JP2009533019A - 抗ｔａｔ２２６抗体とイムノコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

抗ＴＡＴ２２６抗体及びそのイムノコンジュゲートが提供される。抗ＴＡＴ２２６抗体及びそのイムノコンジュゲートの使用方法が提供される。

Description

本出願は、出典明記によって開示内容の全体が本明細書中に援用される、２００６年３月１７日に出願の米国仮特許出願第６０／７８３７４６の優先権を主張するものである。
（発明の分野）
本発明は抗ＴＡＴ２２６抗体とそのイムノコンジュゲートに関する。本発明は、さらに、抗ＴＡＴ２２６抗体とそのイムノコンジュゲートの使用方法に関する。
（発明の背景）
癌細胞の表面上に発現されるポリペプチドに結合する抗体は、有効な抗癌療法であることが明らかにされている。このような抗体は、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)の活性化；補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)の抗体による誘導；サイトカイン放出の促進；及び、アポトーシスの誘導を含む様々なメカニズムにより作用する。例として、Cardarelli等 (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51:15-24を参照。例えば、ハーセプチン(HERCEPTIN(登録商標))及びリツキサン(RITUXAN(登録商標))(ともにGenentech Inc., South San Francisco, Californiaから提供)は、それぞれ乳癌及び非ホジキンリンパ腫を治療するために成功裏に用いられている抗体である。ハーセプチン(登録商標)は、ヒト上皮細胞増殖因子レセプター２(ＨＥＲ２)プロトオンコジーンの細胞外ドメインに選択的に結合する組換えＤＮＡ由来のヒト化モノクローナル抗体である。原発性乳癌の２５〜３０％にＨＥＲ２タンパク質の過剰発現が観察される。リツキサン(登録商標)は、正常及び悪性のＢリンパ球の表面上に見られるＣＤ20抗原に対する遺伝子操作を施したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体である。両抗体は、ＣＨＯ細胞で組み換えて生産される。ハーセプチン(登録商標)は、少なくともある程度、血管新生を阻害することによって作用するようであり(Izumi等 (2002) Nature 416:279-280)、リツキサン(登録商標)は、少なくともある程度、アポトーシスを誘導することによって作用するようである(Cardarelli等 (2002) Cancer Immunol. Immunother. 51:15-24)。
イムノコンジュゲート又は「抗体-薬剤コンジュゲート」は、癌の治療において細胞障害性剤の局所への運搬に有用である。例として、Syrigos等 (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz等 (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 26: 151-172；米国特許第４９７５２７８号を参照。イムノコンジュゲートにより薬剤部分の腫瘍への標的とした運搬が可能になるのに対して、コンジュゲートしていない細胞障害性剤の全身投与により除去しようとする腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対して許容できない程度の毒性が生じうる。Baldwin等 (Mar. 15, 1986) Lancet pp. 603-05；Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications (A. Pinchera等, eds.) pp. 475-506のThorpe (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,"を参照。細胞表面ポリペプチドを標的とするイムノコンジュゲートは、癌の治療のために開発されており、また開発されつつある。参考として、例としてHamann等 (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103を参照。
診断及び／又は治療の目的のために細胞表面ポリペプチドを標的とする薬剤の継続的な必要性があることは明らかである。本明細書中に記載される発明は、この必要性を満たし、他の利点を提供するものである。
特許出願及び刊行物を含む本明細書中で引用されるすべての参考文献は、出典明記によってそれらの全体が援用される。
（概説）
本発明は、抗ＴＡＴ２２６抗体とその使用方法を提供する。
ある態様では、
(1) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(2) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(3) 配列番号：１１のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(4) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(5) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(6) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体を提供する。
ある態様では、ＴＡＴ２２６に結合する抗体は、(a) 配列番号：１１のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b)
(1) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(2) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(3) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(4) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(5) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含んでなる。
ある実施態様では、抗体は、配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列とを含むＨＶＲ-Ｌ２を含んでなる。
ある実施態様では、抗体は、配列番号：６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：１４〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる。ある実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ3は配列番号：１０のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ1と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる。
ある態様では、
(1) 配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(3) 配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；
(4) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(5) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(6) 配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体を提供する。
ある態様では、ＴＡＴ２２６に結合する抗体は、(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b)
(1) 配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(3) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(4) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(5) 配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含んでなる。
ある実施態様では、抗体は、配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる。
ある実施態様では、前記のいずれかの抗体はさらに、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク及びＶＬサブグループIコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも１のフレームワークを含む。
ある態様では、配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体が提供される。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、重鎖可変ドメインは配列番号：２４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：２９のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、重鎖可変ドメインは配列番号：２５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：３０のアミノ酸配列を含む。
ある態様では、配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体が提供される。ある実施態様では、抗体はさらに、配列番号：２６のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる。ある実施態様では、重鎖可変ドメインは配列番号：２０のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは配列番号：２６のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様では、前記いずれかの抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、前記リヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、前記ベクターを含む宿主細胞が提供される。ある実施態様では、宿主細胞は真核生物である。ある実施態様では、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。ある実施態様では、抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に適切な条件下で宿主細胞を培養し、抗体を単離することを含む、抗ＴＡＴ２２６抗体の作製方法が提供される。
ある態様では、細胞の表面上に発現されるＴＡＴ２２６に結合する抗体が提供される。ある実施態様では、抗体は、配列番号：７５のアミノ酸２１−１１５のＴＡＴ２２６の領域内のエピトープに結合する。ある実施態様では、前記細胞は癌細胞である。ある実施態様では、前記癌細胞は、卵巣癌細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞である。
ある実施態様では、前記いずれかの抗体はモノクローナル抗体である。ある実施態様では、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２の断片から選択される抗体断片である。ある実施態様では、抗体はヒト化である。ある実施態様では、抗体はヒトである。ある実施態様では、抗体は、ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６から選択される抗体と同じエピトープに結合する。
ある態様では、ＴＡＴ２２６への抗体の結合に許容される条件下で前記いずれかの抗体と生体試料を接触させ、抗体とＴＡＴ２２６との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む、生体試料においてＴＡＴ２２６の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様では、生体試料は、卵巣腫瘍細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞を含む。
ある態様では、ＴＡＴ２２６の発現の増加と関係する細胞増殖性疾患の診断方法であって、前記いずれかの抗体と試験細胞を接触させ、ＴＡＴ２２６への抗体の結合を検出することによってＴＡＴ２２６の発現レベルを測定し、そして、試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルをコントロール細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルと比較することを含み、コントロール細胞と比べて試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルが高い場合にＴＡＴ２２６の発現の増加に関連する細胞増殖性疾患の存在が示される方法が提供される。ある実施態様では、試験細胞は細胞増殖性疾患があると疑われる患者からの細胞である。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は卵巣癌及びウィルムス腫瘍から選択される。ある実施態様では、前記方法は、試験細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルを決定し、試験細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルをコントロール細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルと比較することを含む。
本発明はさらに、イムノコンジュゲートとその使用方法を提供する。
ある態様では、イムノコンジュゲートは細胞障害性剤に共有結合された前記いずれかの抗ＴＡＴ２２６抗体を含んでなる。ある実施態様では、細胞障害性剤は、毒素、化学療法剤、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素から選択される。
ある態様では、
(a) Ａｂは前記いずれかの抗ＴＡＴ２２６抗体であり、
(b) Ｌはリンカーであり、
(c) Ｄは式ＤＥ又はＤＦの薬剤であり、
Figure 2009533019
Figure 2009533019
このとき、Ｒ２及びＲ６それぞれがメチルであり、Ｒ３及びＲ４それぞれがイソプロピルであり、Ｒ７がｓｅｃ−ブチルであり、それぞれのＲ８がＣＨ３、Ｏ−ＣＨ３、ＯＨ及びＨから別々に選択され、Ｒ９がＨであり、Ｒ１０がアリールであり、Ｚが−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１がＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−(ＣＨ２)２−Ｏ−(ＣＨ２)２−Ｏ−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ３であり、そして、Ｒ１８が−Ｃ(Ｒ８)２−Ｃ(Ｒ８)２−アリールであり、
(d) ｐがおよそ１から８の範囲である、
式 Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐを有するイムノコンジュゲートが提供される。
ある実施態様では、抗体(Ａｂ)は、1) 配列番号：１１のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、2) 以下、
(i) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
(ii) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
(iii) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
(iv) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
(v) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含んでなる。
ある実施態様では、抗体は、配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる。ある実施態様では、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。
以下の実施態様は前記いずれかのイムノコンジュゲートをさらに提供する。ある実施態様では、イムノコンジュゲートはインビトロ又はインビボでの細胞殺傷活性を有する。ある実施態様では、リンカーは抗体のチオール基を介して抗体に付着している。ある実施態様では、リンカーはプロテアーゼによって切断可能である。ある実施態様では、リンカーはｖａｌ−ｃｉｔジペプチドを含む。ある実施態様では、リンカーはｐ-アミノベンジルユニットを含む。ある実施態様では、ｐ-アミノベンジルユニットは薬剤とリンカーのプロテアーゼ切断部位との間に配置する。ある実施態様では、ｐ-アミノベンジルユニットはｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢ)である。ある実施態様では、リンカーは６-マレイミドカプロイルを含む。ある実施態様では、６-マレイミドカプロイルは抗体とリンカーのプロテアーゼ切断部位との間に配置する。前記の実施態様は単独で行われても、他のいずれかと組み合わせて行われてもよい。
ある実施態様では、薬剤はＭＭＡＥ及びＭＭＡＦから選択される。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、式
Figure 2009533019
を有し、このときＡｂは前記いずれかの抗ＴＡＴ２２６抗体であり、Ｓは硫黄原子であり、ｐは２から５の範囲である。ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、式
Figure 2009533019
を有し、このときＡｂは前記いずれかの抗ＴＡＴ２２６抗体であり、Ｓは硫黄原子であり、ｐは２から５の範囲である。
ある態様では、前記いずれかのイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含有する薬剤的組成物が提供される。ある態様では、薬剤的組成物を個体に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法が提供される。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍及びウィルムス腫瘍から選択される。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現の増加と関係している。
ある態様では、ＴＡＴ２２６へのイムノコンジュゲートの結合に許容される条件下で、前記いずれかのイムノコンジュゲートに細胞を曝すことを含む、細胞増殖の阻害方法が提供される。ある実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。ある実施態様では、腫瘍細胞は卵巣腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞である。ある実施態様では、細胞は異種移植片である。ある実施態様では、インビトロで曝される。ある実施態様では、インビボで曝される。
（本発明の実施態様の詳細な説明）
ＴＡＴ２２６に結合する単離された抗体が提供される。さらに、抗ＴＡＴ２２６抗体を含んでなるイムノコンジュゲートが提供される。本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、例えば、ＴＡＴ２２６の発現の変更、例えば発現の増加と関係している疾患の診断又は治療に有用である。ある実施態様では、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、腫瘍又は癌などの細胞増殖性疾患の診断又は治療に有用である。ある実施態様では、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、ＴＡＴ２２６、例えば細胞表面上に発現されるＴＡＴ２２６の検出に有用である。
抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供され、さらに該ベクターを含む宿主細胞が提供される。また、本発明のポリヌクレオチド、抗ＴＡＴ２２６抗体又はイムノコンジュゲートのいずれか一又は複数を含有する製剤を含む組成物が提供される。
I．一般的技術
本願明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))；the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, 編集, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, 編集, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney), 編集, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, 及び D. G. Newell, 編集, 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir 及び C. C. Blackwell, 編集)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller 及び M. P. Calos, 編集, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 等, 編集, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan 等, 編集, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley 及び Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway 及び P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., 編集, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd 及び C. Dean, 編集, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow 及び D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti 及び J. D. Capra, 編集, Harwood Academic Publishers, 1995)；及び Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等, 編集, J.B. Lippincott Company, 1993)。
II．定義と省略記号
Ａ．定義
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の研究、診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、タンパク質は、(１)例えばローリー法で測定した場合９５％を超える抗体、ある実施態様では９９重量％を超えるまで、(２)例えばスピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)例えばクーマシーブルーあるいは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで十分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、例えば天然の環境に通常付随している少なくとも一の他の核酸分子から分離された核酸分子である。さらに、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子を通常発現するが、その核酸分子がその天然の染色体位置と異なる染色体位置にあるか又は染色体外に存在する、細胞に含まれる核酸分子を含む。
「精製」とは、分子が、含まれる試料中の重量にして少なくとも９５％、又は重量にして少なくとも９８％の濃度で試料中に存在することを意味する。
ここで用いる「実質的に類似」、「実質的に同じ」なる用語は、当業者が２つの数値(例えば、本発明の抗体に関連するもの、及び参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が有意に類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較値の例えば約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、及び／又は約１０％以下である。
ここで用いる「実質的に減少」、又は「実質的に異なる」という句は、当業者が２つの数値(一般に、分子に関連するもの、及び参照／比較分子に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上統計学的に有意であると認められるほど、２つの数値が有意に異なっていることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較分子の値の、例えば約１０％より大きく、約２０％より大きく、約３０％より大きく、約４０％より大きく、及び／又は約５０％より大きい。
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二本鎖ＤＮＡを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後になされる修飾(一又は複数)、例えば標識との結合を含みうる。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
ここで使用される「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
ここで同定した参照ポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定の参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのプログラムアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
本明細書中で用いる「ＴＡＴ２２６」なる用語は、特段の記載がない限り、霊長類などの哺乳動物(例えばヒト)及び齧歯類(例えばマウス及びラット)を含む任意の脊椎動物種の任意の天然のＴＡＴ２２６を指す。この用語は、「完全長」、未処理のＴＡＴ２２６、並びに細胞におけるプロセシングから生じるいずれかの形態のＴＡＴ２２６を包含する。また、この用語は、天然に生じるＴＡＴ２２６の変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子型変異体を包含する。ＴＡＴ２２６の「成熟形態」は、プロセシングされていないＴＡＴ２２６の形態、例えば、ＧＰＩアンカーの結合によるＮ末端(例えばシグナル配列)及び／又はＣ末端の切断及び／又は修飾が行われたＴＡＴ２２６の形態である。一実施態様では、ＴＡＴ２２６の「成熟形態」は細胞表面上に発現される。
「抗体」(Ａｂ)及び「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体と、一般に抗原特異性を欠く抗体様分子の双方を含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系では低レベルで、骨髄腫では高レベルで産出される。
「抗体」及び「免疫グロブリン」なる用語は、最も広義で相互に交換可能に使用され、モノクローナル抗体(例えば、全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、一価抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物活性を示す限り二重特異性抗体)が含まれ、さらにある種の抗体断片(ここに詳細に記載されるもの)も含まれ得る。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化及び／又は親和成熟したものであってよい。
「抗ＴＡＴ２２６抗体」又は「ＴＡＴ２２６に結合する抗体」は、抗体がＴＡＴ２２６をターゲッティングする際に診断用及び／又は治療用の薬剤として有用である程度に十分な親和性を有してＴＡＴ２２６を結合することが可能である抗体を指す。好ましくは、関係がなくＴＡＴ２２６でないタンパク質への抗ＴＡＴ２２６抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)によって測定するところの、ＴＡＴ２２６への抗体の結合のおよそ１０％未満である。ある実施態様では、ＴＡＴ２２６に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０.１ｎＭの解離定数(Ｋｄ)を有する。ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、異なる種のＴＡＴ２２６間で保存されるＴＡＴ２２６のエピトープに結合する。
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを意味する。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と称されうる。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と称されうる。これらのドメインは一般に抗体の最も可変の部分であり、抗原結合部位を含む。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域(ＨＶＲ)と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、例えば、Abbas等．Cellular and Mol. Immunology, 第４版(2000)に概説されている。抗体は、抗体と１以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合性又は非共有結合性の会合により形成された融合大分子の一部であり得る。
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、ほぼインタクトな形態の抗体を指し、以下に定義するような抗体断片は意味しない。この用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、及び多ければその殆ど又は全てを保持する。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片である。ある実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)種では、柔軟なペプチドリンカーによって１の重鎖及び１の軽鎖可変ドメインは共有結合性に連鎖することができ、よって軽鎖及び重鎖は、二本鎖Ｆｖ種におけるものと類似の「二量体」構造に連結することができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは二価でも二特異性であってもよい。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまたHudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134に記載されている。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある突然変異、例えば自然に生じる突然変異を除いて同一である。従って、「モノクローナル」との形容は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。ある実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この場合、標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、この選択プロセスは、雑種細胞クローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールのような複数のクローンからの、唯一のクローンの選択とすることができる。重要なのは、選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的への親和性の向上、標的結合配列のヒト化、細胞培養液中におけるその産生の向上、インビボでの免疫原性の低減、多選択性抗体の生成等が可能になること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることである。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の調製物は、それらが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
「モノクローナル」との形容は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作製することができ、それらの技術には、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981))、組換えＤＮＡ法(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5);1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immounol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004))、並びに、ヒト免疫グロブリン座位の一部又は全部、或るいはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒト又はヒト様抗体を生成する技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号；国際公開第９６／３４０９６号；国際公開第９６／３３７３５号；国際公開第９１／１０７４１号；Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362: 255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号; Marks等, Bio.Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368: 812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996)及びLonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)参照)が含まれる。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施態様では、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。また次の文献とそこに引用されている文献を参考のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle及びGross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つの高頻度可変領域を含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つの高頻度可変領域のうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。
多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これら高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ カバット ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
「親和成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数のＨＶＲにおいて一又は複数の改変を持つものである。一実施態様では、親和成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において知られている手順によって生産される。Marks等, Bio/Technology, 10：779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘導は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91：3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169：147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol.226：889-896(1992)に記載されている。
「阻止(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低下させる抗体である。特定の阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を、ほぼ又は完全に阻害する。
本明細書において使用する「アゴニスト」抗体は、対象とするポリペプチドの機能活性の少なくとも一つを模倣する抗体である。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。ある実施態様では、ＦｃＲは天然のヒトＦｃＲである。ある実施態様では、ＦｃＲはＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif；ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送と(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれる。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシンのようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド集団、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合集団を包含しうる。
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。ある実施態様では、既存のアミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下又は２以下である。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみ起こり、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、上掲のKabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、上掲のKabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:50)-H1-WVRQAPGKGLEWV (配列番号:51)-H2-RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYC (配列番号:59)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:35)
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:60)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:61)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:62)-L3-FGQGTKVEIK (配列番号:63)
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、以下のアッセイで示されるような、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは平衡状態に達したことを確認するまでに長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。
「疾病」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状又は疾患である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病を含む。限定的なものではなく、腫瘍などの癌性症状、例えば、カルチノーマ(上皮腫瘍)及び芽細胞腫(胚組織に由来する腫瘍)、いくつかの実施態様では、卵巣癌、子宮癌(子宮体癌を含む)、脳腫瘍(例えば、星状細胞腫及び膠腫)、及び腎芽細胞腫(例えば、ウィルムス腫瘍)を含む腎臓癌が含まれる。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫(例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、グリオーマ、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、白血病及び他のリンパ系増殖性疾患、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。
ここで使用されるところの「治療」(及び「処置」又は「治療する」などの変形句)は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるため又は疾患又は疾病の進行をゆっくりにするために用いられる。
「個体」は脊椎動物である。ある実施態様では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。ある実施態様では、哺乳動物はヒトである。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子の能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子の任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回る量を包含する。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死ないしは破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
「毒素」は、細胞の成長又は増殖に対して有害な作用を有することができる任意の物質である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポシロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(XELODA(登録商標))；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター(EGF-R)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(LURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(ABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞(例えばＴＡＴ２２６を発現する細胞)の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＴＡＴ２２６を発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「細胞内代謝物」なる用語は、抗体-抗原コンジュゲート(ＡＤＣ)上の細胞内部で代謝プロセス又は反応から生じている化合物に関する。代謝プロセス又は反応はＡＤＣのペプチドリンカーのタンパク質切断や、ヒドラゾン、エステル又はアミドなどの官能基の加水分解といった酵素的な過程であってもよい。細胞内代謝物には、限定するものではないが、細胞内への移行、拡散、取り込み又は輸送後に細胞内切断が行われた遊離薬剤及び抗体が含まれる。
「細胞内に切断される」及び「細胞内切断」なる用語は、抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)に対する細胞内の代謝プロセス又は反応であって、これによって薬剤成分(Ｄ)と抗体(Ａｂ)間の共有結合、すなわちリンカーが壊れ、その結果、細胞内の抗体から遊離した薬剤が分離される。ゆえに、ＡＤＣの切断された成分は細胞内代謝物である。
「生物学的利用能」なる用語は、患者に投与される薬剤の所定の量の全身有効性(すなわち、血液／血しょう濃度)を指す。生物学的利用能は、投与された用量形態から体循環に達する薬剤の時間(速度)と総量(程度)の測定値を示す絶対的な用語である。
「細胞障害活性」なる用語は、抗体-薬剤コンジュゲート又は抗体-薬剤コンジュゲートの細胞内代謝物の細胞殺傷効果、細胞増殖抑制効果又は増殖阻害効果を指す。細胞障害活性は、細胞の半分が生存する単位容量当たりの濃度(モル又は質量)であるＩＣ５０値として表されてもよい。
「アルキル」は、ノルマル、第２級、第３級、又は環式の炭素原子を含むＣ１-Ｃ１８炭化水素である。例として、methyl (Me、-CH3)、ethyl (Et、-CH2CH3)、1-propyl (n-Pr、n-propyl、-CH2CH2CH3)、2-propyl (i-Pr、i-propyl、-CH(CH3)2)、1-butyl (n-Bu、n-butyl、-CH2CH2CH2CH3)、2-methyl-1-propyl (i-Bu、i-butyl、-CH2CH(CH3)2)、2-butyl (s-Bu、s-butyl、-CH(CH3)CH2CH3)、2-methyl-2-propyl (t-Bu、t-butyl、-C(CH3)3)、1-pentyl (n-pentyl、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-pentyl (-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-pentyl (-CH(CH2CH3)2)、2-methyl-2-butyl (-C(CH3)2CH2CH3)、3-methyl-2-butyl (-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-methyl-1-butyl (-CH2CH2CH(CH3)2)、2-methyl-1-butyl (-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-hexyl (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-hexyl (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-hexyl (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-methyl-2-pentyl (-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-methyl-2-pentyl (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-methyl-2-pentyl (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-methyl-3-pentyl (-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-methyl-3-pentyl (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-dimethyl-2-butyl (-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-dimethyl-2-butyl (-CH(CH3)C(CH3)3がある。
本明細書中で用いる「Ｃ１-Ｃ８アルキル」なる用語は、１から８の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の、飽和ないしは不飽和炭化水素を指す。典型的な「Ｃ１-Ｃ８アルキル」基には、限定するものではないが、-methyl、-ethyl、-n propyl、-n butyl、-n pentyl、-n hexyl、-n-heptyl、-n-octyl、-n-nonyl、及び-n-decylが含まれ、一方、分岐したＣ１-Ｃ８アルキルには、限定するものではないが、-イソプロピル、-ｓｅｃブチル、-イソブチル、-ｔｅｒｔブチル、-イソペンチル、２-メチルブチルが含まれ、
不飽和のＣ１-Ｃ８アルキルには、限定するものではないが、-vinyl、-allyl、-1 butenyl、-2 butenyl、-isobutylenyl、-1 pentenyl、-2 pentenyl、-3 methyl 1 butenyl、-2 methyl 2 butenyl、-2,3 dimethyl 2 butenyl、1-hexyl、2-hexyl、3-hexyl,-acetylenyl、-propynyl、-1 butynyl、-2 butynyl、-1 pentynyl、-2 pentynyl、-3 methyl 1 butynyl、methyl、ethyl、propyl、isopropyl、n-butyl、isobutyl、sec-butyl、tert-butyl、n-pentyl、isopentyl、neopentyl、n-hexyl、isohexyl、2-methylpentyl、3-methylpentyl、2,2-dimethylbutyl、2,3-dimethylbutyl、2,2-dimethylpentyl、2,3-dimethylpentyl、3,3-dimethylpentyl、2,3,4-trimethylpentyl、3-methylhexyl、2,2-dimethylhexyl、2,4-dimethylhexyl、2,5-dimethylhexyl、3,5-dimethylhexyl、2,4-dimethylpentyl、2-methylheptyl、3-methylheptyl、n-heptyl、isoheptyl、n-octyl、及びisooctylが含まれる。Ｃ１-Ｃ８アルキル基は、限定するものではないが、置換されていなくてもよいし、-C1-C8 alkyl、-O-(C1-C8 alkyl)、-aryl、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-halogen、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含め、一又は複数の基によって置換されていてもよく、各々のＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールから別々に選択される。
「アルケニル」は、不飽和の少なくとも一部、すなわち炭素-炭素、ｓｐ2二重結合を有するノルマル、第２級、第３級、又は環式の炭素原子を含むＣ２-Ｃ１８炭化水素である。例には、限定するものではないが、エチレン又はビニル(-ＣＨ＝ＣＨ2)、アリル(-ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2)、シクロペンテニル(-Ｃ5Ｈ7)及び５-ヘキセニル(-ＣＨ2 ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2)などがある。
「アルキニル」は、不飽和の少なくとも一部、すなわち炭素-炭素、ｓｐ三重結合を有するノルマル、第２級、第３級、又は環式の炭素原子を含むＣ２-Ｃ１８炭化水素である。例には、限定するものではないが、アセチレン(-Ｃ≡ＣＨ)及びプロパルギル(-ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ)などがある。
「アルキレン」は、１〜１８の炭素原子であって、親のアルカンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する飽和した、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基には、限定するものではないが、メチレン(-ＣＨ2 ) 1,2-エチル(-ＣＨ2ＣＨ2-)、1,3-プロピル(-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-)、1,4-ブチル(-ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2-)などが含まれる。
「Ｃ１-Ｃ１０アルキレン」は、式 -(ＣＨ２)１-１０-の直鎖 の飽和した炭化水素基である。Ｃ１-Ｃ１０アルキレンの例には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、及びデカレンが含まれる。
「アルケニレン」は、２〜１８の炭素原子であって、親のアルケンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する不飽和の、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基には、限定するものではないが、1,2-エチレン(-ＣＨ＝ＣＨ-)が含まれる。
「アルキニレン」は、２〜１８の炭素原子であって、親のアルキンと同じ又は２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を取り除くことによって誘導される２つの一価基センターを有する不飽和の、分岐鎖又は直鎖又は環式の炭化水素基を指す。典型的なアルキニレン基には、限定するものではないが、アセチレン(-C≡C-)、プロパルギル(-CH2C≡C-)、及び 4-ペンチニル(-CH2CH2CH2C≡C-)が含まれる。
「アリール」は炭素環の芳香基を指す。アリール基の例には、限定するものではないが、フェニール、ナフチル及びアントラセニルが含まれる。炭素環の芳香基又はヘテロサイクリック芳香基は、置換されていなくてもよいし、限定するものではないが、-C1-C8アルキル、-O-(C1-C8アルキル)、-アリール、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-ハロゲン、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含む、一又は複数の基によって置換されていてもよく、各々のＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールから別々に選択される。
「アリレン(arylene)」は２つの共有結合を有するアリール基であり、以下の構造で示すようなオルト、メタ又はパラの立体配置でありうる。
Figure 2009533019
ここで、フェニル基は置換されていなくても、限定するものではないが、-C1-C8 alkyl、-O-(C1-C8 alkyl)、-aryl、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-halogen、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含む最大４つの基にて置換されてもよく、それぞれのＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールから個々に選択される。
「アリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ３炭素原子に結合した水素原子のうちの１つがアリール基に置換している非環式アルキル基を指す。代表的なアリールアルキル基には、限定するものではないが、ベンジル、2-phenylethan-1-yl、2-phenylethen-1-yl、ナフチルメチル、2-naphthylethan-1-yl、2-naphthylethen-1-yl、naphthobenzyl、2-naphthophenylethan-1-ylなどが含まれる。アリールアルキル基は６〜２０の炭素原子を含み、例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基を含む、アリールアルキル基のアルキル部分は１〜６の炭素原子であり、アリール部分は５〜１４の炭素原子である。
「ヘテロアリールアルキル」は、炭素原子、典型的には末端又はｓｐ３炭素原子に結合した水素原子のうちの１つがヘテロアリール基に置換している非環式アルキル基を指す。典型的なヘテロアリールアルキル基には、限定するものではないが、2-benzimidazolylmethyl、2-furylethylなどが含まれる。ヘテロアリールアルキル基は６〜２０の炭素原子を含み、例えば、アルカニル、アルケニル又はアルキニル基を含む、ヘテロアリールアルキル基のアルキル部分は１〜６の炭素原子であり、ヘテロアリール部分は５〜１４の炭素原子であり、１〜３のヘテロ原子はＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される。ヘテロアリールアルキル基のヘテロアリール部分は３〜７員環を有するモノシクロ(２〜６の炭素原子)又は７〜１０員環を有するビシクロ(４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]システムであってもよい。
「置換されたアルキル」、「置換されたアリール」、「置換されたアリールアルキル」とは、アルキル、アリール及びアリールアルキルをそれぞれ意味し、一又は複数の水素原子がそれぞれ別々に置換基に置換している。典型的な置換基には、限定するものではないが、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ−、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ−、−ＮＲ２、−ＮＲ３、＝ＮＲ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−ＮＣ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ２、−ＳＯ３ −、−ＳＯ３Ｈ、−Ｓ(＝Ｏ)２Ｒ、−ＯＳ(＝Ｏ)２ＯＲ、−Ｓ(＝Ｏ)２ＮＲ、−Ｓ(＝Ｏ)Ｒ、−ＯＰ(＝Ｏ)(ＯＲ)２、−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＲ)２、−ＰＯ− ３、−ＰＯ３Ｈ２、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｃ(＝Ｏ)Ｘ、−Ｃ(＝Ｓ)Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯ２ −、−Ｃ(＝Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(＝Ｏ)ＳＲ、−Ｃ(＝Ｓ)ＳＲ、−Ｃ(＝Ｏ)ＮＲ２、−Ｃ(＝Ｓ)ＮＲ２、−Ｃ(＝ＮＲ)ＮＲ２が含まれ、それぞれのＸは個々にハロゲン：Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、それぞれのＲは個々に−Ｈ、Ｃ２−Ｃ１８アルキル、Ｃ６−Ｃ２０アリール、Ｃ３−Ｃ１４複素環、保護基又はプロドラッグ部分である。上記のアルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基もまた、同じように置換されてもよい。
「ヘテロアリール」及び「複素環」は、一又は複数の環原子がヘテロ原子、例えば窒素、酸素及び硫黄である環式システムを指す。複素環基は、１〜２０の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子を含む。複素環は、３〜７員環を有するモノシクロ(２〜６の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)又は７〜１０員環を有するビシクロ(４〜９の炭素原子とＮ、Ｏ、Ｐ及びＳから選択される１〜３のヘテロ原子)、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]、又は[６,６]システムであってもよい。
複素環は、Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)、特に第1, 3, 4, 6, 7及び9章；"The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)、特に13, 14, 16, 19及び28号；及び、J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566に記載される。
複素環の例には、例示のためであって限定するものではなく、pyridyl、dihydroypyridyl、tetrahydropyridyl (piperidyl)、thiazolyl、tetrahydrothiophenyl、sulfur oxidized tetrahydrothiophenyl、pyrimidinyl、furanyl、thienyl、pyrrolyl、pyrazolyl、imidazolyl、tetrazolyl、benzofuranyl、thianaphthalenyl、indolyl、indolenyl、quinolinyl、isoquinolinyl、benzimidazolyl、piperidinyl、4-piperidonyl、pyrrolidinyl、2-pyrrolidonyl、pyrrolinyl、tetrahydrofuranyl、bis-tetrahydrofuranyl、tetrahydropyranyl、bis-tetrahydropyranyl、tetrahydroquinolinyl、tetrahydroisoquinolinyl、decahydroquinolinyl、octahydroisoquinolinyl、azocinyl、triazinyl、6H-1,2,5-thiadiazinyl、2H,6H-1,5,2-dithiazinyl、thienyl、thianthrenyl、pyranyl、isobenzofuranyl、chromenyl、xanthenyl、phenoxathinyl、2H-pyrrolyl、isothiazolyl、isoxazolyl、pyrazinyl、pyridazinyl、indolizinyl、isoindolyl、3H-indolyl、1H-indazolyl、purinyl、4H-quinolizinyl、phthalazinyl、naphthyridinyl、quinoxalinyl、quinazolinyl、cinnolinyl、pteridinyl、4aH-carbazolyl、carbazolyl、β-carbolinyl、phenanthridinyl、acridinyl、pyrimidinyl、phenanthrolinyl、phenazinyl、phenothiazinyl、furazanyl、phenoxazinyl、isochromanyl、chromanyl、imidazolidinyl、imidazolinyl、pyrazolidinyl、pyrazolinyl、piperazinyl、indolinyl、isoindolinyl、quinuclidinyl、morpholinyl、oxazolidinyl、benzotriazolyl、benzisoxazolyl、oxindolyl、benzoxazolinyl、及びisatinoylが含まれる。
例示的なものであって限定するものではなく、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５、又は６位、ピリダジンの３、４、５、又は６位、ピリミジンの２、４、５、又は６位、ピラジンの２、３、５、又は６位、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロールないしはテトラヒドロピロールの２、３、４、又は５位、オキサゾール、イミダゾールないしはチアゾールの２、４、又は５位、イソキサゾール、ピラゾールないしはイソチアゾールの３、４、又は５位、アジリジンの２又は３位、アゼチジンの２、３、又は４位、キノリンの２、３、４、５、６、７、又は８位、又はイソキノリンの１、３、４、５、６、７、又は８位に結合する。さらにより典型的には、炭素結合複素環には、2-pyridyl、3-pyridyl、4-pyridyl、5-pyridyl、6-pyridyl、3-pyridazinyl、4-pyridazinyl、5-pyridazinyl、6-pyridazinyl、2-pyrimidinyl、4-pyrimidinyl、5-pyrimidinyl、6-pyrimidinyl、2-pyrazinyl、3-pyrazinyl、5-pyrazinyl、6-pyrazinyl、2-thiazolyl、4-thiazolyl、又は5-thiazolylが含まれる。
例示的なものであって限定するものではなく、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼチジン、ピロール、ピロリジン、２-ピロリン、３-ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２-イミダゾリン、３-イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２-ピラゾリン、３-ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ-インダゾールの１位、イソインドールないしはイソインドリンの２位、モルフォリンの４位、カルバゾールないしはβ-カルボリンの９位に結合する。さらにより典型的には、窒素結合複素環には、1-aziridyl、1-azetedyl、1-pyrrolyl、1-imidazolyl、1-pyrazolyl、及び1-piperidinylが含まれる。
「Ｃ３−Ｃ８複素環」は、１〜４の環状炭素原子が個々にＯ、Ｓ及びＮからなる群のヘテロ原子に置換されている芳香族ないしは非芳香族のＣ３-Ｃ８複素環を指す。Ｃ３-Ｃ８複素環の代表的な例には、限定するものではないが、benzofuranyl、benzothiophene、indolyl、benzopyrazolyl、coumarinyl、isoquinolinyl、pyrrolyl、thiophenyl、furanyl、thiazolyl、imidazolyl、pyrazolyl、triazolyl、quinolinyl、pyrimidinyl、pyridinyl、pyridonyl、pyrazinyl、pyridazinyl、isothiazolyl、isoxazolyl及びtetrazolylが含まれる。Ｃ３-Ｃ８複素環は置換されていなくても、限定するものではないが、-C1-C8 alkyl、-O-(C1-C8 alkyl)、-aryl、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-halogen、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含む最大７基に置換されていてもよく、各々のＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールからそれぞれ選択される。
「Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロ」は、複素環基の水素原子のうちの１つが結合に置換されている上記のＣ３-Ｃ８複素環基を指す。Ｃ３-Ｃ８ヘテロシクロは置換されていなくても、限定するものではないが、-C1-C8 alkyl、-O-(C1-C8 alkyl)、-aryl、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-halogen、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含む最大６基に置換されていてもよく、各々のＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールからそれぞれ選択される。
「炭素環」は、単環として３〜７の炭素原子又は二環として７〜１２の炭素原子を有する飽和ないしは不飽和の環を意味する。単環の炭素環は３〜６の環状原子、より一般的には５又は６の環状原子を有する。二環式の炭素環は、例えばビシクロ[４,５]、[５,５]、[５,６]又は[６,６]システムとして配置した７〜１２の環状原子、又はビシクロ[5,6]又は[6,6]システムとして配置した９又は１０の環状原子を有する。単環の炭素環の例には、cyclopropyl、cyclobutyl、cyclopentyl、1-cyclopent-1-enyl、1-cyclopent-2-enyl、1-cyclopent-3-enyl、cyclohexyl、1-cyclohex-1-enyl、1-cyclohex-2-enyl、1-cyclohex-3-enyl、cycloheptyl、及びcyclooctylが含まれる。
「Ｃ３−Ｃ８炭素環」は、3-、4-、5-、6-、7-又は8-員の飽和ないしは不飽和非芳香族炭素環である。代表的なＣ３-Ｃ８炭素環には、限定するものではないが、-cyclopropyl、-cyclobutyl、-cyclopentyl、-cyclopentadienyl、-cyclohexyl、-cyclohexenyl、-1,3-cyclohexadienyl、-1,4-cyclohexadienyl、-cycloheptyl、-1,3-cycloheptadienyl、-1,3,5-cycloheptatrienyl、-cyclooctyl、及び-cyclooctadienylが含まれる。Ｃ３-Ｃ８炭素環基は置換されていなくても、限定するものではないが、-C1-C8 alkyl、-O-(C1-C8 alkyl)、-aryl、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2 、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2 -NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-halogen、-N3 、-NH2、-NH(R')、-N(R')2、及び-CNを含む一又は複数の基に置換されていてもよく、各々のＲ'は、Ｈ、-Ｃ１-Ｃ８アルキル及びアリールからそれぞれ選択される。
「Ｃ３−Ｃ８カルボシクロ」は、炭素環基の水素原子のうちの１つが結合に置換されている上記のＣ３-Ｃ８炭素環基を指す。
「リンカー」は、共有結合を含む化学的な部分又は薬剤部分に抗体を共有結合させる原子の鎖を指す。様々な実施態様では、リンカーには、二価の基、例としてalkyldiyl、aryldiyl、heteroaryldiyl、アルキロキシ(例としてpolyethylenoxy、PEG、polymethyleneoxy)及びアルキラミノ(例えばpolyethyleneamino、JeffamineTM)の繰り返しユニットである-(CR2)nO(CR2)n-などの部分、及び、スクシナート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート及びカプロアミドを含む二酸エステル及びアミドが含まれる。
「キラル」なる用語は、鏡像パートナーの重ね合わすことができない特性を有する分子を指し、一方、「アキラル」なる用語は、鏡像パートナーの重ね合わすことができる分子を指す。
「立体異性体」なる用語は、同一の化学構造を有するが、空間の原子又は基の配列に関しては異なる化合物を指す。
「ジアステレオマー」はキラリティの２以上の中心を有し、その分子が互いの鏡像でない立体異性体を指す。ジアステレオマーは、異なる物理的性質、例えば融点、沸点、分光特性及び反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、電気泳動及びクロマトグラフィなどの高分解能解析手順により分離されうる。
「鏡像異性体」は、互いに重ね合わせることができない鏡像である化合物の２つの立体異性体を指す。
本明細書中で用いる立体化学的定義及び慣例は、一般にS. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York；及び、Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物は光学的に活性な形態で存在する。すなわち直線偏光の平面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物を記載する場合、接頭語ＤとＬ又はＲとＳを用いて、キラル中心(一又は複数)の周りの分子の絶対配置を示す。接頭後ｄとｌ又は(＋)と(−)は、化合物による直線偏光の回転のサインを示すために用いるものであって、(−)又は１は化合物が左旋性であることを意味する。(＋)又はｄを接頭に付した化合物は右旋性である。所定の化学構造では、互いの鏡像であることを除いて、これらの立体異性体は同一である。また、特定の立体異性体は鏡像異性体とも称され、この異性体の混合物は鏡像異性体混合物と称されることが多い。鏡像異性体の５０：５０混合物は、化学的反応又は過程において立体選別でも立体特異性でもなくなった場合に生じうるラセミ混合物又はラセミ化合物を指す。「ラセミ混合物」及び「ラセミ化合物」なる用語は、光学的活性を欠く、２つの鏡像異性種を指す。
「脱離基」は、他の官能基によって置換されうる官能基を指す。特定の脱離基は当分野で公知であり、例として、限定するものではないが、ハロゲン化物(例えば、クロライド、ブロマイド、イオジド)、methanesulfonyl (mesyl)、p-toluenesulfonyl (tosyl)、trifluoromethylsulfonyl (triflate)、及びtrifluoromethylsulfonateなどがある。
Ｂ．省略記号
リンカー成分：
ＭＣ＝６-マレイミドカプロイル
Ｖａｌ−Ｃｉｔ又は「ｖｃ」＝バリン−シトルリン(プロテアーゼにより切断可能なリンカーの例示的なジペプチド)
シトルリン＝２-アミノ-５ウレイドペンタン酸
ＰＡＢ＝ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「自己犠牲(self immolative)」リンカー成分の例)
Ｍｅ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ＝Ｎ−メチル−バリン−シトルリン(リンカーペプチド結合が、カテプシンＢによる切断を阻害するように修飾されているもの)
ＭＣ(ＰＥＧ)６−ＯＨ＝マレイミドカプロイル−ポリエチレングリコール(抗体システインに結合しうる)
細胞障害性剤：
ＭＭＡＥ＝モノメチルアウリスタチンＥ(ＭＷ７１８)
ＭＭＡＦ＝薬剤のＣ末端にフェニルアラニンを有するアウリスタチンＥ(ＭＭＡＥ)の変異体(ＭＷ７３１．５)
ＭＭＡＦ−ＤＭＡＥＡ＝Ｃ末端のフェニルアラニンに対するアミド連結にＤＭＡＥＡ(ジメチルアミノエチルアミン)を有するＭＭＡＦ(ＭＷ８０１．５)
ＭＭＡＦ−ＴＥＧ＝フェニルアラニンにエステル化したテトラエチレングリコールを有するＭＭＡＦ
ＭＭＡＦ−ＮｔＢｕ＝ＭＭＡＦのＣ末端にアミドとして結合した、Ｎ-ｔ-ブチル
さらに、略語は以下の通りである：ＡＥはアウリスタチンＥであり、ＢｏｃはＮ(ｔブトキシカルボニル)であり、ｃｉｔはシトルリンであり、ｄａｐはドラプロイン(dolaproine)であり、ＤＣＣは１,３-ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＣＭはジクロロメタンであり、ＤＥＡはジエチルアミンであり、ＤＥＡＤはジエチルアゾジカルボキシレートであり、ＤＥＰＣはジエチルホスホリルシアニダートであり、ＤＩＡＤはジイソプロピルアゾジカルボキシレートであり、ＤＩＥＡはＮ,Ｎ-ジイソプロピルエチルアミンであり、ｄｉｌはドライソロイシンであり、ＤＭＡはジメチルアセトアミドであり、ＤＭＡＰは４-ジメチルアミノピリジンであり、ＤＭＥはエチレングリコールジメチルエーテル(又は１,２-ジメトキシエタン)であり、ＤＭＦはＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ｄｏｅはドラフェニン(dolaphenine)であり、ｄｏｖはＮ,Ｎ-ジメチルバリンであり、ＤＴＮＢは５,５'-ジチオビス(２-ニトロ安息香酸)であり、ＤＴＰＡはジエチレントリアミンペンタ酢酸であり、ＤＴＴはジチオトレイトールであり、ＥＤＣＩは１-(３-ジメチルアミノプロピル)-３-エチルカルボジイミド塩酸塩であり、ＥＥＤＱは、２-エトキシ-１-エトキシカルボニル-１,２-ジヒドロキノリンであり、ＥＳ-ＭＳはエレクトロスプレー質量分析であり、ＥｔＯＡｃは酢酸エチルであり、ＦｍｏｃはＮ-(９-フルオレニルメトキシカルボニル)であり、ｇｌｙはグリシンであり、ＨＡＴＵは、Ｏ-(７-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＨＯＢｔは１-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィであり、ｉｌｅはイソロイシンであり、ｌｙｓはリジンであり、ＭｅＣＮ(ＣＨ３ＣＮ)はアセトニトリルであり、ＭｅＯＨはメタノールであり、Ｍｔｒは４-アニシルジフェニルメチル(又は４-メトキシトリチル)であり、(１Ｓ, ２Ｒ)-(＋)-ノルエフェドリンではなく、ＰＢＳはリン酸塩緩衝生理食塩水(ｐＨ７．４)であり、ＰＥＧはポリエチレングリコールであり、Ｐｈはフェニルであり、Ｐｎｐはｐ-ニトロフェニルであり、ＭＣは６-マレイミドカプロイルであり、ｐｈｅはＬ-フェニルアラニンであり、ＰｙＢｒｏｐは、ブロモトリス-ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェイトであり、ＳＥＣはサイズ排除クロマトグラフィであり、Ｓｕはスクシンイミドであり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィであり、ＵＶは紫外線であり、ｖａｌはバリンである。
III．組成物及びその作製方法
ＴＡＴ２２６に結合する抗体が提供される。抗ＴＡＴ２２６抗体を含んでなるイムノコンジュゲートが提供される。本発明の抗体及びイムノコンジュゲートは、例えば、ＴＡＴ２２６の発現の増加などの発現の変更と関係する疾患の診断や治療に有用である。ある実施態様では、本発明の抗体又はイムノコンジュゲートは、癌などの細胞増殖性疾患の診断や治療に有用である。
Ａ．抗ＴＡＴ２２６抗体
ＴＡＴ２２６(「腫瘍関連抗原標的番号２２６」)は、プロセシングされ、腫瘍細胞を含む特定の種類の細胞の表面上に発現されるタンパク質である。特に、ヒトＴＡＴ２２６は、特定の種類の腫瘍、例えば卵巣、子宮、子宮内膜、腎臓、肺、膵臓、副腎及び肝細胞性の腫瘍において過剰発現することが報告されている。例として、米国特許公開第２００３／０１４８４０８号Ａ１、同第２００４／０２２９２７７号Ａ１、及び同第２００３／０１００７１２号Ａ１(ＴＡＴ２２６を「ＰＲＯ９９１７」として示す)；及び米国特許第６７１０１７０号Ｂ２(配列番号：２１５)を参照のこと。ＴＡＴ２２６に関する他のデータベース登録事項及び開示は、以下の通りである：ＮＣＢＩ寄託番号ＡＹ３５８６２８＿１(ヒトＴＡＴ２２６を「ＰＳＣＡ Ｈｌｏｇ」として示す)；ＮＣＢＩ寄託番号ＡＡＱ８８９９１.１及び「ｇｉ」番号３７１８２３７８(ヒトＴＡＴ２２６を「ＰＳＣＡ Ｈｌｏｇ」として示す)；ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２；米国特許公開第２００３／００９６９６１号Ａ１(配列番号：１６)；米国特許公開第２００３／０１２９１９２号Ａ１(配列番号：２１５)；米国特許公開第２００３／０２０６９１８号Ａ１(実施例５；配列番号：２１５)；米国特許公開第２００３／０２３２０５６号Ａ１(配列番号：２１５)；米国特許公開第２００４／００４４１７９号Ａ１(配列番号：１６)；米国特許公開第２００４／００４４１８０号Ａ１(配列番号：１６)；米国特許公開第２００５／０２３８６４９号Ａ１(ヒトＴＡＴ２２６を「ＰＳＣＡ Ｈｌｏｇ」として示す)；国際公開第２００３／０２５１４８号(配列番号：２９２)；国際公開第２００３／１０５７５８号(配列番号：１４)；及び、欧州特許第１３４７０４６号(配列番号：２６４０)。
完全長ＴＡＴ２２６は細胞内でプロセシングされ、細胞表面に発現されるタンパク質の成熟形態を生成する。例えば、配列番号：７５に示す完全長ヒトＴＡＴ２２６は、アミノ酸１−２０又は１−２２に予測されるシグナルペプチド配列を含み、このシグナルペプチドはタンパク質から切断されると予測される。アミノ酸１１６−１４１のＣ末端はタンパク質から切断されると予測され、アミノ酸１１５でタンパク質に付着したＧＰＩ部分である。配列番号：７５のアミノ酸２１−１１５又は２３−１１５のヒトＴＡＴ２２６の成熟形態は、ＧＰＩ部分を介して細胞表面に固定されると予測される。サル及び齧歯目のＴＡＴ226(例えば、配列番号：７６−７８を参照)は、ヒトＴＡＴ２２６と非常に類似しているため、対応するアミノ酸位で切断され、修飾されると思われる。図１を参照。アミノ酸２１−１１５又は２３−１１５のヒト、サル及び齧歯動物の結果として生じるＴＡＴ２２６の成熟形態は、１００％同一である(図１に示す)。
ヒトＴＡＴ２２６の他の特徴には、アミノ酸４５での予測されるＮ-グリコシル化部位(実験的に確認されている)と、配列番号：７５のアミノ酸９４−１０７の予測されるLy6/u-PARがある。ヒトＴＡＴ226は、ＧＰＩ連結を介して細胞表面上に発現される前立腺幹細胞抗原(ＰＳＣＡ)である前立腺癌特異的腫瘍抗原とおよそ３２％のアミノ酸相同性を有する。Reiter等 (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95:1735-1740を参照。ＰＳＣＡは前立腺癌の８０％より多くで過剰発現している。同上。ＴＡＴ２２６と同様に、シグナル伝達や細胞接着などの細胞機能に関連している予測されるＬｙ６／ｕ-ＰＡＲドメインを含む。同上。
一態様では、本発明はＴＡＴ２２６に結合する抗体を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＡＴ２２６の成熟形態に結合する抗体が提供される。そのような実施態様では、ＴＡＴ２２６の成熟形態は、配列番号：７５のアミノ酸２１−１１５又は２３−１１５のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様では、ＴＡＴ２２６に対する抗体は、細胞表面に発現されるＴＡＴ２２６の成熟形態に結合する。いくつかの実施態様では、細胞表面に発現されるＴＡＴ２２６の成熟形態に結合する抗体は、細胞の成長を阻害する。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、細胞表面に発現されるＴＡＴ２２６の成熟形態に結合して、細胞増殖を阻害する。ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、細胞表面に発現されるＴＡＴ２２６の成熟形態に結合して、細胞死を誘導する。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、癌細胞の表面に発現されるＴＡＴ２２６の成熟形態に結合する。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、同じ組織起源の正常細胞と比べて癌細胞の表面に過剰発現しているＴＡＴ２２６の成熟形態に結合する。
一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体はモノクローナル抗体である。一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２の断片である。一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体である。一態様では、本明細書中に記載のいずれかの抗ＴＡＴ２２６抗体は精製される。
ファージライブラリから得られる例示的なモノクローナル抗体は、実施例Ｂに記載のように本明細書において提供される。ライブラリをスクリーニングするために用いた抗原は、推定のＧＰＩ付着部位のＣ末端であるアミノ酸を欠くＴＡＴ２２６の形態に対応する、配列番号：７５のアミノ酸１−１１５の配列を有するポリペプチドであった。ライブラリのスクリーニングから得る抗体をＹＷＯ.３２及びＹＷＯ.４９と称す。ＹＷＯ.４９を親和性成熟して、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６を生成した。ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の重鎖及び軽鎖の可変ドメインの配列のアラインメントを、それぞれ図１１及び１２に示す。
一態様では、ＴＡＴ２２６への結合についてＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６と競合するモノクローナル抗体が提供される。ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体も提供される。
本発明の一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある実施態様では、このようなベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の他の態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体を含有する組成物又は抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある実施態様では、本発明の組成物は、本明細書中に列挙したものなどの細胞増殖性疾患の治療のための薬学的製剤である。
例示的な抗ＴＡＴ２２６抗体の詳細な説明は以下の通りである。
１．抗ＴＡＴ２２６抗体の具体的な実施態様
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；(b) 配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；(c) 配列番号：３及び配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３；(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び(f) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３、から選択される少なくとも１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含んでなる抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；(b) 配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；及び(c) 配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３、から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は３つすべてのＶＨ ＨＶＲを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：３及び６−１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：９又は１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：１及び配列番号：４から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：４を含むＨＶＲ-Ｈ１とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：９又は１０を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：４を含むＨＶＲ-Ｈ１とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：３を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：１を含むＨＶＲ-Ｈ１とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：２及び配列番号：５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：５を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：９又は１０を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：５を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：３を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：２を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：９又は１０を含む。一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：３のアミノ酸配列を含む。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１、(b) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び(c) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３、から選択される少なくとも１、少なくとも２、又は３つすべてのＶＬ ＨＶＲを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、(a) 配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b) 配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。いくつかの実施態様では、ＴＡＴ２２６抗体はさらに、(a) 配列番号：１を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：２を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：１０のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、ＴＡＴ２２６抗体はさらに、配列番号：４を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：１又は配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、(b) 配列番号：２又は配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、(c) 配列番号：３及び６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２と、(f) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、(b) 配列番号：２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、(c) 配列番号：３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２と、(f) 配列番号：１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、(b) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、(c) 配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２と、(f) 配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、(b) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、(c) 配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２と、(f) 配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、(b) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、(c) 配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(d) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、(e) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２と、(f) 配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は親和性成熟され、所望の標的結合親和性を得る。いくつかの実施態様では、抗体のいずれか一又は複数のアミノ酸は以下のＨＶＲ位置：Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００Ｂ、Ｌ９０、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９６及びＬ９７で置換される。例えば、いくつかの実施態様では、以下のいずれか一又は複数の置換はいずれかの組合せでなされてもよい。
−ＨＶＲ-Ｈ３(配列番号：６)の、Ｖ９８Ｉ；Ｓ９９Ｔ；Ｒ１００Ｌ又はＩ；Ｇ１００ｂＡ、Ｓ又はＰ
−ＨＶＲ-Ｌ３(配列番号：１４)の、Ｑ９０Ｒ、Ｋ、Ｈ又はＮ；Ｙ９２Ｖ；Ｔ９３Ｆ、Ｎ、Ｇ又はＡ；Ｐ９６Ｆ；Ｔ９７Ｉ又はＡ
上記の置換のすべての可能な組合せは、配列番号：１１(ＨＶＲ-Ｈ３)及び配列番号：１９(ＨＶＲ-Ｌ３)のコンセンサス配列に包含される。
抗体がＴＡＴ２２６結合能を保持するならば、抗ＴＡＴ２２６抗体はいかなる適切なフレームワーク可変ドメイン配列を含んでいてもよい。例えば、いくつかの実施態様では、本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体は、ヒトのサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を含んでなる。これらの抗体の一実施態様では、重鎖フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換(一又は複数)を含む。これらの抗体のある実施態様では、位置７１はＡであり、位置７３はＴであり、及び／又は位置７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の重鎖可変ドメインフレームワーク配列、例えば配列番号：５０、５１、５９、３５(それぞれＦＲ１、２、３、４)を含む。ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８はハーセプチン(登録商標)、Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USAとして商業的に知られている。米国特許第6407213号及び同第5821337号、及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5): 1073-93も参照のこと。そのような実施態様では、これらの抗体はさらに、ヒトｋＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を含む。そのような実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。
一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図５Ａ及び５Ｂに示すものから選択されるＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ1は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は、配列番号：９又は１０のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図６Ａ及び６Ｂに示すものから選択されるＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：１２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１３のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含んでなる。
一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図７に示すように配列番号：５０、５１、５９及び３５のＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：９又は１０のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗ＴＡＴ226抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図６Ａ及び６Ｂに示すように配列番号：６０、６１、６２及び６３のＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：１２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１３のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含む。
一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図８に示すように配列番号：５０、５１、５３及び３５のＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６〜１１から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：９又は１０のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、フレームワーク配列と高頻度可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。このフレームワーク配列は図８に示すように配列番号：６０、６１、６２及び７４のＦＲ１−ＦＲ４配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：１２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：１３のアミノ酸配列を含み、そして、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１４〜１９から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施態様では、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１７又は１８のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、本発明は、配列番号：２０〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。いくつかの実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比べて置換、挿入又は欠失を含有するが、そのアミノ酸配列を含む抗体はＴＡＴ２２６への結合能を保持する。いくつかの実施態様では、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号：２０〜２５から選択される配列において置換されているか、挿入されているか、又は欠失されている。いくつかの実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ以外の領域(すなわちＦＲ)で起こる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２０〜２５から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなる。
いくつかの実施態様では、本発明は、以下の配列番号：３１に示すように、ヒト化４Ｄ５抗体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８)(ハーセプチン(登録商標), Genentech, Inc.、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)(米国特許第６４０７２１３号、及びLee等, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93においても言及されている)の軽鎖可変ドメイン配列を含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
Figure 2009533019
(ＨＶＲ残基を下線で示す)
いくつかの実施態様では、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖可変ドメイン配列は、位置３０、６６及び９１の一又は複数(それぞれ、上記に太字／斜体で示したＡｓｎ、Ａｒｇ及びＨｉｓ)で修飾される。一実施態様では、修飾したｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８配列は、位置３０にＳｅｒ、位置６６にＧｌｙ及び／又は位置９１にＳｅｒを含む。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、以下の配列番号：２６に示す配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。
Figure 2009533019
(ＨＶＲ残基を下線で示す)
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８に関する置換された残基を上記に太字／斜体で示す。
一態様では、本発明は、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる抗ＴＡＴ226抗体を提供する。いくつかの実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比べて置換、挿入又は欠失を含有するが、そのアミノ酸配列を含む抗体はＴＡＴ２２６への結合能を保持する。いくつかの実施態様では、合計１〜１０のアミノ酸が、配列番号：２６〜３１から選択される配列において置換されているか、挿入されているか、又は欠失されている。いくつかの実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ以外の領域(すなわちＦＲ)で起こる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなる。
一態様では、本発明は、(a) 配列番号：２０〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、(b) 配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。いくつかの実施態様では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比べて置換、挿入又は欠失を含有するが、そのアミノ酸配列を含む抗体はＴＡＴ２２６への結合能を保持する。いくつかの実施態様では、合計１〜１０のアミノ酸が、参照配列において置換されているか、挿入されているか、又は欠失されている。いくつかの実施態様では、置換、挿入又は欠失はＨＶＲ以外の領域(すなわちＦＲ)で起こる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２０〜２５から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含んでなる。
いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。いくつかの実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる。
一態様では、本発明は、(a) 図２及び４に示すものから選択される１、２又は３のＶＨ ＨＶＲ、及び／又は(b) 図３及び４に示すものから選択される１、２又は３のＶＬ ＨＶＲを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一態様では、本発明は、図９及び１１に示すものから選択される重鎖可変ドメインと、図１０及び１２に示すものから選択される軽鎖可変ドメインを含んでなる抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。
２．抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化などの古典的な手段や組み換え技術によって生成されうる。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。ある抗体断片の概説については、Hudson等 (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。ある実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３/１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の抗体は単特異的又は二重特異的であってもよい。
３．ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要となりうる。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが一般的に望ましい。この目標を達成するべく、ある方法によって、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
４．ヒト抗体
本発明のヒト抗ＴＡＴ２２６抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗ＴＡＴ２２６抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255(1993)；Bruggermann等, Year in Immunol., 7: 33 (1993)を参照のこと。
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、本明細書中に記載のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３/０６２１３を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
５．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施態様では、二重特異性抗体はヒト又はヒト化の抗体である。ある実施態様では、結合特異性の一つはＴＡＴ２２６に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。ある実施態様では、二重特異性抗体は、ＴＡＴ２２６の２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＡＴ２２６を発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＡＴ２２６結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公報第９３／０８８２９号及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なるアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は例えば、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。ある実施態様では、軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)は、融合の少なくとも一つに存在する。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報第９１／００３６０号、国際公報第９２／００３７３号及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
６．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。ある実施態様では、二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ある実施態様では、多価抗体は３からおよそ８の抗原結合部位を有する。このような一実施態様では、多価抗体は４つの抗原結合部位を含む(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(例えば２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、少なくとも２つ(例えば４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有してもよい。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
７．単一のドメイン抗体
いくつかの実施態様では、本発明の抗体は単一のドメイン抗体である。単一のドメイン抗体は、抗体のすべてないしは一部の重鎖可変ドメイン又はすべてないしは一部の軽鎖可変ドメインを含んでなる単一ポリペプチドである。ある実施態様では、単一のドメイン抗体は、ヒトの単一のドメイン抗体である(Domantis, Inc., Waltham, MA；例として米国特許第６２４８５１６号Ｂ１を参照)。一実施態様では、単一のドメイン抗体は、抗体のすべてないしは一部の重鎖可変ドメインからなる。
８．抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸に適切な変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(例えばアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、さらなる、又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合及び／又はカルボキシ−末端融合、ならびに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素の抗体のＮ−末端又はＣ−末端への融合が含まれる。
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は低減するために変更する。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)が作られるか又は除かれるように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
ある実施態様では、グリコシル化変異体はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。置換突然変異について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の望ましい変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてよい。
表１
Figure 2009533019
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
(１)無極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(２)無電荷極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(３)酸性：Asp (D), Glu (E)
(４)塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けてもよい：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このような置換された残基も、保存的置換部位か、残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
ある型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して変更した(例えば向上した)生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたファージコートタンパク質の少なくとも一部(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、それらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、スキャニング突然変異誘発(例えばアラニンスキャニング)を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術を含む当分野で公知の技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載する技術を含む当分野で公知の技術を用いてスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
本発明の抗体のＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域)を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、WO99/51642などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報00/42072(Presta)及び国際公開公報2004/056312(Lowman)は、ＦｃＲへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が改善している抗体は、米国特許公開2005/0014934A1 (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更されてＣ１ｑ結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第6,194,551号B1、国際公開公報99/51642に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの境界面に修飾を含む抗体を提供する。この修飾はヘテロ二量体化を容易にする及び／又は促進する。これらの修飾は第一Ｆｃポリペプチドに隆起(protuberance)、そして第二Ｆｃポリペプチドに腔(cavity)の導入を含み、この隆起は第１及び第２のＦｃポリペプチドの複合体形成を促進するように腔に配置することができる。これらの修飾を有する抗体の生成方法は、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載のように、当分野で公知である。
９．抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
他の実施態様では、放射線に曝すことによって選択的に熱すことができる非タンパク質性部分と抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質性部分は炭素ナノチューブである(Kam等, Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005))。放射線はいずれの波長のものでもよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を及ぼさないが、抗体-非タンパク質性部分に近位の細胞が死滅する温度にまで非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれる。
Ｂ．抗体のある作製方法
１．ハイブリドーマベースの方法
本発明の抗ＴＡＴ２２６モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。一般的に、ＴＡＴ２２６への抗体は、ＴＡＴ２２６とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じる。ＴＡＴ２２６は当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、ＴＡＴ２２６は組み換えて産生されてもよい。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合したＴＡＴ２２６の細胞外ドメイン(ＥＣＤ)を含有するＴＡＴ２２６の誘導体で免疫化する。一実施態様では、動物を、ＴＡＴ２２６-ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。一実施態様では、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)により溶液中のＴＡＴ２２６の免疫原性誘導体にて免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７〜１４日後、動物から採血して、血清を抗ＴＡＴ２２６力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、適当な培養培地、例えば融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含む培地に播き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
ある実施態様では、骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。例示的な骨髄腫株化細胞には、限定するものではないが、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものが含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、ＴＡＴ２２６に結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
２．ある一つのライブラリスクリーニング法
本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体は、所望の活性(一又は複数)を有する抗体についてスクリーニングするためにコンビナトリアルライブラリを用いて作製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成して、所望の結合特性を有する抗体についてこのライブラリをスクリーニングするためには当分野で様々な方法が公知である。このような方法は、一般にMethods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien等, ed., Human Press, Totowa, NJ)のHoogenboom等 (2001)に、ある実施態様では、Lee等 (2004) J. Mol. Biol. 340:1073-1093に記載される。
原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Ｆｖ)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗ＴＡＴ２２６抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Ｆｃ)配列を用いての全長抗ＴＡＴ２２６抗体クローンの構築によって得ることができる。
ある実施態様では、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域である軽(ＶＬ)及び重(ＶＨ)鎖で形成され、その双方には、３つの高頻度可変ループ(ＨＶＲ)又は相補鎖決定領域(ＣＤＲ)が存在する。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、ｓｃＦｖコード化ファージクローン、及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
ある実施態様では、繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Ｆｖ断片として表示することが可能であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はｐＩＩＩと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗ＴＡＴ２２６クローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、検体をＴＡＴ２２６で免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)である循環Ｂ細胞を、ライブラリ構築のために回収する。好ましい実施態様では、ＴＡＴ２２６免疫化により、ＴＡＴ２２６に対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗ＴＡＴ２２６クローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗ＴＡＴ２２６抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
抗ＴＡＴ２２６反応細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用してＴＡＴ２２６特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、ＴＡＴ２２６アフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識ＴＡＴ２２６への細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によって得ることができる。
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、ＴＡＴ２２６が免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を被検体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandi等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWard等，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた前方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jones等，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastry等，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandi等(1989)又はSastry等(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。ある実施態様では、例えば、Marks等，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrum等，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandi等(1989)に記載のように、又はClackson等，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０-８ＭのＫｄ -１)の多くの多様な抗体を提供する。
別法として、このレパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニング、又は、Clakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲ後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７Ｍ-１のＫｄ -１)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開第９６０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０-９Ｍの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
ライブラリのスクリーニングは当分野で公知の様々な技術によって達成されうる。例えば、ＴＡＴ２２６は、吸収プレートのウェルをコーティングするために利用すること、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用すること、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる捕獲のためにビオチンとコンジュゲートすること、又はファージディスプレイライブラリをパニングするためのあらゆる他の方法において利用することが可能である。
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化ＴＡＴ２２６と接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるＴＡＴ２２６抗原競合によって溶出する。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
選択の効率は多くの要因に依存し、それには、洗浄の間の解離の動力学、そして単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかということが含まれる。一次解離定数(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動力学(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第92/09690号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの利用、そしてMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低度のコーティング密度によって促進することが可能である。
親和性に僅かな違いがあったとしても、ＴＡＴ２２６に対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。ＴＡＴ２２６を限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。すべてのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過度のビオチン化ＴＡＴ２２６とインキュベートすることが可能であるが、ＴＡＴ２２６に対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化ＴＡＴ２２６とインキュベートできる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数を基礎として識別することも可能である。
抗ＴＡＴ２２６クローンは活性を元に選択されうる。ある実施態様では、本発明は、ＴＡＴ２２６を天然に発現する生細胞に結合する抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。一実施態様では、本発明は、ＴＡＴ２２６リガンドとＴＡＴ２２６との結合をブロックするが、ＴＡＴ２２６リガンドと第二タンパク質との結合をブロックしない抗ＴＡＴ２２６抗体を提供する。このような抗ＴＡＴ２２６抗体に対応するＦｖクローンは、(1) 上記のようなファージライブラリから抗ＴＡＴ２２６クローンを単離して、場合によって、好適な宿主細胞で個体集団を成長させることによって、ファージクローンの単離した母集団を増幅する、(2) 望ましいブロック活性及び非ブロック活性のそれぞれについてＴＡＴ２２６と第二タンパク質を選択する、(3) 固定されたＴＡＴ２２６に抗ＴＡＴ２２６ファージクローンを吸着する、(4) 過剰量の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップするＴＡＴ２２６-結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する、そして、(5) 工程(4)の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって選別できる。場合によって、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮できる。
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解されるであろう。このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。ある実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、完全長ないし一部のヒト重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗ＴＡＴ２２６抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体ないし抗体断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
３．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
a) 原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
(1) ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
また、本発明の抗体は、発現されるポリペプチド成分の量的な比を変更することにより、分泌されて適切に集合体化(アセンブル)される本発明の抗体の産出を最大化することができる発現系を用いても生成することができる。このような変更は、少なくとも部分的にはポリペプチド成分の翻訳強度を同時に変更することにより行われる。
翻訳の強度を変更するための一つの技術は、Simmons等の米国特許第５８４０５２３号に開示されている。この方法は、シストロン内の翻訳開始領域(ＴＩＲ)の変異体を利用する。任意のＴＩＲについて、一連のアミノ酸又は核酸配列の変異体を一定の範囲の翻訳強度を有するように作製することができ、これにより特定の鎖に所望の発現レベルが得られるようにこの因子を調節する便利な手段が提供される。ＴＩＲ変異体は、アミノ酸配列を変更しうるコドンの変化を起こす常套的な変異原性技術により生成することができる。特定の実施態様では、ヌクレオチド配列における変化はサイレントである。ＴＩＲにおける変更は、例えば、シャイン・ダルガノ配列の数又はスペーシングの変更、並びにシグナル配列の変更を含みうる。変異シグナル配列を生成するための一つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変更しない(つまり、変化がサイレントである)コード配列の始めに「コドンバンク」を生成することである。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変更することにより達成することができる。さらに、いくつかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンは、１番目及び２番目の位置を複数有しており、これによって前記バンクの作製が複雑になり得る。変異原性の方法は、Yansura等(1992)METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
一実施態様では、含有される各シストロンについて一定の範囲のＴＩＲ強度を有する一組のベクターを生成する。この限定された組により、各鎖の発現レベル、及び種々のＴＩＲ強度の組み合わせにおける所望の抗体産物の産出を比較することができる。ＴＩＲ強度は、Simmons等による米国特許第５８４０５２３号に詳細に記載されているレセプター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度の比較に基づいて、所望の個々のＴＩＲを選択し、本発明の発現ベクターコンストラクトと組み合わせる。
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
(2) 抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。ある実施態様では、例えば、大腸菌の増殖に対しては、温度は約２０℃から約３９℃、約２５℃から約３７℃の範囲、又は約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。ある実施態様では、大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、又は約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。ある実施態様では、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、ある実施態様では約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
(3) 抗体精製
一実施態様では、本明細書中で産生した抗体タンパク質は、更なるアッセイや使用のために実質的に均一である調製物を得るためにさらに精製される。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、又は孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムでありうる。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐ可能性があるグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去してもよい。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
b. 真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、真核生物宿主細胞で用いるためのベクターは、以下の非限定的な成分の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
(1) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであってもよい。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
(2) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
(3) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
(4) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され対象のポリペプチド(例えば抗体)をコードする核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。例えば、実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある実施態様では、これらの配列のいずれか又は全ては真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ-インターフェロンｃＤＮＡの発現を記載している、Reyes等, Nature 297:598-601 (1982)を参照。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
(5) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体をコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素を記載している、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、一般にはプロモーターから５'位に位置している。
(6) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含みうる。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
(7) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
(8) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
(9) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去されうる。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮してもよい。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが従来の技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであってもよく、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液を、例えばｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いた低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィによってさらに精製してもよい。
一般に、研究、試験及び臨床において使用するための抗体を調製するために、上記の方法と一致しており、及び／又は当業者が対象の特定の抗体にふさわしいと思われる、様々な方法が当分野で確立されている。
Ｃ．イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞毒性剤にコンジュゲートした本発明の何れかの抗ＴＡＴ２２６抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
細胞障害性剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞の成長又は増殖を殺す又は阻害する薬剤の局部運搬にイムノコンジュゲートを用いてもよい(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)。イムノコンジュゲートは腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等 (ed.s), pp. 475-506)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗ＴＡＴ２２６抗体と化学療法剤又は他の毒素とを含む。イムノコンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。酵素活性毒素及びその断片も用いられてもよく、本明細書中に記載する。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは抗ＴＡＴ２２６抗体と一又は複数の小分子毒素、限定するものではないが、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれら薬剤の誘導体などの小分子薬剤とを含む。このようなイムノコンジュゲートの例は以降にさらに詳細に検討される。
１．例示的なイムノコンジュゲート
本発明のイムノコンジュゲート(又は「抗体-薬剤コンジュゲート」(「ＡＤＣ」))は、以下の式Ｉのものであり、任意のリンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)に抗ＴＡＴ２２６抗体がコンジュゲート(すなわち共有結合)しているものである。
Figure 2009533019
したがって、抗ＴＡＴ２２６抗体は直接又はリンカーを介して薬剤にコンジュゲートしうる。式Ｉでは、ｐは抗体当たりの薬剤部分の平均数であり、例えば１抗体当たりおよそ１〜およそ２０の薬剤部分、ある実施態様では、抗体当たり１〜およそ８の薬剤部分の範囲でありうる。
a) 例示的なリンカー
リンカーは、一又は複数のリンカー成分を含みうる。例示的なリンカー成分には、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」又は「ｖｃ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)が含まれる。様々なリンカー成分が当分野で公知であり、そのいくつかを以下に記載する。
リンカーは、細胞内での薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸に弱いリンカー(例えばヒドラゾン)、プロテアーゼ感受性(例えばペプチダーゼ感受性)リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等，Cancer Research 52:127-131[1992]；米国特許第５２０８０２０号)を使用してもよい。
いくつかの実施態様では、リンカー成分は、抗体を他のリンカー成分又は薬剤部分に連結する「ストレッチャーユニット」を含んでもよい。例示的なストレッチャーユニットを以下に示す(波線は抗体への共有結合の部位を示す)。
Figure 2009533019
Figure 2009533019
Figure 2009533019
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いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸ユニットを含みうる。そのような実施態様では、アミノ酸ユニットにより、プロテアーゼによるリンカーの切断が可能となり、それによってリソソーム酵素などの細胞内プロテアーゼへの曝露によってイムノコンジュゲートからの薬剤放出が促される。例としてDoronina等 (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784を参照。例示的なアミノ酸ユニットには、限定するものではないが、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドには、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ-ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ-ｐｈｅ)；フェニルアラニン-リジン(ｆｋ又はｐｈｅ-ｌｙｓ)；又はＮ-メチル-バリン-シトルリン(Ｍｅ-ｖａｌ-ｃｉｔ)が含まれる。例示的なトリペプチドには、グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ-ｖａｌ-ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ-ｇｌｙ-ｇｌｙ)が含まれる。アミノ酸ユニットは、天然に生じるアミノ酸残基、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含みうる。アミノ酸ユニットは設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
いくつかの実施態様では、リンカー成分は、直接又は、ストレッチャーユニット及び／又はアミノ酸ユニットにより、抗体を薬剤部分に連結する「スペーサー」ユニットを含みうる。スペーサーユニットは、「自己犠牲」又は「非自己犠牲」であってもよい。「非自己犠牲」のスペーサーユニットは、ＡＤＣの酵素的な(例えばタンパク質分解性の)切断によりスペーサーユニットの一部又はすべてが薬剤部分に結合したままとなるものである。非自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、グリシンスペーサーユニット及びグリシン-グリシンスペーサーユニットが含まれる。また、配列特異的な酵素的切断の影響を受けるペプチド性スペーサーの他の組合せも考慮される。例えば、グリシン-グリシンスペーサーユニットを含有するＡＤＣの腫瘍細胞関連のプロテアーゼによる酵素切断によって、残りのＡＤＣからグリシン-グリシン-薬剤部分が放出されるであろう。そのような実施態様では、グリシン-グリシン-薬剤部分は腫瘍細胞の異なる加水分解処理を受け、それによってグリシン-グリシンスペーサーユニットを薬剤部分から分離する。
「自己犠牲」のスペーサーユニットは、異なる加水分解処置を経ずに薬剤部分を放出させる。ある実施態様では、リンカーのスペーサーユニットはｐ-アミノベンジルユニットが含まれる。このような実施態様では、ｐ-アミノベンジルアルコールはアミド結合によりアミノ酸ユニットに結合し、カルバメート、メチルカルバメート又はカルボネートがベンジルアルコールと細胞障害性剤との間に作られる。例としてHamann等 (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103を参照。一実施態様では、スペーサーユニットはｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢ)である。ある実施態様では、ｐ-アミノベンジルユニットのフェニレン部分はＱｍに置き換えられ、このＱは-Ｃ１-Ｃ８アルキル、-Ｏ-(Ｃ１-Ｃ８アルキル)、-ハロゲン、-ニトロ、又は-シアノであり、そしてｍは０〜４の範囲の整数である。さらに、自己犠牲のスペーサーユニットの例には、限定するものではないが、ｐ-アミノベンジルアルコールに電子工学的に類似している芳香族化合物(例として米国特許公開第２００５/０２５６０３０号Ａ１を参照)、例えば２-アミノイミダゾール-５-メタノール誘導体(Hay等 (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9:2237)及びオルソ-ないしはパラ-アミノベンジルアセタール類が含まれる。アミド結合加水分解により環化されるスペーサー、例として、置換されたないしは置換されていない４-アミノ酪酸アミド類(Rodrigues等, Chemistry Biology, 1995, 2, 223)；適切に置換されたビシクロ[２.２.１]及びビシクロ[２.２.２]環システム(Storm,等, J. Amer. Chem. Soc., 1972, 94, 5815)；及び、２-アミノフェニルプロピオン酸アミド類(Amsberry,等, J. Org. Chem., 1990, 55, 5867)が用いられうる。グリシンのａ-位置で置換されているアミン含有薬剤の除去(Kingsbury,等, J. Med. Chem., 1984, 27, 1447)もまたＡＤＣに有用な自己犠牲のスペーサーの例である。
一実施態様では、以下に示すように、スペーサーユニットは分岐したビス(ヒドロキシメチル)スチレン(ＢＨＭＳ)ユニットであり、これを用いて複数の薬剤の取り込みと放出が行われうる。
Figure 2009533019
ここで、Ｑは−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)、−ハロゲン、−ニトロ、又は−シアノであり、ｍは０〜４の範囲の整数であり、ｎは０又は１であり、そして、ｐは１〜およそ２０の範囲である。
リンカーは、上記いずれかの一又は複数のリンカー成分を含んでもよい。ある実施態様では、リンカーは、以下のＡＤＣ 式IIにおいて括弧で示す。
Figure 2009533019
ここで、Ａはストレッチャーユニットであり、ａは０〜１の整数であり、Ｗはアミノ酸ユニットであり、ｗは０から１２の整数であり、Ｙはスペーサーユニットであり、ｙは０、１又は２であり、そして、Ａｂ、Ｄ及びｐは、式Iに関して上記に定義した。このようなリンカーの例示的な実施態様は、米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１に記載されており、出典明記によって本明細書中に明確に援用される。
例示的なリンカー成分及びその組合せは、式IIのＡＤＣについて以下に示す。
Figure 2009533019
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ストレッチャー、スペーサー及びアミノ酸ユニットを含むリンカー成分は、例えば米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１に記載のものなど、当分野で公知の方法によって合成されうる。
b) 例示的な薬剤部分
(1) メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
メイタンシノイド薬剤部分としての使用に適切なメイタンシン化合物は当分野で周知であり、公知の方法に従って天然の供給源から単離してもよいし、又は遺伝子工学技術を用いて産生してもよい(Yu等 (2002) PNAS 99:7968-7973を参照)。また、マイタンシノール及びマイタンシノール類似体は、公知の方法に従って合成して調製されてもよい。
例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾した芳香族環を有するもの、例えば、C-19-デクロロ(米国特許第４２５６７４６号)(アンサマイトシンＰ２のリチウムアルミニウム水素化物の還元によって調製される)；Ｃ−２０−ヒドロキシ(又はＣ−２０−デメチル) ＋／−Ｃ−１９−デクロロ(米国特許第４３６１６５０号及び同第４３０７０１６号)(ストレプトミセス属ないしはアクチノミセス属を用いた脱メチル化又はＬＡＨを用いた脱塩素により調製される)；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシロキシ(−ＯＣＯＲ)、＋／−デクロロ(米国特許第４２９４７５７号)(アシル塩化物を用いたアシル化により調製される)、及び他の位置に修飾を有するものが含まれる。
また、例示的なメイタンシノイド薬剤部分には、修飾を有するもの、例えば、Ｃ−９−ＳＨ(米国特許第４４２４２１９号)(Ｈ２Ｓ又はＰ２Ｓ５を有するメイタンシノールの反応により調製される)；Ｃ−１４−アルコキシメチル(デメトキシ／ＣＨ２ ＯＲ)(米国特許第４３３１５９８号)；Ｃ−１４−ヒドロキシメチル又はアシロキシメチル(ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ) (米国特許第４４５０２５４号)；Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシロキシ(米国特許第４３６４８６６号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの変換によって調製される)；Ｃ−１５−メトキシ(米国特許第４３１３９４６号及び同第４３１５９２９号)(トレウィア ヌドロフローラ(Trewia nudlflora)より単離)；Ｃ−１８−Ｎ−デメチル(米国特許第４３６２６６３号及び第４３２２３４８号)(ストレプトミセス属によるメイタンシノールの脱メチル化により調製される)；及び、４,５−デオキシ(米国特許第４３７１５３３号)(メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される)が含まれる。
メイタンシノイド薬剤部分の例示的な実施態様には、以下の構造を有するＤＭ１；ＤＭ３；及びＤＭ４が含まれる。
Figure 2009533019
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ここで、波線は、抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への薬剤の硫黄原子の共有結合を示す。ＤＭ１に対してＳＭＣＣにより連結したハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)が報告されている(国際公開第２００５／０３７９９２号；米国特許公開２００５／０２７６８１２号Ａ１)。
他の例示的メイタンシノイド抗体−薬剤コンジュゲートは以下のような構造と略記号を有している。(ここでＡｂは抗体であり、ｐは１〜およそ８である。)
Figure 2009533019
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ＤＭ１が抗体のチオール基にＢＭＰＥＯリンカーにより連結されている例示的な抗体−薬剤コンジュゲートは、以下のような構造及び略記号を有する。
Figure 2009533019
ここで、Ａｂは抗体であり、ｎは０、１又は２であり、そして、ｐは１、２、３又は４である。
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、米国特許公開第２００５/０２７６８１２号Ａ１、及び欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示内容は出典を明示してここに援用する。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び米国特許公開第2005/016993号A1(これらの開示内容は出典明記により特別に援用される)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、米国特許公開第2005/0276812号A1, "Antibody-drug conjugates and Methods."に開示されるように調製されうる。リンカーには、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれる。更なるリンカーを本願明細書中に記載し、例示する。
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。ある実施態様では、カップリング剤は、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)又はＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])である。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。一実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
(2) アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体ないしは誘導体、例えばアウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(US 5663149)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第02/088172号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様には、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦを含み、２００４年３月２８日に公開されたSenter等, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に援用される。
ペプチド性薬剤部分は以下の式ＤＥ及びＤＦから選択されうる。
Figure 2009533019
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ここで、ＤＥ及びＤＦの波線は、独立して各々の位置で、抗体又は抗体−リンカー成分への共有結合部位を示す。
Ｒ２は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル-アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
Ｒ５は、Ｈ及びメチルから選択され、
又はＲ４及びＲ５は共同で環状炭素を形成し、Ｒａ及びＲｂがＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル及びＣ３−Ｃ８炭素環式化合物からそれぞれ選択される式−(ＣＲａＲｂ)ｎ−を有し、ｎは２、３、４、５及び６から選択され、
Ｒ６は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物、アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−アリール、Ｃ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環及びＣ１−Ｃ８アルキル−(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)から選択され、
各々のＲ８は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ３−Ｃ８炭素環及びＯ−(Ｃ１−Ｃ８アルキル)からそれぞれ選択され、
Ｒ９は、Ｈ及びＣ１−Ｃ８アルキルから選択され、
Ｒ１０は、アリール又はＣ３−Ｃ８ヘテロ環から選択され、
ＺはＯ、Ｓ、ＮＨ、又はＲ１２がＣ１−Ｃ８アルキルであるＮＲ１２であり、
Ｒ１１は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、アリール、Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環、−(Ｒ１３Ｏ)ｍ−Ｒ１４、又は−(Ｒ１３Ｏ)ｍ−ＣＨ(Ｒ１５)２から選択され、
ｍは、１〜１０００の範囲の整数であり、
Ｒ１３はＣ２−Ｃ８アルキルであり、
Ｒ１４は、Ｈ又はＣ１−Ｃ８アルキルであり、
各々のＲ１５の発生は、独立してＨ、ＣＯＯＨ、−(ＣＨ２)ｎ−Ｎ(Ｒ１６)２、−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３Ｈ、又は−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３−Ｃ１−Ｃ８アルキルであり、
各々のＲ１６の発生は、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＯＨであり、
Ｒ１８は、−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２−アリール、−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２(Ｃ３−Ｃ８ヘテロ環)、及び−Ｃ(Ｒ8)２−Ｃ(Ｒ8)２(Ｃ３−Ｃ８炭素環式化合物)から選択され、そして、ｎは０から６の範囲の整数である。
一実施態様では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７は、それぞれイソプロピル又はｓｅｃ−ブチルであり、Ｒ５は-Ｈ又はメチルである。ある例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ５は-Ｈであり、そしてＲ７はｓｅｃ−ブチルである。
さらに他の実施態様では、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ９は−Ｈである。
さらに他の実施態様では、各々のＲ８の発生は-ＯＣＨ３である。
例示的な実施態様では、Ｒ３及びＲ４は各々イソプロピルであり、Ｒ２及びＲ６はそれぞれメチルであり、Ｒ５は-Ｈであり、Ｒ７はｓｅｃ−ブチルであり、各々のＲ８の発生は−ＯＣＨ３であり、そしてＲ９は−Ｈである。一実施態様では、Ｚは−Ｏ−又は−ＮＨ−である。
一実施態様では、Ｒ１０はアリールである。
ある例示的な実施態様では、Ｒ１０は−フェニールである。
ある例示的な実施態様では、Ｚが−Ｏ−の場合、Ｒ１１は−Ｈ、メチル又はｔ−ブチルである。
一実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２である。このＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−Ｎ(Ｒ１６)２であり、Ｒ１６は−Ｃ１−Ｃ８アルキル又は−(ＣＨ２)ｎ−ＣＯＯＨである。
他の実施態様では、Ｚが−ＮＨである場合に、Ｒ１１は−ＣＨ(Ｒ１５)２である。このＲ１５は−(ＣＨ２)ｎ−ＳＯ３Ｈである。
式ＤＥの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＥである。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す。
Figure 2009533019
式ＤＦの例示的なアウリスタチンの実施態様はＭＭＡＦである。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す(米国特許公開第２００５／０２３８６４９号及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124)を参照)。
Figure 2009533019
他の薬剤部分には以下のＭＭＡＦ誘導体が含まれる。ここで、波線は抗体−薬剤コンジュゲートのリンカー(Ｌ)への共有結合を示す。
Figure 2009533019
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一態様では、限定するものではないが、上記のようなトリエチレングリコールエステル(ＴＥＧ)を含む親水基はＲ１１で薬剤部分に結合することができる。ある特定の理論に縛られるものではないが、親水基は薬剤部分の内在化及び非凝集に存在する。
アウリスタチン／ドラスタチン又はその誘導体を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様は、米国特許公開第2005-0238649号Ａ１及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載されており、これは出典明記によってここに明確に援用される。ＭＭＡＥ又はＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様は、以下の構造及び略記号を有する(ここで、「Ａｂ」は抗体であり、ｐは１〜およそ８であり、「Ｖａｌ−Ｃｉｔ」はバリン-シトルリンジペプチドであり、そして「Ｓ」は硫黄原子である。
Figure 2009533019
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さらに、ＭＭＡＦと様々なリンカー成分を含む式IのＡＤＣの例示的な実施態様には、Ａｂ-ＭＣ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＡｂ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦが含まれる。興味深いことに、タンパク質分解性の切断を受けないリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートは、タンパク質分解で切断可能なリンカーによって抗体に結合しているＭＭＡＦを含むイムノコンジュゲートに比べて活性を有することが示されている。Doronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124を参照。このような場合、薬剤放出は細胞内の抗体分解に影響を受けると思われる。同上。
一般的に、ペプチドベースの薬剤部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、米国特許公開第2005-0238649号A1；米国特許公開第5635483号；米国特許第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863；及びDoronina (2003) Nat. Biotechnol. 21(7): 778-784の方法に従って調製されうる。
特に、式ＤＦのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＦ及びその誘導体は、米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１及びDoronina等 (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124に記載の方法を用いて調製されうる。式ＤＥのアウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分、例えばＭＭＡＥ及びその誘導体は、Doronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784に記載の方法を用いて調製されうる。薬剤−リンカー部分であるＭＣ-ＭＭＡＦ、ＭＣ-ＭＭＡＥ、ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ、及びＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥは、例えばDoronina等 (2003) Nat. Biotech. 21:778-784、及び米国特許公開第２００５／０２３８６４９号Ａ１に記載のような常套的な方法によって都合よく合成され、その後対象の抗体にコンジュゲートされてもよい。
(3) カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体がコンジュゲート可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
c) 他の細胞障害性剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同第５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。イムノコンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でイムノコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
ある実施態様では、イムノコンジュゲートは、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開８１／０１１４５を参照)を抗癌剤などの活性な薬剤へ変換するプロドラッグ活性化酵素へコンジュゲートした本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体を含みうる。このようなイムノコンジュゲートは抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法(「ＡＤＥＰＴ」)に有用である。本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体にコンジュゲートされうる酵素には、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に変換するのに有用なノイラミニダーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ；β-ラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換させるのに有用なβ-ラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。酵素が、当分野で周知の組み換えＤＮＡ技術によって本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体に共有結合されてもよい。例として、Neuberger等, Nature 312:604-608 (1984)を参照。
d) 薬剤ローディング(Drug Loading)
薬剤ローディングは、式Iの分子において、抗体当たりの薬剤部分の平均数であるｐによって表される。薬剤ローディングは抗体当たり１〜２０の薬剤部分(Ｄ)の範囲であってもよい。式IのＡＤＣには、１から２０の薬剤部分の範囲でコンジュゲートされる抗体の集まりが含まれる。コンジュゲート反応からのＡＤＣの調製において抗体当たりの薬剤部分の平均数は、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ及びＨＰＬＣなどの従来の方法によって特徴付けられうる。ｐに関するＡＤＣの定量的分布も決定されうる。いくつかの場合では、ｐが他の薬剤ローディングを有するＡＤＣの一定の値である場合の均質なＡＤＣの分離、精製及び特徴づけは、逆相ＨＰＬＣ又は電気泳動などの手段によって達成されうる。
ある抗体−薬剤コンジュゲートでは、ｐは抗体上の結合部位の数によって限定されうる。例えば、結合がシステインチオールである場合、上記の例示的な実施態様のように、抗体はたった１つ又は複数のシステインチオール基を有してもよいし、結合しうるリンカーによってたった１つ又は複数の十分に活性なチオール基を有してもよい。ある実施態様では、薬剤ローディングが高いと、例えばｐ＞５であると、特定の抗体−薬剤コンジュゲートの凝集、難溶性、毒性又は細胞透過性の喪失が起こりうる。ある実施態様では、本発明のＡＤＣの薬剤ローディングは、１〜およそ８の範囲、およそ２〜およそ６、又は、およそ３〜およそ５の範囲である。実際、あるＡＤＣでは、抗体当たりの薬剤部分の適切な比は、８未満であってもよいし、およそ２〜およそ５であってもよい。米国特許公開第２００５-０２３８６４９号Ａ１を参照。
ある実施態様では、理論的な最大よりも少ない薬剤部分がコンジュゲート反応の間に抗体にコンジュゲートされる。抗体は、例えば、以下に検討するように、薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬と反応しないリジン残基を含みうる。一般に、抗体は薬剤部分に結合しうる多くの遊離した反応性のシステインチオール基を含まず、実際、抗体のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィド架橋として存在する。ある実施態様では、抗体は、反応性のシステインチオール基を生成するために、部分的ないしは完全に還元な条件下で、ジチオトレイトール(ＤＴＴ)又はトリカルボニルエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)などの還元剤により還元されうる。ある実施態様では、抗体は変性条件下に曝されるとリジンやシステインなどの反応性の求核基を現す。
ＡＤＣのローディング(薬剤／抗体比率)は、例えば、(i) 抗体に対して薬剤−リンカー中間体又はリンカー試薬のモル過剰量を限定する、(ii) コンジュゲートの反応時間又は温度を限定する、及び(iii) システインチオール修飾のための還元条件を限定することによるなど、異なる方法で制御しうる。
１以上の求核基が薬剤部分試薬が続くリンカー試薬又は薬剤−リンカー中間体と反応する場合、その結果生じる生成物は、抗体に結合した一又は複数の薬剤部分を有するＡＤＣ化合物の混合物であると考えられる。抗体当たりの薬剤の平均数は、抗体特異的かつ薬剤特異的である二重ＥＬＩＳＡアッセイによって混合物から算出されうる。個々のＡＤＣ分子は、質量分析によって混合物中で識別され、ＨＰＬＣ、例えば疎水性相互作用クロマトグラフィによって分離されうる(例としてHamblett, K.J.,等 "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004；Alley, S.C.,等 "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004を参照)。ある実施態様では、単一のローディング値をもつ均質なＡＤＣは、電気泳動又はクロマトグラフィによってコンジュゲート混合物から単離してもよい。
e) イムノコンジュゲートの調製方法
式IのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学的反応、条件及び試薬を用いた様々な手段、例えば、(1) 共有結合によってＡｂ−Ｌを形成するための二価のリンカーと抗体の求核基との反応とその後の薬剤部分Ｄとの反応、及び(2) 共有結合によってＤ−Ｌを形成するための二価のリンカーと薬剤部分の求核基との反応とその後の抗体の求核基との反応などによって調製されてもよい。後者の手段による式IのＡＤＣを調製するための例示的な方法は米国特許公開第2005−0238649号A1に記載されており、出典明記によって本明細書中に明確に援用される。
抗体の求核基には、限定するものではないが、(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリジン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基が含まれる。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基により共有結合を形成することができる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、(i) 活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(iii) アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、抗体が完全ないしは部分的に還元されるように、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)又はトリカルボニルエチルホスフィン(ＴＣＥＰ)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２つの反応性のチオール求核基を形成する。リジン残基の修飾によって、例えば、チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリジンを反応させることによって、抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体に導入されてもよい。
また、本発明の抗体−薬剤コンジュゲートは、アルデヒドないしはケトンカルボニル基などの抗体上の求電子性基とリンカー試薬や薬剤上の求核基との間の反応によって生成してもよい。リンカー試薬上の有用な求核基には、限定するものではないが、hydrazide, oxime, amino, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate, 及びarylhydrazideが含まれる。一実施態様では、抗体を修飾して、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる求電子性の部分を導入する。他の実施態様では、グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応しうるアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができる抗体のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含む抗体はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基が含まれる。このリンカー部分及びリンカー試薬には、(i) 活性エステル類、例えばＮＨＳエステル類、ＨＯＢｔエステル類、ハロギ酸類及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えばハロアセトアミド類；(iii) アルデヒド類、ケトン類、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
本発明の化合物は、限定するものではないが、以下の架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
また、抗体と細胞障害性剤のイムノコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。
別法として、抗体と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。組み換えＤＮＡ分子は、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの抗体と細胞障害性の部分をコードする領域を含みうる。
さらに他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用して循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与してもよい。
Ｄ．薬剤的製剤
一態様では、本発明はさらに、少なくとも一の本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体及び／又は少なくとも一のこのイムノコンジュゲートを含有する薬学的製剤を提供する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、1) 抗ＴＡＴ２２６抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、2) 薬学的許容性のある担体とを含有する。いくつかの実施態様では、薬学的製剤は、1) 抗ＴＡＴ２２６抗体及び／又はこのイムノコンジュゲートと、場合によって2) 少なくとも一の付加的治療剤とを含有する。付加的治療剤には、限定するものではないが、以下のセクションＥ２に記載のものが含まれる。
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートを含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、水溶液又は凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
インビボ投与に用いられる薬学的製剤は一般に滅菌されている。これは滅菌濾過メンブレンによる滅菌によって容易に達成される。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体ないしイムノコンジュゲートが体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
Ｅ．抗ＴＡＴ２２６抗体及びイムノコンジュゲートの使用方法
１．診断法と検出の方法
一態様では、本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体及びイムノコンジュゲートは、生体試料中のＴＡＴ２２６の存在を検出するために有用である。本明細書中で用いる「検出する」なる用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。ある実施態様では、生体試料は、細胞又は組織、例えば図１３に列挙される組織を含む。ある実施態様では、このような組織には、他の組織、例えば卵巣、腎臓、脳、子宮内膜、副腎、骨、肺、皮膚及び軟組織と比較して高いレベルでＴＡＴ２２６を発現する正常及び／又は癌性組織が含まれる。
一態様では、本発明は、生体試料中のＴＡＴ２２６の存在を検出する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、ＴＡＴ２２６への抗ＴＡＴ２２６抗体の結合に許容される条件下で抗ＴＡＴ２２６抗体と生体試料を接触させ、抗ＴＡＴ２２６抗体と任意のＴＡＴ２２６との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む。
一態様では、本発明は、ＴＡＴ２２６の発現増加と関係している疾患を診断する方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、抗ＴＡＴ２２６抗体と試験細胞を接触させ、ＴＡＴ２２６への抗ＴＡＴ２２６抗体の結合を検出することによって試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベル(量的に又は質的に)を測定し、そして、試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルをコントロール細胞(例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞、又はこの正常細胞と同等のレベルでＴＡＴ２２６を発現する細胞)によるＴＡＴ２２６の発現レベルと比較することを含み、コントロール細胞と比べて試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルが高い場合にＴＡＴ２２６の発現の増加に関連する細胞増殖性疾患の存在が示される。ある実施態様では、試験細胞は、ＴＡＴ２２６の発現の増加に関連する疾患があると疑われる患者から得られる。ある実施態様では、前記疾患は、癌又は腫瘍などの細胞増殖性疾患である。
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的な細胞増殖性疾患には、腫瘍などの癌性症状、例えば、カルチノーマ(上皮腫瘍)及び芽細胞腫(胚組織に由来する腫瘍)、いくつかのある実施態様では、卵巣癌、子宮癌(子宮内膜癌を含む)、及び腎芽細胞腫(例えば、ウィルムス腫瘍)を含む腎臓癌が含まれる。特に卵巣癌は、卵巣由来の悪性腫瘍の異種性のグループを包含する。悪性卵巣腫瘍のおよそ９０％は卵巣の上皮性であり、残りのものは、生殖細胞及び間質腫瘍である。上皮性卵巣腫瘍は、以下の組織学的サブタイプに分類される。漿液性腺癌(およそ５０％の上皮性卵巣腫瘍を構成する)；類子宮内膜腺癌(〜２０％)；粘液性腺癌(〜１０％)；明細胞カルチノーマ(〜５〜１０％)；ブレンナー(移行細胞)腫瘍(比較的まれ)。女性の６番目に多い癌である卵巣癌の予後は通常悪く、５年生存率が５〜３０％の範囲である。卵巣癌の概要については、Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs等, eds., Oxford University Press, New York)のFox等 (2002) "Pathology of epithelial ovarian cancer,"；Encyclopedic Reference of Cancer, pp.654-656 (Schwab, ed., Springer-Verlag, New York)のMorin等 (2001) "Ovarian Cancer,"を参照。本発明は、上記の上皮性卵巣腫瘍サブタイプのいずれか、特に漿液性腺癌サブタイプを診断ないし治療する方法を考慮する。
ある実施態様では、上記のような診断ないし検出の方法は、表面にＴＡＴ２２６を発現する細胞から得た膜調整物中又は細胞の表面において発現されるＴＡＴ２２６に対する抗ＴＡＴ２２６抗体の結合を検出することを含む。ある実施態様では、前記方法は、ＴＡＴ２２６への抗ＴＡＴ２２６抗体の結合に許容される条件下で抗ＴＡＴ２２６抗体と細胞を接触させ、抗ＴＡＴ２２６抗体と細胞表面上のＴＡＴ２２６との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む。細胞の表面上に発現されたＴＡＴ２２６への抗ＴＡＴ２２６抗体の結合を検出するための例示的なアッセイは、以下の実施例Ｄに記載のものなどの「ＦＡＣＳ」アッセイである。
ある他の方法は、ＴＡＴ２２６に対する抗ＴＡＴ２２６抗体の結合を検出するために用いてもよい。前期の方法には、限定するものではないが、当分野で周知である抗原-結合アッセイ、例えばウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ(抗体結合免疫吸着検定)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び免疫組織化学(ＩＨＣ)が含まれる。
ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は標識される。標識には、限定するものではないが、直接検出される標識又は分子(例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識)、並びに、例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される酵素ないしはリガンドなどの分子が含まれる。例示的な標識には、限定するものではないが、放射性同位体である３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希有土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環のオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ又はマイクロペルオキシダーゼなどの色素前駆体を酸化するために水素ペルオキシダーゼを用いる酵素とカップリングさせたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定した遊離基などが含まれる。
ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は不溶性基質に固定される。固定化は、溶液中で遊離したままであるいずれかのＴＡＴ２２６から抗ＴＡＴ２２６抗体を分離することを伴う。これは従来、水不溶性基質ないしは表面に吸着させる(Bennich等, 米国特許第３７２７６０号)又は共有的にカップリングさせる(例えば、グルタールアルデヒド架橋結合を使用する)などしてアッセイ手順の前に抗ＴＡＴ２２６抗体を不溶化するか、又は抗ＴＡＴ２２６抗体とＴＡＴ２２６との複合体の形成の後に、例えば免疫沈降によって抗ＴＡＴ２２６抗体を不溶化することによって達成される。
診断ないし検出の上記いずれかの実施態様は、抗ＴＡＴ２２６抗体の代わりに、ないしは抗ＴＡＴ２２６抗体に加えて本発明のイムノコンジュゲートを用いて行われうる。
２．治療法
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、例えばインビトロ、エクスビボ、及びインビボの治療法で使われてもよい。一態様では、本発明は、ＴＡＴ２２６へのイムノコンジュゲートの結合が許容される条件下で抗ＴＡＴ２２６抗体ないしはそのイムノコンジュゲートに細胞を曝すことを含む、インビボ又はインビトロでの細胞の成長ないしは増殖を阻害するための方法を提供する。「細胞成長又は増殖を阻害する」ことは、細胞の成長ないしは増殖を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％低減することを意味し、細胞死を誘導することを含む。ある実施態様では、細胞は腫瘍細胞である。ある実施態様では、細胞は、卵巣腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、脳腫瘍細胞又は腎臓腫瘍細胞である。ある実施態様では、細胞は、例えば本明細書中に例示したような異種移植片である。
一態様では、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、細胞増殖性疾患を治療するか又は予防するために用いる。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は、ＴＡＴ２２６の発現及び／又は活性の増加と関係している。例えば、ある実施態様では、細胞増殖性疾患は、細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現増加と関係している。ある実施態様では、細胞増殖性疾患は腫瘍又は癌である。本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートによって処置される細胞増殖性疾患の例には、限定するものではないが、腫瘍などの癌性症状、例えば、カルチノーマ(上皮腫瘍)及び芽細胞腫(胚組織に由来する腫瘍)、ある実施態様では、卵巣癌、子宮癌(子宮体癌を含む)、脳腫瘍(例えば、星状細胞腫、多形性神経膠芽腫とも称される進行したグリオーマを含む)、及び腎芽細胞腫(例えば、ウィルムス腫瘍)を含む腎臓癌が含まれる。
一態様では、本発明は、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしそのイムノコンジュゲートの有効量を個体に投与することを含む細胞増殖性疾患を治療するための方法を提供する。ある実施態様では、細胞増殖性疾患を治療するための方法は、抗ＴＡＴ２２６抗体と、場合によって以下に挙げるような少なくとも一の付加的治療剤とを含有する薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む。ある実施態様では、細胞増殖性疾患を治療するための方法は、1) 抗ＴＡＴ２２６抗体と細胞障害性剤とを含むイムノコンジュゲートと、場合によって2) 以下に挙げるような少なくとも一の付加的治療剤とを含有する薬学的製剤の有効量を個体に投与することを含む。
一態様では、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの少なくともいくつかは、ヒト以外の種のＴＡＴ２２６を結合しうる。したがって、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、例えば、ＴＡＴ２２６を含む細胞培養物において、ヒトにおいて、又は、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートが交差反応するＴＡＴ２２６を有する他の哺乳動物(例えばチンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス)においてＴＡＴ２２６を結合するために用いてもよい。一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしイムノコンジュゲートは、ＴＡＴ２２６活動性が阻害されるように、ＴＡＴ２２６を抗体ないしイムノコンジュゲートと接触させることによってＴＡＴ２２６活性を阻害するために使われてもよい。一実施態様では、ＴＡＴ２２６はヒトＴＡＴ２２６である。
一実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしイムノコンジュゲートは、個体のＴＡＴ２２６が結合されるように抗体ないしイムノコンジュゲートを個体に投与することを含む、ＴＡＴ２２６発現及び／又は活性の増加と関係する疾患を患っている個体において抗体を結合させるための方法に用いられうる。一実施態様では、ＴＡＴ２２６はヒトのＴＡＴ２２６であり、個体はヒト個体である。あるいは、個体は、抗ＴＡＴ２２６抗体が結合するＴＡＴ２２６を発現している哺乳動物であってもよい。また更に、個体は、ＴＡＴ２２６が(例えば、ＴＡＴ２２６の投与によって、又はＴＡＴ２２６をコードする導入遺伝子の発現によって)導入された哺乳動物であってもよい。
抗ＴＡＴ２２６抗体ないしイムノコンジュゲートは、治療目的のためにヒトに投与されうる。さらに、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしイムノコンジュゲートは、獣医学の目的のため又はヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するＴＡＴ２２６を発現する非ヒト哺乳動物(例えば、霊長類、ブタ、ラット又はマウス)に投与されうる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの治療有効性を評価するため(例えば、投与の用量及び時間経過の試験する)に有用となりうる。
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートが、治療において単独、又は他の組成物と組み合わせて使われてもよい。例えば、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、少なくとも一の付加的治療剤及び／又はアジュバントと同時に投与されてもよい。ある実施態様では、付加的治療剤は、細胞障害性剤、化学療法剤又は増殖阻害性剤である。このような実施態様のうちの一つでは、化学療法剤は、卵巣癌の治療に用いられる薬剤又はこの薬剤の組合せ、例えば、白金化合物(例えばシスプラチン又はカルボプラチン)；タキサン(例えばパクリタキセル又はドセタキセル)；トポテカン；アンスラサイクリン(例えばドキソルビシン(ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ(登録商標))又はリポソームドキソルビシン(ＤＯＸＩＬ(登録商標)))；ゲムシタビン；シクロホスファミド；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ヘキサメチルメラミン；イホスファミド；及びエトポシドである。このような他の実施態様では、化学療法剤は、子宮癌ないし子宮内膜癌の治療に用いられる薬剤又はこの薬剤の組合せ、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、メトトレキセート、フルオロウラシル及びメドロキシプロゲステロンである。このような他の実施態様では、化学療法剤は、脳腫瘍の治療に用いられる薬剤又はこの薬剤の組合せ、例えば、ニトロソウレア(例えばカルムスチン又はロムスチン)；細胞障害性剤(例えばイリノテカン又はテモゾラミド)；抗血管新生剤(例えばサリドマイド、ＴＮＰ-４７０、血小板因子４、インターフェロン及びエンドスタチン)；分化剤(例えばレチノイド、フェニルブチレート、フェニルアセテート及び抗ネオプラストン)；抗浸潤剤(例えばマリマスタット(marimastat)などの基質メタロプロテイナーゼインヒビター)；シグナル伝達モジュレーター(例えばタモキシフェン、ブリオスタチン及びＯ-６ベンジグアニン)；トポイソメラーゼインヒビター(例えばイリノテカン又はトポテカン)；及び増殖因子インヒビター(例えばチロシンキナーゼインヒビター)である。このような他の実施態様では、化学療法剤は、腎臓癌(例えばウィルムス腫瘍)の治療に用いられる薬剤又はこの薬剤の組合せ、例えば、ビンクリスチン、アクチノマイシンＤ、アドリアマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、イホスファミド、エトポシド及びカルボプラチンである。ある実施態様では、本発明の抗体は、抗炎症薬及び／又は消毒剤と組み合わされてもよい。
上記の併用治療には、併用投与(２以上の治療剤が同じか又は別の製剤に包含される)、及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは付加的治療剤及び／又はアジュバントの前、同時及び／又はその後に投与することができる。また、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、放射線療法と組み合わせて使われてもよい。
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、及び鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体ないしイムノコンジュゲートを、特に抗体ないしイムノコンジュゲートの用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の好適な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって投与することができる。
結合標的が脳に位置する場合、本発明の特定の実施態様は、血液脳関門を横切る抗体ないしイムノコンジュゲートを提供する。血液脳関門を越えて分子を搬送するためには複数の従来技術に既知の手法が存在し、それらには、限定するものではないが、物理的方法、脂質に基づく方法、幹細胞に基づく方法、及びレセプターとチャネルに基づく方法が含まれる。
血液脳関門に抗体ないしイムノコンジュゲートを搬送する物理的方法には、限定するものではないが、血液脳関門を完全に包囲すること、又は血液脳関門に開口部を形成することが含まれる。包囲法には、限定するものではないが、脳への直接注入(例えば、Papanastassiou等, Gene Therapy 9: 398-406 (2002))、間質性注入／対流強化送達(例えば、Bobo等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)参照)、及び脳への送達装置の移植(例えば、Gill等, Nature Med. 9: 589-595 (2003)；及びGliadel WafersTM, Guildford Pharmaceutical参照)が含まれる。関門に開口を形成する方法には、限定するものではないが、超音波(例えば、米国特許出願公開第２００４／００３８０８６号参照)、浸透圧(例えば、高浸透圧性マンニトールの投与による(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えば、ブラジキニン又はパーミアライザーＡ−７による透過性化(例えば、米国特許第５１１２５９６号、同第５２６８１６４号、同第５５０６２０６号、及び同第５６８６４１６号参照)、及び抗体をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入(例えば、米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号)が含まれる。
血液脳関門を越えて抗体ないしイムノコンジュゲートを搬送する脂質に基づく方法には、限定されるものではないが、血液脳関門の血液内皮上のレセプターに結合する抗体結合断片に連結されるリポソームに抗体ないしイムノコンジュゲートを封入すること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００２５３１３号参照)、及び低密度リポプロテイン粒子(例えば、米国特許出願公開第２００４／０２０４３５４号参照)、又はアポリポタンパク質Ｅ(例えば、米国特許出願公開第２００４／０１３１６９２号参照)中の抗体ないしイムノコンジュゲートをコーティングすることが含まれる。
血液脳関門を越えて抗体ないしイムノコンジュゲートを搬送する幹細胞に基づく方法は、対象の抗体ないしイムノコンジュゲートを発現するように神経前駆細胞(ＮＰＣ)を遺伝的に操作し、次いで、治療する個体の脳に幹細胞を移植することを伴う。詳細なオンライン文献であるBehrstock等 (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005(神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作したＮＰＣが齧歯類及び霊長類のモデルの脳に移植した場合にパーキンソン病の症状を低減したことを報告している)を参照。
血液脳関門を越えて抗体ないしイムノコンジュゲートを搬送するレセプター及びチャネルに基づく方法には、限定するものではないが、グリココルチコイド遮断薬を用いて血液脳関門の透過性を増大させること(例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同第２００３／０１６２６９５号、及び同第２００５／０１２４５３３号参照)、カリウムチャネルを活性化させること(例えば、米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号参照)、ＡＢＣ薬の搬送を抑制すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号参照)、抗体ないしイムノコンジュゲートをトランスフェリンでコーティングし、一以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること(例えば、米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号参照)、及び抗体ないしイムノコンジュゲートのカチオン化(例えば、米国特許第５００４６９７号参照)が含まれる。
本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体ないしイムノコンジュゲートとを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の抗体ないしイムノコンジュゲートの量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートの好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの一又は複数の他の付加的な治療剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体ないしイムノコンジュゲートのタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体ないしイムノコンジュゲートを予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体ないしイムノコンジュゲートへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体ないしイムノコンジュゲートは一時的又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体ないしイムノコンジュゲートを、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体ないしイムノコンジュゲートの用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体ないしイムノコンジュゲートが投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
３．アッセイ
本発明の抗ＴＡＴ２２６抗体及びイムノコンジュゲートは、当分野で公知の様々なアッセイによって、それらの物理的／化学的な性質及び／又は生物活性について特徴付けされうる。
a) 活性アッセイ
一態様では、アッセイは、生物学的な活性を有する抗ＴＡＴ２２６抗体ないしそのイムノコンジュゲートを同定するために提供される。生物学的な活性には、例えば、細胞成長又は増殖の阻害能(例えば「細胞殺傷」活性)、又はプログラムされた細胞死(アポトーシス)を含む細胞死誘導能が含まれうる。また、インビボ及び／又はインビトロでのこのような生物学的な活性を有する抗体ないしイムノコンジュゲートが提供される。
ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体又はそのイムノコンジュゲートは、インビトロでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。細胞成長又は増殖の阻害のためのアッセイは当分野で周知である。本明細中に記載の「細胞殺傷」アッセイにて例示した細胞増殖のためのあるアッセイは、細胞生存度を測定する。このようなあるアッセイは、Promega (Madison, WI)から市販されているCellTiter-GloTM発光細胞生存率アッセイである。このアッセイは、代謝活性のある細胞の指標であるＡＴＰの存在の量に基づいて生細胞数を決定する。Crouch等 (1993) J. Immunol. Meth. 160:81-88、米国特許第6602677号を参照。アッセイは、自動ハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)に用いられるように96-又は３８４-ウェルフォーマットで行ってもよい。Cree等 (1995) AntiCancer Drugs 6:398-404を参照。アッセイ手順は、単一の試薬(ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-Ｇｌｏ(登録商標)試薬)を直接培養細胞に加えることを伴う。この結果細胞溶解が生じ、ルシフェラーゼ反応によって生産される発光シグナルが生成される。この発光シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に直接比例している、ＡＴＰの存在の量に比例する。データは、ルミノメーター又はＣＣＤカメラ画像デバイスによって記録することができる。発光の結果は相対的な光の単位(ＲＬＵ)として表す。
細胞増殖についての他のアッセイは「ＭＴＴ」アッセイであり、これは、ミトコンドリアレダクターゼによる３-(４,５-ジメチルチアゾール-２-イル)-２,５-ジフェニルテトラゾリウムブロマイドのホルマザンへの酸化を測定する比色アッセイである。CellTiter-GloTMアッセイのように、このアッセイは、細胞培養物に存在する代謝活性のある細胞の数を表す。例としてMosmann (1983) J. Immunol. Meth. 65:55-63及びZhang等 (2005) Cancer Res. 65: 3877-3882を参照。
一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、インビトロでの細胞死を誘導する能力について試験される。細胞死の誘導についてのアッセイは当分野で周知である。いくつかの実施態様では、このようなアッセイは、例えば、プロピジウムヨウ素(ＰＩ)トリパンブルー(Moore等 (1995) Cytotechnology, 17:1-11を参照)、又は7ＡＡＤの取り込みによって示される膜統合性の喪失を測定する。例示的なＰＩ取り込みアッセイでは、細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳ(Hyclone)と２ｍＭのＬ-グルタミンを添加した、ダルベッコ変更イーグル培地(Ｄ-ＭＥＭ)：ハムＦ-１２(５０:５０)中で培養する。したがって、このアッセイは、補体と免疫エフェクター細胞の非存在下で行う。１００×２０ｍｍのディッシュにディッシュ当たり３×１０６の密度で細胞を播き、終夜接着させる。培地を取り除き、新鮮な培地のみ、又は様々な濃度の抗体ないしイムノコンジュゲートを含む培地と交換する。細胞を３日間インキュベートする。処置後、単層をＰＢＳにて洗浄し、トリプシン処理によって脱離させる。次いで、１２００ｒｐｍで４℃で５分間遠心して、ペレットを３ｍｌの冷却Ｃａ２＋結合バッファ(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２.５ｍＭ ＣａＣｌ２)に再懸濁し、細胞凝集塊を取り除くために３５ｍｍのストレーナーを取り付けた１２×７５ｍｍチューブ(チューブ当たり１ｍｌ、１処理群につき３チューブ)に分注する。次いで、チューブにＰＩ(１０μｇ／ｍｌ)を加える。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて分析される。次いで、ＰＩ取り込みによって定まる統計学的に有意なレベルの細胞死を誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートを同定する。
一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしイムノコンジュゲートは、インビトロでのアポトーシス(プログラムされた細胞死)を誘導する能力について試験される。アポトーシスを誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートの例示的なアッセイはアネキシン結合アッセイである。例示的なアネキシン結合アッセイでは、細胞を培養し、前段落で述べたようにディッシュに播く。培地を取り除き、新鮮培地のみ、又は０．００１〜１０μｇ／ｍｌの抗体ないしイムノコンジュゲートを含む培地と交換する。３日間のインキュベート後、単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって脱離させる。次いで、細胞を遠心して、Ｃａ２＋結合バッファに再懸濁し、前段落で述べたようにチューブに分注する。その後、チューブに標識したアネキシン(例えばアネキシンＶ-ＦＩＴＣ)(１μｇ／ｍｌ)を加える。試料は、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭフローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴＴＭＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析される。次いで、コントロールと比べて統計学的に有意なレベルのアネキシン結合を誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートを同定する。アポトーシスを誘導する抗体ないしイムノコンジュゲートの他の例示的なアッセイは、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム間分解を検出するためのヒストンＤＮＡ ＥＬＩＳＡ比色アッセイである。このアッセイは、例えば細胞死検出ＥＬＩＳＡキット(Roche, Palo Alto, CA)を用いて行うことができる。
上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための細胞には、天然でＴＡＴ２２６を発現する又はＴＡＴ２２６を発現するように操作された細胞ないしは細胞株が含まれる。このような細胞には、同じ細胞起源の正常細胞と比べてＴＡＴ２２６を過剰発現する腫瘍細胞が含まれる。また、このような細胞には、ＴＡＴ２２６を発現する細胞株(腫瘍細胞株を含む)や、正常にＴＡＴ２２６を発現しないがＴＡＴ２２６をコードする核酸を形質移入してある細胞株が含まれる。上記いずれかのインビトロアッセイに用いるための本明細書中に挙げる例示的な細胞株には、ＴＡＴ２２６を発現するＯＶＣＡＲ３ヒト卵巣癌細胞株や、ＴＡＴ２２６をコードする核酸を形質移入したＨＣＴ１１６ヒト大腸癌細胞株が含まれる。
一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしそのイムノコンジュゲートは、インビボでの細胞成長又は増殖を阻害する能力について試験される。ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体ないしそのイムノコンジュゲートは、インビボでの腫瘍成長を阻害する能力について試験される。異種移植片モデルなどのインビボモデルシステムが前記の試験のために用いられうる。例示的な異種移植片システムでは、好適に免疫を低下させた非ヒト動物、例えば胸腺「ヌード」マウスにヒト腫瘍細胞が導入される。本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートは動物に投与される。抗体ないしイムノコンジュゲートの腫瘍成長を阻害するか又は減少させる能力が測定される。上記の異種移植片システムのある実施態様では、ヒト腫瘍細胞はヒト患者の腫瘍細胞である。このような異種移植片モデルはOncotest GmbH (Frieberg, Germany)から市販されている。ある実施態様では、ヒト腫瘍細胞は、本明細書中で例示したようにＯＶＣＡＲ３細胞などのヒト腫瘍細胞株由来の細胞である。ある実施態様では、皮下投与や、哺乳動物の脂肪体などの好適な部位に移植することによって好適に免疫を低下させた非ヒト動物にヒト腫瘍細胞を導入する。
b) 結合アッセイ及び他のアッセイ
一態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体はその抗原結合活性について試験される。例えば、ある実施態様では、抗ＴＡＴ２２６抗体は、細胞の表面に発現されるＴＡＴ２２６に結合する能力について試験される。実施例Ｄに記載のものなどのＦＡＣＳアッセイが前記の試験に用いられてもよい。
一態様では、競合アッセイを用いて、ＴＡＴ２２６への結合についてＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６と競合するモノクローナル抗体を同定してもよい。ある実施態様では、前記の競争する抗体は、ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６が結合する同じエピトープ(例えば線形又は立体のエピトープ)に結合する。例示的な競合アッセイには、限定するものではないが、Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)に挙げられるものなどの常套的アッセイが含まれる。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的な方法は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)のMorris (1996) "Epitope Mapping Protocols,"に示される。２つの抗体のそれぞれが５０％以上他の結合をブロックする場合、これらの抗体は同じエピトープに結合すると言える。
例示的な競合アッセイでは、固定されたＴＡＴ２２６は、ＴＡＴ２２６に結合する第一標識抗体(例えばＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６)と、ＴＡＴ２２６への結合について第一抗体と競合する能力について試験されている第二非標識抗体とを含む溶液中でインキュベートされる。二次抗体はハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定したＴＡＴ２２６を第一標識抗体を含むが第二非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＴＡＴ２２６への第一抗体の結合に許容される条件下でのインキュベートの後、過剰な結合していない抗体を取り除き、固定されたＴＡＴ２２６と結合している標識の量を測定する。固定されたＴＡＴ２２６と結合している標識の量がコントロール試料と比較して試験試料において実質的に減少している場合、二次抗体がＴＡＴ２２６への結合について第一抗体と競合していることが示唆される。ある実施態様では、固定されたＴＡＴ２２６は、細胞の表面上に、又はその表面上にＴＡＴ２２６を発現する細胞から得た膜調製物中に存在する。
一態様では、精製した抗ＴＡＴ２２６抗体はさらに、限定するものではないが、Ｎ末端配列決定法、アミノ酸分析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィ及びパパイン消化を含む、一連のアッセイによって特徴付けることができる。
一実施態様では、本発明は、全てではないが幾つかのエフェクター機能を有する変更された抗体を考慮し、この抗体は、抗体のインビボ半減期が重要であり、更に特定のエフェクター機能(補体又はＡＤＣＣなど)が不要又は有害である多くの用途の好ましい候補となる。特定の実施態様では、抗体のＦｃ活性を測定して、所望の特性だけが維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性を欠損していると思われる)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを仲介する第一細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲIIIのみを発現し、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現する。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの一例は、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等のPNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいてインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。
Ｆ．製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートである。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択された症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体ないしイムノコンジュゲートを含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)更なる細胞障害剤又はそれ以外の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
以降は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に一般的な記載がなされているので、様々な他の実施態様が実施されうると理解される。
Ａ．ＴＡＴ２２６遺伝子発現の分析
ヒトＴＡＴ２２６遺伝子発現は、遺伝子発現情報を含む登録商標のデータベースを用いて分析した(ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ(登録商標)、Gene Logic Inc., Gaithersburg, MD)。マイクロアレイプロファイル画面を用いてＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ(登録商標)データベースの図式的分析を行った。図１３は、左に列挙した様々な組織におけるＴＡＴ226遺伝子発現を図で示すものである。グラフの上のスケールは、ハイブリダイゼーションシグナル強度に基づいて遺伝子発現レベルを示す。それぞれの列挙した組織について隣接する線の上と下に点が現れる。線の上に現れる点は正常組織における遺伝子発現を表し、線の下に現れる点は腫瘍又は患部組織における遺伝子発現を表す。図１３は、それらの正常な相対物と比較して腫瘍又は患部組織においてＴＡＴ２２６遺伝子発現が増加している傾向を示す。特に、ＴＡＴ２２６は、正常な卵巣に比較して腫瘍性及び罹患した卵巣において、及び正常な腎臓と比較してウィルムス腫瘍において実質的な過剰発現を示す。正常組織と比較して腫瘍ないしは罹患した組織において過剰発現を示す他の組織には、子宮内膜、副腎、骨、肺、皮膚及び軟組織がある。さらに、ＴＡＴ２２６は、正常な脳組織(例えば嗅脳、海馬及び脳幹神経節)と、腫瘍性ないしは罹患した脳組織、例えばグリオーマにおいて強く発現される。
また、ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ(登録商標)データベースを用いて、正常卵巣；正常卵管；明細胞、粘液性及び漿液性の嚢胞腺腫サブタイプの卵巣癌；転移性卵巣癌；及び、他のタイプの卵巣癌におけるＴＡＴ２２６遺伝子の発現を分析した。結果を図１４にグラフとして示す。特定の組織の種類をグラフの下に示す。グラフのｙ軸上のスケールは、ハイブリダイゼーションシグナル強度に基づく遺伝子発現レベルを示す。漿液性嚢胞腺癌と転移性卵巣癌は正常卵巣と比べてＴＡＴ２２６の強い過剰発現を示した。明細胞及び粘液性のサブタイプは正常卵巣に相当する発現を示した。また、正常卵管はＴＡＴ２２６の実質的な発現を示した。とりわけ、卵巣癌の漿液性サブタイプは組織学的に卵管上皮を非常に似ており、卵巣と卵管は同じ胚組織に由来する。Fox等 (2002) "Pathology of epithelial ovarian cancer," in Ovarian Cancer ch. 9 (Jacobs等, eds., Oxford University Press, New York)を参照。
Ｂ．抗ＴＡＴ２２６抗体の生成
ＴＡＴ２２６に対する抗体は、配列番号：７５のアミノ酸１−１１５を含む組み換え「ＴＡＴ２２６-Ｈｉｓ」融合タンパク質とＣ末端ポリヒスチジンタグによってファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることによって生成した。ファージディスプレイライブラリは、Ｆａｂ'-ｚｉｐ−ファージシステムを用いて生成される合成(Ｆａｂ')２ライブラリであった。Lee等 (2004) J. Immunol. Methods 284:119-132を参照。ライブラリは、ｈｕＭＡｂ4Ｄ5-８重鎖可変領域のフレームワークの重鎖ＨＶＲ(図５Ａ及び５Ｂ、第二アクセプター「Ｂ」、配列番号：５０、５１、５７、３５を参照)と、配列番号：２６に示す固定されたｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖可変領域のライブラリを含む。ファージディスプレイを用いて選択されるクローンは、ファージＥＬＩＳＡを用いてＴＡＴ２２６-Ｈｉｓに対してスクリーニングした(Sidhu等 (2004) J. Mol. Biol. 338:299-310を参照)。クローンＹＷＯ.３２及びＹＷＯ.４９を更なる分析のために選択した。
ＹＷＯ.４９の親和性を改善するために、ファージディスプレイライブラリは、ソフトランダム化の標的としたＨＶＲ-Ｈ３とＨＶＲ-Ｌ３を有するＹＷＯ.４９のバックグラウンドで生成した。このとき、設定したＨＶＲ中の選択したアミノ酸残基は不変に保たれるのに対して、その他は変異しうる。選択されたクローンはファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６と称する親和性成熟された抗体は更なる分析に用いた。図９及び１０に示すように、ＹＷＯ.３２, ＹＷＯ.４９, ＹＷＯ.４９.Ｂ７, ＹＷＯ.４９.Ｃ９, ＹＷＯ.４９.Ｈ２, 及びＹＷＯ.４９.Ｈ６のＶＨ及びＶＬ領域のヌクレオチドとコードしたポリペプチド配列を決定した。ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の重鎖及び軽鎖のＨＶＲ配列を図２〜４に示す。ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６から得るコンセンサスＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３配列もまた、図４に示す。ＹＷＯ.４９, ＹＷＯ.４９.Ｂ７, ＹＷＯ.４９.Ｃ９, ＹＷＯ.４９.Ｈ２, ａｎｄ ＹＷＯ.４９.Ｈ６は、組み換え技術を用いて適切な定常領域へＦａｂ'断片を移植することによって完全長ＩｇＧとして「再フォーマット」した。以降に記載した実施例は再フォーマットした抗体を用いて行った。
Ｃ．組み換え抗原に対する結合親和性の特徴付け
組み換え抗原に対するＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の結合親和性は、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)３０００システム(Biacore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた表面プラスモン共鳴法によって測定した。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(ＣＭ５、BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗ＴＡＴ２２６抗体は、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)にて５μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、およそ５００反応単位(ＲＵ)の抗体がカップリングするまで、５μｌ／分の流速で注入した。次に、１Ｍ エタノールアミンを注入して反応していない基をブロックした。動力学的な測定のために、ＴＡＴ２２６-Ｈｉｓの２倍の段階希釈物(０．７ｎＭ〜５００ｎＭ)を２５℃、２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに注入した。単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)は比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。この実験の結果を下記の表２に示す。
表２
Figure 2009533019
Ｄ．細胞表面ＴＡＴ２２６に対する抗体結合の特徴付け
ヒト卵巣癌細胞株であるＯＶＣＡＲ３の表面上に発現するＴＡＴ２２６に結合する抗ＴＡＴ２２６抗体の能力を試験した。ＹＷＯ.４９, ＹＷＯ.４９.Ｂ７, ＹＷＯ.４９.Ｃ９, ＹＷＯ.４９.Ｈ２, 又はＹＷＯ.４９.Ｈ６の存在下及び非存在下において、ＯＶＣＡＲ３に対する蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)を行った。簡単に言うと、分離した細胞を、５μｇ／ｍｌの一次抗体とともに氷上で１時間インキュベートし、洗浄して、二次抗体(フィコエリトリンにコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ)とともに氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎＴＭフローサイトメーター(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いてＦＡＣＳを行った。
ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.Ｈ６についてのＦＡＣＳ分析の結果を図１５に示す。各グラフの左側のピークは「バックグラウンド」結合、すなわち二次抗体のみの結合を表す。各グラフの右側のピークは示した抗ＴＡＴ２２６抗体の結合を表す。ＦＡＣＳによって、ＹＷＯ.４９.Ｂ７は、ＹＷＯ.４９と他の親和性成熟した抗体について観察されたＫｄの範囲内のＫｄで組み換え抗体に結合したが、ＯＶＣＡＲ３細胞に対して有意な結合を示さなかった(ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)分析の結果である上記の表２を参照)。ＹＷＯ.４９.Ｃ９の結合はＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.Ｈ６について観察された結合と同じ程度であった。
Ｅ．細胞表面抗原に対する結合能の特徴づけ
ＯＶＣＡＲ３細胞の表面上に発現するＴＡＴ２２６に対するＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の結合親和性は、競合アッセイを用いて試験した。簡単に言うと、標識した(ヨード化)ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６を非標識抗体の存在下でＯＶＣＡＲ３細胞に結合させた。抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem. 107:220 (1980)に最初に記載されたスキャッチャード分析方法に従って決定した。この実験の結果を下記の表３に示す。
表３
Figure 2009533019
ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６のＫｄは、組み換えＴＡＴ２２６-ＨｉｓよりもＯＶＣＡＲ３細胞の表面上に発現したＴＡＴ２２６に対して高い(表２及び３のＹＷＯ.４９.Ｈ２とＹＷＯ.４９.Ｈ６に関するＫｄを比較)。このことから、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６は、ＯＶＣＡＲ３細胞の表面上に発現したＴＡＴ２２６に対してよりも組み換えＴＡＴ２２６-Ｈｉｓに対してわずかに高い親和性を有して結合することが示唆される。
Ｆ．ＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現
ＯＶＣＡＲ３細胞と卵巣癌試料のパネルにおけるＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡ発現を、５'ヌクレアーゼ(ＴａｑＭａｎ(登録商標))アッセイとリアルタイム量的ＰＣＲを用いて分析した。図１６で「ＨＦ＃＃＃＃」と称した卵巣癌試料は凍結組織切片であった。組織切片からＲＮＡを単離し、ＡｍｂｉｏｎのＭｅｓｓａｇｅ Ａｍｐ ＩＩキット(Ambion, Austin, TX)を用いて増幅し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＯＶＣＡＲ３細胞からＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＴＡＴ２２６ ｃＤＮＡを、伸展可能でない、増幅生成物に特異的なレポータープローブの存在下でリアルタイムＰＣＲによって増幅した。閾値サイクル又は「Ｃｔ」(レポータープローブの切断から生成されるシグナルがバックグラウンドを上回ったサイクル)を決定して、それを用いて開始ＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡレベルを算出した。卵巣癌試料のパネルにおけるＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡのレベルは、図１６の棒グラフに示すように、ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡのレベルと比較して表した。
ＯＶＣＡＲ３細胞と卵巣癌試料のパネルにおけるＴＡＴ２２６タンパク質発現は、以下のような免疫組織化学法(ＩＨＣ)を用いて分析した。卵巣癌試料の組織切片(凍結ないしはパラフィン包埋)をアセトン／エタノールにて５分間かけて固定した。切片をＰＢＳで洗浄して、アビジン及びビオチン(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)にてそれぞれ１０分かけてブロックし、再びＰＢＳで洗浄した。その後切片を、１０％の血清にて２０分かけてブロックし、ブロットして過剰な血清を除去した。その後、一次抗体(ＹＷＯ.４９.Ｈ２又はＹＷＯ.４９.Ｈ６)を１０μｇ／ｍｌの濃度で１時間かけて切片に加えた。その後切片をＰＢＳで洗浄した。ビオチン化した二次抗ヒト抗体を３０分間切片に添加し、その後切片をＰＢＳで洗浄した。次いで、切片をベクターＡＢＣキット(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)の試薬に３０分間曝し、その後ＰＢＳで洗浄した。次いで、切片をジアミノベンジジン(Pierce)に５分間曝し、その後ＰＢＳにて洗浄した。次いで、切片をメーヤーズヘマトキシリンにて対比染色し、カバーグラスで覆い、視覚化した。細胞が初めペレット状で、凍結して、その後切片化したことを除いて同じプロトコールを用いて、ＯＶＣＡＲ３細胞に対してＩＨＣを行った。次いで、切片に対して上記のプロトコールを行った。
結果を、図１６において質的に報告する。発現レベルを「−」、「＋／−」又は「＋」に分類した。一般的に、ＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡ発現のレベルとＯＶＣＡＲ３細胞の表面上のＴＡＴ２２６タンパク質の発現との間に全体的に見て相関関係があった。また、ＩＨＣ実験から、抗体が細胞表面上のＴＡＴ226を認識することが確認された。卵巣癌細胞パネルにおける各細胞の組織像も図１６に示し、「adenoca.」の省略形は「腺癌(adenocarcinoma)」を表す。
Ｇ．抗ＴＡＴ２２６ ＡＤＣの産生
抗ＴＡＴ２２６ ＡＤＣは、以下の薬剤−リンカー部分にＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６をコンジュゲートさせることによって産生した。セクションＩＩＩのＣ.１.ｂ.２.において示す、ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ；ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ；及び、ＭＣ-ＭＭＡＦ。コンジュゲートの前に、国際公開第２００４/０１０９５７号Ａ２に記載の方法に従って、標準的な方法を用いてＴＣＥＰにより部分的に還元した。部分的に還元した抗体は、Doronina等 (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784及び米国公開特許第２００５／０２３８６４９号Ａ１に記載の方法に従って標準的な方法を用いて上記の薬剤−リンカー部分にコンジュゲートした。簡単に言うと、部分的に還元した抗体を薬剤リンカーと組み合わせて、該部分をシステイン残基にコンジュゲートさせた。コンジュゲート反応を止め、ＡＤＣを精製した。各ＡＤＣに対する薬剤ロード(抗体当たりの薬剤部分の平均数)を以下のようにＨＰＬＣにより決定した。
Figure 2009533019
Ｈ．細胞殺傷アッセイ
抗体−薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)は、以下のインビトロ及びインビボの細胞殺傷アッセイにおいて、ＴＡＴ２２６を発現する細胞の増殖を阻害する能力について試験した。
１．ＯＶＣＡＲ３インビトロ細胞殺傷アッセイ
ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣを、ＯＶＣＡＲ３細胞の増殖を阻害する能力について試験した。ＯＶＣＡＲ３細胞を、２０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩを有する９６ウェルプレートに播いた。図１７に示すように、ウェル当たり３０００細胞の密度のＯＶＣＡＲ３細胞を様々な濃度のＡＤＣとともにインキュベートした。ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ＭＵＣ１６/ＣＡ１２５抗体をポジティブコントロールとして用いた。ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５は卵巣癌抗原であることがわかっている。例としてYin等 (2001) J. Biol. Chem. 276:27371-27375を参照。ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ＩＬ-８抗体をネガティブコントロールとして用いた。５日のインキュベートの後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイ(Promega, Madison, WI)を用いて細胞生存率を測定した。図１７のｙ軸上のスケールは、細胞生存率の程度であるルシフェラーゼ発光から得る、相対的な光の単位又は「ＲＬＵ」を示す。
図１７から、ポジティブコントロールと同様に、ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦは、特に０．０１と０．１μｇ／ｍｌのあたりの濃度で顕著な細胞殺傷活性を有したことが示唆される。また、ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥも細胞殺傷活性を有したが、ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦで観察されるよりも低い程度であった。ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦのＩＣ５０はおよそ０．００５ｎＭであり、 ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥのＩＣ５０はおよそ０．２ｎＭであった。遊離したＭＭＡＥのＩＣ５０はおよそ０．１ｎＭであった。ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ＭＭＡＦはこのアッセイにおいて有意な細胞殺傷活性を示さなかった。この特定のアッセイ系では、ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦの濃度が全体的に高いので、ネガティブコントロールのＡＤＣを含む高濃度のＡＤＣで、細胞生存率が実質的に減少することが示される。
２．ＨＣＴ１１６形質移入細胞を用いたインビトロ細胞殺傷アッセイ
ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣを、ヒトＴＡＴ２２６をコードする核酸を安定して形質移入してある大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞の増殖を阻害する能力について試験した。形質移入していないＨＣＴ１１６細胞は通常、遊離(コンジュゲートしていない)のＭＭＡＥに対してＯＶＣＡＲ３細胞のおよそ５〜６分の１の感受性である。
簡単に言うと、ＨＣＴ１１６細胞を以下の通りに形質移入した。エピトープ-タグ化ヒトＴＡＴ２２６をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３.１(Invitrogen, Carlsbad, CA)にて構築した。エピトープタグは、１型単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(「ｇＤ」タグ)のアミノ酸１−５３からなる。これは、ヒトＴＡＴ２２６のＮ末端でアミノ酸１−２２からシグナル配列を置換したものである。組み換えベクターは、製造業者のプロトコールに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ200(Invitrogen)を用いてＨＣＴ116細胞に形質移入した。形質移入したＨＣＴ116細胞を、１０％ＦＢＳ及び０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を有するマッコイの５ａ培地中で培養した。細胞を抗ｇＤ抗体を用いて染色し、組み換えｇＤ：ヒトＴＡＴ２２６融合タンパク質を発現する個々のクローンについて選択するためにＦＡＣＳにて分類した。クローンの中の１つをＨＣＴ１１６#９-４と称し、更なる分析のために選んだ。
細胞殺傷アッセイを行うために、ＨＣＴ１１６#９-４細胞を９６ウェルプレートに播いた。図１８に示すように、ウェル当たり１０００個の細胞の密度のＨＣＴ１１６#９-４細胞を、様々な濃度のＡＤＣとともにインキュベートした。ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥにコンジュゲートした抗ｇｐ１２０抗体をネガティブコントロールとして用いた。３日のインキュベートの後、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ-ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイ(Promega, Madison, WI)を用いて細胞生存率を測定した。
図１８から、ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦは、特におよそ０．０１μｇ／ｍｌから試験した最も高い濃度以下で顕著な細胞殺傷活性を有したことが示される。ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦのＩＣ５０はおよそ０．０５ｎＭであり、遊離ＭＭＡＥのＩＣ５０はおよそ０．９ｎＭであった。この特定のアッセイにおいて、ＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥは、ネガティブコントロールと比べて実質的な細胞殺傷活性を有さなかった。ＯＶＣＡＲ３細胞殺傷アッセイ(上記)と比べて、このアッセイにおけるＹＷＯ.４９.Ｈ２-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥとＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥの細胞殺傷活性の差異は、細胞密度及び／又は薬剤感受性の差異などの様々な要因に起因しうる。
ＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡないしはタンパク質を正常に発現する試験した他の細胞株であるＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣは有意な細胞殺傷活性を示さなかったことが示唆される。これは、様々な要因、例えば細胞種類特異的な作用、細胞表面ＴＡＴ２２６発現のレベル、及び／又は薬剤感度性の差異によるものでありうる。
３．ＨＣＴ１１６＃９-４異種移植片を用いたインビボアッセイ
インビボ異種移植片モデルを用いて、インビボでのＴＡＴ２２６発現腫瘍細胞の増殖を阻害する能力について、コンジュゲートしていないＹＷＯ.４９.Ｈ６とコンジュゲートしているＹＷＯ.49.Ｈ6を試験した。マウスの背側両側腹部におよそ５×１０６個のＨＣＴ１１６#９-４細胞を皮下注入すると、胸腺ヌード「ｎｕ-ｎｕ」マウスにおいて腫瘍が誘導された。腫瘍は、２００ｍｍ３の平均腫瘍体積に達するまで大きくなった。この時点を「０日目」とする。図１９に示すように、０、７及び１６日目に、３ｍｇ／ｋｇの示したコンジュゲートしていない抗体又はＡＤＣをマウスに静脈内投与した。コンジュゲートしていないないしはコンジュゲートしている抗ブタクサ抗体(Ａｂ)をネガティブコントロールとして用いた。３、７、１０、１６及び２１日目に平均腫瘍体積を測定した。図１９に示すように、平均腫瘍体積によって測定したところ、この特定の異種移植片モデルにおいて抗ブタクサＡｂ-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦと比較して、ＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦは有意な腫瘍細胞殺傷活性を示した。この異種移植片モデルにおいて、ＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥは、抗ブタクサＡｂ-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥと比較して有意な腫瘍細胞殺傷活性を示さなかった。しかしながら、この異種移植片モデルは、薬剤感受性の差異や異種移植片腫瘍微小環境における細胞表面ＴＡＴ２２６の発現レベルなどの様々な要因に関してインビトロで観察されるＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥの細胞殺傷活性を示していないかもしれない。
４．他の異種移植片モデル
他の異種移植片モデルを用いて、インビボでのＴＡＴ２２６発現腫瘍細胞の増殖を阻害する能力について、コンジュゲートしていない抗ＴＡＴ２２６抗体とコンジュゲートしている抗ＴＡＴ２２６抗体を試験してもよい。例えば、卵巣及び脳の腫瘍についての異種移植片モデルは、Oncotest GmbH (Frieberg, Germany)及びSouthern Research Institute (Birmingham, AL)など公の供給源から提供されうる。特にOncotestモデルは、免疫欠損ヌードマウスで患者腫瘍を成長させることによって開発された。ＴＡＴ２２６ ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を発現する異種移植片は、インビボでの抗ＴＡＴ２２６抗体の細胞殺傷活性を示すために有用でありうる。
コンジュゲートしているＹＷＯ.４９.Ｈ６は、インビボでの卵巣腫瘍細胞の増殖を阻害する能力についてＯｎｃｏｔｅｓｔモデルＯＶＸＦ１０２３において試験した。ＯｎｃｏｔｅｓｔモデルＯＶＸＦ１０２３は、転移したあまり識別できない乳頭漿液性腺腫卵巣癌、ステージＭ１に由来する。ＯＶＸＦ１０２３マウスは図２０に示したＡＤＣにて試験した。図２０では、ＹＷＯ.４９.Ｈ６を「Ｈ６」とし、抗ブタクサ(コントロール)抗体を「ＲＷ」とし、リンカー-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-を「ｖｃ」と略す。ＡＤＣは図２０に示す濃度と日数で投与した。図２０に示す結果から、ＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ＭＭＡＦは他のＡＤＣよりも有意に腫瘍体積を減少させたことが示唆される。
上記の実験は、用量とコントロールＡＤＣを変えて同じ条件でＯＶＸＦ１０２３を用いて繰り返した。繰り返した実験では、マウスは、より高い用量(５ｍｇ／ｍｌ)のＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥとより低い用量(５ｍｇ／ｍｌ)のＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ及びＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ＭＭＡＦで処理した。結果から、Ｈ６ ＡＤＣ(及び特にＹＷＯ.４９.Ｈ６-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ)は、それぞれのコントロールＡＤＣ(６.４ｍｇ/ｋｇの抗-ｇｐ１２０-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥ；７.２ｍｇ/ｋｇの抗-ｇｐ１２０-ＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＦ；及び５.４ｍｇ/ｋｇの抗-ｇｐ１２０-ＭＣ-ＭＭＡＦ)と比べて腫瘍体積の減少を示したが、Ｈ６ ＡＤＣとそのそれぞれのコントロールＡＤＣとの効果の差はいくつかのデータポイントでは統計的に有意ではなかったことが示唆される(データは示さない)。これらの結果と初めのＯＶＸＦ１０２３実験で得られた結果との差異は、Ｈ６ ＡＤＣの用量における差異と腫瘍体積低減においてコントロール抗ｇｐ１２０ＡＤＣが予期しない活性を示したという観察によるものであるかもしれない。
さらに、Ｈ６ ＡＤＣは、中程度に分化した乳頭漿液性卵巣癌(原発性腫瘍)に由来する他のＯｎｃｏｔｅｓｔモデルであるＯＶＸＦ８９９においても試験した。このモデルにおいてはＨ６ ＡＤＣは腫瘍体積を低減しなかった(データは示さない)。しかしながら、この特定のＯｎｃｏｔｅｓｔモデルはＴＡＴ２２６の発現が低く、これは観察された結果を示唆するものであるかもしれない。
Ｉ．ＴｈｉｏＭＡｂ
システイン操作抗体又は「ｔｈｉｏＭＡｂ」は、リンカー−薬剤部分のコンジュゲートのための付加的な部位を提供するためにＹＷＯ.４９.Ｈ６の選択した残基をシステインと置換して作製した。具体的に言うと、ＹＷＯ.４９.Ｈ６の重鎖にＡ１１８Ｃ置換(ＥＵ番号付け)を作製するか、又はＹＷＯ.４９.Ｈ６の軽鎖にＶ２０５Ｃ置換(カバット番号付け)を作製した。次いで、結果として生じたＡ１１８Ｃ ｔｈｉｏＭＡｂをＭＣ-ＭＭＡＦにコンジュゲートし、結果として生じたＶ２０５Ｃ ｔｈｉｏＭＡｂをＭＣ-ＭＭＡＦ又はＭＣ-ｖｃ-ＰＡＢ-ＭＭＡＥのいずれかにコンジュゲートした。ＦＡＣＳ分析によるとすべてのｔｈｉｏＭＡｂはＯＶＣＡＲ３細胞に結合することができた(データは示さない)。
前述の発明は、理解を明確にする目的のために図及び実施例によってある程度詳細に記載したのであって、この記載及び実施例が本発明の権利範囲を限定すると解されるべきではない。本明細書中で引用したすべての特許及び科学文献の開示内容は、出典明記によってその全体が明確に援用される。
ヒト、カニクイザル(「ｃｙｎｏ」)、マウス及びラットのＴＡＴ２２６のアラインメントを示す。囲った残基は種間で同一である。囲っていない残基は４種のうちの少なくとも２種間で異なる。ヒト、カニクイザル、マウス及びラットのＴＡＴ２２６配列間で同一なアミノ酸の割合をアラインメントの下の表に示す。同一性の割合はＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出した。 実施例Ｂに記載のように、ＹＷＯ.３２及びＹＷＯ.４９と称した抗ＴＡＴ２２６モノクローナル抗体のＨ１、Ｈ２及びＨ３重鎖高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列を示す。アミノ酸位は、後述するようにカバット番号付けシステムに従って番号をつける。 実施例Ｂに記載のように、ＹＷＯ.３２及びＹＷＯ.４９と称した抗ＴＡＴ２２６モノクローナル抗体のＬ１、Ｌ２及びＬ３軽鎖ＨＶＲ配列がを示す。アミノ酸位は、後述するようにカバット番号付けシステムに従って番号をつける。 実施例Ｂに記載のように、ＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３ソフトランダム化ライブラリを用いたＹＷＯ.４９の親和性成熟によって生成されたＹＷＯ.４９及びＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６のＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３配列を示す。コンセンサスＨＶＲ-Ｈ３及びＨＶＲ-Ｌ３配列も示す。 以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒト可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク配列を示す。−ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：３２、３３、３４、３５)。−ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：３６、３７、３４、３５；配列番号：３６、３７、３８、３５；及び、配列番号：３６、３７、３９、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：４０、４１、４２、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：４３、４４、４２、３５；配列番号：４３、４４、４５、３５；及び、配列番号：４３、４４、４６及び３５)。−ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：４７、４８、４９、３５)。−ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、４９、３５；配列番号：５０、５１、５２、３５；及び、配列番号：５０、５１、５３、３５)。−ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：５４、４８、５５、３５)。−ヒトＶＨアクセプターフレームワーク「Ｂ」及び「Ｃ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、５５、３５；及び、配列番号：５０、５１、５６、３５)。−ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ａ」からカバットＣＤＲを除いたもの(配列番号：５４、４８、５７、３５)。−ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク「Ｂ」、「Ｃ」及び「Ｄ」から伸展した高頻度可変領域を除いたもの(配列番号：５０、５１、５７、３５；配列番号：５０、５１、５８、３５；及び、配列番号：５０、５１、５９、３５)。 以下に示す配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒト可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク配列を示す。−ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(κｖ１)：配列番号：６０、６１、６２、６３。−ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(κｖ２)：配列番号：６４、６５、６６、６３。−ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(κｖ３)：配列番号：６７、６８、６９、６３。−ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(κｖ４)：配列番号：７０、７１、７２、６３。 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖及び重鎖のフレームワーク配列を示す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。 ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖及び重鎖のフレームワーク配列を修飾とともに示す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。 ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の重鎖可変領域(ＶＨ)配列を示す。ＨＶＲは下線で示す。 ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の軽鎖可変領域(ＶＬ)配列を示す。また、ヒト化モノクローナル抗体４Ｄ５-８(「ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８」)及び「修飾した」ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８のＶＬ配列を、それぞれ配列番号：３１及び配列番号：２６に示す。ＹＷＯ.３２及びＹＷＯ.４９は「修飾した」ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８ ＶＬ(配列番号：２６)と同じＶＬ配列を有する。このｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８ ＶＬは配列番号：３１と関連して以下の置換：Ｎ３０Ｓ、Ｒ６６Ｇ及びＨ９１Ｓを含有する。ＨＶＲは下線で示す。 ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の重鎖可変領域配列のアラインメントを示す。ＨＶＲを囲みで示す。ＹＷＯ.４９のＨＶＲ-Ｈ３の対応する残基と異なるＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６のＨＶＲ-Ｈ３の残基に陰影をつける。 ＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６の軽鎖可変領域配列のアラインメントを示す。ＨＶＲを囲みで示す。ＹＷＯ.４９のＨＶＲ-Ｌ３の対応する残基と異なるＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６のＨＶＲ-Ｌ３の残基に陰影をつける。 実施例Ａに記載のように、様々な組織におけるヒトのＴＡＴ２２６遺伝子発現のレベルを図で示す。 実施例Ａに記載のように、正常卵巣；正常卵管；明細胞性、粘液性及び漿液性の嚢胞腺癌サブタイプの卵巣癌；転移性卵巣癌；及び他のタイプの卵巣癌におけるヒトのＴＡＴ２２６遺伝子発現のレベルを図で示す。 実施例Ｄに記載のように、示した抗ＴＡＴ２２６抗体の存在下又は非存在下におけるＯＶＣＡＲ３細胞の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)の結果を示す。 実施例Ｆに記載のように、５'ヌクレアーゼ(ＴａｑＭａｎ(登録商標))アッセイ及びＯＶＣＡＲ３細胞と卵巣癌試料のパネルに対して行った免疫組織化学(ＩＨＣ)によって決定した、ＴＡＴ２２６ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を示す。 実施例Ｈに記載のように、ＯＶＣＡＲ３細胞殺傷アッセイにおける様々なＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６抗体-薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)のインビトロアッセイを示す。 実施例Ｈに記載のように、ＨＣＴ１１６＃９-４安定発現株を用いた細胞殺傷アッセイにおける様々なＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣのインビトロ活性を示す。 実施例Ｈに記載のように、マウス異種移植片を用いたＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣのインビボ活性を示す。 実施例Ｈに記載のように、ヒト患者腫瘍から得られるマウス異種移植片を用いたＹＷＯ.４９.Ｈ６ ＡＤＣのインビボ活性を示す。

Claims (106)

  1. (a) 配列番号：１１のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、(b) 以下、
    (1) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
    (2) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
    (3) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
    (4) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
    (5) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
    から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体。
  2. 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
  3. さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる、請求項２に記載の抗体。
  4. さらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる、請求項３に記載の抗体。
  5. 前記抗体が配列番号：６〜１０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
  6. 配列番号：１４〜１８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる、請求項５に記載の抗体。
  7. さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる、請求項６に記載の抗体。
  8. さらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる、請求項７に記載の抗体。
  9. ＨＶＲ-Ｈ３が配列番号：９のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１７のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  10. さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる、請求項９に記載の抗体。
  11. さらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる、請求項１０に記載の抗体。
  12. ＨＶＲ-Ｈ３が配列番号：１０のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ-Ｌ３が配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の抗体。
  13. さらに、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２とを含んでなる、請求項１２に記載の抗体。
  14. さらに、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２とを含んでなる、請求項１３に記載の抗体。
  15. さらに、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク及びＶＬサブグループIコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも１のフレームワークを含む、請求項１に記載の抗体。
  16. 配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、ＴＡＴ２２６に結合する抗体。
  17. さらに、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
  18. 配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
  19. さらに、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１８に記載の抗体。
  20. 重鎖可変ドメインが配列番号：２４のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：２９のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の抗体。
  21. 前記抗体が配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含んでなる、請求項１６に記載の抗体。
  22. さらに、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含んでなる、請求項２１に記載の抗体。
  23. 重鎖可変ドメインが配列番号：２５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号：３０のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の抗体。
  24. 請求項１６に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  26. 請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
  27. 宿主細胞が真核生物である、請求項２６に記載の宿主細胞。
  28. 宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２７に記載の宿主細胞。
  29. a) 抗体をコードするポリヌクレオチドの発現に適切な条件下で請求項２６に記載の宿主細胞を培養し、b) 抗体を単離することを含む、抗ＴＡＴ２２６抗体の作製方法。
  30. 細胞の表面上に発現されるＴＡＴ２２６に結合する抗体。
  31. 前記抗体が配列番号：７５のアミノ酸２１−１１５のＴＡＴ２２６の領域内のエピトープに結合する、請求項３０に記載の抗体。
  32. 前記細胞が癌細胞である、請求項３０に記載の抗体。
  33. 前記癌細胞が、卵巣癌細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞である、請求項３２に記載の抗体。
  34. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１、１６及び３０のいずれか一に記載の抗体。
  35. 前記抗体がＦａｂ、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は(Ｆａｂ')２の断片から選択される抗体断片である、請求項３４に記載の抗体。
  36. 前記抗体がヒト化である、請求項３４に記載の抗体。
  37. 前記抗体がヒトである、請求項３４に記載の抗体。
  38. 前記抗体がＹＷＯ.３２、ＹＷＯ.４９、ＹＷＯ.４９.Ｂ７、ＹＷＯ.４９.Ｃ９、ＹＷＯ.４９.Ｈ２及びＹＷＯ.４９.Ｈ６から選択される抗体と同じエピトープに結合する、請求項３４に記載の抗体。
  39. ＴＡＴ２２６への抗体の結合に許容される条件下で請求項１、１６及び３０のいずれか一に記載の抗体と生体試料を接触させ、抗体とＴＡＴ２２６との間に複合体が形成されるか否かを検出することを含む、生体試料においてＴＡＴ２２６の存在を検出する方法。
  40. 前記生体試料が、卵巣腫瘍細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ＴＡＴ２２６の発現の増加と関係する細胞増殖性疾患の診断方法であって、請求項１、１６又は３０に記載の抗体と試験細胞を接触させ、ＴＡＴ２２６への抗体の結合を検出することによって試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルを測定し、そして、試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルをコントロール細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルと比較することを含み、コントロール細胞と比べて試験細胞によるＴＡＴ２２６の発現レベルが高い場合にＴＡＴ２２６の発現の増加に関連する細胞増殖性疾患の存在が示される、方法。
  42. 前記試験細胞が細胞増殖性疾患があると疑われる患者からの細胞である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記細胞増殖性疾患が卵巣癌及びウィルムス腫瘍から選択される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記方法が、試験細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルを決定し、試験細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルをコントロール細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現レベルと比較することを含む、請求項４１に記載の方法。
  45. 細胞障害性剤に共有結合された請求項１、１６又は３０に記載のＴＡＴ２２６を結合する抗体を含んでなるイムノコンジュゲート。
  46. 前記細胞障害性剤が、毒素、化学療法剤、抗生物質、放射性同位体及び核酸分解酵素から選択される、請求項４５に記載のイムノコンジュゲート。
  47. (a) Ａｂが、1) 配列番号：１１のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、2) 以下、
    (i) 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１；
    (ii) 配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２；
    (iii) 配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１；
    (iv) 配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２；及び
    (v) 配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３
    から選択される少なくとも１、２、３、４又は５のＨＶＲとを含んでなるＴＡＴ２２６を結合する抗体であり、
    (b) Ｌはリンカーであり、
    (c) Ｄが式ＤＥ又はＤＦの薬剤であり、
    Figure 2009533019
    Figure 2009533019
    このとき、Ｒ２及びＲ６それぞれがメチルであり、Ｒ３及びＲ４それぞれがイソプロピルであり、Ｒ７がｓｅｃ-ブチルであり、それぞれのＲ８がＣＨ３、Ｏ−ＣＨ３、ＯＨ及びＨから別々に選択され、Ｒ９がＨであり、Ｒ１０がアリールであり、Ｚが−Ｏ−又は−ＮＨ−であり、Ｒ１１がＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、又は−(ＣＨ２)２−Ｏ−(ＣＨ２)２−Ｏ−(ＣＨ２)２−Ｏ−ＣＨ３であり、そして、Ｒ１８が−Ｃ(Ｒ８)２−Ｃ(Ｒ８)２−アリールであり、(d) ｐがおよそ１から８の範囲である、
    式 Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐを有するイムノコンジュゲート。
  48. 前記抗体が、配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  49. 前記抗体が、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項４８に記載のイムノコンジュゲート。
  50. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項４９に記載のイムノコンジュゲート。
  51. 前記抗体が、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項４８に記載のイムノコンジュゲート。
  52. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項５１に記載のイムノコンジュゲート。
  53. 前記抗体が、配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  54. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
  55. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項５４に記載のイムノコンジュゲート。
  56. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項５３に記載のイムノコンジュゲート。
  57. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項５６に記載のイムノコンジュゲート。
  58. インビトロ又はインビボでの細胞殺傷活性を有する、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  59. 前記リンカーが、抗体のチオール基を介して抗体に付着している、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  60. 前記リンカーがプロテアーゼによって切断可能である、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  61. 前記リンカーがｖａｌ-ｃｉｔジペプチドを含む、請求項６０に記載のイムノコンジュゲート。
  62. 前記リンカーがｐ-アミノベンジルユニットを含む、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  63. 前記リンカーが６-マレイミドカプロイルを含む、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  64. 前記薬剤がＭＭＡＥ及びＭＭＡＦから選択される、請求項４７に記載のイムノコンジュゲート。
  65. 前記薬剤がＭＭＡＥである、請求項６４に記載のイムノコンジュゲート。
  66. 前記薬剤がＭＭＡＦである、請求項６４に記載のイムノコンジュゲート。
  67. 前記リンカーがプロテアーゼによって切断可能である、請求項６４に記載のイムノコンジュゲート。
  68. 前記リンカーがｖａｌ-ｃｉｔジペプチドを含む、請求項６７に記載のイムノコンジュゲート。
  69. 前記リンカーがｐ-アミノベンジルユニットを含む、請求項６７に記載のイムノコンジュゲート。
  70. 前記ｐ-アミノベンジルユニットがｐ-アミノベンジルオキシカルボニル(ＰＡＢ)である、請求項６９に記載のイムノコンジュゲート。
  71. 前記リンカーが６-マレイミドカプロイルを含む、請求項６７に記載のイムノコンジュゲート。
  72. 前記イムノコンジュゲートが、式
    Figure 2009533019
    を有し、このときＳが硫黄原子であり、ｐが２から５の範囲である、請求項６５に記載のイムノコンジュゲート。
  73. 前記抗体が、配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる、請求項７２に記載のイムノコンジュゲート。
  74. 前記抗体が、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項７３に記載のイムノコンジュゲート。
  75. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項７４に記載のイムノコンジュゲート。
  76. 前記抗体が、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項７３に記載のイムノコンジュゲート。
  77. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項７６に記載のイムノコンジュゲート。
  78. 前記抗体が、配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項７２に記載のイムノコンジュゲート。
  79. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項７８に記載のイムノコンジュゲート。
  80. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項７９に記載のイムノコンジュゲート。
  81. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項７８に記載のイムノコンジュゲート。
  82. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項８１に記載のイムノコンジュゲート。
  83. 前記イムノコンジュゲートが、式
    Figure 2009533019
    を有し、このときＳが硫黄原子であり、ｐが２から５の範囲である、請求項６６に記載のイムノコンジュゲート。
  84. 前記抗体が、配列番号：１９のコンセンサス配列に一致するアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３を含んでなる、請求項８３に記載のイムノコンジュゲート。
  85. 前記抗体が、配列番号：９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と、配列番号：１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項８４に記載のイムノコンジュゲート。
  86. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ２と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項８５に記載のイムノコンジュゲート。
  87. 前記抗体が、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ３と配列番号：１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ３とを含んでなる、請求項８４に記載のイムノコンジュゲート。
  88. 前記抗体が、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ１と、配列番号：５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｈ2と、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ１と、配列番号：１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ-Ｌ２をさらに含んでなる、請求項８７に記載のイムノコンジュゲート。
  89. 前記抗体が、配列番号：２１〜２５から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２６〜３１から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項８３に記載のイムノコンジュゲート。
  90. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項８９に記載のイムノコンジュゲート。
  91. 前記抗体が、配列番号：２４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項９０に記載のイムノコンジュゲート。
  92. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項８９に記載のイムノコンジュゲート。
  93. 前記抗体が、配列番号：２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号：３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、請求項９２に記載のイムノコンジュゲート。
  94. 請求項４７、７５、７７、８０、８２、８６、８８、９１及び９３のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートと薬学的に許容される担体とを含有する薬剤的組成物。
  95. 請求項９４に記載の薬剤的組成物の有効量を個体に投与することを含む、細胞増殖性疾患の治療方法。
  96. 前記細胞増殖性疾患が卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍及びウィルムス腫瘍から選択される、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記細胞増殖性疾患が細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現の増加と関係している、請求項９５に記載の方法。
  98. ＴＡＴ２２６へのイムノコンジュゲートの結合に許容される条件下で、請求項４７、７５、７７、８０、８２、８６、８８、９１及び９３のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートに細胞を曝すことを含む、細胞増殖の阻害方法。
  99. 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記腫瘍細胞が卵巣腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、脳腫瘍細胞又はウィルムス腫瘍細胞である、請求項９９に記載の方法。
  101. 前記細胞が異種移植片である、請求項９９に記載の方法。
  102. インビトロで曝す、請求項９８に記載の方法。
  103. インビボで曝す、請求項９８に記載の方法。
  104. 細胞増殖性疾患の治療のための医薬の調製における、請求項４７、７５、７７、８０、８２、８６、８８、９１及び９３のいずれか一に記載のイムノコンジュゲートの使用。
  105. 前記細胞増殖性疾患が卵巣癌、子宮癌、脳腫瘍及びウィルムス腫瘍から選択される、請求項１０４に記載の使用。
  106. 前記細胞増殖性疾患が細胞の表面上のＴＡＴ２２６の発現の増加と関係している、請求項１０４に記載の使用。
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