JP2008537673A - 抗ephb2抗体とその使用方法 - Google Patents
抗ephb2抗体とその使用方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008537673A JP2008537673A JP2007553371A JP2007553371A JP2008537673A JP 2008537673 A JP2008537673 A JP 2008537673A JP 2007553371 A JP2007553371 A JP 2007553371A JP 2007553371 A JP2007553371 A JP 2007553371A JP 2008537673 A JP2008537673 A JP 2008537673A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- ephb2
- antibodies
- cell
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- VJMFGZJUJBPTIT-UHFFFAOYSA-N CC(CC(N1CCCCCC(C)=O)=O)C1=O Chemical compound CC(CC(N1CCCCCC(C)=O)=O)C1=O VJMFGZJUJBPTIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
- A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
Description
この出願は、米国特許法119条に基づき、2005年1月31日に出願の米国仮出願第60/648,541号と2006年1月5日に出願の米国仮出願第60/756,844号の優先権を主張するものであり、これらは出典により本明細書中にその内容全体が組み込まれるものである。
本発明は、概して分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は抗EphB2抗体とその使用に関する。
EphB2レセプター(「EphB2」又は「EphB2R」)はephレセプターファミリのメンバーであり、ヒトゲノムのチロシンキナーゼレセプターで最も大きなファミリーを構成する(Dodelet, Oncogene, 19: 5614-5619, 2000に概説される)。ヒトのephレセプターチロシンキナーゼは、エフリンと称される対応するAタイプ及びBタイプのリガンドとのAクラス及びBクラス内の配列同一性により分類される。シグナル伝達は前者の様式で起こり、このシグナル伝達では、レセプターチロシンキナーゼはリガンドによって、活性化され、後者の様式では、このシグナル伝達では、膜貫通エフリンBリガンドはレセプターとの相互作用によって、活性化される。Ephレセプターリガンド相互作用は、軸索誘導、組織境界形成、脈管形成、及び細胞運動性を含む多くの生物学的機能に関係している(Kullander 等 Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 3: 475-486, 2002、Cheng 等 Cytokine Growth Factor Rev., 13: 75-85, 2002、Coulthard 等 Int. J. Dev. Biol., 46: 375-384, 2002)。
抗体ベースの治療法は、様々な疾患の治療に非常に有効であると判明している。例えば、ハーセプチンTM及びリツキサンTM(ともにGenentech, S. San Francisco)は、それぞれ乳癌及び非ホジキンリンパ腫の治療のために成功裏に用いられている。ハーセプチンTMは、ヒト上皮性成長因子レセプター2(HER2)プロトオンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えDNA由来のヒト化モノクローナル抗体である。HER2タンパク質過剰発現は、原発性乳癌の25〜30%に観察される。リツキサンTMは、正常及び悪性のBリンパ球の表面上に見られるCD20抗原に対する、遺伝子操作したキメラマウス/ヒトモノクローナル抗体である。両抗体はCHO細胞で産生される。
治療薬として開発されるために適する臨床特質を有する薬剤が必要とされ続けることは明らかである。本明細書に記述される本発明は、この必要性を満たして、他の利点を提供するものである。
特許出願及び刊行物を含め、本明細書に挙げるすべての引例は、出典明記によって、その全体が組み込まれる。
本発明は、様々なEphB2結合剤(例えば免疫コンジュゲート、抗体及びその断片)の同定にある程度基づく。EphB2は重要で有益な治療的標的として表し、本発明はEphB2の結合に基づく組成物及び方法を提供する。本明細書に記載のように、本発明のEphB2結合剤は、EphB2-EphB2リガンド経路の発現及び/又は活性化と関係する病的状態を標的とする(ターゲティングする)際に使用するための、重要な治療薬剤及び診断用薬剤を提供する。したがって、本発明は、EphB2結合に関連する方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
本発明は、EphB2と結合する抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、2005年2月24日に寄託された米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株2H9.11.14により産生される抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株2H9.11.14により産生される抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを含有し、ヒトEphB2に特異的に結合する単離された抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株2H9.11.14により産生される抗体と同じヒトEphB2上のエピトープに結合する単離された抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、ヒトEphB2への結合について、米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株2H9.11.14により産生される抗体と競合する単離された抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、EphB2のリガンド結合領域を結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施態様では、単離された抗体は、ヒトEphB2のアミノ酸のおよそ19からおよそ208を含有する、これらからなる又は基本的にこれらからなるポリペプチドを結合する(図12)。
ある態様では、本発明は、EphB2の結合についてEphB2リガンドと競合する単離された抗EphB2抗体を提供する。
ある態様では、本発明は、EphB2活性を阻害する、減弱する、及び/又はブロックする、単離された抗EphB2抗体を提供する。いくつかの実施態様では、EphB2自己リン酸化は、阻害、減弱、及び/又はブロックされる。
一実施態様では、本発明の抗体は、KSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)、GASTRES (配列番号2)、及びQNDHSYPFT (配列番号3)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む軽鎖を含有してなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列KSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)を有する軽鎖HVR-L1を含んでなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列GASTRES (配列番号2)を有する軽鎖HVR-L2を含んでなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列QNDHSYPFT (配列番号3)を有する軽鎖HVR-L3を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、SYWMH (配列番号4)、FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)、及びRLKLLRYAMDY (配列番号6)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む重鎖を含有してなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列SYWMH (配列番号4)を有する重鎖HVR-H1を含んでなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)を有する重鎖HVR-H2を含んでなる。一実施態様では、抗体は、アミノ酸配列RLKLLRYAMDY (配列番号6)を有する重鎖HVR-H3を含んでなる。一実施態様では、本発明の抗体は、SYWMH (配列番号4)、FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)、及びRLKLLRYAMDY (配列番号6)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む重鎖、とKSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)、GASTRES (配列番号2)、及びQNDHSYPFT (配列番号3)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む軽鎖を含有してなる。
一実施態様では、本発明の抗体は、配列:QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGFINPSTGYTDYNQKFKDKATLTVKSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRRLKLLRYAMDYWGQGTTLTVSA (配列番号8)を有する重鎖可変ドメインを含有してなる。
一実施態様では、本発明の抗体は、配列:DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (配列番号7)を有する軽鎖可変ドメインを含有し、配列:QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGFINPSTGYTDYNQKFKDKATLTVKSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRRLKLLRYAMDYWGQGTTLTVSA (配列番号8)を有する重鎖可変ドメインを含有してなる。
当分野で公知、そして、以下により詳細に記述されるように、(後述のような)当分野の様々な定義及び前後関係に従って、抗体の高頻度可変領域を表すアミノ酸位/境界は異なってもよい。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ある判断基準の下では高頻度可変領域内にあると判断されるが、異なるある判定基準の下では高頻度可変領域の外にあると判断される、ハイブリッド高頻度可変位置と見られうる。また、これらの位置の一又は複数は、伸展した高頻度可変領域内にありうる(以下にさらに定義する)。
いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2又はscFvである。
本発明のヒト化抗体は、融合したCDR内に変異を有する親和性成熟変異体及びFR内にアミノ酸置換を有するものを含む。CDR又はFR内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエントの抗体に存在するものに限らない。他の実施態様では、本発明の抗体はさらに、CDC及び/又はADCCの機能及びB細胞の殺傷の亢進を含め、エフェクター機能の改善を生じるFc領域内のアミノ酸残基に変異を含有する。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。また、本発明の抗体には、インビボでADCC機能を向上させているフコース欠陥変異体が含まれる。他の実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能の低減、例えばCDC及び/又はADCC機能の低減及び/又はB細胞殺傷の低減を生じるFc領域内のアミノ酸残基に変化を含有する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー(NK)細胞上のヒトFcレセプター及び/又はヒト補体因子C1qへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのFcγRI、FcγRIIA及び/又はFcγRIIIAへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、IgGクラスのもの(例えばIgG1又はIgG4)であり、そしてE233、L234、L235、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及び/又はP329(EUインデックスに従った番号付け)の少なくとも一つの突然変異を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗体は、突然変異L234A/L235A又はD265A/N297Aを含んでなる。
一態様では、本発明は、薬剤などの作用剤にコンジュゲートした、本明細書に開示された何れかの抗EphB2抗体を含有してなる免疫コンジュゲート(「抗体薬剤コンジュゲート」又は「ADC」と交換可能に称される)を提供する。EphB2過剰発現は、胃癌、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌及び肝細胞癌において、観察されており、結腸直腸腫瘍形成のすべての段階において、観察された。このことから、EphB2が免疫コンジュゲート療法のための適切な標的であることが示唆される。EphB2発現は大腸腺腫において、観察された。このことから、EphB2が大腸腺腫に特徴がある疾患のための適切な標的であることが示唆される。
いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲートの薬剤は、化学療法剤、成長阻害性剤、毒素(例えば細菌、菌類、植物又は動物の起源の酵素的に活性な毒素又はその断片)又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)である。いくつかの実施態様では、薬剤は、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン又はカリケアマイシンである。いくつかの実施態様では、薬剤は、DM1、DM3、DM4、MMAE又はMMAFである。
いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲートは、SPP-DM1、SMCC-DM1、BMPEO-DM1、MC-vc-PAB-MMAF、MC-vc-PAB-MMAE、MC-MMAF又はMC-MMAEを含んでなる。
一態様では、本発明は、腫瘍細胞を死滅する抗EphB2抗体を含有してなる免疫コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞はインビトロで死滅される(実施態様によっては、およそ50ng/ml、40ng/ml、30ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml又はそれ以下、例えば900pg/ml、800pg/ml、700pg/ml、600pg/ml、500pg/ml又はそれ以下のIC50を有する)。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞はインビボで死滅される。いくつかの実施態様では、免疫コンジュゲートの投与により、腫瘍成長が低減するか(実施態様によっては、コントロール腫瘍と比較して90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%又は10%又はそれ以下の腫瘍成長の低減を有する)、又は腫瘍倍加の時間が減少する。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗体又は免疫コンジュゲートと担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の抗EphB2抗体をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の核酸と担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に受容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、何れの型のもの、例えば発現ベクターなどの組換えベクターでもよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞である。
一態様では、本発明は、容器、と容器内に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲートを含有するものである、製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様では、抗体又は免疫コンジュゲートを含有してなる組成物は、さらに担体を含有するものであって、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に受容可能なものである。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示書をさらに具備する(例えば、本明細書に記載の何れかの方法のための指示書)。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患の治療及び/又は予防治療のための医薬の調製における、抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(いくつかの実施態様では、本発明の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート)の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患の治療及び/又は予防治療のための医薬の調製における、本発明の発現ベクターの使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患の治療及び/又は予防治療のための医薬の調製における、本発明の宿主細胞の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患の治療及び/又は予防治療のための医薬の調製における、本発明の製造品の使用を提供する。
一態様では、本発明は、疾患、例えば癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患の治療及び/又は予防治療のための医薬の調製における、本発明のキットの使用を提供する。
本発明は、EphB2の発現及び/又は活性、例として、発現及び/又は活性の増加又は望ましくない発現及び/又は活性、又は発現及び/又は活性の減少と関連している疾患状態を調整するために有用な方法及び組成物を提供する。
一態様では、本発明は、EphB2の発現及び/又は活性の増加と関連する腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患の治療方法又は予防方法であって、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては、本発明の抗EphB2抗体)が投与されることを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては本発明の抗EphB2抗体)を投与することを含む、腫瘍又は癌の成長を低減、阻害、阻止(ブロック)又は防止する方法を提供する。
一態様では、本発明は、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては本発明の抗EphB2抗体)を投与することを含む、神経障害又は神経変性疾患を治療又は予防する方法、又は損傷した神経細胞を修復する方法を提供する。
一態様では、本発明は、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては本発明の抗EphB2抗体)を投与することを含む、ニューロンの発達、増殖、維持又は再生を促進する方法を提供する。
一態様では、本発明は、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては本発明の抗EphB2抗体)を投与することを含む、血管新生を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様では、血管新生の部位は腫瘍又は癌である。
一実施態様では、本発明の方法で標的とする細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣の癌細胞、頸部癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞及び大腸腺腫細胞からなる群から選択されるものであってもよい。一実施態様では、本発明の方法で標的とする細胞は、過剰増殖細胞及び/又は過形成細胞である。一実施態様では、本発明の方法で標的とする細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法で標的とする細胞は転移性細胞である。いくつかの実施態様では、標的とする細胞は大腸腺腫細胞である。いくつかの実施態様では、標的とする細胞は、少なくともおよそ20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000、600,000、650,000、700,000、750,000、800,000、850,000又は850,000以上のEphB2分子を細胞膜上に発現する。
他の態様では、本発明は、試料中のEphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む、EphB2の検出方法を提供する。本明細書において、使用する「検出」なる用語は、コントロールへの参照の有無にかかわらず、定性的及び/又は定量的な検出(例えば測定レベル)を含む。
他の態様では、本発明は、疾患を有する又は有すると思われる患者の生体試料において、EphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む、EphB2発現及び/又は活性と関連する疾患を診断するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、EphB2発現は発現の増加又は異常な発現である。いくつかの実施態様では、疾患は、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患である。
他の態様では、本発明は、検出可能な標識を含有する、本明細書に記載の何れかの抗EphB2抗体を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗EphB2抗体とEphB2の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は、癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗EphB2抗体は、検出可能に標識される。
他の態様では、本発明は、EphB2のアミノ酸19−208を含有するか、それから成るか、基本的にそれから成るポリペプチドを提供する。
本明細書中の発明は、例えば、EphB2の発現及び/又は活性の増加又は望ましくない発現及び/又は活性などのEphB2の発現及び/又は活性に関連する疾患状態の治療又は予防に有用な、抗EphB2抗体、又は抗EphB2抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを提供する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体又は免疫コンジュゲートは、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患を治療するために用いられる。
他の態様では、本発明の抗EphB2抗体は、様々な組織及び細胞型でのEphB2留置などのEphB2の検出及び/又は単離のための試薬としての有用性を見出す。
さらに、本発明は、抗EphB2抗体、及び抗EphB2抗体をコードするポリヌクレオチドの作製方法を提供する。
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を超えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、抗体核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある抗体を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
本願明細書において用いられるように、「EphB2」なる用語(「EphB2R」なる用語と交換可能)は、特別に又は文脈上別途示されない限り、任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のEphB2ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、特に天然に生じる切断型又は分泌型(例えば、細胞外ドメイン配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「野生型EphB2」なる用語は、一般に、天然に生じるEphB2タンパク質のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを指す。「野生型EphB2配列」なる用語は、一般に、天然に生じるEphB2においてみられるアミノ酸配列を指す。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び/又は親和性成熟したものであり得る。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばFc領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のFc領域に通常関連する生物学的な機能、例えばFcRn結合、抗体半減期の調節、ADCC機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるFc配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(アメリカ特許番号4,816,567、及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本明細書中で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物ないしは合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。
---- ----- ------- -------
L1 L24-L34 L24-L34 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H32 H30-H35B
(Kabat番号付け)
H2 H50-H65 H52-H56 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H93-H101
高頻度可変領域は、以下の「伸展した高頻度可変領域」を含有してもよい:VLの24−36又は24−34(L1)、46−56又は50−56(L2)および89−97又は89−96(L3)およびVHの26−35(H1)、50−65又は49−65(H2)および93−102、94−102又は95−102(H3)。可変ドメイン残基は、各々のこれらの定義にあるように上掲のKabat 等に従って番号を付けた。
「一本鎖Fv」又は「scFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、scFvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはscFvが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、EP404,097;WO93/11161;及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994);Schier他、Gene, 169:147-155 (1995);Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995);Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995);およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ADCC」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するFcレセプター(FcRs)と結合した分泌Igにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ADCCを媒介する主要な細胞NK細胞はFcγRIIIのみを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞でのFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の464頁の表3に要約されている。対象の分子のADCC活性をアッセイするために、米国特許第5500362号又は同第5821337号に記載されているようなインビトロADCCアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー細胞(NK細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のADCC活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「Fcレセプター」又は「FcR」は、抗体のFc領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに好適なFcRは、IgG抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。FcγRIIレセプターには、FcγRIIA(「活性型レセプター」)及びFcγRIIB(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターFcγRIIAは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ITAM)を含んでいる。阻害型レセプターFcγRIIBは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ITIM)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。FcRsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のFcRsはここでの「FcR」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性IgGの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターFcRnも含まれる。
FcRnへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトFcRnへの結合とヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はFc変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
「補体依存性細胞障害」もしくは「CDC」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Clq)の第1補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質/分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍;癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
「末梢神経障害」は末梢神経に作用する神経変性疾患であり、多くの場合運動神経系、感覚神経系、感覚運動神経系、自律神経系の機能不全の一又は組合せとして現れる。末梢神経障害は、例えば、遺伝的に獲得されうるか、全身性疾患から生じうるか、毒性薬剤、例えば神経毒薬剤、例として抗腫瘍剤又は産業汚染物質ないし環境汚染物質により誘導されうる。「末梢感覚の神経障害」は、原因不明で起こりうる末梢感覚ニューロンの変性に特徴があり、例えば、糖尿病(糖尿病性神経障害)、癌の細胞増殖抑制薬物治療(例として、化学療法剤、例えばビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、3'-アジド-3'-デオキシチミジン又はタキサン、例えばパクリタキセル[TAXOL(登録商標), Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.]及びドキセタキセル[TAXOTERE(登録商標), Rhone- Poulenc Rorer, Antony, France]による治療)、アルコール中毒、後天性免疫不全症候群(AIDS)又は遺伝子の素因の結果として生じうる。遺伝的に獲得した末梢神経障害は、例えば、レフサム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ファブリー病、デジュリーヌ・ソッタ病、無βリポ蛋白血症、及びシャルコー・マリー・トゥース(CMT)病(別名腓骨筋萎縮症又は遺伝性運動感覚神経障害(HMSN))を含む。末梢神経障害の多くのタイプは数か月又は数年の期間にわたってゆっくりと進行する。医療において、このような神経障害は慢性という。場合によって、末梢神経障害は、2、3日の期間で急速に進行する、急性と呼ばれるものもある。通常、末梢神経障害は感覚神経及び運動神経ともに影響して、混合性の感覚及び運動神経障害を起こすが、単なる感覚神経障害及び単なる運動神経障害も知られている。
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本発明の物質/分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(8S-シス)-10-[(3-アミノ-2,3,6-トリデオキシ-α-L-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-7,8,9,10-テトラヒドロ-6,8,11-トリヒドロキシ-8-(ヒドロキシアセチル)-1-メトキシ-5,12-ナフタセンジオンである。
本発明は、医薬組成物を含む組成物であって、抗EphB2抗体を含んでなるもの、及び、抗EphB2抗体をコードする配列を包含する。本明細書で用いられるように、組成物は、EphB2に結合する一又は複数の抗体、及び/又はEphB2に結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、適切な担体、例えばバッファなどの薬学的に受容可能な賦形剤を含みうる。これは当分野で周知である。
また、本発明は、単離された抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。また、本発明は、実質的に純粋な抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。
本発明の抗EphB2抗体は望ましくはモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗EphB2抗体のFab、Fab'、Fab'-SH及びF(ab')2断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
本発明の抗EphB2モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。一般的に、EphB2への抗体は、EphB2とアジュバントを複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)に注射することにより動物内に生じる。EphB2は当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、EphB2の組み換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のFc部位に融合したEphB2の細胞外ドメイン(ECD)を含有するEphB2の誘導体で免疫化する。好適な実施態様では、動物を、EphB2-IgG1融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドA(MPL)/トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)によりEphB2の免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。2週後に、動物を追加免役する。7〜14日後、動物から採血して、血清を抗EphB2力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、HGPRT欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(HAT培地)。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、EphB2に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)又は酵素結合免疫吸着検定(ELISA)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び/又はB細胞又は他のPBLの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、EphB2が免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
これに対して、GenBank寄託番号NM_017449ないしNM_004442又は国際公開公報03/000113の図23のcDNA配列(又はその断片)を用いてもよい。更なるEphB2配列は、例えばAnnu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. Cytol. 196:177-244 (2000))、国際公開公報2003042661、国際公開公報200053216、国際公開公報2004065576、国際公開公報2004020583、国際公開公報2003004529(128−132ページ)、及び国際公開公報200053216にさらに開示される。EphB2をコードするDNAは、当分野で公知の様々な方法によって、調製できる。これらの方法には、Engels 等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載の何れかの方法、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びH-ホスホン酸塩方法による化学的な合成法が含まれるがこれに限定されるものではない。一実施態様では、発現宿主細胞に好ましいコドンが、DNAをコードするEphB2の設定に用いられる。これに対して、EphB2をコードするDNAは、ゲノムないしcDNAのライブラリから単離できる。
場合によっては、EphB2をコードしているDNAは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される。分泌リーダー配列の例には、stII、エコチン(ecotin)、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインAの36アミノ酸リーダー配列である(Abrahmsenら, EMBO J., 4:3901(1985) )。
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
形質転換とは、DNAが染色体外成分として又は染色体組み込みによってのいずれかで複製可能となるように、生物にDNAを導入することを意味する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した基本的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当分野で公知であり、そのいくつかをさらに本明細書中に記載する。
EphB2を産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般的に、Sambrookら, 上掲に記載のように培養することが可能である。
EphB2を産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したEphB2を付着させることが可能である。基質へのEphB2タンパク質の付着は、Methods in Enzymology, 44巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第1級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化EphB2と接触させる。通常は、pH、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarksら, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClacksonら, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるEphB2抗原競合によって溶出する。ファージは、1回目の選択で20〜1,000倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
(1) 上記のセクションB(I)(2)に記載のようなファージライブラリから抗EphB2クローンを単離して、場合によって、好適な宿主細胞で個体集団を成長させることによって、ファージクローンの単離した母集団を増幅する、(2) 望ましいブロック活性及び非ブロック活性のそれぞれについて第二タンパク質とEphB2を選択する、(3) 固定されたEphB2に抗EphB2ファージクローンを吸着する、(4) 過剰量の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップするEphB2-結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する。そして、(5) 工程(4)の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって、選別できる。場合によって、所望のブロック/非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮できる。
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Fab、Fv及びScFv抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')2断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したFab及びF(ab')2断片は米国特許第5,869,046号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFV)である。国際公開93/16185;米国特許第5,571,894号;及び米国特許第5,587,458号を参照のこと。Fv及びsFvは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である;したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。sFv融合タンパク質は、sFvのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
本発明のヒト抗EphB2抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したFvクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗EphB2抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は,例えば,Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993);Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはEphB2に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、EphB2タンパク質の2つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はEphB2を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はEphB2結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
異なったより好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、CH2及びCH3領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているDNAを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、2または3個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたFab'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性および/または生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基または領域の同定に有益な方法は、CunninghamおよびWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基または残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、およびgluなどの荷電した残基)、中性の、または負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、または置換の部位のために、さらなる、または他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドンまたは領域においてalaスキャンニングまたはランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、N結合又はO結合の何れかである。N結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-X-セリン及びアスパラギン-X-スレオニン(ここでXはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。O結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類N-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、5-ヒドロキシプロリン又は5-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体がFc領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のFc領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国特許公開出願番号2003/0157108(Presta, L.)に記載される。米国公開特許2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のFc領域に接着した炭水化物内のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)を二分する抗体は、国際公報03/011878, Jean-Mairet 等、及び米国特許第6,602,684号, Umana 等に参照されている。抗体のFc領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報97/30087, Patel 等に報告される。また、抗体のFc領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報98/58964 (Raju, S.)及び国際公報99/22764 (Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国特許公開2005/0123546 (Umana 等)を参照。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr、asn、gln;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのFc領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してFc領域変異型を生成することが望ましい。Fc領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトFc領域配列(例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4 Fc領域)を含みうる。
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、EphB2活性化の減少又はブロック、EphB2下流分子のシグナル伝達の減少又はブロック、EphB2リガンド活性化の減少又はブロック、EphB2リガンド下流分子のシグナル伝達の減少又はブロック、EphB2に対するリガンド(例えばエフリン-B1、エフリン-B2及び/又はエフリン-B3)結合の破壊又はブロック、EphB2リン酸化及び/又はEphB2多量体化、及び/又はEphB2リガンドリン酸化、及び/又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び/又は防止;及び/又はEphB2発現及び/又は活性(例えばEphB2発現及び/又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は防止の何れか一又は複数に特徴がある。
精製された抗体は、限定されるものではないが、N末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
他の実施態様では、本発明は、ハイブリドーマ細胞株2H9.11.14(ATCC寄託番号PTA-6606)により産生される抗EphB2モノクローナル抗体(本明細書では「2H9」又は「Mab 2H9」と交換可能に称する)を提供する。
他の態様では、本発明は、2H9抗体の一又は複数(例えば2、3、4、5及び/又は6) のHVRを含んでなる抗EphB2モノクローナル抗体を提供する。2H9の一又は複数のHVRを含んでなる抗EphB2モノクローナル抗体は、2H9の一又は複数のHVRを鋳型抗体配列、例えば親の抗体の対応するマウス配列に最も近接するヒト抗体配列、又は親の抗体軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に融合させ、結果として生じたキメラ軽鎖及び/又は重鎖の可変領域配列を、定常領域配列(一又は複数)を伴うことの有無にかかわらず、本明細書に記載の組換え宿主細胞内で発現させることによって構築できる。
EphB2活性化を阻害する抗EphB2抗体が望まれる場合、候補抗体をEphB2リン酸化アッセイにて試験できる。このようなアッセイは当分野で周知であり、そのようなアッセイは実施例の項目に記載され、例証される。抗体の内部移行を妨げる抗体が望まれる場合、候補アッセイは細胞内部移行アッセイにおいて、試験できる。このようなアッセイは当分野で周知であり、そのようなアッセイは実施例の項目に記載され、例証される。
細胞を死滅するか又は細胞成長を阻害する抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲートが望まれる場合、候補抗体又は免疫コンジュゲートは、細胞成長の細胞死滅及び/又は阻害を測定する、インビトロ及び/又はインビボアッセイにおいて、試験できる。このようなアッセイは当分野で周知であり、本明細書中でさらに記載され、例証される。
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λGEM.TM.-11のようなバクテリオファージを、大腸菌LE392のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源DNAからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンDNAに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び/又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドDNAの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ippあるいは熱安定性エンテロトキシンII(STII)リーダー、LamB、PhoE、PelB、OmpA及びMBPからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はSTIIシグナル配列又はその変異体である。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する33D3株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁;ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。pBR322、pBR325、pACYC177、又はpKN410のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(LB)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約20℃から約39℃、より好ましくは約25℃から約37℃の範囲、更により好ましくは約30℃である。培地のpHは、主として宿主生物に応じて、約5から約9の範囲の任意のpHでありうる。大腸菌に対しては、pHは好ましくは約6.8から約7.4、より好ましくは約7.0である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにPhoAプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はC.R.A.P培地である(例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも1000リットルの容量、好ましくは約1000から100000リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素/エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ100リットル以下の容積で、約1リットルから約100リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばDsbタンパク質(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD及び/又はDsbG)又はFkpA(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605;Georgiou等, 米国特許第6083715号;Georgiou等, 米国特許第6027888号;Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105;Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113;Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインAを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインAは抗体のFc領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した41kDの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインAを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインA固定固形層に適応し、プロテインAに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み取り枠を一致させて結合される。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442); ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065); マウス乳房腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗EphB2抗体を含む、免疫コンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ADC」と交換可能に称される)を提供する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172;米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581;Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028;Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213;Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928;Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、DNA結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
他の例示的なメイタンシノイド抗体薬剤コンジュゲートは、以下の構造および略号を有する(ここで、Abは抗体であり、pは1〜約8である):
ここでAbは抗体であり;nは0、1又は2であり;pは1、2、3又は4である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52:127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分SMCCを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
例示的なアウリスタチンの実施態様はMMAFである(ここで、波形の線は抗体薬剤コンジュゲートのリンカー(L)への共有結合を示す)。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる:(1) 共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ab−(L−D)p I
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「SIAB」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAEは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAEと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。
抗体-MC-val-cit-PAB-MMAFは、Ab-MC-MMAEの調製のためのプロトコールによるMC-val-cit-PAB-MMAFと本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。
抗体-SMCC-DM1は、以下のSMCC-DM1と本明細書において、提供される何れかの抗体とのコンジュゲートにより調製されうる。精製された抗体は、(スクシンイミジル4(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC、Pierce Biotechnology, Inc) で誘導体化して、SMCCリンカーを導入する。具体的には、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5中で、7.5モル等量のSMCC(DMSO中に20mM、6.7mg/mL)にて20mg/mLの抗体を処理した。室温のアルゴン下で2時間撹拌した後に、反応混合物を、50mM リン酸カリウム/50mM 塩化ナトリウム/2mM EDTA、pH6.5にて平衡化したSephadex G25カラムにてろ過する。抗体を含有する分画をプールして、アッセイする。
Ab-SPP-DM1は、本明細書中で提供される何れかの抗体と以下のSPP-DM1とのコンジュゲートにより調製されうる。精製された抗体は、ジチオピリジル基を導入するために、N-スクシンイミジル-4-(2-ピリジルチオ)ペンタノエートによって、誘導体化される。NaCl(50mM)及びEDTA(1mM)を含有する44.7mLの50mM リン酸カリウムバッファ(pH6.5)中の抗体(376.0mg、8mg/mL)を、SPP(2.3mL エタノール中に5.3のモル等量)にて処理した。室温、アルゴン下にて90分間インキュベートした後、抗応混合物を、35mMのクエン酸ナトリウム、154mM NaCl、2mM EDTAにて平衡化したSephadex G25カラムにろゲル濾過する。抗体含有分画をプールして、アッセイした。抗体の修飾の程度は、上記の通りに決定される。
抗体-BMPEO-DM1は、本明細書中に示される何れかの抗体と以下のBMPEO-DM1とのコンジュゲートにより調製されうる。抗体を、ビスマレイミド試薬BM(PEO)4 (Pierce Chemical)にて修飾して、抗体の表面上の反応していないマレイミド基を除去する。これは、BM(PEO)4を50%のエタノール/水混合液に10mMの濃度になるまで溶解して、およそ1.6mg/ml(10マイクロモル)の濃度でリン酸緩衝食塩水に抗体を含有する溶液に10倍のモル過剰量を加え、1時間反応させて、抗体-リンカー中間生成物である抗体-BMPEOを形成させることにより達成される。150mMのNaClバッファと0mMのクエン酸塩、pH6のゲル濾過(HiTrap column, Pharmacia)によって、過剰なBM(PEO)4を取り除く。およそ10倍のモル過剰DM1を、ジメチルアセトアミド(DMA)に溶解して、抗体-BMPEO中間生成物に加える。また、ジメチルホルムアミド(DMF)を用いて薬剤成分試薬を溶解してもよい。反応混合物を終夜反応させて、PBSでゲル濾過ないし透析を行って反応していないDM1を取り除く。PBSのS200カラムによるゲル濾過を用いて、高分子量凝集塊を取り除いて、精製された抗体-BMPEO-DM1に供給する。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本発明の抗体を、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法に用いてもよい。
一態様では、本発明は、EphB2の発現増加及び/又は活性増加に関連する腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患を治療するか又は予防するための方法であって、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲートが投与されることを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、治療を必要とする被検体に、有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート(実施態様によっては、本発明の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲート)が投与されることを含む、腫瘍細胞を死滅させる方法を提供する。
一態様では、本発明は、治療を必要とする被検体に、有効量の抗EphB2抗体又は免疫コンジュゲートが投与されることを含む、腫瘍又は癌の成長を低減、阻害ないしは予防する方法を提供する。
一実施態様では、本発明の抗体は、抗原の発現及び/又は活性の増加に関連する疾患に罹患している被検体での抗原を結合する方法であって、被検体の抗原が結合されるように本発明の抗体が被検体に投与されることを含む方法に用いることができる。好ましくは、抗原はヒトのタンパク質分子であり、被検体はヒト被験者である。これに対して、被検体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現している哺乳動物であってもよい。また更に、被検体は、抗原が導入されている(例えば、抗原の投与、又は抗原導入遺伝子の発現によって、)哺乳動物であってもよい。本発明の抗体は、治療目的のためにヒト被験者に投与されてもよい。さらに、本発明の抗体は、獣医学のために又はヒト疾患の動物モデルとしての、免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ又はマウス)に投与されてもよい。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するため(例えば、投与の用量及び時間経過の試験)に有用でありうる。
例示的な疾患には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な癌には、扁平細胞癌(例えば上皮性扁平細胞癌)、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞性癌、胃癌(gastric又はstomach)、例えば胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌又は腎癌(kidney又はrenal)、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門の上皮癌、陰茎上皮癌、メラノーマ、多発性骨髄腫及びB細胞リンパ腫、脳、並びに頭頸部癌、及び関連する転移が含まれる。いくつかの実施態様では、癌は、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(CRC)及び肝細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、癌は結腸直腸癌である。
また、本発明の抗体は、疾患の病態が細胞の変性ないし機能不全を伴うものである疾患の治療(防止を含む)、例えば様々な(慢性)神経変性疾患及び急性神経細胞損傷の治療に有用である。このような神経変性疾患としては、末梢性神経障害、運動神経疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS、Lou Gehrig's病)、Bell's麻痺、及び脊髄筋萎縮又は麻痺を伴う様々な症状、及び、他のヒト神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴及びメニエール病、及び例えば外傷又は脊髄損傷による急性神経細胞損傷が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施態様では、疾患は、大腸腺腫(一又は複数)に特徴がある。本発明の方法は、複数の大腸腺腫(例えば10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000以上の大腸腺腫)に特徴がある疾患に特に適する。この疾患には少なくとも以下のものが含まれる:APC遺伝子の突然変異によって、生じる常染色体優性家族性大腸ポリープ症(FAP)(Tomlinson 等, J Med Genet 1996、33:268-73)、ポイツ・ジェガース症候群(PJS)、若年性ポリープ症候群(JPS)、MYH遺伝子の突然変異による弱毒性FAP(Sieber 等 N Eng J Med 348:791-9 (2003))、遺伝性混合性ポリープ症候群(HMPS)、カウデン病及びBannayan-Ruvalcaba-Riley症候群。
EphB2は、発生中の胚における軸索運動(motoaxon)誘導及び神経冠細胞の移動に関係している。したがって、本発明の抗体は、インビトロ又はインビボでの軸索誘導、神経系発達及び/又は神経冠移動を調整するためにも有用である。
本発明の抗体又は免疫コンジュゲートは、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤(一又は複数)(化学療法剤の混合を含む)、他の細胞障害性剤(一又は複数)、抗血管形成剤(一又は複数)、サイトカインおよび/または増殖阻害性剤(一又は複数)と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一又は複数の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。例えば、転移性乳癌の治療において、VEGF活性を遮断する抗VEGF抗体は抗ErbB抗体(例えばハーセプチン(登録商標)抗HER2抗体)と組み合わせてもよい。あるいは又は加えて、放射線療法(例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療)を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与(2以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療(一又は複数)の前及び/又はその後に投与することができる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、1回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の1〜99%で用いる。
他の態様では、本発明は、試料中のEphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む、EphB2の検出方法を提供する。本明細書において、用いられる「検出」なる用語は、コントロールに対する参照の有無にかかわらず、定性的及び/又は定量的な検出(測定レベル)を含む。
他の態様では、本発明は、EphB2の発現及び/又は活性に関連する疾患を診断するための方法であって、該疾患を有する又は有すると思われる患者からの生体試料において、EphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、EphB2発現は、発現の増加又は異常な(望ましくない)発現である。いくつかの実施態様では、疾患は、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患である。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗EphB2抗体を提供するものであって、この抗EphB2抗体は検出可能な標識を含んでなる。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗EphB2抗体とEphB2の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗EphB2抗体は検出可能に標識される。
EphB2についての分析法では、すべて、1つ又はそれより多い次の試薬を用いる:標識EphB2アナログ、固定化EphB2アナログ、標識抗EphB2抗体、固定化抗EphB2抗体及び立体コンジュゲート。標識試薬は、「トレーサー」としても知られている。
試料におけるタンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて試験しうる。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「IHC」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法または蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。試料の調整では、哺乳動物(典型的にはヒト患者)の組織または細胞試料を用いてもよい。試料の例として、大腸、乳房、前立腺、卵巣、肺、胃、膵臓、リンパ系および白血球などの癌細胞が含まれるが、これらに限定するものではない。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引または生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい。当分野の通常の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の通常の技術者は、組織試料の大きさおよび用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次および/または二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である:
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばHRPO)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
表2
競合アッセイは、限られた数の抗EphB2抗体抗原結合部位について試験試料EphB2と競合するトレーサーEphB2類似体の能力に依存する。一般的に、抗EphB2抗体は、競合の前又は競合の後に不溶化して、次いで抗EphB2抗体に結合したEphB2とトレーサーを結合していないトレーサーとEphB2から分離する。この分離は、別の容器へ移す(結合パートナーが予め不溶化された場合)か、又は遠心分離する(結合パートナーが競合反応の後で沈殿した場合)ことにより達成される。マーカー物質の量で測定されるように、試験試料EphB2の量は結合したトレーサーの量に反比例する。EphB2の既知量による用量-反応曲線を作成して、試験結果と比較して試験試料に存在するEphB2の量を量的に決定する。検出可能なマーカーとして酵素が用いられる場合に、これらのアッセイはELISAシステムと呼ばれている。
「均質な」アッセイと称される競合アッセイの他の種類は、相分離を必要としない。ここで、EphB2と酵素とのコンジュゲートが調製され、抗EphB2抗体がEphB2に結合する場合に抗EphB2抗体の存在により酵素活性が修飾されるように用いられる。この場合、EphB2又はその免疫学的に活性な断片は、二機能性有機架橋によって、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされる。抗EphB2抗体の結合が標識の酵素活性を阻害するか又は強化するために、抗EphB2抗体により使用についてコンジュゲートを選別する。この方法自体は、EMITという名前で広く実施される。
サンドイッチアッセイは、EphB2又は抗EphB2抗体の測定のために特に有用である。一連のサンドイッチアッセイにおいて、固定された抗EphB2抗体を用いて、試験試料EphB2を吸着し、洗浄によって、試験試料を除去し、結合したEphB2を用いて第二の標識した抗EphB2抗体を吸着して、次いで結合した材料を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、試験試料EphB2に正比例する。「同時」サンドイッチアッセイにおいて、試験試料は、標識した抗EphB2を加える前に分離されない。一抗体として抗EphB2モノクローナル抗体を、他方の抗体としてポリクローナル抗EphB2抗体を用いる一連のサンドイッチアッセイは、試料をEphB2について試験する際に有用である。
前述は、単にEphB2のための例示的な検出アッセイにすぎない。EphB2の測定のために抗EphB2抗体を用いる、現在の他の方法又は今後開発される方法は、本明細書に記載のバイオアッセイを含め、本願の権利内に包含される。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器;と(b)更なる細胞毒性剤を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以下の材料及び方法が実施例において用いられた。
抗体及び組換えタンパク質
西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたモノクローナル抗-ホスホチロシンは、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から入手した。p44/42 MAPキナーゼ、リン酸-p44/42 MAPキナーゼ、EGF及びリン酸-上皮性成長因子(EGF)に対する抗体は、Cell Signaling Technology (Beverly, MA)から購入した。エフリン-B2-Fc及び融合タンパク質エフリン-B1-Fc及びGDエピトープに対する抗体は、Genentech (South San Francisco, CA)で生産された。
ヒトの大腸腺癌細胞株SW480、SW620、及びColo 205及び線維肉腫細胞株HT1080は、American Type Culture Collection (Manassas, VA)から入手した。HT1080-EphB2及びHT1080-GD細胞株は、EphB2のNH2末端GDエピトープ-タグ付加型をコードするSV40動作性ベクター又は空のベクターそれぞれと、サイトメガロウィルスプロモータ動作性ピューロマイシンベクターにて同時形質移入して生成した。細胞は、1μg/mlのピューロマイシンにて選択した。SVT2-EphB2細胞株は、マウス3T3細胞にサイトメガロウイルスプロモータ動作性Neoを同時形質移入し、細胞を400μg/mlでジェネテシン(Life Technologies, Inc.)にて選択したことを除き同じ様式で作成した。細胞は、10%ウシ胎児血清、2mM グルタミン及びペニシリン-ストレプトマイシン(100単位/ml)を添加した高グルコースDMEMにて生育した。
EphB2リガンド結合ドメインコンストラクト(ss.EphB2LBD.gD.GPI)は、COOH終末GPIリンカー及びNH2終末GDエピトープ標識(ss.his.gD.GPI)をコードしているベクターに、ヒトEphB2のアミノ酸19〜208をコードするポリヌクレオチドをクローニングして調製した。このベクターを、293細胞に過渡的に形質移入した。細胞を、10%FBSを含有するF12 DMEM Mix(50:50)培地にて生育した。形質移入した細胞を、形質移入の48時間時間後に更に分析した。
腫瘍及び正常大腸の組織試料の分析のために(図3A)、各ヒト腫瘍又は正常大腸の組織試料の全RNAのおよそ10μgを、Affymetrix GeneChipのオリゴヌクレオチドアレイ分析に必要なプローブの調製のための開始材料として用いた。プローブは製造業者の指示に従って調製した。ハイブリダイゼーションの後、アレイを洗浄して、ストレプトアビジン-フィコエリトリンで染色して、次いでGene Arrayスキャナ(Agilent Technologies)でスキャンした。Affymetrixデータ分析ソフトウェアパッケージで提供されるデフォルトパラメータを適応して、シグナル強度を決定して、平均的相違とした。Affymetrix Expression Analysis Technical Manualにおいて述べられるように、広域のスケーリング(global scaling)を用いて試料の正規化を行い、1500の標的強度を用いて平均的相違発現値を決定した。複数のヒト腫瘍及び正常な生検試料におけるEphB2 mRNA発現の分析のために、Gene Logic, Inc. (Gaithersburg, MD)からAffymetrixデータを得た。
示した分析に、合計4841の試料を用いた(正常試料 1808;癌試料 1545;
そして、非癌性疾患試料 1488)。また、Gene Logicデータを、広域のスケーリングを用いて正規化したが、この場合、標的強度を100とした。EphB2 mRNA発現のAffymetrixデータは、U95プローブセットID 41678_atから生成した。EphB2 mRNAのためのリアルタイムPCR (TaqMan; Perkin-Elmer, Applied Biosystems)は、遺伝子特異的なプライマー(5'-CGA-GCC-ACG-TTA-CAT-CA-3' (配列番号10)及び5'-TCA-GTA-ACG-CCG-TTC-ACA-GC-3' (配列番号11))とプローブ(5'-CCC-ACA-CCC-AGT-ACA-CCT-TCG-AGA-TCC-3' (配列番号12))を用いて行った。インサイツハイブリダイゼーションのために、458塩基対の33P標識アンチセンスリボプローブを、オリゴヌクレオチド配列5'-TCTGTCCATCTGTCCCGTCCT-3' (配列番号13)によるプライマー及びプライマー5'-GCCCTCCTGGTGCTCTATCC-3' (配列番号14)によるセンスコントロールリボプローブを用いてEphB2 PCR産物から生成した。
BALB/cマウス(Charles River Laboratories, Wilmington, DE)は、Ribiアジュバント(Corixia, Hamilton, MT)にて希釈したバキュロウイルス由来のHis8タグ付加EphB2レセプターを、週2回、経足蹠にて5用量投与して免疫化した。高い血清力価を示している5匹のマウスのリンパ節からB細胞を回収して、マウス骨髄腫細胞(X63.Ag8.653;American Type Culture Collection)と融合した。10〜14日後に、HT1080-GD細胞及びHT1080-EphBR細胞の直接ELISA及びフローサイトメトリによって抗体産生について上清をスクリーニングした。ポジティブのものを2度サブクローニングしてモノクローナルにした。精製した抗体の大量産生のために、ハイブリドーマ細胞を、プリスタンで初回刺激したBALB/cマウスへ腹腔内投与した。腹水液をプールして、プロテインA親和性クロマトグラフィ(Pharmacia Fast Protein Liquid Chromatography; Pharmacia, Uppsala, Sweden)にて精製した。
RNeasyミニキット(Qiagen, Germany)を用いてマウス抗ヒトEphB2モノクローナル抗体2H9を生産しているハイブリドーマ細胞から総RNAを抽出した。可変軽鎖(VL)ドメイン及び可変重鎖(VH)ドメインは、以下の変性プライマーによるRT-PCRを用いて増幅した:
軽鎖(LC)フォワード:5'-GATCGATATCGTGATGACMCAGTCTCCATC-3' (配列番号15)
軽鎖リバース:5'-TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC-3' (配列番号16)
重鎖(HC)フォワード:5'-GATCCGTACGCTCAGGTYCARCTSCAGCAGTCTGG-3' (配列番号17)
重鎖リバース:5'-ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT-3' (配列番号17)
フォワードプライマーは、VL領域及びVH領域のN末端アミノ酸配列に特異的なものであった。それぞれのLC及びHCリバースプライマーは、定常軽鎖(CL)及び定常重鎖ドメイン1(CH1)の領域にアニールするように設定した。この領域は種全体に非常に保存されている。増幅したVLを、pRK哺乳類細胞発現ベクター(Shields 等 J Biol Chem (2000) 276:659-604)にクローニングした。増幅したVHは、pRK哺乳類細胞発現ベクターに挿入した。挿入物のポリヌクレオチド配列は、常法の配列決定方法を用いて決定した。
可溶性エフリン-FcリガンドによるEphB2活性化の分析は、精製したFc-エフリンB2(5μg/ml、15分)にてSVT2-EphB2細胞株を刺激して、以下のプロトコールを用いてEphB2自己リン酸化を検出することによって実施した。細胞は放射性免疫沈降アッセイバッファ(50mM トリス、150 mM NaCl、1%デオキシコレート、1%NP40、2mM バナジウム酸ナトリウム、1mM フェニルメチルスルホニルフッ化物、及び、完全なプロテイナーゼインヒビター混合物(Roche Molecular Biochemicals))に溶解した。10μgの抗GD MAbを溶解物に加えて、プロテインGアガロース(Life Technologies, Inc.)にて、4℃で終夜インキュベートした。免疫沈降物を回収して、溶解バッファにて洗浄し、SDS-PAGE及びイムノブロッティングの試料とした。ブロットを、1μg/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ホスホチロシンマウスMAb(Santa Cruz Biotechnology)又は抗GDマウスMAbとともにインキュベートした。二次抗体としてヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて、ブロットを洗浄し、高感度化学発光システム(Pierce)を用いて反応させた。MAPキナーゼ活性化の分析は、HT1080-EphB2細胞株を用いて行った。細胞を12時間無血清状態にして、無処置のままにしたものと、5μgのヒトFc-エフリンB2/mlの存在下及び非存在下で100ng/mlのEGFにて刺激したものを作製した。細胞溶解物は、タンパク質濃度を等しくして、SDS-PAGEを行い、抗ホスホ-EGFレセプター又はホスホ-MAPキナーゼ抗体にてイムノブロットした。
フローサイトメトリのために、細胞は、90%の集密度まで生育して、細胞解離バッファ(Invitrogen)を用いてプレートから取り除いた。細胞を洗浄して、蛍光活性細胞-分類バッファ(1%のBSAを含むPBS)に再懸濁して、抗EphB2 MAb 2H9又は抗GD抗体(Genentech)とともに45分間インキュベートして、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗マウス二次抗体とともに30分インキュベートした。FACSスキャンにて分析を行った。
室温で、Pharmacia BIAcore(登録商標) 3000 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を用いた表面プラスモン共鳴法によって、Mab 2H9の結合親和性を測定した(例としてMorton, T.A.等 (1998) Methods in Enzymology 295: 268-294を参照)。抗EphB2抗体を、一次アミン基を介してセンサチップ(CM5)に固定した。0.025M N-ヒドロキシスクシンイミド及び0.1M N-メチル-N'(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの混合物 20μlを5μl/分で注入することによって、カルボキシメチル化したセンサチップ表面基質を活性化した。10mM 酢酸ナトリウム、pH4.5中に10μg/mlの抗EphB2抗体を含む溶液 5〜10μlを5μl/分で注入した。カップリングの後、チップ上のカップリングしなかった部位を、20μlの1M エタノールアミン(pH8.5)を注入してブロックした。ランニングバッファは、0.05% ポリソルベート20を含有するPBSとした。動態学的な測定のために、ランニングバッファにて2倍に段階希釈したポリHisタグ付加EphB2を、フローセルに対して30μl/分の流速で3分間注入し、結合したポリHisタグ付加EphB2を20分間解離させた。20μlの10mM グリシン・HCl(pH1.5)を注入することによって、結合表面を再生した。活性化されるが、固定した抗体を有さないフローセル1をコントロールセルとして用いた。フローセル1に対するポリHisタグ付加EphB2の有意な非特異的結合はなかった。見かけの結合親和性を算出するために、データを、広域フィッティング(global fitting)を用いた1:1結合モデルによって分析した。結合速度定数及び解離速度定数は、同時にフィッティングした(BIAevaluationソフトウェア)。
関連したEphレセプターEphB3とのMab 2H9の反応を以下の通りに試験した。EphB3を発現する293細胞は、EphB3 ECD配列、NH2末端GDタグ及びCOOH末端GPIリンカーを含有するベクターにて過渡的に形質移入して生成した。48時間後に、Mab 2H9を細胞とともにインキュベートして、その後洗浄し、細胞を上記の通りにFACS分析した。Mab 2H9は、EphB3との非常に低い交差結合を示した。
Mab 2H9は、標準的な方法を用いて測定したところ、アイソタイプIgG1であることが明らかとなった。
精製したMAb 2H9は、ラクトペルオキシダーゼ方法を用いてヨード化し、放射性標識した抗体をPharmacia PD-10カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィによって遊離した125I-Naから精製した。基本的に既に記載されているように(Gladhaug I. P. 等, J. Biol. Chem., 263: 12199-12203, 1988)、内部移行の評価を行った。細胞をヨード化した抗体とともに氷上でインキュベートして、37℃に移して4時間置き、その後4℃で酸/塩/尿素インキュベートして表面結合したリガンドを分離した。全体の表面結合した抗体と内部移行した抗体を、シンチレーションカウンターで測定した。また、EphB2の内部移行を、細胞の免疫蛍光染色法によって評価した。
抗EphB2抗体によりヒトの大腸腫瘍切片の免疫組織化学的染色を、凍結組織切片に行った。結腸直腸腺癌の悪性上皮細胞を含有する切片を、5μg/mlの濃度の一次抗体2H9とともにインキュベートして、その後、ビオチン化したウマ抗マウスIgG親和性精製抗血清とともにインキュベートした。コントロールとして、先の(adjacent)切片を無関係な一次抗体とともにインキュベートして、ヘマトキシリンで対比染色した。
HT1080-EphB2細胞を含有するスライドは、氷上で30分間、1μg/mlの2H9抗体とともにインキュベートして、37℃のCO2インキュベータに移して1時間置いた。スライドをPBSで洗浄して、3%パラホルムアルデヒドに固定して、ローダミンコンジュゲート抗マウスIgG抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories)にて1:2000に希釈して室温で20分間インキュベートした。基本的に既に記載のあるように(Holmes W. 等, Science, 256: 1205-1210, 1992)、漸増濃度の非標識のMab 2H9と組み合わせた固定濃度の125I標識MAb 2H9とともに、氷上で4時間インキュベートして、細胞表面MAb 2H9結合部位の数を推定した。
EphB2のリガンド結合ドメインを決定するために、過渡的形質転換の48時間後に、1μlのEphB2リガンド(91ng/μlのエフリンB1-IgG)をss.EphB2LBD.gD.GPI-293細胞に添加して、細胞を氷上に20分間置いた。2回洗浄した後、細胞をFITCコンジュゲートFc特異的抗ヒトIgG抗体(Sigmaカタログ番号F9512)とともに30分間氷上でインキュベートした。さらに2回洗浄した後、上記のように細胞をFACS分析した。この結果から、EphB2リガンドエフリンB1がEphB2アミノ酸19-208を結合したことを示したため、EphB2リガンド結合ドメインを含有するとして、EphB2アミノ酸19−208を定めた。結合は、コントロールベクターを発現する細胞を用いると結合は観察されなかった。
EphB2のアミノ酸番号19−208にてMab 2H9の反応性を決定するために、Mab 2H9(1μg/ml)又は抗GD抗体(4μg/ml)をss.EphB2LBD.gD.GPI-293細胞とともにインキュベートして、洗浄した後、細胞を上記の通りにFACS分析した。この結果から、そのGDタンパク質とEphB2リガンド結合ドメインタンパク質がこれらの抗体にて検出された。これらの結果は、Mab 2H9がEphB2リガンド結合ドメインを結合することを示した。2H9又は抗GD抗体結合は、コントロールベクターを発現した細胞を用いて観察されなかった。
他で記述されるように(Doronina S. O. 等 Nat. Biotechnol., 21: 778-784, 2003;2004年11月5日に出願の米国特許第10/983,340号)、MC-vc-PAB-MMAEによる抗EphB2抗体2H9とコントロール抗インターロイキン(IL)-8のコンジュゲートと、MC-vc-PAB-MMAFによる2H9のコンジュゲートを行った。2004年11月5日に出願の米国特許第10/983,340号の後に上掲のDoroninaに示されるプロトコールにて、MC-MMAE及びMC-MMAFによる2H9のコンジュゲートを行った。2004年10月8日に出願の米国特許第10/960,602号に記載のように、SMCC-DM1及びSPP-DM1にて2H9のコンジュゲートを行った。
HT1080-EphB2細胞株又はベクターコントロール細胞株を、1.5×103細胞/ウェル(100μl/ウェル)で96ウェルマイクロタイタープレートの各々のウェルに加えて、5%CO2の加湿空気中にて37℃で終夜インキュベートした。細胞を1:3の段階希釈を元にした様々な濃度のMAb 2H9-MC-vc-PAB-MMAE又はMab 抗IL-8-MC-vc-PAB-MMAEに曝した。48時間のインキュベーションの後、Cell Titer-Glo試薬(Promega, Madison, WI)を100μl/ウェルでウェルに加え、室温で10分間インキュベートした後、蛍光シグナルを記録した。
別の実験では、基本的に上記の通りに、HT1080-EphB2細胞を、様々な濃度の2H9-SPP-Dm1、2H9-SMCC-DM1、2H9-MC-vc-PAB-MMAE、2H9-MC-vc-PAB-MMAF又は抗インターロイキン-8-MC-vc-PAB-MMAEに曝し、上記の通りに2日後に細胞生存度を測定した。
実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従って、雌ヌードマウス(Charles River Laboratories, Hollister, CA)を維持した。HT1080-EphB2細胞及びHT1080-GD細胞を回収して、PBSに再懸濁して、6〜8週齢のマウスの左右の横腹のそれぞれに(1×106細胞/腹)、s.c.注入した。腫瘍がおよそ100mm3に達したとき、各動物に、最終用量3mg/kg体重で週1回i.v.で、0.2mlの天然のEphB2 MAb又は2H9-MC-vc-PAB-MMAE又はMab 抗IL-8-MC-vc-PAB-MMAEを腹腔内投与した。既に記載のように、長さ(l)及び幅(w)を計量して、容量(V=lw2/2)を算出することによって腫瘍容積を決定した。
CXF1103腫瘍株によるアッセイを、Oncotest Gmbh (Feiburg, Germany)によって実施した。米国特許第6,271,342を参照。Affymetrixオリゴヌクレオチドアレイ分析を、Oncotestコレクションの、CXF1103においてEphB2 mRNAの発現を示す腫瘍について行った。これはリアルタイムPCR及び免疫組織化学によって確認した。CXF1103は、ヌードマウスの連続継代によって定着されたヒト大腸腫瘍である。NMRIバックグラウンドの10匹のヌードマウスのグループに腫瘍を皮下移植して、ランダム化のために同じサイズの腫瘍を有する30匹のマウスを得た。腫瘍は平均100〜200mgのサイズに大きくした。このとき、溶媒コントロール、コントロール抗体コンジュゲート抗GD-MC-vc-PAB-MMAE、又は抗EphB2抗体コンジュゲート2H9-MC-vc-PAB-MMAEによる処置をi.v.注射にて開始した。3mg/kg体重の抗体コンジュゲートを、7日間の間隔を置いて3週間投与した。
実施例1:癌及び正常なヒト組織におけるEphB2 mRNA及びタンパク質発現の分析
EphB2 mRNA及びタンパク質は、癌組織において過剰発現する。オリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイ発現分析法は、38のヒト結腸直腸腫瘍及び7の正常大腸生検試料について行った。データマイニングにより、大部分の腫瘍では、正常試料の平均発現レベルの2〜6倍のEphB2の過剰発現が明らかとなった(図3A)。大腸癌における過剰発現を確認するために、リアルタイムPCR(TaqMan)を11の更なるヒト結腸直腸腫瘍について行った。その各々は患者が一致する正常大腸試料と比較した。これらのデータは、マイクロアレイデータと非常に一致していた(図3B)。4800以上のヒト生検試料のマイクロアレイデータを含むより大きなデータベースのマイニングでは、EphB2 mRNAが腸組織において主に発現しており、多くの他の組織と比較して、結腸直腸の柔組織癌(例えば線維肉腫及び他の肉腫)及び胃癌において発現が増加したことが示された。
また、EphB2 mRNA発現を、組織マイクロアレイのインサイツハイブリダイゼーションによって調べた。この方法では、EphB2タンパク質発現が検出された正常なヒト組織は大腸及び小腸のみであった。また、様々な癌由来の試料を含有する胃腸組織マイクロアレイにおいてインサイツハイブリダイゼーションを行った。ここで、18の原発性結腸腺癌のうちの12、8の肝臓への転移性腺癌のうちの6、9の原発性胃上皮癌のうちの2、及び4の食道上皮癌のうちの1に、EphB2 mRNA発現が見られた。4の膵臓腺癌のうちの4に、発現は観察されなかった。インサイツハイブリダイゼーションにより正常な結腸粘膜及び結腸直腸癌における発現の実験を図4Aに示す。
Mab 2H9は、ヒト大腸腺癌から得た組織切片と強く反応した(図4B)。EphB2タンパク質発現は、すべての正常な陰窩、及び77%の腺腫、82%の原発性癌及び64%の転移の過剰発現を含め、結腸直腸腫瘍形成のすべての段階で示されている。2005年1月6日に出願中の共有の米国特許出願番号60/642,164を参照。
EphB2の細胞外配列に対する抗体は上記のように調整して、EphB2を発現する細胞のフローサイトメトリ(蛍光標示式細胞分取器)による完全長EphB2及び精製したEphB2抗原と反応するMAbを発現したいくつかのハイブリドーマをクローニングした。陽性ハイブリドーマからのMAbを精製して、内因的にEphB2を発現する結腸直腸癌細胞株及び、レセプターを過剰発現するように操作した細胞株(HT-1080EphB2、及びSVT2EphB2)に対する反応性について比較した。これらのアッセイにおいてMAb設定の2H9を十分に行った。
ELISA分析により、Mab 2H9がヒト及びマウスのEphB2を結合したことが示された。アイソタイプ分析により、Mab 2H9がIgG1アイソタイプを有することが示された。また、Mab 2H9結合親和性をBiaCore分析で測定した。Mab 2H9は、Ka(1/Ms) 8.28E+04、Kd(1/s) 1.03E−05及びKd(nM) 0.12のヒトEphB2を結合した。Mab 2H9は、FACSベースの分析法において、関連したEphレセプターであるEphB3と非常に低い交差反応を示した。
EphB2のチロシンキナーゼ活性は、エフリンBリガンドとレセプターの結合により活性化されうる(Davis S. 等 Science, 266: 816-819, 1994)。これは、ヒトEphB2を発現するマウス3T3細胞株が精製したFc-エフリンB2融合タンパク質とともにインキュベートされた場合に観察された(図5A)。このアッセイにおいてMAb 2H9を試験した。Fc-エフリンB2によるEphB2のチロシン自己リン酸化は、細胞をMab 2H9と予めインキュベートした場合に阻害されるが、コントロール抗体は効果を示さなかった(図5A)。MAb 2H9がEphB2活性化を阻害するメカニズムを調べたところ、リガンド結合の競合的な阻害を伴うことが明らかとなった。これは、MAb 2H9とともに又はMab 2H9なしでインキュベートした後にFc-エフリンB1リガンドとインキュベートした細胞にてフローサイトメトリを行うことによって決定した。この実験では、結合したFc-エフリンB1リガンドへのFITCコンジュゲート抗ヒトFc抗体の特異的な結合からポジティブな蛍光活性化細胞-分類シグナルが得られた。MAb 2H9の量を増やすと、対応してFc-エフリンB1リガンド結合が減少した(図5B)。すべてのインキュベーションを、レセプター内部移行が最小となる氷上で行ったので、取り込まれた抗体媒介性レセプターのために結合はなかった。したがって、MAb 2H9は、EphB2レセプターへのエフリンリガンドの結合を阻害した。
EphB2結合後のMab 2H9の内部移行を調べた。HT1080-EphB2細胞を、MAb 2H9とともに氷上で30分間インキュベートして、その後37℃に移して1時間置いた後、固定して二次抗体にて染色した。実験経過中氷上に置いた細胞と比較して、37℃に移した細胞は、有意な量の内部移行した抗体を含んでいた(図6A)。125I放射性標識した抗体とともに細胞を4℃でインキュベートすることによってMAb 2H9取り込みを調べた。細胞を37℃に移して1時間置いた後に内部移行した125I標識MAb 2H9の量は、4℃に置いたままにした細胞のおよそ2倍であった(図6B)。EphB2への結合の際にMAb 2H9は容易に内部移行された。したがって、Mab 2H9は、抗原-抗体複合体の取り込み又は内部移行により癌細胞内部で薬剤の放出が優先的に生じる免疫コンジュゲート治療法に適する。
エフリンB1-IgGとともにss.EphB2LBD.gD.GPI-293細胞をインキュベートして、その細胞をFACS分析することによって、EphB2リガンド結合ドメインを定めた。この結果から、EphB2リガンドであるEphrinB1がEphB2アミノ酸19−208を結合したので、EphB2リガンド結合ドメインを含有するEphB2アミノ酸19−208を定めた(図11)。コントロールベクターを発現する細胞を用いると結合は観察されなかった。
EphB2リガンド結合ドメインに対するMab 2H9結合は、ss.EphB2LBD.gD.GPI-293細胞とともにMab 2H9又は抗GD抗体をインキュベートして、その細胞をFACS分析することによって調べた。この結果から、GDタンパク質及びEphB2リガンド結合ドメインがこれらの抗体によって検出されたことが示された。これはMab 2H9がEphB2リガンド結合ドメインを結合したことを示唆する。コントロールベクターを発現する細胞を用いると2H9又は抗GD抗体の結合は観察されなかった。
MAb 2H9は、カテプシンBにより切断されやすいリンカーMC-vc-PABを介して薬剤MMAEに共有結合していた(Weiner L. M. Semin. Oncol., 26: 43-51, 1999)。カテプシンBによる切断では、活性なMMAEが放出され、細胞のチュブリン重合の動態力学を崩壊させる。2H9-MC-vc-PAB抗体薬剤コンジュゲート(免疫コンジュゲート)を、HT1080癌細胞を漸増濃度の抗体にて処理することによって、インビトロで試験した。ベクターコントロールHT1080細胞株(HT1080-GD)とEphB2を過剰発現するクローン誘導体(HT1080-EphB2)の両方は、コントロール抗体コンジュゲート抗IL-8-MC-vc-PABと比較して、有意に低い濃度の2H9-MC-vc-PAB-MMAEにより死滅した(図7)。10mg/mlの濃度以下の非誘導体化MAb 2H9では効果は見られなかった。最大半量の細胞死滅(IC50)に必要な抗体濃度は、癌細胞HT1080-EphB2では0.006μg/mlであった。
異なる実験において、基本的には上記の通りに、HT1080-EphB2細胞を様々な濃度の2H9-SPP-Dm1、2H9-SMCC-DM1、2H9-MC-vc-PAB-MMAE、2H9-MC-vc-PAB-MMAF又は抗インターロイキン-8-MC-vc-PAB-MMAEに曝し、上記のように2日後に細胞生存度を測定した。HT1080-EphB2細胞は、コントロール抗体コンジュゲート抗IL-8-MC-vc-PAB-MMAEと比較して、有意に低い濃度の2H9-MC-vc-PAB-MMAE、2H9-SMCC-DM1及び2H9-SPP-DM1により死滅した(図9A)。Ht1080-EphB2細胞は、2H9-MC-vc-PAB、2H9-MC-vc-PAB-MMAF、2H9-SPP-DM1及び2H9-SMCC-DM1により死滅した(図9B)。
2H9-MC-vc-PAB-MMAEは、ヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスに投与することによって、インビボ有効性について試験した。腫瘍は、マウスの一方の脇腹にHT1080-GD細胞をそして、逆側の脇腹にHT1080-EphB2細胞を接種することによって、定着させた。腫瘍は、100〜200mm3のサイズにまで大きくして、週に1回、3mg/kg用量の2H9-MC-vc-PAB-MMAEをi.v.投与した。更なる動物を、溶媒コントロール又は、3mg/kgのコントロール抗体抗IL-8-MC-vc-PAB-MMAEにて処理した。この実験では、HT1080-EphB2細胞株は、コントロール条件下において、HT1080-GDベクターコントロール細胞株より急速に成長した。これは、HT1080-EphB2クローンの以前の試験では腫瘍成長速度に対して再現性のある効果を示さなかったので、EphB2の過剰発現によるものであるとは考えられない。にもかかわらず、両方のタイプの腫瘍は、溶媒コントロール及びコントロール抗体コンジュゲート抗IL-8-MC-vc-PAB-MMAEと比較して、2H9-MC-vc-PAB-MMAEによる治療に十分に応答した(図10A)。コントロール動物グループは、それらの腫瘍の悪性の成長のために、7〜14日の間で死に至った。2H9-MC-vc-PAB-MMAEで処置した動物は、処置を中止する4週まで維持した。対照的に、裸のMab 2H9抗体は、週2回、10mg/kg体重の用量のMAb 2H9を与えられたヌードマウスにおいて、腫瘍異種移植片としてHT1080-EphB2細胞株を成長させて試験した。しかしながら、このアッセイでは、裸のMAb 2H9による処置により腫瘍成長の速度に有意な効果が全く得られなかった。
インビボ有効性の更なる試験として、ヌードマウスの連続継代により定着されたヒト大腸腫瘍を皮下に移植して、上記のHT1080モデルについて記載されたのと同じように治療経過中その成長を測定した。溶媒コントロール又はコントロール抗体抗GD-MC-vc-PAB-MMAEと比較して、2H9-MC-vc-PAB-MMAEによって、有意な成長遅延が再び観察された(図10B)。全体として、これらの結果から、インビボ腫瘍成長モデルの2H9-MC-vc-PAB-MMAEの特異性及び有効性が示された。
細胞株 ATCC受託番号 受託日
ハイブリドーマ2H9.11.14 PTA-6606 2005年2月24日
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。これらの細胞株はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、関連の米国特許の発行及び任意の米国又は外国特許出願の公開のうち、いずれか早く行なわれた方の時点で、これらの細胞株を永久且つ非制限的に入手可能とすることを保証し、35USC122条及びそれに従う特許商標庁長官規則(特に参照番号886OG638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に細胞株を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した細胞株が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託された細胞株の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
Claims (42)
- (a) 配列KSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)を含むHVR-L1;
(b) 配列GASTRES (配列番号2)を含むHVR-L2;
(c) 配列QNDHSYPFT (配列番号3)を含むHVR-L3;
(d) 配列SYWMH (配列番号4)を含むHVR-H1;
(e) 配列FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)を含むHVR-H2;及び
(f) 配列RLKLLRYAMDY (配列番号6)を含むHVR-H3、
からなる群から選択される少なくとも1、2、3、4、5及び/又は6の高頻度可変領域(HVR)配列を含有し、ヒトEphB2に特異的に結合する抗EphB2抗体。 - KSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)、GASTRES (配列番号2)、及びQNDHSYPFT (配列番号3)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む軽鎖を含有してなる、請求項1に記載の抗EphB2抗体。
- SYWMH (配列番号4)、FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)、及びRLKLLRYAMDY (配列番号6)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む重鎖を含有してなる、請求項1又は2に記載の抗EphB2抗体。
- (a) SYWMH (配列番号4)、FINPSTGYTDYNQKFKD (配列番号5)、及びRLKLLRYAMDY (配列番号6)からなる群から選択されるHVR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む重鎖;と
(b) KSSQSLLNSGNQENYLA (配列番号1)、GASTRES (配列番号2)、及びQNDHSYPFT (配列番号3)からなる群から選択されるCDR配列の少なくとも1、少なくとも2、又は3つすべてを含む軽鎖
を含有してなる、請求項1に記載の抗EphB2抗体。 - 配列:DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQENYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGAGTKVEIKR (配列番号7)を有する軽鎖可変ドメインを含有してなる、請求項1に記載の抗EphB2抗体。
- 配列:QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGFINPSTGYTDYNQKFKDKATLTVKSSNTAYMQLSRLTSEDSAVYYCTRRLKLLRYAMDYWGQGTTLTVSA (配列番号8)を有する重鎖可変ドメインを含有してなる、請求項1又は5に記載の抗EphB2抗体。
- 米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株により産生される抗体のHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2、及びHVR-H3からなる群から選択される配列を含む少なくとも1の高頻度可変配列を含有し、ヒトEphB2に特異的に結合する単離された抗体。
- 米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株により産生される抗体の重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメインを含有し、ヒトEphB2に特異的に結合する単離された抗体。
- 米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株により産生される抗体と同じヒトEphB2上のエピトープに結合する単離された抗体。
- ヒトEphB2への結合について、米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株により産生される抗体と競合する単離された抗体。
- 米国のTissue Type Culture(ATCC)番号PTA-6606を有するハイブリドーマ細胞株の抗体コード化配列によってコードされる単離された抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1ないし11の何れか一に記載の抗体。
- 前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体からなる群から選択されるものである、請求項1ないし12の何れか一に記載の抗体。
- 前記抗体が抗体断片である、請求項1ないし12の何れか一に記載の抗体。
- 前記抗体が成長阻害剤とコンジュゲートしている、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体。
- 前記抗体が細胞障害性剤とコンジュゲートしている、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体。
- 前記細胞障害性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体及び核溶解性酵素からなる群から選択される、請求項16に記載の抗体。
- 前記抗体が、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン及びカリケアマイシンからなる群から選択される薬剤とコンジュゲートしている、請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体。
- 前記薬剤が、DM1、DM3、DM4、MMAE及びMMAFからなる群から選択される、請求項18に記載の抗体。
- 請求項1ないし14の何れか一に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項20に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項21に記載のベクター。
- 請求項21又は22に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項23に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項23に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項25に記載の宿主細胞。
- (a) 好適な宿主細胞内で請求項22に記載のベクターを発現する、そして(b) 抗EphB2抗体を回収することを含む、抗EphB2抗体の作製方法。
- (a) 好適な宿主細胞内で請求項22に記載のベクターを発現する、そして(b) 抗EphB2抗体を回収することを含む、抗EphB2イムノコンジュゲートの作製方法。
- 前記宿主細胞が原核細胞である、請求項27又は28に記載の方法。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項27又は28に記載の方法。
- 請求項1ないし19の何れか一に記載の抗EphB2抗体の有効量を、治療が必要な被検体に投与することを含む、EphB2の発現の増加又は活性の増加に関連する腫瘍、癌又は細胞増殖性疾患を治療又は予防するための方法。
- 前記癌が、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、乳癌、胃癌、結腸直腸癌及び肝細胞癌からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記癌が結腸直腸癌である、請求項32に記載の方法。
- 請求項15ないし19の何れか一に記載の抗EphB2抗体の有効量を、治療が必要な被検体に投与することを含む、癌又は腫瘍細胞を死滅させる方法。
- 前記の癌又は腫瘍細胞が大腸癌細胞又は胃癌細胞である、請求項34に記載の方法。
- 生体試料においてEphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む、EphB2の検出方法。
- EphB2発現の増加と関連する疾患を有する又は有すると思われる患者の生体試料においてEphB2-抗EphB2抗体複合体を検出することを含む、EphB2発現の増加と関連する疾患を診断するための方法。
- 前記疾患が、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患である、請求項37に記載の方法。
- 前記抗EphB2抗体が検出可能に標識される、請求項36ないし38の何れか一に記載の方法。
- 請求項1ないし19の何れか一に記載の抗EphB2抗体を含有する組成物。
- 請求項20ないし22の何れか一に記載のポリヌクレオチドを含有してなる組成物。
- さらに担体を含有してなる、請求項40又は41に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US64854105P | 2005-01-31 | 2005-01-31 | |
US75684406P | 2006-01-05 | 2006-01-05 | |
PCT/US2006/003502 WO2006083936A2 (en) | 2005-01-31 | 2006-01-31 | Anti-ephb2 antibodies and methods using same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2008537673A true JP2008537673A (ja) | 2008-09-25 |
JP2008537673A5 JP2008537673A5 (ja) | 2009-02-26 |
Family
ID=36341431
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007553371A Pending JP2008537673A (ja) | 2005-01-31 | 2006-01-31 | 抗ephb2抗体とその使用方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7767205B2 (ja) |
EP (1) | EP1844076A2 (ja) |
JP (1) | JP2008537673A (ja) |
AU (1) | AU2006210837B2 (ja) |
CA (1) | CA2594636A1 (ja) |
NZ (1) | NZ556317A (ja) |
WO (1) | WO2006083936A2 (ja) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1545613B9 (en) | 2002-07-31 | 2012-01-25 | Seattle Genetics, Inc. | Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease |
KR101520209B1 (ko) | 2003-11-06 | 2015-05-13 | 시애틀 지네틱스, 인크. | 리간드에 접합될 수 있는 모노메틸발린 화합물 |
US8288352B2 (en) | 2004-11-12 | 2012-10-16 | Seattle Genetics, Inc. | Auristatins having an aminobenzoic acid unit at the N terminus |
JP5007238B2 (ja) * | 2005-01-06 | 2012-08-22 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 癌の予後予測、診断および治療に有用な方法および組成物 |
WO2007008848A2 (en) | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus |
CA2614436C (en) | 2005-07-07 | 2016-05-17 | Seattle Genetics, Inc. | Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the c-terminus |
US7750116B1 (en) | 2006-02-18 | 2010-07-06 | Seattle Genetics, Inc. | Antibody drug conjugate metabolites |
AU2007291891B2 (en) | 2006-08-31 | 2013-10-31 | A.C.N. 135 493 391 Pty Ltd | Treatment and/or prevention of non-infectious medical conditions using antibody-containing compositions |
TW200918089A (en) | 2007-07-16 | 2009-05-01 | Genentech Inc | Humanized anti-CD79b antibodies and immunoconjugates and methods of use |
JP5469600B2 (ja) | 2007-07-16 | 2014-04-16 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗CD79b抗体及びイムノコンジュゲートとその使用方法 |
US20090309617A1 (en) * | 2007-08-24 | 2009-12-17 | Ye Fang | Biosensor antibody functional mapping |
SI2657253T1 (sl) | 2008-01-31 | 2017-10-30 | Genentech, Inc. | Protitelesa proti CD79b in imunokonjugati in postopki za uporabo |
WO2011057147A1 (en) | 2009-11-07 | 2011-05-12 | Astute Medical, Inc. | Methods and compositions for diagnosis and prognosis of renal injury and renal failure |
US9981046B2 (en) | 2012-05-15 | 2018-05-29 | Concortis Biosystems, Corp., a wholly owned Subsidiary of Sorrento Therapeutics, Inc. | Drug-conjugates, conjugation methods, and uses thereof |
AU2014337317A1 (en) | 2013-10-15 | 2016-09-15 | Sorrento Therapeutics Inc. | Drug-conjugates with a targeting molecule and two different drugs |
US11103593B2 (en) | 2013-10-15 | 2021-08-31 | Seagen Inc. | Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics |
CN106536551B (zh) * | 2014-02-06 | 2021-04-16 | X4制药(奥地利)有限责任公司 | 大肠杆菌特异性抗体序列 |
PL3262071T3 (pl) | 2014-09-23 | 2020-08-10 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Sposób stosowania immunokoniugatów anty-CD79b |
JP6871858B2 (ja) | 2015-01-28 | 2021-05-19 | ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドSorrento Therapeutics, Inc. | 抗体薬物コンジュゲート |
WO2017089606A1 (en) * | 2015-11-26 | 2017-06-01 | Kotter Mark Reinhard | Therapy to increase remyelination |
US11793880B2 (en) | 2015-12-04 | 2023-10-24 | Seagen Inc. | Conjugates of quaternized tubulysin compounds |
AU2016363013B2 (en) | 2015-12-04 | 2022-03-10 | Seagen Inc. | Conjugates of quaternized tubulysin compounds |
AU2017237186A1 (en) | 2016-03-25 | 2018-11-01 | Seagen Inc. | Process for the preparation of PEGylated drug-linkers and intermediates thereof |
EP3436480A4 (en) | 2016-03-30 | 2019-11-27 | Musc Foundation for Research Development | METHOD FOR THE TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER BY TARGETING GLYCOPROTEIN A REPETITION PREDOMINANT (GARP) AND FOR EFFECTIVE IMMUNOTHERAPY ALONE OR IN COMBINATION |
US11730822B2 (en) | 2017-03-24 | 2023-08-22 | Seagen Inc. | Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004529614A (ja) * | 2000-11-20 | 2004-09-30 | カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 動脈平滑筋及び静脈平滑筋並びにそれらの利用 |
JP2007514652A (ja) * | 2003-11-06 | 2007-06-07 | シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド | リガンドに結合体化可能なモノメチルバリン化合物 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5622701A (en) * | 1994-06-14 | 1997-04-22 | Protein Design Labs, Inc. | Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin |
EP1992643A3 (en) * | 2001-06-20 | 2008-12-10 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
PT1517921E (pt) * | 2002-06-28 | 2006-09-29 | Domantis Ltd | Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada |
AU2003291736A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-06-03 | Cell Signaling Technology, Inc. | Methods and materials for examining pathways associated with glioblastoma progression |
CA2559870A1 (en) * | 2004-04-07 | 2005-10-27 | Genetech,Inc. | Mass spectrometry of antibody conjugates |
JP5007238B2 (ja) * | 2005-01-06 | 2012-08-22 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 癌の予後予測、診断および治療に有用な方法および組成物 |
-
2006
- 2006-01-31 JP JP2007553371A patent/JP2008537673A/ja active Pending
- 2006-01-31 WO PCT/US2006/003502 patent/WO2006083936A2/en active Application Filing
- 2006-01-31 NZ NZ556317A patent/NZ556317A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-01-31 AU AU2006210837A patent/AU2006210837B2/en not_active Ceased
- 2006-01-31 EP EP06720045A patent/EP1844076A2/en not_active Ceased
- 2006-01-31 CA CA002594636A patent/CA2594636A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-07-31 US US11/831,787 patent/US7767205B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-06-08 US US12/796,496 patent/US20100278842A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004529614A (ja) * | 2000-11-20 | 2004-09-30 | カリフォルニア・インスティテュート・オブ・テクノロジー | 動脈平滑筋及び静脈平滑筋並びにそれらの利用 |
JP2007514652A (ja) * | 2003-11-06 | 2007-06-07 | シアトル ジェネティックス, インコーポレイテッド | リガンドに結合体化可能なモノメチルバリン化合物 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CANCER RES., vol. 64, JPN6011040978, 2004, pages 781 - 788, ISSN: 0001984573 * |
CANCER RES., vol. 64, JPN6011040980, 2004, pages 3179 - 3185, ISSN: 0001984574 * |
J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 42, JPN6011040983, 2001, pages 38940 - 38948, ISSN: 0001984575 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2006210837B2 (en) | 2012-07-12 |
NZ556317A (en) | 2011-01-28 |
WO2006083936A2 (en) | 2006-08-10 |
US20080254024A1 (en) | 2008-10-16 |
WO2006083936A3 (en) | 2007-01-11 |
EP1844076A2 (en) | 2007-10-17 |
CA2594636A1 (en) | 2006-08-10 |
AU2006210837A1 (en) | 2006-08-10 |
US20100278842A1 (en) | 2010-11-04 |
US7767205B2 (en) | 2010-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7767205B2 (en) | Anti-EphB2 antibodies and methods using same | |
JP6234962B2 (ja) | 抗ephb4抗体およびその使用方法 | |
JP5623272B2 (ja) | 抗notch1nrr抗体とその使用方法 | |
JP5902130B2 (ja) | 抗エフリンb2抗体とその使用方法 | |
JP2009539384A (ja) | 抗dll4抗体および抗dll4抗体使用の方法 | |
JP5364137B2 (ja) | Egfl7に対する抗体とその使用方法 | |
JP2009519718A (ja) | 抗ox40l抗体とその使用方法 | |
JP2009533019A (ja) | 抗tat226抗体とイムノコンジュゲート | |
JP2009525764A (ja) | 抗fgf19抗体およびその使用方法 | |
TWI391402B (zh) | 抗ephb4抗體及使用該抗體之方法 | |
TWI429655B (zh) | 抗egfl7抗體、包含其之組合物、編碼其之多核苷酸及其製造及使用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090107 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090107 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110823 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20111124 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20111201 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111222 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120507 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130226 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130527 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130603 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130625 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130702 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20140204 |