CN110964043B

CN110964043B - 一种瓜氨酸探针化合物及其应用

Info

Publication number: CN110964043B
Application number: CN201911225510.8A
Authority: CN
Inventors: 张静
Original assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-12-02
Filing date: 2019-12-02
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2039-12-02
Also published as: CN110964043A

Abstract

本发明公开了一种化合物，如式2‑GBA、2‑GBA‑1、2‑GBA‑N3、2‑GBA‑N3‑1、2‑GBA‑Biotin或2‑GBA‑Biotin‑1所示。本发明所述2‑GBA所示化合物可以与瓜氨酸在中性条件下反应，即它可以像抗体一样清除瓜氨酸的蛋白；通过在这个2‑GBA所示化合物的母核上进行叠氮和炔基取代，通过click反应引入生物素和荧光素，制得的2‑GBA‑Biotin所示化合物可以实现对瓜氨酸化蛋白的标记和检测。本发明还公开了该化合物的应用。

Description

一种瓜氨酸探针化合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种化学生物检测技术领域，具体涉及一种瓜氨酸探针化合物及其应用。

背景技术

蛋白质的翻译后修饰是蛋白功能的一种表观遗传学调控方式，在细胞的生命活动中有着重要的意义。其中，精氨酸作为一种重要的氨基酸，目前已知的翻译后修饰主要有三种：甲基化(methylation)修饰、去甲基化(demethylation)修饰和瓜氨酸化(citrullination)修饰。如图1所示，蛋白质上精氨酸残基的瓜氨酸化修饰主要是指在肽酰基精氨酸脱亚氨酶(Peptidylarginine Deiminases，PAD，又名Protein ArginineDeiminase)催化下，由带有正电的胍基官能团转变为电中性的脲官能团，也就是精氨酸残基转化为瓜氨酸残基的一种过程。

目前普遍认为，蛋白质瓜氨酸化水平的异常与多种疾病相关，包括癌症、阿尔茨海默病和各种自身免疫性疾病，尤其以类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)的研究较多。就其原因，则有可能是由于侧链带正电的精氨酸残基被转化为中性的瓜氨酸残基，使精氨酸参与的一些蛋白分子内(间)相互作用遭到破坏，从而改变蛋白构象、蛋白与其他蛋白的相互作用等，使得正常的下游信号传导受扰。而具体的针对RA来说，目前大部分的研究认为，RA患者滑膜组织内的肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)高表达，引起蛋白质瓜氨酸化水平升高，继而引发机体自身免疫反应，产生多种抗瓜氨酸化蛋白的自身抗体，引发炎症反应和对骨、软骨、滑膜等组织的损伤，是诱导类风湿性关节炎发生的重要原因。因此，患者血清中的抗瓜氨酸化蛋白的自身抗体，比如抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(抗MCV)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)，被认为是类风湿性关节炎的早期诊断生物标志物。除此之外，Akihito检测到阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者的海马组织中含有各种不同分子量的瓜氨酸蛋白而正常人中没有，强烈表明瓜氨酸化蛋白在人类神经性疾病的发生和发展中起着重要的作用。

肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)是催化蛋白质瓜氨酸化的关键酶。因此，通过PAD抑制剂抑制PAD酶的活性，降低蛋白质瓜氨酸化修饰水平，是目前治疗类风湿性关节炎的一种新的途径。PAD家族共有5种成员，其中以PAD4为靶点的研究最为广泛。例如，早在2011年，一个经典的PAD4抑制剂Cl-amidine被证实可以显著降低胶原诱导的关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的血清中的蛋白瓜氨酸化水平，并且能够缓解CIA诱导的关节炎小鼠的发病进程。在2017年，另一个PAD4抑制剂GSK199，也被报道具有类似的效果。这些都证实了PAD4作为一个抗类风湿性关节炎靶点的有效性。除此之外，最近的研究也发现PAD4酶在肿瘤的患者中高度表达，暗示了蛋白瓜氨酸化和肿瘤之间的联系，故以PAD4为靶点的化合物也展现出了一定的抗肿瘤活性。

目前，在蛋白质瓜氨酸化研究领域有以下几个亟待解决的问题，他们的概述如下：

1)寻找瓜氨酸化的蛋白。目前我们知道，生物体内有许多蛋白都可能被瓜氨酸化并且产生生物效应。但是，现在并不明确，哪些蛋白会被瓜氨酸化，而瓜氨酸化之后它们的命运又如何。这就需要高选择性的瓜氨酸化标记方法。

2)蛋白瓜氨酸化的检测方法。无论是开发肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)抑制剂，还是研究瓜氨酸化的疾病模型，都需要在细胞水平或蛋白水平精确检测蛋白的瓜氨酸化水平，但是目前的蛋白瓜氨酸化的检测方法还存在许多缺陷。

3)有效的清除瓜氨酸化蛋白的方法。在蛋白瓜氨酸化相关的疾病(尤其是类风湿性关节炎)的治疗上，目前的一个新的途径是使用肽酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)抑制剂。但是PAD抑制剂主要是抑制PAD酶产生新的瓜氨酸化蛋白，但对已经瓜氨酸化蛋白则不起作用。因此，需要一种更快速清除已有的瓜氨酸化蛋白的方法。

总的说来，这三个问题都需要对瓜氨酸残基进行有效地标记和捕捉。但是，由于瓜氨酸上的脲官能团是一个非常惰性的基团，而且从精氨酸到瓜氨酸的分子量变化也较小，因此对瓜氨酸化修饰的检测仍然面临很多的挑战。目前，常见的蛋白瓜氨酸化的标记和检测方法主要有COLDER(color development reagent assay)法、抗体检测法和荧光检测法。它们的概述如表1所示。

表1已报道的蛋白瓜氨酸化水平的标记和检测方法

COLDER法是目前筛选PAD抑制剂的主要方法。它的原理是在强酸、加热(95℃)和铁催化下，脲官能团能和2，3-丁二酮单肟反应生成有颜色的咪唑啉酮类化合物。但是，该检测体系的反应条件太过剧烈、易出现假阳性结果，只能用于检测，不能用于标记瓜氨酸化蛋白。

抗体检测无疑是灵敏度较高的一种方法，这种方法的局限主要是抗体制备困难、检测步骤较多等，这种方法也不能用于标记瓜氨酸化蛋白。

酸催化的缩合反应是目前唯一一种可同时用于检测和选择性标记瓜氨酸的化学方法，标记反应见图2反应式。它的主要原理是苯乙二醛类化合物在强酸性条件下(20％三氯乙酸，或者pH<1)，选择性地与瓜氨酸发生反应。这类方法已经被用于标记瓜氨酸化蛋白，再结合质谱方法可以鉴定瓜氨酸化蛋白的序列。尽管这些研究对我们了解瓜氨酸化蛋白有很大的帮助，但是强酸性的反应条件仍然是一个巨大的问题，这极大的阻碍了这些探针的应用。强酸性条件带来的主要问题有：1)由于该标记反应必须在强酸性条件下进行，使其只能用于单个蛋白、或者细胞裂解液，无法应用于细胞内；2)相当一部分的荧光基团是pH敏感性的，强酸性的反应条件使得苯乙二醛类化合物与荧光基团联合应用于瓜氨酸的检测效果不佳。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种瓜氨酸探针化合物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种化合物，如式2-GBA、2-GBA-1、2-GBA-N3、2-GBA-N3-1、2-GBA-Biotin或2-GBA-Biotin-1所示：

或其游离碱形式、游离酸形式、药学上可接受的盐、前药和溶剂合物。

硼酸基团是一种特殊的化学基团，它有很好的配位能力。之前有报道称，如果苯甲醛或苯乙酮的邻位含有硼酸取代基时，当羰基与伯胺反应时，硼酸可以通过形成B-N配位键将不稳定的希夫碱稳定，加速缩合反应的速率。基于此，发明人将硼酸加在苯乙二醛官能团的邻位，并通过分子内关环形成内酯，并通过验证认为该化合物有可能加快与瓜氨酸的反应速率，使其能够在中性条件下反应，从而克服之前的苯乙二醛方法的局限，可用于标记鉴定、检测和清除蛋白瓜氨酸化蛋白。

化合物2-GBA(2-glyoxal benzeneboronic acid cyclic monoester，2-乙二醛-苯硼酸环单酯)本身可以与瓜氨酸在中性条件下反应，即它可以像抗体一样清除瓜氨酸化的蛋白。进一步地，通过在这个2-GBA所示化合物的母核上进行叠氮取代，制备得到化合物2-GBA-N3。通过该N3基团，该母核可以方便地用Click反应连接其他基团(如荧光基团或生物素等)，使该类化合物具有新的功能，如实现对瓜氨酸化蛋白的标记、富集、捕捉和检测等；再进一步地，通过click反应在母核引入生物素，制得的2-GBA-Biotin所示化合物可以实现对瓜氨酸化蛋白的标记和检测。

本发明的目的还在于提供上述化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

在式(Ⅰ)所示化合物中加入I₂、DMSO和H₂O的混合液中，在50～150℃反应，即得式2-GBA所示化合物；

2-GBA性质稳定，在PBS中加热到37℃3小时以上都不会分解。优选地，所述化合物I和I₂的摩尔数之比为：化合物I：I₂＝1：1～3，更优选为1:1.5；溶剂为DMSO和H₂O的混合液。

本发明的目的还在于提供上述化合物在制备标记或检测瓜氨酸试剂中的应用。

本发明的目的还在于提供一种瓜氨酸探针，所述瓜氨酸探针包含上述所述化合物。

本发明的目的还在于提供上述所述化合物在制备瓜氨酸检测试剂盒中的应用。

本发明的目的还在于提供一种瓜氨酸检测试剂盒，所述试剂盒包含所述化合物。

更进一步地，所述试剂盒还包含荧光染料。

本发明的目的还在于提供一种瓜氨酸的检测方法，所述检测方法以下步骤：在待测样品中加入权利要求1所述化合物或在权利要求1所述化合物上引入生物素基团和/或化学发光基团的化合物，孵育，染色，检测分析待测样品。

本发明的目的还在于提供上述所述化合物在制备降低蛋白质瓜氨酸化水平、降低抗瓜氨酸抗体水平或治疗蛋白质瓜氨酸化水平升高引起的疾病的药物中的应用。

进一步地，所述疾病为类风湿性关节炎、阿尔茨海默病或肿瘤。

本发明的目的还在于提供一种降低蛋白质瓜氨酸化水平、降低抗瓜氨酸抗体水平或治疗蛋白质瓜氨酸化水平升高引起的疾病的药物，所述药物包含上述所述化合物。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种化合物，本发明所述2-GBA或2-GBA-1所示化合物可以与瓜氨酸在中性条件下反应，即它可以像抗体一样清除瓜氨酸的蛋白；通过在这个2-GBA或2-GBA-1所示化合物的母核上进行叠氮和炔基取代，通过click反应引入生物素和荧光素，制得的2-GBA-Biotin或2-GBA-Biotin-1所示化合物可以实现对瓜氨酸化蛋白的标记和检测。本发明还提供了该化合物的应用。

附图说明

图1为PAD介导的蛋白瓜氨酸化过程；

图2为苯乙二醛类化合物与瓜氨酸的标记反应式；

图3为式(Ⅰ)所示化合物与瓜氨酸的标记反应式；

图4为化合物2-GBA-1的X-射线单晶衍射图；

图5为2-GBA所示化合物或苯乙二醛与2-GBA所示化合物或苯乙二醛在中性条件下反应后反应混合液的NMR对比图；

图6为2-GBA和Fmoc-L-瓜氨酸的不同反应时间的HPLC对比图；

图7为第一组、第二组、第三组和第四组在不同反应时间点的¹H NMR图；

图8为转化率和时间的关系图；

图9为2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃(序列：Ac-SGCitGKGGKGLGKG-NH₂)的反应液的HPLC对比图；

图10为2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃反应液的质谱对比图，其中，上图为2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃反应液的质谱图；下图为多肽的质谱图；

图11为2-GBA-Biotin对细胞的染色图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

化合物2-GBA的合成

将2-乙酰基苯硼酸(100mg，0.6mmol)溶解在10mL DMSO/H₂O(1：1)的混合溶剂中，随后加碘单质(228mg，0.9mmol)，加热至100℃反应3小时。停止搅拌，取下反应，用0.2M的硫代硫酸钠水溶液淬灭，再用40mL乙醚萃取三次，将有机相合并，用饱和NaCl水溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥。在旋转蒸发仪上将溶剂旋干，得到黄色固体粗品。用水重结晶，得到56mg黄色纯品，产率为51％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,D₂O/CD₃CN＝5:1)δ/ppm:7.97-7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.86-7.85(d,J＝7.2Hz,1H),7.80-7.76(m,1H),7.71-7.67(m,1H),5.62(s,1H)；¹H NMR(400MHz,d₆-DMSO)δ/ppm:9.23(s,1H),7.91-7.87(m,2H),7.79-7.69(m,2H),7.64-7.62(d,J＝7.6Hz,1H),5.42-5.40(d,J＝7.6Hz,1H)；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ/ppm:7.95-7.93(d,J＝7.2Hz,1H),7.85-7.83(d,J＝6.8Hz,1H),7.73-7.64(m,2H),5.25(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,d₆-DMSO)δ/ppm:195.6,137.4,134.5,133.5,132.6,126.2,92.5；低分辩质谱：MS(ESI)[M-H]⁺＝177.0.

同时，该化合物的结构也通过X-射线单晶衍射验证，见图4。值得一提的是，该化合物的核磁结构和单晶结构存在1个氢的差别(如结构式2-GBA-1所示结构)。该差别可能是由于化合物在溶液中和固体状态下不同的结构所导致。

实施例2

2-GBA-Biotin所示化合物的合成路线如下：

2-GBA-Biotin所示化合物的制备方法包括以下步骤：

(1)化合物2的制备：

将2-4二羟基苯乙酮(500mg，3.28mmol)，无水碳酸钾(681mg，4.92mmol)和1,2-二溴乙烷(924mg，4.92mmol)加至25mL乙腈中，加热至40℃，搅拌反应12小时。停止加热，放至室温，向其中加入50mL水，再用二氯甲烷(50mL×3)萃取，收集合并有机相。依次用H₂O、饱和NaCl水溶液各洗一次，再加无水Na₂SO₄干燥，过滤后经减压旋蒸得到白色粉末状固体粗品。用200～300目硅胶柱层析分离纯化[洗脱剂为V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝15：1]，得到白色固体纯品463mg，产率为55％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm:12.71(s,1H),7.65-7.63(d,J＝8.4Hz,1H),6.47-6.45(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.39(d,J＝2.4Hz,1H),4.33-4.29(t,J＝6.4Hz,2H),3.66-3.63(t,J＝6.4Hz,2H),2.55(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ/ppm:202.7,165.1,164.4,132.5,114.3,107.7,101.5,67.8,28.5,26.3；低分辩质谱：MS(ESI)[M-H]^-＝258.1；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₁₀H₁₁BrO₃:258.9970,found:258.9966.

(2)化合物3的制备：

称取化合物2(200mg，0.78mmol)于20mL DMSO中，再向其中加叠氮化钠(76mg，1.17mmol)，将反应液加热至80℃，搅拌反应1小时。随后停止搅拌，冷却至室温，向其中加入30mL水，再用二氯甲烷(30mL×3)萃取，水相用次氯酸钠溶液淬灭后丢弃，收集合并有机相。用饱和NaCl水溶液洗一次，再加无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋干，得到黄色液体纯品170mg，产率为99％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm:12.74(s,1H),7.67-7.65(d,J＝8.8Hz,1H),6.50-6.47(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.42(d,J＝2.4Hz,1H),4.19-4.17(t,J＝6.0Hz,2H),3.64-3.62(t,J＝6.0Hz,2H),2.57(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ/ppm:202.8,165.0,164.5,132.5,114.3,107.7,101.5,67.1,49.9,26.3；低分辩质谱：MS(ESI)[M+H]⁺＝221.5；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for:C₁₀H₁₁N₃O₃:222.0878；found,222.0876.

(3)化合物4的制备：

将化合物3(1750mg，7.91mmol)溶解在15mL DMF中，缓慢加入三乙胺(2400mg，23.73mmol)并且在室温搅拌。随后将N-苯基双(三氟甲磺酰)亚胺(3387mg，9.49mmol)加入反应液中，此操作慢加快搅，30分钟完成，加完之后继续反应30分钟。停止反应，向其中加入40mL水，用乙酸乙酯(40mL×3)萃取，收集有机相。依次用H₂O、5％氯化锂水溶液、饱和NaCl水溶液各洗两次，再加无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋干。粗品用200～300目硅胶柱层析分离纯化[洗脱剂为V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝10：1]，得到黄色固体纯品2600mg，产率为93％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm:7.87-7.85(d,J＝8.0Hz,1H),7.01-6.98(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H),6.85(d,J＝2.4Hz,1H),4.23-4.20(t,J＝4.8Hz,2H),3.68-3.66(t,J＝4.8Hz,2H),2.61(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ/ppm:195.1,162.1,148.4,132.8,124.7,120.2,117.0,113.8,109.5,67.8,49.8,29.2；低分辩质谱：MS(ESI)[M+H]⁺＝353.2；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₁₁H₁₀F₃N₃O₅S:354.0371；found,354.0381.

(4)化合物5的制备：

准备一个三口反应瓶，向其中加入化合物4(200mg，0.59mmol)、连硼酸频哪醇酯(360mg，1.42mmol)、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物(46mg，0.056mmol)和乙酸钠(138mg，1.68mmol)，接好回流装置，用油泵抽真空后通入氮气，再加8mL二氧六环，随后置于60℃反应12小时。将反应液在40℃下旋干，向其中加入20mL乙酸乙酯，依次用H₂O、饱和NaCl水溶液各洗一次，再加无水Na₂SO₄干燥，过滤，旋干得到黑色油状粗品。用200～300目硅胶柱层析分离纯化[洗脱剂为V(石油醚)：V(二氯甲烷)＝1：2]，得到白色固体纯品138mg，产率为93％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm:7.80-7.78(d,J＝8.4Hz,1H),6.99(d,J＝2.4Hz,1H),6.91-6.89(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.22-4.19(t,J＝5.2Hz,2H),3.63-3.61(t,J＝5.2Hz,2H),2.56(s,3H),1.44(s,12H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ/ppm:198.5,161.8,134.1,130.8,117.7,114.4,83.7,67.0,50.1,25.0.低分辩质谱：MS(ESI)[M+H]⁺＝331.6；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M-H]^-calcd for C₁₆H₂₂BN₃O₄:330.1625；found,330.1632.

(5)化合物6的制备：

将化合物5(400mg，1.2mmol和甲基硼酸(432mg，7.2mmol)溶解在12mL(二氯甲烷：甲醇＝4:1的)混合溶剂中，再加600μL三氟乙酸，室温搅拌反应24小时。随后停止反应，直接旋干。向残渣中加入1M盐酸溶液10mL，超声溶解后在40℃下旋干。残渣用200～300目硅胶柱层析分离纯化[梯度洗脱剂为V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝100：0到V(二氯甲烷)：V(甲醇)＝100：1]，得到黄色固体纯品230mg，产率为77％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ/ppm:7.72-7.70(d,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝2.4Hz,1H),6.85-6.83(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),4.29-4.27(t,J＝4.8Hz,2H),3.64-3.61(t,J＝4.8Hz,2H),2.65(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ/ppm:202.4,163.7,133.0,129.8,115.3,115.2,67.1,50.0,22.9；低分辩质谱：MS(ESI)[M-H]^-＝248.4；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M-H]^-calcd for C₁₀H₁₂BN₃O₄:248.0843；found,248.0907.

(6)化合物7的制备：

称取化合物6(80mg，0.32mmol)和碘单质(162mg，0.64mmol)溶解在6mL(二甲基亚砜：水＝1:1的)混合溶剂中，加热至80℃搅拌反应3小时。停止加热，放至室温，用0.1M硫代硫酸钠淬灭反应，立即用乙酸乙酯(40mL×3)萃取。用饱和NaCl水溶液洗涤一次，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干。粗品用二氯甲烷重结晶，得到黄白色粉末纯品18mg，产率为21％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ/ppm:7.94-7.92(d,J＝8.4Hz,1H),7.29-7.28(d,J＝2.4Hz,1H),7.20-7.17(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H),5.21(s,1H),4.27-4.25(t,J＝4.8Hz,2H),3.65-3.62(t,J＝4.8Hz,2H)；¹³C NMR(100MHz,CD₃OD)δ/ppm:191.7,163.4,130.4,128.7,119.0,116.4,98.6,67.3,49.8；低分辩质谱：MS(ESI)[M+H]⁺＝263.6；高分辨质谱：HRMS(ESI)m/z[M+H]⁺calcd for C₁₀H₁₀BN₃O₅:264.0792；found,264.0794.

(7)化合物9的制备：

将N-羟基琥珀酰亚胺生物素(100mg，0.293mmol)溶解在4mL DMF中，再加炔丙基胺(21mg，0.381mmol)，室温搅拌12小时。随后将反应停止，旋干。残渣用200～300目硅胶柱层析分离纯化[洗脱剂为V(乙酸乙酯)：V(甲醇)＝10：0到V(乙酸乙酯)：V(甲醇)＝10：1]，得到白色粉末状固体纯品80mg，产率为97％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ/ppm:4.50-4.47(m,1H),4.31-4.28(m,1H),3.94-3.93(d,J＝2.4Hz,2H),3.22-3.17(m,1H),2.94-2.90(dd,J＝12.4,4.8Hz,1H),2.71-2.66(m,1H),2.57-2.56(t,J＝2.8Hz,1H),2.23-2.19(t,J＝7.2Hz,2H),1.77-1.54(m,4H),1.47-1.40(m,2H).

(8)2-GBA-Biotin所示化合物的制备：

在氮气保护下，将化合物7(13mg，0.05mmol)和化合物9(15mg，0.05mmol)加在一圆底烧瓶中，用3mL(DMF：THF＝5:1)混合溶剂溶解，再加N,N-二异丙基乙胺(13mg，0.1mmol)和碘化亚铜(1mg，0.005mmol)，室温反应5小时。将反应旋干，残渣用水：乙腈＝1：1溶解，用C₁₈反相填料HPLC制备分离(洗脱剂为v(水)：v(甲醇)＝60：40，0.1％三氟乙酸)，得到纯品15mg，产率为55％。核磁共振：¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ/ppm:7.97-7.92(m,2H),7.28(d,J＝2.4Hz,1H),7.19-7.16(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),5.48&5.21(s,1H),4.53-4.42(m,5H),4.27-4.24(m,1H),3.66-3.56(m,1H),3.52-3.48(m,1H),3.16-3.11(m,1H),2.91-2.87(m,1H),2.69-2.66(m,1H),2.23-2.19(t,J＝8.0Hz,2H),1.72-1.50(m,4H),1.41-1.36(m,2H)；¹HNMR(400MHz,d₆-DMSO)δ/ppm:8.31-8.28(t,J＝5.6Hz,1H),8.00(s,1H),7.86-7.84(d,J＝8.8,1H),7.37-7.36(d,J＝2.4Hz,1H),7.22-7.20(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.42(m,1H),5.76&5.36(s,1H),4.80-4.77(t,J＝4.8Hz,2H),4.54-4.52(t,J＝4.8Hz,2H),4.31-4.28(m,3H),4.13-4.10(m,1H),3.10-3.06(m,1H),2.83-2.79(m,1H),2.59-2.55(m,1H),2.11-2.07(t,J＝7.6Hz,2H),1.63-1.42(m,4H),1.34-1.23(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,d₆-DMSO)δ/ppm:194.1,172.5,163.2,162.7,130.8,129.1,123.7,119.5,117.6,92.5,67.0,61.5,59.7,55.9,49.2,49.1,35.4,34.5,28.7,28.5,25.7。

实施例3

1、2-GBA所示化合物与瓜氨酸的反应：

将2-GBA所示化合物或苯乙二醛和L-瓜氨酸在中性条件反应，测试反应活性，反应条件为：2-GBA或苯乙二醛(1.1当量)和L-瓜氨酸(1.0当量)，在1X PBS和CH₃CN的混合溶液(PBS和CH₃CN的体积比为：3:1)中，在37℃下反应3h，测试反应产物(2-GBA+L-瓜氨酸和苯乙二醛+L-瓜氨酸)的1H NMR谱图，以及纯L-瓜氨酸的1H NMR谱图，见图5。从图5可以看出，2-GBA+L-瓜氨酸中，L-瓜氨酸信号峰在逐渐消失，同时有两个新的峰出现，提示有化学反应发生。而在相同条件下，苯乙二醛和瓜氨酸反应的1H NMR对比谱图则没有任何变化，这也和已有的报道保持一致，说明单纯的苯乙二醛化合物只能在酸性条件和瓜氨酸进行反应。

2、2-GBA所示化合物与Fmoc-L-瓜氨酸的反应

为了进一步测试其反应活性，我们选用了Fmoc-L-瓜氨酸为反应物，用HPLC来分析其在中性条件下的反应性能。反应条件为：2-GBA或苯乙二醛(2.8当量)与L-瓜氨酸(1.0当量)在1X PBS和MeOH的混合溶液(PBS和MeOH的体积比为：3:1)中，在37℃下反应0h、1h、2h、3h，测试结果见图6。从图6可以看出，在2-GBA和Fmoc-L-citrulline 3个小时的反应过程中，Fmoc-L-瓜氨酸的峰逐渐消失，并且有另外两个峰逐渐出现。这进一步说明了2-GBA可以在中性条件下与瓜氨酸发生反应。

3、2-GBA所示化合物对其它氨基酸的选择性

为了测试2-GBA对于其他氨基酸的选择性设置以下四组试验：

第一组的反应条件为：苯乙二醛(1.5当量)与L-瓜氨酸(1.0当量)在体积百分含量为20％的三氯乙酸水溶液中，在37℃条件下反应3h；

第二组的反应条件为：苯乙二醛(1.5当量)与L-精氨酸(1.0当量)在1X PBS和CD₃CN的混合溶液(PBS和CD₃CN的体积比为：3:1)中，在37℃条件下反应3h；

第三组的条件为：2-GBA与L-瓜氨酸(1.0当量)在1X PBS和CD₃CN的混合溶液(PBS和CD₃CN的体积比为：3:1)中，在37℃条件下反应3h；

第四组的条件为：2-GBA与L-精氨酸(1.0当量)在1X PBS和CD₃CN的混合溶液(PBS和CD₃CN的体积比为：3:1)中，在37℃条件下反应3h；

采用NMR表征，具体方法为：将氘代1X PBS是由10X PBS和D₂O按照1：9的比例稀释而成的。为了实时测量反应动力学，取2-GBA或苯乙二醛0.06mmol，L-瓜氨酸或者L-精氨酸0.04mmol，用500μL氘代1X PBS/CD₃CN(3:1)溶解，随后置于37℃水浴加热。选择不同的时间点(0,10,20,30,60,120,180min),取20μL反应液，用450μL D₂O稀释，然后立即用1H NMR监测。其中，苯乙二醛和L-瓜氨酸反应的强酸性条件是由20％三氯乙酸溶解在D₂O中配制而成的。第一组、第二组、第三组和第四组在不同反应时间点的¹H NMR图分别见图7(a)、(b)、(c)和(d)。

第一组的转化率计算公式如下：

第二组的转化率计算公式如下：

第三组的转化率计算公式如下：

第四组的转化率计算公式如下：

四组试验的转化率和时间的关系见图8。

从图8可以看出，2-GBA对于精氨酸，在反应的前半小时内，也是没有反应活性。同时，2-GBA在中性条件下的反应速率，与苯乙二醛在酸性条件下的反应速率相当，说明2-GBA对瓜氨酸有较高的选择性。

4、2-GBA对于多肽上的瓜氨酸的标记

为了验证2-GBA对瓜氨酸的反应活性，我们进一步采用了含有瓜氨酸的多肽H4(1-13)Cit₃(序列：Ac-SGCitGKGGKGLGKG-NH₂)进行反应。反应条件为：取10μL的H₄(1-13)Cit₃母液(10mM，H₂O)，20μL的2-GBA母液(100mM，乙腈)，以及70μL的1X PBS，最后成终体积为100μL的反应液。将反应液置于37℃水浴加热，在不同的时间点取样，用HPLC分析。

2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃(序列：Ac-SGCitGKGGKGLGKG-NH₂)的反应液的HPLC对比图见图9。

2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃反应液的质谱对比图见图10，其中上图为2-GBA和多肽H4(1-13)Cit₃反应液的质谱图；下图为多肽的质谱图。

从图9和图10可以看出，2-GBA能够成功地对多肽上的瓜氨酸进行标记。

实施例4

细胞标记实验采用RAW264.7细胞株。将细胞(6×10⁴cells/well)接种在24孔板中。次日用PAD抑制剂Cl-amidine(Selleck,CAS No.1043444-18-3)处理24小时。然后细胞用4％多聚甲醛固定30分钟。之后用PBS洗涤，并用1％的triton-X100破膜10分钟。将2-GBA-Biotin(5μM)加入至以上处理的细胞中，室温孵育2小时。然后用PBS洗涤，Alexa Fluor 488标记链霉亲和素(Invitrogen,Catalog No.S11223)加入其中，室温再孵育2小时。细胞核用DAPI(Invitrogen,D3571)染色，室温孵育30分钟。为了检测是否有潜在的细胞内硫醇物质的干扰，部分分组的细胞在染色之前用N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)处理。结果见图11。

图11原图为彩色图片，从该图的结果可以看出，2-GBA-Biotin可以有效地对细胞进行染色。而且，其染色效果受PAD的抑制剂Cl-amidine所抑制，不受硫醇类物质的干扰，这两者都揭示了化合物2-GBA-Biotin可以在细胞内实现对蛋白瓜氨酸化的特异性显色。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种化合物，其特征在于，如式2-GBA、2-GBA-N3或2-GBA-Biotin所示：

、

、

；

2-GBA 2-GBA-N3 2-GBA-Biotin

或其药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述化合物在制备标记或检测瓜氨酸试剂中的应用。

3.一种瓜氨酸探针，其特征在于，包含权利要求1所述化合物。

4.如权利要求1所述化合物在制备瓜氨酸检测试剂盒中的应用。

5.一种瓜氨酸检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述化合物。

6.如权利要求5所述瓜氨酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含荧光染料。

7.一种非诊断或治疗目的瓜氨酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤：在待测样品中加入权利要求1所述化合物或在权利要求1所述化合物上引入了生物素基团和/或化学发光基团的化合物，孵育，染色，检测分析待测样品。

8.如权利要求1所述化合物在制备降低蛋白质瓜氨酸化水平、降低抗瓜氨酸抗体水平或治疗蛋白质瓜氨酸化水平升高引起的疾病的药物中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述疾病为类风湿性关节炎、阿尔茨海默病或肿瘤。

10.一种降低蛋白质瓜氨酸化水平、降低抗瓜氨酸抗体水平或治疗蛋白质瓜氨酸化水平升高引起的疾病的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述化合物。