결합하는 것에 의해, CD137 시그널을 전달하여, NK 세포의 IFN-γ 분비, 증식, 생존 증가; 사이토카인의 분비 및 공자극 분자의 상방 제어에 의해 나타나는 DC 활성화; TCR 유도; T 세포 증식; 및/또는 림포카인 분비를 유의하게 유도 또는 증강하는 항원 결합 분자 또는 항체이다. 다른 일 태양에 있어서, 「항CD137 아고니스트 항원 결합 분자」 또는 「항CD137 아고니스트 항체」는 T 세포 상의 CD137에 결합하는 것에 의해 CD137 시그널을 전달하여, 당해 T 세포의 NF-kappaB의 활성화를 유의하게 유도하는 항원 결합 분자 또는 항체이다. 또한, 항원 결합 분자 또는 항체가 「CD137 아고니스트 활성을 나타낸다」란, 당해 항원 결합 분자 또는 항체가, CD137에 결합하는 것에 의해, 전술한 생리 현상 중 어느 것인가가 관찰되는 것을 말한다. CD137 아고니스트 활성의 측정 방법에 대해서는, 후술하는 「C. 측정법(어세이)」의 항에서 상술된다.
특정의 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물에 의존한 CD137 아고니스트 활성을 갖는다. 비한정의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 CD137 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137의 CD137 아고니스트 활성과 비교하여 높다. 다른 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 고농도 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137 아고니스트 활성이, 저농도의 당해 저분자 화합물 화합물의 존재하에서의 CD137 아고니스트 활성과 비교하여 높다. 추가적인 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물 화합물의 존재하에서의 CD137 아고니스트 활성이, 당해 저분자 화합물 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성의, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 상, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다.
저분자 화합물의 농도로서는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 결합 활성에 차이가 검출되는 한, 임의의 농도를 선택할 수 있다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 세포 표면 상의 CD137에 결합하는 것에 의해, CD137 시그널을 전달한다. 따라서, 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물에 의존한 CD137 아고니스트 활성을 가짐이 당업자에게 이해될 것이다. 그러나, 다른 한편으로, 결합 활성의 측정과, 아고니스트 활성의 측정에서는 측정법이 상이하므로, 결합 활성에 대해 차이가 검출되는 저분자 화합물의 농도와, 아고니스트 활성에 대해 차이가 검출되는 저분자 화합물 농도는, 상이할 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다(예를 들어, 10μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 결합 활성의 2배 이상인 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서, 10μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(측정치)이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(측정치)의 2배 미만인 경우가 있다). 또한, CD137 아고니스트 활성의 측정법(C. 측정법(어세이) 참조)에 의해, 아고니스트 활성의 판단이 상이할 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는, 또는 당해 저분자 화합물의 비존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성이 (당해 저분자 화합물의 존재하와 비교하여) 낮다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성이, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 a) 아고니스트 활성 측정법(PBMC)에 있어서 평가되는 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (i) 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성이 (당해 저분자 화합물의 존재하와 비교하여) 낮다. 추가의 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (i) 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성이, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서 평가되는 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타내고, 또한, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않거나, 아고니스트 활성이 (당해 저분자 화합물의 존재하와 비교하여) 낮다. 리포터 유전자 어세이에 있어서의 항체 농도는 임의로 선택할 수 있고, 예를 들어, 항체의 최종 농도는, 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10μg/mL이다. 바람직한 일 태양에 있어서, 항체의 최종 농도는, 0.1μg/mL 또는 1μg/mL이다.
일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 0.1μg/mL로 하는 경우, (i) 10μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 0.1μg/mL로 하는 경우, (i) 100μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 0.1μg/mL로 하는 경우, (i) 250μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 상기 몇 가지 태양에 있어서, 더욱이, 0.1μg/mL의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 비존재하에 있어서, CD137 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는다.
일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 1μg/mL로 하는 경우, (i) 10μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 0.1μg/mL로 하는 경우, (i) 100μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 일 태양에 있어서, C. 측정법(어세이)에서 상술되는 b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)에 있어서, 항체의 최종 농도를 0.1μg/mL로 하는 경우, (i) 250μM의 저분자 화합물 존재하에서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)은, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높다. 상기 몇 가지 태양에 있어서, 더욱이, 1μg/mL의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 비존재하에 있어서, CD137 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는다.
2. 항체 단편
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체 단편이다. 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편, 및 후술하는 다른 단편을 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)을 참조할 것. scFv 단편의 총설로서 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조할 것. 솔베이지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 인 비보(in vivo)에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 것.
다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되는, 항원 결합 부위를 2개 수반하는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404,097호; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참조. 트라이아보디(triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1참조).
항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지 수법에 의해 만들 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 키메라 항체이다. 특정의 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 일례에서는, 키메라 항체는, 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이 등의 비인간 영장류에게 유래하는 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가적인 예에 있어서, 키메라 항체는, 친항체의 것으로부터 클래스 또는 서브클래스가 변경된 「클래스 스위치」 항체이다. 키메라 항체는, 그의 항원 결합 단편도 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 키메라 항체는, 인간화 항체이다. 전형적으로는, 비인간 항체는, 친비인간 항체의 특이성 및 어피니티를 유지한 채로 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해서, 인간화된다. 통상, 인간화 항체는 1개 또는 복수의 가변 도메인을 포함하고, 당해 가변 도메인 중, HVR(예를 들어 CDR(또는 그의 부분))은 비인간 항체에서 유래하고, FR(또는 그의 부분)는 인간 항체 서열에서 유래한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 정상 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 인간화 항체 중의 몇 개의 FR 잔기는, 예를 들어, 항체의 특이성 또는 어피니티를 회복 또는 개선하기 위해서, 비인간 항체(예를 들어, HVR 잔기의 유래가 된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환되어 있다.
인간화 항체 및 그의 제작 방법은, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 있어서 총설되어 있고, 또한, 예를 들어, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역 (specificity determining region: SDR) 그래프팅을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (리서페이싱을 기재); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (FR 셔플링을 기재); 및, Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링을 위한 「가이드 셀렉션」 어프로치를 기재)에 있어서, 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 이들로 한정되는 것은 아니지만: 「베스트 피트」법(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조)을 이용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정의 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 프레임워크 영역(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙(체세포 변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 세포계 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 및, FR 라이브러리의 스크리닝에서 유래하는 프레임워크 영역(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조)을 포함한다.
4. 인간 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 인간 항체이다. 인간 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 여러 가지 수법에 따라 제조될 수 있다. 인간 항체는, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개설되어 있다.
인간 항체는, 항원 챌린지(부하)에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수반하는 완전 항체를 산생하도록 개변된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여하는 것에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 동물은, 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분을 포함하고, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분은, 내인성의 면역글로불린 유전자자리를 치환하거나, 또는, 염색체 외에 혹은 당해 동물의 염색체 내에 랜덤으로 거둬들여진 상태로 존재한다. 그와 같은 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성의 면역글로불린 유전자자리는, 통상 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법의 총설로서, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조할 것. 또한, 예를 들어, XENOMOUSE(상표) 기술을 기재한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제7,041,870호; 및, VELOCIMOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허출원공개 제2007/0061900호를, 아울러 참조할 것. 이와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 다른 인간 정상 영역과 조합하는 등을 하여, 추가로 수식되어도 된다.
인간 항체는, 하이브리도마에 기초한 방법으로도 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한, 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주는, 이미 기술되어 있다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 개재시켜 생성된 인간 항체도, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 진술되어 있다. 추가적인 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재), 및, Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)도, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는, 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써도 생성할 수 있다. 이와 같은 가변 도메인 서열은, 다음에 원하는 인간 정상 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 수법을, 이하에 기술한다.
5. 라이브러리 유래 항체
본 개시의 항체는, 원하는 1개 또는 복수의 활성을 수반하는 항체에 대해 컴비너토리얼 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리해도 된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리의 생성이나, 원하는 결합 특성을 구비하는 항체에 대해 그와 같은 라이브러리를 스크리닝하기 위한, 다양한 방법이 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있다. 그와 같은 방법은, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에 있어서 총설되어 있고, 더욱이, 예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기재되어 있다.
특정의 파지 디스플레이법에 있어서, VH 및 VL 유전자의 레퍼터리는, 폴리메라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 따로따로 클로닝되어, 무작위로 파지 라이브러리 중에서 재결합되고, 당해 파지 라이브러리는, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 진술되어 있는 바와 같이 하여, 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는, 전형적으로는, 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서의 어느 것인가로, 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 구축하는 것을 필요로 하지 않고서, 면역원에 대한 고(高)어피니티 항체를 제공한다. 혹은, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재되는 바와 같이, 나이브 레퍼터리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 면역화하지 않고서, 광범위한 비자기 및 자기 항원에의 항체의 단일한 공급원을 제공할 수도 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재되는 바와 같이, 줄기세포로부터 재편성 전의 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 초가변 CDR3 영역을 코딩하고 또한 인비트로(in vitro)로 재구성을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하는 것에 의해, 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허문헌은, 예를 들어: 미국 특허 제5,750,373호, 및 미국 특허출원공개 제2005/0079574호, 2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은, 본 명세서에서는 인간 항체 또는 인간 항체 단편이라고 간주한다.
본 개시의, 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체는, 항원 결합 분자의 라이브러리로부터 스크리닝하는 것에 의해 선택해도 된다. 라이브러리로서는, 상기의 컴비너토리얼 라이브러리를 이용해도 된다. 또한, 항원 결합 분자의 라이브러리는, 항원 결합 분자의 레퍼터리에 바이어스가 걸쳐 있지 않은 라이브러리(나이브 라이브러리)여도 되고, 바이어스가 걸쳐져 있는 라이브러리여도 된다. 후자의 라이브러리의 예로서는, 소정의 화합물에 대한 결합 활성이 미리 부여된 항원 결합 분자의 라이브러리를 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 라이브러리는, 소정의 화합물에 대한 결합 활성을 부여하기 위한 아미노산 개변이 미리 도입되어 있는 항원 결합 분자의 라이브러리이다. 그와 같은 라이브러리의 예로서, 예를 들어, 국제 공개 WO2015/083764에 기재된 라이브러리가 참조될 수 있다.
6. 다중 특이성 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체)이다. 다중 특이성 항체는, 적어도 2개의 상이한 부위에 결합 특이성을 갖는, 모노클로날 항체이다. 특정의 태양에 있어서, 결합 특이성 중 1개는, CD137에 대한 것이고, 다른 1개는 다른 임의의 항원에 대한 것이다. 특정의 태양에 있어서, 이중 특이성 항체는, CD137의 상이한 2개의 에피토프에 결합해도 된다. 이중 특이성 항체는, CD137을 발현하는 세포에 세포 상해제를 국재화(局在化)하기 위해서 사용되어도 된다. 이중 특이성 항체는, 전장 항체로서 또는 항체 단편으로서 조제될 수 있다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 한쪽의 Arm이 저분자 화합물 의존적인 CD137 결합 활성을 갖고, 다른 쪽의 Arm이 CD137과는 상이한 항원에 결합하는, 이중 특이성 항체이다. CD137과 상이한 「항원」은, 그 구조는 특정의 구조로 한정되지 않는다. 다른 의미에서는, 항원은 무기물일 수도 있고 유기물일 수도 있다. 예시적인 항원이, 본 명세서(예를 들어, 「IV. 조성물 및 방법(화합물의 농도에 응하여 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자), B. 항원」)에 있어서 개시된다. 일 태양에 있어서, 항원으로서는 암조직 또는 염증성 조직에 있어서의 암 세포·면역 세포·스트로마 세포 등에 발현하는 항원이 바람직하다.
다중 특이성 항체를 제작하기 위한 수법은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 페어의 재조합 공발현(Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), WO93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 참조), 및 knob-in-hole 기술(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호 참조)을 포함한다. 다중 특이성 항체는, Fc 헤테로 2량체 분자를 제작하기 위해서 정전 스티어링 효과(electrostatic steering effects)를 조작하는 것(WO2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것(미국 특허 제4,676,980호 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 이용하여 2개의 특이성을 갖는 항체를 작성하는 것(Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 참조); 「다이아보디」 기술을 이용하여 이중 특이성 항체 단편을 제작하는 것(Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 및, 단쇄 Fv(scFv) 2량체를 이용하는 것(Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 및, 예를 들어 Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재되는 바와 같이 삼중 특이성 항체를 조제하는 것에 의해 제작해도 된다.
「옥토퍼스 항체」를 포함하는, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 수반하는 개변 항체도, 본 명세서에서는 포함된다(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2006/0025576호 A1 참조).
본 명세서에서 항체 또는 단편은, CD137과 별도의 상이한 항원에 결합하는 1개의 항원 결합 부위를 포함하는, 「듀얼 액팅 Fab」 또는 「DAF」도 포함한다(예를 들어, 미국 특허출원공개 제2008/0069820호 참조).
7. 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 아미노산 서열 변이체도, 고려의 범위 내이다. 예를 들어, 항체의 결합 어피니티 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이, 바람직한 경우도 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 수식을 도입하는 것, 또는, 펩티드 합성에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 수식은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중으로의 삽입, 및/또는 항체의 아미노산 서열 중의 잔기의 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특징(예를 들어, 항원 결합성)을 구비하는 것을 전제로, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이, 최종 구축물에 이르기 위해서 행해질 수 있다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정의 태양에 있어서, 1개 또는 복수의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 변이 도입의 목적 부위는, HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환을, 표 1의 「바람직한 치환」의 표제하에 나타낸다. 보다 실질적인 변경을, 표 1의 「예시적인 치환」의 표제하에 제공함과 함께, 아미노산 측쇄의 클래스에 언급하면서 아래에서 상술한다. 아미노산 치환은 목적하는 항체에 도입되어도 되고, 산물은, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합성, 감소한 면역원성, 또는 개선한 ADCC 또는 CDC 등의, 원하는 활성에 대해 스크리닝되어도 된다.
Figure pct00005
아미노산은, 공통의 측쇄 특성에 의해 군으로 나눌 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, 메티오닌(Met), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile);
(2) 중성의 친수성: 시스테인(Cys), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln);
(3) 산성: 아스파라긴산(Asp), 글루타민산(Glu);
(4) 염기성: 히스티딘(His), 리신(Lys), 아르기닌(Arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: 글리신(Gly), 프롤린(Pro);
(6) 방향족성: 트립토판(Trp), 티로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe).
비보존적 치환은, 이들 클래스의 하나의 멤버를, 다른 클래스의 것으로 교환하는 것을 말한다.
치환 변이체의 하나의 타입은, 친항체(예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 또는 복수의 초가변 영역 잔기의 치환을 포함한다. 통상, 그 결과로서 생기고, 추가적인 연구를 위해서 선택된 변이체는, 친항체와 비교하여 특정의 생물학적 특성에 있어서의 수식(예를 들어, 개선)(예를 들어, 증가된 어피니티, 감소한 면역원성)을 갖고, 및/또는 친항체의 특정의 생물학적 특성을 실질적으로 유지하고 있을 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 어피니티 성숙 항체이며, 이것은, 예를 들어 파지 디스플레이 베이스의 어피니티 성숙 기술(예를 들어 본 명세서에 기재되는 것)을 이용하여 적절히 제작될 수 있다. 간결히 설명하면, 1개 또는 복수의 HVR 잔기를 변이시키고, 그리고 변이 항체를 파지 상에 제시시키고, 특정의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 어피니티)에 관해서 스크리닝을 행한다.
개변(예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체의 어피니티를 개선하기 위해서, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, HVR의 「핫 스포트」, 즉, 체세포 성숙 프로세스의 사이에 고빈도로 변이가 일어나는 코돈에 의해 코딩되는 잔기(예를 들어, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)을 참조) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에 있어서 행해질 수 있고, 얻어진 변이 VH 또는 VL이 결합 어피니티에 관해서 시험될 수 있다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 어피니티 성숙이, 예를 들어, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에 기재되어 있다. 어피니티 성숙의 몇 가지 태양에 있어서, 다양성은, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 에러-프론 PCR, 체인 셔플링 또는 올리고 뉴클레오티드 지향 변이 도입)에 의해 성숙을 위해서 선택된 가변 유전자에 도입된다. 그 다음에, 2차 라이브러리가 제작된다. 그 다음에, 이 라이브러리는, 원하는 어피니티를 갖는 임의의 항체 변이체를 동정하기 위해서 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은, 몇몇의 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4∼6잔기)를 무작위화하는 HVR 지향 어프로치를 포함한다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 변이 도입 또는 모델링을 이용하여, 구체적으로 특정될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 자주 표적화된다.
특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, 그와 같은 개변이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 또는 복수의 HVR 내에서 행해질 수 있다. 예를 들어, 결합 어피니티를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 개변(예를 들어, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 보존적 치환)이, HVR에 있어서 행해질 수 있다. 그와 같은 개변은, 예를 들어, HVR의 항원 접촉 잔기의 외측일 수 있다. 상기의 변이 VH 및 VL 서열의 특정의 태양에 있어서, 각 HVR은 개변되어 있지 않거나, 불과 1개, 2개, 혹은 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
변이 도입을 위해서 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법은, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 기재되는, 「알라닌 스캐닝 변이 도입」이라고 불리는 것이다. 이 방법에 있어서, 1잔기 또는 1군의 표적 잔기(예를 들어, 하전 잔기, 예를 들어 아르기닌, 아스파라긴산, 히스티딘, 리신, 및 글루타민산)가 동정되고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 혹은 폴리알라닌)으로 치환되어, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받을지 여부가 결정된다. 이 초기 치환에 대해서 기능적 감수성을 나타낸 아미노산 위치에, 추가적인 치환이 도입될 수 있다. 혹은 또는 더하여, 항체와 항원 사이의 접촉점을 동정하기 위해서, 항원 항체 복합체의 결정 구조를 해석해도 된다. 그와 같은 접촉 잔기 및 근린의 잔기를, 치환 후보로서 표적화해도 되고, 또는 치환 후보로부터 제외해도 된다. 변이체는, 그들이 원하는 특성을 포함할지 여부를 결정하기 위해서 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열의 삽입은, 서열 내부에의 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 삽입과 마찬가지로, 아미노 말단 및/또는 카복실 말단에 있어서의 1잔기로부터 100잔기 이상을 포함하는 폴리펩티드의 길이의 범위에서의 융합도 포함한다. 말단의 삽입의 예는, N말단에 메티오닐 잔기를 수반하는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는, 항체의 N- 또는 C-말단에, 효소(예를 들어, ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 폴리펩티드를 융합시킨 것을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체가 글리코실화 되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키도록 개변되어 있다. 항체로의 글리코실화 부위의 추가 또는 삭제는, 1개 또는 복수의 글리코실화 부위를 만들어 내거나 또는 제거하도록 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 간편하게 달성 가능하다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부가되는 탄수화물이 개변되어도 된다. 포유동물 세포에 의해 산생되는 천연형 항체는, 전형적으로는, 분기한 2분기의 올리고당을 포함하고, 당해 올리고당은 통상 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 부가되어 있다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 올리고당은, 예를 들어, 만노스, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산 등의 여러 가지 탄수화물, 또한, 2분기의 올리고당 구조의 「줄기」 중의 GlcNAc에 부가된 푸코스를 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 본 개시의 항체 중의 올리고당의 수식은, 특정의 개선된 특성을 수반하는 항체 변이체를 만들어 내기 위해서 행해져도 된다.
일 태양에 있어서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부가된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조체를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그와 같은 항체에 있어서의 푸코스의 양은, 1%∼80%, 1%∼65%, 5%∼65% 또는 20%∼40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO2008/077546에 기재되는 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정되는, Asn297에 부가된 모든 당구조체(예를 들어, 복합, 하이브리드, 및 고(高)만노스 구조체)의 합에 대한, Asn297에 있어서의 당쇄 내의 푸코스의 평균량을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은, Fc 영역의 297위쯤에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링). 그러나, 복수의 항체 사이의 근소한 서열의 다양성에 기인하여, Asn297은, 297위의 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294위∼300위의 사이에 위치하는 경우도 있을 수 있다. 그와 같은 푸코실화 변이체는, 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조할 것. 「탈푸코실화」 또는 「푸코스 결손」 항체 변이체에 관한 간행물의 예는, US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 산생할 수 있는 세포주의 예는, 단백질의 푸코실화를 결여하는 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원공개 제US2003/0157108호 A1, Presta, L; 및 WO2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11) 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스페라제 유전자 FUT8 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107을 참조할 것)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부가된 2분지형 올리고당이 GlcNAc에 의해 2분되어 있는, 2분된 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO2003/011878(Jean-Mairet et al.) ; 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US2005/0123546(Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부가된 올리고당 중에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO1997/30087(Patel et al.); WO1998/58964(Raju, S.); 및 WO1999/22764(Raju, S.)에 기재되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 1개 또는 복수의 아미노산 수식을 도입하고, 그것에 의해 Fc 영역 변이체(또는 「개변 Fc 영역」이라고 호칭하는 경우도 있다.)를 생성해도 된다. Fc 영역 변이체는, 1개 또는 복수의 아미노산 포지션의 장소에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함해도 된다.
특정의 태양에 있어서, 모두는 아니지만 몇몇의 이펙터 기능을 구비하는 항체 변이체도, 본 개시의 고려의 범위 내이며, 당해 이펙터 기능은, 항체를, 그 인비보에서의 반감기가 중요하지만, 특정의 이펙터 기능(보체 및 ADCC 등)은 불요 또는 유해한 경우의 적용에 바람직한 후보로 하는 것이다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/결핍을 확인하기 위해서, 인비트로 및/또는 인비보의 세포 상해 측정을 행할 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 측정은, 항체가 FcγR 결합성을 결여하는(따라서 ADCC 활성을 결여할 개연성이 높은) 한편으로 FcRn 결합 활성을 유지하는 것을 확인하기 위해서 행해질 수 있다. ADCC를 매개하는 프라이머리 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 한편 단구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR의 발현은, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 제464페이지의 Table 3에 정리되어 있다. 목적하는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 인비트로 측정법(어세이)의 비한정적인 예는, 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참조) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 미국 특허 제5,821,337호(Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참조)에 기재되어 있다. 혹은, 비방사성의 측정법을 이용해도 된다(예를 들어, ACT1(상표) non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 및, CytoTox 96(등록상표) non-radioactive cytotoxicity assays법 (Promega, Madison, WI) 참조). 이와 같은 측정법에서 유용한 이펙터 세포는, 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 및 내추럴 킬러(natural killer: NK) 세포를 포함한다. 혹은 또는 더하여, 목적하는 분자의 ADCC 활성은, 예를 들어, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에 기재되는 바와 같은 동물 모델에 있어서, 인비보로 평가되어도 된다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없는 것, 따라 CDC 활성을 결여하는 것을 확인하기 위해서, C1q 결합 측정을 행해도 된다. 예를 들어, WO2006/029879 및 WO2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조할 것. 또한, 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 측정을 행해도 된다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 참조). 더욱이, FcRn 결합성 및 인비보에서의 클리어런스/반감기의 결정도, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 방법을 이용하여 행할 수 있다(예를 들어 Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 참조).
감소한 이펙터 기능을 수반하는 항체는, Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327, 및 329의 1개 또는 복수의 치환을 수반하는 것을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이와 같은 Fc 변이체는, 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 수반하는 이른바 「DANA」 Fc 변이체(미국 특허 제7,332,581호)를 포함하는, 아미노산 포지션 265, 269, 270, 297, 및 327의 2개 이상의 치환을 수반하는 Fc 변이체를 포함한다.
FcRs에의 증가 또는 감소한 결합성을 수반하는 특정의 항체 변이체가, 기술되어 있다. (미국 특허 제6,737,056호; WO2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)를 참조할 것.)
특정의 태양에 있어서, 항체 변이체는, ADCC를 개선하는 1개 또는 복수의 아미노산 치환(예를 들어, Fc 영역의 포지션 298, 333, 및/또는 334(EU 넘버링에서의 잔기)에서의 치환)을 수반하는 Fc 영역을 포함한다.
몇 가지 태양에 있어서, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, WO99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에 기재되는 바와 같이, 개변된(즉, 증가했거나 감소했거나의 어느 하나인) C1q 결합성 및/또는 보체 의존성 세포 상해(CDC)를 가져오는 개변이, Fc 영역에 있어서 이루어진다.
증가된 반감기, 및 신생아형 Fc 수용체(FcRn: 모체의 IgG류를 태아에게 이행시키는 역할을 부담한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)))에 대한 증가된 결합성을 수반하는 항체가, 미국 특허출원공개 제2005/0014934호A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는, Fc 영역의 FcRn에의 결합성을 증가시키는 1개 또는 복수의 치환을 그 중에 수반하는 Fc 영역을 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는, Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 또는 434의 하나 또는 복수의 장소에서의 치환(예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제7,371,826호))을 수반하는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351도 참조할 것.
일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역(변이 Fc 영역을 포함한다. 이하 마찬가지.)의 각 인간 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 결합 활성은, 표면 플라즈몬 공명 분석법을 측정 원리로 하는, 예를 들어 BIACORE(상표 등록) T200을 이용한 리간드 포착법에 의해 측정된다.
예시적인, 항체 Fc 영역의 각 인간 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 결합 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역의 FcγR에 대한 결합 활성은, BIACORE(상표 등록) T200으로 평가된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 이 측정은, 측정용 완충액으로서 50mM 인산, 150mM NaCl, 0.05w/v%-P20, pH 7.4가 이용되고, 25℃에서 실시된다. 구체적으로는, 우선, 리간드 포착용 분자로서 CaptureSelect(상표) Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate (ThermoFisher scientific)를 고상화한 센서 칩을 이용하여, 개변 Fc 영역을 포함하는 항체가 약 1000RU 포착된다. 인간 FcγR은 측정용 완충액으로 FcγRIa는 8nM로, 그 이외의 FcγR은 1000nM로 희석하여, 포착된 항체에 결합시킨다. 각 항체의 각 FcγR에 대한 결합 활성은 Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 단위 항체량당의 FcγR 결합량(RU)을 산출하는 것에 의해 평가된다. 일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역의 각 인간 Fcγ 수용체(FcγR)에 대한 결합 활성은, 실시예 7-4에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
바람직한 일 태양에 있어서, 상기 측정법에서 이용되는 FcγR은, 이하의 방법으로 조제되는 FcγR의 세포외 도메인이어도 된다. 우선 FcγR의 세포외 도메인의 유전자의 합성이 당업자 공지의 방법으로 실시된다. 그 때, 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보에 기초하여 제작된다. 구체적으로는, FcγRI에 대해서는 NCBI의 accession #NM_000566.3의 서열, FcγRIIa에 대해서는 NCBI의 accession #NM_001136219.1의 서열, FcγRIIb에 대해서는 NCBI의 accession #NM_004001.3의 서열, FcγRIIIa에 대해서는 NCBI의 accession #NM_001127593.1의 서열에 기초하여 제작되고, C말단에 His 태그가 부가된다. 또한 FcγRIIa의 다형 부위에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25를, FcγRIIIa의 다형 부위에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070을 참고로 하여 제작된다. 얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입함으로써, 발현 벡터가 제작된다. 제작된 발현 벡터가 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에, 일과성으로 도입되어, 목적 단백질이 발현된다. 배양 상청은 회수된 후, 0.22μm 필터에 통과되고, 원칙으로서 다음의 4 스텝으로 정제된다. 제 1 스텝은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제 2 스텝은 His 태그에 대한 어피니티 컬럼 크로마토그래피(HisTrap HP), 제 3 스텝은 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(Superdex200), 제 4 스텝은 무균 여과가 실시된다. 단, FcγRI에 대해서는, 제 1 스텝에 Q sepharose FF를 이용한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 실시된다. 정제된 단백질의 농도는, 분광 광도계를 이용하여 280nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용함으로써 산출된다(Protein Science, 1995, 4, 2411-2423).
일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성은, 표면 플라즈몬 공명 분석법을 측정 원리로 하는, 예를 들어 BIACORE(상표 등록) T200을 이용한 리간드 포착법에 의해 측정된다.
예시적인, 항체 Fc 영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성은, BIACORE(상표 등록) T200으로 평가된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 이 측정은, 측정용 완충액으로서 50mM 인산, 150mM NaCl, 0.05w/v%-P20, pH 6.0이 이용되고, 25℃에서 실시된다. 구체적으로는, 우선, 리간드 포착용 분자로서 CaptureSelect(상표) Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(ThermoFisher scientific)를 고상화한 센서 칩을 이용하여, Fc 영역을 포함하는 항체가 약 400RU 포착되고, 측정용 완충액으로 희석된 인간 FcRn을 결합시킨다. 각 항체의 FcRn에 대한 결합 활성은 Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 Steady state 모델에 의해 KD(M)를 산출하는 것에 의해 평가된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 본 측정에 이용한 인간 FcRn 단백질은 WO2010107110의 참고예 2에 기재된 수법으로 조제된다. 일 태양에 있어서, 항체 Fc 영역의 인간 FcRn에 대한 결합 활성은, 실시예 7-5에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
d) 시스테인 개변 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 항체의 하나 또는 복수의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 개변 항체(예를 들어, 「thioMAbs」)를 만들어 내는 것이 바람직할 것이다. 특정의 태양에 있어서, 치환을 받는 잔기는, 항체의, 액세스 가능한 부위에 생긴다. 그들의 잔기를 시스테인으로 치환하는 것에 의해, 반응성의 싸이올기가 항체의 액세스 가능한 부위에 배치되고, 당해 반응성의 싸이올기는, 당해 항체를 다른 부분(약제 부분 또는 링커-약제 부분 등)에 컨주게이트하여 본 명세서에서 더욱 상술하듯이 이뮤노컨주게이트를 만들어 내는데 사용되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 이하의 잔기의 임의의 1개 또는 복수가, 시스테인으로 치환되어도 된다: 경쇄의 V205(Kabat 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 개변 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재되는 바와 같이 하여 생성되어도 된다.
e) 항체 유도체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있고 또한 용이하게 입수 가능한 추가의 비단백질 부분을 포함하도록, 추가로 수식되어도 된다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비한정적인 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 코폴리머, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐 피롤리돈, 폴리1,3다이옥솔레인, 폴리1,3,6,트라이옥세인, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머의 어느 것이라도), 및, 덱스트란 또는 폴리(n-바이닐피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를 들어 글리세롤), 폴리바이닐 알코올, 및, 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는, 그 물에 대한 안정성 때문에, 제조에 있어서 유리할 것이다. 폴리머는, 어떠한 분자량이어도 되고, 분기하고 있어도 분기하고 있지 않아도 된다. 항체에 부가되는 폴리머의 수에는 폭이 있어도 되고, 하나 이상의 폴리머가 부가된다면 그들은 동일한 분자여도 되고, 상이한 분자여도 된다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 개선되어야 할 항체의 특정의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정의 조건하에서의 요법에 사용되는지 여부 등에 대한 고려에 기초하여, 결정할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항체와 방사선에 폭로하는 것에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질 부분과의, 컨주게이트가 제공된다. 일 태양에 있어서, 비단백질 부분은, 카본 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 어떠한 파장이어도 되고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 세포에는 해를 주지 않지만 항체-비단백질 부분에 근접한 세포를 사멸시키는 온도까지 비단백질 부분을 가열하는 파장을 포함한다.
B. 재조합의 방법 및 구성
예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되는 바와 같이, 항체는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나에서는, 숙주 세포는, (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는, (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질 전환되어 있다). 일 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성이다(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 또는 림프계의 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)). 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 전술한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제작하는 방법이 제공된다.
항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 재조합 제조를 위해서, (예를 들어, 전술한 것 등의) 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해서, 1개 또는 복수의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은, 종래의 수순을 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정될 것이다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요해지지 않는 경우는, 세균으로 제조해도 된다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조할 것. (더하여, 대장균에 있어서의 항체 단편의 발현에 대해 기재한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254도 참조할 것.) 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 프랙션 중에 단리되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적인 또는 완전한 인간의 글리코실화 패턴을 수반하는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 「인간화」되어 있는 균류 및 효모의 주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코드 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)을 참조할 것.
다세포 생물(무척추 생물 및 척추 생물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현을 위해서 적합한 숙주 세포이다. 무척추 생물 세포의 예는, 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질 전환에 이용되는, 수많은 바큐로바이러스주가 동정되어 있다.
식물세포 배양물도, 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(트랜스제닉 식물로 항체를 산생하기 위한, PLANTIBODIES(상표) 기술을 기재)를 참조할 것.
척추동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응된 포유동물 세포주는, 유용할 것이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신(腎)CV1주(COS-7); 인간 태아성 신주(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 등에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 셀트리 세포(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 등에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카녹색원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); Buffalo계 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방암(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및, FS4 세포 등이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0, 및 Sp2/0 등의 미엘로마 세포주를 포함한다. 항체 산생에 적합한 특정의 포유동물 숙주 세포주의 총설로서, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조할 것.
C. 측정법(어세이)
본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있는 여러 가지 측정법에 따라, 동정되거나, 스크리닝되거나, 또는 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 명확하게 되어도 된다.
1. 결합 측정법 및 그 외의 측정법
일 국면에 있어서, 본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체는, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등의 공지의 방법에 의해, 그 항원 결합 활성에 관해서 시험된다.
다른 국면에 있어서, 저분자 화합물의 존재하(예를 들어, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하)에서, CD137에의 결합에 관해서 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 및/또는 A549/B167을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 경합하는 항원 결합 분자 또는 항체를 동정하기 위해서, 저분자 화합물 존재하에서의 경합 어세이가 사용될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항원 결합 분자 또는 항체는, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서, 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 및/또는 A549/B167을 포함하는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체에 의해 결합되는 것과 동일한 에피토프(예를 들어, 선상 또는 입체 구조 에피토프)에 결합한다. 항원 결합 분자 또는 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하는, 상세한 예시적 방법은, Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공되어 있다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 항원(예를 들어, CD137)과 저분자 화합물(예를 들어, ATP)의 복합체에 의해 형성되는 에피토프를 인식한다.
항체를 이용한 예시적인 경합 어세이에 있어서, 고정화된 CD137은, 저분자 화합물의 존재하(예를 들어, 10μM 이상, 50μM 이상, 100μM 이상, 150μM 이상, 200μM 이상, 또는 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하)에서, CD137에 결합하는 제 1의 표지된 항체(예를 들어, 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역의 조합으로서 표 17에 기재된 A375/B167, A372/B040, A356/B040, A486/B167, A487/B167, A488/B226, A489/B223, A548/B376, A551/B256, A551/B379, A555/B379, A548/B256, 및/또는 A549/B167을 포함하는 항CD137 항체) 및 CD137에의 결합에 관해서 제 1의 항체와 경합하는 능력에 관해서 시험되는 제 2의 미표지의 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제 2의 항체는, 하이브리도마 상청에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정화된 CD137이, 제 1의 표지된 항체를 포함하지만 제 2의 미표지의 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제 1의 항체의 CD137에 대한 결합을 허용하는 조건하에서의 인큐베이션 후, 여분의 미결합의 항체가 제거되고, 고정화된 CD137에 결합한 표지의 양이 측정된다. 고정화된 CD137에 결합한 표지의 양이 대조 샘플과 비교하여 시험 샘플에 있어서 실질적으로 감소하고 있는 경우, 그것은 제 2의 항체가 CD137에의 결합에 관해서 제 1의 항체와 경합하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조할 것. 당해 어세이는, 항체 이외의 항원 결합 분자에 대해서도 마찬가지로 실시할 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
2. 활성 측정법
일 국면에 있어서, 생물학적 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 그것을 동정하기 위한 측정법이 제공된다. 생물학적 활성은, 예를 들어, CD137 아고니스트 활성; 혈장중 반감기; 항종양 활성; 및, 낮은 또는 억제된 종양 이외의 조직에서의 전신 반응을 포함해도 된다. 또한, 이와 같은 생물학적 활성을 인비보 및/또는 인비트로로 갖는 항원 결합 분자 또는 항체가, 제공된다.
특정의 태양에 있어서, 본 개시의 항원 결합 분자(예를 들어, 항CD137 항원 결합 분자) 또는 항체는, 이와 같은 생물학적 활성에 대해 시험된다.
a) 아고니스트 활성 측정법(PBMC)
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성은, 저분자 화합물이 첨가된, 또는 첨가되어 있지 않은 용액 중에서, CD137 발현 세포와 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 접촉시키는 것에 의해, 측정된다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물이 첨가된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성은, 각각, 당해 용액 중에서 CD137 발현 세포와 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 접촉시킨 후, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 72시간 이내에 측정되는 사이토카인 산생량(예를 들어, IL-2, IFN-γ, 및/또는 IL-6 산생량)에 의해 평가된다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물이 첨가된 용액은, 조정 후의 저분자 화합물 농도가, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM이 되도록 조정된다. 추가적인 일 태양에 있어서, 상기 CD137 발현 세포는, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC), 또는 단리된 인간 PBMC로부터 확대 배양된 T 세포가 이용된다.
일 태양에 있어서, 인간 PBMC는, 정상인의 채혈로부터, 400xg, 30분간, 실온에서 원심분리되는 것에 의해 단리된 것이 이용된다. 바람직하게는, 인간 PBMC는, 다음의 2스텝으로 단리된 것이 이용된다. 제 1 스텝은 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)가 첨가된 Leucosep(greiner bio-one)이 1000xg, 1분간, 실온에서 원심된 후에 PBS로 희석된 혈액이 첨가되고, 400xg, 30분간, 실온에서 원심이 행해진다. 제 2 스텝에서는 원심 후의 튜브로부터 버피코트가 채취된 후에, 60mL의 PBS(Wako)에 의해 세정된다.
예시적인, 인간 PBMC를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 한편, 이하의 예에서는, 저분자 화합물로서 ATP를 예시적으로 이용하고 있지만, 다른 저분자 화합물을 배제하는 것은 아니다. 일 태양에 있어서, 단리된 인간 PBMC는, 배지(5% 인간 혈청(SIGMA), 95%AIM-V(Thermo Fischer Scientific)에서 세포 밀도 5x106/mL로 희석된다. 그 후, 당해 단리된 인간 PBMC는, 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체와 접촉된다. 이것에 의해, 인간 PBMC에 CD137 발현이 유도된다. 바람직하게는, 당해 단리된 인간 PBMC(세포 밀도 5x106/mL로 100μL)에, 배지로 희석된 0.04μg/mL 항인간 CD3ε 항체(BD사제, 클론 SP34) 및 20μg/mL 항인간 CD28 항체(BD, 클론: CD28.2)가 50μL 첨가된다.
항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체가 첨가된 인간 PBMC는, 그 후 추가로 (i) ATP를 포함하는, 또는 포함하지 않는 배지; 및 (ii) 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 첨가된다. 당해 ATP를 포함하는, 또는 포함하지 않는 배지는, 바람직하게는, 25μL가 첨가된다. 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 바람직하게는, 40μg/mL로 25μL가 첨가된다. 더 바람직하게는, 상기 (i) 및 (ii)는, 인간 PBMC에 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체를 접촉시키고 나서 약 6시간 후에 첨가된다. 일 태양에 있어서, 바람직하게는, IL-2 산생량은, IFN-γ 산생량보다 먼저 측정된다. 일 태양에 있어서, IL-2 산생량은, 인간 PBMC에 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체를 접촉시킨 후, 약 24시간 이내에 측정된다. 바람직하게는, IL-2 산생량은, 인간 PBMC에 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체를 접촉시키고 나서 약 24시간 후, 또한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 첨가되고 나서 약 18시간 후에 측정된다.
다른 일 태양에 있어서, IFN-γ 산생량은, 인간 PBMC에 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체를 접촉시킨 후, 약 48시간 이내에 측정된다. 바람직하게는, IFN-γ 산생량은, 인간 PBMC에 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체를 접촉시키고 나서 약 48시간 후, 또한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 첨가되고 나서 약 42시간 후에 측정된다. 일 태양에 있어서, IL-2 산생량 및/또는 IFN-γ 산생량은, 회수된 배양 상청 중에 IL-2 산생량 및/또는 IFN-γ 산생량이 측정된다. 일 태양에 있어서, 항인간 CD3ε 항체 및/또는 항인간 CD28 항체가 첨가된 인간 PBMC는, 모든 측정이 완료될 때까지, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 정치된다.
추가적인 예시적인, 인간 PBMC를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 단리된 인간 PBMC는, 배지(5% 인간 혈청(SIGMA), 95%AIM-V(Thermo Fischer Scientific)에서 세포 밀도 5x106/mL로 희석된다. 그 후, 인간 PBMC는 세포 밀도 5x106/mL로 조정되고, 100μL씩 96웰 멀티플 웰 플레이트 평저 뚜껑 부착(Corning)에 파종된다. 그 후, 인간 PBMC에 CD137 발현을 유도하는 조작을 행한다. 예를 들어, 배지로 희석된 0.04μg/mL 항인간 CD3ε 항체(BD사제, 클론 SP34) 및 20μg/mL 항인간 CD28 항체(BD, 클론: CD28.2)가 50μL 첨가되는 것에 의해, 인간 PBMC에 CD137 발현이 유도된다.
인간 PBMC에 CD137 발현이 유도된 후, 플레이트는 진탕되고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된다. 그 후 각 웰에 배지로 희석한 2mM ATP(SIGMA) 혹은 ATP를 포함하지 않는 배지만 25μL와 40μg/mL의 각 항체 25μL가 첨가되고, 플레이트가 진탕된 후에 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 18시간 정치된다. 그 후, 배양 상청을 일부 회수하고, 배양 상청을 이용하여 배양 상청 중에 포함되는 IL-2량이 Human IL-2 DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 혹은 Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences)를 이용하여 정량된다. 배양 상청을 회수한 후의 플레이트는 다시 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 24시간 정치된다. 그 후, 배양 상청이 일부 회수되고, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ량이 Human IFN-γ DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 혹은 Human IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)를 이용하여 정량된다. ELISA는 기본적으로 키트 부속의 프로토콜에 따라, 실시된다. Human IL-2 DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 및 Human IFN-γ DuoSet ELISA 키트(R&D systems)에 관해서는, H2O2 및 tetramethylbenzidine를 포함하는 substrate solution(R&D systems) 및 1N H2SO4(Wako)를 이용하여, 프로토콜에 따라 발색과 발색 정지를 행한다. Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences)에 관해서는, 1N H2SO4(Wako)를 이용하여 발색 정지를 행한다.
IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)에 관해 TMB Chromogen Solution(Thermo Fischer Scientific) 및 1N H2SO4(Wako)를 이용하여 발색과 발색 정지를 행한다. 그 후 흡광도의 측정이 EnVision(PerkinElmer)으로 행해지고, 프로토콜에 따라 제작된 검량선을 이용하여, 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ량(pg/mL)이 각각 계산된다. 당해 PBMC 어세이에 있어서, CD137 아고니스트 활성은, 배양 상청 중의 IL-2량 및 IFN-γ량의, 음성 컨트롤 항체(CD137에 결합하지 않는 항체)에 대한 fold change로 표시될 수 있다. 일 태양에 있어서, CD137 아고니스트 활성은, 실시예 5-5-1 및 5-5-2에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 사이토카인 산생량(예를 들어, IL-2, IFN-γ, 및/또는 IL-6 산생량)으로 평가되는 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 사이토카인 산생량이, 음성 컨트롤 항체를 첨가했을 경우의 사이토카인 산생량의, 1.01배 이상, 1.02배 이상, 1.03배 이상, 1.05배 이상, 1.06배 이상, 1.07배 이상, 1.08배 이상, 1.09배 이상, 1.1배 이상, 1.11배 이상, 1.12배 이상, 1.13배 이상, 1.14배 이상 또는 1.15배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상인 경우, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 IL-2 산생량으로 평가되는 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 IL-2 산생량이, 음성 컨트롤 항체를 첨가했을 경우의 IL-2 산생량의, 1.01배 이상, 1.02배 이상, 1.03배 이상 또는 1.05배 이상인 경우, 바람직한 일 태양에 있어서는 1.05배 이상인 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 IFN-γ 산생량으로 평가되는 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 IFN-γ 산생량이, 음성 컨트롤 항체를 첨가했을 경우의 IFN-γ 산생량의, 1.1배 이상, 1.11배 이상, 1.12배 이상, 1.13배 이상, 1.14배 이상 또는 1.15배 이상인 경우, 바람직한 일 태양에 있어서는 1.15배 이상인 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다.
추가적인 일 태양에 있어서, 전술한 음성 컨트롤 항체와의 비교에 있어서 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가된 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체로부터, 추가로, 당해 저분자 부존재하에 있어서 CD137 아고니스트 활성을 나타내지 않거나, 또는 CD137 아고니스트 활성이(당해 저분자 화합물의 존재하와 비교해) 낮다고 평가되는 항체가 결정된다. 구체적으로는, 다음의 (ii)가 (i)보다 큰 경우에, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 부존재하에 있어서 CD137 아고니스트 활성을 나타내지 않거나, 또는 CD137 아고니스트 활성이 낮다고 평가된다:
(i) 〔항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 저분자 화합물의 비존재하에서의 사이토카인 산생량〕/〔음성 컨트롤 항체를 첨가했을 경우의, 저분자 화합물의 비존재하에서의 사이토카인 산생량〕
(ii) 〔항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 저분자 화합물의 존재하에서의 사이토카인 산생량〕/〔음성 컨트롤 항체를 첨가했을 경우의, 당해 저분자 화합물의 존재하에서의 사이토카인 산생량〕
다른 일 태양에 있어서, 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 및 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 CD137 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 사이토카인 산생량(예를 들어, IL-2, IFN-γ, 및/또는 IL-6 산생량)으로 비교되는 경우, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 사이토카인 산생량이, (ii) 동일 조건하에서 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 사이토카인 산생량의, 1.01배 이상, 1.02배 이상, 1.03배 이상, 1.04배 이상, 1.05배 이상, 1.06배 이상, 1.07배 이상, 1.08배 이상, 1.09배 이상, 1.1배 이상, 1.11배 이상, 1.12배 이상, 1.13배 이상, 1.14배 이상 또는 1.15배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상인 경우, 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체보다 높은 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 IL-2 산생량으로 평가되는 경우, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 사이토카인 산생량이, (ii) 동일 조건하에서 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 IL-2 산생량의, 1.01배 이상, 1.02배 이상, 1.03배 이상 또는 1.04배 이상인 경우, 바람직한 일 태양에 있어서는 1.04배 이상인 경우, 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체보다 높은 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 인간 PBMC 어세이에 있어서의 IFN-γ 산생량으로 평가되는 경우, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 사이토카인 산생량이, (ii) 동일 조건하에서 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의 1.05배 이상, 1.06배 이상, 1.07배 이상, 1.08배 이상, 1.09배 이상 또는 1.1배 이상인 경우, 바람직한 일 태양에 있어서는 1.1배 이상인 경우에, 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 제 2의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체보다 높은 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다. 일 태양에 있어서, 제 1의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 친Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체이며, 제 2의 항CD137 항원 결합 분자는, 변이 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체이다.
일 태양에 있어서, 인간 PBMC를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법은, 실시예 5-5-1 및 5-5-2에 기재된 방법을 이용할 수 있고, 단리된 인간 PBMC로부터 확대 배양된 T 세포를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법은, 실시예 2-6에 기재된 방법을 이용할 수 있다.
또한 일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성은, 저분자 화합물이 첨가된, 또는 첨가되어 있지 않은 용액 중에서, 인간 PBMC로부터 단리된 CD8 양성 T 세포, 혹은 CD4 양성 T 세포와, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 접촉시킴으로써, 측정되어도 된다. 이 때, 추가로, 용액 중에 FcγRIIb 발현 세포를 가해도 된다. 혹은, CD137에 대한 아고니스트 활성은, B 세포(인간 PBMC로부터 단리된 것이어도 되고, 공지의 B 세포주를 이용해도 된다)와 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 접촉시킴으로써, 측정되어도 된다. 일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성은, 용액 중에서, CD8 양성 T 세포, CD4 양성 T 세포, 또는 B 세포와 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 접촉시킨 후에 측정되는 사이토카인 산생량(예를 들어, IL-2, IFN-γ 산생량 및/또는 IL-6 산생량)에 의해 평가된다.
일 태양에 있어서, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 이용한 아고니스트 활성 측정은, 건상인의 채혈로부터 단리된다. 따라서, 상기 어느 태양에 있어서도, 당해 측정법에 따르는 측정 결과는, 혈액 시료의 제공자(도너)마다 차이가 생길 수 있음이, 당업자에게 이해될 것이다. 이 점을 고려하여, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC의 일부 또는 과반수에 대해 CD137 아고니스트 활성이 나타나지 않았던 항체에 대해서는, 다른 일부의 인간 PBMC에 있어서 아고니스트 활성의 기준에 합치하고 있어도, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단하지 않을 수 있는 것으로 해도 된다. 또한, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC에 대해 상기 방법에 의한 측정을 행하여, 과반수의 도너에 있어서 CD137 아고니스트 활성의 기준에 합치하는 경우에, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단해도 된다. 혹은, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC에 대해 상기 방법에 의한 측정을 행하여, 그 측정치(예를 들어, IL-2, IFN-γ 산생량 및/또는 IL-6 산생량)의 평균치 또는 중앙치를 이용하여, CD137 아고니스트 활성의 유무를 결정해도 된다. 일 태양에 있어서, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC에 대해 상기 방법에 의한 측정을 행하는 경우, 도너수는, 예를 들어, 2명 이상, 3명 이상, 4명 이상, 5명 이상, 10명 이상, 15명 이상 또는 20명 이상이어도 된다.
b) 아고니스트 활성 측정법(리포터 유전자 어세이)
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성은, 저분자 화합물이 첨가된, 또는 첨가되어 있지 않은 용액 중에서, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가된다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물이 첨가된 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성, 및 저분자 화합물을 첨가하지 않은 용액 중에서의 CD137에 대한 아고니스트 활성은, 각각, 당해 용액 중에서 각각, NF-kappaB-루시페라제 리포터 구축물 및 CD137을 발현하는 T 세포와 항CD137 항원 결합 분자를 접촉시킨 후, 일정 시간 정치된 후에 측정되는 루시페라제 발광 시그널에 의해 평가된다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물이 첨가된 용액은, 조정 후의 저분자 화합물 농도가, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM이 되도록 조정된다. NF-kappaB-루시페라제 리포터 구축물 및 CD137을 발현하는 T 세포는, 바람직하게는, GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega, CS196004)이다.
예시적인, 리포터 유전자 어세이를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 한편, 이하의 예에서는, 저분자 화합물로서 ATP를 예시적으로 이용하고 있지만, 다른 저분자 화합물을 배제하는 것은 아니다. 일 태양에 있어서, 우선, FcγRIIB 발현 세포가, 배지(CHO culture medium(90% Ham's F12, 10% FBS))에 의해 5×104/mL로 농도가 조제되고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 하룻밤 정치된다. 일 태양에 있어서, FcgRIIB 발현 세포로서는, FcgRIIB 강제 발현 세포뿐만 아니라, B 세포 라인 등의 내인성으로 FcgRIIB를 발현하는 셀 라인이나, 생체 내로부터 분리한 B 세포 등도 사용할 수 있다. 바람직한 일 태양에 있어서, FcγRIIB 발현 세포는, FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)이다. 다음에, 배지가 흡인 제거된 후, 다른 배지(99% RPMI, 1% FBS)로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(이하, 「4-1BB Jurkat」라고 한다.)이 첨가된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 배지로 조정된 FcγRIIB 발현 세포 200μL당, 배지로 조정된 GloResponseTM NF-kappaB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 25μL 첨가된다. 계속하여, 목적하는 농도(예를 들어, 최종 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL)가 되도록 상기 배지(99% RPMI, 1% FBS)로 희석된 항CD137 항원 결합 분자가 각각 25μL 가해지고, 추가로 목적하는 농도(예를 들어, 최종 농도가 0, 10, 50, 100, 150, 200, 250μM)가 되도록 상기 배지(99% RPMI, 1% FBS)로 희석된 ATP 용액이 25μL 가해진다. 일 태양에 있어서, 루시페라제 발광 시그널은, 4-1BB Jurkat에 항CD137 항원 결합 분자를 첨가한 후, 2시간 또는 그보다 짧은 시간, 4시간 또는 그보다 짧은 시간, 6시간 또는 그보다 짧은 시간, 혹은 24시간 또는 그보다 짧은 시간 정치된 후에 측정된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 4-1BB Jurkat는, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된다. 정치된 후, Bio-Glo reagent가 75μL씩 가해지고, 발광량이 플레이트 리더로 측정된다. 바람직한 일 태양에 있어서, Bio-Glo reagent는, Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이다. 일 태양에 있어서, 반응 시의 온도를 균일하게 하기 위해, 4-1BB Jurkat는, 인큐베이터로부터 꺼내진 후, 5분, 10분, 15분 또는 20분 실온에서 정치되어도 된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 4-1BB Jurkat는, 인큐베이터로부터 꺼내진 후, 15분 실온에서 정치된다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자를 첨가한 4-1BB Jurkat의 발광의 값을, 항CD137 항원 결합 분자 미첨가의 4-1BB Jurkat의 발광의 값으로 나눈 값을 Fold induction(상대 발광량)으로 하여, 각 항원 결합 분자의 CD137 아고니스트 활성을 평가하는 지표로 할 수 있다.
추가적인 예시적인, 리포터 유전자 어세이를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 5×104/mL로 농도를 조제한 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 200μL씩 가해지고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 하룻밤 정치한다. 배지로는 CHO culture medium(90% Ham's F12, 10% FBS)가 이용된다. 다음에, 배지가 모두 흡인 제거된 후, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 25μL 가해진다. 계속하여, 최종 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL가 되도록 Assay medium으로 희석된 각 항체 용액이 각각 25μL 가해지고, 마지막에 최종 농도가 0, 250μM이 되도록 Assay medium으로 희석된 ATP 용액이 25μL 가해진다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 75μL씩 가해진다. Bio-Glo reagent로는, 예를 들어, Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)을 사용해도 된다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정된다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Fold induction으로 한다. 당해 리포터 유전자 어세이에 있어서, CD137 아고니스트 활성은, 각 항체를 첨가한 웰의 발광량의, 항체 미첨가 웰의 발광량에 대한 fold change(상대 발광량)로 평가될 수 있다.
추가적인 예시적인, 리포터 유전자 어세이를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 384웰 플레이트의 각 웰에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 10μL씩 가해진다. 계속하여, ADP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP 혹은 ADP를 포함하지 않는 항체 용액이 각각의 웰에 10μL 가해진다. 다음에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 10μL 가해진다. ADP는 최종 농도 50μM, ATP는 최종 농도 50μM이다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 30μL씩 가해진다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System (Buffer and Substrate)가 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정된다. CD137 아고니스트 활성은, 각 항체를 첨가한 웰의 발광량의, 항체 미첨가 웰의 발광량에 대한 상대 발광량(Luminescence fold 또는 fold change라고 호칭하는 경우도 있다)으로 평가될 수 있다.
추가적인 예시적인, 리포터 유전자 어세이를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 측정법의 상세를 이하에 기술한다. 384웰 플레이트의 각 웰에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 4×105/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 10μL씩 가해진다. 계속하여, ADP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP 혹은 ADP를 포함하지 않는 항체 용액이 각각의 웰에 10μL 가해진다. 다음에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 10μL 가해진다. ADP는 최종 농도 10μM, ATP는 최종 농도 10μM이다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 30μL씩 가해진다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정된다. CD137 아고니스트 활성은, 각 항체를 첨가한 웰의 발광량의, 항체 미첨가 웰의 발광량에 대한 상대 발광량(Luminescence fold 또는 fold change라고 호칭하는 경우도 있다)으로 평가될 수 있다.
일 태양에 있어서, CD137에 대한 아고니스트 활성이, 리포터 유전자 어세이를 이용하여 측정되는 경우, (i) 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성(상대 발광량)이, (ii) 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137 아고니스트 활성(상대 발광량)과 비교하여, 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높은 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 당해 저분자 화합물의 존재하에서 CD137에 대한 아고니스트 활성을 나타낸다고 평가할 수 있다. 일 태양에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)에 있어서의 항체의 최종 농도는, 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 또는 10μg/mL이며, 바람직한 일 태양에 있어서는, 0.1μg/mL 또는 1μg/mL이다.
추가적인 일 태양에 있어서, 특정의 농도(예를 들어, 최종 농도가 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL, 바람직한 일 태양에 있어서는, 0.1μg/mL 또는 1μg/mL)에서 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 첨가했을 경우의, 저분자 화합물의 비존재하에서의 Fold induction(상대 발광량)이, 10 이하인 경우, 9 이하인 경우, 8 이하인 경우, 바람직한 일 태양에 있어서는 5 이하인 경우, 더 바람직한 일 태양에 있어서는 실질적으로 1인 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 저분자 화합물의 비존재하에 있어서, CD137 아고니스트 활성을 실질적으로 나타내지 않는다고 평가된다. 일 태양에 있어서, 「저분자 화합물의 비존재하에서의 Fold induction(상대 발광량)이, 실질적으로 1이다」란, 저분자 화합물의 비존재하에서의 Fold induction(상대 발광량)이, 2배 미만, 1.9배 미만, 1.8배 미만, 1.7배 미만, 1.6배 미만, 1.5배 미만, 1.4배 미만, 1.3배 미만, 1.2배 미만 또는 1.1배 미만인 경우를 말한다.
c) 혈장중 농도
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 혈중 동태는, 인간 CD137 노크인 마우스를 이용하여 측정 및/또는 비교된다. 인간 CD137 노크인 마우스는, 예를 들어, 마우스 배성 줄기세포(ES 세포)로의 인간 CD137 유전자 치환 벡터의 도입에 의해, 마우스 CD137 유전자를 인간 CD137 유전자로 치환하여 제작된다. 일 태양에 있어서, 본 개시의 CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 인간 CD137 노크인 마우스에게 단회 정맥내 투여되고, 투여 직후부터, 약 5일, 10일, 15일, 20일, 25일 또는 30일 후까지, 경시적으로 복수회 혈액이 채취된다. 바람직한 일 태양에 있어서, 본 개시의 CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 인간 CD137 노크인 마우스에 단회 정맥내 투여되고, 투여 후 5분 후부터 28일 후에 걸쳐, 경시적으로 복수회 혈액이 채취된다. 채취된 혈액으로부터는 신속하게 혈장이 분리되어, 혈장 중의 항체 농도가 전기화학발광(ECL)법으로 측정된다. 일 태양에 있어서, 혈장 중의 항체 농도는, 실시예 6-3-2를 참조로 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
인간 CD137 노크인 마우스를 이용한 혈장중 반감기의 측정에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가, 참조 분자보다 느린 혈장 중으로부터의 소실을 나타냈을 경우, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 참조 분자보다 개선된 혈중 동태를 갖는다고 평가할 수 있다. 또한, 저분자 화합물에 의존한 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체(스위치 분자 또는 스위치 항체)가, 저분자 화합물에 의존한 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체(논스위치 분자 또는 논스위치 항체)보다 느린 혈장 중으로부터의 소실을 나타냈을 경우, 스위치 분자(또는 스위치 항체)는, 논스위치 분자(또는 논스위치 항체)에 비해, 종양 이외의 조직에 발현하는 CD137에 결합하지 않는다고 평가할 수 있다.
d) 항종양 활성
일 국면에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 인비보로 세포 성장 또는 증식을 저해하는 그 능력에 관해서 시험된다. 특정의 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 인비보로 종양 성장을 저해하는 그 능력에 관해서 시험된다. 동종 이식 모델, 또는 이종 이식 모델 등의 인비보 모델 시스템이, 그와 같은 시험에 사용될 수 있다. 예시적인 이종 이식 시스템에 있어서, 인간 종양 세포를, 적절히 면역 부전화된 비인간 동물, 예를 들어 무흉선 「누드」 마우스에게 도입한다. 본 개시의 항체를, 이 동물에게 투여한다. 종양 성장을 저해하는 또는 감소시키는 항체의 능력을 측정한다. 상기의 이종 이식 시스템의 특정의 태양에 있어서, 인간 종양 세포는, 인간 환자 유래의 종양 세포이다. 그와 같은 이종 이식 모델은, Oncotest GmbH(Frieberg, Germany)로부터 시판되고 있다. 특정의 태양에 있어서, 인간 종양 세포는, 피하 주사에 의해 또는 유방 지방 패드 등의 적절한 부위로의 이식에 의해, 적절히 면역 부전화된 비인간 동물에게 도입된다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 항종양 활성은, 상기의 인간 CD137 노크인 마우스를 이용한 동계(同系) 종양 세포 이식 모델을 이용하여 측정 및/또는 비교된다. 시험에 이용하는 암 세포주는 적절히 선택되어도 되지만, 바람직하게는, 마우스 대장암 세포주 MC38 세포주이다. 일 태양에 있어서, MC38 세포주는 마우스의 복부 피하에 이식되고, 종양 체적이 대략 50-300mm3가 된 시점에서 모델 성립으로 한다. 모델 성립 후, MC38 세포주 이식 마우스는 군나누기가 실시된 후에, 각종 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 투여된다. 일 태양에 있어서, 항종양 활성 평가를 위해, 종양 체적 측정은 주1-2회의 빈도로 실시된다. 또한, 종양 체적은 다음의 계산식으로 산출된다: 종양 체적=장경×단경×단경/2. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 항종양 활성은, 실시예 6-4에 기재된 방법으로 시험 및 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 투여군에 있어서의 종양 체적이 Vehicle군과 비교하여 작거나, 또는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 투여군에 있어서의 종양 체적의 증가량이 Vehicle군과 비교하여 작은 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 항종양 활성을 나타냈다고 평가할 수 있다.
e) 전신 반응
일 태양에 있어서, 본 개시의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 전신 반응은, 상기의 인간 CD137 노크인 마우스를 이용한 동계 종양 세포 이식 모델을 이용하여 측정 및/또는 비교된다. 전신 반응을 측정하기 위한 장기는, 적절히 선택되어도 되지만, 바람직하게는, 간장, 비장 및/또는 림프절이다. 일 태양에 있어서, 전신 반응의 평가는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 투여 후의 적절한 타이밍으로, 인간 CD137 노크인 마우스로부터, 간장, 비장, 및/또는 림프절을 적출하는 것에 의해 행해진다. 적출되는 장기가 비장 및/또는 림프절인 경우, 이들 장기의 중량 측정 및/또는 림프구 획분의 세포수 측정이 실시된다. 이 때, 바람직하게는, 비장에 대해서는 용혈 후의 림프구 획분을, 림프절에 대해서는 갈아서 으깨어져 얻어진 림프구 획분을 이용한다. 적출되는 장기가 간장인 경우, Liver dissociation kit, mouse(Milteny Biotec)를 이용하여 얻어진 림프구 획분의 세포수 측정이 실시된다. 추가로, 각종 장기(간장, 비장, 및/또는 림프절)의 림프구 획분을 이용하여, 플로 사이토메트리(FCM)를 사용한 T 세포 해석을 행해도 된다. FCM 해석에 있어서는, 예를 들어 CD8α 양성 T 세포에서의 Granzyme B 발현 또는 PD-1 발현 또는 ICOS 발현, 혹은 CD45 양성 세포에 대한 CD8α 양성 T 세포의 비율이 이용된다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 전신 반응은 실시예 6-4에 기재된 방법으로 시험 및 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 상기 각 지표의 평가에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 투여군이, 동량의 참조 분자 투여군과 비교하여 낮은 값인 경우에, 당해 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 참조 분자보다도 전신 반응 및/또는 종양 이외의 조직(예를 들어, 간장, 비장 및/또는 림프절)에서의 면역 세포의 활성화가 억제되었다고 평가할 수 있다. 또한, 상기 각 지표의 평가에 있어서, 저분자 화합물에 의존한 결합 활성을 갖는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체(스위치 분자 또는 스위치 항체) 투여군이, 동량의 저분자 화합물에 의존한 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체(논스위치 분자 또는 논스위치 항체) 투여군과 비교하여 낮은 값인 경우, 스위치 분자(또는 스위치 항체)는, 논스위치 분자(또는 논스위치 항체)보다도, 전신 반응 및/또는 종양 이외의 조직(예를 들어, 간장, 비장 및/또는 림프절)에서의 면역 세포의 활성화가 억제되었다고 평가할 수 있다.
상기의 측정법의 어느 것도, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 대신에 또는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체에 더하여 본 개시의 이뮤노컨주게이트를 이용하여 실시될 수 있음이 이해된다.
D. 이뮤노컨주게이트
본 개시는 또한, 1개 또는 복수의 세포 상해제(예를 들어 화학요법제 또는 화학요법약, 증식 저해제, 독소(예를 들어 세균, 진균류, 식물 혹은 동물 기원의 단백질 독소, 효소적으로 활성인 독소, 혹은 그들의 단편) 또는 방사성 동위체)에 컨주게이트된 본 명세서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
일 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 항체가, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 1개 또는 복수의 약제에 컨주게이트된, 항체-약제 컨주게이트(antibody-drug conjugate: ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 유럽 특허 제0,425,235호 B1 참조); 예를 들어 모노메틸오리스타틴 약제 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조) 등의 오리스타틴; 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 그의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신 등의 안트라사이클린(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀 등의 탁세인; 트리코테센; 및 CC1065.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 효소적으로 활성인 독소 또는 그 단편에 컨주게이트된, 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다: 디프테리아 A쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A쇄(녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A쇄, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로신, 비누풀(saponaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 방사성 컨주게이트를 형성하기 위해서 방사성 원자에 컨주게이트된 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위체가 방사성 컨주게이트의 제조에 이용 가능하다. 예는, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체를 포함한다. 방사성 컨주게이트를 검출을 위해서 사용하는 경우, 방사성 컨주게이트는, 신티그래피 검사용의 방사성 원자(예를 들어 Tc-99m 혹은 123I), 또는, 핵자기 공명(NMR) 이미징(자기 공명 이미징, MRI로서도 알려짐)용의 스핀 표지(예를 들어 여기에서도 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈, 또는 철)를 포함할 수 있다.
항체 및 세포 상해제의 컨주게이트는, 다양한 2작용성 단백질 연결제를 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트(SMCC), 이미노싸이오란(IT), 이미드 에스터의 2작용성 유도체(예를 들어, 아디프이미드산 다이메틸 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 수베르산 다이석신이미딜), 알데하이드(예를 들어, 글루타르 알데하이드), 비스-아자이드 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일)헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스 활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)이다. 예를 들어, 리신 면역 독소는, Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재되는 바와 같이 하여 조제될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-아이소싸이오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌트라이아민 5아세트산(MX-DTPA)은, 항체에의 방사성 핵종의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조할 것. 링커는, 세포 내에서의 세포 상해약의 방출을 촉진하는 「절단 가능한 링커」일 수 있다. 예를 들어, 산불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커, 또는 다이설파이드 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는, (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-바이닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 가교 시약을 이용하여 조제되는 컨주게이트를 명시적으로 고려하지만, 이들로 한정되지 않는다.
E. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 어느 것도, 생물학적 샘플에 있어서의 CD137 항원 결합 분자 또는 그의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본 명세서에서 이용되는 용어 「검출」은, 정량적 또는 정성적인 검출을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 생물학적 샘플은, 세포 또는 조직을 포함한다.
일 태양에 있어서, 진단 방법 또는 검출 방법에 있어서 사용하기 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 생물학적 샘플 중의 CD137의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 이 방법은, CD137에 대한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 결합이 허용되는 조건하에서 본 명세서에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 것, 및 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체와 CD137의 사이에 복합체가 형성되었는지 여부를 검출하는 것을 포함한다. 그와 같은 방법은, 인비트로의 방법 또는 인비보의 방법일 수 있다. 일 태양에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체는, 예를 들어 CD137이 환자를 선택하기 위한 바이오 마커인 경우, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 이용하는 치료에 적합하는 피험체를 선택하기 위해서 사용된다.
본 개시의 항체를 이용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는, 암이다.
특정의 태양에 있어서, 표지된 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 표지는, 직접적으로 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어, 형광 표지, 발색 표지, 고전자 밀도 표지, 화학 발광 표지, 및 방사성 표지) 및, 예를 들어 효소 반응 또는 분자간 상호작용을 통해서 간접적으로 검출되는 부분(예를 들어 효소 또는 리간드)을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예시적인 표지는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하를 포함한다: 방사성 동위체 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 희토류 킬레이트 등의 발형광단 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 반딧불이 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 제4,737,456호) 등의 루시페라제, 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진다이온, 서양와사비 퍼옥시다제(horseradish peroxidase: HRP), 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 단당 옥시다제(예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-인산 데하이드로제나제), 유리카제 및 잔틴 옥시다제 등의 헤테로환 옥시다제, 과산화 수소를 이용하여 색소 전구체를 산화하는 효소(예를 들어 HRP, 락트퍼옥시다제, 또는 마이크로퍼옥시다제)와 연결된 것, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 프리 라디칼류, 및 이들과 유사한 것.
F. 약학적 제제
본 명세서에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 약학적 제제는, 원하는 순도를 갖는 항체를, 1개 또는 복수의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 조제된다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대체로, 이용될 때의 용량 및 농도에서는 레시피언트에 대해서 비독성이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는, 항산화제; 보존료(옥타데실다이메틸벤질염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 뷰틸, 또는 벤질알코올; 메틸 또는 프로필파라벤 등의 알킬파라벤; 카테콜; 레조르신올; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자(약 10잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리바이닐 피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당, 이당, 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의, 사탕류; 나트륨 등의 염형성 짝이온류; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 비이온계 표면 활성제. 본 명세서의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는, 추가로 가용성 중성 활성형 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)(예를 들어, rHuPH20(HYLENEX(등록상표), Baxter International, Inc.) 등의 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질) 등의 간질성 약제 분산제를 포함한다. 특정의 예시적 sHASEGP 및 그의 사용 방법은(rHuPH20을 포함한다), 미국 특허출원공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 국면에 있어서, sHASEGP는, 콘드로이티나제 등의 1개 또는 복수의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는, 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수용액 항체 제제는, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함하고 있다.
유효 성분은, 예를 들어 액적 형성(코아세르베이션) 수법에 의해 또는 계면중합에 의해 조제된 마이크로캡슐(각각, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐, 및 폴리(메타크릴산 메틸)마이크로캡슐)에 거둬들여져도 되고, 콜로이드상 약제 송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 소구체, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐)에 거둬들여져도 되고, 매크로에멀션에 거둬들여져도 된다. 이와 같은 수법은, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방성 제제를 조제해도 된다. 서방성 제제의 적합한 예는, 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 당해 매트릭스는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 등의 조형품의 형태이다.
생체내(in vivo) 투여를 위해서 사용되는 제제는, 통상 무균이다. 무균 상태는, 예를 들어 멸균 여과막을 통과시켜 여과하는 것 등에 의해, 용이하게 달성된다.
G. 치료적 방법 및 치료용 조성물
본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 어느 것도, 치료적인 방법에 있어서 사용되어도 된다.
일 국면에 있어서, 본 개시에 있어서는, 의약품으로서의 사용을 위한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 본 개시에 있어서는, 해당 의약품은, 구체적으로는, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하는 CD137에 결합하는 것에 의한 세포의 활성화를 개재시켜, 항종양 작용, 예를 들어, 종양 내의 혈관 신생의 저해, 종양 세포 증식의 저해, 종양성 B 세포 고갈 등을 유도하기 위한 것을 일례로서 들 수 있다. 추가적인 국면에 있어서, 본 개시에 있어서는, 종양의 치료에 있어서의 사용을 위한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 치료 방법에 있어서의 사용을 위한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 본 개시는, 종양을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 당해 개체에 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 개시에 있어서는, 해당 종양은, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, CD8 양성 T 세포 및/또는 제어성 T 세포(Treg 세포)가 침윤하고 있는 고형 종양을 일례로서 들 수 있다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 개체에 있어서 면역 세포의 활성화를 위한 방법으로서, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, 및/또는 CD8 양성 T 세포 등의 면역 세포(보다 구체적으로는 종양 조직에 침윤하고 있는 이들 면역 세포)를 활성화하기 위해서 당해 개체에 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 개체에 있어서 세포(예를 들어, 종양 세포)의 상해를 위한 방법으로서, 당해 개체에 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 해당 종양은, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, CD8 양성 T 세포 및/또는 제어성 T 세포(Treg 세포)가 침윤하고 있는 고형 종양을 일례로서 들 수 있다. 상기 태양의 임의의 것에 의한 「개체」는, 적합하게는 인간이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는 의약품의 제조 또는 조제에 있어서의 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 사용을 제공한다. 일 태양에 있어서, 의약품은, 종양(경우에 따라, 암이라고 칭하는 것이 적절한 경우도 있다. 이하 동일.)의 치료를 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 종양(경우에 따라 암이라고 칭한다)을 치료하는 방법으로서, 종양(경우에 따라 암이라고 칭한다)을 갖는 개체에게 의약품의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하는 CD137에 결합하는 것에 의한 세포의 활성화를 개재시켜, 예를 들어, 종양 내의 혈관 신생의 저해, 종양 세포 증식의 저해, 종양성 B 세포 고갈 등의 항종양 작용을 유도하기 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 개체에 있어서, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체가, T 세포 등의 면역 세포 상에 발현하는 CD137에 결합하는 것에 의한 세포의 활성화를 개재시켜, 예를 들어, 종양 내의 혈관 신생을 저해하는, 종양 세포 증식을 저해하는, 종양성 B 세포를 고갈시키는 등을 위한 방법으로서, 그를 위해 당해 개체에 의약품의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 것이다. 상기 태양의 임의의 것에 의한 「개체」는, 인간이어도 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는 종양을 치료하는 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 방법은, 그와 같은 종양을 갖는 개체에 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 개시에 있어서는, 해당 종양은, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, CD8 양성 T 세포 및/또는 제어성 T 세포(Treg 세포)가 침윤하고 있는 고형 종양을 일례로서 들 수 있다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 개체에 있어서 면역 세포의 활성화를 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 해당 방법은, 개체에게 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 개시에 있어서는, 해당 면역 세포는, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, 및/또는 CD8 양성 T 세포 등의 면역 세포(보다 구체적으로는 종양 조직에 침윤하고 있는 이들 면역 세포)를 들 수 있다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 개체에 있어서 세포(구체적으로는, 종양 세포)를 상해하기 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 해당 방법은, 개체에게 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 해당 종양은, B 세포, 수상 세포, 내추럴 킬러 세포, 매크로파지, CD8 양성 T 세포 및/또는 제어성 T 세포(Treg 세포)가 침윤하고 있는 고형 종양을 일례로서 들 수 있다. 상기 태양의 임의의 것에 의한 「개체」는, 인간이어도 된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시에 있어서는, 전술한 치료 방법, 치료에 있어서의 사용, 의약품에 가지고 있기 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학적 제제는, 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 비종양 조직에 있어서의 면역의 활성화의 레벨이 낮은, 항CD137 항원 결합 분자 또는 그 항체의 유효량을 포함할 수 있다.
일 태양에 있어서, 해당 비종양 조직은, 림프절, 비장, 및/또는 간장을 들 수 있다.
추가적인 태양에 있어서, 전술한 치료 방법, 치료에 있어서의 사용, 의약품에 가지고 있기 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학적 제제는, 비종양 조직에 발현하고 있는 CD137에 실질적으로 결합하지 않는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 포함할 수 있다.
추가적인 태양에 있어서, 전술한 치료 방법, 치료에 있어서의 사용, 의약품에 가지고 있기 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학적 제제는, 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 혈중 반감기가 신장하고 있는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 포함할 수 있다.
추가적인 태양에 있어서, 전술한 치료 방법, 치료에 있어서의 사용, 의약품에 가지고 있기 위한 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체를 포함하는 약학적 제제는, 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항CD137 항원 결합 분자와 비교하여, 부작용의 레벨이 낮은, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 유효량을 포함할 수 있다.
추가적인 태양에 있어서, 해당 부작용은, AST 증가, ALT 증가, 열, 구토, 급성 간염, 간 장애, 비종(splenomegaly), 장염, 피부의 화농성 염증, 호중구 감소, 림프구 감소, 혈소판 감소, 트랜스아미노아제의 발현, 및/또는 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 본 개시에 있어서의 항CD137 항원 결합 분자는, 부작용이 적으므로, 부작용의 염려 없이 투여량을 증가시킬 수 있고, 결과적으로 보다 강한 약효(세포 상해 활성 또는 항종양 활성)를 발휘하는 것이 가능하다.
추가적인 국면에 있어서, 본 개시는, 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 임의의 것을 포함하는, 약학적 제제를 제공한다(예를 들어 전술한 치료적 방법의 임의의 것에 있어서의 사용을 위한). 일 태양에 있어서, 약학적 제제는, 본 명세서에서 제공되는 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체의 임의의 것과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 개시의 항원 결합 분자 또는 항체는, 비경구 투여, 폐내 투여, 및 경비 투여, 또한 국소적 처치를 위해서 바람직한 경우는 병소내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 단기인지 장기인지에 일부 따라서, 예를 들어, 정맥내 주사 또는 피하 주사 등의 주사에 의하는 등, 임의의 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만, 단회 투여 또는 여러 가지의 시점에 걸친 반복 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함하는, 여러 가지의 투약 스케줄이 본 명세서의 고려 범위 내이다.
본 개시의 항체는, 우량 의료 규범(good medical practice)에 일치한 방식으로, 제제화되고, 투약되고, 또한 투여된다. 이 관점에서 고려되어야 할 팩터는, 치료되고 있는 그 특정의 장애, 치료되고 있는 그 특정의 포유동물, 개개의 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 제를 송달하는 부위, 투여 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 팩터를 포함한다. 항체는, 반드시 그렇지 않아도 되지만, 임의로, 문제의 장애를 예방하거나 또는 치료하기 위해서 실제로 사용되고 있는 1개 또는 복수의 제와 함께, 제제화된다. 그와 같은 다른 제의 유효량은, 제제 중에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입, 및 위에서 논한 다른 팩터에 의존한다. 이들은 통상, 본 명세서에서 기술한 것과 동일한 용량 및 투여 경로로, 또는 본 명세서에서 기술한 용량의 약 1 내지 99%로, 또는 경험적/임상적으로 적절하다고 판단되는 임의의 용량 및 임의의 경로로, 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 개시의 항체의 적절한 용량은, 치료되는 질환의 타입, 항체의 타입, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 목적으로 투여되는지 치료적 목적으로 투여되는지, 약력, 환자의 임상력 및 항체에 대한 응답, 및, 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체는, 환자에 대해서, 1회로, 또는 일련의 처치에 걸쳐서, 적합하게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 따라서, 예를 들어, 1회 또는 복수회의 별개의 투여에 의해서 하여도 연속 주입에 의해서 하여도, 약 1μg/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1mg/kg∼10mg/kg)의 항체가, 환자에 대한 투여를 위한 최초의 후보 용량이 될 수 있다. 하나의 전형적인 1일 용량은, 전술한 팩터에 의존하여, 약 1μg/kg으로부터 100mg/kg 이상까지, 폭이 있어도 된다. 수일 또는 보다 장기에 걸치는 반복 투여의 경우, 상황에 따라서, 치료는 통상 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 유지된다. 항체의 하나의 예시적인 용량은, 약 0.05mg/kg 내지 약 10mg/kg의 범위 내이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg, 혹은 10mg/kg의 하나 또는 복수의 용량(또는 이들의 임의의 조합)이, 환자에게 투여되어도 된다. 이와 같은 용량은, 단속적으로, 예를 들어 1주간마다 또는 3주간마다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6용량의 항체를 받도록), 투여되어도 된다. 높은 초회 부하 용량의 후에, 1회 또는 복수회의 저용량이 투여되어도 된다. 이 요법의 경과는, 종래의 수법 및 측정법에 의해, 용이하게 모니터링 된다.
전술한 제제 또는 치료적 방법의 어느 것에 대해서도, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 개시의 이뮤노컨주게이트를 이용하여 실시해도 됨이, 이해될 것이다.
H. 제품
본 개시의 다른 국면에 있어서, 전술한 장애의 치료, 예방, 및/또는 진단에 유용한 기재를 포함하는 제품이, 제공된다. 제품은, 용기, 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서를 포함한다. 바람직한 용기로서는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기류는, 유리나 플라스틱 등의, 다양한 재료로 형성되어 있어도 된다. 용기는 조성물을 단체(單體)로 보지해도 되고, 또한, 무균적인 액세스 포토를 갖고 있어도 된다(예를 들어, 용기는, 피하 주사 바늘에 의해 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 투여용 용액 백 또는 바이알이어도 된다). 조성물 중의 적어도 하나의 유효 성분은, 본 개시의 항체이다. 라벨 또는 첨부 문서는, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해서 사용되는 것임을 나타낸다. 본 개시의 이 태양에 있어서의 제품은, 추가로 조성물이 특정의 증상을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는, 첨부 문서를 포함해도 된다. 혹은 또는 더하여, 제품은 추가로 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의, 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, 제 2의(또는 제 3의) 용기를 포함해도 된다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지 등의, 다른 상업적 관점 또는 유저의 입장에서 바람직한 기재를 추가로 포함해도 된다.
용어 「첨부 문서」는, 치료 용품의 상용 패키지에 통상 포함되고, 그와 같은 치료 용품의 사용에 관한, 적응증, 용법, 용량, 투여 방법, 병용 요법, 금기, 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는 사용 설명서를 말하기 위해서 이용된다.
전술한 제품의 어느 것에 대해서도, 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 개시의 이뮤노컨주게이트를 포함해도 됨이, 이해될 것이다.
III. 조성물 및 방법(등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자 및 세포 상해성 항원 결합 분자)
일 국면에 있어서, 본 개시는, 등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 몇 가지 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 친Fc 영역에 있어서 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 아미노산 개변의 각각은, 친Fc 영역과 비교하여, 변이 Fc 영역의 등전점(pI)을 상승시킨다. 특정의 이론에 구속되지 않고, 생체액(예를 들어 혈장)의 pH는 중성의 pH 범위 내에 있다고 생각된다. 생체액에 있어서, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체의 알짜 양전하는, 상승된 pI에 기인하여 증가하고 있고, 그 결과, 당해 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이것에 의해, 아고니스트 항원 결합 분자(또는 항체), 혹은 항원에 결합한 아고니스트 항원 결합 분자(또는 항체)가, Fcγ 수용체 발현 세포 표면에 보다 가까워져, 항원 결합 분자 또는 항체의 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승될 수 있다. Fcγ 수용체에의 결합 활성이 아고니스트 활성에 기여하는 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, pI를 상승시키는 아미노산 개변에 의해 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승된 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체가, 당해 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 포함하지 않는 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 보다 높은 아고니스트 활성을 나타내는 것이 가능하다. 일 태양에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자는, 항CD137 항원 결합 분자, 또는 항CD3 항원 결합 분자이다. 추가적인 태양에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자는, 항CD137 항체, 또는 항CD3 항체이다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역을 포함하고, 세포 상해성 항원 결합 분자 또는 항체, 및 그의 사용 방법을 제공한다. 생체액에 있어서, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체의 알짜 양전하는, 상승된 pI에 기인하여 증가하고 있고, 그 결과, 당해 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이것에 의해, 세포 상해성 항원 결합 분자(또는 항체), 혹은 항원에 결합한 세포 상해성 항원 결합 분자(또는 항체)가, Fcγ 수용체 발현 세포 표면에 보다 가까워져, 항원 결합 분자 또는 항체의 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승될 수 있다. Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 세포 상해 활성에 기여하는 세포 상해성 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, pI를 상승시키는 아미노산 개변에 의해 Fcγ 수용체 발현 세포에의 결합이 상승된 세포 상해성 항원 결합 분자 또는 항체가, 당해 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 포함하지 않는 세포 상해성 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 보다 높은 아고니스트 활성을 나타내는 것이 가능하다.
일 태양에 있어서, 세포 상해성 항원 결합 분자가 갖는 세포 상해 활성은, 항체 의존성 세포 상해 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)이나 항체 의존성 세포 탐식 활성(antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP) 등과 같이, 이펙터 세포에 의해 야기되는 것을 포함한다.
본 개시에 있어서, pI는 이론 pI여도 실측 pI여도 된다. pI의 값은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 등전점 분리법에 의해 측정할 수 있다. 이론 pI의 값은, 예를 들어, 유전자 및 아미노산의 서열 해석 소프트웨어(Genetyx 등)를 이용하여 산출할 수 있다. 그 때, 항체의 특성을 계산식에 반영해도 된다. 예를 들어, (i) 통상, 항체 내에 있어서 보존되고 있는 Cys는 다이설파이드 결합을 형성하고, 측쇄의 전하를 가지지 않는다. 그와 같은 Cys는 계산으로부터는 제외하고, 다이설파이드 결합을 형성하고 있지 않는 프리형의 Cys만을 계산에 더해도 된다. 또한, (ii) 항체에 관해서는, 번역 후 수식에 의해 하전 상태, 즉 등전점이 변화하는 경우가 있을 수 있다. 이와 같은 번역 후 수식을 고려하여, 다음과 같이 계산식을 개변해도 된다: (a) 중쇄의 N말단이 Q(글루타민)인 경우는, 파이로글루타밀화가 일어나는 것으로 하여, N말단의 아미노기는 계산으로부터 제외하고, (b) 중쇄의 C말단이 K(리신)인 경우는, 절단이 일어나는 것으로 하여 K(1잔기분)를 계산으로부터 제외하고, 및, (c) 일반적으로 보존되고 있는 개소의 C(시스테인)는 모두, 분자 내에서 다이설파이드 결합을 형성하고 있는 것으로 하여, 이들 C의 측쇄는 계산으로부터 제외한다. 바람직한 일 태양에 있어서, 상기 (i) 및 (ii)의 양방을 계산식에 반영해도 된다.
일 태양에 있어서, pI치는, 개변 전과 비교하여, 예를 들어 적어도 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 혹은 그 이상, 적어도 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 혹은 그 이상, 적어도 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 혹은 그 이상, 또는 적어도 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 3.0 혹은 그 이상, 상승될 수 있다.
특정의 태양에 있어서, pI 상승에 관한 아미노산은, 변이 Fc 영역의 표면에 노출될 수 있다. 본 개시에 있어서, 표면에 노출될 수 있는 아미노산이란, 통상, 변이 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면에 위치하는 아미노산 잔기를 가리킨다. 폴리펩티드의 표면에 위치하는 아미노산 잔기란, 그 측쇄가 용매 분자(통상, 대부분이 물 분자이다)에 접촉할 수 있는 아미노산 잔기를 가리킨다. 그렇지만, 측쇄는 반드시 전체적으로 용매 분자와 접촉하고 있지 않으면 안 되는 것은 아니고, 비록 측쇄의 일부가 용매 분자와 접촉하고 있는 경우여도, 아미노산은 「표면에 위치하는 아미노산 잔기」라고 규정된다. 또한, 폴리펩티드의 표면에 위치하는 아미노산 잔기에는, 표면 근처에 위치하고, 그것에 의해, 비록 부분적이라도 그 측쇄가 용매 분자와 접촉하고 있는 다른 아미노산 잔기로부터의 전하의 영향을 받을 수 있는, 아미노산 잔기도 포함된다. 당업자는, 예를 들어 시판되는 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드의 상동성 모델을 작성할 수 있다. 혹은, X선 결정학 등의 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있다. 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는, 예를 들어 InsightII 프로그램(Accelrys) 등의 컴퓨터 프로그램을 이용한 삼차원 모델 유래의 좌표를 이용하여 결정된다. 표면에 노출 가능한 부위는, 당 기술분야에서 공지된 알고리즘(예를 들어, Lee and Richards(J. Mol. Biol. 55:379-400(1971)); Connolly(J. Appl. Cryst. 16:548-558(1983))을 이용하여 결정되어도 된다. 표면에 노출 가능한 부위는, 단백질 모델링에 적절한 소프트웨어 및 삼차원 구조 정보를 이용하여 결정할 수 있다. 그와 같은 목적을 위해서 사용 가능한 소프트웨어는, 예를 들어, SYBYL Biopolymer Module 소프트웨어(Tripos Associates)를 포함한다. 알고리즘에 유저 입력 사이즈 파라미터가 필요한 경우, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4옹스트롬(Å) 이하로 설정될 수 있다. 더욱이, 퍼스널 컴퓨터용의 소프트웨어를 사용하여, 표면에 노출 가능한 영역을 결정하기 위한 방법이, Pacios(Comput. Chem. 18(4):377-386(1994); J. Mol. Model. 1:46-53(1995))에 의해 기재되어 있다. 상기한 그와 같은 정보에 기초하여, 변이 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드의 표면에 위치하는 적절한 아미노산 잔기를 선택할 수 있다.
항체 정상 영역에 1아미노산 치환을 가하여 pI를 상승시키는 방법으로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 WO2014/145159에 기재된 방법에 의해 실시 가능하다. 정상 영역에 도입하는 아미노산 치환으로서는, 가변 영역의 경우와 마찬가지로, 음전하를 갖는 아미노산(예를 들어, 아스파라긴산 또는 글루타민산)의 수를 줄이는 한편으로, 양전하를 갖는 아미노산(예를 들어, 아르기닌 또는 리신)을 늘리기 위한 아미노산 치환을 도입하는 것이 바람직하다.
한정되지 않지만, 정상 영역에 있어서의 아미노산 치환의 도입 위치로서는, 항체 분자의 표면에 아미노산 측쇄가 노출될 수 있는 위치가 바람직하다. 바람직한 예로는, 이와 같은 항체 분자 표면에 노출될 수 있는 개소에, 복수의 아미노산 치환을 조합하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 혹은, 도입되는 복수의 아미노산 치환은, 서로 입체 구조적으로 근접한 위치인 것이 바람직하다. 또한, 한정되지 않지만, 도입되는 복수의 아미노산 치환은, 입체 구조적으로 근접한 위치에 복수의 양전하를 갖는 상태가 경우에 따라서는 초래되는, 양전하를 갖는 아미노산으로의 치환인 것이 바람직하다. 본 개시에 있어서의 「입체 구조적으로 근접한 위치」의 정의로서는, 특별히 한정은 되지 않지만, 서로로부터 예를 들어 45Å 이내, 40Å 이내, 30Å 이내, 20Å 이내, 바람직하게는 15Å 이내, 또는 보다 바람직하게는 10Å 이내에, 단일 아미노산 치환 또는 복수의 아미노산 치환이 도입되어 있는 상태가 의미될 수 있다. 목적하는 아미노산 치환이 항체 분자 표면에 노출된 어떤 위치에 있는지 여부, 혹은 복수 위치의 아미노산 치환이 근접한 위치에 있는지 여부는, X선 결정 구조 해석 등, 공지된 방법에 의해 결정 가능하다.
일 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 311, 343, 및 413으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, EU 넘버링으로 표시되는 위치 311, 343, 또는 413에 있어서의 아미노산 개변을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 이하 (1)∼(3)의 어느 1개의 아미노산 개변을 포함하는, pI가 상승된 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: EU 넘버링으로 표시되는, (1) 위치 311 및 343; (2) 위치 311 및 413; 및 (3) 위치 343 및 413. 추가적인 태양에 있어서, pI가 상승된 변이 Fc 영역은, 선택된 위치의 각각에 있어서 Arg 또는 Lys를 포함한다.
단백질의 pI를 상승시키기 위한 방법이란, 예를 들어, 중성 pH 조건에 있어서, 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파라긴산 및 글루타민산)의 수를 줄이는 것, 및/또는, 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산(예를 들어 아르기닌, 리신, 및 히스티딘)의 수를 늘리는 것이다. 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산은, 그 측쇄 pKa보다 충분히 높은 pH 조건에 있어서 -1로 표시되는 음전하를 갖고, 이것은 당업자에게 주지의 이론이다. 예를 들어, 아스파라긴산의 측쇄의 이론 pKa는 3.9이며, 해당 측쇄는, 중성 pH 조건에서(예를 들어 pH 7.0의 용액 중에서) -1로 표시되는 음전하를 갖는다. 반대로, 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산은, 그 측쇄 pKa보다 충분히 낮은 pH 조건에 있어서 +1로 표시되는 양전하를 갖는다. 예를 들어, 아르기닌의 측쇄의 이론 pKa는 12.5이며, 해당 측쇄는, 중성 pH 조건에서(예를 들어 pH 7.0의 용액 중에서) +1로 표시되는 양전하를 갖는다. 그에 대해, 중성 pH 조건에서(예를 들어 pH 7.0의 용액 중에서) 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산은, 15종류의 천연 아미노산, 즉 알라닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 및 티로신을 포함함이 알려져 있다. 당연히, pI를 상승시키기 위한 아미노산은 비천연 아미노산이어도 됨이 이해된다.
위에 기술한 것으로부터, 중성 pH 조건에서(예를 들어 pH 7.0의 용액 중에서) 단백질의 pI를 상승시키기 위한 방법은, 예를 들어 단백질의 아미노산 서열 중의 아스파라긴산 또는 글루타민산(그 측쇄가 -1의 음전하를 갖는다)를, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산으로 치환하는 것에 의해, 관심 대상의 단백질에 +1의 전하 개변을 부여할 수 있다. 더욱이, 예를 들어, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산을 아르기닌 또는 리신(그 측쇄가 +1의 양전하를 갖는다)으로 치환하는 것에 의해, 단백질에 +1의 전하 개변을 부여할 수 있다. 더하여, 아스파라긴산 또는 글루타민산(그 측쇄가 -1의 음전하를 갖는다)을 아르기닌 또는 리신(그 측쇄가 +1의 양전하를 갖는다)으로 치환하는 것에 의해, 단백질에 +2의 전하 개변을 한 번에 부여할 수 있다. 혹은, 단백질의 pI를 상승시키기 위해서, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산 및/혹은 바람직하게는 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산을 단백질의 아미노산 서열에 부가 혹은 삽입할 수 있고, 또는, 단백질의 아미노산 서열 중에 존재하는, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산 및/혹은 바람직하게는 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산을 결실시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질의 N말단 및 C말단의 아미노산 잔기는, 그 측쇄 유래의 전하에 더하여, 주쇄 유래의 전하(N말단에 있어서의 아미노기의 NH3 + 및 C말단에 있어서의 카보닐기의 COO-)를 가짐이 이해된다. 따라서, 주쇄 유래의 작용기에 대해서 어떠한 부가, 결실, 치환, 또는 삽입을 실시하는 것에 의해서도, 단백질의 pI를 상승시킬 수 있다.
pI를 상승시키기 위한 아미노산의 치환에는, 예를 들어, 친Fc 영역의 아미노산 서열에 있어서, 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산을 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산으로 치환하는 것, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산을 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 것, 및, 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산을 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 것이 포함되고, 이들은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 실시된다.
pI를 상승시키기 위한 아미노산의 삽입 또는 부가에는, 예를 들어, 친Fc 영역의 아미노산 서열에 있어서의, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산의 삽입 또는 부가, 및/혹은, 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산의 삽입 또는 부가가 포함되고, 이들은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 실시된다.
pI를 상승시키기 위한 아미노산의 결실에는, 예를 들어, 친Fc 영역의 아미노산 서열에 있어서의, 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산의 결실, 및/또는, 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산의 결실이 포함되고, 이들은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 실시된다.
일 태양에 있어서, pI를 상승시키기 위해서 사용되는 천연 아미노산은, 이하와 같이 분류할 수 있다: (a) 측쇄가 음전하를 갖는 아미노산은 Glu(E) 또는 Asp(D)일 수 있고; (b) 측쇄가 전하를 갖지 않는 아미노산은 Ala(A), Asn(N), Cys(C), Gln(Q), Gly(G), His(H), Ile(I), Leu(L), Met(M), Phe(F), Pro(P), Ser(S), Thr(T), Trp(W), Tyr(Y), 또는 Val(V)일 수 있고; 및 (c) 측쇄가 양전하를 갖는 아미노산은 His(H), Lys(K), 또는 Arg(R)일 수 있다. 일 태양에 있어서, 수식 후의 아미노산의 삽입 또는 치환은 Lys(K) 또는 Arg(R)이다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb) 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 단리된 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 기재되는 변이 Fc 영역은, 친Fc 영역에 있어서 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함한다. 전술한 대로, pI가 상승된 항원 결합 분자 또는 항체는, pI가 상승되어 있지 않는 항원 결합 분자 또는 항체와 비교하여, 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의해, 알짜 음전하를 갖는 내피 세포 표면에 보다 강하게 끌어당겨진다. 이로부터, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)에의 결합 활성이 아고니스트 활성에 기여하는 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체에 있어서는, Fcγ 수용체(바람직하게는 FcγRIIb)를 상승시키는 아미노산 개변과 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 조합하는 것에 의해, 당해 항원 결합 분자 또는 항체의 아고니스트 활성을 상승시키는 것이 가능하다. 용어 「Fcγ 수용체」에 대해서는, II. 조성물 및 방법(항CD137 아고니스트 항원 결합 분자)에서 기재된 설명이 마찬가지로 적용된다.
일 태양에 있어서, 일 국면에 있어서, 본 개시는, (a) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 264, 266, 267, 268, 271, 295, 298, 325, 326, 327, 328, 330, 331, 332, 334, 및 396으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변과, (b) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 285, 311, 312, 315, 318, 333, 335, 337, 341, 342, 343, 384, 385, 388, 390, 399, 400, 401, 402, 413, 420, 422, 및 431로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 위치의 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함하는 적어도 3개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, (a) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 234, 235, 236, 237, 238, 264, 268, 295, 326, 및 330으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 위치의 적어도 1개의 아미노산 개변과, (b) EU 넘버링으로 표시되는, 위치 311, 343, 및 413으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개의 위치의 적어도 2개의 아미노산 개변을 포함하는 적어도 3개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
다른 국면에 있어서, 본 개시는, 이하 (1)∼(26)의 어느 1개의 아미노산 개변을 포함하는, FcγRIIb 결합 활성의 상승과 pI 상승을 수반하는 변이 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다: EU 넘버링으로 표시되는,
(1) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 343, 및 413;
(2) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 343, 및 413;
(3) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 330, 343, 및 413;
(4) 위치 234, 238, 264, 330, 343, 및 413;
(5) 위치 234, 237, 238, 250, 307, 330, 343, 및 413;
(6) 위치 234, 237, 238, 330, 343, 및 413;
(7) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 311, 및 343;
(8) 위치 234, 238, 250, 264, 307, 330, 311, 및 343;
(9) 위치 234, 238, 264, 330, 311, 및 343;
(10) 위치 234, 237, 238, 250, 307, 330, 311, 및 343;
(11) 위치 234, 237, 238, 330, 311, 및 343;
(12) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 343;
(13) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 343;
(14) 위치 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 413;
(15) 위치 214, 236, 268, 330, 및 343;
(16) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 및 343;
(17) 위치 214, 236, 268, 330, 및 413;
(18) 위치 214, 236, 268, 330, 343, 및 413;
(19) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 343, 및 413;
(20) 위치 214, 236, 268, 330, 및 311;
(21) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 및 311;
(22) 위치 214, 236, 268, 330, 311, 및 343;
(23) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 311, 및 343;
(24) 위치 214, 236, 268, 330, 311, 및 413;
(25) 위치 214, 235, 236, 268, 330, 311, 및 413;
(26) 위치 214, 235, 236, 268, 295, 326, 330, 및 311.
일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 하기 표 6에 기재되는 아미노산 개변을 포함한다.
Fc 영역의 pI를 상승시키는 아미노산 개변
Figure pct00006
일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 표 6(Fc의 pI 상승을 수반하는 아미노산 개변)에 기재되는 아미노산 개변에 더하여, 추가로 하기 표 7에 기재되는 아미노산 개변을 포함한다.
Fc 영역의 FcγRIIb 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변
Figure pct00007
일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 하기 표 8에 기재되는 아미노산 개변을 포함한다. 바람직한 일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 하기 표 8에 기재되는 아미노산 개변에 더하여, EU 넘버링 447위의 아미노산 결실을 포함한다. 더 바람직한 일 태양에 있어서, 본 개시의 변이 Fc 영역은, 하기 표 8에 기재되는 아미노산 개변에 더하여, EU 넘버링 446위 및 447위의 아미노산의 결실을 포함한다.
Figure pct00008
상기에서 예시되는 개변 외에, 예를 들어 WO2013/047752, WO2013/125667, WO2014/030728, WO2014/163101, 또는 WO2017104783에 기재되거나 또는 시사되는, 친Fc 영역과 비교하여 FcγRIIb를 포함하는 FcγR에의 결합 활성을 상승시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 및 예를 들어 WO2017/104783, WO2017/046994에 기재되거나 또는 시사되는, 친Fc 영역과 비교하여 pI를 상승시키는 적어도 1개의 아미노산 개변, 및, 그들의 아미노산 개변의 조합이 이용될 수 있음이, 당업자에게 이해될 것이다.
일 태양에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자 또는 항체는 변이 Fc 영역 및 항원 결합 도메인의 양방을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 항원은 막항원이다. 추가적인 태양에 있어서, 항원은 세포 표면에 발현하는 수용체이다. 몇 가지 태양에 있어서, 친Fc 영역은 인간 IgG1에서 유래한다. 추가적인 태양에 있어서, 폴리펩티드는 항체이다. 추가적인 태양에 있어서, 폴리펩티드는 Fc 융합 단백질이다.
일 국면에 있어서, 본 개시는, 상기에 상술한 개변 Fc 영역(등전점(pI) 상승 변이 Fc 영역)을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
이와 같은 본 개시의 방법은, 일 태양에 있어서, 친Fc 영역에, 친Fc 영역을 포함하는 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 등전점(pI)의 상승을 가져오는 적어도 1개의 아미노산 개변(전술한 대로)을 도입하고, 그 결과 얻어지는 개변 Fc 영역을 포함하는 아고니스트 항원 결합 분자의 아고니스트 활성이, 친아고니스트 항원 결합 분자와 비교하여 상승되어 있는 아고니스트 항원 결합 분자를 동정, 단리하는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법은, 이와 같이 하여 동정, 단리된 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자와 작동 가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 취득하고, 당해 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 당해 숙주 세포를 배양하여 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 생산시켜, 숙주 세포 배양물로부터 상기 아고니스트 항원 결합 분자를 회수하는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 의해, 10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높은, 아고니스트 항원 결합 분자를 제조할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 의해, 10μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높은, 아고니스트 항원 결합 분자를 제조할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 의해, 50μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높은, 아고니스트 항원 결합 분자를 제조할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 의해, 250μM 이상의 저분자 화합물의 존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성이, 저분자 화합물의 비존재하에서의 항원에 대한 아고니스트 활성과 비교하여, 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 60배 이상, 70배 이상, 80배 이상, 또는 90배 이상 높은, 아고니스트 항원 결합 분자를 제조할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 방법에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자 항원에 대한 아고니스트 활성은, 항원 발현 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 방법에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자 항원에 대한 아고니스트 활성은, 단리된 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 또는 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC) 유래 T 세포에 의한 IL-2 및/또는 IFN-γ 산생량에 의해 평가할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 방법에 있어서, 아고니스트 항원 결합 분자 항원에 대한 아고니스트 활성은, 리포터 유전자 어세이에 의해 평가할 수 있다.
IV. 조성물 및 방법(저분자 화합물의 농도에 따라서 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자)
A. 저분자 화합물의 농도에 따라서 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자
일 국면에 있어서, 본 발명은, 저분자 화합물의 농도에 따라서 항원 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자를 제공한다. 본 분자는, 저분자 화합물 의존적인(저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖는다) 항원 결합 분자라고 바꿔 말할 수도 있다. 몇 가지 국면에 있어서, 항원 결합 분자는 항체이다. 몇 가지 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대한다. 몇 가지 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 감소한다. 일 태양에 있어서, 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 결합 활성과 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 높다. 다른 태양에 있어서, 고농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 결합 활성과 저농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 결합 활성을 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 높다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 저분자 화합물은, 표적 조직 특이적 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 저분자 화합물은, 종양 조직 특이적 화합물이다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, 높은 혈장중 체류성을 갖는 항원 결합 분자를 제공한다. 추가적인 국면에 있어서, 당해 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대한다. 특정의 태양에 있어서, 저분자 화합물은, 표적 조직 특이적 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 항원 결합 분자는, 비표적 조직에 있어서의 항원 결합 활성에 비해, 표적 조직에 있어서의 항원 결합 활성이 보다 높다. 몇 가지 국면에 있어서, 항원 결합 분자는 항체이다. 특정의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 전술한 혈장 중에 있어서의 동태의 변화는 이하와 같이 해석할 수 있다. 항원 결합 분자의 표적 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성이 높아짐에 따라, 당해 항원 결합 분자의 표적 조직 이외의 조직에 있어서의 항원 결합능이 저하된다. 그 결과, 당해 항원 결합 분자의 표적 조직 이외의 조직에 있어서의 항원 의존적인 소실(클리어런스)이 저하되게 된다. 생체 내의 대부분의 조직(표적 조직 이외의 조직)에 있어서, 항원 의존적인 소실(클리어런스)이 저하되는 것은, 종합적으로 보면, 당해 항원 결합 분자의 높은 혈장중 체류성으로 연결된다. 본 발명에 있어서의 항원 결합 분자가 높은 혈장중 체류성을 갖고 있는지 여부의 판단은, 대조가 되는 항원 결합 분자와의 상대적인 비교에 의해 행할 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자는, 대조가 되는 항원 결합 분자와 비교하여, 높은 혈장중 체류성을 갖는다. 일 태양에 있어서, 대조가 되는 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자란, 당해 저분자 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차이가, 예를 들어 2배보다 작은, 1.8배보다 작은, 1.5배보다 작은, 1.3배보다 작은, 1.2배보다 작은, 또는 1.1배보다 작은 항원 결합 분자를 의미한다. 비교의 관점에서 보면, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 충분량의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 서로 실질적으로 동등한 것이 바람직하다.
여기에서, 생체 내에서 검출되는 항원 결합 분자의 항원 의존적인 소실의 크기는, 혈장 중에 존재하는 항원과 항원 결합 분자의 양적인 밸런스에 따라서 변화한다고 생각된다. 일반적으로, 혈장 중에 존재하는 항원이 많을수록/항원 결합 분자가 적을수록, 항원 결합 분자의 항원 의존적인 소실은 검출되기 쉬워지고, 반대로, 혈장 중에 존재하는 항원이 적을수록/항원 결합 분자가 많을수록, 항원 결합 분자의 항원 의존적인 소실은 검출되기 어려워진다고 생각된다. 본 발명의 항원 결합 분자는, 모든 조건에서 높은 혈장중 체류성을 나타낼 필요는 없고, 충분한 항원 의존적인 소실이 검출되는 적절한 조건하에 있어서 높은 혈장중 체류성을 나타내면 된다. 혈장 중의 항원량이 적은 경우는, 어떠한 인위적인 수단에 의해 항원량을 늘리고 나서 혈장중 체류성을 평가해도 된다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는 항원 결합 분자를 제공한다. 추가적인 국면에 있어서, 당해 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대된다. 특정의 태양에 있어서, 저분자 화합물은, 표적 조직 특이적 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 항원 결합 분자는, 비표적 조직에 있어서의 항원 결합 활성에 비해, 표적 조직에 있어서의 항원 결합 활성이 보다 높다. 몇 가지 국면에 있어서, 항원 결합 분자는 항체이다. 특정의 이론에 구속되는 것은 아니지만, 전술한 혈장 중에 있어서의 동태의 변화는 이하와 같이 해석할 수 있다. 항원 결합 분자의 표적 조직 특이적 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성이 높아짐에 따라, 당해 항원 결합 분자의 표적 조직 이외의 조직에 있어서의 항원 결합능이 저하된다. 그 결과, 당해 항원 결합 분자의 표적 조직 이외의 조직에 있어서의 항원-항체 복합체의 형성능이 저하되게 된다. 일반적으로, 항체 등의 항원 결합 분자가 항원과 결합하면, 항원의 클리어런스가 저하되어 혈장 중의 항원 농도가 상승(항원이 축적)됨이 알려져 있다. 생체 내의 대부분의 조직(표적 조직 이외의 조직)에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성능이 저하되는 것은, 종합적으로 보면, 항원의 낮은 축적(바꾸어 말하면, 항원 결합 분자의 낮은 항원 축적능)으로 연결된다. 본 발명에 있어서의 항원 결합 분자가 낮은 혈장중 항원 축적능을 가지고 있는지 여부의 판단은, 대조가 되는 항원 결합 분자와의 상대적인 비교에 의해 행할 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대되는 항원 결합 분자는, 대조가 되는 항원 결합 분자와 비교하여, 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는다. 일 태양에 있어서, 대조가 되는 항원 결합 분자는, 저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자란, 당해 저분자 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차이가, 예를 들어 2배보다 작은, 1.8배보다 작은, 1.5배보다 작은, 1.3배보다 작은, 1.2배보다 작은, 또는 1.1배보다 작은 항원 결합 분자를 의미한다. 비교의 관점에서 보면, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 충분량의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 서로 실질적으로 동등한 것이 바람직하다.
여기에서, 생체 내에서 형성되는 항원-항체 복합체의 양은, 혈장 중에 존재하는 항원 및 항체의 양에 의존한다고 생각된다. 일반적으로, 혈장 중의 항원·항체량이 증가할수록, 형성되는 항원-항체 복합체량도 증가하고, 반대로, 혈장 중의 항원·항체량이 감소할수록, 형성되는 항원-항체 복합체량도 감소한다고 생각된다. 본 발명의 항원 결합 분자는, 모든 조건에서 낮은 혈장중 항원 축적능을 나타낼 필요는 없고, 충분한 항원-항체 복합체가 형성되는 적절한 조건하에 있어서 낮은 혈장중 항원 축적능을 나타내면 된다. 혈장중의 항원량이 적은 경우는, 어떠한 인위적인 수단에 의해 항원량을 늘리고 나서 혈장중 항원 축적능을 평가해도 된다.
몇 가지 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자의, 저분자 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성의 차이는, 예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다.
몇 가지 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 결합 활성은 KD(Dissociation constant: 해리 상수)치로 나타낼 수 있다. 추가적인 태양에 있어서, 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 KD치와 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 KD치를 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 작다. 혹은 다른 태양에 있어서, 고농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 KD치와 저농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 KD치를 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 작다. 추가적인 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 KD치의 차이는, 예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다. 보다 작은 쪽의 KD치는, 예를 들어 9×10-7M 이하, 8×10-7M 이하, 7×10-7M 이하, 6×10-7M 이하, 5×10-7M 이하, 4×10-7M 이하, 3×10-7M 이하, 2×10-7M 이하, 1×10-7M 이하, 9×10-8M 이하, 8×10-8M 이하, 7×10-8M 이하, 6×10-8M 이하, 5×10-8M 이하, 4×10-8M 이하, 3×10-8M 이하, 2×10-8M 이하, 1×10-8M 이하, 9×10-9M 이하, 8×10-9M 이하, 7×10-9M 이하, 6×10-9M 이하, 5×10-9M 이하, 4×10-9M 이하, 3×10-9M 이하, 2×10-9M 이하, 1×10-9M 이하, 9×10-10M 이하, 8×10-10M 이하, 7×10-10M 이하, 6×10-10M 이하, 5×10-10M 이하, 4×10-10M 이하, 3×10-10M 이하, 2×10-10M 이하, 1×10-10M 이하일 수 있다. 보다 큰 쪽의 KD치는, 예를 들어 1×10-8M 이상, 2×10-8M 이상, 3×10-8M 이상, 4×10-8M 이상, 5×10-8M 이상, 6×10-8M 이상, 7×10-8M 이상, 8×10-8M 이상, 9×10-8M 이상, 1×10-7M 이상, 2×10-7M 이상, 3×10-7M 이상, 4×10-7M 이상, 5×10-7M 이상, 6×10-7M 이상, 7×10-7M 이상, 8×10-7M 이상, 9×10-7M 이상, 1×10-6M 이상, 2×10-6M 이상, 3×10-6M 이상, 4×10-6M 이상, 5×10-6M 이상, 6×10-6M 이상, 7×10-6M 이상, 8×10-6M 이상, 9×10-6M 이상일 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 결합 활성을, KD치 대신에 kd(Dissociation rate constant: 해리 속도 상수)치로 나타내도 된다.
다른 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 결합 활성은, 항원 결합 분자에의 항원의 결합량 등으로 나타내도 된다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 어세이에 있어서는, 센서 칩 상에 고정된 항원 결합 분자의 결합량, 및 추가로 거기에 결합한 항원의 결합량이 각각 반응 단위(resonance unit: RU)로서 측정된다. 거기에서의 항원의 결합량을 지표로 항원 결합 활성을 나타내도 되고, 혹은, 항원의 결합량을 항원 결합 분자의 결합량으로 나눈 값(즉, 항원 결합 분자의 단위량당의 항원의 결합량)을 지표로 항원 결합 활성을 나타내도 된다. 그와 같은 결합량의 측정 및 산출의 구체적인 방법은 후술하는 실시예에 기재되어 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원의 결합량과 저분자 화합물의 비존재하에 있어서의 항원의 결합량을 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 크다. 혹은 다른 태양에 있어서, 고농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원의 결합량과 저농도의 저분자 화합물의 존재하에 있어서의 항원의 결합량을 비교했을 경우, 한쪽의 값이 다른 한쪽의 값보다 크다. 추가적인 태양에 있어서, 항원의 결합량의 차이는, 예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다. 보다 큰 쪽의 항원의 결합량은, 예를 들어 0.01 이상, 0.02 이상, 0.03 이상, 0.04 이상, 0.05 이상, 0.06 이상, 0.07 이상, 0.08 이상, 0.09 이상, 0.1 이상, 0.2 이상, 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 1 이상일 수 있다. 보다 작은 쪽의 항원의 결합량은, 예를 들어 0.5 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 0.1 이하, 0.09 이하, 0.08 이하, 0.07 이하, 0.06 이하, 0.05 이하, 0.04 이하, 0.03 이하, 0.02 이하, 0.01 이하, 0.009 이하, 0.008 이하, 0.007 이하, 0.006 이하, 0.005 이하, 0.004 이하, 0.003 이하, 0.002 이하, 0.001 이하일 수 있다.
몇 가지 태양에 있어서, 본 명세서에서 표시되는 KD치나 kd치, 결합량의 값 등은, 표면 플라즈몬 공명 어세이를 25℃ 또는 37℃에서 실시하는 것에 의해, 측정 혹은 산출된다(예를 들어, 본 명세서의 실시예를 참조).
저분자 화합물의 농도로서는, 항원 결합 분자의 결합 활성에 차이가 검출되는 한, 임의의 농도를 선택할 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 고농도로서는, 예를 들어 1nM 또는 그보다 높은 농도, 3nM 또는 그보다 높은 농도, 10nM 또는 그보다 높은 농도, 30nM 또는 그보다 높은 농도, 100nM 또는 그보다 높은 농도, 300nM 또는 그보다 높은 농도, 1μM 또는 그보다 높은 농도, 3μM 또는 그보다 높은 농도, 10μM 또는 그보다 높은 농도, 30μM 또는 그보다 높은 농도, 100μM 또는 그보다 높은 농도, 300μM 또는 그보다 높은 농도, 1mM 또는 그보다 높은 농도, 3mM 또는 그보다 높은 농도, 10mM 또는 그보다 높은 농도, 30mM 또는 그보다 높은 농도, 100mM 또는 그보다 높은 농도, 300mM 또는 그보다 높은 농도, 1 M 또는 그보다 높은 농도를 들 수 있다. 혹은, 각각의 항원 결합 분자가 최대의 결합 활성을 나타내는 충분량을 여기에서의 고농도로 할 수도 있다. 일 태양에 있어서, 1μM, 10μM, 100μM, 1mM, 혹은, 각각의 항원 결합 분자가 최대의 결합 활성을 나타내는 충분량을 여기에서의 고농도로서 선택할 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 저농도로서는, 예를 들어 1mM 또는 그보다 낮은 농도, 300μM 또는 그보다 낮은 농도, 100μM 또는 그보다 낮은 농도, 30μM 또는 그보다 낮은 농도, 10μM 또는 그보다 낮은 농도, 3μM 또는 그보다 낮은 농도, 1μM 또는 그보다 낮은 농도, 300nM 또는 그보다 낮은 농도, 100nM 또는 그보다 낮은 농도, 30nM 또는 그보다 낮은 농도, 10nM 또는 그보다 낮은 농도, 3nM 또는 그보다 낮은 농도, 1nM 또는 그보다 낮은 농도, 300pM 또는 그보다 낮은 농도, 100pM 또는 그보다 낮은 농도, 30pM 또는 그보다 낮은 농도, 10pM 또는 그보다 낮은 농도, 3pM 또는 그보다 낮은 농도, 1pM 또는 그보다 낮은 농도 등을 들 수 있다. 혹은, 각각의 항원 결합 분자가 최소의 결합 활성을 나타낼 때의 농도를 여기에서의 저농도로 할 수도 있다. 실질적인 농도가 제로(저분자 화합물의 비존재하)인 경우를, 저농도의 일 태양으로서 선택할 수도 있다. 일 태양에 있어서, 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 각각의 항원 결합 분자가 최소의 결합 활성을 나타낼 때의 농도, 혹은 저분자 화합물의 비존재하를 여기에서의 저농도로서 선택할 수 있다. 다른 태양에 있어서, 고농도와 저농도의 비로서는, 예를 들어 예를 들어 3배 또는 그 이상, 10배 또는 그 이상, 30배 또는 그 이상, 100배 또는 그 이상, 300배 또는 그 이상, 1×103배 또는 그 이상, 3×103배 또는 그 이상, 1×104배 또는 그 이상, 3×104배 또는 그 이상, 1×105배 또는 그 이상, 3×105배 또는 그 이상, 1×106배 또는 그 이상, 3×106배 또는 그 이상, 1×107배 또는 그 이상, 3×107배 또는 그 이상, 1×108배 또는 그 이상, 3×108배 또는 그 이상, 1×109배 또는 그 이상, 3×109배 또는 그 이상, 1×1010배 또는 그 이상, 3×1010배 또는 그 이상, 1×1011배 또는 그 이상, 3×1011배 또는 그 이상, 1×1012배 또는 그 이상의 값을 선택할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 당해 항원을 발현하는 세포에 대해서 세포 상해 활성을 나타낸다. 표적이 되는 세포의 표면에 당해 항원이 발현하고 있고, 거기에 본 발명의 항원 결합 분자가 결합했을 경우, 당해 세포가 상해될 수 있다. 세포에의 상해는, 항체 의존성 세포 상해 활성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)이나 항체 의존성 세포 탐식 활성(antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP) 등과 같이, 이펙터 세포에 의해 야기되는 것이어도 되고, 보체 의존성 세포 상해 활성(complement-dependent cytotoxicity; CDC) 등과 같이, 보체에 의해 야기되는 것이어도 된다. 혹은 이뮤노컨주게이트 등과 같이, 세포 상해제(예를 들어, 방사성 동위체나 화학요법제 등)에 의해 야기되는 것이어도 된다. 여기에서의 세포 상해는, 세포사를 유도하는 작용이나 세포 증식을 억제하는 작용, 세포 기능에 장애를 주는 작용 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자가 충분한 양으로 존재하는 경우, 예를 들어 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 당해 항원을 발현하는 세포에 대해서 상해를 야기할 수 있다. 그와 같은 세포 상해 활성의 측정은, 본 발명의 항원 결합 분자의 비존재하, 혹은 음성 대조가 되는 항원 결합 분자의 존재하에서의 측정과 비교하여 행할 수 있다. 예시적인 세포 상해 어세이가, 본 명세서에서 제공된다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 당해 항원에 대해서 중화 활성을 나타낸다. 중화 활성이란 당해 항원이 관련된 어떠한 생물학적 활성을 중화(혹은 저해, 저지)하는 활성을 의미한다. 일 태양에 있어서, 생물학적 활성은 리간드와 리셉터의 결합에 의해 초래된다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 당해 리간드와 리셉터의 결합을 저해한다. 본 발명의 항원 결합 분자가 충분한 양으로 존재하는 경우, 생물학적 활성을 예를 들어 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 저해할 수 있다. 그와 같은 저해 활성의 측정은, 본 발명의 항원 결합 분자의 비존재하, 혹은 음성 대조가 되는 항원 결합 분자의 존재하에서의 측정과 비교하여 행할 수 있다. 중화 활성의 측정의 구체적인 방법이 본 명세서에서 제공된다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는 Fc 영역을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는 정상 영역을 포함한다. 정상 영역은, 중쇄 정상 영역(Fc 영역을 포함한다), 경쇄 정상 영역, 혹은 그 양자여도 된다. 몇 가지 태양에 있어서, Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역이다. 천연형 항체에서 유래하는 예시적인 중쇄 정상 영역으로서, 예를 들어 인간 IgG1(서열 번호: 219), 인간 IgG2(서열 번호: 220), 인간 IgG3(서열 번호: 221), 인간 IgG4(서열 번호: 222) 등의 중쇄 정상 영역을 들 수 있다. 또한, 다른 예시적인 중쇄 정상 영역으로서, 서열 번호: 215, 서열 번호: 217 등의 중쇄 정상 영역을 들 수 있다. 천연형 항체에서 유래하는 예시적인 경쇄 정상 영역으로서, 예를 들어 인간 κ쇄(서열 번호: 186, 서열 번호: 199, 서열 번호: 218), 인간 λ쇄(서열 번호: 189, 서열 번호: 216) 등의 경쇄 정상 영역을 들 수 있다.
다른 태양에 있어서, Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역에 아미노산 개변을 가하여 제작된 변이 Fc 영역이다. 특정의 태양에 있어서, 변이 Fc 영역은, 천연형 서열의 Fc 영역에 비해, FcγRIa, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성이 증강되어 있다.
추가적인 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는 항체이다. 특정의 태양에 있어서, 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 포함하는, 모노클로날 항체이다. 일 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아보디, 또는 F(ab')2 단편 등의, 항체 단편이다. 다른 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 완전 IgG1 항체나 완전 IgG4 항체, 본 명세서에서 정의된 다른 항체 클래스 또는 아이소타입 등의, 전장 항체이다.
다른 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 저분자 화합물 및 항원과 함께 3자 복합체를 형성한다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 분자는 항체이다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 중쇄 CDR1, CDR2, CDR3을 개재시켜 저분자 화합물에 결합한다. 일 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 저분자 화합물에 대한 결합 모티프를 갖는다. 저분자 화합물에 대한 결합 모티프는, 예를 들어 Kabat 넘버링으로 표시되는 33위, 52위, 52a위, 53위, 55위, 56위, 58위, 95위, 96위, 98위, 100a위, 100b위, 100c위에 존재하는 적어도 하나의 아미노산으로 구성될 수 있다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 예를 들어 Kabat 넘버링으로 표시되는 33위, 52위, 52a위, 53위, 55위, 56위, 58위, 95위, 96위, 98위, 100a위, 100b위, 100c위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산을 개재시켜 저분자 화합물에 결합한다. 본 발명의 항원 결합 분자와 저분자 화합물이 결합하여 형성된 복합체에 대해서, 추가로 항원이 결합해도 된다. 또한, 저분자 화합물은, 항원 결합 분자와 항원이 상호작용하는 계면에 존재하여, 그들 양자에 결합하고 있어도 된다. 본 발명의 항원 결합 분자가, 저분자 화합물 및 항원과 함께 3자 복합체를 형성하고 있는 것은, 예를 들어 후술하는 결정 구조 해석 등의 수법에 의해 확인할 수 있다(실시예 참조). 특정의 태양에 있어서, 저분자 화합물은 아데노신 함유 화합물이다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 저분자 화합물은, 「표적 조직 특이적 화합물」이다. 추가적인 태양에 있어서, 「표적 조직 특이적 화합물」은, 종양 조직 특이적 화합물이다. 예시적인 표적 조직 특이적 화합물 및 종양 조직 특이적 화합물이, 본 명세서(예를 들어, 「II. 조성물 및 방법(항CD137 아고니스트 항원 결합 분자), A. 예시적 항CD137 항원 결합 분자 또는 항체,［저분자 화합물에 의존한 결합 활성］」에 있어서 개시된다.
B. 항원
본 명세서에 있어서, 「항원」은, 본 발명의 항원 결합 분자가 결합하는 에피토프를 포함하는 한 그 구조는 특별히 한정되지 않는다. 항원은 무기물이어도 되고, 유기물이어도 된다. 몇 가지 태양에 있어서, 항원으로서는, 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-아이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 어드레신, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨 인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극 인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2, BMP-2 a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4, BMP-2b, BMP-5, BMP-6, Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 붐베신, 골 유래 신경 영양 인자, BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암태아성 항원(CEA), 암관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리누스균 독소, 웰슈균 독소, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD1, PDL1, LAG3, TIM3, galectin-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어 인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, endothelin 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프락탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파 1, GFR-알파 2, GFR-알파 3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출 인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린양(樣) 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 무틴(Muc1), MUC18, 뮐러관 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴라이신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-캐드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리 포스파타제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로렐락신, 프로틴 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 렐락신 A쇄, 렐락신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV) F, RSV Fgp, Ret, 리우마이드 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T 세포 수용체(예를 들어, T 세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP양 알칼리 포스파타제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파 베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2 A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 커넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL-R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TLR(Toll-like receptor) 1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 유로키나제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직 인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor Xia, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P 등을 들 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 항원으로서는, 호르몬 및 성장 인자를 위한 수용체 등을 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원은, 종양 조직에 포함되는 세포(예를 들어 종양 세포, 면역 세포, 간질 세포 등)가 발현 또는 분비하는 항원이다.
C. 활성, 조성물 및 방법
일 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 세포 상해 활성으로서는, 예를 들어 항체 의존성 세포 개재성 세포 상해(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 활성, 항체 의존성 세포 탐식 활성(antibody-dependent cellular phagocytosis; ADCP), 보체 의존성 세포 상해(complement-dependent cytotoxicity: CDC) 활성, 및 T 세포에 의한 세포 상해 활성 등을 들 수 있다. CDC 활성이란 보체계에 의한 세포 상해 활성을 의미한다. 한편, ADCC 활성이란, 표적 세포의 세포 표면에 존재하는 항원에 항원 결합 분자가 결합하고, 추가로 당해 항원 결합 분자에 이펙터 세포가 결합하는 것에 의해, 당해 이펙터 세포가 표적 세포에 상해를 주는 활성을 의미한다. 목적하는 항원 결합 분자가 ADCC 활성을 갖는지 여부, 또는 CDC 활성을 갖는지 여부는 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Coligan 등 편(1993) 등 ).
일 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 중화 활성이란, 어떠한 생물학적 활성에 관여하는 분자에 항원 결합 분자가 결합하는 것에 의해, 당해 생물학적 활성을 저해하는 활성을 말한다. 몇 가지 태양에 있어서, 생물학적 활성은 리간드와 리셉터의 결합에 의해 초래된다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 분자가 당해 리간드 또는 리셉터에 결합하는 것에 의해, 당해 리간드와 리셉터의 결합을 저해한다. 항원 결합 분자가 항체인 경우, 이와 같은 중화 활성을 갖는 항원 결합 분자는 중화 항체로 불린다. 어느 피검 물질의 중화 활성은, 리간드의 존재하에 있어서의 생물학적 활성을 그 피검 물질의 존재 또는 비존재하의 조건 사이에서 비교하는 것에 의해 측정될 수 있다.
일 국면에 있어서, 본 발명은, 화합물의 농도에 따라서 항원 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 화합물이 표적 조직 특이적 화합물인 경우, 본 발명은, 표적 조직에 있어서 특이적으로 작용하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 표적 조직은 종양 조직이다. 화합물이 종양 조직 특이적 화합물의 경우, 본 발명은, 종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 몇 가지 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 다른 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 몇 가지 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 다른 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, (a) 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정, (b) 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및 (c) 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 상이한 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 몇 가지 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, (a) 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정, (b) 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정, 및 (c) 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 상이한 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 혹은 다른 국면에 있어서, 본 발명은, 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 감소하는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 당해 제조 방법은, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 추가적인 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다. 다른 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 고농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 저농도의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 분자를 선택하는 공정을 포함한다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, 높은 혈장중 체류성을 갖는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 몇 가지 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 공정을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, (a) 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 공정, 및 (b) (a)에서 제조된 항원 결합 분자의 혈장중 체류성을 측정하는 공정을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 화합물은, 표적 조직 특이적 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 화합물은, 종양 조직 특이적 화합물이다. 본 발명에 있어서의 항원 결합 분자가 높은 혈장중 체류성을 갖고 있는지 여부의 판단은, 대조가 되는 항원 결합 분자와의 상대적인 비교에 의해 행할 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자는, 대조가 되는 항원 결합 분자와 비교하여, 높은 혈장중 체류성을 갖는다. 일 태양에 있어서, 대조가 되는 항원 결합 분자는, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자란, 당해 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차이가, 예를 들어 2배보다 작은, 1.8배보다 작은, 1.5배보다 작은, 1.3배보다 작은, 1.2배보다 작은, 또는 1.1배보다 작은 항원 결합 분자를 의미한다. 비교의 관점에서 보면, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 충분량의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 서로 실질적으로 동등한 것이 바람직하다.
다른 국면에 있어서, 본 발명은, 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는 항원 결합 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 몇 가지 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 공정을 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, (a) 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자를 제조하는 공정, 및 (b) (a)에서 제조된 항원 결합 분자의 혈장중 항원 축적능을 측정하는 공정을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 화합물은, 표적 조직 특이적 화합물이다. 추가적인 태양에 있어서, 화합물은, 종양 조직 특이적 화합물이다. 본 발명에 있어서의 항원 결합 분자가 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖고 있는지 여부의 판단은, 대조가 되는 항원 결합 분자와의 상대적인 비교에 의해 행할 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 표적 조직 특이적 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자는, 대조가 되는 항원 결합 분자와 비교하여, 낮은 혈장중 항원 축적능을 갖는다. 일 태양에 있어서, 대조가 되는 항원 결합 분자는, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자란, 당해 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차이가, 예를 들어 2배보다 작은, 1.8배보다 작은, 1.5배보다 작은, 1.3배보다 작은, 1.2배보다 작은, 또는 1.1배보다 작은 항원 결합 분자를 의미한다. 비교의 관점에서 보면, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 충분량의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 서로 실질적으로 동등한 것이 바람직하다.
몇 가지 태양에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 항원 결합 분자의, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성의 차이는, 예를 들어 2배 이상, 3배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 500배 이상, 1×103배 이상, 2×103배 이상, 3×103배 이상, 5×103배 이상, 1×104배 이상, 2×104배 이상, 3×104배 이상, 5×104배 이상, 또는 1×105배 이상이다.
몇 가지 태양에 있어서, 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant: 해리 상수)치를 이용하여 나타내도 되고, kd(Dissociation rate constant: 해리 속도 상수)치를 이용하여 나타내도 된다. 혹은 전술된 바와 같은, 항원 결합 분자에 대한 항원의 결합량을 이용하여 나타내도 된다. 혹은 다른 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 세포 상해 활성이나 중화 활성을 항원 결합 활성 대신의 지표로서 이용해도 된다.
특정의 태양에 있어서, 보다 높은 쪽의 항원 결합 활성으로서는, 예를 들어, KD치가 9×10-7M 이하, 8×10-7M 이하, 7×10-7M 이하, 6×10-7M 이하, 5×10-7M 이하, 4×10-7M 이하, 3×10-7M 이하, 2×10-7M 이하, 1×10-7M 이하, 9×10-8M 이하, 8×10-8M 이하, 7×10-8M 이하, 6×10-8M 이하, 5×10-8M 이하, 4×10-8M 이하, 3×10-8M 이하, 2×10-8M 이하, 1×10-8M 이하, 9×10-9M 이하, 8×10-9M 이하, 7×10-9M 이하, 6×10-9M 이하, 5×10-9M 이하, 4×10-9M 이하, 3×10-9M 이하, 2×10-9M 이하, 1×10-9M 이하, 혹은, 항원의 결합량이 0.01 이상, 0.02 이상, 0.03 이상, 0.04 이상, 0.05 이상, 0.06 이상, 0.07 이상, 0.08 이상, 0.09 이상, 0.1 이상, 0.2 이상, 0.3 이상, 0.4 이상, 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 1 이상 등을 들 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 보다 낮은 쪽의 항원 결합 활성으로서는, 예를 들어, KD치가 1×10-8M 이상, 2×10-8M 이상, 3×10-8M 이상, 4×10-8M 이상, 5×10-8M 이상, 6×10-8M 이상, 7×10-8M 이상, 8×10-8M 이상, 9×10-8M 이상, 1×10-7M 이상, 2×10-7M 이상, 3×10-7M 이상, 4×10-7M 이상, 5×10-7M 이상, 6×10-7M 이상, 7×10-7M 이상, 8×10-7M 이상, 9×10-7M 이상, 1×10-6M 이상, 2×10-6M 이상, 3×10-6M 이상, 4×10-6M 이상, 5×10-6M 이상, 6×10-6M 이상, 7×10-6M 이상, 8×10-6M 이상, 9×10-6M 이상, 혹은, 항원의 결합량이 0.5 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 0.1 이하, 0.09 이하, 0.08 이하, 0.07 이하, 0.06 이하, 0.05 이하, 0.04 이하, 0.03 이하, 0.02 이하, 0.01 이하, 0.009 이하, 0.008 이하, 0.007 이하, 0.006 이하, 0.005 이하, 0.004 이하, 0.003 이하, 0.002 이하, 0.001 이하 등을 들 수 있다.
화합물의 농도로서는, 항원 결합 분자의 결합 활성에 차이가 검출되는 한, 임의의 농도를 선택할 수 있다. 예시적인 농도(고농도 및 저농도)가 본 명세서 중에서 거론되고 있다. 특정의 태양에 있어서, 고농도로서는, 예를 들어 1μM 또는 그보다 높은 농도, 3μM 또는 그보다 높은 농도, 10μM 또는 그보다 높은 농도, 30μM 또는 그보다 높은 농도, 100μM 또는 그보다 높은 농도, 300μM 또는 그보다 높은 농도, 1mM 또는 그보다 높은 농도를 들 수 있다. 혹은, 각각의 항원 결합 분자가 최대의 결합 활성을 나타내는 충분량을 여기에서의 고농도로 할 수도 있다. 특정의 태양에 있어서, 저농도로서는, 예를 들어 1mM 또는 그보다 낮은 농도, 300μM 또는 그보다 낮은 농도, 100μM 또는 그보다 낮은 농도, 30μM 또는 그보다 낮은 농도, 10μM 또는 그보다 낮은 농도, 3μM 또는 그보다 낮은 농도, 1μM 또는 그보다 낮은 농도 등을 들 수 있다. 혹은, 각각의 항원 결합 분자가 최소의 결합 활성을 나타낼 때의 농도를 여기에서의 저농도로 할 수도 있다. 실질적인 농도가 제로(화합물의 비존재하)인 경우를, 저농도의 일 태양으로 할 수도 있다.
추가적인 국면에 있어서, 당해 제조 방법은, 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이, 화합물의 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성과 상이한 항원 결합 분자를, 항원 결합 분자의 라이브러리로부터 선택하는 공정을 포함한다. 항원 결합 분자의 라이브러리는, 항원 결합 분자의 레퍼터리에 바이어스가 걸쳐지지 않은 라이브러리(나이브 라이브러리)여도 되고, 바이어스가 걸쳐진 라이브러리여도 된다. 후자의 라이브러리의 예로서는, 소정의 화합물에 대한 결합능이 미리 부여된 항원 결합 분자의 라이브러리를 들 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 항원 결합 분자의 라이브러리는, 소정의 화합물에 대한 결합능을 부여하기 위한 아미노산 개변이 미리 도입되어 있는 항원 결합 분자의 라이브러리이다. 그와 같은 라이브러리의 예로서, 예를 들어, 국제 공개 WO2015/083764에 기재된 라이브러리가 참조될 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 추가로 (d) (c)에서 선택된 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산을 얻는 공정, (e) (d)에 기재된 핵산을 숙주 세포에 도입하는 공정, 및 (f) 항원 결합 분자가 발현하도록 (e)에 기재된 세포를 배양하는 공정을 포함한다. (d)에 기재된 핵산은, 1 이상의 핵산이어도 되고, 또한 1 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)에 포함되어 있어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 당해 제조 방법은, 추가로 (g) (f)에 기재된 세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정을 포함한다.
본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자도, 본 발명에 포함된다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자를 포함하는, 약학적 제제를 제공한다. 일 태양에 있어서, 상기의 약학적 제제는, 추가로 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명은, 종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 약학적 제제를 제공한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자를, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 공정을 포함하는, 약학적 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 추가적인 태양에 있어서, 본 발명은, 종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 약학적 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자가 생체 내에 투여되었을 경우, 당해 항원 결합 분자는, 비종양 조직에 비해, 종양 조직에 있어서보다 강한 항원 결합 활성을 나타낸다. 이와 같은 반응의 차이는, 당해 항원 결합 분자의 모든 용량에서 관찰될 필요는 없고, 어느 특정의 범위의 용량에서 관찰되면 된다. 다른 태양에 있어서, 비종양 조직에 비해, 종양 조직에 있어서 표적이 되는 세포(항원을 발현하는 세포)가 보다 강하게 상해된다. 다른 태양에 있어서, 비종양 조직에 비해, 종양 조직에 있어서 보다 낮은 용량에서 표적이 되는 세포가 상해된다. 혹은 다른 태양에 있어서, 부작용이 관찰되는 것보다도 낮은 용량에서, 치료 효과가 관찰된다. 여기에서의 치료 효과란 항종양 효과(예를 들어, 종양의 퇴축, 종양 세포에 대한 세포사의 유도 혹은 증식 억제 등)의 발현이며, 부작용이란 정상 조직에 있어서의 유해 사상(예를 들어, 정상 조직에 대한 상해 등)의 발생이다.
일 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항원 결합 분자에 의해 초래되는 의약품으로서의 효과의 정도는, 화합물 의존적인(즉, 화합물의 농도에 따라서 변화하는) 항원 결합 활성을 갖고 있는지 여부에 따라서 상이하다. 몇 가지 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 화합물의 농도가 높아짐에 따라 항원 결합 활성이 증대하는 항원 결합 분자이다. 몇 가지 태양에 있어서, 대조가 되는 항원 결합 분자는, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자이다. 특정의 태양에 있어서, 화합물은 종양 조직 특이적 화합물이다. 특정의 태양에 있어서, 화합물의 농도에 의존한 항원 결합 활성을 갖지 않는 항원 결합 분자란, 당해 화합물의 존재하와 비존재하에 있어서의 항원 결합 활성의 차이가, 예를 들어 2배보다 작은, 1.8배보다 작은, 1.5배보다 작은, 1.3배보다 작은, 1.2배보다 작은, 또는 1.1배보다 작은 항원 결합 분자를 의미한다. 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 충분량의 화합물의 존재하에 있어서의 항원 결합 활성이 서로 실질적으로 동등한 것이 바람직하다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 각각에 의해 초래되는 의약품으로서의 효과가 상이하다. 특정의 태양에 있어서, 화합물의 농도가 낮은 조직에 있어서, 의약품으로서의 효과가 상이하다. 화합물의 농도가 낮은 조직으로서, 예를 들어 정상 조직 등의 비종양 조직을 들 수 있다. 항원 결합 분자는, 그것을 포함하는 약학적 제제로서 제공될 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 낮은 조직에 있어서는, 대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자에서는, 표적이 되는 세포(항원을 발현하는 세포)를 상해하는 활성이 낮다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 낮은 조직에 있어서는, 대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자에서는, 세포를 상해하기 위해서 필요한 용량이 많다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 낮은 조직에 있어서는, 대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자에서는, 부작용의 레벨이 낮다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 낮은 조직에 있어서는, 대조의 항원 결합 분자와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자에서는, 부작용이 관찰될 때의 용량이 많다. 이와 같은 반응의 차이는, 모든 조직(예를 들어, 화합물의 농도가 낮은 모든 조직)에서 관찰될 필요는 없고, 어느 것인가의 조직에서 관찰되면 된다. 특정의 태양에 있어서, 부작용이란 정상 조직에 있어서의 유해 사상(예를 들어, 정상 조직에 대한 상해 등)이다.
일 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조가 되는 항원 결합 분자는, 각각에 의해 초래되는 의약품으로서의 효과가 실질적으로 동등하다. 특정의 태양에 있어서, 화합물의 농도가 높은 조직에 있어서, 의약품으로서의 효과가 실질적으로 동등하다. 화합물의 농도가 높은 조직으로서, 예를 들어 종양 조직을 들 수 있다. 항원 결합 분자는, 그것을 포함하는 약학적 제제로서 제공될 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 높은 조직에 있어서는, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조의 항원 결합 분자는, 표적이 되는 세포(항원을 발현하는 세포)를 상해하는 활성이 실질적으로 동등하다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 높은 조직에 있어서는, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조의 항원 결합 분자와는, 세포를 상해하기 위해서 필요한 용량이 실질적으로 동등하다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 높은 조직에 있어서는, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조의 항원 결합 분자는, 치료 효과의 레벨이 실질적으로 동등하다. 몇 가지 태양에 있어서, 화합물의 농도가 높은 조직에 있어서는, 본 발명의 항원 결합 분자와 대조의 항원 결합 분자는, 치료 효과가 관찰될 때의 용량이 실질적으로 동등하다. 특정의 태양에 있어서, 치료 효과는 항종양 효과(예를 들어, 종양의 퇴축, 종양 세포에 대한 세포사의 유도 혹은 증식 억제 등)이다.
추가적인 국면에 있어서, 의약품으로서의 사용을 위한 항원 결합 분자가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 종양의 치료에 있어서의 사용을 위한 항원 결합 분자가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 의약품의 제조에 있어서의 항원 결합 분자의 사용이 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 종양을 치료하기 위한 항원 결합 분자의 사용이 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 종양을 치료하는 방법으로서, 종양을 갖는 개체에게 항원 결합 분자의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법이 제공된다. 상기 태양의 임의의 것에 의한 「개체」는, 적합하게는 인간이다.
＜ATP 농도를 측정하는 방법＞
일 국면에 있어서, 본 발명은, 용액 중에 있어서의 ATP 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 몇 가지 태양에 있어서, 상기의 방법은, (a) P2Y 수용체를 발현하는 split Luc/HEK293 세포를 당해 용액에 접촉시키는 공정, 및 (b) 당해 세포 내의 루시페라제 활성을 측정하는 공정을 포함한다. P2Y 수용체는, 세포 외의 퓨린 뉴클레오티드(ATP, ADP), 피리미딘 뉴클레오티드(UTP, UDP), 당 뉴클레오티드 등을 내인성 리간드로 하는 세포 표면 수용체이며, 7회 막관통형의 G 단백질 공액형 수용체(GPCR)이다. 추가적인 태양에 있어서, P2Y 수용체는, P2Y1(Accession No. U42029), P2Y2(Accession No. U07225), P2Y4(Accession No. X91852), P2Y6(Accession No. X97058), P2Y11(Accession No. AF030335), P2Y12(Accession No. AJ320495), P2Y13(Accession No. AF295368), P2Y14(Accession No. D13626)의 어느 것인가이다. 특정의 태양에 있어서, P2Y 수용체는, P2Y11(Accession No. AF030335)이다. split Luc/HEK293 세포는, ProbeX사 보유의 스플릿 루시페라제 기술을 이용하여 제작된 재조합 세포이며(Misawa et al., Anal. Chem. (2010) 82, 2552-2560), 이하의 2개의 단백질을 발현하고 있다: (i) P2Y 수용체의 C말단에, 루시페라제 분자를 2분할한 중의 C말단측의 단편이 연결된 융합 단백질, 및 (ii) β 알레스틴(Accession No. NM_004313)의 N말단에, 루시페라제 분자를 2분할한 중의 N말단측의 단편이 연결된 융합 단백질.
P2Y 수용체를 발현하는 split Luc/HEK293 세포에 ATP를 첨가하면, 세포막 근방에 있어서 P2Y 수용체와 β 알레스틴의 상호작용이 일어나, 그 결과, 분할된 루시페라제가 회합하여, 활성인 루시페라제 분자가 세포 내에서 재구성된다. 루시페라제의 활성은, 예를 들어 루시페린 등의 루시페라제 기질을 이용하여 측정할 수 있다. 몇 가지 태양에 있어서, 상기의 방법은, 루시페라제 기질을 포함하는 용액을 당해 세포에 접촉시키는 공정을 추가로 포함한다. 루시페라제 기질을 포함하는 용액은, 공정(a)의 전에 당해 세포에 접촉시켜도 되고, 공정(a)의 후에 당해 세포에 접촉시켜도 된다.
몇 가지 태양에 있어서, ATP 농도가 측정되는 용액은, in vitro의 용액이어도 되고, in vivo의 조직 중에 있어서의 체액이어도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 체액은, 혈액, 림프액, 조직액(조직간액, 세포간액, 간질액), 체강액(장막강액, 흉수, 복수, 심낭액), 뇌척수액(수액), 관절액(활액), 안방수(방수)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 체액은, 세포간액이다. 다른 태양에 있어서, 조직은 건상 조직/정상 조직이어도 되고, 질환 조직(예를 들어, 종양 조직 등)이어도 된다. 일 태양에 있어서, 상기의 방법이, in vivo 조직 중의 체액에 있어서의 ATP 농도를 측정하는 방법인 경우, 공정(i)은, P2Y 수용체를 발현하는 split Luc/HEK293 세포를 in vivo의 조직 중에 이식하는 공정이어도 된다.
몇 가지 태양에 있어서, 루시페라제 활성은, 그것이 루시페린 등의 기질과 반응할 때에 발하는 광을 검출하는 것에 의해 측정할 수 있다. 용액이 in vitro의 용액인 경우, 그와 같은 발광은, 플레이트 리더 등의 발광 검출용 기기를 이용하여 측정할 수 있다. 용액이 in vivo의 조직 중에 있어서의 체액인 경우, 그와 같은 발광은, in vivo 발광 이미징 장치 등을 이용하여 측정할 수 있다. 측정치의 정량화는, 예를 들어 당업자 주지의 방법으로서 기정 농도의 ATP를 포함하는 용액을 측정하고, ATP 농도와 발광량의 상관을 나타내는 검량선을 작성함으로써 행할 수 있다.
V. 스크리닝 방법
(1) 다가의 항원을 이용한 분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법
일 국면에 있어서, 본 개시는, 1분자(1단위)의 융합 파트너 분자에, 2분자(2단위) 이상의 항원을 융합시켜 얻어지는 융합 분자를 이용하여, 분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 고효율, 고정밀도로 스크리닝, 동정, 취득하는 방법을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 방법은, 분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법은,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 융합 파트너 분자 1단위당 2단위 이상의 항원을 융합한 융합 분자에, 항원 결합 도메인 혹은 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 해당 융합 분자 중의 항원과 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 2분자(2단위) 이상의 항원을 융합시키는 융합 파트너 분자는, 2량체의 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 Fc 영역은, 제 1의 Fc 서브유닛 및 제 2의 Fc 서브유닛을 포함하고, 제 1 및 제 2의 Fc 서브유닛의 각각에 항원 1개씩 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 항원은, 제 1 및 제 2의 Fc 서브유닛의 N말단에 1개씩 융합되어 있는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리가, 파지 라이브러리인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 파지 라이브러리에 포함되는 파지는, 2 이상의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 그 표면에 제시하는 파지인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 파지 라이브러리에 포함되는 파지는, 헬퍼 파지 유래 pIII 유전자에 결손을 갖는 파지인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원은, 전술한 바와 같은 임의의 항원이어도 되고, 예를 들어, 전술한 「IV. 조성물 및 방법(화합물의 농도에 따라서 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 항원 결합 분자), B. 항원」에 기재되어 있는 각종의 「항원」을 들 수 있다. 일 태양에 있어서, 바람직하게는 막형 항원(예를 들어, CD137, CTLA4, CD40, OX40, RANK, GITR, ICOS 등의 부자극 분자)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, Fc 영역(Fc 서브유닛)과 항원의 융합은, 전술한 바와 같은 유전자 조작 기술을 이용하여 상법(常法)에 의해 제작할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 저분자 화합물은, 전술한 바와 같은 여러 가지 화합물(예를 들어, 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 이노신, 또한, 시판되는 ADPbetaS(Sigma제) 등의 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드, 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산, 키누레닌, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 키누렌산 등의 아미노산의 대사 산물, 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사 산물, 락트산, 석신산, 시트르산 등의 해당계 또는 크렙스 회로의 1차 대사 산물, 1-메틸니코틴아마이드 등의 니코틴아마이드의 대사 산물 등의 종양 조직 특이적 화합물)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원(예를 들어, Fc 영역과 항원과의 융합 분자)의, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 파지 라이브러리에의 접촉, 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 단리, 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 저분자 화합물의 존재하 또는 비존재하에서의 어세이는, 전술한 방법 및 이하의 실시예에 기재되는 방법에 따라, 본원 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 참조하면서 행할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법은, 실시예 2에 기재되는 방법을 들 수 있다.
(2) 2 이상의 상이한 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법
일 국면에 있어서, 본 개시는, 2 이상의 상이한 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 방법은,
(a) 제 1의 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 혹은 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 제 1의 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고,
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정,
(d) 상기 공정(c)에서 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를, 제 2의 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 상기 항원에 접촉시키고,
(e) 상기 공정(d)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 제 2의 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고,
(f) 상기 공정(e)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하고, 상기 (c) 및 (d)의 사이에, 상기 (c)에서 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 코딩하는 유전자를 증폭하는 것을 포함하지 않는,
것을 특징으로 한다
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리가, 파지 라이브러리인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원은, 전술한 바와 같은 임의의 항원이어도 되고, 바람직하게는 막형 항원(예를 들어, CD137, CTLA4, CD40, OX40, RANK, GITR, ICOS 등의 부자극 분자)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 저분자 화합물은, 전술한 바와 같은 여러 가지 화합물(예를 들어, 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 이노신 등의 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드, 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산, 키누레닌, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 키누렌산 등의 아미노산의 대사 산물, 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사 산물, 락트산, 석신산, 시트르산 등의 해당계 또는 크렙스 회로의 1차 대사 산물, 1-메틸니코틴아마이드 등의 니코틴아마이드의 대사 산물 등의 종양 조직 특이적 화합물)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 제 1의 저분자 화합물 및 제 2의 저분자 화합물은, 상기의 여러 가지 저분자 화합물로부터 선택된 임의의 2종류의 상이한 화합물일 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원의, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 파지 라이브러리에의 접촉, 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 단리, 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 제 1의 저분자 화합물의 존재하 또는 비존재하에서의 어세이, 및 제 2의 저분자 화합물의 존재하 또는 비존재하에서의 어세이는, 전술한 방법 및 이하의 실시예에 기재되는 방법에 따라, 본원 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 참조하면서 행할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법은, 실시예 9에 기재되는 방법을 들 수 있다.
(3) 나이브 라이브러리를 이용한 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법
일 국면에 있어서, 본 개시는, 항원 자극을 받은 적이 없는 인간 림프구(예를 들어, 인간 PBMC)로부터 제작한 서로 상이한 인간 항체 서열의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자(예를 들어, Fab 도메인)를 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 나이브 라이브러리(naive library)를 이용하여, 저분자 화합물에 의존한 항원 결합 활성을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 태양에 있어서, 본 개시의 방법은,
(a) 저분자 화합물의 존재하에 있어서, 항원에, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 나이브 라이브러리를 접촉시키고,
(b) 상기 공정(a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 당해 화합물의 비존재하 또는 저농도 존재하에 두고, 및
(c) 상기 공정(b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는
것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 나이브 라이브러리는, 2 이상의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 그 표면에 제시하는 파지를 포함하는 파지 라이브러리인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 나이브 라이브러리는, 헬퍼 파지 유래 pIII 유전자에 결손을 갖는 파지를 포함하는 라이브러리인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 나이브 라이브러리는, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 발현을, 해당 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 발현을 제어하고 있는 프로모터로부터의 발현량을 상승시키는 저분자 첨가물에 의해 증대시켜 조제된 파지를 포함하는 라이브러리인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 저분자 첨가물은, 아이소프로필-β-싸이오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 arabinose인 것을 특징으로 한다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원은, 전술한 바와 같은 임의의 항원이어도 되고, 바람직하게는 막형 항원(예를 들어, CD137, CTLA4, CD40, OX40, RANK, GITR, ICOS 등의 부자극 분자)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 해당 저분자 화합물은, 전술한 바와 같은 여러 가지의 화합물(예를 들어, 아데노신(ADO), 아데노신 3인산(ATP), 아데노신 2인산(ADP), 아데노신 1인산(AMP), 이노신 등의 퓨린환 구조를 갖는 뉴클레오티드, 알라닌, 글루타민산, 아스파라긴산 등의 아미노산, 키누레닌, 안트란일산, 3-하이드록시키누레닌, 키누렌산 등의 아미노산의 대사 산물, 프로스타글란딘 E2 등의 아라키돈산의 대사 산물, 락트산, 석신산, 시트르산 등의 해당계 또는 크렙스 회로의 1차 대사 산물, 1-메틸니코틴아마이드 등의 니코틴아마이드의 대사 산물 등의 종양 조직 특이적 화합물)을 들 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법에 있어서는, 항원의, 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 파지 라이브러리에의 접촉, 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 단리, 단리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 저분자 화합물의 존재하 또는 비존재하에서의 어세이는, 전술한 방법 및 이하의 실시예에 기재되는 방법에 따라, 본원 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 참조하면서 행할 수 있다.
일 태양에 있어서, 이러한 본 개시의 방법은, 실시예 10에 기재되는 방법을 들 수 있다.
실시예
이하는, 본 개시의 방법 및 조성물의 실시예이다. 전술한 일반적인 기재에 비추어, 여러 가지의 다른 태양이 실시될 수 있음이 이해될 것이다.
실시예 1: 항원의 조제
(1-1) 인간 CD137 세포외 영역의 조제
인간 CD137 세포외 영역(hCD137이라고도 부른다)은 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137의 세포외 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 히스티딘 태그를 코딩하는 유전자 단편과 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열 번호: 86)을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 영역, 히스티딘 태그와 Avitag가 연결된 단백질(인간 CD137 또는 hCD137-HisBAP, 서열 번호: 87)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터는 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 동시에 도입되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, 목적하는 단백질(인간 CD137 세포외 영역)이 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양액이 0.22μm 필터로 여과되어, 배양 상청이 얻어졌다.
배양 상청은 HisTrap-HP(GE healthcare)에 어플라이되고, 인간 CD137 세포외 영역이 컬럼에 결합되었다. 20mM 인산 나트륨, 500mM 염화 나트륨, 500mM 이미다졸, pH 7.5 용액을 이용하여 인간 CD137 세포외 영역이 용출되었다. 다음에, Superdex 200 26/600(GE healthcare)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 회합체가 제거되어, 정제 인간 CD137 세포외 영역이 얻어졌다.
인간 CD137의 농도는, 서열 번호: 87로부터 추측되는 시그널 시퀀스를 제외한 아미노산 서열(서열 번호: 183)을 기초로 Pace 등의 방법으로 산출했다. (Pace, C.N., et al. Protein Science 1995; 4; 2411-2423)
(1-2) 인간 CD137 세포외 영역(hCD137(FXa digested))의 조제
인간 CD137 세포외 영역(hCD137(FXa digested)라고도 부른다)은 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137의 세포외 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 Factor Xa 절단 서열을 코딩하는 유전자 단편과 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 영역, FactorXa 절단 서열과 항체 정상 영역이 연결된 단백질(hCD137-F-Fc, 서열 번호: 89)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터가 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 동시에 도입되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, hCD137-F-Fc가 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양액은 0.22μm 필터로 여과되어, 배양 상청이 회수되었다.
배양 상청이 Protein A(MabSelect SuRe, GE헬스케어)가 충전되어 있는 컬럼에 어플라이되었다. hCD137-F-Fc가 컬럼에 결합되고, 50mM 아세트산 용액으로 용출되었다. 용출액이 1M Tris-HCl, pH 8.0으로 중화된 후, hCD137-F-Fc의 용매가 20mM Tris, 100mM 염화 나트륨, 2mM 염화 칼슘, pH 8.0으로 치환되었다. 다음에, Factor Xa Protease(NEW ENGLAND BioLabs, Cat#.P8010L)가 첨가되어, hCD137-F-Fc가 소화되었다. 그 후 프로테아제 저해제(DNS-GGACK, calbiochem, Cat#251700)가 첨가되어 반응이 정지되었다. 프로테아제 반응액에 5M 염화 나트륨이 첨가되고, 조제된 용액 전량이 HiTrap Benzamidine(GE헬스케어, Cat# 17-5143-01)에 어플라이되었다. 컬럼을 통과한 용액이 추가로 Protein A(MabSelect SuRe, GE헬스케어) 컬럼에 어플라이되어 패스 획분이 회수되었다. 패스 획분은 Superdex 200 Increase, 10/30(GE헬스케어, Cat#28990944)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 회합체가 제거되어, 정제 인간 CD137 세포외 영역이 얻어졌다.
(1-3) 비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137의 조제
비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137(「비오틴화 hCD137-Fc」 또는 「bio-hCD137-Fc」, hCD137-Fc-Bio라고도 부른다)은 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137의 세포외 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편과 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열 번호: 86)을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 영역, 항체의 정상 영역과 Avitag가 연결된 단백질(Fc 융합형 인간 CD137, 서열 번호: 90)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터는 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자 및 비오틴리가제(BirA, 서열 번호: 91)를 발현하는 유전자가 동시에 도입되고, 추가로 Fc 융합형 인간 CD137을 비오틴화할 목적으로 비오틴이 첨가되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, 목적하는 단백질(비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137)이 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양액은 0.22μm 필터로 여과되어, 배양 상청이 얻어졌다.
배양 상청은 Protein A(MabSelect SuRe, GE헬스케어)가 충전되어 있는 컬럼에 어플라이되어 비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137이 컬럼에 결합되었다. 50mM 아세트산 용액을 이용하여 비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137이 용출되었다. 다음에, Superdex 200, 26/600(GE healthcare)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 회합체가 제거되어, 정제 비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137이 얻어졌다.
(1-4) Fc 융합형 인간 CD137의 조제
Fc 융합형 인간 CD137(hCD137-Fc라고도 부른다)은 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137의 세포외 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편과 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열 번호: 86)을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 영역, 항체의 정상 영역과 Avitag가 연결된 단백질(Fc 융합형 인간 CD137, 서열 번호: 90)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터는 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293F 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자를 발현하는 유전자가 동시에 도입되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, 목적하는 단백질(Fc 융합형 인간 CD137)이 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양액은 0.22μm 필터로 여과되어, 배양 상청이 얻어졌다.
배양 상청은 Protein A(MabSelect SuRe, GE헬스케어)가 충전되어 있는 컬럼에 어플라이되어, Fc 융합형 인간 CD137이 컬럼에 결합되었다. 50mM 아세트산 용액을 이용하여 Fc 융합형 인간 CD137이 용출되었다. 다음에, Superdex 200, 26/600(GE healthcare)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 회합체가 제거되어, 정제 Fc 융합형 인간 CD137이 얻어졌다.
(1-5) 비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137의 조제
비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137(「cyCD137-Fc-BAP」라고도 부른다)은 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 원숭이 CD137의 세포외 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편과 비오틴이 부가되는 특이적인 서열(AviTag 서열, 서열 번호: 86)을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 원숭이 CD137의 세포외 영역, 항체의 정상 영역과 Avitag가 연결된 단백질(Fc 융합형 원숭이 CD137, 서열 번호: 92)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다.
구축된 플라스미드 벡터가, 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자 및 비오틴리가제(BirA, 서열 번호: 91)를 발현하는 유전자가 동시에 도입되고, 추가로 Fc 융합형 원숭이 CD137을 비오틴 표지할 목적으로 비오틴이 첨가되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, 목적하는 단백질(비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137)이 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양액은 0.22μm 필터로 여과되어, 배양 상청이 얻어졌다.
배양 상청은 Protein A(MabSelect SuRe, GE헬스케어)가 충전되어 있는 컬럼에 어플라이되어, 비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137이 컬럼에 결합되었다. 50mM 아세트산 용액을 이용하여 비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137이 용출되었다. 다음에, Superdex 200 increase 10/300(GE healthcare)을 이용한 겔 여과 크로마토그래피에 의해 회합체가 제거되어, 정제 비오틴화 Fc 융합형 원숭이 CD137이 얻어졌다.
실시예 2: ATP 의존성 CD137 항체의 취득
(2-1) ATP를 이용한 래셔널 디자인 라이브러리로부터의, 저분자에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항체(저분자 스위치 항체)의 취득(1)
(2-1-1) 패닝
선행 특허 WO2015/083764에 있어서 구축된 래셔널 디자인 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP) 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 취득되었다. 한편, 저분자 의존적인 항원(예를 들어 CD137) 결합 활성을 갖는 항체는, 「스위치 항체」 또는 「저분자 스위치 항체」라고 호칭되고, ATP 의존적인 항원(예를 들어 CD137) 결합 활성을 갖는 항체는 「스위치 항체」 또는 「ATP 스위치 항체」라고 호칭되는 경우가 있다. 취득을 위해서, ATP 존재하에서 비즈에 포착된 항원에 대해서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 그 후, ATP의 비존재하에서 비즈로부터 용출된 용출액으로부터 파지가 회수되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지하는 대장균으로부터 파지가 일반적인 방법으로 산생되었다. 구체적으로는, 구축된 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7ΔpIII(「하이퍼파지」라고 호칭)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 Tris Buffered Saline(TBS)으로 희석하는 것에 의해 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서, Sera-Mag NeutrAvidin beads(Thermo Fisher Scientific), 혹은 Dynabeads M-280 StreptAvidin(Life Technologies)이 이용되었다. 항원으로서 Jena Bioscience사로부터 구입된 비오틴화된 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP), 실시예 1-2 및 1-3에서 제작된 hCD137-Fc-Bio(서열 번호: 90) 또는 hCD137(FXa digested)을 No weight Premeasured NHS-PEO4-Biotin(PIERCE)을 이용하여 비오틴화한 bio-hCD137(서열 번호: 89)이 사용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위한 패닝이 실시되었다. 구체적으로는, 저분자인 ATP 존재하에서 항원에 결합하고, ATP 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에 나타난 방법을 참고로 실시되었다. Round1에서는 비오틴화 hCD137(bio-hCD137), hCD137-Fc-Bio 및 비오틴화 ATP(bio-ATP)는 모두, 먼저 비오틴화 항원을 자성 비즈 상에 고상화한 후에 조제된 파지 라이브러리 용액이 첨가되는 방법(「비즈 고상법」이라고 호칭)으로 패닝이 실시되었다. Bio-ATP에 대해서는, 저분자 화합물로서의 ATP의 비존재하에서, 항원(Bio-ATP)에 결합할 수 있는 항체를 농축하는 패닝이 전술한 선행 특허 WO2015/083764에 기재된 방법을 참고로 실시되었다. hCD137-Fc-Bio에 대해서는, Fc 영역에 결합하는 항체를 제거하기 위해서 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역 4nmol이 첨가되었다. 회수된 파지는 대장균주 ER2738에 첨가되어 파지를 대장균에 감염시킨 후, 회수된 대장균에 대해서 하이퍼파지를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다.
Round2 이후에서는 비오틴화 hCD137(bio-hCD137) 및 hCD137-Fc-Bio에 대해서만, 비즈 고상법으로 ATP 존재하에서 항원에 결합하고, ATP 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에 나타난 방법을 참고로 실시되었다. 어느 경우도 hCD137-Fc-Bio에 대해서는, Fc 영역에 결합하는 항체를 제거하기 위해서 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역 4nmol이 첨가되었다. 마찬가지의 패닝이 Round5까지 반복되어, 목적하는 항체 서열이 농축되었다.
(2-1-2) 파지 ELISA에 의한 ATP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성 평가
상기의 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 상법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라서, 파지 함유 배양 상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)을 이용하여, 회수된 배양 상청이 한외 여과되었다. 배양 상청 각 100μL가 각 웰에 어플라이된 NucleoFast 96을 원심분리(4,500g, 45분간)하는 것에 의해 플로 스루가 제거되었다. 100μL의 H2O가 각 웰에 가해진 당해 NucleoFast 96이, 재차 원심분리(4,500g, 30분간)에 의해 세정되었다. 마지막에 TBS 100μL가 가해지고, 실온에서 5분간 정치된 당해 NucleoFast 96의 각 웰 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS, 또는 ATP/TBS가 가해진 정제 파지가 이하의 수순으로 ELISA에 제공되었다. 384 well Microplates Streptavidin-coated(Greiner)가 실시예 1에서 제작된 비오틴화 항원(bio-hCD137, hCD137-Fc-Bio 및 bio-Fc)을 포함하는 10μL의 TBS에서 하룻밤 코팅되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 Tris Buffered Saline with Tween 20(TBST)으로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하지 않았던 비오틴화 항원이 제거된 후, 당해 웰이 80μL의 2% SkimMilk-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% SkimMilk-TBS는 TBST 세정으로 제거되고, 그 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 가해진 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치하는 것에 의해, 항체를 제시한 파지를, 각 웰에 존재하는 비오틴화 항원에 ATP의 비존재하 및 존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 또는 ATP/TBST로 세정된 각 웰에, TBS 또는 ATP/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(GE Healthcare 27-9421-01)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 ATP/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색 반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
그 결과, bio-hCD137 혹은 hCD137-Fc-Bio에 대해서, ATP 존재하와 비존재하에서 결합 활성이 변화하는 항체가 복수 확인되었다.
패닝 Round 4 및 5 후의 클론을 이용한 파지 ELISA의 결과를 표 9에 나타냈다.
여기에서, ATP 존재하에서의 흡광도가 0.2 이상이며, 또한 항원의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비가 2보다 높은 클론이 양성 클론으로 판정되었다. 더욱이, 당해 양성 클론 중, ATP의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N가 2.보다 높은 클론이 ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로 판정되었다.
Figure pct00009
(2-1-3) ATP의 존재/비존재에 의해 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 스위치 항체의 서열 해석
파지 ELISA의 결과, ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로부터 특이적인 프라이머 pBAD-F, G1seq-R을 이용하여 증폭된 유전자의 염기 서열이 해석되었다. 해석의 결과, 해석의 결과, ATP 존재하에서 인간 CD137에 결합하고, ATP 비존재하에서는 인간 CD137에 결합하지 않는다고 판단된 클론의 염기 서열이 취득되었다.
(2-2) ATP를 이용한 래셔널 디자인 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 취득(2)
(2-2-1) 패닝
선행 특허 WO2015/083764에 있어서 구축된 래셔널 디자인 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, ATP 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 취득되었다. 취득을 위해서, ATP 존재하에서 항원에 대해서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되고, 그 후 ATP의 비존재하에서 비즈로부터 용출된 용출액으로부터 파지가 회수되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지하는 대장균으로부터 파지가 일반적인 방법으로 산생되었다. 구체적으로는, 구축된 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석하는 것에 의해 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated), NeutrAvidin beads(TAMAGAWA SEIKI) 혹은 Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)이 이용되었다. 항원으로서 실시예 1에서 제작된 hCD137-Fc-Bio 또는 bio-hCD137이 사용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위한 패닝이 실시되었다. 구체적으로는, 저분자인 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP) 존재하에서 항원에 결합하고, ATP 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에서 나타난 방법을 참고로 실시되었다. bio-hCD137에 대해서는, 먼저 비오틴화 항원을 자성 비즈 상에 고상화한 후에 조제된 파지 라이브러리 용액이 첨가되는 방법(「비즈 고상법」이라고 호칭) 및, 먼저 비오틴화 항원과 조제된 파지 라이브러리 용액이 혼합된 후에 자성 비즈가 첨가되는 방법(「액상법」이라고 호칭)이 실시되었다. hCD137-Fc-Bio에 대해서는, Fc 영역에 결합하는 항체를 제거하기 위해서 비오틴화하지 않은 인간 IgG1 Fc 영역 4nmol이 첨가되고, 패닝은 액상법으로만 실시되었다. 회수된 파지는 대장균주 ER2738에 첨가되어, 파지를 대장균에 감염시킨 후, 회수된 대장균에 대해서 M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 마찬가지의 패닝이, Round5까지 반복되었다.
(2-2-2) 파지 ELISA에 의한 ATP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성 평가
상기의 방법에 의해 얻어진 각 Round 후의 대장균의 싱글 콜로니로부터, 상법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라서, 파지 함유 배양 상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)을 이용하여, 회수된 배양 상청이 한외 여과되었다. 배양 상청 각 100μL가 각 웰에 어플라이된 NucleoFast 96을 원심분리(4,500g, 45분간)하는 것에 의해 플로 스루가 제거되었다. 100μL의 H2O가 각 웰에 가해진 당해 NucleoFast 96이, 재차 원심분리(4,500g, 30분간)에 의해 세정되었다. 마지막에 TBS 100μL가 가해지고 실온에서 5분간 정치된 당해 NucleoFast 96의 각 웰 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS, 또는 ATP/TBS가 가해진 정제 파지가 이하의 수순으로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 실시예 1에서 제작된 비오틴화 항원(hCD137-Fc-Bio 또는 bio-hCD137)을 포함하는 100μL의 TBS에서 하룻밤 고상화되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하지 않았던 비오틴화 항원이 제거된 후, 당해 웰이 250μL의 2% SkimMilk-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% SkimMilk-TBS가 제거되고, 그 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 가해진 당해 플레이트가 37℃에서 1시간 정치되는 것에 의해, 항체를 제시한 파지가, 각 웰에 존재하는 비오틴화 항원에, ATP의 비존재하 및 존재하에 있어서 결합되었다. TBST 또는 ATP/TBST로 세정된 각 웰에, TBS 또는 ATP/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(GE Healthcare 27-9421-01)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 또는 ATP/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색 반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
그 결과, bio-hCD137 또는 hCD137-Fc-Bio에 대해서, ATP 존재하와 비존재하에서 결합 활성이 변화하는 항체가 복수 확인되었다.
예시로서 패닝 Round5 후의 클론을 이용한 파지 ELISA의 결과를 표 10에 나타냈다.
여기에서, ATP의 존재하에 있어서의 흡광도가 0.2 이상이고, 또한 항원의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비가 2보다 높은 클론이 양성 클론으로 판정되었다. 더욱이 당해 양성 클론 중, ATP의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비가 2보다 높은 것이 ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로 판정되었다.
Figure pct00010
(2-2-3) ATP의 존재/비존재에 의해 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 스위치 항체의 서열 해석
파지 ELISA의 결과, ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로부터 특이적인 프라이머 pBAD-F, G1seq-R을 이용하여 증폭된 유전자의 염기 서열이 해석되었다. 해석의 결과, ATP 존재하에서 인간 CD137에 결합하고, ATP 비존재하에서는 인간 CD137에 결합하지 않는다고 판단된 클론의 염기 서열이 취득되었다.
(2-3) 스위치 항체의 선발
실시예 2-1-3 및 2-2-3의 해석의 결과 취득된, ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는다고 판단된 클론 중에서 17검체가 선발되어 표 11에 기재대로 클론명이 재부여되었다.
Figure pct00011
(2-4) ATP의 존재/비존재에 의해 항원에 대한 결합 활성이 변화하는 스위치 항체의 발현과 정제
래셔널 디자인 파지 라이브러리로부터 취득된, 표 11에 기재된 항체의 가변 영역을 코딩하는 유전자는, 인간 IgG1/Lambda의 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 이하의 방법을 이용하여 항체가 발현되었다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 1.33x106세포/mL의 세포 밀도로 현탁되고, 6 well plate의 각 웰에 3mL씩 파종된 인간 태아 신장 세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해서, 조제된 플라스미드가 리포펙션법에 의해 도입되었다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90rpm)에서 4일간 배양된 배양 상청으로부터, rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 이용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 항체 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(2-5) 파지 디스플레이법으로 동정된 항CD137 항체의 평가
(2-5-1) ATP 및 그 대사물의 유무에 의해 항원에 대한 결합이 변화하는 스위치 항체의 발현과 정제
인간 래셔널 디자인 파지 라이브러리로부터 취득된 항체의 가변 영역을 코딩하는 유전자는 개변 인간 IgG1(P253)(서열 번호: 93)의 하류에 Gly와 Lys를 코딩하는 유전자가 융합된 중쇄 정상 영역, 및 경쇄 정상 영역인 Lambda쇄 Lamlib(서열 번호: 63)를 갖는 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 표 12에 클론명으로 서열 번호가 기록되었다.
평가 클론
Figure pct00012
당업자 공지의 방법을 이용하여 항체가 발현되어 정제되었다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 항체 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(2-5-2) 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 CD137에 대한 결합의 ATP, ADP, AMP의 영향의 평가
Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여, 항CD137 항체와 hCD137(FXa digest)의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 아민 커플링법으로 Protein G(CALBIOCHEM)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM3(GE Healthcare)에 항CD137 항체를 포착시켜, 실시예 1-2에서 조제된 hCD137(FXa digest)을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 20mM ACES, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20(pH7. 4)이 이용되고, 재생 용액으로서는 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)이 이용되었다.
TBS에 현탁된 항CD137 항체가 포착된 후에, 500nM의 hCD137(FXa digest)이 각 flow cell에 유속 10μL/min으로 3분간 인젝트되었다. 이 3분간이 hCD137(FXa digest)의 결합상으로 여겨지고, 결합상 종료 후, 러닝 버퍼로 전환된 2분간이 hCD137(FXa digest)의 해리상으로 여겨졌다. 해리상 종료 후, 재생 용액이 유속 30μl/min으로 30초간 인젝트되었다. 이상이 항CD137 항체의 결합 활성 측정 사이클로 여겨졌다. 결합상에서 항CD137 항체에 상호작용한 hCD137(FXa digest)의 결합량은 포착된 항체량에 대해서 보정되었다. Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0을 이용하여 capture ligand 1RU당의 binding량(RU)을 표시시켜, 항체 포착량(포착된 항체량), 항원 결합량의 수치가 얻어졌다. 항원 결합량이 표 13에 나타났다. 항원 결합량은 결합 활성을 반영하므로, 저분자 없음의 값과 비교하여, 저분자(ATP, ADP 혹은 AMP)가 존재할 때의 값이 높은 경우에, 각 저분자 의존성이 인정된다고 할 수 있다. 특히 차이가 클수록 저분자 의존성이 높다고 할 수 있다.
Figure pct00013
(2-5-3) 원숭이 CD137 항원에의 결합 활성 평가
취득된 항체가 원숭이 CD137에 결합하는지 ELISA로 평가되었다. 처음에, 실시예 1에서 조제된 cyCD137-Fc-BAP가 Streptawell 마이크로타이터 플레이트에 고상화되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 Wash buffer로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하고 있지 않은 항원이 제거된 후, 당해 웰이 Blocking Buffer(2% BSA를 포함하는 TBS) 150μL로 1시간 이상 블로킹되었다. Blocking Buffer가 제거된 각 웰에, 종농도 1mM ADP를 포함하는 TBS 또는 종농도 1mM ADP를 포함하는 TBS로 희석된 정제 항체가 각 웰 100μL 첨가되었다. 항체가 첨가된 당해 플레이트는 600rpm으로 1시간 진탕되었다. 종농도 1mM ADP를 포함하는 Wash Buffer(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 세정된 후에, 종농도 1mM ADP를 포함하는 TBS에 의해 희석된 AP 결합 항인간 Lambda 항체(BETHYL)가 각 웰에 첨가되었다. 1시간 인큐베이트된 후 종농도 1mM ATP를 포함하는 Wash Buffer로 세정 후, BluePhos phosphate substrate(KPL)가 첨가되었다. 600nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 항체 농도가 0μg/mL 때의 흡광도에 대한 증가율이 표 14에 나타나 있다. 농도 의존적으로 흡광도의 비가 상승되어 있는 샘플은, 원숭이의 CD137에 결합하고 있다고 할 수 있다.
흡광도의 비
Figure pct00014
(2-5-4) Jurkat 세포를 이용한 CD137 아고니스트 활성의 평가
In vitro 항체 활성 측정에는 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega)이 이용되었다. 384 웰 플레이트의 각 웰에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 10μL씩 가해졌다. 계속하여, ADP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP 혹은 ADP를 포함하지 않는 항체 용액이 각각의 웰에 10μL 가해졌다. 다음에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 10μL 가해졌다. ADP는 최종 농도 50μM, ATP는 최종 농도 50μM이다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 30μL씩 가해졌다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Luminescence fold로 하여, 각 항체의 활성을 평가하는 지표로 했다.
얻어진 결과를 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1 및 도 2로부터, 논스위치 항체인 NS1-P253을 제외한 모든 항체가, ATP 및 ADP 의존적으로 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 확인되었다.
(2-6) 패닝으로부터 취득된 스위치 항체의, 인간 T 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 CD137 아고니스트 활성의 평가
(2-6-1) 인간 T 세포의 확대 배양
건상한 볼런티어 채혈로부터 단리한 인간 말초혈 단핵 세포가 이용되었다. 50mL의 혈액에 0.5mL의 헤파린이 혼화되고, 추가로 50mL의 PBS로 희석되었다. 인간 말초혈 단핵 세포는 다음의 2스텝으로 단리되었다. 제 1 스텝은 Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)가 첨가된 Leucosep(greiner bio-one)가 1000xg, 1분간, 실온에서 원심된 후에 PBS로 희석된 혈액이 첨가되고, 400xg, 30분간, 실온에서 원심이 행해졌다. 제 2 스텝에서는 원심 후의 튜브로부터 버피코트가 채취된 후에, 60mL의 PBS(Wako)에 의해 세정되었다. 그 후 T cell activation/expansion kit/human(MACS Miltenyi biotec)을 이용하여 T 세포의 확대 배양이 행해졌다.
(2-6-2) 인간 T 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 CD137 아고니스트 활성의 평가
인간 말초혈 단핵 세포 유래 T 세포 2x104개 및 REC-1 세포 2x104개가, 컨트롤 항체인 IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0, ATP 비의존적인 인간 CD137 결합 활성을 갖는 항체(실시예를 통해서 「논스위치 항체」 또는 「논스위치 CD137 항체」라고 호칭하는 경우가 있다.)인 NS1-P253, 혹은 표 12에 기재된 클론의 어느 것; 및, 30U/mL 인간 IL-2(SIGMA), 10ng/mL PMA(SIGMA), 0.5μg/mL Ionomycin, 500μM ADPbetaS(Sigma), 10% FBS(Sigma)를 포함하는 RPMI1640 배지 100μL에 현탁되고 96웰 멀티플 웰 플레이트 평저 뚜껑 부착(Corning)에 파종되었다. NS1-P253, IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0, 및 표 12에 기재된 클론은 10μg/mL가 평가되었다. ADPbetaS를 포함하지 않는 배지 중에서의 IFN-γ 산생도 평가되었다. 플레이트는 진탕된 후에 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 72시간 정치되었다. 그 후, 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ량이 Human IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)를 이용하여 정량되었다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech)의 지시에 따라 실시했다. 흡광도의 측정은 EnVision(PerkinElmer)으로 행해졌다.
결과를 도 3에 나타낸다.
dBBAT007-P253, dBBAT013-P253, dBBAT015-P253, dBBAT019-P253, dBBAT021-P253, dBBAT025-P253, dBBAT031-P253, dBBAT042-P253, dBBAT056-P253, dBBAT118-P253, dBBAT121-P253, dBBAT122-P253, dBBAT119-P253은 ADPbetaS 의존적으로 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 확인되었다. ADPbetaS는, ADP와 비교하여 가수분해를 받기 어려운 ADP의 아날로그이다. 이로부터, 이들 인간 CD137 스위치 항체는, ATP, ADP, AMP 등의 저분자 의존적으로 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타낼 가능성이 나타났다.
(2-6-3) 인간 T 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 CD137 아고니스트 활성의 평가(2)
인간 말초혈 단핵 세포 유래 T 세포 2x104개 및 REC-1 세포 2x104개가, NS1-P253(논스위치 항체) 혹은 dBBAT119-P253의 어느 것; 및, 30U/mL 인간 IL-2(SIGMA), 10ng/mL PMA(SIGMA), 0.5μg/mL Ionomycin, 500μM ADPbetaS(Sigma), 10% FBS(Sigma)를 포함하는 RPMI1640 배지 100μL에 현탁되고, 96웰 멀티플 웰 플레이트 평저 뚜껑 부착(Corning)에 파종되었다. NS1-P253 및 dBBAT119-P253은 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032, 0.00064μg/mL가 평가되었다. 플레이트는 진탕된 후에 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 72시간 정치되었다. 그 후, 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ량이 Human IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)를 이용하여 정량되었다. ELISA는 키트 제조업자(PeproTech)의 지시에 따라 실시했다. 흡광도의 측정은 EnVision(PerkinElmer)으로 행해졌다.
결과를 도 4에 나타낸다.
dBBAT119-P253은 ADPβS 존재하에 있어서 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 확인되었다. 이로부터, dBBAT119-P253은, ATP, ADP, AMP등의 저분자 의존적으로 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타낼 가능성이 나타났다.
실시예 3: 래셔널 디자인 경쇄 및 중쇄 라이브러리를 사용한 저분자 존재하에 있어서 항원에 결합하는 항체의 결합 활성 향상
(3-1) 래셔널 디자인 경쇄 라이브러리를 사용한 결합 활성 향상용 라이브러리의 구축
실시예 2-2-1에 있어서 회수된, ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항체가 다수 포함되는 항체 라이브러리에 대하여, 재차 항체 경쇄를 라이브러리화하는 것에 의해 결합 활성의 향상이 실시되었다.
선행 특허 WO2015/083764에 있어서 구축된 래셔널 디자인 항체 파지 디스플레이 라이브러리의 경쇄 영역 및 중쇄 영역이 결합 활성 향상을 위한 항체 경쇄 라이브러리 및 항체 중쇄 라이브러리를 구축하기 위해서 사용되었다. 상기 경쇄 라이브러리 또는 실시예 2-2-1에 있어서 회수된 파지미드 벡터 라이브러리의 경쇄 영역 또는 중쇄 영역에 도입되고, 대장균 ER2738주에 일렉트로포레이션에 의해 도입되었다.
(3-2) 래셔널 디자인 라이브러리를 이용한, ATP 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 항체의 결합 활성 향상
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지하는 대장균으로부터 파지가 일반적인 방법으로 산생되었다. 구체적으로는, 구축된 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7TC(WO2015/046554) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석하는 것에 의해 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated), NeutrAvidin beads(TAMAGAWA SEIKI) 혹은 Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)이 이용되었다. 항원으로서 비오틴화 hCD137-Fc가 사용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위한 패닝이 실시되었다. 구체적으로는, 저분자인 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP) 존재하에서 항원에 결합하고, ATP 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에 나타난 방법을 참고로 실시되었다.
(3-3) 파지 ELISA에 의한 ATP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성 평가
상기의 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 상법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라서, 파지 함유 배양 상청이 회수되었다. 그 후, 실시예 2-2-2에 기재된 방법에 의해, ATP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 인간 CD137에의 결합 활성이 파지 ELISA에 의해 확인되었다.
그 결과를 도 5에 나타낸다.
항원의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비가 2보다 높고, 또한, ATP의 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비가 2보다 높은, ATP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로 판정되는 클론이 다수 취득되었다.
실시예 4: 개변된 CD137 항체의 제작 및 그 활성 평가
(4-1) dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib의 개변에 의한 결합 활성의 상승
실시예 2-4에서 취득된 항CD137 항체(클론명: dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib)의 중쇄 가변 영역인 dBBAT119H, 경쇄 가변 영역인 dBBAT119L의 개변체가 PCR 등 당업자 공지의 방법에 의해 제작되었다. 중쇄 가변 영역에서는, dBBAT119H의 D10(10위(Kabat 번호)의 아스파라긴산(Asp)을 가리킨다.) 및 G17(17위(Kabat 번호)의 글리신(Gly)을 가리킨다.)을 각각 글리신(Gly) 및 세린(Ser)으로 치환한 dBBAT119H010의 N99(99위(Kabat 번호)의 아스파라긴(Asn)을 가리킨다.), M100a(100a위(Kabat 번호)의 메티오닌(Met)을 가리킨다.), 및 N100b(100b위(Kabat 번호)의 아스파라긴(Asn)을 가리킨다.)를 다른 아미노산으로 치환한 개변체가 제작되었다. 경쇄 가변 영역에서는, dBBAT119L의 F87(87위(Kabat 번호)의 페닐알라닌(Phe)을 가리킨다.)을 티로신(Tyr)으로 치환한 dBBAT119L010의 D27b(27b위(Kabat 번호)의 아스파라긴산(Asp)을 가리킨다.), N31(31위(Kabat 번호)의 아스파라긴(Asn)을 가리킨다.), 및 D94(94위(Kabat 번호)의 아스파라긴산(Asp)을 가리킨다.)를, 다른 아미노산으로 치환한 개변체가 제작되었다.
중쇄 가변 영역의 개변체에 대해서는, 표면 플라즈몬 공명 분석 기기인 BiacoreT200(GE헬스케어)에 의해 인간 CD137에 대한 결합 활성이 측정되었다. Series S Sensor Chip CM3 (GE헬스케어)에 Protein G(CALBIOCHEM)를 고정화한 칩에 대해서, 정제된 개변체를 상호작용시켜 항체가 포착되었다. 다음에 ATP를 첨가한 인간 CD137(FXa digested) 혹은 ATP를 첨가하고 있지 않는 인간 CD137(FXa digested) 용액을 상호작용시켜, ATP 존재하 및 ATP 비존재하에서의 개변체와 인간 CD137(FXa digested)의 결합 활성이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween20, 2mM MgCl2, pH 7.4를 이용하여 25℃에서 측정이 행해졌다. 측정의 결과, L100a 개변체(100a위(Kabat 번호)의 메티오닌(Met)을 류신(Leu)으로 치환한 개변체)은, ATP 존재하에서만, 인간 CD137에의 결합 활성이 향상되었다(도 6). 당해 L100a 개변체의 중쇄 가변 영역은, dBBATk119H024(서열 번호: 132)이다. 또한 인간 CD137 결합량은, 각 개변체의 포착량(1000RU)으로 보정되었다.
경쇄 가변 영역의 개변체에 대해서는, BiacoreT200에 의해 마찬가지의 상기 조건에서 인간 CD137(FXa digested)에 대한 결합 활성이 측정되었다. 측정의 결과, E94 개변체(94위(Kabat 번호)의 아스파라긴산(Asp)을 글루타민산(Glu)으로 치환한 개변체)는, ATP 존재하에서만, 인간 CD137에의 결합 활성이 향상되었다(도 6). 당해 E94 개변체의 경쇄 가변 영역은, dBBATk119L020(서열 번호: 133)이다.
이들 중쇄 개변체 및 경쇄 개변체를 조합한 당해 개변체를 dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib로 약칭한다(중쇄 가변 영역 서열 번호: 132, 경쇄 가변 영역 서열 번호: 133, 중쇄 정상 영역 서열 번호: 93, 경쇄 정상 영역 서열 번호: 63)
한편, 본 명세서에 있어서의 항체는, 이하의 규칙에 따라 명명되고 있다; (중쇄 가변 영역)-(중쇄 정상 영역)/(경쇄 가변 영역)-(경쇄 정상 영역).
예를 들어, dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib라고 하는 항체명이면, 본 항체의 중쇄 가변 영역은 dBBAT119H, 중쇄 정상 영역은 P253, 경쇄 가변 영역은 dBBAT119L, 경쇄 정상 영역은 LamLib인 것을 의미한다.
(4-2) 개변된 항인간 CD137 항체의, 인간 T 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 CD137 아고니스트 활성의 평가
(4-2-1) 인간 T 세포의 확대 배양
실시예 2-6-1에 기재된 방법으로 인간 T 세포가 확대 배양되었다.
(4-2-2) 인간 T 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 CD137 아고니스트 활성의 평가
실시예 2-6-2에 기재된 방법으로, NS1-P253(논스위치 항체) 혹은 dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib 혹은 dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib 혹은 컨트롤 항체인 IC17HdK-hIgG1/IC17L-k0 각각 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016μg/mL존재하에 있어서의 IFN-γ 산생이 평가되었다. ADPbetaS를 포함하지 않는 배지 중에서의 IFN-γ 산생도 평가되었다.
합쳐서 결과를 도 7에 나타낸다.
개변된 dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib는, dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib보다 강한 ADPbetaS 의존적인 아고니스트 활성을 나타냈다. 이로부터 dBBATk119H024-P253/dBBATk119L020-LamLib는, dBBAT119H-P253/dBBAT119L-LamLib보다 강한 ATP, ADP, AMP등의 저분자 의존적인 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타낼 가능성이 나타났다.
실시예 5: CD137 항체의 추가적인 개변
(5-1) 망라적 개변의 도입에 의한 결합 활성을 상승시키는 개변의 탐색
보다 우수한 항CD137 항체를 제작하기 위해, 실시예 4-1에 있어서 제작된 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역인 dBBATk119H024 및 경쇄 가변 영역인 dBBATk119L020에 대해서 아미노산 개변이 망라적으로 도입되었다. PCR 등 당업자 공지의 방법에 의해, dBBATk119H024 및 dBBATk119L020의 CDR을 구성하는 전체 아미노산 잔기의 각각에 대해서, 시스테인을 제외한 전체 18 아미노산으로 치환한 개변체가 각각 제작되었다. 제작된 약 1200개의 개변체의 인간 CD137에의 결합 측정이 Biacore4000을 이용하여 실시되었다. Series S Sensor Chip CM3(GE헬스케어)에 Protein G(CALBIOCHEM)를 고정화한 칩에 대해서, 개변체의 배양 상청을 상호작용시켜 항체가 포착되었다. 다음에 저분자(ATP)가 첨가된 인간 CD137 용액, 혹은 저분자가 첨가되어 있지 않은 인간 CD137 용액을 상호작용시켜, 저분자 존재하, 및 저분자 비존재하에서의 항체의 인간 CD137에 대한 결합 활성이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.02% Tween20, 2mM MgCl2, pH 7.4에 CaCl2가 첨가된 용액이 사용되고, 25℃에서 측정이 행해졌다.
(5-2) ATP 결합의 상승
중쇄 가변 영역으로서 dBBATk119H024(서열 번호: 132)를 갖고, 중쇄 정상 영역으로서 인간 IgG1에 대해서 S267E/L328F의 개변이 도입되고, 또한 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 P253(서열 번호: 93)을 갖는 dBBATk119H024-P253의 유전자에 대해서, 실시예 5-1에서 발견된 저분자 존재하에서의 인간 CD137에 대한 결합 활성을 상승시키는 개변을 조합하여, 항체 중쇄 유전자 A002-P253(서열 번호: 134)이 제작되었다. 또한, 경쇄 가변 영역으로서 dBBATk119L020(서열 번호: 133)을 갖고, 경쇄 정상 영역으로서 인간 λ쇄 Lamlib(서열 번호: 63)를 갖는 항체 경쇄dBBATk119L020-Lamlib에 대해서, 실시예 5-1에서 발견된 저분자 존재하에서의 인간 CD137에 대한 결합 활성을 상승시키는 개변을 조합하여, 항체 경쇄 유전자 B040-Lamlib(서열 번호: 135)가 제작되었다. 이들 유전자를 조합하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 발현, 정제되어, 목적으로 하는 항CD137 항체, A002-P253/B040-Lamlib가 제작되었다. A002-P253/B040-Lamlib의 중쇄 가변 영역은 A002(서열 번호: 136), 경쇄 가변 영역은 B040(서열 번호: 137), 중쇄 정상 영역은 P253(서열 번호: 93), 경쇄 정상 영역은 인간 λ쇄 Lamlib(서열 번호: 63)이다.
본 항목에 있어서 제작된 A002-P253/B040-Lamlib의 중쇄 가변 영역에 대해서, ATP 결합 활성을 상승시키는 것을 목적으로 하여, Kabat 번호에 있어서의 53번째, 54번째 또는 55번째의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 각종 개변체가 제작되었다. 표 15는 제작된 항체의 중쇄 가변 영역에 있어서의, A002로부터의 아미노산 개변(Kabat 번호)을 나타낸다.
Figure pct00015
제작된 개변체의, ATP에 대한 결합 활성, 및 인간 CD137에 대한 결합 활성이, Biacore T200으로 평가되었다.
ATP에 대한 결합 활성의 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시되었다. 우선 Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)에 Sure Protein A(GE Healthcare)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 항체가 포착되었다. 다음에 러닝 버퍼로 조제된 ATP 용액을 상호작용시킴으로써, 항체와의 결합 활성이 평가되었다. 칩은 25mM NaOH와 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 이용하여 재생되어, 반복하여 항체를 포착하여 측정이 행해졌다. 각 항체의 ATP에 대한 결합량은, ATP를 100nM의 농도로 인젝트했을 때의 결합량을 칩 표면에 포착한 항체의 양으로 보정함으로써, 단위 항체량당의 ATP의 결합량이 산출되었다.
인간 CD137에 대한 결합 활성의 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시되었다. 우선 Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)에 Sure Protein A(GE Healthcare)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 항체가 포착되었다. 다음에 저분자로서 100μM ATP를 첨가한 인간 CD137 용액을 상호작용시켜, 인간 CD137과의 결합 활성이 평가되었다. 항원인 인간 CD137은 실시예(1-1)에서 조제된 hCD137-HisBAP를 사용하여, 항원 농도 0, 15.625, 62.5, 250, 1000nM에서 측정이 실시되었다. 칩은 25mM NaOH와 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 이용하여 재생되어, 반복하여 항체를 포착하여 측정이 행해졌다. 각 항체의 인간 CD137에 대한 해리 상수(KD)는, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 산출되었다. 구체적으로는, 측정에 의해 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합 속도 상수 ka(L/mol/s), 해리 속도 상수 kd(1/s)가 산출되고, 그들의 값으로부터 해리 상수 KD(mol/L)가 산출되었다.
표 16은 이들의 측정 결과를 나타낸다.
ATP 및 인간 CD137에 대한 결합 해석
Figure pct00016
표 16대로, 중쇄 가변 영역의 Kabat 번호에 있어서의 53, 54, 또는 55번째의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 개변체는 A146-P253/B040-Lamlib 및 A160-P253/B040-Lamlib를 제외하는 어느 개변체도, 개변 도입 전의 항체 A002-P253/B040-Lamlib와 비교하여 ATP에 대한 결합 활성이 상승되어 있었다. 또한 결합 속도 상수 ka(L/mol/s)의 비교로부터, 상기에서 평가한 항체 중, A146-P253/B040-Lamlib, A159-P253/B040-Lamlib, A162-P253/B040-Lamlib, A163-P253/B040-Lamlib, A164-P253/B040-Lamlib, A167-P253/B040-Lamlib 및 A168-P253/B040-Lamlib에 관해서는, 인간 CD137에의 결합 속도 상수가 증가함이 나타났다.
(5-3) 망라적 개변의 도입에 의한 결합 활성의 상승
보다 우수한 항CD137 항체를 제작하기 위해, 실시예 5-1에서 발견된 저분자 존재하에서의 인간 CD137에 대한 결합 활성을 상승시키는 개변, 및 저분자가 존재하지 않는 조건하에서의 인간 CD137에 대한 결합을 저감시키는 개변, 및 실시예 5-2에서 발견된 ATP에의 결합 활성을 상승시켜, 인간 CD137에의 결합 속도 상수를 증가시키는 개변이 조합되어, 보다 우수한 프로파일을 나타내는 항인간 CD137 항체가 제작되었다. 중쇄 가변 영역으로서 A002(서열 번호: 136)를 갖고, 중쇄 정상 영역으로서 인간 IgG1에 대해서 K214R/Q419E의 개변이 도입되고, 또한 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1T3(서열 번호: 138)을 갖는 항체 중쇄 A002-G1T3의 유전자에 대해서 실시예 5-1 및 5-2에서 발견된 개변을 조합한 항체 중쇄 유전자가 제작되었다. 또한 경쇄 가변 영역으로서 B040(서열 번호: 137)을 갖고, 경쇄 정상 영역으로서 인간 λ쇄 Lamlib를 갖는 항체 경쇄 B040-Lamilib에 대해서 실시예 5-1에서 발견된 개변을 조합한 항체 경쇄 유전자가 제작되었다.
또한 비교 대상으로서 US8137667에 기재된 기존의 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 20H4.9(서열 번호: 139) 및 중쇄 정상 영역으로서 P253(서열 번호: 93)을 갖는 항체 중쇄 20H4.9-P253의 유전자와, 경쇄 가변 영역 20H4.9LC(서열 번호: 140)와 경쇄 정상 영역으로서 인간κ쇄 k0(서열 번호: 141)을 조합한 항체 경쇄의 유전자가 제작되었다. 또한 다른 비교 대상으로서 US8337850에 기재된 기존의 항CD137 항체 MOR-7480.1을 구성하는 중쇄 가변 영역 MOR-7480.1H(서열 번호: 142) 및 중쇄 정상 영역으로서 P253(서열 번호: 93)을 갖는 항체 중쇄 MOR-7480.1H-P253의 유전자와, 경쇄 가변 영역 MOR-7480.1L(서열 번호: 143)과 경쇄 정상 영역으로서 인간λ쇄 lam(서열 번호: 63)을 조합한 항체 경쇄 MOR-7480.1L-lam의 유전자가 제작되었다(한편, 인간 λ쇄 Lamlib와 lam은 모두 동일한 아미노산 서열(서열 번호: 63)이다.
이들 유전자를 조합하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 발현, 정제되어, 목적으로 하는 항CD137 항체가 제작되었다. 표 17은 제작된 항체의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역, 경쇄 정상 영역, 및 초가변 영역(Hyper Variable Region; HVR 또는 CDR라고도 한다.)의 서열 번호의 일람이다.
중쇄, 경쇄, 및 그들의 초가변 영역의 아미노산 서열(서열 번호로 나타낸다)
Figure pct00017
제작된 개변체의 ATP에 대한 결합 및 인간 CD137에 대한 결합이 Biacore T200으로 평가되었다. 인간 CD137에 대한 결합 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시되었다. 우선 Series S Sensor Chip CM3(GE Healthcare)에 Sure Protein A(GE Healthcare)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 250∼400RU의 항체가 포착되었다. 다음에 목적 농도가 되도록 ATP가 첨가된 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액, 혹은 ATP를 포함하지 않는 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액을 상호작용시킴으로써, ATP 존재하, 및 ATP 비존재하에서의 인간 CD137과의 결합 활성이 평가되었다. 항원인 인간 CD137은 실시예(1-1)에서 조제된 hCD137-HisBAP를 사용하여, 항원 농도 0, 15.625, 62.5, 250, 1000nM에서 KD치의 측정이 실시되었다. 결합량의 평가에 관해서는 항원 농도 0, 1000nM에서 측정이 실시되었다. 칩은 25mM NaOH와 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 이용하여 재생되어, 반복하여 항체를 포착하여 측정이 행해졌다. 각 항체의 인간 CD137에 대한 해리 상수는, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 산출되었다. 구체적으로는, 측정에 의해 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합 속도 상수 ka(L/mol/s), 해리 속도 상수 kd(1/s)가 산출되고, 그들의 값으로부터 해리 상수 KD(mol/L)가 산출되었다.
표 18은 이들의 측정 결과를 나타낸다.
개변 항체의 인간 CD137에 대한 결합 해석
Figure pct00018
상기 표 18 중의 「인간 CD137에 대한 결합」의 값은, 기재되어 있는 각 ATP 농도 조건에 있어서 인간 CD137을 1000nM에서 상호작용시켰을 때의 단위 항체량당의 인간 CD137의 결합량을 나타내고, 「인간 CD137에 대한 KD(M)」는 각 ATP 농도 조건에 있어서의 인간 CD137에의 해리 상수를 나타낸다. 표 중의 * 마크를 붙인 KD치는, steady state model로 산출되었다. 제작된 개변체는 모두 ATP가 1μM로 존재하는 조건보다 10μM로 존재하에 있어서의 결합량이 많고, 더욱이 100μM 존재하에 있어서의 결합량이 많았으므로, ATP 농도 의존적으로 인간 CD137에 결합함이 나타났다. 한편, 비교 대상인 20H4.9-P253/20H4.9LC-k0 및 MOR-7480.1H-P253/MOR-7480.1L-lam은 ATP 농도 의존적인 인간 CD137에의 결합은 나타내지 않았다.
(5-4) 개변된 항인간 CD137 항체의, 4-1BB Jurkat 리포터 진 어세이를 이용한 in vitro에 있어서의 ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성의 평가
제작된 개변체의 In vitro 활성 측정에는, GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega, CS196004)이 이용되었다. 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 5×104/mL로 농도를 조제한 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 200μL씩 가해지고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 하룻밤 정치되었다. 배지로는 CHO culture medium(90% Ham's F12, 10% FBS)이 이용되었다. 다음에, 배지가 모두 흡인 제거된 후, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 25μL 가해졌다. 계속하여, 최종 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL가 되도록 Assay medium으로 희석된 각 항체 용액이 각각 25μL 가해지고, 마지막에 최종 농도가 0, 250μM이 되도록 Assay medium으로 희석된 ATP 용액이 25μL 가해졌다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 75μL씩 가해졌다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 상대 발광량(Fold induction)으로 하여, 각 항체의 CD137 아고니스트 활성을 평가하는 지표로 했다.
결과를 도 8에 나타낸다.
(5-5) 개변된 항인간 CD137 항체의, 인간 말초혈 단핵 세포를 이용한 in vitro에 있어서의 ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성의 평가
(5-5-1) 인간 말초혈 단핵 세포의 단리
실시예 2-6-1에 기재된 방법으로, 출원인 사내의 건상한 볼런티어 채혈로부터 단리한 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)가 단리되었다. 그 후, 배지(5% 인간 혈청(SIGMA), 95% AIM-V(Thermo Fischer Scientific)로 세포 밀도 5x106/mL로 희석되었다.
(5-5-2) 인간 말초혈 단핵 세포를 이용한, CD137 아고니스트 활성의 평가
인간 말초혈 단핵 세포는 세포 밀도 5x106/mL로 조정되어, 100μL씩 96웰 멀티플 웰 플레이트 평저 뚜껑 부착(Corning)에 파종되었다. 그 후, 배지로 희석된 0.04μg/mL 항인간 CD3ε 항체(BD사제, 클론 SP34) 및 20μg/mL 항인간 CD28 항체(BD, 클론: CD28.2)가 50μL 첨가되었다. 플레이트는 진탕된 후에 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치되었다. 그 후 각 웰에 배지로 희석한 2mM ATP(SIGMA) 혹은 ATP를 포함하지 않는 배지만 25μL와 40μg/mL의 각 항체 25μL가 첨가되고, 플레이트가 진탕된 후에 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 18시간 정치되었다. 그 후, 배양 상청을 일부 회수하고, 배양 상청을 이용하여 배양 상청 중에 포함되는 IL-2량이 Human IL-2 DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 혹은 Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences)를 이용하여 정량되었다. 배양 상청을 회수한 후의 플레이트는 다시 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 24시간 정치되었다. 그 후, 배양 상청이 일부 회수되어, 배양 상청 중에 포함되는 IFN-γ량이 Human IFN-γ DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 혹은 Human IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)를 이용하여 정량되었다. ELISA는 기본적으로 키트 부속의 프로토콜에 따라, 실시되었다. Human IL-2 DuoSet ELISA 키트(R&D systems) 및 Human IFN-γ DuoSet ELISA 키트(R&D systems)에 관해서는, H2O2 및 tetramethylbenzidine를 포함하는 substrate solution(R&D systems) 및 1N H2SO4(Wako)를 이용하여, 프로토콜에 따라 발색과 발색 정지가 행해졌다. Human IL-2 ELISA Set(BD Biosciences)에 관해서는, 1N H2SO4(Wako)를 이용하여 발색 정지가 행해졌다. IFN-γ ELISA Development Kit(PeproTech)에 관해서는 TMB Chromogen Solution(Thermo Fischer Scientific) 및 1N H2SO4(Wako)를 이용하여 발색과 발색 정지가 행해졌다. 그 후 흡광도의 측정이 EnVision(PerkinElmer)으로 행해졌다.
결과를 실시예 5-5-3 이하에서 상술한다.
(5-5-3) 중쇄 정상 영역의 Fcγ 수용체에의 결합 활성을 상승시키는 것에 의한 아고니스트 활성의 증강의 평가
실시예 5-5-1 및 실시예 5-5-2에 기재된, 인간 말초혈 단구를 이용한 in vitro 평가에 의해, 중쇄 정상 영역의 FcγRIIb에의 결합 활성을 다양하게 상승시킨 P587, MY518, TT14, TT16을 이용하는 것에 의한 CD137 아고니스트 활성에의 영향이 평가되었다.
평가된 항체는 표 19대로이다.
표 19에 기재된 항체의 제작은, 실시예 7-1에 기재되어 있다. 250μM ATP 존재 조건하에서, 음성 컨트롤 항체(IC17HdK-MY518/IC17L-k0, IC17HdK-G4d/IC17L-k0)를 첨가했을 경우의 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ의 양과 비교하여, 당해 항체의 첨가에 의해 배양 상청 중의 IL-2의 양이 1.05배 이상 상승 또한 IFN-γ의 양이 1.15배 이상 상승시켰던 것이 확인된 항체에 관해서, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단되었다. 한편, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 이용한 아고니스트 활성 측정은, 혈액 시료의 제공자(도너)마다 차이가 생길 수 있다. 이 점을 고려하여, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC의 일부 또는 과반수에 대해 CD137 아고니스트 활성이 나타나지 않았던 항체에 대해서는, 다른 일부의 인간 PBMC에 있어서 아고니스트 활성의 기준에 합치하고 있어도, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단하지 않을 수 있는 것으로 했다.
ATP 250μM 존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다고 판단된 항체는 표 19대로이다. 이로부터 중쇄 정상 영역의 FcγRIIb에의 결합 활성이 상승된 P587, TT16을 조합함으로써 CD137 아고니스트 활성이 증강됨이 나타났다(도 9 및 도 10). 항체가 CD137 발현 세포에 대해서 아고니스트 활성을 나타낼 때에 필요한, 가교의 발판이 되는 FcγRIIb 발현 세포에의 결합 활성이 증가함에 의해, 아고니스트 활성이 증강되었다고 생각된다. (Protein Eng Des Sel. 2013 Oct; 26(10): 589-598. Published online 2013 Jun 5. doi: 10.1093/protein 참조)
Figure pct00019
(5-5-4) 가변 영역의 ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성의 평가
실시예 5-5-1 및 실시예 5-5-2에 기재된, 인간 말초혈 단구를 이용한 in vitro 평가에 의해, 중쇄 정상 영역 P587 및 P253에 다양한 가변 영역을 조합하여, 각 가변 영역의 ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성이 평가되었다.
평가된 항체는 표 20대로이다. 표 20에 기재된 항체의 제작은, 실시예 7-1에 기재되어 있다. 250μM ATP 존재 조건하에서, 음성 컨트롤 항체(IC17HdK-P253/IC17L-k0, IC17HdK-P587/IC17L-k0)를 첨가했을 경우의 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ의 양과 비교하여, 당해 항체의 첨가에 의해 배양 상청 중의 IL-2의 양이 1.05배 이상 상승 또한 IFN-γ의 양이 1.15배 이상 상승시켰던 것이 확인된 항체에 관해서, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단되었다. 한편, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 이용한 아고니스트 활성 측정은, 혈액 시료의 제공자(도너)마다 차이가 생길 수 있다. 이 점을 고려하여, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC의 일부 또는 과반수에 대해 CD137 아고니스트 활성이 나타나지 않았던 항체에 대해서는, 다른 일부의 인간 PBMC에 있어서 아고니스트 활성의 기준에 합치하고 있어도, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단하지 않을 수 있는 것으로 했다. ATP 250μM 존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다고 판단된 항체는 표 20대로이다(도 11, 도 12, 도 13, 도 14 및 도 15).
더욱이, 250μM ATP 존재하에서 CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단된 항체 중, ATP 첨가 없음의 조건하에서 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ의 어느 양에 관해서도 음성 컨트롤 항체(IC17HdK-P253/IC17L-k0, IC17HdK-P587/IC17L-k0) 첨가군에 대한 fold change가, 250μM ATP 존재 조건하에 있어서의 음성 컨트롤에 대한 fold change보다 작은 항체는, ATP 비존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성이 낮다고 판단되었다. ATP 250μM 존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성을 나타내고, 또한 ATP 비존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성이 낮다고 판단된 항체는 표 20대로이다(도 11, 도 12, 도 13, 도 14 및 도 15). 이들 항체는, ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성을 나타냈다고 판단되었다.
이들로부터, 가변 영역에 대해서는, (중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역)의 조합으로서, (A375/B167), (A356/B040), (A372/B040), (A486/B167), (A488/B226), (A489/B223), (A551/B256), (A548/B256), 및 (A551/B379)이 ATP 의존적으로 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 확인되었다.
Figure pct00020
(5-5-5) Fcγ 수용체에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역에 중쇄 정상 영역의 pI를 상승시키는 개변을 조합하는 것에 의한 CD137 아고니스트 활성의 증강 효과의 평가
실시예 5-5-1 및 실시예 5-5-2에 기재된, 인간 말초혈 단구를 이용한 in vitro 평가에 의해, 다양하게 FcγRIIb에의 결합 활성이 상승된 중쇄 정상 영역에 대해서, 중쇄 정상 영역의 pI를 상승시키는 각종 아미노산 개변을 도입했을 때의, CD137 아고니스트 활성에의 영향이 평가되었다. 중쇄 정상 영역 TT16, MY518, TT14에 pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입된 중쇄 정상 영역 TT16+P343R/D413K (SCF028), TT16+Q311R/P343R(SCF033), MY518+P343R/D413K (SCF025), MY518+Q311R/P343R (SCF030), TT14+P343R/D413K (SCF027), TT14+Q311R/P343R (SCF032)이 제작되었다. pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입된 평가된 항체의 명칭 및 대응하는 pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입되기 전의 항체의 명칭은 표 21대로이다. 표 21에 기재된 항체의 제작은, 실시예 7-2에 기재되어 있다.
pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입된 것에 의한 아고니스트 활성의 증강의 평가에 관해서는, 당해 아미노산 개변을 포함하지 않는 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체인 A375-TT16/B167-LamLib, A375-MY518/B167-LamLib, A375-TT14/B167-LamLib 첨가군에 대해서, 그 항체의 첨가에 의해 배양 상청 중의 IL-2의 양이 1.04배 이상 상승 또한 IFN-γ의 양이 1.1배 이상 상승시켰던 것이 확인된 것에 관해서, CD137 아고니스트 활성이 증강되었다고 판단되었다. ATP 250μM 존재 조건하에 있어서, pI를 상승시키는 아미노산 개변을 포함하지 않는 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체와 비교하여, CD137 아고니스트 활성이 증강되고 있음이 나타난 아미노산 개변이 도입된 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체는 표 22대로이다(도 10).
이로부터 중쇄 정상 영역의 FcγRIIb에의 결합 활성의 상승의 정도에 의존하지 않고, 중쇄 정상 영역의 pI를 상승시키는 개변의 도입이, 항인간 CD137 항체의 CD137 아고니스트 활성을 증강시킴이 나타났다. 중쇄 정상 영역의 FcγRIIb에의 결합을 상승시키는 개변에 중쇄 정상 영역의 pI를 상승시키는 개변을 조합함으로써, 음으로 대전한 FcγRIIb 발현 세포 표면과의 상호작용을 증강시켜, 항체, 혹은 항원-에 결합한 항체의 면역 복합체가 FcγRIIb 발현 세포 표면에 보다 가까워지는 것에 의해, 항체가 CD137 발현 세포에 대해서 아고니스트 활성을 나타낼 때에 필요한, 가교의 발판이 되는 FcγRIIb 발현 세포에의 결합성이 더욱 증가하는 것에 의해, 아고니스트 활성이 더욱 증강되었음이 시사되었다.
Figure pct00021
Figure pct00022
(5-5-6) 중쇄 정상 영역의 pI를 상승시키는 각 개변의 도입에 의한 아고니스트 활성에의 영향의 평가
실시예 5-5-1 및 실시예 5-5-2에 기재된, 인간 말초혈 단구를 이용한 in vitro 평가에 의해, 중쇄 정상 영역 MY201aPh 및 MY518에 pI를 상승시키기 위한 각종 아미노산 개변을 도입하고, 당해 아미노산 개변이 CD137 아고니스트 활성에 주는 영향이 평가되었다. 중쇄 정상 영역 MY518 및 MY518a 및 MY201aPh에 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 도입한, MY518+P343R/D413K(SCF025), MY518+Q311R/P343R(SCF030), MY518+P343R(SCF039), MY518+D413K(SCF040), MY518a+Q311R(SCF060a), MY201aPh+P343R(SCF041aPh), MY201aPh+P343R/D413K(SCF043aPh), MY201aPh+Q311R(SCF056aPh), MY201aPh+Q311R/P343R(SCF057aPh), MY201aPh+Q311R/D413K(SCF059aPh)가 제작되었다. pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입된 평가된 항체의 명칭 및 대응하는 pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입되기 전의 항체의 명칭은 표 23대로이다. 표 23에 기재된 항체의 제작은, 실시예 7-2에 기재되어 있다.
pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입된 것에 의한 아고니스트 활성의 증강의 평가에 관해서는, 당해 아미노산 개변을 포함하지 않는 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체인 A375-MY518a/B167-LamLib, A375-MY201aPh/B167-LamLib 첨가군에 대해서, 그 항체의 첨가에 의해 배양 상청 중의 IL-2의 양이 1.04배 이상 상승 또한 IFN-γ의 양이 1.1배 이상 상승시켰던 것이 확인된 것에 관해서, CD137 아고니스트 활성이 증강되었다고 판단되었다. ATP 250μM 존재 조건하에 있어서 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 포함하지 않는 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체와 비교하여, CD137 아고니스트 활성의 증강이 나타난 아미노산 개변이 도입된 중쇄 정상 영역을 포함하는 항체는, 표 24대로이다(도 16 및 도 17).
Figure pct00023
Figure pct00024
(5-5-7) 제작된 가변 영역과 정상 영역을 조합한 항인간 CD137 항체의, ATP 의존적 CD137 아고니스트 활성의 평가
실시예 5-5-1 및 실시예 5-5-2에 기재된, 인간 말초혈 단구를 이용한 in vitro 평가에 의해, 전술에서 제작된 각 가변 영역과 pI를 상승시키는 중쇄 정상 영역을 조합하여 제작된 항인간 CD137 항체의, ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성이 평가되었다. 평가된 항체는 표 25대로이다.
250μM ATP 존재 조건하에서, 음성 컨트롤 항체(IC17HdK-MY518a/IC17L-k0, IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0, IC17HdK-MY201/IC17L-k0, IC17HdK-G4d/IC17L-k0, IC17HdK-MY518/IC17L-k0, 또는 IC17HdK-TT16/IC17L-k0)를 첨가했을 경우의 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ의 양과 비교하여, 당해 항체의 첨가에 의해 배양 상청 중의 IL-2의 양이 1.05배 이상 상승 또한 IFN-γ의 양이 1.15배 이상 상승시켰던 것이 확인된 항체에 관해서, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단되었다. 한편, 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 이용한 아고니스트 활성 측정은, 혈액 시료의 제공자(도너)마다 차이가 생길 수 있다. 이 점을 고려하여, 복수의 도너로부터 단리된 인간 PBMC의 일부 또는 과반수에 대해 CD137 아고니스트 활성이 나타나지 않았던 항체에 대해서는, 다른 일부의 인간 PBMC에 있어서 아고니스트 활성의 기준에 합치하고 있어도, CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단하지 않을 수 있는 것으로 했다. ATP 250μM 존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다고 판단된 항체는 표 25대로이다(도 16, 도 17, 도 18, 도 19, 도 20, 도 21, 도 22 및 도 23).
더욱이, 이들 항체 중, 250μM ATP 존재하에서 CD137 아고니스트 활성이 나타났다고 판단된 항체 중, ATP 첨가 없음의 조건하에서 배양 상청 중의 IL-2 및 IFN-γ의 어느 양에 관해서도 음성 컨트롤(IC17HdK-MY518a/IC17L-k0, IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0, IC17HdK-MY201/IC17L-k0, IC17HdK-G4d/IC17L-k0, IC17HdK-MY518/IC17L-k0, 또는 IC17HdK-TT16/IC17L-k0) 첨가군에 대한 fold change가, 250μM ATP 존재 조건하에 있어서의 음성 컨트롤에 대한 fold change보다 작은 항체는, ATP 비존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성이 낮다고 판단되었다. ATP 비존재 조건하에서 CD137 아고니스트 활성이 낮다고 판단된 항체는 표 25대로이다(도 16, 도 17, 도 18, 도 19, 도 20, 도 21, 도 22 및 도 23). 이들 항체는 ATP 의존적으로 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 나타났다.
Figure pct00025
실시예 6: 항인간 CD137 스위치 항체의, 인간 CD137 노크인 마우스 투여 시험
(6-1) 인간 CD137 노크인 마우스 투여 시험을 위한 항체의 제작
인간 CD137 노크인 마우스 투여 시험을 위해서, 마우스 정상 영역을 갖는 항인간 CD137 스위치 항체 및 논스위치 항체가 제작되었다. 구체적으로는, 항인간 CD137 논스위치 항체 (20H4.9-mIgG1/20H4.9LC-mk0 약명: NS1-mIgG1, 20H4.9-MB110/20H4.9LC-mk0 약명: NS1-MB110, 20H4.9-MB492/20H4.9LC-mk0 약명: NS1-MB492, MOR-7480.1H-MB110/MOR-7480.1L-ml0r 약명: NS2-MB110, MOR-7480.1H-MB492/MOR-7480.1L-ml0r 약명: NS2-MB492), 및 항인간 CD137 스위치 항체(A375-mIgG1/B167-ml0r, A372-mIgG1/B040-ml0r, A372-MB110/B040-ml0r, A372-MB492/B040-ml0r, A356-MB110/B040-ml0r, A486-MB492/B167-ml0r, A488-MB492/B226-ml0r, A489-MB492/B223-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r, A551-MB110/B379-ml0r, 및 A548-mIgG1/B256-ml0r)가 제작되었다.
NS1-mIgG1, NS1-MB110 및 NS1-MB492 항체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역 20H4.9(서열 번호: 139)에, 중쇄 정상 영역으로서,
(i) 마우스 IgG1의 중쇄 정상 영역인 mIgG1(서열 번호: 144),
(ii) WO2014030750에 기재된 MB110(서열 번호: 145), 또는
(iii) WO2014030750에 기재된 MB492(서열 번호: 146)
의 어느 하나를 조합한 항체 중쇄의 유전자가 제작되었다. 즉, 20H4.9-mIgG1, 20H4.9-MB110, 및 20H4.9-MB492의 유전자가 제작되었다.
NS1-mIgG1, NS1-MB110 및 NS1-MB492 항체의 경쇄는, 경쇄 가변 영역 20H4.9LC(서열 번호: 140)에, 경쇄 정상 영역으로서 마우스 κ쇄 mk0(서열 번호: 147)을 조합한 항체 경쇄 20H4.9LC-mk0의 유전자가 제작되었다. 이들 중쇄 및 경쇄의 유전자를 조합함으로써 당업자 공지의 방법에 의해 각 항체가 발현, 정제되었다.
NS2-MB110 및 NS2-MB492 항체의 중쇄는, 중쇄 가변 영역 MOR-7480.1H(서열 번호: 142)에, 중쇄 정상 영역으로서 (i) MB110(서열 번호: 145) 혹은
(ii) MB492 (서열 번호: 146)
의 어느 하나를 조합한 항체 중쇄의 유전자가 제작되었다. 즉, MOR-7480.1H-MB110 및 MOR-7480.1H-MB492의 유전자가 제작되었다.
NS2-MB110 및 NS2-MB492 항체의 경쇄는, 경쇄 가변 영역 MOR-7480.1L(서열 번호: 143)에 경쇄 정상 영역으로서 마우스 λ쇄 ml0r(서열 번호: 148)을 조합한 항체 경쇄 MOR-7480.1L-ml0r의 유전자가 제작되었다. 이들 중쇄 및 경쇄의 유전자를 조합함으로써 당업자 공지의 방법에 의해 각 항체가 발현, 정제되었다.
항CD137 스위치 항체는, 하기 표 26 및 표 27의 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 유전자가 제작되고, 이들 유전자를 조합함으로써 당업자 공지의 방법에 의해 각 항체가 발현, 정제되었다.
마우스 정상 영역을 갖는 항CD137 스위치 항체의 항체 중쇄
Figure pct00026
마우스 정상 영역을 갖는 항CD137 스위치 항체의 항체 경쇄
Figure pct00027
(6-2) 인간 CD137 노크인 마우스 투여 시험용으로 조제된 항체의, 인간 CD137에 대한 결합 활성의 평가
실시예 6-1에서 제작된 항인간 CD137 논스위치 항체 및 항CD137 스위치 항체의, 인간 CD137에 대한 결합 활성이 평가되었다. 인간 CD137에 대한 결합 측정은, 러닝 버퍼로서 20mM ACES(pH 7.4), 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20이 이용되고, 37℃에서 실시되었다. 우선 Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare)에 Rabbit Anti-Mouse IgG(Thermo Scientific)를 고정화한 칩에 대해서, 러닝 버퍼로 조제한 항체 용액을 상호작용시킴으로써, 항체가 포착되었다. 다음에 목적 농도가 되도록 ATP가 첨가된 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액, 혹은 ATP를 포함하지 않는 러닝 버퍼로 조제된 인간 CD137 용액을 상호작용시킴으로써, ATP 존재하, 및 ATP 비존재하에서의 인간 CD137과의 결합 활성이 평가되었다. 항원인 인간 CD137은 실시예(1-2)로 조제된 hCD137(FXa digested)을 사용하여, 항원 농도 0, 15.625, 62.5, 250, 1000nM에서 측정이 실시되었다. 칩은 25mM NaOH와 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)을 이용하여 재생되어, 반복하여 항체를 포착하여 측정이 행해졌다. 각 항체의 인간 CD137에 대한 해리 상수(KD)는, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 산출되었다. 구체적으로는, 측정에 의해 얻어진 센서그램을 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합 속도 상수 ka(L/mol/s), 해리 속도 상수 kd(1/s)가 산출되고, 그들의 값으로부터 해리 상수 KD(mol/L)가 산출되었다.
표 28은 이들의 측정 결과를 나타낸다.
마우스 정상 영역을 갖는 항CD137 항체의 인간 CD137에 대한 결합 해석
Figure pct00028
상기에서 제작된, 마우스 정상 영역을 포함하는 항인간 CD137 논스위치 항체 및 항인간 CD137 스위치 항체는 모두, 인간 CD137에 결합함이 확인되었다. 또한 항인간 CD137 스위치 항체는 모두, ATP 농도 의존적으로 인간 CD137에 결합함이 나타났다. 한편 논스위치 항체에 있어서는 그와 같은 ATP 농도 의존적인 인간 CD137에의 결합은 관찰되지 않고, 어느 ATP 농도에 있어서도 거의 동등한 결합을 나타냈다.
(6-3) 개변된 항체의 인간 CD137 노크인 마우스에 있어서의 혈장중 동태 평가
(6-3-1) 인간 CD137 노크인 마우스의 제작
마우스 배성 줄기세포(ES 세포)에의 인간 CD137 유전자 치환 벡터의 도입에 의해, 마우스 CD137 유전자를 인간 CD137 유전자로 치환한 인간 CD137 노크인 마우스를 제작했다. 이 마우스를 hCD137 KI 마우스라고 기재한다.
(6-3-2) hCD137KI 마우스 모델에 있어서의, 혈장중의 항인간 CD137 항체 농도의 측정
실시예 6-3-1의 hCD137KI 마우스 제작 후, 표 29대로, 각 항체가 hCD137KI 마우스에 단회 정맥내 투여되었다. 표 29 중, NS1-mIgG1, NS1-MB110, NS1-MB492는 모두 논스위치 항체, 그 외는 스위치 항체이다. 투여 후 5분후로부터 28일 후에 걸쳐, 경시적으로 복수회 혈액이 채취되었다. 얻어진 혈액은 원심되어, 혈장이 분리되었다. 혈장은 측정까지 -20℃ 이하로 설정된 냉각기에 보존되었다.
혈장중 동태 평가 시험을 위한 군 상세
Figure pct00029
혈장 중의 각 스위치 항체의 농도는 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. 구체적으로는, hCD137(Sino Biological Inc.)은 PBS(-)로 희석되어, MULTI-ARRAY 96-well Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되었다. hCD137이 첨가된 플레이트는, 실온에서 1시간 진탕되어, hCD137은 플레이트에 고상되었다. 그 후, 블로킹을 위해, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액이 첨가되고, 실온에서 1시간 진탕되었다. 각 스위치 항체의 검량선은, 혈장중 농도로서 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1ng/mL로 조제되었다. hCD137 고상 플레이트에 3mM ADP, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액이 첨가된 후, 2배량의 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액으로 희석된 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되었다. 그 후, 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 비오틴화 항마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)가 첨가되었다. 추가로 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, SULFO-TAG Labeled Streptavidin(Meso Scale Diagnostics, LLC)이 첨가되었다. 추가로 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 2mM ADP, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액으로 2배 희석한 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해졌다. hCD137KI 마우스 혈장 중의 각 항체 농도의 측정은, SULFO-TAG를 SECTOR Imager(Meso Scale Diagnostics, LLC)를 이용하여 검출하는 것에 의해 행해졌다. 마우스 혈장 중의 각 항체 농도의 산출은, SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 행해졌다.
혈장 중의 각 논스위치 항체 농도는 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. 구체적으로는, hCD137(Sino Biological Inc.)은 PBS(-)로 희석되어, MULTI-ARRAY 96-well Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되었다. hCD137이 첨가된 플레이트는, 실온에서 1시간 진탕되어 hCD137은 플레이트에 고상되었다. 그 후, 블로킹을 위해, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액이 첨가되고, 실온에서 1시간 진탕되었다. 각 논스위치 항체의 검량선은, 혈장중 농도로서 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5ng/mL로 조제되었다. hCD137 고상 플레이트에 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액으로 희석된 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되었다. 그 후, 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 비오틴화 항마우스 IgG 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)가 첨가되었다. 추가로 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, SULFO-TAG Labeled Streptavidin(Meso Scale Diagnostics, LLC)이 첨가되었다. 추가로 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 2배 희석한 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해졌다. hCD137KI 마우스 혈장 중의 각 항체 농도의 측정은, 전술한 스위치 항체와 마찬가지로 행해졌다.
결과를 도 24, 도 25 및 도 26에 나타낸다.
표 29에 나타낸 각 항체 중, Fc가 mIgG1인 항체(논스위치 항체로서 NS1-mIgG1, 스위치 항체로서 A375-mIgG1/B167-ml0r, A372-mIgG1/B040-ml0r, A548-mIgG1/B256-ml0r, 및 A551-mIgG1/B256-ml0r)의, hCD137 KI 마우스에 있어서의 평균 혈장중 농도의 추이를 나타낸 것이 도 24이다. Fc가 MB110인 항체(논스위치 항체로서 NS1-MB110, 스위치 항체로서 A356-MB110/B040-ml0r, A372-MB110/B040-ml0r, 및 A551-MB110/B379-ml0r)의, hCD137 KI 마우스에 있어서의 평균 혈장중 농도의 추이를 나타낸 것이 도 25이다. Fc가 MB492인 항체(논스위치 항체로서 NS1-MB492, 스위치 항체로서 A372-MB492/B040-ml0r, A486-MB492/B167-ml0r, A488-MB492/B226-ml0r, 및 A489-MB492/B223-ml0r)의, hCD137 KI 마우스에 있어서의 평균 혈장중 농도의 추이를 나타낸 것이 도 26이다. 한편, 도 26에 있어서, A488-MB492/B226-ml0r에 대해서는, 1예에서 ADA에 의하는 것이라고 의심되는 혈장중 농도 추이의 급격한 감소가 확인되었으므로 2예의 평균치로 했다.
hCD137 KI 마우스에서는, 어느 Fc에 있어서도, 스위치 항체가 논스위치 항체보다 느린 혈장 중으로부터의 소실을 나타냈다. 이것은, 논스위치 항체가 스위치 항체와 비교하여, 체내에 발현하는 CD137에 결합했기 때문에, 보다 빨리 혈장 중으로부터 소실되었기 때문이라고 생각된다. 또한, 정상 조직에 있어서의 세포외 ATP 농도는, 본 실험에 이용한 스위치 항체가 CD137에 결합을 나타내지 않을 정도로 충분히 낮음이 시사되었다. 이로부터, 스위치 항체를 이용하는 것에 의해, 전신에 발현하는 항원에의 결합성을 저감시킬 수 있어, 그것에 의해 혈중 동태가 좋은 항체를 제작할 수 있음이 시사되었다.
(6-4) hCD137KI 마우스를 이용한 동계 종양 세포 이식 모델에 의한 항CD137 항체의 약효 및 전신 반응 마커의 움직임
(6-4-1) 세포주 및 동계 종양 이식 마우스 모델의 제작, 및, 항종양 효과 및 전신 반응의 평가 방법
각종 시험에는 미국 국립 암연구소로부터 라이센스 공여된 마우스 대장암 세포주 MC38 세포와 실시예 6-3-1에 기재된 hCD137 KI 마우스가 사용되었다. MC38 세포주는 마우스의 복부 피하에 이식되어, 종양 체적이 대략 50-300mm3가 된 시점에서 모델 성립으로 했다. 모델 성립 후, MC38 세포주 이식 마우스는 군나누기가 실시된 후에, 각종 항CD137 항체가 투여되었다.
항종양 효과 평가를 위해, 종양 체적 측정은 주1-2회의 빈도로 실시되었다. 또한, 종양 체적은 이하의 계산식으로 산출되었다.
종양 체적(mm3) = 장경(mm)×단경(mm)×단경(mm)/2
전신 반응은, 항체 투여 후의 적절한 타이밍에 간장 및 비장 또는 림프절 등이 적출되고, 장기 중량이나 림프구 획분 세포수, 또는 플로 사이토메트리(FCM)를 사용한 T 세포 해석에 의해 평가되었다. 이들 각 지표의 평가에 있어서는, 대상 스위치 항체가, 동량의 논스위치 항체(ATP 의존적인 인간 CD137 결합 활성을 갖지 않는 항인간 CD137 컨트롤 항체)와 비교하여, 전신 반응을 나타내는 지표가 낮은 값인 경우에, 전신 반응 및/또는 종양 이외의 조직(예를 들어, 림프절, 비장 및 간장)에서의 T 세포의 활성화가 억제되었다고 평가되었다.
한편, 각종 시험에는 실시예 6-1(인간 CD137 노크인 마우스 투여 시험을 위한 항체의 제작)에서 제작된 항체가 이용되었다.
(6-4-2) MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제
적출된 비장, 림프절은 중량 측정 혹은 림프구 획분의 세포수 측정이 실시되었다. 또한, 간장에서의 활성화 평가에는 Liver dissociation kit, mouse(Milteny Biotec)를 이용하여 얻어진 림프구 획분이 사용되었다. 비장에서의 활성화 평가는 용혈 후의 림프구 획분이 이용되고, 림프절에서의 활성화 평가는 갈아서 으깨어져 얻어진 림프구 획분이 이용되었다.
(6-4-3) 각종 장기의 림프구 획분을 이용한 FCM 해석
FCM에 의한 활성화 마커 평가에는 CD8α 양성 T 세포에서의 Granzyme B 발현 또는 PD-1 발현 또는 ICOS 발현, 혹은 CD45 양성 세포에 대한 CD8α 양성 T 세포의 비율이 이용되었다. 이를 위해 FCM 해석에서는 형광 표지된 항Granzyme B항체, 항PD-1 항체, 항ICOS 항체, 항CD8α 항체 및 항CD45 항체 등이 이용되었다. 측정은 BD LSRFortessa(상표) X-20(BD Biosciences)으로 행해졌다.
(6-4-4) A375-mIgG1/B167-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 30에 나타난 용량으로, Vehicle 및 A375-mIgG1/B167-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 4일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A375-mIgG1/B167-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00030
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 그 결과, A375-mIgG1/B167-ml0r 항체의 용량 의존적인 항종양 효과가 확인되었다(도 27).
(6-4-5) A375-mIgG1/B167-ml0r의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 31에 나타난 대로 Vehicle, NS1-mIgG1(논스위치 항체) 및 A375-mIgG1/B167-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 5일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장, 림프절에 있어서는 3마리분의 장기가 pool되고, 실시예 6-4-3(각종 장기의 림프구 획분을 이용한 FCM 해석)에 나타나는 방법으로 FCM 해석이 이루어졌다.
A375-mIgG1/B167-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00031
상기 투여 항체의 전신 작용이 평가되었다. 림프절, 비장의 장기 중량 평가의 결과, NS1-mIgG1 투여 시에는 0.3mg/kg에서 장기 중량의 증가가 인정되고, 1.5mg/kg, 7.5mg/kg에서는 더욱 강한 장기 비대화 현상이 관찰되었다. 한편으로, A375-mIgG1/B167-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 7.5mg/kg, 37.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 장기의 비대화가 관찰되지 않았다(도 28).
또한, FCM 평가에 의한 T 세포 활성화 평가의 결과, PD-1, ICOS, Granzyme B 어느 마커에 있어서도 NS1-mIgG1 투여 시에는 0.3mg/kg에서 발현 상승이 관찰되었다. 한편, A375-mIgG1/B167-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 7.5mg/kg, 37.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 PD-1, ICOS, Granzyme B 모든 마커에서 현저한 발현 억제가 인정되었다(도 29, 도 30). 한편, A375-mIgG1/B167-ml0r의 결과로부터, 림프절과 비장에 있어서는 장기 중량과 T 세포 활성화 마커가 상관하는 결과가 나타났기 때문에, 이후의 항체 평가에서는 림프절 및 비장 유래 면역 세포 활성화의 지표로서 장기 중량을 주로 이용했다.
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, PD-1, Granzyme B 모두 NS1-mIgG1 투여 시에는 0.3mg/kg에서 발현 상승이 관찰되었다. 한편, A375-mIgG1/B167-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 7.5mg/kg, 37.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 발현 억제가 인정되었다(도 31).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 동량의 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장 및 간장에 있어서 T 세포의 활성화를 억제시켰다.
(6-4-6) A356-MB110/B040-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 32에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A356-MB110/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A356-MB110/B040-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00032
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 그 결과, A356-MB110/B040-ml0r의 용량 의존적인 항종양 효과가 확인되었다(도 32).
(6-4-7) A356-MB110/B040-ml0r의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 33에 나타난 대로 Vehicle, NS2-MB110(논스위치 항체) 및 A356-MB110/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 7일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장, 림프절은 장기 중량 측정만 실시되었다.
A356-MB110/B040-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00033
상기 투여 항체의 전신 작용이 평가되었다. NS2-MB110 및 A356-MB110/B040-ml0r 투여 시의 림프절, 비장의 장기 중량 평가의 결과, NS2-MB110 투여 시에는 2.5mg/kg 투여 시에도 비대화가 관찰되었다. 한편, A356-MB110/B040-ml0r 투여 시에는 7.5mg/kg 투여에서도 림프절 비대화 억제가 인정되고, 비장에 대해서는 2.5mg/kg 투여 시에 비대화 억제가 인정되었다(도 33).
또한, 간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, NS2-MB110 투여 시에는 0.3mg/kg 투여 시에도 CD8α 양성 세포에 있어서의 PD-1 발현의 상승이 관찰되었다. 한편, A356-MB110/B040-ml0r 투여 시에는 7.5mg/kg에서 PD-1 발현 억제, 2.5mg/kg 투여 시에는 현저한 발현 억제가 인정되었다. CD8α 양성 세포에 있어서의 ICOS 발현에서는 NS2-MB110 항체 0.3mg/kg 투여 시에도 약간의 상승이 관찰되었다. 한편, A356-MB110/B040-ml0r 투여 시에는 2.5mg/kg 투여 시에는 Vehicle 정도의 발현으로 억제되고 있음이 관찰되었다(도 34).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장 및 간장에 있어서 T 세포의 활성화를 억제시켰다.
(6-4-8) A372-mIgG1/B040-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 34에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A372-mIgG1/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 4일 후, 7일 후, 10일 후의 합계 4회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A372-mIgG1/B040-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00034
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 그 결과, 7.5mg/kg 투여에 있어서, A372-mIgG1/B040-ml0r 항체의 항종양 효과가 인정되었다(도 35).
(6-4-9) A372-mIgG1/B040-ml0r의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 35에 나타난 대로 Vehicle 및 A372-mIgG1/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후후, 6일 후의 합계 3회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 7일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장은 장기 중량만 실시되고, 림프절은 3마리의 것을 pool한 후, 림프구 획분의 세포수 측정만 실시되었다.
A372-mIgG1/B040-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00035
상기 투여 항체의 전신 작용이 평가되었다. 림프절의 세포수 측정, 비장의 장기 중량 평가의 결과, A372-mIgG1/B040-ml0r 투여 시에는 림프절의 세포수 증가, 및 비장 중량의 증가는 인정되지 않고, Vehicle군과 동등의 장기 중량임이 확인되었다(도 36).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, A372-mIgG1/B040-ml0r 투여 시에는 Vehicle군과 동일한 정도의 Granzyme B 발현 레벨이었다(도 37).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 림프절, 비장 및 간장에 있어서 T 세포의 활성화 억제가 확인되었다.
(6-4-10) A372-MB110/B040-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 36에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A372-MB110/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 4일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A372-MB110/B040-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00036
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 그 결과, A372-MB110/B040-ml0r의 항종양 효과가 확인되었다(도 38).
(6-4-11) A372-MB110/B040-ml0r의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 37에 나타난 대로 Vehicle, NS2-MB110(논스위치 항체) 및 A372-MB110/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 7일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나듯이 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장, 림프절은 중량 측정만 실시되었다.
A372-MB110/B040-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00037
상기 투여 항체의 전신 작용이 평가되었다. 림프절, 비장의 장기 중량 평가의 결과, NS2-MB110 투여 시에는 2.5mg/kg, 7.5mg/kg에서 장기 중량의 증가가 인정되었다. 한편, A372-MB110/B040-ml0r 투여 시에는 2.5mg/kg, 7.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 장기 비대화의 억제가 관찰되었다(도 39).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, PD-1은 NS2-MB110 투여 시에는 발현 상승이 관찰되었다. 이것은 A372-MB110/B040-ml0r 투여 시에도 마찬가지로 나타나고 있었다(도 40).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장에 있어서는 T 세포의 활성화 억제가 확인되었다.
(6-4-12) A372-MB492/B040-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 38에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A372-MB492/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A372-MB492/B040-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00038
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 그 결과, 어느 투여량에 있어서도 A372-MB492/B040-ml0r 항체의 항종양 효과가 인정되었다(도 41).
(6-4-13) A372-MB492/B040-ml0r 항체의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 39에 나타난 대로 Vehicle, NS1-MB492(논스위치 항체) 및 A372-MB492/B040-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 8일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장은 장기 중량 측정만, 림프절은 림프구 획분 조제 후의 세포수 측정만 실시되었다.
A372-MB492/B040-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00039
상기 투여 항체의 전신 작용이 평가되었다. 비장의 장기 중량으로부터 NS1-MB492 투여 시에는 장기 중량의 증가, 세포수 측정에 의해 NS1-MB492 투여 시에 림프구 획분의 증가가 인정되었다. 한편으로, A372-MB492/B040-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 3.0mg/kg, 7.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 NS1-MB492와 비교하여, 장기 비대화 억제가 관찰되었다(도 42).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, NS1-MB492, A372-MB492/B040-ml0r 투여 시 모두 Vehicle과 비교하여 Granzyme B의 발현 상승이 관찰되었다(도 43).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장에 있어서는 T 세포의 활성화 억제가 확인되었다.
(6-4-14) A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 40에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A486-MB492/B167-ml0r, A488-MB492/B226-ml0r이 투여되었다. 세포 이식 후 10일 후에 군나누기가 실시되고, 항체 투여는 세포 이식 후 11일 후, 15일 후, 18일 후, 22일 후의 합계 4회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A486-MB492/B167-ml0r, A488-MB492/B226-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00040
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 결과, A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r에 의한 항종양 효과가 확인되었다(도 44).
(6-4-15) A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 41에 나타난 대로 Vehicle, NS1-MB492(논스위치 항체) 및 A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r이 투여되었다. 세포 이식 후 10일 후에 군나누기가 실시되고, 항체 투여는 세포 이식 후 11일 후, 15일 후, 18일 후, 22일 후의 합계 4회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 13일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장은 장기 중량 측정, 림프절은 림프구 획분 세포수 측정만 실시되었다.
A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00041
림프절의 림프구 획분 세포수수 측정과 비장 중량 측정의 결과, NS1-MB492 투여 시에는 림프구 세포수 및 비장 중량의 증가가 인정되었다. 한편, A486-MB492/B167-ml0r 및 A488-MB492/B226-ml0r 투여 시에는 NS1-MB492 투여 시와 비교하여, 림프구수나 비장 중량의 증가가 억제되고 있음이 관찰되었다(도 45).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, NS1-MB492 및 A486-MB492/B167-ml0r, A488-MB492/B226-ml0r 투여 시 모두 Vehicle과 비교하여 CD8α 양성 세포의 비율 상승이 관찰되었다(도 46).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장에 있어서는 T 세포의 활성화 억제가 확인되었다.
(6-4-16) A489-MB492/B223-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 42에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A489-MB492/B223-ml0r이 투여되었다. 항체는 군나누기 다음날과 군나누기 4일 후, 7일 후, 10일 후의 합계 4회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A489-MB492/B223-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00042
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 결과, 7.5mg/kg 투여에 있어서 항종양 효과가 확인되었다(도 47).
(6-4-17) A489-MB492/B223-ml0r 항체의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 43에 나타난 대로 Vehicle, NS1-MB492(논스위치 항체) 및 A489-MB492/B223-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후, 6일 후의 합계 3회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 7일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장, 림프절은 림프구 획분 조제 후의 세포수 측정만 실시되었다.
A489-MB492/B223-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00043
림프절, 비장의 림프구 획분 세포수수 측정의 결과, NS1-MB492 투여 시에는 세포 증가가 인정되었다. 한편, A489-MB492/B223-ml0r 투여 시에는 NS1-MB492 투여 시와 비교하여, 림프구 증가 억제의 현상이 관찰되었다(도 48).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, NS1-MB492, A489-MB492/B223-ml0r 투여 시 모두 Vehicle과 비교하여 CD8α 양성 세포의 비율 상승이 관찰되었다(도 49).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장에 있어서는 T 세포의 활성화 억제가 확인되었다.
(6-4-18) A548-mIgG1/B256-ml0r 및 A551-mIgG1/B256-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 44에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00044
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 결과, A548-mIgG1/B256-ml0r 투여에서는 37.5mg/kg, 100mg/kg에 있어서, 항종양 효과가 인정되었다. 또한, A551-mIgG1/B256-ml0r에서는 100mg/kg에 있어서 현저한 항종양 효과가 인정되었다(도 50).
(6-4-19) A548-mIgG1/B256-항체 및 A551-mIgG1/B256-항체의 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 45에 나타난 대로 Vehicle, NS1-mIgG1(논스위치 항체) 및 A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 5일 후에 실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되었다. 한편, 비장, 림프절은 장기 중량 측정만 실시되었다.
A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00045
림프절, 비장의 장기 중량 평가의 결과, NS1-mIgG1 투여 시에는 0.3mg/kg, 1.5mg/kg, 7.5mg/kg에서 장기 중량의 증가가 인정되었다. 한편, A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 7.5mg/kg, 37.5mg/kg, 100mg/kg 어느 투여량에 있어서도 장기의 비대화가 관찰되지 않았다(도 51).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가의 결과, Granzyme B, PD-1 모두 NS1-mIgG1 투여 시에는 0.3mg/kg에서 발현 상승이 관찰되었다. 한편, A548-mIgG1/B256-ml0r, A551-mIgG1/B256-ml0r 투여 시에는 1.5mg/kg, 7.5mg/kg, 37.5mg/kg, 100mg/kg 어느 투여량에 있어서도 발현 억제가 인정되었다(도 52).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장 및 간장에 있어서 T 세포의 활성화를 억제시켰다.
(6-4-20) A551-MB110/B379-ml0r 항체에 관한 약효(항종양 효과) 시험
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 46에 나타난 용량으로 Vehicle 및 A551-MB110/B379-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
A551-MB110/B379-ml0r 항체 약효 시험을 위한 군 상세
Figure pct00046
각 군에 있어서의 항종양 효과는, 실시예 6-4-1에 기재된 방법으로 산출된 종양 체적에 의해 평가되었다. 결과, 어느 용량에 있어서도 항종양 효과가 확인되었다(도 53).
(6-4-21) 전신 작용 평가를 위한 항체 투여와 채재, 및 FCM 해석
실시예 6-4-1의 MC38 이식 마우스 모델 제작 후, 표 47에 나타난 대로 Vehicle, NS1-mIgG1(논스위치 항체) 및 A551-MB110/B379-ml0r이 투여되었다. 항체 투여는 군나누기 당일과 군나누기 3일 후의 합계 2회, 꼬리 정맥 경로로부터 실시되었다. Vehicle로는 0.05% Tween-20 함유 PBS가 이용되었다.
초회 투여 후 5일 후에(실시예 6-4-2(MC38 세포주 이식 마우스로부터의 각종 장기의 적출과 림프구 획분의 조제)에 나타나는 방법으로 간장, 림프절, 비장이 적출되고, 실시예 6-4-3(각종 장기의 림프구 획분을 이용한 FCM 해석)에 나타나는 방법으로 FCM 해석이 이루어졌다.
A551-MB110/B379-ml0r 항체에 의한 전신 반응 평가를 위한 군 상세
Figure pct00047
림프절, 비장의 장기 중량 평가의 결과, NS1-mIgG1 투여 시에는 7.5mg/kg에서 장기 중량의 증가가 인정되었다. 한편, A551-MB110/B379-ml0r 투여 시에는 0.83mg/kg, 2.5mg/kg, 7.5mg/kg, 22.5mg/kg 어느 투여량에 있어서도 장기의 비대화가 관찰되지 않았다(도 54). 또한, 비장에서의 FCM 평가에 의한 T 세포 활성화 평가에 있어서도, NS1-mIgG1 투여 시에 관찰된 활성화 마커(PD-1, ICOS, Granzyme B) 상승이 A551-MB110/B379-ml0r 투여 시에는 어느 투여량에 있어서도 확인되지 않았다(도 55).
간장에 있어서의 T 세포 활성화 평가에서는, NS1-mIgG1 투여 시에는 PD-1, ICOS 모두 7.5mg/kg에서 발현 상승이 관찰되었다. 한편, A551-MB110/B379-ml0r 투여 시에는 0.83mg/kg, 2.5mg/kg에 있어서 Vehicle 레벨까지 발현 억제가 인정되고, 7.5mg/kg 투여 시에도 NS1-mIgG1보다도 발현 증가가 억제되었다(도 56).
이상으로부터, 당해 스위치 항체는, 논스위치 항체와 비교하여, 림프절, 비장 및 간장에 있어서 T 세포의 활성화를 억제시켰다.
실시예 7: 아고니스트 활성 증강을 가능하게 하는 개변 Fc의 제작
(7-1) FcγR에의 결합 활성을 상승시킨 개변체의 제작
WO2017104783에 기재되어 있는 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역 TT14(서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, T250V/T307P의 아미노산 개변, 및 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변으로서 L234Y/P238D/V264I/A330K를 포함하는 중쇄 정상 영역인(개변 위치는 모두 EU 번호).)(서열 번호: 149), WO2017104783에 기재되어 있는 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역 TT11(서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, T250V/T307P의 아미노산 개변, 및 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시키는 개변으로서 L234Y/P238D/A330K를 포함하는 중쇄 정상 영역이다(개변 위치는 모두 EU 번호).)에 G237D의 아미노산 변이가 도입된 TT16(서열 번호: 150), WO2014163101에 기재되어 있는 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역 P587(서열 번호: 151), 및 기존의 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역인 P253(서열 번호: 93)이, 스위치 항체의 중쇄 가변 영역(A375, A372, A356, A486, A488, A489, A548, 및 A551), 혹은 음성 컨트롤 항체의 중쇄 가변 영역(IC17HdK(서열 번호: 152))과 조합되었다. 이것에 의해, 다음과 같이 각 정상 영역과 각 중쇄 가변 영역을 조합한 유전자가 제작되었다.
Figure pct00048
또한, WO2017104783에 기재되어 있는 FcγR에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역 MY201(서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변으로서 G236N/H268D/A330K를 포함하는 중쇄 정상 영역인(개변 위치는 모두 EU 번호).)(서열 번호: 153), MY518(서열 번호: 182의 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역에 있어서, FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시키는 아미노산 개변으로서 L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K를 포함하는 중쇄 정상 영역이다(개변 위치는 모두 EU 번호).)(서열 번호: 154), 및 그들에 K214R의 개변이 도입된 MY201a(서열 번호: 155), MY518a(서열 번호: 156), 혹은 MY201a에 L235W의 개변이 도입된 MY201aPh(서열 번호: 157)와 스위치 항체의 중쇄 가변 영역(A375, A356, 및 A551), 혹은 음성 컨트롤 항체의 중쇄 가변 영역(IC17HdK(서열 번호: 152))이 조합되었다. 이것에 의해, 다음과 같이 각 정상 영역과 각 중쇄 가변 영역을 조합한 유전자가 제작되었다.
Figure pct00049
이들 항체 중쇄 유전자와 스위치 항체의 항체 경쇄 유전자(실시예 5-2 및 5-3에서 제작된 B040-Lamlib, B167-Lamlib, B226-Lamlib, B223-Lamlib, B256-Lamlib, 및 B379-Lamlib), 및 음성 컨트롤 항체의 항체 경쇄 유전자(경쇄 가변 영역 IC17L(서열 번호: 158)에 경쇄 정상 영역으로서 인간 κ쇄 k0(서열 번호: 141)을 조합함으로써 제작된, IC17L-k0을 조합함으로써, 당업자 공지의 방법에 의해, 표 50대로, 목적으로 하는 항체가 발현, 정제되었다.
FcγR에의 결합 활성을 상승시킨 각 개변체
Figure pct00050
(7-2) 정상 영역의 아미노산 개변에 의해 pI를 상승시킨 개변체의 제작
WO2017046994에 기재되어 있는 FcγR에의 결합 활성을 크게 변화시키지 않고 pI를 상승시키는 아미노산 변이인 Q311R, P343R, D413K를 실시예 7-1에서 제작된 FcγR에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역과 조합한 중쇄 정상 영역이 제작되었다.
구체적으로는, 하기와 같이 각 항체 중쇄 정상 영역의 유전자에 아미노산 변이를 도입한 중쇄 정상 영역의 유전자가 제작되었다.
· MY518(서열 번호: 154)에 P343R/D413K를 도입: SCF025(서열 번호: 64)
· MY518a(서열 번호: 156)에 P343R/D413K를 도입: SCF025a(서열 번호: 65)
· TT14(서열 번호: 149)에 P343R/D413K를 도입: SCF027(서열 번호: 66)
· TT16(서열 번호: 150)에 P343R/D413K를 도입: SCF028(서열 번호: 67)
· MY518(서열 번호: 154)에 Q311R/P343R을 도입: SCF030(서열 번호: 68)
· TT14(서열 번호: 149)에 Q311R/P343R을 도입: SCF032(서열 번호: 69)
· TT16(서열 번호: 150)에 Q311R/P343R을 도입: SCF033(서열 번호: 70)
· MY518(서열 번호: 154)에 P343R을 도입: SCF039(서열 번호: 71)
· MY518a(서열 번호: 156)에 P343R을 도입: SCF039a(서열 번호: 72)
· MY518(서열 번호: 154)에 D413K를 도입: SCF040(서열 번호: 73)
· MY201a(서열 번호: 155)에 P343R을 도입: SCF041a(서열 번호: 74)
· MY201aPh(서열 번호: 157)에 P343R을 도입: 및 SCF041aPh(서열 번호: 75)
· MY201a(서열 번호: 155)에 D413K를 도입: SCF042a(서열 번호: 76)
· MY201a(서열 번호: 155)에 P343R/D413K를 도입: SCF043a(서열 번호: 77)
· MY201aPh(서열 번호: 157)에 P343R/D413K를 도입: SCF043aPh(서열 번호: 78)
· MY201a(서열 번호: 155)에 Q311R을 도입: SCF056a(서열 번호: 79)
· MY201aPh(서열 번호: 157)에 Q311R을 도입: SCF056aPh(서열 번호: 80)
· MY201a(서열 번호: 155)에 Q311R/P343R을 도입: SCF057a(서열 번호: 81)
· MY201aPh(서열 번호: 157)에 Q311R/P343R을 도입: SCF057aPh(서열 번호: 82)
· MY201a(서열 번호: 155)에 Q311R/D413K를 도입: SCF059a(서열 번호: 83)
· MY201aPh(서열 번호: 157)에 Q311R/D413K를 도입: SCF059aPh(서열 번호: 84)
· MY518a(서열 번호: 156)에 Q311R을 도입: SCF060a(서열 번호: 85)
여기에서 제작된 중쇄 정상 영역의 유전자와 각 중쇄 가변 영역 A375(서열 번호: 43), 또는 A551(서열 번호: 51)의 유전자가 조합됨으로써, 다음의 표 51대로, 각 항체 중쇄 유전자가 제작되었다.
Figure pct00051
더욱이, 이들 항체 중쇄 유전자와 항체 경쇄 유전자로서 실시예 5-3에서 제작된 B167-Lamlib, B256-Lamlib, B379-Lamlib의 유전자가 조합됨으로써, 당업자 공지의 방법에 의해, 표 52대로 목적으로 하는 항체가 발현, 정제되었다.
Figure pct00052
(7-3) 아고니스트 활성의 비교 대조용의 컨트롤 항체의 제작
아고니스트 활성의 비교 대조용의 컨트롤 항체로서 실시예 7-1에서 제작된 IC17HdK(서열 번호: 152)를 중쇄 가변 영역에 가지는 항체(IC17HdK-MY201/IC17L-k0, IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0, IC17HdK-MY518/IC17L-k0, IC17HdK-MY518a/IC17L-k0, IC17HdK-P253/IC17L-k0, IC17HdK-P587/IC17L-k0, IC17HdK-TT16/IC17L-k0)가 제작되었다. 또한, 중쇄 가변 영역 IC17HdK(서열 번호: 152)의 유전자와 인간 IgG4의 중쇄 정상 영역의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G4d(서열 번호: 159)의 유전자가 조합됨으로써 제작된 항체 중쇄 IC17HdK-G4d와 항체 경쇄IC17L-k0(가변 영역의 서열 번호: 158, 정상 영역의 서열 번호: 141)의 유전자를 조합함으로써 당업자 공지의 방법에 의해 목적으로 하는 항체(IC17HdK-G4d/IC17L-k0)가 발현, 정제되었다. 이들 컨트롤 항체는, 실시예 5에 있어서 사용되었다.
(7-4) 정상 영역의 아미노산 개변에 의해 pI를 상승시킨 개변체의 각 인간 Fcγ 수용체 결합의 평가
Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여, 각 인간 Fcγ 수용체(이하 FcγR로 표시한다)에 대한 결합 활성이 평가되었다. 측정용 완충액으로서 50mM 인산, 150mM NaCl, 0.05w/v%-P20, pH 7.4가 이용되고, 25℃에서 실시되었다. 리간드 포착용 분자로서 CaptureSelect(상표) Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(ThermoFisher scientific)를 고상화한 센서 칩을 이용하여 항체를 약 1000RU 포착시켰다. 인간 FcγR은 측정용 완충액으로 FcγRIa는 8nM로, 그 이외의 FcγR은 1000nM로 희석하여, 포착시킨 항체에 상호작용시켰다. 각 항체의 각 FcγR에 대한 결합 활성은, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 단위 항체량당의 FcγR 결합량(RU)을 산출하는 것에 의해 평가되었다.
FcγR의 세포외 도메인은 이하의 방법으로 조제되었다. 우선 FcγR의 세포외 도메인의 유전자의 합성이 당업자 공지의 방법으로 실시되었다. 그 때, 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보에 기초하여 제작되었다. 구체적으로는, FcγRI에 대해서는 NCBI의 accession # NM_000566.3의 서열, FcγRIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001136219.1의 서열, FcγRIIb에 대해서는 NCBI의 accession # NM_004001.3의 서열, FcγRIIIa에 대해서는 NCBI의 accession # NM_001127593.1의 서열에 기초하여 제작되고, C말단에 His 태그가 부가되었다. 또한 FcγRIIa의 다형 부위에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172, 19-25를, FcγRIIIa의 다형 부위에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100, 1059-1070을 참고로 하여 제작되었다. 얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입함으로써, 발현 벡터가 제작되었다. 제작된 발현 벡터가 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에, 일과성으로 도입되어, 목적 단백질이 발현되었다. 배양 상청은 회수된 후, 0.22μm 필터에 통과되고, 원칙으로서 다음의 4 스텝으로 정제되었다. 제 1 스텝은 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제 2 스텝은 His 태그에 대한 어피니티 컬럼 크로마토그래피(HisTrap HP), 제 3 스텝은 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(Superdex200), 제 4 스텝은 무균 여과가 실시되었다. 다만, FcγRI에 대해서는, 제 1 스텝에 Q sepharose FF를 이용한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피가 실시되었다. 정제된 단백질의 농도는, 분광 광도계를 이용하여 280nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용함으로써 산출되었다(Protein Science, 1995, 4, 2411-2423).
표 53에 단위 항체량당의 결합량, 및 A375-G1T3/B167-Lamlib의 결합량에 대한 상대량을 나타낸다. 표 53 중의 어느 항체도 단위 항체량당의 인간 FcγRIIb 결합량은 A375-G1T3/B167-Lamlib의 그것보다 많아, A375-G1T3/B167-Lamlib의 인간 FcγRIIb 결합량을 1.0으로 했을 경우의 상대치로서 2.85-14.26이었다. 정상 영역의 pI를 상승시키는 아미노산 개변의 유무로 단위 항체량당의 인간 FcγRIIb 결합량 및 결합량의 상대치는 동일한 정도였다. 또한, L235W의 개변을 포함하는 항체의 hFcgRIa에의 결합량은 A375-TT14/B167-Lamlib의 그것과 비교하여 저하되고 있었다.
각 인간 FcγR의 결합 활성
Figure pct00053
(7-5) 정상 영역의 아미노산 개변에 의해 pI를 상승시킨 개변체의 인간 FcRn 결합의 평가
Biacore T200(GE Healthcare)를 이용하여, 인간 FcRn에 대한 결합 활성이 평가되었다. 측정용 완충액으로서 50mM 인산, 150mM NaCl, 0.05w/v%-P20, pH 6.0이 이용되고, 25℃에서 실시되었다. 본 측정에 이용한 인간 FcRn 단백질은 WO2010107110에 기재된 수법으로 조제되었다. 리간드 포착용 분자로서 CaptureSelect(상표) Human Fab-lambda Kinetics Biotin Conjugate(ThermoFisher scientific)를 고상화한 센서 칩을 이용하여 항체를 약 400RU 포착시킨 후, 측정용 완충액으로 희석된 인간 FcRn을 결합시켰다. 각 항체의 FcRn에 대한 결합 활성은, Biacore T200 Evaluation Software 2.0을 이용하여 Steady state 모델에 의해 KD(mol/L)를 산출하는 것에 의해 평가되었다. 정상 영역의 pI를 상승시키는 아미노산 개변의 유무로 KD치는 동일한 정도였다. 표 54에 인간 FcRn와 각 항체의 KD(mol/L)를 나타낸다.
Figure pct00054
실시예 8: 키누레닌(Kyn) 의존성 CD137 항체의 취득
(8-1) 래셔널 디자인 항체 라이브러리로부터의 키누레닌에 의존적인 인간 CD137 결합 활성을 갖는 항체의 취득
국제 공개 WO2015/083764호에 기재된 방법으로 구축된, 키누레닌에 대한 패닝을 이용한 키누레닌스잇치 항체 취득용 래셔널 디자인 항체 파지 디스플레이 라이브러리(키누레닌 라이브러리)로부터, 키누레닌 존재하에서 인간 CD137에 대한 결합 활성을 나타내고, 키누레닌 비존재하에서 결합 활성을 나타내지 않는 항체가 취득되었다. 취득을 위해서, 키누레닌 존재하에서 파지가 결합한 비오틴화 항원이 비즈에 포착되고, 키누레닌 존재하에서 항원에 대해서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 그 후, 비즈로부터 용출된 용출액으로부터 파지가 회수되었다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지하는 대장균으로부터 파지가 일반적인 방법으로 산생되었다. 구체적으로는, 구축된 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7ΔpIII(「하이퍼파지」라고 호칭)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 Tris Buffered Saline(TBS)으로 희석하는 것에 의해 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated(Thermo Fisher Scientific), FG beads NeutrAvidin(다마가와세이키), 혹은 Dynabeads MyOne Streptavidin T1(Life Technologies)이 이용되었다. 항원으로서 실시예 1-3(비오틴화 Fc 융합형 인간 CD137의 조제)에 기재된 방법으로 조제된 비오틴화 hCD137-Fc(hCD137-Fc-Bio)가 사용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위한 패닝이 실시되었다. 구체적으로는, 저분자인 키누레닌 존재하에서 항원에 결합하고, 키누레닌 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에서 나타난 방법을 참고로 실시되었다. Round1에서는 hCD137-Fc-Bio 또는 비오틴화 키누레닌(bio-Kyn)(WO2015/083764에 기재된 화합물 028([화 28]로 표시됨), 029([화 29]로 표시됨) 및 036([화 36]로 표시됨))에 대한 패닝이 실시되었다. hCD137-Fc-Bio에 대한 패닝에서는, 먼저 항원에 파지 용액이 첨가된 후에 자성 비즈로 항원과 결합한 파지를 회수하는 방법으로 실시되고 bio-Kyn에 대한 패닝은 먼저 비오틴화 항원을 자성 비즈 상에 고상화한 후에 조제된 파지 라이브러리 용액이 첨가되는 방법으로 패닝이 실시되었다. Bio-Kyn에 대해서는 저분자로서의 키누레닌은 비존재하에서 항원 결합할 수 있는 항체를 농축하는 패닝이 전술한 선행 특허 WO2015/083764에 기재된 방법을 참고로 실시되었다. hCD137-Fc-Bio에 대해서는, Fc 영역에 결합하는 항체를 제거하기 위해서 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역 4nmol이 첨가되었다. 회수된 파지는 대장균주 ER2738에 첨가되어 파지를 대장균에 감염시킨 후, 회수된 대장균에 대해서 하이퍼파지를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다.
Round2 이후에서는 hCD137-Fc-Bio에 대해서, 키누레닌 존재하에서 항원에 결합하고, 키누레닌 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2015/083764에서 나타난 방법을 참고로 실시되었다. 어느 경우도 hCD137-Fc-Bio에 대해서는, Fc 영역에 결합하는 항체를 제거하기 위해서 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역 4nmol이 첨가되었다. 마찬가지의 패닝이 Round5까지 반복되어, 목적하는 항체 서열이 농축되었다.
(8-2) 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 hCD137에 결합하는 항체의 취득
(8-2-1) hCD137p12-FX-Fc-Bio의 조제
hCD137p12-FX-Fc-Bio는 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137 세포외 부분 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 Factor Xa 절단 서열을 코딩하는 유전자 단편과 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 부분 영역, FactorXa 절단 서열과 항체 정상 영역이 연결된 단백질(hCD137p12-FX-Fc-Bio, 서열 번호: 160)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터가 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 BirA와 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 동시에 도입되었다. 배양 중에 비오틴이 첨가되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, hCD137p12-FX-Fc-Bio가 배양 상청 중에 분비되었다. 이 배양 상청이 회수되었다. 배양 상청으로부터 프로틴 A를 이용하여 hCD137p12-FX-Fc-Bio가 정제되었다.
래셔널 디자인 라이브러리를 이용하면, 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 저분자 존재하에서만 패닝하는 것에 의해, 저분자 존재하에서 항원 결합 활성을 나타내는 저분자 스위치 항체를 취득할 수 있다고 생각되었다. 즉, 국제 공개 WO2015/083764호에 기재된 방법으로 구축된 키누레닌 라이브러리로부터, 비즈에 포착된 hCD137에 대해서 키누레닌 존재하에서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 회수되었다. 본 취득 방법에서는, 항원으로서 실시예 1-3(비오틴 표지 Fc 융합형 인간 CD137의 조제)에 기재된 방법으로 조제된 비오틴화 hCD137-Fc(hCD137-Fc-Bio)가 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio가 이용되었다.
국제 공개 WO2015/083764호에 기재된 방법으로 구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석하는 것에 의해, 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용한 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 FG beads NeutrAvidin(다마가와세이키), 혹은 Dynabeads MyOne Streptavidin T1(Life Technologies)이 이용되었다.
Round1의 패닝에서는 키누레닌 존재하에서 항원에 대해서 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 조제한 파지 라이브러리액 0.8mL에 125pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 종농도 500μM의 키누레닌 및 4nmol의 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역(hFc)을 가하는 것에 의해, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비즈(FG beads NeutrAvidin)가 가해지고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비즈와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST로 2회, 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후, 1mg/mL의 트립신 용액 0.5mL가 당해 혼합액에 가해졌다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 회수된 파지가, 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행하는 것에 의해, 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225mm x 225mm의 플레이트에 파종되었다. 다음에, 파종된 대장균의 배양액에 대해서 M13KO7TC(WO2015046554A1)(헬퍼 파지)(Takara)를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수하는 것에 의해, 항체 1가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
Round2의 패닝에서는, 조제한 파지 라이브러리액 0.8mL에 40pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 종농도 500μM의 키누레닌 및 4nmol의 비오틴 비표지의 인간 IgG1 Fc 영역을 가하는 것에 의해, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비즈(Dynabeads MyOne Streptavidin T1)가 가해지고, 항원과 파지의 복합체를 자기 비즈와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST로 2회, 키누레닌/TBS로 1회 세정되었다. 그 후, 1mg/mL의 트립신 용액 0.5mL가 당해 혼합액에 가해졌다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 그 후, 상기 Round1과 마찬가지의 방법으로, 항체 1가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
Round3의 패닝에서는, 조제한 파지 라이브러리액 0.8mL에 10pmol의 비오틴 표지 항원과 함께 종농도 500μM의 키누레닌 및 4nmol의 비오틴 비표지의 인간 IgG1 Fc 영역을 가하는 것에 의해, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. BSA로 블로킹된 자기 비즈(FG beads NeutrAvidin)가 더해져 항원과 파지와의 복합체를 자기 비즈와 실온에서 15분간 결합시켰다. 비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST로 3회, 키누레닌/TBS로 2회 세정되었다. 그 후, 1mg/mL의 트립신 용액 0.5mL가 당해 혼합액에 가해졌다. 당해 혼합액은 실온에서 15분 현탁된 후, 즉석에서 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 그 후, 상기 Round1과 마찬가지의 방법으로, 항체 1가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
Round4의 패닝에서는, Round3의 패닝과 마찬가지의 조건에 의한 패닝이 실시되었다. 단, 자기 비즈는 Dynabeads MyOne Streptavidin T1이 이용되었다.
(8-3) SS 비오틴화 항원과 네거티브 셀렉션법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 인간 CD137에 결합하는 항체의 취득
(8-3-1) hCD137p12-FX-Fc의 조제
hCD137p12-FX-Fc는 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 구체적으로는, 인간 CD137 세포외 부분 영역을 코딩하는 유전자 단편의 하류에 Factor Xa 절단 서열을 코딩하는 유전자 단편과 항체의 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 부분 영역, FactorXa 절단 서열과 항체 정상 영역이 연결된 단백질(hCD137p12-FX-Fc, 서열 번호: 160)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터가 293 펙틴(Invitrogen)을 이용하여 FreeStyle293 세포(Invitrogen)에 도입되었다. 이 때 EBNA1(서열 번호: 88)을 발현하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터가 동시에 도입되었다. 전술한 수순에 따라 유전자가 도입된 세포가 37℃, 8% CO2에서 배양되어, hCD137p12-FX-Fc-Bio가 배양 상청 중에 분비되었다. 이 세포 배양 상청으로부터 프로틴 A를 이용하여 hCD137p12-FX-Fc-Bio가 정제되었다.
(8-3-2) SS 비오틴화 항원과 네거티브 셀렉션법을 이용한 항체 라이브러리로부터의 키누레닌 존재하에 있어서 인간 CD137에 결합하는 항체의 취득
저분자 존재하에서 항원 결합 활성을 나타내는 저분자 스위치 항체를 취득할 때에, 다이설파이드 결합(SS 결합) 갖는 링커를 개재시켜 비오틴화(SS 비오틴화)한 항원을 이용하여, 자성 비즈로 항원에 결합한 항체 디스플레이 파지를 키 포착한 후에, dithiothreitol(DTT) 등을 이용하여 환원 조건에서 SS 결합을 절단함으로써, 항원에 결합한 항체 디스플레이 파지만을 비즈로부터 용출할 수 있다고 생각되었다. 국제 공개 WO2015/083764호에 기재된 방법으로 구축된 키누레닌 라이브러리로부터, 키누레닌이 존재하는 조건하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체의 스크리닝이 행해졌다. 스크리닝을 위해서, 우선 항체 파지 디스플레이 라이브러리를, 키누레닌 비존재하에서 비오틴 표지 항원-자기 비즈와 접촉시켜, 키누레닌 비존재하에서도 항원에 대해서 결합 활성을 갖는 항체를 제시하고 있는 파지가 제거되었다. 그에 계속하여, 키누레닌이 존재하는 조건하에서와 마찬가지로 패닝을 실시하는 것에 의해, 키누레닌이 존재하는 조건하에서만 항원에 대해서 결합 활성을 갖는 항체의 스크리닝이 실시되었다. 본 취득 방법에서는, 항원으로서 실시예 1-4 기재의 방법으로 조제된 hCD137-Fc 또는 (8-3-1)에서 조제된 hCD137p12-FX-Fc를 EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 첨부의 프로토콜에 따라 비오틴 표지한 항원(SS 비오틴화 항원)이 이용되었다. 한편, 네거티브 셀렉션에는 실시예 1-3 방법으로 조제된 hCD137-Fc-Bio 또는 (8-2-1)에서 조제된 hCD137p12-FX-Fc-Bio가 이용되었다.
국제 공개 WO2015/083764호에 기재된 방법으로 구축된 파지 디스플레이 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10% PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을 TBS로 희석하는 것에 의해, 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. 다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용한 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서, Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated(Thermo Fisher Scientific), FG beads NeutrAvidin(다마가와세이키), 혹은 Dynabeads MyOne Streptavidin T1(Life Technologies)이 이용되었다.
Round1의 패닝에서는, 네거티브 셀렉션법을 이용한 키누레닌 존재하에서만 항원에 대해서 결합 가능한 파지의 농축이 행해졌다. 구체적으로는, 미리 Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated에 800pmol의 hCD137-Fc-Bio 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.8mL를 가하고 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 이용하여 비즈를 분리하는 것에 의해, 항원 및 비즈에 결합하지 않는 파지가 회수되었다.
다음에, Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 FG beads NeutrAvidin에 225pmol의 SS 비오틴화 hCD137-Fc 또는 450pmol의 SS 비오틴화 hCD137p12-FX-Fc-Bio를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, 회수된 파지와 함께 종농도 0.2mM의 키누레닌 및 4nmol의 hFc가 첨가되고, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST(0.2mM 키누레닌, 0.1% Tween20, TBS, pH 7.4)로 2회, 키누레닌/TBS(0.2mM 키누레닌, TBS, pH 7.4)로 1회 세정되었다. 그 후, 종농도 25mM의 DTT를 포함하는 TBS 용액 500μL가 첨가되고, 실온에서 5분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비즈로부터 파지가 회수되었다. 그 후 종농도 1mg/mL가 되도록 Trypsin이 당해 혼합액에 가해졌다. 당해 혼합액은 실온에서 15분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비즈로부터 파지가 회수되었다. 회수된 파지는, 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 완만하게 상기 대장균의 교반 배양을 행하는 것에 의해, 파지를 대장균에 감염시켰다. 감염시킨 대장균은 225mm x 225mm의 플레이트에 파종되었다. 다음에, 파종된 대장균의 배양액에 대해서, 하이퍼파지를 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지를 회수하는 것에 의해, 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
Round2의 패닝에서는, 미리 Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated에 400pmol의 hCD137-Fc-Bio 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, BSA로 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.4mL을 가하고 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 이용하여 비즈를 분리하는 것에 의해, 항원 및 비즈에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수한 파지는 재차 마찬가지의 조작으로 400pmol의 hCD137-Fc-Bio 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio와 인큐베이트된 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated와 인큐베이트된 후, 자기 스탠드를 이용하여 항원 및 비즈에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 FG beads NeutrAvidin에 56.3pmol의 SS 비오틴화 hCD137-Fc 또는 113pmol의 SS 비오틴화 hCD137p12-FX-Fc를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, 회수된 파지와 함께 종농도 0.2mM의 키누레닌 및 4nmol의 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역이 첨가되고, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다. 비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST(0.2mM 키누레닌, 0.1% Tween20, TBS, pH 7.4)로 3회, 키누레닌/TBS(0.2mM 키누레닌, TBS, pH 7.4)로 2회 세정되었다. 그 후, 종농도 25mM의 DTT를 포함하는 TBS 용액 500μL가 첨가되고, 실온에서 5분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비즈로부터 파지가 회수되었다. 그 후, 상기 Round1과 마찬가지의 방법으로, 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
Round3의 패닝에서는, 미리 Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated에 200pmol의 hCD137-Fc-Bio 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, BSA에서 블로킹이 행해진 파지 라이브러리액 0.2mL을 가하고 실온에서 1시간 결합시켰다. 자기 스탠드를 이용하여 비즈를 분리하는 것에 의해, 항원 및 비즈에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. 회수한 파지는 재차 마찬가지의 조작으로 200pmol의 hCD137-Fc-Bio 또는 hCD137p12-FX-Fc-Bio와 인큐베이트된 Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated와 인큐베이트된 후, 자기 스탠드를 이용하여 항원 및 비즈에 결합하지 않는 파지가 회수되었다. Streptavidin(Roche)과 인큐베이트된 스킴 밀크로 블로킹된 FG beads NeutrAvidin에 12.5pmol의 SS 비오틴화 hCD137-Fc 또는 25pmol의 SS 비오틴화 hCD137p12-FX-Fc를 가하고 실온에서 15분간 결합시켰다. TBST로 3회 세정된 비즈에 대해서, 회수된 파지와 함께 종농도 0.2mM의 키누레닌 및 4nmol의 비오틴화되어 있지 않은 인간 IgG1 Fc 영역이 첨가되고, 파지 라이브러리를 실온에서 1시간 항원 및 키누레닌과 접촉시켰다.
비즈는 0.5mL의 키누레닌/TBST(0.2mM 키누레닌, 0.1% Tween20, TBS, pH 7.4)로 5회, 키누레닌/TBS(0.2mM 키누레닌, TBS, pH 7.4)로 5회 세정되었다. 그 후, 종농도 25mM의 DTT를 포함하는 TBS 용액 500μL가 첨가되고, 실온에서 5분간 교반된 후, 자기 스탠드를 사용하여 분리된 비즈로부터 파지가 회수되었다. 그 후, 상기 Round1과 마찬가지의 방법으로, 항체 다가 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다. Round4의 패닝에서는, Round3의 패닝과 마찬가지의 조건에 의한 패닝이 실시되었다. 단, 자기 비즈는 FG beads NeutrAvidin 대신에 Dynabeads MyOne Streptavidin T1이 이용되었다.
Round5의 패닝에서는, Round3의 패닝과 마찬가지의 조건에 의한 패닝이 실시되었다.
(8-4) 파지 디스플레이법으로 동정된 키누레닌 의존성 항CD137 항체의 평가
(8-4-1) 키누레닌의 존재/비존재에 의해 항원에 대한 결합이 변화하는 스위치 항체의 발현과 정제
본 명세서에 기재된 키누레닌 라이브러리로부터 취득된 항체의 가변 영역을 코딩하는 유전자는 인간 IgG1 또는 개변 인간 IgG1(P253), Kappa쇄를 갖는 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 표 55에 클론명과 서열 번호가 기록되었다.
평가 클론
Figure pct00055
당업자 공지의 방법을 이용하여 항체가 발현되고, 정제되었다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 항체 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항체의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(8-4-2) 표면 플라즈몬 공명에 의한 인간 CD137에 대한 결합의 키누레닌의 영향의 평가
Biacore T200(GE Healthcare)을 이용하여, 항CD137 항체와 hCD137-His-BAP(서열 번호: 87)의 항원 항체 반응의 상호작용이 해석되었다. 아민 커플링법으로 Sure protein A가 적당량 고정화된 Sensor chip CM3(GE Healthcare)에 항CD137 항체를 포착시키고, 실시예 1-1에서 조제된 hCD137-His-BAP를 상호작용시켰다. 러닝 버퍼로는 TBS가 이용되고, 재생 용액으로서는 10mM Glycine-HCl(pH 1.5)과 25mM NaOH가 이용되었다.
TBS에 현탁된 항CD137 항체가 포착된 후에, 500nM의 hCD137-His-BAP가 각 flow cell에 유속 10μL/min으로 3분간 인젝트되었다. 이 3분간이 hCD137-His-BAP의 결합상으로 여겨지고, 결합상 종료 후, 러닝 버퍼로 전환된 5분간이 hCD137-His-BAP의 해리상으로 여겨졌다. 해리상 종료 후, 재생 용액이 유속 30μl/min으로 10초간 인젝트되었다. 이상이 항CD137 항체의 결합 활성 측정 사이클로 여겨졌다. Biacore T200 Evaluation Software Version:2.0으로 해석된, 결합상에서 항CD137 항체에 상호작용한 hCD137-His-BAP의 결합량이 표 56에 나타났다.
키누레닌 존재하에서의 항원 결합량을 나타내는 표이다.
Figure pct00056
(8-4-3) 취득된 항체의 CD137 부분 서열에 대한 결합 활성 평가
(8-4-3-1) CD137의 부분 서열을 갖는 항원의 조제
CD137의 부분 서열을 갖는 항원은 당업자 공지의 방법으로 조제했다. 구체적으로는, 인간 CD137의 세포외 영역의 일부를 코딩하는 유전자 단편의 하류에 항체 정상 영역을 코딩하는 유전자 단편이 연결되었다. 인간 CD137의 세포외 영역 부분 서열과 항체 정상 영역이 연결된 단백질(표 57)을 코딩하는 유전자 단편이 동물세포 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 구축된 플라스미드 벡터는 ExpiFectamine293(Invitrogen)을 이용하여 Expi293 세포(Invitrogen)에 도입되어, 목적하는 단백질을 배양 상청 중에 분비시켰다. 배양액 상청으로부터 프로틴 A를 이용하여, 목적 단백질이 정제되었다.
CD137의 부분 서열을 갖는 항원
Figure pct00057
(8-4-3-2) 결합의 확인
취득된 항체가 CD137의 부분 서열을 갖는 항원에 결합하는지 여부가 ELISA로 평가되었다. 처음에, 실시예 1 또는 실시예 8-4-3-1에서 조제된 각종 항원이 Maxisorp 384 마이크로타이터 플레이트에 고상되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 Wash buffer로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하고 있지 않는 항원이 제거된 후, 당해 웰이 Blocking Buffer(BlockAce를 포함하는 TBS) 50μL로 1시간 이상 블로킹되었다. Blocking Buffer가 제거된 각 웰에, 종농도 500μM L-키누레닌을 포함하는 TBS 또는 종농도 500μM 키누레닌을 포함하는 TBS로 10μg/mL로 조제된 정제 항체가 각 웰 10μL 첨가되고, 1시간 정치되었다. 종농도 500μM 키누레닌을 포함하는 Wash Buffer(0.1% Tween20을 포함하는 TBS)로 세정된 후에, 종농도 500μM 키누레닌을 포함하는 TBS에 의해 희석된 AP 결합 항인간 Kappa 항체(BIOSOURCE)가 각 웰에 첨가되었다. 1시간 인큐베이트된 후 종농도 500μM 키누레닌을 포함하는 Wash Buffer로 세정 후, BluePhos phosphate substrate(KPL)가 첨가되었다. 각 웰 중의 용액의 발색 반응이, BluePhos Stop Solution의 첨가에 의해 정지된 후, 620nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 항체 농도가 0μg/mL의 웰의 값을 1로 했을 때의 흡광도의 비를 나타냈다. 비가 2 이상인 경우에 결합하고 있다고 판정하면, 평가한 클론 중에 상이한 결합 특성을 나타내는 항체가 포함됨이 나타났다.
Figure pct00058
(8-5) 취득된 항체의 In vitro 활성 평가
In vitro 항체 활성 측정에는 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega)이 이용되었다. 384 웰 플레이트의 각 웰에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)로 2×106/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells가 10μL씩 가해졌다. 키누레닌을 포함하는 항체 용액 또는 키누레닌을 포함하지 않는 항체 용액이 각각의 웰에 10μL 가해졌다. 다음에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 10μL 가해졌다. 키누레닌은 최종 농도 500μM이다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 30μL씩 가해졌다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Luminescence fold로 하여, 각 항체의 활성을 평가하는 지표로 했다.
얻어진 결과를 도 57에 나타낸다.
L-키누레닌의 농도가 500μM일 때에 Luminescence fold가 0μM일 때보다 높으므로, 키누레닌의 농도 혹은 존재에 의해 아고니스트 활성이 변화했음이 나타났다.
실시예 9: Double round selection법에 따르는 ATP 및 AMP 의존성 CD137 결합 항체의 취득
(9-1) Double round selection법을 이용한 래셔널 디자인 라이브러리로부터의 ATP 및 AMP 존재하에 있어서 각각 항원에 결합하는 항체의 취득
지금까지 특정의 저분자 존재하에 있어서 항원에 대해서 결합 활성을 나타내는 항체가 취득되고 있지만, 복수의 상이한 저분자에 대해, 각각의 존재하에 있어서 항원에 대해서 결합 활성을 나타내는 항체의 취득에 대해서는 보고되었던 적이 없다. 이 과제를 해결하기 위한 방법의 하나로서, 패닝 라운드마다 사용되는 저분자, 예를 들어 ATP와 AMP를 바꾸는 교호 패닝이 생각되지만, 이 경우, 각 라운드마다 각각의 저분자에 대한 선택압이 걸리기 때문에, 동시에 양방의 저분자에 대한 선택압을 동일하게 걸 수가 없다고 하는 과제가 존재한다. 이 과제를 해결하기 위해서, Double round selection법을 실시했다. Double round selection법이란, 패닝 1라운드 내에서 하나의 항원에 대해서 2회 패닝이 반복되는 수법이다(J Mol Biol. 1992 Aug 5;226(3):889-96.). 여기에서 1라운드란, 예를 들어 파지 디스플레이법의 경우, 대장균으로부터 파지를 회수하고 나서, 패닝 후의 파지를 재차 대장균에 감염시킬 때까지의 스텝을 가리키고, 예를 들어 리보솜 디스플레이법의 경우는 in vitro 전사로부터 PCR에 의한 유전자 증폭까지의 스텝을 가리킨다. 지금까지, 1종류의 항원에 대한 double round selection은 보고되어 있었지만 저분자 의존성 항체의 취득에 응용된 보고는 없고, 당연히 복수의 상이한 저분자에 의존성을 나타내는 항체의 취득에 응용된 보고도 없다. 그러나 우리는, double round selection법을 개변하여, 1라운드에 있어서 ATP와 AMP의 쌍방에 대한 선택압을 거는 것에 의해, 보다 효율적으로 ATP 및 AMP에 의존적으로 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 취득할 수 있다고 생각했다.
선행 특허 WO2015/083764에 있어서 구축된 래셔널 디자인 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, ATP 및 AMP 존재하에서 항원에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 취득되었다. 패닝 조건을 표 59에 나타낸다. 조건 1 및 2는 종래대로의 패닝 조건 및 상기 교호 패닝 조건이 적용되고, 한편 조건 3에서는 상기 double round selection법이 적용되었다. 여기에서, double round selection은 라운드 2및 라운드 3에서 실시되었다. 항원으로서는 비오틴화 hCD137-Fc가 사용되었다.
표 59에 있어서, ATP란 ATP를 사용한 패닝, AMP란 AMP를 사용한 패닝, Double이란 double round selection을 사용한 패닝이 각각 실시되었음을 나타내고 있다.
Figure pct00059
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지하는 대장균으로부터 파지가 일반적인 방법으로 산생되었다. 구체적으로는, 구축된 파지미드 벡터를 보지하는 대장균에 대해서, M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 파지 산생이 행해진 대장균의 배양액에 2.5M NaCl/10%PEG를 첨가하는 것에 의해 침전시킨 파지의 집단을, TBS로 희석하는 것에 의해 항체 제시 파지 라이브러리액이 조제되었다.
다음에, 당해 파지 라이브러리액에 종농도 4%가 되도록 BSA가 첨가되었다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용하여 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 NeutrAvidin beads(TAMAGAWA SEIKI) 혹은 Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)이 이용되었다.
조제된 파지 라이브러리액에 비오틴화 hCD137-Fc와 종농도 1mM의 ATP가 가해지고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 블로킹된 자기 비즈를 파지와 항원의 반응액에 가하고 실온에서 15분 반응시켰다. 비즈는 1mM ATP를 포함하는 TBS/0.1% Tween20 buffer로 2회 혹은 3회, 및 1mM ATP를 포함하는 TBS로 1회 혹은 2회 세정되었다. 그 후 TBS가 가해진 비즈가 실온에서 현탁되고, 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 이 작업이 2회 반복된 후, 용출된 파지 용액이 혼합되었다. 회수된 파지 용액에 최종 농도 1mg/mL의 트립신이 가해졌다. 회수된 파지가, 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 상기 대장균의 교반 배양을 행하는 것에 의해, 파지를 대장균에 감염시켰다. 대장균은 225mm x 225mm의 플레이트에 파종되었다. 회수된 대장균에 대해서 M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지라고 호칭된다)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 조건 1에 있어서는 이 작업이 3회 반복되었다. 조건 2에 있어서는, 상기 작업을 1번 행해진 후, ATP를 AMP로 바꾸어 상기 작업이 재차 실시되고(라운드 2), 그 후 추가로 상기 작업이 ATP로 다시 한 번 행해졌다(라운드 3).
한편 조건 3에 있어서는, 상기 작업이 1번 행해진 후 라운드 2 및 라운드 3에 있어서는 double round selection이 실시되었다. 구체적으로는, 우선 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴화 hCD137-Fc와 종농도 1mM의 AMP를 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 블로킹된 자기 비즈를 파지와 항원의 반응액에 가하고 실온에서 15분 반응시켰다. 비즈는 1mM AMP를 포함하는 TBS/0.1% Tween20 buffer로 2회 혹은 3회, 및 1mM AMP를 포함하는 TBS로 1회 혹은 2회 세정되었다. 그 후 TBS가 가해진 비즈가 실온에서 현탁되고, 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 이 작업이 2회 반복된 후, 용출된 파지 용액이 혼합되었다. 추가로 그 후, 회수된 파지 라이브러리액에 비오틴화 hCD137-Fc와 종농도 1mM의 ATP를 가하고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 블로킹된 자기 비즈를 파지와 항원의 반응액에 가하고 실온에서 15분 반응시켰다. 비즈는 1mM ATP를 포함하는 TBS/0.1% Tween20 buffer로 2회 혹은 3회, 및 1mM ATP를 포함하는 TBS로 1회 혹은 2회 세정되었다. 그 후 TBS가 가해진 비즈가 실온에서 현탁되고, 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. 이 작업이 2회 반복된 후, 용출된 파지 용액이 혼합되었다. 회수된 파지 용액에 최종 농도 1mg/mL의 트립신이 가해졌다. 회수된 파지가, 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 20mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 상기 대장균의 교반 배양을 실시하는 것에 의해, 파지를 대장균에 감염시켰다. 대장균은 225mm x 225mm의 플레이트에 파종되었다. 회수된 대장균에 대해서 M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지라고 호칭된다)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다.
(9-2) 파지 ELISA에 의한 ATP 혹은 AMP의 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성 평가
상기의 방법에 의해 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 상법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라서, 파지 함유 배양 상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)을 이용하여, 회수된 배양 상청이 한외 여과되었다. 배양 상청 각 100μL가 각 웰에 어플라이된 NucleoFast 96을 원심분리(4,500g, 45분간)하는 것에 의해 플로 스루가 제거되었다. 100μl의 H2O가 각 웰에 가해진 당해 NucleoFast 96이, 재차 원심분리(4,500g, 30분간)에 의해 세정되었다. 마지막에 TBS 100μL가 가해지고, 실온에서 5분간 정치된 당해 NucleoFast 96의 각 웰 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS, 1mM AMP/TBS 또는 1mM ATP/TBS가 가해진 정제 파지가 이하의 수순으로 ELISA에 제공되었다. 384 Well Microplates Streptavidin-coated(greiner, 781990)가 실시예 1에서 제작된 비오틴화 hCD137-Fc를 포함하는 100μL의 TBS로 하룻밤 코팅되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하고 있지 않는 항원이 제거된 후, 당해 웰이 250μL의 0.4% block ace, 1% BSA, 0.02% Tween, 0.05% ProClin 300-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 그 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 가해진 당해 플레이트를 37℃에서 1시간 정치하는 것에 의해, 항체를 제시한 파지를 각 웰에 존재하는 항원에 ATP 혹은 AMP의 비존재하 및 존재하에 있어서 결합시켰다. TBST, 1mM ATP/TBST 또는 1mM AMP/TBST로 세정된 각 웰에, TBS, 1mM AMP/TBS 또는 1mM ATP/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가되고, 1시간 인큐베이트시켰다. TBST, 1mM ATP/TBST 또는 1mM AMP/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색 반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다.
파지 ELISA의 결과를 표 60에 나타냈다.
여기에서, ATP 존재하에 있어서의 흡광도의 S/N비(항원 존재하에서의 흡광도와 항원 비존재하에서의 흡광도의 비)가 2보다 높은 클론이 결합 양성으로 판정되고, ATP 또는 AMP 존재하의/비존재하에 있어서의 흡광도의 비가 3 이상인 것이 ATP 또는 AMP에 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로 판정되었다. 그 결과, hCD137-Fc에 대해서, 조건 1로부터 얻어진 클론의 대부분은 ATP 존재하에서는 결합을 나타내도 AMP 존재하에서는 결합을 나타낼 수 없었다. 조건 2로부터 얻어진 ATP 존재하에서 결합을 나타내고 비존재하에서는 결합을 나타내지 않는 클론 중에는, AMP 존재하에서도 결합을 나타내는 항체가 복수 인정되었지만, 그 비율은 50% 이하였다. 한편 double round selection이 실시된 조건 3에서는, ATP 존재하에서 결합을 나타내고 비존재하에서는 결합을 나타내지 않는 클론의 65% 이상이, AMP 존재하에서도 결합을 나타낼 수 있었다.
또한, 얻어진 클론에 대해, 특이적인 프라이머 pBAD-F, G1seq-R을 이용하여 증폭된 항체 중쇄 유전자의 염기 서열이 해석되었다.
그 결과, Double round selection이 실시된 조건 3에 있어서는, ATP만으로 실시된 조건 1의 3배, ATP와 AMP가 교대로 사용되어 실시된 조건 2와 비교해도 약 1.5배나 많은, ATP와 AMP의 쌍방에 의존적인 human CD137 결합을 나타내는 항체 중쇄 서열이 얻어지고 있었다. 이로부터, 복수의 상이한 저분자에 의존적인 항원 결합 활성을 나타내는 항체를 취득할 때에, double round selection이 보다 유용한 수법임이 나타났다.
Figure pct00060
실시예 10: 나이브 라이브러리로부터의 ATP 의존성 항마우스 CTLA4 결합 항체의 취득
(10-1) 비즈 패닝에 의한 나이브 인간 항체 라이브러리로부터의 저분자 존재하에 있어서 마우스 CTLA4에 결합하는 항체의 취득
인간 PBMC로부터 작성한 폴리 A RNA나, 시판되고 있는 인간 폴리 A RNA 등을 주형으로 하여 당업자에게 공지된 방법에 따라, 서로 상이한 인간 항체 서열의 Fab 도메인을 제시하는 복수의 파지로 이루어지는 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리가 구축되었다.
구축된 나이브 인간 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터, 저분자 존재하에서 마우스 CTLA4 세포외 영역(mCTLA4)에 대한 결합 활성을 나타내는 항체가 스크리닝되었다. 즉, 비즈에 포착된 mCTLA4에 대해서 저분자 존재하에서 결합 활성을 나타내는 항체를 제시하고 있는 파지가 모아졌다. 저분자 비존재의 조건에서 비즈로부터 용출된 파지 용출액으로부터 파지가 회수되었다. 본 취득 방법에서는, 항원으로서 비오틴화된 mCTLA4(mCTLA4-His-Biotin)가 이용되었다. mCTLA4-His-Biotin은, mCTLA4의 세포외 영역에 His 태그가 융합된 mCTLA4-His(Sino Biologics Inc. 50503-M08H, Accession No. NP_033973.2)가, 아민 커플링법에 의해 비오틴화된(PIERCE Cat. No. 21329) 것이다.
구축된 파지 디스플레이용 파지미드를 보지한 대장균으로부터 산생된 파지는 일반적인 방법에 의해 정제되었다. 그 후 TBS로 투석 처리된 파지 라이브러리액이 얻어졌다. 자기 비즈에 고정화된 항원을 이용한 패닝이 실시되었다. 자기 비즈로서 NeutrAvidin coated beads(Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin-coated) 혹은 Streptavidin coated beads(Dynabeads M-280 Streptavidin)가 이용되었다.
암조직에 있어서 스위치의 역할을 할 수 있는 저분자에 의존적인 저분자 스위치 항체를 효율적으로 취득하기 위해서, 아데노신 3인산(adenosine 5'-triphosphate; ATP) 및 ATP 대사물 존재하에서 항원에 결합하고, ATP 비존재하에서는 항원에 결합하지 않는 항체를 농축하는 패닝이 선행 특허 WO2013/180200에서 나타난 방법으로 실시되었다.
구체적으로는, 조제된 파지 라이브러리액에 비오틴화 mCTLA4와 종농도 1mM의 ATP 및 ATP 대사물이 가해지고, 실온에서 60분간 반응시켰다. 블로킹된 자기 비즈를 파지와 항원의 반응액에 가하고 실온에서 15분 반응시켰다. 비즈는 1mM ATP를 포함하는 TBS/0.1% Tween20 buffer로 2회 혹은 3회, 및 1mM ATP를 포함하는 TBS로 1회 혹은 2회 세정되었다. 그 후, Round1에 있어서는 최종 농도 1mg/mL의 트립신이, Round2 이후에 있어서는 TBS가 가해진 비즈가 실온에서 현탁되고, 자기 스탠드를 이용하여 분리된 비즈로부터 파지 용액이 회수되었다. TBS가 사용되었을 경우는 이 작업이 2회 반복된 후, 용출된 파지 용액이 혼합되고, 회수된 파지 용액에 최종 농도 1mg/mL의 트립신이 가해졌다. 회수된 파지가, 대수 증식기(OD600이 0.4-0.7)가 된 10mL의 대장균주 ER2738에 첨가되었다. 37℃에서 1시간 상기 대장균의 교반 배양을 실시하는 것에 의해, 파지를 대장균에 감염시켰다. 대장균은 225mm x 225mm의 플레이트에 파종되었다. 회수된 대장균에 대해서 M13KO7TC(WO2015046554A1) 혹은 M13KO7ΔpIII(하이퍼파지라고 호칭된다)(PROGEN Biotechnik)을 감염시키고, 30℃에서 하룻밤 배양한 상청으로부터 파지가 회수되었다. 배양 시에는, lac promoter로부터의 Fab 유전자의 발현 유도를 걸기 위해서, 100μM IPTG를 첨가한 조건, 및 첨가하고 있지 않는 조건이 이용되었다. 이 작업이 4회 반복되었다.
(10-2) 파지 ELISA에 의한 저분자 존재하 및 비존재하에 있어서의 결합 활성의 평가
실시예 10-1에서 얻어진 대장균의 싱글 콜로니로부터, 상법(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)에 따라서, 파지 함유 배양 상청이 회수되었다. NucleoFast 96(MACHERY-NAGEL)을 이용하여 회수된 배양 상청이 한외 여과되었다. 배양 상청 각 100μL가 NucleoFast 96의 각 웰에 어플라이되고, 4,500g, 45분간 원심분리를 행하여 플로 스루가 제거되었다. H2O 100μL을 가하고, 재차 4,500g, 30분간 원심분리에 의한 세정이 행해졌다. 그 후, TBS 100μL를 가하고 실온에서 5분간 정치한 후, 상청에 포함되는 파지액이 회수되었다.
TBS가 가해진 정제 파지가 이하의 수순으로 ELISA에 제공되었다. StreptaWell 96 마이크로타이터 플레이트(Roche)가 mCTLA4-His-Biotin를 포함하는 100μL의 TBS에서 하룻밤 코팅되었다. 당해 플레이트의 각 웰을 TBST로 세정하는 것에 의해 플레이트에 결합하고 있지 않는 mCTLA4-His-Biotin가 제거된 후, 당해 웰이 250μL의2% 스킴 밀크-TBS로 1시간 이상 블로킹되었다. 2% 스킴 밀크-TBS를 제거하고, 그 후, 각 웰에 조제된 정제 파지가 가해진 당해 플레이트를 실온에서 1시간 정치하는 것에 의해, 항체를 제시하는 파지를 각 웰에 존재하는 mCTLA4-His-Biotin에 ATP 비존재 혹은 존재하에 있어서 결합시켰다. TBST 혹은 ATP/TBST로 세정된 각 웰에, TBS 혹은 ATP/TBS에 의해 희석된 HRP 결합 항M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)가 첨가된 플레이트를 1시간 인큐베이트시켰다. TBST 혹은 ATP/TBST로 세정 후, TMB single 용액(ZYMED)이 첨가된 각 웰 중의 용액의 발색 반응이 황산의 첨가에 의해 정지된 후, 450nm의 흡광도에 의해 당해 발색이 측정되었다. 그 결과, mCTLA4에 대해서, ATP 존재하에서만 결합하는 항체가 복수 확인되었다.
파지 ELISA의 결과를 표 61에 나타냈다.
여기에서, ATP 존재하에 있어서의 흡광도가 0.2보다 높은 클론이 양성으로 판정되고, ATP 존재하/비존재하에 있어서의 흡광도의 비가 2보다 높은 것이 ATP 의존적인 항원 결합 활성을 갖는 클론(스위치 클론)으로 판정되었다.
Figure pct00061
전술한 발명은, 명확한 이해를 돕는 목적 아래, 실례 및 예시를 이용하여 상세하게 기재했지만, 본 명세서에 있어서의 기재 및 예시는, 본 발명의 범위를 한정하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 인용한 모든 특허문헌 및 과학 문헌의 개시는, 그 전체에 걸쳐서, 참조에 의해 명시적으로 본 명세서에 원용할 수 있다.
실시예 11: 개변된 항인간 CD137 항체의, 4-1BB Jurkat 리포터 진 어세이를 이용한 in vitro에 있어서의 ATP 및 ADP 의존적인 CD137 아고니스트 활성의 평가
실시예 7-2(표 52)에 있어서 제작된 개변체의 In vitro 활성 측정에는, GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega, CS196004)이 이용되었다. 384 웰 플레이트의 각 웰에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)로 4×105/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells (Promega)가 10μL씩 가해진다. 계속하여, ADP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP를 포함하는 항체 용액 또는 ATP 혹은 ADP를 포함하지 않는 항체 용액이 각각의 웰에 10μL 가해진다. 다음에, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 10μL 가해진다. ADP는 최종 농도 10μM, ATP는 최종 농도 10μM이다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 30μL씩 가해진다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 상대 발광량(Fold induction)으로 하여, 각 항체의 CD137 아고니스트 활성을 평가하는 지표로 했다.
결과를 도 58에 나타낸다. 도 58로부터 A375-P587/B167-LamLib, A551-P587/B256-LamLib, A551-P587/B379-LamLib, A375-SCF041aPh/B167-LamLib, A551-SCF041aPh/B256-LamLib, A551-SCF041aPh/B379-LamLib, A375-SCF043aPh/B167-LamLib, A551-SCF043aPh/B256-LamLib, A551-SCF043aPh/B379-LamLib, A375-SCF057aPh/B167-LamLib, A551-SCF057aPh/B256-LamLib, A551-SCF057aPh/B379-LamLib는 ATP 및 ADP 의존적으로 인간 CD137 아고니스트 활성을 나타냄이 확인되었다.
〔실시예 12〕 종양부에 있어서의 세포외 ATP 레벨의 측정
ATP 스위치형 항체는 ATP 존재하에 있어서 표적 분자에 결합하여 약효를 나타낸다. 종양 조직 부위에 있어서의 세포외 ATP 레벨의 평가를 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 이용하여 행했다. 본 세포는, ProbeX사에서 동사 보유의 스플릿 루시페라제 기술을 이용하여 제작되고, ATP를 리간드로 하는 퓨린 리셉터 P2Y11(Accession No. AF030335)을 결합한 루시페라제의 C말단 단백과 β-arrestin-2 isoform 1(Accession No. NM_004313)을 결합한 루시페라제 N말단 단백을 발현하고 있고, ATP 자극에 의해 세포 내에서 2개로 나누어져 있던 루시페라제 단편이 회합함으로써 활성을 가지는 루시페라제가 생성되어, 루시페린을 기질로 한 발광을 얻을 수 있다.
(12-1) P2Y11 split Luc/HEK293 세포의 ATP 응답성
P2Y11 split Luc/HEK293 세포는, 10% 소 태아 혈청, 0.8mg/mL G418(GeneticinTM), 및 0.05mg/mL 플레오마이신 D1(ZeocinTM)를 포함하는 덜베코 개변 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose : D5796 / Sigma-Aldrich)에서 배양, 계대 유지했다. P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 96 well microplate(μCLEAR(등록상표), WHITE, CELLSTAR(등록상표) / Greiner Bio-One)에 30000cells/well로 뿌려 하룻밤 배양한 후, 각 웰로부터 배양액을 제거하고, 루시페린(VivoGloTM Luciferin, In Vivo Grade / Promega)을 0.5mg/mL로 포함하는 배양액 0.18mL와 교환했다. 최종 농도가 0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0mM이 되도록 아데노신, AMP, ADP, 혹은, ATP의 각 용액 0.02mL를 가하고, CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 30분간 배양한 후, 플레이트 리더 EnVision(Perkin Elmer)으로 발광치의 측정이 행해졌다.
도 59는 그 결과를 나타낸다. P2Y11 split Luc/HEK293 세포는, ATP 특이적으로 리간드 농도 의존성에 발광치를 증가시켰다.
(12-2) 종양 조직 부위에 있어서의 세포외 ATP 농도의 평가
P2Y11 split Luc/HEK293 세포는 Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS(Thermo Fisher Scientific)로 배양 플라스크로부터 벗기고, HBSS로 세정 후, HBSS의 세포 현탁액으로 하여, in vivo 세포외 ATP 레벨 측정에 이용했다.
(12-2-1) in vivo ATP 검량선의 제작
기정 농도의 ATP, 1mg/mL 루시페린(VivoGlo, Promega), 및 1.0×107cells/mL의 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 포함하는 세포 현탁액의 0.2mL를 C3H/HeN 마우스의 복측부 피하에 이식하고, 20분 후 아이소플루레인 마취하 in vivo 이미징 장치 IVIS spectrum CT에서 발광 이미징 측정을 행했다. 취득한 이미징 화상을 Living Image Software로 해석하여, 산출된 발광치와 첨가한 ATP 농도로부터 in vivo 측정 조건에서의 ATP 검량선을 제작했다.
도 60은 그 결과를 나타낸다. P2Y11 split Luc/HEK293 세포는, C3H/HeN 마우스 피하에 이식한 in vivo 조건에서도 ATP 농도에 의존한 발광을 나타내어, in vivo로 ATP 레벨 평가를 할 수 있는 검량선으로 할 수 있었다.
(12-2-2) 종양 조직 부위에 있어서의 세포외 ATP 레벨의 평가
1mg/mL 루시페린(VivoGlo, Promega)과 1.0×107cells/mL의 P2Y11 split Luc/HEK293 세포를 포함하는 세포 현탁액의 0.2mL를 FM3A 담암 마우스의 종양부 피하에 이식하고(종양 체적이 200∼300mm3), 20분 후 아이소플루레인 마취하 in vivo 이미징 장치 IVIS spectrum CT로 발광 이미징 측정을 행했다. 취득한 이미징 화상을 Living Image Software로 해석하여, 종양부의 발광치로부터 ATP 레벨을 in vivo ATP 검량선을 이용하여 산출하여, 종양 부위에 있어서의 세포외 ATP 레벨로 했다.
발광 이미징 측정의 결과를 도 61에, ATP의 검량선으로부터 산출된, 종양 부위에 있어서의 세포외 ATP 레벨을 표 62에 나타낸다. 백그라운드(정상 부위)에 비해, 종양 조직 부위(FM3A tumor bearing mouse)에 있어서의 발광 레벨은 높고, FM3A 이식 모델에서의 종양 조직 부위의 세포외 ATP 레벨은 제작한 in vivo ATP 검량선으로부터 평균으로 1.31mM로 산출되었다.
Figure pct00062
〔실시예 13〕ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체에 의한 ATP 의존적항종양 활성
(13-1) ATP 의존적인 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체의 제작
WO2015/083764 및 WO2013/180200에 기재된 방법을 참고로, 취득된 항체를 최적화하여, ATP 의존적인 결합 특성을 갖는 항인간 인터류킨 6 수용체(hIL6R) 항체를 제작했다. 표 63에 나타난 바와 같이 중쇄와 경쇄가 조합되어, 당업자 공지의 방법으로 항hIL6R 항체가 발현 및 정제되었다.
항체의 중쇄와 경쇄의 조합
Figure pct00063
항원으로서 hIL6R(서열 번호: 200)이 유전자 합성되어, 동물 발현용 플라스미드에 삽입된 후, CHO 세포에 도입되어 항상적으로 항원을 발현하는, 안정 발현주(hIL6R-CHO)가 클론화되었다. 항원 단백질은 이하의 방법을 이용하여 발현, 정제되었다. hIL6R-CHO주는 적절한 세포 밀도로 현탁되고, 플라스크에 파종 및 배양되고, 그 배양 상청으로부터, 당업자 공지의 방법으로 항원이 정제되었다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 항원 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항원의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(13-2) 항hIL6R 항체에 대한 ATP 농도 의존적인 KD치 산출
표 63에 기재된 항체를 이용하여, Biacore T200을 이용하여 0, 1, 10, 100μM의 각 ATP 농도 존재하에서의 hIL6R에 대한 affinity 해석을 행했다. 측정은 유속 10μL/min, 상호작용 시간 1분, 해리 시간 1분, single cycle kinetics로 37℃에서 행하고, 버퍼는 상이한 농도(0, 1, 10, 100μM)의 ATP를 각각 포함하는 20mM ACES, 150mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.05% Tween20, pH 7.4를 이용했다. 해석에는 Biacore T200 부속의 Biacore Evaluation Software를 이용하고, fitting model에는1:1 Langmuir binding model를 이용했다. 그 해석 결과를 표 64, 도 62에 나타낸다.
항hIL6R 항체에 대한 ATP 농도 의존적인 KD치(M) 산출
Figure pct00064
*Biacore의 해석상에서 Kinetic constants cannot be uniquely determined.로 코멘트가 나온 것은 Rejected로 하고, 그 결과는 N.A.로 했다.
이 결과로부터 MRAH-G4T1/MRAL-k0의 hIL6R에 대한 KD는 어세이 중에 있어서의 ATP 농도의 영향을 받지 않지만, H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, H0052-G4T1/L1083-lam1의 hIL6R에 대한 KD는 어세이 중에 있어서의 ATP 농도가 높으면 높을수록 작아짐이, 즉 결합 활성이 ATP 농도가 높을수록 강해짐이 나타났다. 이 결과로부터, H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, H0052-G4T1/L1083-lam1은 ATP 의존적인 hIL6R에 대한 결합 활성을 가짐이 확인되었다.
이후에서는, MRAH-G4T1/MRAL-k0과 같이 그 항원에 대한 결합 활성이 ATP 농도에 의존하지 않는 항체를 non-switch 항체라고 표기하고, H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, H0052-G4T1/L1083-lam1과 같이 그 항원에 대한 결합 활성이 ATP 농도에 의존하는 항체를 switch 항체라고 표기하는 경우가 있다.
(13-3) 항hIL6R 항체에 대한 ADP, AMP 농도 의존적인 KD치 산출
다음에 표 63에 기재된 항체를 이용하여, Biacore T200을 이용하여 전술한 조건에 따라 ATP 대신에 10, 100μM의 각 ADP, AMP 농도 존재하에서의 hIL6R에 대한 affinity 해석을 행했다. ADP를 이용한 측정의 해석 결과를 표 65, 도 63에, AMP를 이용한 측정의 해석 결과를 표 66, 도 64에 나타냈다. 한편, 측정 시에 10RU 이하의 반응 밖에 없는 항체에 대해서는 해석 불능이라고 판단하고, N.D.로 표기했다.
항hIL6R 항체에 대한 ADP 농도 의존적인 KD치(M) 산출
Figure pct00065
항hIL6R 항체에 대한 AMP 농도 의존적인 KD치(M) 산출
Figure pct00066
이 결과로부터 MRAH-G4T1/MRAL-k0의 hIL6R에 대한 KD는 어세이 중에 있어서의 ADP 및 AMP 농도의 영향을 받지 않지만, ATP와 마찬가지로 어세이 중에 있어서의 ADP 또는 AMP 농도가 높아짐에 수반하여, H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, H0052-G4T1/L1083-lam1의 hIL6R에 대한 KD는 작아짐이, 즉 결합 활성이 강해짐이 나타났다. 이 결과로부터, H0002-G4T1/L1058-lam1, H0041-G4T1/L1088-lam1, H0052-G4T1/L1083-lam1은 ADP 또는 AMP 의존적인 hIL6R에 대한 결합 활성을 가짐이 확인되었다.
(13-4) 항hIL6R 항체의 ATP 농도에 의존한 ADCC 활성의 평가
다음에, 이들의 항체의 중쇄 정상 영역을, mIgG2a에 FcγRIV에 대한 결합을 증강하는 개변을 가하여 ADCC 활성을 증강한 mFa55(서열 번호: 184)로 변경하고, 경쇄 정상 영역을 인간으로부터 마우스로 변경한 항체가 표 67과 같이 당업자 공지의 방법으로 조제되었다. 또한, 맞추어 음성 컨트롤로서 KLH-mFa55(IC17Hdk-mFa55/IC17L-mk1)가 준비되었다.
항체의 중쇄와 경쇄의 조합
Figure pct00067
이들 항체를 이용하여, 당업자 공지의 방법으로 조제한 hIL6R 전장(서열 번호: 213)을 발현시킨 마우스 간암주 Hepa1-6(hIL6R-Hepa1-6)에 대해서, 이하의 방법에 따라 ADCC를 평가했다.
이하의 측정에는 mFcγRIV ADCC Reporter Bioassay, Core Kit(Promega)를 이용했다. 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지로 2×105/mL로 농도를 조제한 hIL6R-Hepa1-6을 100μL씩 가하고, 37℃에서 21시간 정치했다. 배지로는 90% DMEM, 10% FBS, 600μg Geneticin, 500μg Zeocin을 사용했다. 플레이트를 200×g, 4℃에서 5분 원심한 후, 각 웰 상청을 흡인하고, 최종 농도가 0.2μg/mL가 되도록 assay buffer로 희석된 표 67에 기재된 항체 용액, 최종 농도가 0, 1, 10, 100μM이 되도록 assay buffer로 희석된 ATP 용액, 및 3.82mL의 assay buffer에 0.69mL 첨가한 키트 부속의 effector cell 용액 25μL를 각각 합계 75μL가 되도록 혼합하여, 각 웰에 가하고 6시간 37℃에서 정치했다. Assay buffer에는 키트 부속의 low IgG serum 1.5mL를 36mL의 RPMI1640에 첨가한 것을 사용했다. 그 후 플레이트를 실온에서 15분 정치하고, 각 웰에 Bio-Glo reagent를 75μL씩 가했다. Bio-Glo reagent로는 Bio-glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)을 사용했다. 그 후 각 웰의 발광을 플레이트 리더로 측정했다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Fold induction으로 하여, 각 항체의 ADCC를 평가하는 지표로 했다.
얻어진 결과를 도 65에 나타낸다. 도 중에서는, Fold induction을 상대 발광량(RLU)이라고 표기한다.
이 결과로부터 non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0의 hIL6R 발현 세포에 대한 ADCC는 어세이 중에 있어서의 ATP 농도의 영향을 받지 않지만, switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0의 ADCC는 어세이 중에 있어서의 ATP 농도가 높으면 높을수록 강해짐이 나타났다. 이 결과로부터, H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0은 ATP 의존적인 hIL6R에 대한 세포 상해 활성을 가짐이 확인되었다.
(13-5) 항hIL6R 항체의 in vivo에 있어서의 항종양 활성의 평가
각 항체의 ADCC가 확인되었으므로, 이하의 방법에 따라 hIL6R-Hepa1-6을 C57BL/6 마우스에 담암시킨 마우스 모델을 사용하여, 이들 항체의 in vivo에서의 항종양 활성을 평가하는 시험을 행했다.
항아시알로 GM1 항체(와코 순약공업)를 1mL의 증류수(오쓰카 제약공장)에 용해 후, 4mL의 PBS로 희석했다. 이와 같이 조제한 항아시알로 GM1 항체를 C57BL/6 마우스 100마리에게, 1마리에 대해 0.1mL 복강내 투여했다. 1일 후에 Hanks' Balanced Salt solution(Sigma)에 1×108/mL가 되도록 현탁된 hIL6R-Hepa1-6에, 세포 현탁액과 동 용량의 Matrigel Matrix(Corning)를 첨가한 혼합액을 조제했다. 이 혼합액을 C57BL/6 마우스 100마리에 대해, 1마리에 대해 0.2mL 피하에 주입하여 세포를 이식했다. 이후 마우스의 종양 직경은 노기스에 의해 측정되고, 장경×단경×단경×1/2을 종양 체적으로 정의했다. 또한 이 종양 직경 측정은 각 마우스에 투여된 약액의 내용을 모르는 사람이 실시했다. 세포 이식 후 11일째에 상기 C57BL/6 마우스 100마리의 종양 직경 및 체중을 측정했다. 이 값을 기본으로 마우스의 랜더마이즈를 실시하여, 10마리마다의 4군과 8마리의 1군의, 합계 5군으로 마우스를 군나누기하여, 각각의 군에게 표 67에 나타난 항체액을 꼬리 정맥 투여했다. 여기에서 8마리의 군에는 H0002-mFa55/L1058-ml0을 투여했다. 또한 항체액의 투여 용량(mL)은 0.01(mL/g)×각 마우스의 체중(g)으로 했다. 이후 마찬가지의 방법으로 상기 군나누기된 C57BL/6 마우스의 종양 직경 및 체중을, 이식 후 14, 18, 21, 25일째에 측정했다. 또한, 이식 후 18일째에는 측정된 체중 데이터를 기본으로 상기와 같은 계산식에 의해 정의되는 투여 용량의 표 67에 나타난 항체액을, 대응하는 군에게 꼬리 정맥 투여했다. 각 항체 투여군의 각 측정일에 있어서의 종양 체적의 평균치를 산출하여, 각 항체의 in vivo에서의 항종양 활성을 평가하는 지표로 했다.
얻어진 결과를 도 66에 나타낸다.
이 결과로부터 ATP 의존적인 ADCC가 확인된 switch 항체 중, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0은, non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0과 동일한 정도의 hIL6R 발현 세포에 대한 항종양 활성을 나타냄이 확인되었다. 이 결과로부터, 종양 근방의 세포외 ATP는 H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0이 MRAH-mFa55/MRAL-mk0과 마찬가지로 기능할 정도의 농도로 존재함이 시사되었다.
〔실시예 14〕 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체의 전신 작용의 평가
ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체의 정상 조직에 있어서의 작용을 평가하기 위해서, 정상 마우스(C57BL/6) 및 hIL6R을 전신에 과잉 발현시킨 트랜스제닉 마우스(이하 hIL6R-tgm)(Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23; 92(11): 4862-4866.)가 이용되어 항체의 혈장중 동태를 평가했다. 이 평가를 위해서, 표 67에 기재된 항체가, 정상 마우스(C57BL/6) 및 hIL6R-tgm에게 투여되어, 혈장중 동태가 비교되었다. hIL6R-tgm에 있어서는 hIL6R에 결합하는 통상의 항체는 전신에 발현하는 막형 hIL6R에 결합한 결과, 막형 hIL6R을 개재시켜 소실됨이 보고되어 있다(Nature Biotechnology volume 28, pages 1203-1207 (2010)).
2mg/mL의 MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0이 정상 마우스 및 hIL6R-tgm에 10mL/kg으로 단회 정맥내 투여되었다. 정상 마우스에서는 MRAH-mFa55/MRAL-mk0군, H0002-mFa55/L1058-ml0군, H0041-mFa55/L1088-ml0군, H0052-mFa55/L1083-ml0군의 전 군에게 투여 후 5분, 7, 24, 48, 72, 168시간 후에 혈액이 채취되었다. hIL6R-tgm에 대해서는 MRAH-mFa55/MRAL-mk0군에게 투여 후 5분, 7, 24, 48, 52, 55, 72, 168시간 후에, H0002-mFa55/L1058-ml0군, H0041-mFa55/L1088-ml0군, H0052-mFa55/L1083-ml0군에게 투여 후 5분, 7, 24, 48, 72, 168시간 후에 혈액이 채취되었다. 얻어진 혈액은 4℃, 12,000rpm, 10분으로 신속하게 원심하여, 혈장이 분리되었다. 혈장은 측정까지 -20℃ 이하로 설정된 냉각기에서 보존되었다.
혈장 중의 각 항체 농도는 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. hIL6R 용액이 MULTI-ARRAY PR Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되고, 37℃, 1시간 정치되어, hIL6R은 플레이트 상에 고상되었다. 검량선으로서 MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0은 혈장중 농도로서 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125μg/mL로, H0002-mFa55/L1058-ml0은 혈장중 농도로서 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1μg/mL로 하여 조제했다. hIL6R 고상 플레이트에 0.05% Tween20, 1% BSA 함유 1M Tris-HCl 용액 pH 8.0이 첨가된 후, 신속하게 0.3M 아세트산 용액으로 250배 희석한 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되고, 추가로 ATP 용액이 첨가되고 혼화되었다. 실온에서 1시간 정치된 후, 비오틴 라벨 항마우스 IgG 항체(Southern Biotechnology Associates, Inc)가 첨가되고, 실온에서 1시간 정치되었다. 그 후, Streptavidin SULFO-TAG Labeled(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 첨가되고 실온에서 1시간 정치된 후, Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해지고, 전기화학발광 장치 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Diagnostics, LLC)으로 측정되었다. SOFTmax PRO(Molecular Devices)가 이용되어 마우스 혈장 중의 각 항체 농도가 산출되었다.
혈장 중의 가용성 항원 농도가 ECL로 측정되었다. 50배로 희석한 마우스 혈장 샘플과 SULFO-TAG(Meso Scale Diagnostics, LLC)-라벨화 항인간 IL6R 항체(R&D Systems), 비오틴 라벨화 항인간 IL6R 항체(R&D Systems) 및 과잉의 항인간 IL6R 항체 토실리주맙(자사 제조품)이 혼합되어, 37℃, 오버나이트로 인큐베이션되었다. 블로킹한 Streptavidin-coated standard 96-well plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가된 후, Read buffer가 가해지고 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Diagnostics, LLC)으로 측정되었다. SOFTmax PRO (Molecular Devices)가 이용되어 마우스 혈장 중의 가용성 항원 농도가 산출되었다.
MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0의 정상 마우스 및 hIL6R-tgm에 있어서의 혈중 농도가 비교된 결과를 각각 도 67, 도 68, 도 69, 도 70에 나타낸다.
정상 마우스와 비교하여 전신에서 hIL6R을 발현한 hIL6R-tgm에 있어서 non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0은 빠른 소실을 나타냈다(도 67). 이 결과는, non-switch 항체는 전신의 정상 조직에 발현하는 막형의 hIL6R에 결합하여, hIL6R을 개재시켜 소실된 것이 원인으로 생긴다고 생각되었다.
그 한편으로, switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0의 경우는, non-switch 항체와 같이, 정상 마우스와 비교했을 때에 hIL6R-tgm에 있어서는 현저하고 빠른 항체 농도의 소실은 관찰되지 않았다. 이 결과는, non-switch 항체의 결과와는 대조적으로, switch 항체는 전신에 발현하는 막형 hIL6R에 결합하지 않고, hIL6R을 개재시킨 소실도 생기지 않음을 시사하고 있다.
Switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0을 비교하면, 낮은 ATP 농도에서의 보다 강한 결합을 나타내는 H0052-mFa55/L1083-ml0에서만 정상 마우스와 비교하여 hIL6R-tgm에 있어서 항체의 소실의 가속이 관찰되었다.
이들 결과는, 정상 조직에 있어서의 세포외 ATP 농도는 switch 항체가 hIL6R에 결합하기에는 낮은 농도임을 시사하고 있다.
다음에, 각 항체가 투여된 후의, hIL6R-tgm에 있어서의 가용형 hIL6R의 혈장중 농도가 비교되었다. 결과를 도 71에 나타낸다.
아이소타입 컨트롤인 IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1이 투여된 마우스의 가용형 hIL6R 농도와 비교하여, non-switch 항체인 MRAH-mFa55/MRAL-mk0이 투여된 마우스에서는 가용형 hIL6R 농도의 축적이 관찰되었다. 이것은 non-switch 항체가 가용형 hIL6R에 결합하여, 통상의 대사 경로를 막았던 것이 원인으로 생긴다고 생각되었다.
그 한편으로, switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0이 투여된 마우스에서는, non-switch 항체와 같은 항원의 현저한 축적은 관찰되지 않았다. Switch 항체인 H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0이 비교되면, 낮은 ATP 농도에서의 보다 강한 결합을 나타내는 항체가 항원을 축적하는 경향이 관찰되었다.
이들 결과는, 정상 조직이나 혈액 중에 있어서의 세포외 ATP 농도는 switch 항체가 막형, 가용형의 hIL6R에 결합하기에는 낮은 농도임을 시사하고 있다.
〔실시예 15〕 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체의 항종양 작용과 전신 작용의 동시 평가
종양 존재하에서의 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항hIL6R 항체의 전신 작용을 평가하기 위해서, 항종양 작용과 전신 작용이 동시에 평가되었다. 이 평가를 위해서, hIL6R-Hepa1-6을 hIL6R-tgm에 이식한 모델을 이용하여 표 67에 기재된 항체가 투여되었다.
항아시알로 GM1 항체(와코 순약공업)가 1ml의 증류수(오쓰카 제약공장)에 용해 후, 4ml의 PBS로 희석되었다. 이와 같이 조제한 항아시알로 GM1 항체가 hIL6R-tgm 83마리에게, 1마리에 대해 0.1ml 복강내 투여되었다. 1일 후에 Hanks' Balanced Salt solution(Sigma)에 1×108/ml가 되도록 현탁된 hIL6R-Hepa1-6에, 세포 현탁액과 동 용량의 Matrigel Matrix(Corning)를 첨가한 혼합액이 조제되었다. 이 혼합액을 hIL6R-tgm 83마리에 대해, 1마리에 대해 0.2ml 피하에 주입되어 세포가 이식되었다. 이 이후, 마우스의 종양 직경의 측정은 노기스에 의해 실시되고, 장경×단경×단경×1/2이 종양 체적으로서 정의되었다. 또한 이 종양 직경 측정은 각 마우스에 투여된 약액의 내용을 모르는 사람이 실시했다. 세포 이식 후 10일째에 상기 hIL6R-tgm 83마리의 종양 직경 및 체중이 측정되었다. 이 값을 기본으로 마우스의 랜더마이즈가 실시되어, 10마리마다의 4군으로 마우스가 군나누기되고, 각각의 군에게 표 67에 나타난 항체액 중, H0052-mFa55/L1083-ml0을 제외한 4종의 항체액이 각각의 군에게 꼬리 정맥 투여되었다. 항체액의 투여 용량(ml)은 0.01(ml/g)×각 마우스의 체중(g)으로서 계산되었다. 이 이후, 마찬가지의 방법으로 상기 군나누기된 hIL6R-tgm의 종양 직경 및 체중이, 이식 후 13, 17, 20일째에 측정되었다. 또한, 이식 후 17일째에는 측정된 체중 데이터를 기본으로 상기와 같은 계산식에 의해 정의되는 투여 용량의 표 67에 나타난 항체액 중H0052-mFa55/L1083-ml0을 제외한 4종의 항체액이, 대응하는 군에게 꼬리 정맥 투여되었다. 각 항체 투여군의 각 측정일에 있어서의 종양 체적의 평균치가 산출되어, 각 항체의 in vivo에서의 항종양 활성을 평가하는 지표로서 이용되었다.
또한 상기 실험에 있어서, 아이소플루레인 마취하에서 상기 군나누기된 hIL6R-tgm으로부터 안와 채혈에 의해 혈액이, 초회의 항체액 투여로부터 1시간 후, 및 1, 2, 3, 7일째에 채취되었다. 채취된 혈액은 개체 번호마다 8련(連) 튜브에 옮기고, 빙상에 정치되었다. 8련 튜브는 1900×g, 4℃에서 10분 원심된 후, 원심 후 상청은 혈장 성분으로서 취득하여 다른 8련 튜브에 개체 번호마다 옮겨져 -30℃에서 보관되었다.
혈장 중의 각 항체 농도는 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. hIL6R 용액이 MULTI-ARRAY PR Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되고, 37℃, 1시간 정치되어 hIL6R은 플레이트에 고상되었다. 검량선으로서 MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0041-mFa55/L1088-ml0은 혈장중 농도로서 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125μg/mL로, H0002-mFa55/L1058-ml0은 혈장중 농도로서 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1μg/mL로 조제되었다. hIL6R 고상 플레이트에 0.05% Tween20, 1% BSA 함유 1M Tris-HCl 용액 pH 8.0이 첨가된 후, 신속하게 0.3M 아세트산 용액으로 250배 희석된 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되고, 추가로 ATP 용액이 첨가되고 혼화되었다. 실온에서 1시간 정치된 후, 비오틴 라벨 항마우스 IgG 항체(Southern Biotechnology Associates, Inc)가 첨가되고 실온에서 1시간 정치되었다. 그 후, Streptavidin SULFO-TAG Labeled(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 첨가되고 실온에서 1시간 정치된 후, Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해지고 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Diagnostics, LLC)으로 측정되었다. SOFTmax PRO(Molecular Devices)가 이용되어 마우스 혈장 중의 각 항체 농도가 산출되었다.
또한 마찬가지로, 항아시알로 GM1 항체(와코 순약공업)는 1ml의 증류수(오쓰카 제약공장)에 용해 후, 4ml의 PBS로 희석되었다. 이와 같이 조제된 항아시알로 GM1 항체는 hIL6R-tgm 91마리에게, 1마리에 대해 0.1ml 복강내 투여되었다. 1일 후에 Hanks' Balanced Salt solution(Sigma)에 1×108/ml가 되도록 현탁된 hIL6R-Hepa1-6에, 세포 현탁액과 동 용량의 Matrigel Matrix(Corning)가 첨가된 혼합액이 조제되었다. 이 혼합액을 hIL6R-tgm 91마리에 대해, 1마리에 대해 0.2ml 피하에 주입하여 세포가 이식되었다. 이후, 마우스의 종양 직경의 측정은 노기스에 의해 실시되고, 장경×단경×단경×1/2이 종양 체적으로 정의되었다. 또한 이 종양 직경 측정은 각 마우스에 투여된 약액의 내용을 모르는 사람이 실시했다. 세포 이식 후 10일째에 상기 hIL6R-tgm 91마리의 종양 직경 및 체중이 측정되었다. 이 값을 기본으로 마우스의 랜더마이즈가 실시되고, 6마리마다의 4군으로 마우스가 군나누기되어, 각각의 군에게 표 67에 나타난 항체액 중 H0002-mFa55/L1058-ml0을 제외한 4종의 항체액이 각각의 군에게 꼬리 정맥 투여되었다. 항체액의 투여 용량(ml)은 0.01(ml/g)×각 마우스의 체중(g)으로서 계산되었다. 이후, 마찬가지의 방법으로 상기 군나누기된 hIL6R-tgm의 종양 직경 및 체중이, 이식 후 13, 17, 20일째에 측정되었다. 또한, 이식 후 17일째에는 측정된 체중 데이터를 기본으로 상기와 같은 계산식에 의해 정의되는 투여 용량의 표 67에 나타난 항체액 중H0002-mFa55/L1058-ml0을 제외한 4종의 항체액이, 대응하는 군에게 꼬리 정맥 투여되었다. 각 항체 투여군의 각 측정일에 있어서의 종양 체적의 평균치가 산출되어 각 항체의 in vivo에서의 항종양 활성을 평가하는 지표로서 이용되었다.
또한 상기 실험에 있어서, 아이소플루레인 마취하에서 상기 군나누기된 hIL6R-tgm으로부터 안와 채혈에 의해 혈액이, 초회의 항체액 투여로부터 1시간 후, 및 3, 7일째에 채취되었다. 채취된 혈액은 개체 번호마다 8련 튜브에 옮겨지고, 빙상에서 정치되었다. 8련 튜브는 1900×g, 4℃에서 10분 원심된 후, 원심 후 상청은 혈장 성분으로서 취득되어 다른 8련 튜브에 개체 번호마다 옮겨져 -30℃에서 보관되었다.
혈장 중의 각 항체 농도는 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. hIL6R 용액은 MULTI-ARRAY PR Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되고, 37℃, 1시간 정치되어 hIL6R은 플레이트에 고상되었다. 검량선으로서 MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0은 혈장중 농도로서 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125μg/mL로 조제되었다. hIL6R 고상 플레이트에 0.05% Tween20, 1% BSA 함유 1M Tris-HCl 용액 pH 8.0이 첨가된 후, 신속하게 0.3M 아세트산 용액으로 250배 희석된 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되고, 추가로 ATP 용액이 첨가되고 혼화되었다. 실온에서 1시간 정치된 후, 비오틴 라벨 항마우스 IgG 항체(Southern Biotechnology Associates, Inc)가 첨가되고 실온에서 1시간 정치되었다. 그 후, Streptavidin SULFO-TAG Labeled(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 첨가되고 실온에서 1시간 정치된 후, Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해지고 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Diagnostics, LLC)으로 측정되었다. SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 마우스 혈장 중의 각 항체 농도는 산출되었다.
혈장 중의 가용성 항원 농도는 ECL로 측정되었다. 50배로 희석한 마우스 혈장 샘플과 SULFO-TAG(Meso Scale Diagnostics, LLC)-라벨화 항인간 IL6R 항체(R&D Systems), 비오틴 라벨화 항인간 IL6R 항체(R&D Systems) 및 과잉의 항인간 IL6R 항체 토실리주맙(자사 제조품)이 혼합되고, 37℃, 오버나이트로 인큐베이션되었다. 블로킹한 Streptavidin-coated standard 96-well plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가된 후, Read buffer가 가해지고 SECTOR Imager 6000(Meso Scale Diagnostics, LLC)으로 측정되었다. SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 마우스 혈장 중의 가용성 항원 농도가 산출되었다.
최초로, IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1, MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0002-mFa55/L1058-ml0, H0041-mFa55/L1088-ml0의 항종양 작용, 혈장 중의 항체 농도, 및 혈장 중의 항원 농도가 비교되었다. 각각의 결과를 도 72, 도 73, 및 도 74에 도시한다.
이 시험에 있어서는 아이소타입 컨트롤인 IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1이 투여된 군과 비교하여, MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0002-mFa55/L1058-ml0이 투여된 군에서는 보다 큰 종양 증식 억제율(TGI: Tumor Growth Inhibition)을 나타내지 않았다. 그 한편으로, switch 항체인 H0041-mFa55/L1088-ml0을 투여한 군에서는 보다 큰 TGI가 확인되었다(도 72). H0041-mFa55/L1088-ml0과 비교하여, MRAH-mFa55/MRAL-mk0이 투여된 마우스군에서 보다 약한 약효 밖에 관찰되지 않았던 것은, H0041-mFa55/L1088-ml0과 비교하여 MRAH-mFa55/MRAL-mk0은 소실이 빨라, 약효를 나타내는 데 충분한 농도를 유지할 수가 없었기 때문임이 시사되었다(도 73).
또한, H0002-mFa55/L1058-ml0 투여군에서는 가용형 hIL6R의 축적은 관찰되지 않았다. H0041-mFa55/L1083-ml0 투여군에서는 MRAH-mFa55/MRAL-mk0 투여군보다 적은 양밖에 가용형 IL6R이 축적되지 않았다(도 74).
다음에, IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1, MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0의 항종양 작용, 혈장 중의 항체 농도, 및 혈장 중의 항원 농도가 비교되었다. 각각의 결과를 도 75, 도 76, 및 도 77에 도시한다.
이 시험에 있어서는 아이소타입 컨트롤인 IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1이 투여된 군과 비교하여, MRAH-mFa55/MRAL-mk0, H0041-mFa55/L1088-ml0, H0052-mFa55/L1083-ml0이 투여된 군에서는 보다 큰 종양 증식 억제율(TGI: Tumor Growth Inhibition)이 관찰되었다(도 75). 한편으로, 그 혈장중 농도를 비교하면, MRAH-mFa55/MRAL-mk0은 H0052-mFa55/L1083-ml0보다도 빠른 소실을 나타내고 있고, 보다 낮은 혈중 농도가 관찰되었다(도 76).
또한, MRAH-mFa55/MRAL-mk0과 비교하여, H0052-mFa55/L1083-ml0은 보다 적은 양밖에 가용형 IL6R을 축적하지 않았다(도 77).
이들 결과로부터, 담암 마우스에 있어서, switch 항체는 non-switch 항체와 마찬가지이거나 그보다도 강한 항종양 작용을 나타내는 한편으로, non-switch 항체와는 달리, 정상 조직에 있어서 hIL6R에 결합하지 않음이 시사되었다. 이 결과는, 암이 존재했다고 해도, 정상 조직이나 혈액 중에 있어서의 세포외 ATP 농도가 switch 항체의 결합을 촉진할 정도로는 상승되지 않음을 시사하고 있다.
〔실시예 16〕 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항PD1 항체에 의한 ATP 의존적 중화 활성
표 68에 나타내듯이 중쇄와 경쇄를 조합하여, 당업자 공지의 방법으로 항PD-1 항체를 발현시켜 정제했다.
항체의 중쇄와 경쇄의 조합
Figure pct00068
이하의 방법에 따라 PDL1-PD1의 상호작용에 대한 표 68에 기재한 각 항체의 중화 활성을 평가했다.
처음에 항원으로서 mPD1-G1CH2(서열 번호: 209) 및 mPDL1-G1dCH2His(서열 번호: 210)가 유전자 합성되어, 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 항원 단백질은 이하의 방법을 이용하여 발현, 정제되었다. FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 적절한 세포 밀도로 현탁되고, 플라스크에 파종된 인간 태아 신장 세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)에 대해서, 조제된 플라스미드가 리포펙션법에 의해 도입되었다. CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 125rpm)로 4일간 배양된 배양 상청으로부터, 당업자 공지의 방법으로 항원이 정제되었다. 분광 광도계를 이용하여, 정제된 항원 용액의 280nm에서의 흡광도가 측정되었다. 얻어진 측정치로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광 계수를 이용하여 정제된 항원의 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
96웰의 플레이트에, 마우스 PD1에 Fc를 융합시킨 mPD1-G1CH2(서열 번호: 209)를 0.1M NaHCO3, 0.05% NaN3으로 5μg/mL(55nM)로 희석한 용액을 100μL씩 가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여, 플레이트 표면에 고정화했다. 각 웰을 TBS, 0.1% Tween20으로 3회 wash한 후에, TBS로 2%로 희석한 BSA 용액을 각 웰에 250μL 가하여, 플레이트 표면을 블로킹했다. 그 후, 3회 wash가 실시되었다. 최종 농도가 55nM이 되도록 TBS로 희석한 마우스 PDL1에 항체의 Fc 및 His 태그를 융합시킨 mPDL1-G1dCH2His(서열 번호: 210), 최종 농도가 6.25, 1.56, 0.390, 0.0977, 0.0061, 0μg/mL가 되도록 희석한 표 68에 기재된 항체 용액, 및 최종 농도가 0, 1, 10, 100μM이 되도록 희석한 ATP 용액을 각각 합계 100μL가 되도록 혼합하여, 각 웰에 가하고, 1시간 37℃에서 정치했다. 그 후, 각 웰에 가해진 용액의 ATP 농도와 동일한 ATP 농도를 포함하도록 조제된 TBS, 0.1% Tween20으로 각 웰을 3회 wash했다. 각 웰에 가해진 용액의 ATP 농도와 동일한 ATP 농도를 포함하도록 블로킹 버퍼로 10000배로 희석한 anti-His-tag mAb-HRP-Direct(MBL 라이프 사이언스)를 각 웰에 100μL 가하고 1시간 37℃에서 정치했다. 그 후, 각 웰에 가해진 용액의 ATP 농도와 동일한 ATP 농도를 포함하도록 조제된 TBS, 0.1% Tween20으로 각 웰을 3회 wash했다. 거기에 TMB 용액을 각 웰에 100μL 가하고 1시간 37℃에서 정치하고, 1M H2SO4를 각 웰에 50μL 가하여 반응을 정지시켰다. 그 후, 각 웰은 흡광 마이크로 플레이트 리더 Wako Sunrise로 450nm의 흡광도를 검출했다.
동 ATP 농도 조건하에서의, 항체 미첨가 웰의 흡광도의 값을 PD1-PDL1 결합률 100%로 하여, 항체 첨가로 그 결합률이 어느 정도 저하되는지를 평가했다. 그 결과를 도 78, 도 79에 나타낸다.
이 결과로부터 mPD1F2VH-mF18/mPD1F2VL-mk1의 PD1/PDL-1의 상호작용에 대한 중화 활성은 ATP 농도의 영향을 받지 않지만, H5029-mFa31/L3021-ml0, H5041-mFa31/L3021-ml0의 중화 활성은 어세이 중에 있어서의 ATP 농도가 높으면 높을수록 강해짐이 나타났다. 이 결과로부터, H5029-mFa31/L3021-ml0, H5041-mFa31/L3021-ml0은 ATP 의존적인 결합 활성 및 중화 활성을 가짐이 확인되었다.
In vitro 중화 활성 측정에는 luciferase assay system(Promega)이 이용되었다. 이펙터 세포로서 PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay, Core Kit(Promega) 부속의 hPDL1-CHO가 이용되었다. 타겟 세포로서, 자사에서 제작한 Jurkat-NFAT-Luc2-mPD1 세포가 이용되었다. 최초에 Jurkat-NFAT-Luc2 세포(Promega)에, 세포외 mPD1과 세포내 hPD1의 융합 단백질 유전자(서열 번호: 214)가 당업자 공지의 방법으로 도입되어 Jurkat-NFAT-Luc2-mPD1 세포가 제작되었다. hPDL1-CHO 상의 hPDL1과 Jurkat-NFAT-Luc2-mPD1 상의 세포외 mPD1 및 세포내 hPD1의 융합 단백질의 상호작용이 PD-1/PDL-1의 상호작용으로서, in vitro 중화 활성 평가에 이용되었다.
96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 4×105/mL로 농도를 조제한 키트 부속의 hPDL1-CHO를 100μL씩 가하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 배지로는 90% Ham's F-12, 10% FBS, 250μg Geneticin, 200μg Hygromycin을 사용했다. 각 웰 상청을 흡인하고, 최종 농도가 7.5μg/mL가 되도록 assay buffer로 희석된 표 68에 기재된 항체 용액 20μL, 최종 농도가 0, 1, 10, 100μM이 되도록 assay buffer로 희석된 AMP 용액 20μL, 및 세포수가 5×104/well이 되도록 assay buffer로 조제된 NFAT-Luc2-hPD1-mPD1-Jurkat cell 용액 40μL를 혼합하여, 각 웰에 가하고 4시간 37℃에서 정치했다. Assay buffer로는 98% RPMI1640, 2% FBS를 사용했다. 그 후 플레이트를 실온에서 10분 정치하고, 각 웰에 Bio-Glo reagent를 80μL씩 가했다. Bio-Glo reagent로는 Bio-glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)을 사용했다. 그 후 각 웰의 발광을 플레이트 리더로 측정했다.
각 AMP 농도 조건하에서의 각 웰의 발광의 값을, 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Fold induction으로 하여, 각 항체의 PD-1/PDL-1의 상호작용에 대한 중화 활성을 평가하는 지표로 했다. 그 결과를 도 80에 나타냈다. 도 중에서는, Fold induction을 상대 발광량(RLU)이라고 표기한다.
ATP에 대해서도 AMP와 마찬가지로 시험을 실시하여, 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 4×105/mL로 농도를 조제한 hPDL1-CHO를 100μL씩 가하고, 37℃에서 하룻밤 정치했다. 배지로는 90% Ham's F-12, 10% FBS, 250μg Geneticin, 200μg Hygromycin을 사용했다. 각 웰 상청을 흡인하고, 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 assay buffer로 희석된 표 68에 기재된 항체 용액 20μL, 최종 농도가 0, 12.5, 125μM이 되도록 assay buffer로 희석된 ATP 용액 20μL, 및 세포수가 5×104/well이 되도록 assay buffer로 조제된 NFAT-Luc2-hPD1-mPD1-Jurkat cell 용액 40μL를 혼합하여, 각 웰에 가하고 4시간 37℃에서 정치했다. Assay buffer로는98% RPMI1640, 2% FBS를 사용했다. 그 후 플레이트를 실온에서 10분 정치하고, 각 웰에 Bio-Glo reagent를 80μL씩 가했다. Bio-Glo reagent로는 Bio-glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)을 사용했다. 그 후 각 웰의 발광을 플레이트 리더로 측정했다.
각 ATP 농도 조건하에서의 각 웰의 발광의 값을, 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 Fold induction으로 하여, 각 항체의 PD-1/PDL-1의 상호작용에 대한 중화 활성을 평가하는 지표로 했다. 그 결과를 도 81에 나타냈다. 도 중에서는, Fold induction을 상대 발광량(RLU)이라고 표기한다.
〔실시예 17〕 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 항PD1 항체에 의한 ATP 의존적 ADCC에 의한 항종양 활성
표 69에 나타낸 바와 같이 중쇄와 경쇄를 조합하여, 당업자 공지의 방법으로 항PD-1 항체를 발현시켜 정제했다.
항체의 중쇄와 경쇄의 조합
Figure pct00069
이들 항체의 중쇄 정상 영역은, FcγRIV에 대한 결합을 증강하는 개변을 mIgG2a에 가하여 ADCC 활성을 증강한 mFa55로 변경한 것이다. 그 때문에, PD-1 발현 세포에 대해서 ADCC 활성을 발휘하여, PD-1 발현 세포를 제거하는 것이 가능하다고 생각되었다. 이들 항체를 이용하여 이하의 방법에 따라 in vivo에서의 항종양 활성의 평가 및 PD-1 발현 세포의 제거를 평가했다.
마우스 대장암주 Colon38(NCI) 5×106개를 마트리겔(Corning)과 함께, C57BL/6J 마우스(일본 찰스 리버)의 우측 복부 피하에 이식하여, 고형 종양을 형성시켰다. 이식 후 14일째에, IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1을 15mg/kg으로, mPD1F2VH-mFa55/mPD1F2VL-mk1을 1.5, 5, 15mg/kg으로, H5041-mFa55/L3023-ml0을 25.5, 100mg/kg으로 각각 정맥내(i.v.)에 투여했다(각 군 n=7). 추가로, H5041-mFa55/L3023-ml0 투여군에는 이식 후 17일째에, 동 항체가 25.5, 100mg/kg으로 각각 정맥내(i.v.)에 재차 투여되었다. 그 결과, 음성 컨트롤군을 제외한 모든 항체 투여군에 있어서 항종양 효과가 관찰되었다(도 82).
각 항체 투여 후의 종양 조직 중의 PD1 발현 세포의 제거를 Flow cytometry를 이용하여 평가했다. 전술한 대로 Colon38의 고형 종양을 형성시키고, 이식 후 14일째에 IC17HdK-mFa55/IC17L-mk1(isotype control)을 15mg/kg으로, mPD1F2VH-mFa55/mPD1F2VL-mk1을 1.5, 5, 15mg/kg으로, H5041-mFa55/L3023-ml0을 25.5, 100mg/kg으로 각각 정맥내(i.v.)에 투여했다(각 군 n=3). 항체 투여 3일 후에 각 마우스의 비장 및 종양 조직을 채취했다. 비장은 핀셋을 이용하여 세분화되고, 10% FBS 첨가 RPMI-1640을 가하고 400×g로 5분간 원심분리하고, 그 후, 상청을 제거했다. ACK Lysing Buffer(Thermo Fisher Scientific)를 2mL 가하고, 실온에서 2.5분간 정치한 후에, 용혈된 샘플을 비장 세포로서 Flow cytometry 해석에 이용했다. 종양 조직은 가위를 이용하여 세분화된 후, Tumor Dissociation Kit(Miltenyi)의 프로토콜에 따라 효소를 가하고, gentleMACS Dissociator(Miltenyi Biotec)로 더욱 세분화되었다. 10% FBS 첨가 RPMI-1640을 가하고 400×g로 5분간 원심분리하고, 상청을 제거하여, 종양 세포로서 Flow cytometry 해석에 이용했다. 비장 세포와 종양 세포를 V bottom plate(Corning)로 옮기고, 400×g로 5분간 원심분리하고, 상청을 제거했다. 1% FBS, 2mM EDTA(Sigma)를 포함하는 PBS(FACS buffer)로 10배 희석한 FcR blocking reagent(Miltenyi Biotec) 100μL로, 세포를 재현탁했다. 세포는 10분간 실온에서 인큐베이트된 후, BUV737 Anti-Mouse CD3ε(BD)를 0.4μL, Zombie Aqua(Biolegend)를 0.1μL, PerCP/Cy5.5 Anti-Mouse CD8a(Biolegend)를 0.4μL, PE/Cy7 Anti-Mouse CD4(Biolegend)를 0.4μL, APC-R700 Anti-mouse CD45(BD)를 0.2μL, FITC anti-human/mouse/rat CD278(Biolegend)를 0.4μL, APC/FireTM 750 anti-mouse CD25(Biolegend)를 0.4μL, 추가로 투여된 각 PD1 항체와 경합하지 않음이 이미 확인되어 있는 APC anti-mouse CD279(Biolegend)를 0.4μL, 각 웰에 가하고, FACS Buffer를 20μL/웰이 되도록 가했다. 4℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 100μL의 FACS buffer를 가하고 400×g로 5분간 원심분리하고 상청을 제거했다. Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set(eBioscience)의 프로토콜에 기초하여, Fixation/Permeabilization Concentrate와 Fixation/Permeabilization Diluent를 혼합하고, 혼합액을 각 웰에 200μL 가했다. 4℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 400×g로 5분간 원심분리하고, 상청을 제거했다. Permeabilization buffer를 200μL 가하고, 400×g로 5분간 원심분리하고, 상청을 제거했다. 이 세정 조작이 또 1회 행해졌다. eFluor450 Anti-Mouse/Rat Foxp3(eBioscience)을 0.4μL, PE Anti-Mouse CD152(BD)를 0.4μL, 각 웰에 가하고, FACS Buffer를 20μL/웰이 되도록 가했다. 4℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 100μL의 FACS buffer를 가하고, 400×g로 5분간 원심분리하고 상청을 제거했다. Permeabilization buffer를 200μL로 각 웰에 가하고 400×g로 5분간 원심분리하고 상청을 제거했다. 샘플은 200μL의 FACS buffer로 재현탁되고, FACS Fortessa 플로 사이토미터(BD)로 측정되었다. 발현 해석은 FlowJo 소프트웨어를 이용했다. 해석 대상이 되는 세포 집단에 대해서 CD4 양성 세포를 게이팅하여, Foxp3 및 PD1의 발현을 해석했다. CD4+ Foxp3-의 세포 집단에 있어서의 PD1 발현량이 형광 강도로부터 산출되었다. 그 결과, mPD1F2VH-mFa55/mPD1F2VL-mk1 5, 15mg/kg 투여군에서는 비장 세포, 종양 세포 모두 PD1 발현량이 감소 경향에 있었지만, H5041-mFa55/L3023-ml0 25.5, 100mg/kg 투여군에서는 종양 세포에서만 PD1 발현량이 감소 경향에 있었다(도 83A 및 B). 당해 ATP 의존적으로 PD1에 결합하는 switch 항체는 모두 종양에 대한 약효를 나타내는 한편으로, 전신에서의 반응(PD1 발현량의 감소)은 일으키지 않음이 확인되어, switch 항체는 종양 국소에서 특이적으로 활성을 나타낸다고 하는 성질을 가짐이 확인되었다.
〔실시예 18〕 ATP 의존적 결합 특성을 갖는 hIL6R 결합 항체의 결정 구조 해석
실시예 13에서 취득된, ATP를 스위치로 하는 인간 IL6 리셉터(hIL6R) 결합 항체 H0041L1088의 Fab 단편과 ATP, hIL6R 세포외 도메인(shIL6R)의 복합체의 X선 결정 구조 해석이 했해졌다.
(18-1) H0041L1088 전장 항체의 조제
인간 IgG1 포맷을 가지는 H0041L1088 전장 항체(VH; 서열 번호: 194, CH; 서열 번호: 217, VL; 서열 번호: 195, CL; 서열 번호: 189)의 조제 및 정제는, 당업자 공지의 방법에 의해 행해졌다.
(18-2) H0041L1088 Fab 단편의 조제
H0041L1088 전장 항체 샘플은, Papain(SIGMA-ALDRICH, 10108014001)을 이용하여, 35℃, 약 18시간의 조건에서 Fab와 Fc로 단편화되고, 다음에 HiTrap SP HP 1mL(GE Healthcare), 및 HiTrap MabSelect SuRe 1mL(GE Healthcare)에 의한 컬럼 정제와 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE Healthcare)에 의한 SEC 정제를 거쳐, Fab 샘플이 조제되었다.
(18-3) shIL6R의 조제
UniProtKB: P08887 (IL6RA_HUMAN)의 아미노산 서열(서열 번호: 213)을 기초로, 그 도메인 2 및 3(아미노산111-320)이 유전자 합성되어, 발현용 벡터에 짜넣어졌다. 유전자 합성에 있어서는, N말단에 분비 발현을 위한 시그널 서열, C말단에 정제를 위한 FLAG 태그 + His×8 태그가 부가되고, 추가로 도메인 1의 제거에서 유래하는 Cys-Cys 페어의 불완전화에의 대응을 위해, C193S 개변이 도입되었다. 얻어진 발현 플라스미드를 이용하여, Kifunensine[Santa Cruz Biotechnology] 존재하, Expi293TM Expression System(Thermo Fisher Scientific)에 의한 단백 발현이 행해져, 목적 단백을 포함하는 발현 배양 상청이 얻어졌다. 거기로부터, cOmpleteTM His-Tag Purification Column 5mL(SIGMA-ALDRICH)에 의한 어피니티 정제 및 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg(GE Healthcare)에 의한 SEC 정제를 거쳐, shIL6R 샘플이 조제되었다.
(18-4) H0041L1088 Fab - shIL6R - ATP 3자 복합체의 조제
shIL6R 샘플에 대해, N형 당쇄 절단을 위한 Endoglycosidase F1(Endo F1)과 His×8 태그 절단을 위한 Enterokinase(SIGMA-ALDRICH, 11334115001)가 가해지고, 실온에서 1일 정치한 후, HisTrap EXCEL 1mL(GE Healthcare) 스루 처리와 Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)에 의한 SEC 정제가 실시되었다. 얻어진 정제 프랙션은, H0041L1088 Fab 샘플을 가한 후, 한외 여과에 의해 농축되고, 20mM HEPES pH 7.3, 100mM NaCl, 0.5mM ATP를 버퍼로서 이용한 Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)에 의한 SEC 정제를 거쳐, 복합체(Complex) 샘플이 조제되었다. 얻어진 정제 프랙션으로부터 한외 여과 농축에 의해 결정화용 Complex 샘플이 조제되었다.
(18-5) H0041L1088 Fab - shIL6R - ATP 3자 복합체 결정의 제작
결정화용 Complex 샘플을 이용하여, 21℃ 조건하, 시팅 드롭 증기 확산법에 의한 결정화가 행해져, 60mM Tris pH 7.5, 12.0%w/v 폴리에틸렌 글리콜 1500(Polyethylene glycol 1,500), 60mM 황산 암모늄(Ammonium sulfate)의 리저버 조건에서, X선 결정 구조 해석에 적합한 결정이 얻어졌다.
(18-6) H0041L1088 Fab - shIL6R - ATP 3자 복합체 결정으로부터의 X선 회절 데이터 측정 및 결정 구조 결정
얻어진 결정은, 68mM Tris pH 7.5, 13.6%w/v 폴리에틸렌 글리콜 1500(Polyethylene glycol 1,500), 68mM 황산 암모늄(Ammonium sulfate), 14.6% 에틸렌 글리콜(Ethylen Glycol), 0.375mM ATP의 용액에 침지된 후, 액체 질소로 동결되고, 고에너지 가속기 연구 기구 방사광 시설 포톤팩토리 BL-17A에서 X선 회절 데이터가 측정되었다. 측정 중, 결정은 항상 -178℃의 질소류하에 둠으로써, 동결 상태가 유지되었다. 얻어진 회절 화상은, autoPROC(Acta Cryst. D67: 293-302 (2011))를 이용하여 처리되고, 분해능 2.76Å까지의 회절 강도 데이터가 취득되었다.
얻어진 X선 회절 강도 데이터를 이용하여, 기지의 Fab의 결정 구조와 PDB ID=1N26의 shIL6R의 결정 구조를 탐색 모델로 하여, Phaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)를 이용한 분자 치환법을 실시하여, 초기 구조가 결정되었다. 그 후, coot(Acta Cryst. D66: 486-501 (2010)), refmac5(Acta Cryst. D67: 355-367 (2011)) 및 phenix.refine(Acta Cryst. D68: 352-367 (2012))에 의한 모델 구축과 정밀화가 반복되어, 최종적인 정밀화 좌표가 얻어졌다. 그 결정학적 통계치는 표 70에 나타난다. 한편, 결정 구조 좌표 중, Fab의 아미노산의 잔기 번호는 Kabat 번호 붙이기 스킴에 기초하여 부여되고, 항원인 shIL6R의 아미노산의 잔기 번호는 UniProtKB: P08887 (IL6RA_HUMAN)의 아미노산의 잔기 번호와 일치하도록 부여되었다. 본 결정의 비대칭 단위에는 2개의 complex가 존재하지만, shIL6R의 도메인 2에 있어서 도메인 스와핑으로 불리는 특수한 다이머 형성이 관찰되었다. 이와 같은 다이머는, PDB ID=1 N26의 shIL6R의 결정 구조에서는 보이지 않아, 여기에서 이용한 shIL6R 컨스트럭트에 특유의 구조가 되고 있다.
Figure pct00070
(18-7) H0041L1088과 ATP의 상호작용
도 84에 나타내듯이, ATP는, 주로 당해 항체의 중쇄에 의해 인식되고 있다. 구체적으로는, ATP의 아데닌환 부분은, 당해 항체의 중쇄 CDR1: T33, CDR3: Y95, L98, N100B, W100C의 각 측쇄, 및 G96, L100A, W100C의 각 주쇄에 의해 인식된다. 특히, G96 및 L100A의 주쇄의 카보닐 산소와 ATP의 6위 NH2의 사이, W100C의 주쇄 아마이드 NH기와 ATP의 1위 N의 사이에서 수소 결합이 형성됨과 함께, Y95, L98, W100C의 각 측쇄와 아데닌환 부분 사이에서, CH-π, π-π와 같은 상호작용이 형성되고 있어, 당해 항체는 ATP의 아데닌환 부분을 강고하게 인식하고 있다. 리보스 부분은 중쇄 CDR1: T33, CDR2: H56, Y58의 각 측쇄와의 반데르발스 상호작용에 의해 인식된다. 또한, 3인산기 부분은 중쇄 CDR2: S52, S52A, Y55, H56의 각 측쇄, 및 S52A, Q53의 주쇄에 의해 인식된다. 특히, S52 측쇄, S52A 측쇄, 및 주쇄 NH기, Q53 주쇄 NH기는, 3인산기 부분과 강고한 수소 결합 네트워크를 형성하고 있어, 3인산기 부분의 인식에 중요한 역할을 하고 있다.
(18-8) H0041L1088과 hIL6R의 상호작용
이번의 결정 구조를 기초로, H0041L1088 Fab 혹은 ATP의 어느 것인가로부터 4.2Å 이내의 거리에 위치하는 비수소 원자를 1개 이상 포함하는 shIL6R의 아미노산 잔기가 에피토프 잔기로서 선택되고, 그것을 shIL6R의 아미노산 서열 상에 나타냈다(도 85). 이들 에피토프 잔기와 당해 항체의 상호작용의 상세는 도 86 및 도 87에 나타나고, 이들 에피토프 잔기는, 당해 항체의 경쇄CDR1: D27B, G28, D29, A31, Y32, CDR3: R91, S92, P93, G94, P95나 중쇄 CDR2: H56, Y58, CDR3: L98, Y99, N100B, W100C와 같은 잔기와 반데르발스 상호작용이나 수소 결합, 정전 상호작용 등을 형성하여, 당해 항체와 강고하게 결합하고 있다.
(18-9) ATP 의존적인 항원 결합 기구에 대해
또한, 도 86 및 도 87에 나타내듯이, H0041L1088 Fab와 shIL6R의 결합에 있어서는, H0041L1088 Fab에 결합하는 ATP와 shIL6R의 F298의 사이에 큰 분자간 접촉이 형성되고 있다. ATP 비결합 상태에서는 본 상호작용은 없어지므로, 이 H0041L1088 Fab에 결합하는 ATP와 항원의 직접적인 상호작용이, ATP 의존적 결합의 큰 요인이라고 추측된다. 또한, 구조적으로 봐서, ATP는 중쇄 CDR3 잔기와의 수소 결합이나 반데르발스 상호작용을 개재시켜, 중쇄 CDR3의 구조 안정화에 기여하고 있다고 생각된다. ATP 결합에 의해 중쇄 CDR3 구조가 항원과의 결합형으로 안정화 되는 것은, 중쇄 CDR3: L98이나 Y99 등과 shIL6R의 직접 상호작용의 실질적인 강화로 연결되어, ATP 의존적 결합의 요인이 되고 있다고 생각된다.
실시예 19: 개변된 항CD137 항체에 의한 아고니스트 활성의 증강
(19-1) 평가용 항체의 조제
FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역에, pI를 상승시키기 위한 각종 아미노산 개변을 도입했을 경우에 있어서의, 당해 아미노산 개변의, CD137 아고니스트 활성에의 영향, 및 hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스에 있어서의 혈장중 동태와 약효에의 영향이 평가되었다. 우선, 실시예 7-1, 실시예 7-2 및 실시예 7-3에 기재대로, A375-MY201aPh/B167-Lamlib, A375-SCF041aPh/B167-Lamlib, A375-SCF057aPh/B167-Lamlib 및 IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0이 조제되었다.
(19-2) 개변된 항인간 CD137 항체의, 4-1BB Jurkat 리포터 진 어세이를 이용한 in vitro에 있어서의 ATP 의존적인 CD137 아고니스트 활성의 평가
FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역에, pI를 상승시키기 위한 각종 아미노산 개변을 도입했을 경우에 있어서의, 당해 아미노산 개변이 CD137 아고니스트 활성에 주는 영향을 평가하기 위해, A375-MY201aPh/B167-Lamlib, A375-SCF041aPh/B167-Lamlib, A375-SCF057aPh/B167-Lamlib, 및 IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0의 CD137 아고니스트 활성이 평가되었다.
제작된 항체의 In vitro 활성 측정에는, GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line(Promega, CS196004)이 이용되었다. 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 5×104/mL로 농도가 조제된 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 200μL씩 가해지고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 하룻밤 정치되었다. 배지로는 CHO culture medium(90% Ham's F12, 10% FBS)이 이용되었다. 다음에, 배지가 모두 흡인 제거된 후, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line이 각 웰에 대해서 25μL 가해졌다. 계속하여, 최종 농도가 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL가 되도록 Assay medium으로 희석된 각 항체 용액이 각각 25μL 가해졌다. 마지막으로, 최종 농도가 250μM이 되도록 Assay medium으로 희석된 ATP 용액이 25μL 가해졌다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 75μL씩 가해졌다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값이 상대 발광량으로 되고, 각 항체의 CD137 아고니스트 활성을 평가하는 지표로 되었다.
결과를 도 88에 나타낸다. 이 결과로부터, pI를 상승시키기 위한 각종 아미노산 개변을 도입하는 것에 의해, CD137 아고니스트 활성이 상승함이 나타났다.
(19-3) 개변된 항인간 CD137 항체의 마우스에서의 동태 평가
(19-3-1) hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스의 제작
우선, 마우스 배성 줄기세포(ES 세포)에, 마우스 Cd137을 표적으로 하는 Zinc Finger Nuclease(ZFN)와 함께 인간 CD137 유전자 치환 벡터를 도입하는 것에 의해, 마우스 Cd137 유전자를 인간 CD137 유전자로 치환한 인간 CD137 노크인 마우스가 제작되었다. 다음에, 마우스 Fcgr2b 유전자를 타겟으로 하는 ZFN mRNA를 마우스 수정란에 현미(顯微) 주입하고, 표적 영역에 변이가 도입된 개체를 선별하는 것에 의해, 마우스 Fcgr2b 녹아웃 마우스가 제작되었다. 추가로, 인간 FCGR2B 유전자가 클로닝된 BAC vector를 마우스 수정란에 현미 주입하고, 이것에 의해 얻어진 개체로부터 인간 FCGR2B 유전자 게놈 영역이 도입된 개체를 선발하는 것에 의해, 인간 FCGR2B 트랜스제닉 마우스가 제작되었다(Iwayanagi. et al., J Immunol, 2015, 195, 3198-3205).
이들 3계통의 마우스를 교잡하는 것에 의해, 인간 CD137 노크인 Fcgr2b 녹아웃·인간 FCGR2B 트랜스제닉 마우스가 수립되었다. 이 마우스를 hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스라고 기재한다.
(19-3-2) hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스 모델에 있어서의 혈장 중의 항인간 CD137 항체 농도의 측정
CD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스에, 각 항인간 CD137 항체가, 표 71대로 단회 정맥내 투여되었다. 투여 후 5분후로부터 28일 후에 걸쳐, 경시적으로 복수회 혈액이 채취되었다. 얻어진 혈액은 원심되고, 혈장이 분리되었다. 혈장은 측정까지 -20℃ 이하로 설정된 냉각기에 보존되었다.
Figure pct00071
혈장 중의 각 항인간 CD137 항체의 농도는, 전기화학발광(ECL)법으로 측정되었다. hCD137(Sino Biological Inc.)은, PBS(-)로 희석되어, MULTI-ARRAY 96-well Plate(Meso Scale Diagnostics, LLC)에 첨가되었다. hCD137이 첨가된 플레이트는, 실온에서 1시간 진탕되어, hCD137은 플레이트에 고상되었다. 그 후 블로킹을 위해, 1mM ADP, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액이 첨가되어, 실온에서 1시간 진탕되었다. 각 항인간 CD137 항체의 검량선은, 혈장중 농도로서 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10ng/mL로 조제되었다. hCD137 고상 플레이트에 1mM ADP, 1% BSA, 0.05% Tween20 함유 PBS 용액으로 희석된 혈장 샘플 및 검량선 시료가 첨가되었다. 그 후, 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 이들 항인간 CD137 항체의 정상 영역을 특이적으로 인식하는 WO2019112027에 기재된 항체가, 2차 항체로서 첨가되었다. 추가로, 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, SULFO-TAG Labeled Goat Anti-Rabbit Antibody(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 첨가되었다. 추가로, 당해 플레이트는 실온에서 1시간 진탕된 후, 1mM ADP를 함유하는 2배 희석한 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics, LLC)가 가해졌다. 마우스 혈장 중의 각 항체 농도의 측정은, SULFO-TAG를 SECTOR Imager(Meso Scale Diagnostics, LLC)를 이용하여 검출하는 것에 의해 행해졌다. 마우스 혈장 중의 각 항체 농도의 산출은, SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 이용하여 행해졌다.
결과를 도 89에 나타낸다. A375-SCF041aPh/B167-Lamlib는, A375-MY201aPh/B167-Lamlib보다 빠른 소실을 나타냈다. 이것은, A375-SCF041aPh/B167-Lamlib의 중쇄 정상 영역에 pI를 상승시키는 아미노산 개변이 도입되고 있기 때문이라고 생각되었다.
(19-4) 개변된 항인간 CD137 항체의 마우스에서의 약효 평가
(19-4-1) 세포주 및 동계 종양주 이식 마우스 모델의 제작
세포는, 마우스 폐암 세포 유래 세포주 LLC1［LL/2 (별명: LLC1), 판매원: ATCC, 카탈로그 번호: CRL-1642］에 대해서, 닭 ovalbumin(OVA)의 발현 플라스미드 및 인간 Glypican-3(GPC3)의 발현 플라스미드를 도입한 LLC1/OVA/GPC3 clone C5(LLC1/OVA/GPC3) 세포주가 사용되었다. 마우스는, 상기 (19-3-1)에 기재된 hCD137KI/mFcγR2bKO/hFcγR2bTg#90 마우스(11주령, 암컷)가 사용되었다. LLC1/OVA/GPC3 세포주는 9.8% Fetal Bovine Serum(Sigma-Aldrich, Co. LLC.), 0.44mg/mL G418(Nacalai Tesque, Inc.) 및 0.88mg/mL Zeocin(Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 포함하는 RPMI1640 배지(Sigma-Aldrich, Co. LLC.)에서 유지 계대되었다. LLC1/OVA/GPC3 세포주는 마우스의 복부 피하에 이식되고, 종양 체적이 대략 250-500mm3가 된 시점에서 모델 성립으로 했다. 모델 성립 후, LLC1/OVA/GPC3 세포주 이식 마우스는 군나누기가 실시된 후에, Vehicle 및 각 항인간 CD137 항체가 투여되었다.
(19-4-2) 투여 약제의 조제와 투여 및 종양 측정
LLC1/OVA/GPC3 세포주 이식 모델에 대해, 표 72에 나타난 용량이 되도록 0.05% Tween 20 함유 PBS에 의해 조제된, A375-MY201aPh/B167-Lamlib 또는 A375-SCF041aPh /B167-Lamlib가, 종양 이식 후 11일째 및 14일째에 투여되었다. Vehicle군에는, 0.05% Tween 20 함유 PBS가 투여되었다. 조제한 투여액은, 10mL/kg의 용량으로 꼬리 정맥으로부터 투여되었다.
LLC1/OVA/GPC3 세포주 이식 모델에서의 항종양 효과 측정
Figure pct00072
항종양 효과 평가를 위해, 종양 체적 측정은 주1-2회의 빈도로 실시되었다. 또한, 종양 체적은 이하의 계산식으로 산출되었다.
종양 체적(mm3) = 장경(mm)×단경(mm)×단경(mm)/2
그 결과, 실시예(19-3-2)의 결과로부터, A375-SCF041aPh/B167-Lamlib 투여 마우스에 있어서의 혈중 농도 추이는, A375-MY201aPh/B167-Lamlib와 비교하여 낮아짐에도 불구하고, A375-SCF041aPh/B167-Lamlib는 A375-MY201aPh/B167-Lamlib보다도 강한 항종양 효과가 관찰되었다(도 90).
이상의 결과로부터, 중쇄 정상 영역에 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 도입하는 것에 의해, 본 마우스 모델에 있어서, 항인간 CD137 항체의 항종양 효과가 향상됨이 나타났다.
실시예 20: 개변된 항인간 CD3 항체에 의한 아고니스트 활성의 증강
FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역에, pI를 상승시키기 위한 아미노산 개변을 조합하는 것에 의한, 항CD3 항체의 아고니스트 활성의 향상이 검토되었다.
실시예 7-1에서 제작된 FcγRIIb에의 결합 활성을 상승시킨 중쇄 정상 영역인, MY201aPh 및 MY201aPh에 대해서, pI를 상승시키기 위한 아미노산 개변인 Q311R/P343R을 도입한 SCF057aPh가 이용되었다. 또한, 천연형 인간 IgG1의 정상 영역으로서 G1T6(서열 번호: 223)이 이용되었다. 항인간 CD3 항체의 중쇄 가변 영역으로서 TR01H113(서열 번호: 224)을, 중쇄 정상 영역으로서 MY201aPh, SCF057aPh, 또는 G1T6을, 경쇄로서 L0011-k0(서열 번호: 225)을 갖는, 각 항인간 CD3 항체가 제작되었다. 음성 대조로서는 IC17HdK-MY201aPh/IC17L-k0이 이용되었다.
제작된 항체의 In vitro 활성 측정에는, T cell activation Bioassay(NFAT) (Promega, CS176401)가 이용되었다. 96웰 플레이트의 각 웰에, 배지에 의해 5×104/mL로 농도를 조제한 FcγRIIB CHO-K1 Cells(Promega)가 200μL씩 가해지고, 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 하룻밤 정치되었다. 배지로는 CHO culture medium(90% Ham's F12, 10% FBS)이 이용되었다. 다음에, 배지가 모두 흡인 제거된 후, Assay medium(99% RPMI, 1% FBS)으로 2×106/mL로 조제된 NFAT-RE-Luc2 cells가 각 웰에 대해서 25μL 가해졌다. 계속하여, 최종 농도가 0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10μg/mL가 되도록 Assay medium으로 희석된 각 항체 용액이 각각 25μL 가해졌다. 플레이트는 5% CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 6시간 정치된 후, 실온에서 15분 정치되고, 각 웰에 Bio-Glo reagent가 75μL씩 가해졌다. Bio-Glo reagent로는 Bio-Glo Luciferase Assay System(Buffer and Substrate)이 사용되었다. 그 후, 각 웰의 발광량이 플레이트 리더로 측정되었다. 각 웰의 발광의 값을 항체 미첨가 웰의 발광의 값으로 나눈 값을 상대 발광량으로 하여, 각 항체의 CD3 아고니스트 활성을 평가하는 지표로 했다.
결과를 도 91에 나타낸다. 천연형 인간 IgG1의 정상 영역을 갖는 TR01H113-G1T6/L0011-k0과 비교하여 FcγRIIb에의 결합이 증강된 TR01H113-MY201aPh/L0011-k0은 보다 높은 CD3 아고니스트 활성을 나타냈다. 또한 pI를 상승시키는 아미노산 개변을 도입한 TR01H113-SCF057aPh/L0011-k0은 아미노산 개변 도입 전의 TR01H113-MY201aPh/L0011-k0과 비교하여 보다 높은 CD3 아고니스트 활성을 나타냈다.
본 개시의 항CD137 항원 결합 분자, 및 그들을 사용하는 방법은, 면역 세포의 활성화 작용, 세포 상해 활성, 또는 항종양 활성을 가지면서, 정상 조직 등의 비종양 조직에 대한 작용이 낮아, 부작용이 적은 의약의 개발, 제조, 제공, 사용 등에 있어서 이용 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Anti-CD137 antigen-binding molecules and uses thereof <130> C1-A1821P <150> JP 2018-152126 <151> 2018-08-10 <160> 225 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp 1 5 10 15 Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser 20 25 30 Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly 35 40 45 Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys 50 55 60 Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys 65 70 75 80 Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys 85 90 95 Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg 100 105 110 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly 115 120 125 Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly 145 150 155 160 His Ser Pro Gln <210> 3 <211> 256 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln 20 25 30 Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro 35 40 45 Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys 50 55 60 Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr 65 70 75 80 His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro 85 90 95 Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr 100 105 110 Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn 115 120 125 Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg 130 135 140 Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu 165 170 175 Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe 195 200 205 Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln 210 215 220 Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser 225 230 235 240 Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu 245 250 255 <210> 4 <211> 165 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg 1 5 10 15 Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser 20 25 30 Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr 35 40 45 Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu 50 55 60 Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu 65 70 75 80 Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr 85 90 95 Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg 100 105 110 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly 115 120 125 Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser 130 135 140 Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His 145 150 155 160 Ser Leu Gln Val Leu 165 <210> 5 <211> 254 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 5 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg 195 200 205 Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 210 215 220 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 225 230 235 240 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 <210> 6 <211> 165 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 6 Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp 1 5 10 15 Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser 20 25 30 Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly 35 40 45 Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys 50 55 60 Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys 65 70 75 80 Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys 85 90 95 Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg 100 105 110 Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly 115 120 125 Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly 145 150 155 160 His Ser Pro Gln Ile 165 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 7 Thr Phe Thr Met Asn 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 8 Ser Ile Ser Ser Lys Ser Thr Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 9 Ser Ile Ser Ser His Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 10 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 11 Ser Ile Ser Ser Lys Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 12 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 12 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 13 Ser Ile Ser Ser Lys Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 14 Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Glu Gln Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 15 Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Glu Ser Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 16 Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 17 Tyr Gly Ala Lys Asn Phe Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 18 Tyr Gly Pro Lys Asn Glu Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 19 Tyr Gly Lys Lys Asn Glu Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 20 Tyr Gly Ile Lys Asn Glu Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 21 Thr Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Glu Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 22 Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 23 Thr Gly Thr Arg Thr Asp Val Gly Phe Tyr Glu Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 24 Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr Glu Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 25 Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Tyr Tyr Glu Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 26 Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 27 Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu His Gln Val Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 28 Ser Ser Tyr Arg Tyr Pro His Ile Val Ser 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 29 Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu Ala Gln Val Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Lys, His or Ser <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Ser or Gly <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be Thr or Ser <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can Glu or Tyr <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa can be Asp or Glu <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa can be Ser or Gln <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa can be Val, Gly or Leu <400> 30 Ser Ile Ser Ser Xaa Xaa Xaa Tyr Ile Xaa Tyr Ala Xaa Xaa Phe Lys 1 5 10 15 Xaa <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be Ala, Pro, Lys or Ile <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Phe or Glu <400> 31 Tyr Gly Xaa Lys Asn Xaa Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa can be Arg or Ser <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Tyr or Thr <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> Xaa can be Tyr or Phe <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be Glu or Asn <400> 32 Thr Gly Thr Xaa Xaa Asp Val Gly Xaa Tyr Xaa Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be Glu or Pro <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa can be His or Ala <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be Gln or Ile <400> 33 Ser Ser Tyr Arg Tyr Xaa Xaa Xaa Val Ser 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 34 Ser Ile Ser Ser Arg Ser Asn Tyr Lys Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 36 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 36 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 37 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 38 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 39 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 39 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 40 Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 41 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 41 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Val Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 42 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 43 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 43 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Ser Thr Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Lys Asn Phe Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 44 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser His Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Lys Asn Phe Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 45 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 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Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Ser Thr Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Pro Lys Asn Glu Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Asp Ser Phe 50 55 60 Lys Leu Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 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synthesized sequence <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Glu Gln Phe 50 55 60 Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Lys Lys Asn Glu Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Glu Ser Phe 50 55 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Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Lys Gly Ser Tyr Ile Glu Tyr Ala Glu Gln Phe 50 55 60 Lys Val Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ala Lys Asn Phe Leu Asn Trp Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 54 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr 20 25 30 Glu Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu 85 90 95 His Gln Val Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 55 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 55 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu 85 90 95 His Gln Val Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 56 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 56 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr 20 25 30 Glu Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Tyr Pro 85 90 95 His Ile Val Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 57 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 57 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr 20 25 30 Glu Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu 85 90 95 Ala Gln Val Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 58 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 58 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Arg Thr Asp Val Gly Phe Tyr 20 25 30 Glu Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu 85 90 95 His Gln Val Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 59 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 59 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Thr Asp Val Gly Phe 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Gly Lys 325 <210> 221 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 370 375 <210> 222 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 223 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G1T6 <400> 223 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 224 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TR01H113 <400> 224 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Gln Asn Tyr Ala Thr Tyr Val Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Ala Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Ile Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Tyr Val His Tyr Ala Ala Gly Tyr Gly Val Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 225 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L0011-k0 <400> 225 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Pro Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (13)

  1. 저분자 화합물에 의존한 CD137 결합 활성을 갖는, 항CD137 항원 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    10μM, 50μM, 100μM, 150μM, 200μM, 또는 250μM의 저분자 화합물의 존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성이, 당해 저분자 화합물의 비존재하에서의 CD137에 대한 결합 활성과 비교하여, 2배 이상 높은, 항CD137 항원 결합 분자.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    이하의 (a) 내지 (k)로부터 선택되는 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, 및 HVR-H3의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
    (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (b) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (c) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (e) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (f) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (g) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (h) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3;
    (j) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; 및
    (k) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
  4. 이하의 (a) 내지 (m)으로부터 선택되는 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2, HVR-H3, HVR-L1, HVR-L2, 및 HVR-L3의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
    (a) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (b) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (c) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 22의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (d) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (e) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (f) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (g) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (h) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (i) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (j) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (k) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (l) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; 및
    (m) 서열 번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 서열 번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 번호: 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 번호: 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3.
  5. (a) 서열 번호: 43 내지 53 중 어느 1개의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VH; 또는
    (b) 서열 번호: 54 내지 60 중 어느 1개의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 VL을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    개변 Fc 영역을 포함하고, 당해 개변 Fc 영역이, 이하로부터 선택되는 어느 1개의 아미노산 개변의 조합을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자:
    L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
    K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R/D413K;
    L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/P343R/D413K;
    L234Y/P238D/V264I/A330K/P343R/D413K;
    L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/P343R/D413K;
    L234Y/G237D/P238D/A330K/P343R/D413K;
    L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R/P343R;
    L234Y/P238D/T250V/V264I/T307P/A330K/Q311R/P343R;
    L234Y/P238D/V264I/A330K/Q311R/P343R;
    L234Y/G237D/P238D/T250V/T307P/A330K/Q311R/P343R;
    L234Y/G237D/P238D/A330K/Q311R/P343R;
    L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
    K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/P343R;
    L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/D413K;
    K214R/G236N/H268D/A330K/P343R;
    K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R;
    K214R/G236N/H268D/A330K/D413K;
    K214R/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
    K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/P343R/D413K;
    K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R;
    K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R;
    K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
    K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/P343R;
    K214R/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K;
    K214R/L235W/G236N/H268D/A330K/Q311R/D413K; 및
    K214R/L235W/G236N/H268D/Q295L/K326T/A330K/Q311R.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 64 내지 85 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역을 포함하는, 항CD137 항원 결합 분자.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 항CD137 항원 결합 분자를 코딩하는, 단리된 핵산.
  9. 제 8 항에 기재된 핵산이 도입된 벡터.
  10. 제 8 항에 기재된 핵산, 또는 제 9 항에 기재된 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  11. 항CD137 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, 항CD137 항원 결합 분자가 제조되도록 제 10 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 및 세포 상해제를 포함하는, 이뮤노컨주게이트.
  13. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 항CD137 항원 결합 분자 혹은 제 12 항에 기재된 이뮤노컨주게이트; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 제제.
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