JP2018510636A - 抗ｃｅａｃａｍ６抗体およびその使用 - Google Patents

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Abstract

抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体およびその使用本発明は、ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＥＡＣＡＭ６（がん胎児性抗原関連細胞接着分子６、ＣＤ６６ｃ、非特異的交差反応性抗原、ＮＣＡ、ＮＣＡ−５０／９０）に特異的であり、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない組換え抗原結合領域ならびに前記抗原結合領域を含む抗体および機能的断片を提供する。本発明はさらに、この種の抗体を作成する方法を提供する。したがって、抗体を使用して、ＣＥＡＣＡＭ６の発現に関連するがんならびに他の障害および状態を治療することができる。本発明はまた、前記抗体をコードする核酸配列、同配列を含むベクター、医薬組成物および使用説明書を含むキットを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＥＡＣＡＭ６（がん胎児性抗原関連細胞接着分子６、ＣＤ６６ｃ、非特異的交差反応性抗原、ＮＣＡ、ＮＣＡ−５０／９０）に特異的であり、そのため密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない組換え抗原結合領域ならびに前記抗原結合領域を含む抗体および機能的断片を提供する。本発明はさらに、この種の抗体を作成する方法を提供する。
したがって、抗体を使用して、ＣＥＡＣＡＭ６の発現に関連するがんならびに他の障害および状態を治療することができる。本発明はまた、前記抗体をコードする核酸配列、同配列を含むベクター、医薬組成物および使用説明書を含むキットを提供する。
抗体ベースの療法は、固形腫瘍を含む種々のがんの有効かつ臨床的に確立された治療である。例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は乳がん治療でうまく用いられており、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）はＢ細胞関連がんのタイプにおいて有効である。新規な成功した抗体ベースの療法の開発の中心は、対応する受容体の活性を機能的に修正することができる、標的細胞（例えば、がん細胞、免疫細胞等）上で優先的に発現されることが分かった細胞表面タンパク質に対する抗体の単離である。
免疫細胞活性化、したがってがんの免疫療法のための免疫チェックポイント分子の抗体遮断は、臨床的に有効なアプローチである。２０１１年、ＣＴＬＡ−４遮断抗体イピリムマブは、転移性黒色腫（Ｙｅｒｖｏｙ）の第二選択療法としてＦＤＡによって承認されている。別の例は、いくつかの薬物が承認されているまたは現在臨床開発中であり、黒色腫、ＲＣＣおよび肺がんにおいて印象的な臨床応答が報告されているＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の遮断である（Ｈｅｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１４ Ｄｅｃ；１８（１２）：１４０７−２０））。
がん胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーのタンパク質は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパー遺伝子ファミリーに属し、一般にＮドメインとして同定される可変（Ｖ）様ドメインを示す。Ｎドメインには、なしまたは最大６つの定常Ｃ２様Ｉｇドメイン（ＡまたはＢと呼ばれる）のいずれかが続く。これらの細胞外ドメインは、ホモおよびヘテロ親和性の細胞間接着分子として（Ｏｂｒｉｎｃｋ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ｏｃｔ；９（５）：６１６−２６）またはヒトおよびげっ歯類の病原体受容体として（Ｋｕｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；１８（５）：５６５−７１；Ｖｏｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（６）：ｅ３９９０８）のＣＥＡＣＡＭの機能性のために必要とされる。ＣＥＡＣＡＭ受容体は、二量体またはオリゴマーおよび膜における他のパートナーとの複数の会合体として会合し、結果として重要な機能を調節する。ヒト組織におけるそれらの発現に加えて、ＣＥＡＣＡＭ遺伝子ファミリーは、２７の他の哺乳動物種において高度に保存されており、マウス、ラット、ウシ、イヌ、カモノハシおよびオポッサムで最もよく記載されている（Ｋａｍｍｅｒｅｒ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ ４；８：１２）。ＣＥＡＣＡＭの最もよく特徴付けられた生物学的機能は、三次元組織構造の分化および形成、血管新生、アポトーシス、腫瘍抑制ならびに転移における役割を含む、ホモおよびヘテロ親和性相互作用を通した細胞−細胞接着の支持である。（Ｋｕｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；１８（５）：５６５−７１）。ファミリーメンバーについてのさらなる詳細は、他の概説に記載されている（Ｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｗａｇｅｎｅｒ，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４；（１６５）：２８３−３４１；Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；６（６）：４３３−４６）。
ＣＥＡＣＡＭ６（がん胎児性抗原関連細胞接着分子６、ＣＤ６６ｃ、非特異的交差反応性抗原、ＮＣＡ、ＮＣＡ−５０／９０）は、その数個が同定されている種々の膜受容体により細胞外ドメインを通してＣＥＡＣＡＭタンパク質のいくつかの可能なシスまたはトランス指向性相互作用を媒介する、１つのＮドメインおよび２つのＣ２様ドメインを有するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質である。（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ ａｎｄ Ａｒａｂｚａｄｅｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３ Ｄｅｃ；３２（３−４）：６４３−７１）。
ＣＥＡＣＡＭ６は、結腸（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｊａｎ ３；７：２．）、肺（Ｋｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｌ１０１９−Ｌ１０３０）および顆粒球（Ｋｕｒｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２ Ｊａｎ ３１；１８２（２）：５０１−６）などの種々の正常なヒト組織の上皮で発現している。顆粒球系列では、ＣＥＡＣＡＭ６は初期の系列決定前駆細胞を除いて顆粒球成熟の全段階で発現された（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０）；Ｓｃｈｏｌｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５６（２），５９５−６０５）。ＣＥＡＣＡＭ６はげっ歯類では発現しない。（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９ Ｎｏｖ １；２５２（２）：２４３−９）。
いくつかのがんについてＣＥＡＣＡＭ６発現が記載されている。結腸がんでは、ＣＥＡＣＡＭ６は症例の５５％で上方制御され、患者を低リスク群および高リスク群に細分することを可能にする独立した予後因子である（Ｊａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３ Ｏｃｔ １；２１（１９）：３６３８−４６）。膵臓腺がんでは、分析された標本の９２％（ｎ＝８２）は陽性であることが分かったが、ＣＥＡＣＡＭ６発現は低悪性度ＰａｎＩＮ病変よりも高悪性度で優勢であった（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ．２００５ Ｍａｒ；２４１（３）：４９１−６）。これは、浸潤性膵臓腺がんの９０％超（試験した１１５のうち１１０）がＣＥＡＣＡＭ６の強い（過剰）発現を示した別の研究で確認された（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０）。さらに、Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌらは、乳腺腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣腺がん、肺腺がん、リンパ節転移ならびに乳腺腫瘍、結腸腫瘍および肺腫瘍由来の転移におけるＣＥＡＣＡＭ６発現を報告した。（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｊａｎ ３；７：２）。
乳がんにおけるＣＥＡＣＡＭ６発現は、他の者によっても報告された（Ｍａｒａｑａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｊａｎ １５；１４（２）：４０５−１１；Ｐｏｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｕｇ １；１２（１５）：４７７３−８３；Ｂａｌｋ−Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１４ Ａｐｒ；１８４（４）：１１９８−２０８）；Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２０１３ Ｎｏｖ；１４２（２）：３１１−２２）。さらに、ＣＥＡＣＡＭ６発現は、多発性骨髄腫（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）、胃がん（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｒｅｓ．２０１４ Ｓｅｐ ２６；１３（３）：７６８６−９７）および頭頸部がん（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｓｅｐ ２８；１１：７４）で報告されている。
実験的証拠が、転移の重要な調節因子としてのＣＥＡＣＡＭ６の役割を支持している。Ｋｉｍらは、ＣＥＡＣＡＭ６特異的ｓｉＲＮＡを用いてＬｏＶｏ細胞におけるＣＥＡＣＡＭ６発現を減弱する、またはＨＣＴ１１６細胞におけるその発現を増加させることにより、それぞれ、細胞外マトリックスを介した浸潤が妨げられるまたは増強されることを示した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２０１３ Ｊａｎ １６；４１５：１２−９）。ＣＥＡＣＡＭ６発現の抑制は、Ｅ−カドヘリンプロモーター活性の上昇をもたらす。Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌらは、ＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６が、インビボでモノクローナル抗体によって遮断され得るＣＲＣ転移性播種に寄与することを示した。（Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｊａｎ ３；７：２）。また、ＣＥＡＣＡＭ６は、増殖、クローン化能、ならびにインビボ腫瘍形成能がそのサイレンシングで有意に妨げられている幹細胞に富む結腸球を形成することができる結腸がん試料においてＣＤ１３３陽性細胞で発現することが示されている（Ｇｅｍｅｉ ｅｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０１３ Ｆｅｂ １５；１１９（４）：７２９−３８）。乳がんでは、タモキシフェン耐性試料はＣＥＡＣＡＭ６過剰発現をしており、ＣＥＡＣＡＭ６は疾患の再発の重要な予測因子であることが示された（Ｍａｒａｑａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｊａｎ １５；１４（２）：４０５−１１）。ＭＭＵ１−タモキシフェン耐性ＭＣＦ７細胞誘導体におけるｓｉＲＮＡ媒介性ＣＥＡＣＡＭ６サイレンシングは、内分泌耐性、これらの細胞の足場非依存性および侵襲性を逆転させた（Ｌｅｗｉｓ−Ｗａｍｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００８ Ａｕｇ；４４（１２）：１７７０−９）。肺腺がんでは、ＣＥＡＣＡＭ６発現が有害臨床成績と有意に関連していた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｎｏｖ ６；１０７（１０）：１７４５−５３）。膵臓がんでは、ｓｉＲＮＡによるＣＥＡＣＡＭ６サイレンシングが、Ｍｉａ（ＡＲ）膵臓腫瘍細胞の獲得したアノイキス耐性を逆転させた。Ｃａｐａｎ２膵臓がん細胞におけるＣＥＡＣＡＭ６の過剰発現はゲムシタビン耐性を増大させたが、ＢｘＰＣ３細胞におけるＣＥＡＣＡＭ６発現のｓｉＲＮＡ媒介性抑制はＳｒｃ依存的様式でＡＫＴ活性を調節することによってそれらを薬剤に化学増感受した（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ １；６４（１１）：３９８７−９３）。これらの効果は、ｃ−ｓｒｃ活性およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ９）発現を示す高ＣＥＡＣＡＭ６発現細胞の侵襲性増加に対応していた（Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｏｃｔ ４；９１（７）：１３８４−９０）。
腫瘍関連抗原に対するＴ細胞応答は、多くの腫瘍で記載されており（Ｂｅｃｋｈｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ Ｊｕｌ；１１４（１）：６７−７６；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ Ｍａｒ １；１０５（５）：２１３２−４；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｕｇ １５；６６（１６）：８２５８−６５；Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｎｏｖ １；６５（２１）：１００７９−８７．；Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ａｐｒ ２５；９７（９）：４７６０−５；Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９２：１８７−２２４）、しばしばリンパ器官または血液中での腫瘍特異的メモリーＴ細胞の蓄積を引き起こす（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ Ｍａｒ １；１０５（５）：２１３２−４；Ｆｅｕｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１ Ａｐｒ；７（４）：４５２−８；Ｌｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；６３（１７）：５５８２−６）。しかしながら、Ｔ細胞が自己腫瘍細胞に対して反応する能力は一般的に低い（Ｈｏｒｎａ ａｎｄ Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００７ Ｆｅｂ；７（１）：４１−５３）；Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｅ，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；９２：１３−２７）。多くの腫瘍は、腫瘍免疫療法の限られた活性に寄与するＴ細胞のエフェクター機能を遮断する能力を有する。腫瘍細胞に対するＴ細胞の無応答性は、幅広いがんについて実証されている（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；１３（１２）：１１２９−３２）。
ＣＥＡＣＡＭ６はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の調節にも寄与する。近年、Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇらは、いくつかのＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーを発現している多発性骨髄腫において、抗ＣＥＡＣＡＭ６ ｍＡｂまたはｓｉＲＮＡサイレンシングＣＥＡＣＡＭ６による治療が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答調節でＣＥＡＣＡＭ６の役割を示す悪性形質細胞に対するＴ細胞反応性を回復させることを証明した（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）。これまでのところ、Ｔ細胞上のＣＥＡＣＡＭ６の受容体は同定されていない。しかしながら、ＣＥＡＣＡＭ６陽性骨髄腫細胞とＴ細胞の共培養は、ＣＥＡＣＡＭ６連結によるＳＨＰホスファターゼの活性化を含むＴ細胞シグナル伝達事象の調節をもたらした（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００１ Ｊａｎ；１１４（Ｐｔ ２）：２４３−４；Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｕｇ；１７（８）：４４３４−４１；Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ １；１８５（１１）：６４１３−９）。ＣＥＡＣＡＭ６は固有のシグナル伝達能力を有さず、その阻害能力はＴ細胞表面上の受容体への結合によっておそらく媒介される。このような受容体は、例えば、自然および適応免疫応答の調節の機構が記載されているＣＥＡＣＡＭ１であり得る。ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）は、免疫受容体抑制性チロシン（ＩＴＩＭ）モチーフを含む細胞質尾部を有する。ＣＥＡＣＡＭ１は細胞内小胞に貯蔵され、Ｔ細胞活性化で、迅速に（２４時間〜７２時間）外在化され、Ｔ細胞表面上で発現され、そこで標的細胞上で発現しているリガンドへのホモまたはヘテロ親和性結合後にＴ細胞エフェクター機能の遮断を媒介する（Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；６（６）：４３３−４６）。この結合の性質は未知であり、他のＣＥＡＣＡＭへのホモもしくはヘテロ親和性結合、または細胞外マトリックス、成長因子受容体、インテグリンもしくはカドヘリンの他の成分への結合であり得るだろう。ＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ１との間でホモ親和性相互作用が報告されている（Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊｕｎ；１１（６）：１３００−１０）。ヘテロ親和性ＣＥＡＣＡＭ相互作用は、例えばＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５、およびＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ８の間で記載されている（Ｃａｖａｌｌａｒｏ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｆｅｂ；４（２）：１１８−３２）。
上記のように、ＣＥＡＣＡＭ６は、がん免疫療法における治療介入のための非常に魅力的な標的である。注記されるように、ＣＥＡＣＡＭ６は、高度に相同なタンパク質ファミリーのメンバーである。そのため、ＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制を軽減するヒト療法に適した抗体は、それぞれ異なる機能および組織分布を示すＣＥＡＣＡＭ６と他のパラロガスなタンパク質、例えばＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ５を区別して、ＣＥＡＣＡＭ６への作用および局在化の様式を制限し、望ましくない有害な副作用を回避することができなければならない。
ＣＥＡＣＡＭ６は腫瘍細胞上だけでなく正常組織（特に顆粒球であるが、例えば肺および胃腸細胞の上皮細胞も−Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｎｅｒｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｊｕｎ；９（６）：７７５−８５；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０）上でも発現するので、治療用抗体の有害な副作用プロファイルを予測することができることが絶対に重要である。予期される作用様式は、免疫抑制の阻害、すなわち重篤な害をもたらすおそれのある免疫活性化であるので、これは一層重要である（ＣＤ２８スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２試験の出来事；Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００６ Ｓｅｐ ７；３５５（１０）：１０１８−２８）。そのため、顆粒球に対する直接的な効果の上にある免疫系に対する間接的な効果を慎重に評価する必要がある。ヒト治療用抗体および予測的前臨床耐容性試験の開発を可能にするためには、抗体が毒物学的に関連する種、ＣＥＡＣＡＭ６の場合にはヒト以外の霊長類、好ましくはカニクイザルに対する関連交差反応性を示すことが必須である。
前提条件として、治療用抗体は、細胞上のヒトＣＥＡＣＡＭ６に高親和性で結合し、（パラログに結合することなく）ＣＥＡＣＡＭ６に選択的に結合し、一桁以内の一価ＫＤでサルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性であり（非結合活性系結合条件下で低い表面密度でさえ毒物学サルモデルにおいて正常組織上への結合を安全に反映する）、ヒトＣＥＡＣＡＭ６と類似のエピトープに結合し、ＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができ、ヒト療法（すなわち、ヒトまたはヒト化抗体）において非免疫原性であり、医薬として長期間にわたって臨床開発、製剤化および保存を可能にするのに十分安定である必要がある。後者は、物理的分解（特に凝集）が治療用タンパク質に対する免疫応答を高めるおそれがあり（Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ；２１（６）：８９７−９０３）、凝集がＩｇＧの展開およびその熱安定性に密接に関連する（Ｖｅｒｍｅｅｒ ａｎｄ Ｎｏｒｄｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０００ Ｊａｎ；７８（１）：３９４−４０４）ことが前に注目されているので重要である。
いくつかの抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体が存在する。それらのほとんどは非ヒト試薬抗体であり、その多くはポリクローナルである。ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する特異性および選択性、ならびにサルＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性は、症例のほとんどで開示されていないまたは知られていない。
ＣＥＡＣＡＭ６に対する治療用抗体も当技術分野で公知である。ヒトＣＥＡＣＡＭ６に選択的でないものもある（例えば、ＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓのＭＮ−３、ＮｅｏｇｅｎｉｘのＮｅｏ２０１／ｈ１６Ｃ３；共にさらにヒトＣＥＡＣＡＭ５に結合）。単一ドメイン抗体２Ａ３およびその融合変異体（国際公開第２０１２０４０８２４号パンフレットおよびＮｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ １０；１６１（１）：１８−２４）は、サルＣＥＡＣＡＭ６に対する選択性および交差反応性に関して特徴付けられていない。
サルＣＥＡＣＡＭ６に対して明らかに交差反応性の選択的抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体は開示されていない（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０）。
マウス抗体９Ａ６（Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）は、ＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制活性を調節することができると記載された唯一の抗体である（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）。９Ａ６はＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制活性を阻害し、インビトロでのＴ細胞によるサイトカイン分泌の増強およびインビボでの抗腫瘍活性をもたらす（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ６１，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ２２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｃｔｏｂｅｒ ６−８，２０１４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）。その選択性は適切であるように思われるが、９Ａ６は以前はサルＣＥＡＣＡＭ６に対するその交差反応性に関して特徴付けられていなかった。さらに、そのマウス性質は、ヒトにおける直接の治療適用を妨げる。
実施例に示されるように、抗体９Ａ６は組換えヒトＣＥＡＣＡＭ６に結合するが、組換えアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）ＣＥＡＣＡＭ６に対する結合もカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する結合も検出されなかった。比較のために、Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１も試験した。この抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６とサルＣＥＡＣＡＭ６の両方に対する高親和性結合を示した。しかし、Ｎｅｏ２０１は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびＣＥＡＣＡＭ６に結合するので、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的ではない。
結論として、以下の特徴を含む治療用モノクローナル抗体が非常に必要とされている：
ｉ． 抗体はヒトＣＥＡＣＡＭ６の高親和性バインダーである。
ｉｉ． 抗体はＣＥＡＣＡＭ６に対して選択的であり、パラログ、特にＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５には結合しない。
ｉｉｉ． 抗体は、一桁以内の一価ＫＤでサルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性である。
ｉｖ． 抗体はヒト療法において非免疫原性である、すなわち、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。
ｖ． 抗体は、ＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができる。
このような抗体は、先行技術には存在しない。ヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１に結合する９Ａ６は、ＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができる唯一の公知の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体であるが、マウス抗体は別にしてサルＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性を欠いている。Ｎｅｏ２０１は、ＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１の外側の異なるドメインに結合する。Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１の治療効果は、ＡＤＣＣに基づくことが公開されている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１１ Ａｐｒ ２−６；Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ：Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ａｐｒｉｌ １５，２０１１；７１（８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：４５８２）。
国際公開第２０１２０４０８２４号
Ｈｅｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｔｈｅｒ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１４ Ｄｅｃ；１８（１２）：１４０７−２０ Ｏｂｒｉｎｃｋ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ｏｃｔ；９（５）：６１６−２６ Ｋｕｅｓｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ｏｃｔ；１８（５）：５６５−７１ Ｖｏｇｅｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２；７（６）：ｅ３９９０８ Ｋａｍｍｅｒｅｒ ａｎｄ Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＢＭＣ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｆｅｂ ４；８：１２ Ｈｏｒｓｔ ａｎｄ Ｗａｇｅｎｅｒ，Ｈａｎｄｂ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４；（１６５）：２８３−３４１ Ｇｒａｙ−Ｏｗｅｎ ａｎｄ Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６ Ｊｕｎ；６（６）：４３３−４６ Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ ａｎｄ Ａｒａｂｚａｄｅｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３ Ｄｅｃ；３２（３−４）：６４３−７１ Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，２００７，Ｊａｎ ３；７：２． Ｋｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９６：Ｌ１０１９−Ｌ１０３０ Ｋｕｒｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１９９２ Ｊａｎ ３１；１８２（２）：５０１−６ Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０） Ｓｃｈｏｌｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５６（２），５９５−６０５ Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９ Ｎｏｖ １；２５２（２）：２４３−９ Ｊａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００３ Ｏｃｔ １；２１（１９）：３６３８−４６ Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｓｕｒｇ．２００５ Ｍａｒ；２４１（３）：４９１−６ Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ．２００７ Ｊａｎ ３；７：２ Ｍａｒａｑａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８ Ｊａｎ １５；１４（２）：４０５−１１ Ｐｏｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｕｇ １；１２（１５）：４７７３−８３ Ｂａｌｋ−Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２０１４ Ａｐｒ；１８４（４）：１１９８−２０８ Ｔｓａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２０１３ Ｎｏｖ；１４２（２）：３１１−２２ Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３ Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｒｅｓ．２０１４ Ｓｅｐ ２６；１３（３）：７６８６−９７ Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｓｅｐ ２８；１１：７４ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．２０１３ Ｊａｎ １６；４１５：１２−９ Ｇｅｍｅｉ ｅｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０１３ Ｆｅｂ １５；１１９（４）：７２９−３８ Ｌｅｗｉｓ−Ｗａｍｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００８ Ａｕｇ；４４（１２）：１７７０−９ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２０１２ Ｎｏｖ ６；１０７（１０）：１７４５−５３ Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ １；６４（１１）：３９８７−９３ Ｄｕｘｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｏｃｔ ４；９１（７）：１３８４−９０ Ｂｅｃｋｈｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００４ Ｊｕｌ；１１４（１）：６７−７６ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００５ Ｍａｒ １；１０５（５）：２１３２−４ Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６ Ａｕｇ １５；６６（１６）：８２５８−６５ Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｗｉｎｎｅｎｔｈａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｎｏｖ １；６５（２１）：１００７９−８７ Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ａｐｒ ２５；９７（９）：４７６０−５ Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；９２：１８７−２２４ Ｆｅｕｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１ Ａｐｒ；７（４）：４５２−８ Ｌｅｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；６３（１７）：５５８２−６ Ｈｏｒｎａ ａｎｄ Ｓｏｔｏｍａｙｏｒ，Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２００７ Ｆｅｂ；７（１）：４１−５３） Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｃａｒｂｏｎｅ，Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４；９２：１３−２７ Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｄｅｃ；１３（１２）：１１２９−３２ Ｌｉｎ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２００１ Ｊａｎ；１１４（Ｐｔ ２）：２４３−４ Ｌａｔｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９７ Ａｕｇ；１７（８）：４４３４−４１ Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０ Ｄｅｃ １；１８５（１１）：６４１３−９ Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊｕｎ；１１（６）：１３００−１０ Ｃａｖａｌｌａｒｏ ａｎｄ Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ．２００４ Ｆｅｂ；４（２）：１１８−３２ Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｎｅｒｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｊｕｎ；９（６）：７７５−８５； Ｓｕｎｔｈａｒａｌｉｎｇａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００６ Ｓｅｐ ７；３５５（１０）：１０１８−２８ Ｈｅｒｍｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２００４ Ｊｕｎ；２１（６）：８９７−９０３ Ｖｅｒｍｅｅｒ ａｎｄ Ｎｏｒｄｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ．２０００ Ｊａｎ；７８（１）：３９４−４０４ Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ １０；１６１（１）：１８−２４ Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ６１，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ２２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｃｔｏｂｅｒ ６−８，２０１４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １０２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；２０１１ Ａｐｒ ２−６； Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（ＰＡ）：ＡＡＣＲ：Ｄｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ａｐｒｉｌ １５，２０１１；７１（８ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：４５８２
本発明者らは、ＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制の緩和がＮ末端ドメイン１への結合に関連すると仮定した。しかし、ＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１に結合する抗体の作成は、困難な選択性の課題をもたらす。
図１の配列アライメントは、細胞外領域全体にわたるヒトＣＥＡＣＡＭ６およびヒトＣＥＡＣＡＭ３、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ１のタンパク質配列の非常に高度な類似性を示している。標的領域（ヒトＣＥＡＣＡＭ６のドメイン１）は、他のＣＥＡＣＡＭと特に類似しており、これは表７にも反映されている。ヒトＣＥＡＣＡＭ６のパラログ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５）は、カニクイザルのオルソログよりもヒトＣＥＡＣＡＭ６にはるかに類似している。実際、一次配列のＮ末端領域には、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６では同一であるが、他のヒトパラログのアミノ酸とは異なる位置が２つしかない（図１中でアスタリスクで示される）。
予想外に、本発明者らは、所望の選択性および機能的特徴の全てを含む抗体を作成する方法を見出すことができた。
本発明は、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に対する高い親和性を示し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体に関する。これは、抗体またはその抗原結合抗体断片またはその変異体がＣＥＡＣＡＭ６に対して選択的であることを意味する。提供される抗体は、これらのタンパク質の中で高度に保存されているＮ末端ドメイン１に結合する。
本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体は、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−α分泌の増加を特徴とするより細胞傷害性および／または活性化された表現型に向けて腫瘍特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルをインビトロで変化させることができる。そのため、本発明の抗体は、ＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を軽減し、最終的にインビボで抗腫瘍効果をもたらす免疫活性化を誘導することができる。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、先天性免疫応答および適応免疫応答を調節する機構であり得るＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を妨害する。
したがって、本発明の抗体は、がんならびにその転移、特に結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膵臓がん、胃がん、乳がんおよび多発性骨髄腫などのＣＥＡＣＡＭ６発現腫瘍の治療に適している。
本発明は、一桁以内の一価ＫＤでヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に結合する（非結合活性系結合条件下で低い表面密度でさえ毒物学サルモデルにおいて正常組織上への結合を安全に反映する）ことができ、密接に関連するパラログＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しないという点で、既存の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体と区別される抗体を記載している。そのため、これらの抗体は、安全性プロファイルを評価するためのカニクイザルにおける前臨床毒物学的試験に適している。ＣＥＡＣＡＭ６は腫瘍細胞上だけでなく正常組織（特に顆粒球であるが、例えば肺および胃腸細胞の上皮細胞も−Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｓｔａｎｎｅｒｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｊｕｎ；９（６）：７７５−８５；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００９ Ｊｕｌ；２１８（３）：３８０−９０）上でも発現するので、治療用抗体の有害な副作用プロファイルを予測することができることが絶対に重要である。予期される作用様式は、免疫抑制の阻害、すなわち重篤な害をもたらすおそれのある免疫活性化であるので（ＣＤ２８スーパーアゴニストＴＧＮ１４１２試験の出来事）、これは一層重要であり、そのため、顆粒球に対する直接的な効果の上の免疫系に対する間接的な効果を慎重に評価する必要がある。
本発明の非常に好ましい抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を、その構造的特徴により特徴付けられる表１に示す。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含む。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個、２個、３個、４個、５個、８個、１０個、１５個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む。
本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体は、公知の医薬品と同時投与されてもよく、いくつかの例では、抗体自体が修飾されてもよい。例えば、抗体を、細胞傷害剤、免疫毒素、担毒体または放射性同位体に結合して、効力を潜在的にさらに増加させることができるだろう。
本発明はさらに、ＣＥＡＣＡＭ６発現が正常組織と比較して上昇している悪性または異形成状態を診断するためのツールを構成する抗体を提供する。検出可能なマーカーに結合した抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射標識、酵素、発色団または発蛍光団である。
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体またはその抗原結合断片を発現する細胞、本発明の抗体またはその抗原結合断片を作成する方法、本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて異形成細胞の増殖を阻害する方法、ならびに本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いてがんを治療および検出する方法に関する。
本発明はまた、各々がＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに特異的な上記抗体またはその抗原結合断片をコードし得る単離された核酸配列に関する。本発明の核酸は、抗体または抗原結合抗体断片の組換え作成に適している。したがって、本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
本発明の組成物は、治療用途または予防用途に使用することができる。そのため、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片と、そのための薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を含む。関連する態様では、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ６発現細胞の望ましくない存在に関連する障害または状態を治療する方法を提供する。好ましい実施形態では、前記障害ががんである。このような方法は、有効量の本明細書中に記載または企図される本発明の抗体を含む医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
さらに、本発明は、この種の抗体を作成する方法に関する。本発明は、抗体ライブラリーを使用してＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合するこのようなライブラリーの１つまたは複数のメンバーを単離するための説明書を提供する。さらに、本発明は、ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性である抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を産生するようにマウスを免疫化するための説明書を提供する。ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合するマウス抗体のヒト化のための説明書も、本発明によって提供される。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６パラログならびにカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ６オルソログの細胞外領域のタンパク質配列アラインメントを示す図である。数字は、シグナルペプチド配列の除去後のアミノ酸位置を示す。一次配列のＮ末端領域中のヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６では同一であるが、他のヒトパラログ中のこの位置のアミノ酸とは異なる位置をアスタリスクで示す。Ｎ末端ドメイン１を囲んでいる。 ＴＰＰ−２９７１の可変ドメインＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列を示す図である。ヒトフレームワークに移植された配列を、下線付き太字として強調表示している。Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲをイタリック文字で記している。灰色の影付き文字は、ＴＰＰ−２９７１と比較したＴＰＰ−３１８７からの配列の相違を表す。 ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３７１４の可変ドメインＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列を示す図である。ＴＰＰ−２９７１のマウスＣＤＲに由来する配列を、下線付き太字として強調表示している。Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲをイタリック文字で記している。抗体ＴＰＰ−３３１０とＴＰＰ−３７１４は、下線付き非太字として強調されたＶＨフレームワーク内の２個のアミノ酸が異なる。 ＴＰＰ−３８２０およびＴＰＰ−３８２１の可変ドメインＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列を示す図である。ＴＰＰ−３１８７のマウスＣＤＲに由来する配列を、下線付き太字として強調表示している。Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲをイタリック文字で記している。抗体ＴＰＰ−３８２０とＴＰＰ−３８２１は、下線付き非太字として強調されたＶＨフレームワーク内の２個のアミノ酸が異なる。 サバイビンペプチド特異的Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌およびこの分泌の程度に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体のインビトロ薬理学的効果を示す図である。Ａ＋Ｂ．サバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞およびＫＳ腫瘍細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。１００００個のＫＳ腫瘍細胞を２５００個のＳｕｒｖｉｖｉｎ ＴＣと共に２０時間共培養した。共培養における抗体濃度は３０μｇ／ｍｌであった。Ｃ．サバイビン−ペプチド特異的ＴＣおよびＫＳ腫瘍細胞のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡアッセイ。１００００個のＫＳ腫瘍細胞を２００００個のＳｕｒｖｉｖｉｎ ＴＣと共に２０時間共培養した。共培養における抗体濃度は３０μｇ／ｍｌであった。Ｘ軸は試験した異なる条件を示す：Ａ中：１＝１００００個ＫＳ細胞；２＝２５００個Ｔ細胞；３＝抗体処理なし；４＝アイソタイプ適合抗体対照；５＝ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）６＝ＴＰＰ−３３２３；Ｂ中：１＝１００００個ＫＳ細胞；２＝２５００個Ｔ細胞；３＝抗体処理なし；４＝アイソタイプ適合抗体対照；５＝ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）６＝ＴＰＰ−３３１０；７＝ＴＰＰ−３７０７；Ｃ中：１＝１００００個ＫＳ細胞；２＝２００００個Ｔ細胞；３＝抗体処理なし；４＝アイソタイプ適合抗体対照；５＝ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）６＝ＴＰＰ−３３１０；７＝ＴＰＰ−３７０７；Ｙ軸は１ウェル当たりのＩＦＮ−γスポットカウント（ＡおよびＢ）またはＩＦＮ−ガンマ濃度（ｐｇ／ｍｌ）（Ｃ）に相当する。アスタリスクは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、対応のない、両側検定による統計的に有意な結果を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。 サバイビンペプチド特異的Ｔ細胞のサイトカイン分泌（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α）に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体のインビトロ薬理学的効果を示す図である。Ａ．ＩＦＮ−γ Ｌｕｍｉｎｅｘ分析。Ｂ．ＩＬ−２ Ｌｕｍｉｎｅｘ分析。Ｃ．ＴＮＦａ Ｌｕｍｉｎｅｘ分析。サバイビン−ペプチド特異的ＴＣおよびＫＳ腫瘍細胞のＬｕｍｉｎｅｘサイトカイン分析。１００００個のＫＳ腫瘍細胞を２００００個のＳｕｒｖｉｖｉｎ ＴＣと共に２０時間共培養した。共培養における抗体濃度は３０μｇ／ｍｌであった。Ｘ軸は試験した異なる条件を示す：１＝１００００個のＫＳ細胞；２＝２００００個のＴ細胞；３＝抗体処理なし；４＝アイソタイプ適合抗体対照；５＝ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）６＝ＴＰＰ−３３１０；７＝ＴＰＰ−３７０７；Ｙ軸はサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）に相当する。 インビボでの腫瘍増殖に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の効果を示す図である。２×１０６個のＫＳ乳がん細胞を皮下接種した。２３日目および２７日目に、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（サバイビン−ペプチド特異的）を静脈内注射した。２００μｇの抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体または適合アイソタイプ対照を、２２日目、２４日目、２６日目および２８日目に腹腔内投与した。２〜３日毎に腫瘍増殖を評価した。エラーバーはＳＥＭを表す。Ｙ軸＝腫瘍表面（ｍｍ２）；Ｘ軸＝日；ＴＣ＝サバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞。１＝ＰＢＳ処理；２＝Ｔ細胞およびアイソタイプ適合抗体対照による処理；３＝Ｔ細胞およびＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）による処理；４＝Ｔ細胞およびＴＰＰ−３３１０による処理；５＝Ｔ細胞およびＴＰＰ−３７０７による処理。 本発明の好ましい抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体のアノテーション配列を示す図である。ＩｇＧの重鎖および軽鎖ならびに選択された抗体のＶＨおよびＶＬ領域についてのタンパク質およびＤＮＡ配列が提供される。配列の下に重要な領域がアノテーションされている（全長ＩｇＧのＶＨおよびＶＬ領域ならびにＣＤＲ領域（Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３））。 ＦａｂフラグメントＡＰＰ−１５７４に結合したヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１７９４、白色）の単一Ｎ末端ドメイン１の漫画描写（重鎖および軽鎖はそれぞれ暗灰色および薄灰色に着色している）を示す図である。 図９に示されるタンパク質界面の詳細を示す図である。選択された残基は棒描写で描かれ、図９のように着色されている。番号付けはＴＰＰ−１７９４（配列番号１６９）に対応している。 サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を用いるｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを示す図である。
Ａ．２００００個のＫＳ乳がん腫瘍細胞を２００００個のサバイビン特異的Ｔ細胞と共培養した。Ｂ．４００００個のＨＣＴ−１１６−ｈＣ６腫瘍細胞を２００００個のサバイビン特異的Ｔ細胞と共培養した。細胞傷害性を約１００時間監視した。抗体を最終濃度３０μｇ／ｍｌで使用した：＃１、Ｔ細胞添加の時点；＃２、腫瘍細胞のみ；＃３、抗体なし；＃４、アイソタイプ適合抗体対照；＃５、ヒトＩｇＧ２としての抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ；＃６、ヒトＩｇＧ２としてのＴＰＰ−３４７０ ９Ａ６ Ａｂ；＃７ ＴＰＰ−３３１０ ｈＩｇＧ２。アスタリスクは、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、対応のない、両側検定による統計的に有意な結果を示す。Ｘ、ｘ軸、時間（時間）；Ｙ、Ｙ軸、正規化セルインデックス。
膵臓がん（ＴＩＬ−１２）の患者由来Ｔ細胞を用いたｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ細胞傷害性アッセイを示す図である。
ＡおよびＢ：１００００個のＨＣＣ２９３５腫瘍細胞を５００００の膵臓がん浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ−１２）と共培養した。細胞傷害性を約１５０時間監視した。抗ＣＤ３×ＥｐＣＡＭ二重特異性ｍＡｂ（０．２５ｎｇ／ｍｌ）を共培養で添加して、ＨＬＡと独立した腫瘍細胞に対してＴ細胞を向けた。
Ａ：＃１、Ｔ細胞添加；＃２腫瘍細胞のみ；＃３、抗体なし；＃４、アイソタイプ適合抗体対照；＃５、ヒトＩｇＧ２としての抗ＰＤ−Ｌ１ Ａｂ；＃６、ＴＰＰ−３４７０；＃７ ＴＰＰ−３３１０；抗体は３０μｇ／ｍｌで使用した。
Ｂ：ＴＰＰ−３３１０媒介効果の濃度依存性：＃１、Ｔ細胞添加；＃２、腫瘍細胞のみ；＃３、０．０７μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃４、０．０２μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃５、５０μｇ／ｍｌのアイソタイプ適合抗体対照；＃６、０．０２１μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃７、０．０６２μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃８、１．８５μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃９、５．５μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃１０、１６．６７μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；＃１１、５０μｇ／ｍｌのＴＰＰ−３３１０；
Ｘ−ｘ軸、時間（時間）；Ｙ、Ｙ軸、正規化セルインデックス。
本発明は、ＣＥＡＣＡＭ６に対する特異的親和性を有し、対象に治療上の利益をもたらすことができる新規な抗体の発見に基づく。ヒト、ヒト化またはキメラであり得る本発明の抗体は、本明細書により完全に記載される多くの状況で使用することができる。
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。しかしながら、以下の参考文献は、本発明が関連する当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を提供することができ、このような定義が当分野で一般的に理解される意味と一致する限り参照および使用され得る。このような参考文献には、それだけに限らないが、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）；Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）；およびＬａｃｋｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９９）；およびＣｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ａｂｂａｓ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ ａｎｄ Ｐｏｂｅｒ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙが含まれる。当技術分野において一般的に理解される意味を有する本明細書で使用される用語の定義を提供する、当業者に入手可能な任意の追加の技術的資源を調べることができる。本発明の目的のために、以下の用語をさらに定義する。さらなる用語は、明細書のどこかで定義される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数指示対象を含む。したがって、例えば、「遺伝子」への言及は、１つまたは複数の遺伝子への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含む。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語を、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマーおよび非天然アミノ酸ポリマーに適用する。特に指示しない限り、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾された変異体を暗に包含する。
アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている３文字記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される１文字記号によって呼ばれ得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードによって呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＥＡＣＡＭ６」は、「ＣＤ６６ｃ」（分化抗原群６６ｃ）、または非特異的交差反応性抗原、またはＮＣＡ、またはＮＣＡ−５０／９０としても知られている「がん胎児性抗原関連細胞接着分子６」を示す。ＣＥＡＣＡＭ６は、細胞−細胞接着に関与するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面タンパク質である。ＣＥＡＣＡＭ６は、結腸がん、膵臓がん、乳がんおよび肺がんなどの種々の腫瘍細胞の表面上で高度に発現される。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６の基準配列は、シグナルペプチド（位置１〜３４）およびプロペチド（ｐｒｏｐｅｔｉｄｅ）鎖（位置３２１〜３４４）を含む受託番号Ｐ４０１９９．３（配列番号１７９＝ＴＰＰ−４６３９）でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから入手可能である。一塩基多型が位置２３９で観察されている（ＧからＶへの交換）。ヒトＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインは、配列番号１７９の３５〜３２０位のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６（配列番号１７９）
ＭＧＰＰＳＡＰＰＣＲＬＨＶＰＷＫＥＶＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＫＬＴＩＥＳＴＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＡＨＮＬＰＱＮＲＩＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＳＬＩＶＧＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＹＳＧＲＥＴＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＶＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＧＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＭＴＬＴＬＬＳＶＫＲＮＤＡＧＳＹＥＣＥＩＱＮＰＡＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＮＶＬＹＧＰＤＧＰＴＩＳＰＳＫＡＮＹＲＰＧＥＮＬＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＦＩＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＭＣＱＡＨＮＳＡＴＧＬＮＲＴＴＶＴＭＩＴＶＳＧＳＡＰＶＬＳＡＶＡＴＶＧＩＴＩＧＶＬＡＲＶＡＬＩ
ＣＥＡＣＡＭ６のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）タンパク質配列は、本発明者によって推定され、ＴＰＰ−４１８９（配列番号１７７）によって表される。カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインは、配列番号１７７の３５〜３２０位のアミノ酸からなる。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ６（配列番号１７７）
ＭＧＰＰＳＡＰＰＣＲＩＣＶＰＷＫＥＶＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＳＰＰＴＴＡＱＬＴＩＥＳＲＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＡＨＮＬＰＱＮＴＬＧＦＮＷＹＫＧＥＲＶＤＡＫＲＬＩＶＡＹＶＩＧＴＱＱＴＴＰＧＰＡＨＳＧＲＥＭＩＹＳＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＳＹＴＬＱＡＩＫＥＤＬＶＴＥＥＡＴＧＲＦＷＶＹＰＥＬＰＫＰＹＩＴＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＤＦＴＣＥＰＤＩＨＳＴＴＹＬＷＷＶＮＤＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＬＳＶＫＲＮＤＡＧＡＹＥＣＥＩＱＮＰＶＳＡＮＬＳＤＰＶＩＬＮＶＬＹＧＰＤＶＰＴＩＳＰＳＮＳＮＹＲＰＧＥＮＬＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＴＡＱＹＳＷＦＶＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＭＣＱＡＹＮＳＡＴＧＬＮＲＴＴＶＭＭＩＴＶＳＧＳＡＰＧＬＳＡＶＡＴＶＧＩＭＩＧＶＬＡＲＶＡＬＩ
ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ６のドメイン構成は以下の通りである（それぞれ受託番号Ｐ４０１９９．３および配列番号１７９＝ＴＰＰ−４６３９および配列番号１７７＝ＴＰＰ−４１８９のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース配列に基づく）：
Figure 2018510636
ヒトＣＥＡＣＡＭ１全長タンパク質は、受託番号Ｐ１３６８８．２（配列番号１７３＝ＴＰＰ−４１８５）でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ１の成熟細胞外ドメインは、配列番号１７３の３５〜４２８位のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ１（配列番号１７３）
ＭＧＨＬＳＡＰＬＨＲＶＲＶＰＷＱＧＬＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＱＬＴＴＥＳＭＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＱＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＲＱＩＶＧＹＡＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＮＳＧＲＥＴＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＮＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＴＴＹＬＷＷＩＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＴＧＰＹＥＣＥＩＱＮＰＶＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＮＶＴＹＧＰＤＴＰＴＩＳＰＳＤＴＹＹＲＰＧＡＮＬＳＬＳＣＹＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬＩＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＴＣＨＡＮＮＳＶＴＧＣＮＲＴＴＶＫＴＩＩＶＴＥＬＳＰＶＶＡＫＰＱＩＫＡＳＫＴＴＶＴＧＤＫＤＳＶＮＬＴＣＳＴＮＤＴＧＩＳＩＲＷＦＦＫＮＱＳＬＰＳＳＥＲＭＫＬＳＱＧＮＴＴＬＳＩＮＰＶＫＲＥＤＡＧＴＹＷＣＥＶＦＮＰＩＳＫＮＱＳＤＰＩＭＬＮＶＮＹＮＡＬＰＱＥＮＧＬＳＰＧＡＩＡＧＩＶＩＧＶＶＡＬＶＡＬＩＡＶＡＬＡＣＦＬＨＦＧＫＴＧＲＡＳＤＱＲＤＬＴＥＨＫＰＳＶＳＮＨＴＱＤＨＳＮＤＰＰＮＫＭＮＥＶＴＹＳＴＬＮＦＥＡＱＱＰＴＱＰＴＳＡＳＰＳＬＴＡＴＥＩＩＹＳＥＶＫＫＱ
ヒトＣＥＡＣＡＭ３全長タンパク質は、受託番号Ｐ４０１９８．２（配列番号１７５＝ＴＰＰ−４１８７）でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ３の成熟細胞外ドメインは、配列番号１７５の３５〜１５５位のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ３（配列番号１７５）
ＭＧＰＰＳＡＳＰＨＲＥＣＩＰＷＱＧＬＬＬＴＡＳＬＬＮＦＷＮＰＰＴＴＡＫＬＴＩＥＳＭＰＬＳＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＨＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＳＬＩＶＧＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＡＡＹＳＧＲＥＴＩＹＴＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＩＧＦＹＴＬＱＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＨＶＹＱＥＮＡＰＧＬＰＶＧＡＶＡＧＩＶＴＧＶＬＶＧＶＡＬＶＡＡＬＶＣＦＬＬＬＡＫＴＧＲＴＳＩＱＲＤＬＫＥＱＱＰＱＡＬＡＰＧＲＧＰＳＨＳＳＡＦＳＭＳＰＬＳＴＡＱＡＰＬＰＮＰＲＴＡＡＳＩＹＥＥＬＬＫＨＤＴＮＩＹＣＲＭＤＨＫＡＥＶＡＳ
ヒトＣＥＡＣＡＭ５全長タンパク質は、受託番号Ｐ０６７３１．３（配列番号１７６＝ＴＰＰ−４１８８）でＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースから入手可能である。ヒトＣＥＡＣＡＭ５の成熟細胞外ドメインは、配列番号１７６の３５〜６８５位のアミノ酸からなる。
ヒトＣＥＡＣＡＭ５（配列番号１７６）
ＭＥＳＰＳＡＰＰＨＲＷＣＩＰＷＱＲＬＬＬＴＡＳＬＬＴＦＷＮＰＰＴＴＡＫＬＴＩＥＳＴＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＶＨＮＬＰＱＨＬＦＧＹＳＷＹＫＧＥＲＶＤＧＮＲＱＩＩＧＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＹＳＧＲＥＩＩＹＰＮＡＳＬＬＩＱＮＩＩＱＮＤＴＧＦＹＴＬＨＶＩＫＳＤＬＶＮＥＥＡＴＧＱＦＲＶＹＰＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＫＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＴＱＤＡＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶＴＲＮＤＴＡＳＹＫＣＥＴＱＮＰＶＳＡＲＲＳＤＳＶＩＬＮＶＬＹＧＰＤＡＰＴＩＳＰＬＮＴＳＹＲＳＧＥＮＬＮＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＦＶＮＧＴＦＱＱＳＴＱＥＬＦＩＰＮＩＴＶＮＮＳＧＳＹＴＣＱＡＨＮＳＤＴＧＬＮＲＴＴＶＴＴＩＴＶＹＡＥＰＰＫＰＦＩＴＳＮＮＳＮＰＶＥＤＥＤＡＶＡＬＴＣＥＰＥＩＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＮＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＤＮＲＴＬＴＬＬＳＶＴＲＮＤＶＧＰＹＥＣＧＩＱＮＫＬＳＶＤＨＳＤＰＶＩＬＮＶＬＹＧＰＤＤＰＴＩＳＰＳＹＴＹＹＲＰＧＶＮＬＳＬＳＣＨＡＡＳＮＰＰＡＱＹＳＷＬＩＤＧＮＩＱＱＨＴＱＥＬＦＩＳＮＩＴＥＫＮＳＧＬＹＴＣＱＡＮＮＳＡＳＧＨＳＲＴＴＶＫＴＩＴＶＳＡＥＬＰＫＰＳＩＳＳＮＮＳＫＰＶＥＤＫＤＡＶＡＦＴＣＥＰＥＡＱＮＴＴＹＬＷＷＶＮＧＱＳＬＰＶＳＰＲＬＱＬＳＮＧＮＲＴＬＴＬＦＮＶＴＲＮＤＡＲＡＹＶＣＧＩＱＮＳＶＳＡＮＲＳＤＰＶＴＬＤＶＬＹＧＰＤＴＰＩＩＳＰＰＤＳＳＹＬＳＧＡＮＬＮＬＳＣＨＳＡＳＮＰＳＰＱＹＳＷＲＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫＩＴＰＮＮＮＧＴＹＡＣＦＶＳＮＬＡＴＧＲＮＮＳＩＶＫＳＩＴＶＳＡＳＧＴＳＰＧＬＳＡＧＡＴＶＧＩＭＩＧＶＬＶＧＶＡＬＩ
「抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体」および「ＣＥＡＣＡＭ６に結合する抗体」という用語は、抗体がＣＥＡＣＡＭ６を標的とする際の診断薬および／または治療薬として有用であるように十分な親和性でＣＥＡＣＡＭ６に結合することができる抗体を指す。一実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の非関連非ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質への結合の程度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、抗体とＣＥＡＣＡＭ６の結合の約５％未満、好ましくは約２％未満である。一定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ６に結合する抗体が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。一定の実施形態では、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体が、異なる種のＣＥＡＣＡＭ６間で保存されているＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、好ましくは４つのポリペプチド鎖、典型的にはジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、例えば、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、例えば以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲおよび最大４つのＦＲで構成される。
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）という用語は、その存在が抗原結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義される「相補性決定領域」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３））（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｌｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））のアミノ酸残基および／または「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ；Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−９１７（１９８７））の残基を含み得る。いくつかの例では、相補性決定領域が、Ｋａｂａｔによって定義されるＣＤＲ領域と超可変ループの両方のアミノ酸を含み得る。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、完全抗体を異なる「クラス」に割り当てることができる。完全抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかを「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。本発明に使用にするために好ましいクラスの免疫グロブリンはＩｇＧである。
種々のクラスの抗体に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。本明細書で使用される場合、抗体は、従来公知の抗体およびその機能的断片である。
これによって、抗体／免疫グロブリンの「機能的断片」または「抗原結合抗体断片」は、抗原結合領域を保持する抗体／免疫グロブリンの断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には、抗体の１つまたは複数の超可変領域、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域に見される；しかしながら、可変「フレームワーク」領域も、例えば、ＣＤＲのための足場を提供することによって、抗原結合において重要な役割を果たすことができる。好ましくは、「抗原結合領域」は、可変軽（ＶＬ）鎖の少なくともアミノ酸残基４〜１０３および可変重（ＶＨ）鎖の５〜１０９、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３〜１０７およびＶＨの４〜１１１を含み、特に好ましくは、完全ＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸１〜１０９位およびＶＨの１〜１１３位；国際公開第９７／０８３２０号パンフレットによる番号付け）である。
本発明の「機能的断片」、「抗原結合抗体断片」または「抗体断片」には、それだけに限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）；単一ドメイン抗体（ＤＡｂ）、線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；ならびに抗体断片から形成された多重特異性、例えば二重および三重特異性抗体が含まれる（Ｃ．Ａ．Ｋ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄｉｔｏｒ（１９９５） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｓ．Ｄｕｅｂｅｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ（２００１） Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）。「多重特異性」または「多機能性」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であると理解される。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にするまたは完全に除去するよう設計され得る。
本明細書における「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域が、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端まで伸びる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。本明細書において特に指定されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによる。
本発明において企図される抗体または抗原結合抗体断片の変異体は、抗体または抗原結合抗体断片の結合活性が維持されている分子である。
本発明において企図される「結合タンパク質」は、例えば、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）などの抗体模倣物である（Ｇｅｂａｕｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９；１３：２４５−２５５；Ｎｕｔｔａｌｌ Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２００８；８：６０８−６１７により概説）。
「ヒト」抗体またはその抗原結合断片は、これにより、キメラではなく（例えば、「ヒト化」されていない）、（全部または一部）ヒト以外の種からのものでないものとして定義される。ヒト抗体またはその抗原結合断片は、ヒト由来であり得る、または合成ヒト抗体であり得る。「合成ヒト抗体」は、公知のヒト抗体配列の分析に基づく合成配列から全体的にまたは部分的にインシリコで誘導された配列を有する抗体として本明細書で定義される。ヒト抗体配列またはその断片のインシリコ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体断片配列のデータベースを分析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することによって達成することができる。ヒト抗体またはその抗原結合断片の別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリーから単離された核酸によってコードされるものである（例えば、このようなライブラリーはヒト天然源から採取された抗体に基づく）。ヒト抗体の例としては、Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００，１８：８５３−８５６に記載される抗体が挙げられる。
「ヒト化抗体」またはそのヒト化抗原結合断片は、（ｉ）抗体がヒト生殖系列配列に基づく、非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来する；（ｉｉ）非ヒト抗体のフレームワーク領域のアミノ酸が遺伝子工学によってヒトアミノ酸配列に部分的に交換されている、または（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源であるが、可変ドメインの１つまたは複数のフレームワークがヒト起源であり、定常ドメイン（存在する場合）がヒト起源である、ＣＤＲ移植されているものとして本明細書で定義される。
「キメラ抗体」またはその抗原結合断片は、可変ドメインが非ヒト源に由来し、いくつかまたは全ての定常ドメインがヒト源に由来するものとして本明細書で定義される。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が、可能な突然変異、例えば少量存在し得る天然に存在する突然変異を除いて同一である）から得られた抗体を指す。したがって、「モノクローナル」という用語は、抗体の特徴が個別の抗体の混合物ではないことを示す。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。「モノクローナル」という用語は、任意の特定の方法による抗体の作成を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体という用語は、具体的には、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を含む。
「単離された」抗体は、同定され、それを発現した細胞の成分から分離されたものである。細胞の汚染成分は、抗体の診断または治療的使用を妨害する物質であり、これには酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。
「単離された」核酸は、同定され、その自然環境の成分から分離されたものである。単離された核酸は、通常核酸分子を含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は染色体外またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
本明細書で使用される場合、抗体は、対象となる抗原、例えば腫瘍関連ポリペプチド抗原標的「に特異的に結合する」、「に特異的である」、または「を特異的に認識する」ものであり、抗体が抗原を発現している細胞または組織を標的とする際に治療薬として有用であり、他のタンパク質と有意には交差反応せず、上記抗原標的のオルソログおよび変異体（例えば、突然変異型、スプライス変異型もしくはタンパク質分解性切断型）と有意には交差反応しないように十分な親和性で抗原に結合するものである。本明細書で使用される特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「を特異的に認識する」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、例えば、抗体またはその抗原結合断片が約１０−４Ｍ未満、あるいは約１０−５Ｍ未満、あるいは約１０−６Ｍ未満、あるいは約１０−７Ｍ未満、あるいは約１０−８Ｍ未満、あるいは約１０−９Ｍ未満、あるいは約１０−１０Ｍ未満、あるいは約１０−１１Ｍ未満、あるいは約１０−１２Ｍ未満、またはそれ未満の抗原に対する一価ＫＤを有することによって示され得る。このような抗体がこのような抗原と１つまたは複数の基準抗原を区別することができる場合、抗体は、抗原「に特異的に結合する」、「に特異的である」または「を特異的に認識する」。その最も一般的な形態では、「特異的結合」、「に特異的に結合する」、「に特異的である」または「を特異的に認識する」とは、例えば、以下の方法の１つにより決定される、抗体が対象となる抗原と関連しない抗原を区別する能力を指している。このような方法は、それだけに限らないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−試験およびペプチドスキャンを含む。例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを行うことができる。点数化は、標準的な発色（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼによる二次抗体および過酸化水素によるテトラメチルベンジジン）によって行うことができる。あるウェルにおける反応は、例えば４５０ｎｍでの光学濃度によって点数化する。典型的な背景（＝陰性反応）は０．１ＯＤであり得る；典型的な陽性反応は１ＯＤであり得る；これは、陽性／陰性の差が５倍、１０倍、５０倍、好ましくは１００倍超であることを意味する。典型的には、結合特異性の決定は、単一基準抗原ではなく、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの約３〜５個の関連しない抗原のセットを用いて行われる。
「結合親和性」または「親和性」は、分子の単一の結合部位とその結合パートナーとの間の非共有結合相互作用の総和の強さを指す。特に指示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。解離定数「ＫＤ」は、分子（抗体など）とその結合パートナー（抗原など）との間の親和性、すなわちリガンドが特定のタンパク質にどれくらい強く結合するかを記載するために一般的に使用される。リガンド−タンパク質親和性は、２つの分子間の非共有結合分子間相互作用によって影響される。親和性は、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。一実施形態では、本発明による「ＫＤ」または「ＫＤ値」が、それだけに限らないが、Ｂｉａｃｏｒｅ機器、例えばＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）またはＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む適当な装置を用いて表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸もしくは糖側鎖またはこれらの組み合わせなどの分子の化学的に活性な表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。
基準抗体と「同じエピトープに結合する抗体」または基準抗体と「結合について競合する抗体」は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、競合アッセイで基準抗体とその抗原の結合を遮断する抗体を指し、逆に、基準抗体は１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、競合アッセイで抗体とその抗原の結合を遮断する。代表的な競合アッセイを本明細書で提供する。
「標的タンパク質Ｚのエピトープに結合する抗体であって、前記エピトープがアミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、．．．を含む抗体」とは、抗体とその標的タンパク質の結合後に、標的タンパク質Ｚの前記アミノ酸残基Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、．．．の原子まで５Å、好ましくは４Å以内の原子を含む抗体である。このようなエピトープは、実施例１６で例示されるＸ線結晶構造を用いることによって決定することができる。
「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、一定の細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原担持標的細胞に特異的に結合させ、その後、例えば、細胞毒で標的細胞を死滅させる細胞傷害の形態を指す。対象となる抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５５００３６２号明細書または第５８２１３３７号明細書または米国特許第６７３７０５６号明細書（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞にはＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が含まれる。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、その同族抗原に結合している（適当なサブクラスの）抗体への補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイを行うことができる。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列（変異Ｆｃ領域を有するポリペプチド）および増加または減少したＣ１ｑ結合を有するポリペプチド変異体は、例えば、米国特許第６１９４５５１号明細書および国際公開第１９９９／５１６４２号パンフレットに記載されている。
本明細書で使用される場合、「ネイキッド抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）または放射標識に結合していない抗体を指す。このネイキッド抗体が医薬組成物中に存在してもよい。
「免疫複合体」（互換的に「抗体−薬物複合体」または「ＡＤＣ」とも呼ばれる）という用語は、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはこれらの断片）、または放射性同位体（すなわち、放射性複合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））などの１種または複数の細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤と結合した抗体を指す。免疫複合体は、細胞傷害剤、すなわち、がんの治療において、細胞を死滅させるまたはその成長もしくは増殖を阻害する薬物の局所送達に使用されてきた（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６），９３，８６１８−８６２３））。免疫複合体は、非複合体薬物の全身投与が正常細胞および／または組織に対して許容できないレベルの毒性をもたらし得る場合に、腫瘍への薬物部分の標的送達およびその中の細胞内蓄積を可能にする。抗体−毒素複合体に使用される毒素には、ジフテリア毒素などの細菌毒素、リシンなどの植物毒素、ゲルダナマイシンなどの小分子毒素が含まれる。毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合またはトポイソメラーゼ阻害を含む機構によって細胞傷害性効果を発揮し得る。
基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれに関する「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大配列同一性％を達成した後の、基準ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの中の核酸またはアミノ酸残基それぞれと同一である候補配列中の核酸またはアミノ酸残基それぞれの割合として定義される。保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。ギャップのないアラインメントが好ましい。アミノ酸配列同一性％を決定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の技能の範囲内の種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適当なパラメータを決定することができる。
「配列相同性」は、同一であるまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。
成熟Ｆａｂ変異体などの「成熟抗体」または「成熟抗原結合断片」という用語は、標的タンパク質の細胞外ドメインなどの所与の抗原とのより強い結合−すなわち、親和性の増加した結合を示す抗体または抗体断片の誘導体を含む。成熟は、例えば、この親和性増加をもたらす抗体または抗体断片の６つのＣＤＲ内の少数の突然変異を同定するプロセスである。成熟プロセスは、突然変異を抗体に導入するための分子生物学的方法と、改良されたバインダーを同定するためのスクリーニングの組み合わせである。
「アンタゴニスト」抗体または「遮断」抗体は、（部分的にまたは完全に）結合する抗原の生物学的活性を有意に阻害する抗体である。
「アゴニスト」抗体または「アゴニスト活性」を有する抗体は、その標的に結合し、例えば、それぞれの標的によって媒介されるシグナル伝達経路または生物学的効果の活性化（部分的にまたは完全に）をもたらすそれぞれの標的の活性化（部分的にまたは完全に）を誘導する抗体である。本明細書で使用される「アゴニスト」抗体または「アゴニスト活性」を有する抗体は、対象となるポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣し得る抗体である。
「医薬製剤」／「医薬組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物学的活性が有効となるのを可能にするような形態であり、製剤が投与される対象にとって容認できないほど毒性である追加の成分を含有しない調製物を指す。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。一定のベクターは、作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と呼ばれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」という用語は互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（このような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞は、継代数に関わらず、初代形質転換／トランスフェクト／形質導入細胞およびそれに由来する子孫を含む「形質転換体」、「形質転換細胞」、「トランスフェクタント」、「トランスフェクト細胞」および「形質導入細胞」を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異子孫が、本明細書に含まれる。
本発明の抗体
本発明は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、それゆえ密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体に関する。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインに特異的に結合し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５の成熟細胞外ドメインと有意には交差反応しない。成熟細胞外ドメインは、細胞表面上で発現される全長タンパク質の一部であり、可溶性タンパク質（天然に存在または組換え発現される）であり得る。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインおよび／またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインに特異的に結合し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、および／またはヒトＣＥＡＣＡＭ３、および／またはヒトＣＥＡＣＡＭ５の成熟細胞外ドメインのみを含むタンパク質と有意には交差反応しない。
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的な（抗体がヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性であることを意味する）抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。
ＣＥＡＣＡＭ６に選択的な（密接に関連するＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しないことを意味する）抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６に結合し、それだけに限らないが、類似の親和性を有するサルを含む別の種のＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性である抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の別の実施形態である。好ましくは、前記他の種はヒト以外の霊長類、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、オランウータン、ゴリラおよびチンパンジーである。最も好ましくは、抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６に結合し、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性である。
抗原１（Ａｇ１）に結合するモノクローナル抗体は、ＥＣ５０および／またはＫＤ値が両抗原について類似の範囲にある場合、抗原２（Ａｇ２）に対して「交差反応性」である。本開示において、Ａｇ１に対する親和性とＡｇ２に対する親和性の比が１０以下（≦１０）であり、かつ０．１以上（０．１≧）である場合（これは、親和性が両抗原について同じ実験設定で同じ方法で測定されるという条件で、Ａｇ１に対する親和性とＡｇ２に対する親和性が１０倍超異なることはない（両親和性が一桁以内の一価ＫＤである）ことを意味する）、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体はＡｇ２に対して交差反応性である。
したがって、本発明による抗体は、１０以下（≦１０）かつ０．１以上（≧０．１）のヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する親和性とカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する親和性の比を有する（これは、ヒトＣＥＡＣＡＭ６についての親和性とカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６についての親和性が１０倍超異なることはない（両親和性が一桁以内の一価ＫＤである）ことを意味する）。したがって、本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、サルで観察される毒性プロファイルがヒトにおける潜在的有害効果を予測するのに適切であるため、サルで行われる毒物学試験に使用され得る。
親和性が２つの抗原に対して非常に異なる場合、抗原１（Ａｇ１）に結合するモノクローナル抗体は抗原３（Ａｇ３）に対して「有意には交差反応性でない」。結合反応（アッセイにおける測定された結合シグナル）が低すぎる場合、Ａｇ３に対する親和性は測定できないことがある。本出願では、Ａｇ３に対するモノクローナル抗体の結合反応（アッセイで測定された結合シグナル）が、同じ実験設定および同じ抗体濃度におけるＡｇ１に対する同じモノクローナル抗体の結合反応の５％未満、好ましくは２％未満である場合、Ａｇ１に結合するモノクローナル抗体はＡｇ３に対して「有意には交差反応性でない」。実際、使用される抗体濃度は、ＥＣ５０またはＫＤまたはＡｇ１で得られる飽和プラトーに達するのに必要な濃度とすることができる。
本発明によると、抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない。
本発明の好ましい実施形態は、表１３、表１８および表２０に示されるように、組換えＣＥＡＣＡＭ６（実施例２参照）に対する一価親和性として測定される、≦４００ｎＭ、好ましくは≦２００ｎＭ、あるいは好ましくは≦１００ｎＭのヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する親和性を有する。
本発明によると、抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）に結合する（親和性は１桁以内の一価ＫＤである）。ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１はＮドメインとしても知られている。
一桁以内の親和性（一価ＫＤ）で、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）に特異的に、およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１とカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１の両方に対してＫＤ≦１００ｎＭの親和性を有する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体が非常に好ましい。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）および／またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）を含むタンパク質に特異的に結合する。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）および／またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）を含むタンパク質に特異的に結合し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない。
本発明の抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）および／またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）を含むタンパク質に特異的に結合し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、および／またはヒトＣＥＡＣＡＭ３、および／またはヒトＣＥＡＣＡＭ５の成熟細胞外ドメインのみを含むタンパク質と有意には交差反応しない。
ＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメインに特異的に結合し、ヒトＣＥＡＣＡＭ６上で９Ａ６抗体（Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）と結合について競合し、密接に関連するヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３、およびヒトＣＥＡＣＡＭ５の成熟細胞外ドメインと有意には交差反応しない抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）に特異的に結合し、ヒトＣＥＡＣＡＭ６上で９Ａ６抗体（Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）と結合について競合する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、ＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を妨害する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。予め形成された抗体−ＣＥＡＣＡＭ６−複合体の結合シグナルが、実施例で提供されるＣＥＡＣＡＭ１を用いた典型的な結合アッセイにおいて、ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質単独の結合シグナルと比べて２０％超、好ましくは５０％超減少する場合、抗体はＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を妨害する。ＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用の妨害は、自然免疫応答および適応免疫応答の調節のためのメカニズムであり得る。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、免疫調節活性を有する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。「免疫調節」は、免疫強化、免疫抑制または免疫寛容の誘導におけるような所望のレベルへの免疫応答の調整である。「免疫調節抗体」薬物は、疾患、例えばがんの治療または抗炎症のために免疫応答を刺激または抑制する免疫応答修飾剤である。本発明は、免疫マーカー発現プロファイルの変化ならびに抗腫瘍Ｔ細胞再活性化および有効な抗がん免疫応答に向けられたＴ細胞の活性化状態をもたらす免疫系の成分を含む、がん細胞および潜在的に他の細胞上の免疫細胞抑制リガンドであるＣＥＡＣＡＭ６を遮断する、実施例１１に示される、抗ＣＥＡＣＡＭ６免疫調節抗体を提供する。ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１に結合する抗体が好ましい。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌またはＩＦＮ−γ分泌活性化Ｔ細胞の数のいずれかによって測定される腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができる抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体は、腫瘍特異的Ｔ細胞と腫瘍細胞の共培養における抗体が対照試料と比較してＩＦＮ−γ分泌の１．２倍超、好ましくは１．５倍超の増加を生じる場合に、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができる。好ましくは、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である。密接に関連するＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応せず、ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１に結合する抗体が好ましい。これは、アイソタイプ適合対照で処理した対照試料と比較してＩＦＮ−γ分泌の１．５倍超の増加をもたらす、サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞とＫＳ腫瘍細胞の共培養における本発明の抗体によるＣＥＡＣＡＭ６の遮断によって例示的に示される（図５および図６）。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合し、増加したＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−α分泌を特徴とするさらなる細胞傷害性および／または活性化表現型に向けて腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイル変化させることができる抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。好ましくは、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、表現型は増加したＩＦＮ−γおよびＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌である。腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞と腫瘍細胞の共培養における抗体が、アイソタイプ適合対照で処理した対照試料と比較して、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−α分泌の１．２倍超、好ましくは１．５倍超の増加をもたらす場合、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体はさらなる細胞傷害性および／または活性化表現型に向けて腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることができる。サバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞とＫＳ腫瘍細胞の共培養における本発明の抗体によるＣＥＡＣＡＭ６の遮断によって、アイソタイプ適合対照で処理した対照試料と比較してＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌の１．５倍超の増加がもたらされる（図６）。
それだけに限らないが、実施例に示されるものを含む広範囲の異なるＣＥＡＣＡＭ６発現細胞株に結合する抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。これらの例としては、多くの腫瘍起源（例えば、ＣＥＡＣＡＭ６陽性であると文献に以前記載されたがん徴候を表すＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ、ＣＲＣ、ＰａｎｃＣＡ、ＢｒｅａｓｔＣＡ、ＧａｓｔｒｉｃＣＡ、多発性骨髄腫、子宮頸がん、皮膚がん）ヒト細胞株が挙げられる（導入または概説Ｂｅａｕｃｈｉｍｅｎ ａｎｄ Ａｒａｂｚａｄｅｈ，Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．２０１３ Ｄｅｃ；３２（３−４）：６４３−７１を参照）。
ヒト投与に安全な抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体を提供することが本発明の実施形態である。好ましくは、抗体はキメラ、ヒト化またはヒトである。ヒト化抗体またはヒト抗体が非常に好ましい。
それにもかかわらず、一定のアッセイでは、マウスＩｇＧとしての本発明の抗体の発現が好ましい；例えば、ヒト試料を用いた免疫組織化学は、マウス抗体またはヒト−マウスキメラ抗体を用いることにより、より容易に分析することができる。
ＣＥＡＣＡＭ６発現が正常組織と比較して上昇しているまたはＣＥＡＣＡＭ６が細胞表面から脱落して血清中で検出可能になっている悪性または異形成状態を診断するためのツールを構成する抗体を提供することが本発明の別の実施形態である。検出可能なマーカーに結合した抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射標識、酵素、発色団または発蛍光団である。
本文書を通して、表１に示される本発明の以下の好ましい抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体に言及する。
Figure 2018510636
表１に示される本発明の好ましい抗体またはその抗原結合断片の配列を、図８でさらに提供し、説明する。
ＴＰＰ−３３０８は、配列番号４３に相当する重鎖領域および配列番号４４に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３３１０は、配列番号５７に相当する重鎖領域および配列番号５８に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３７１４は、配列番号１２９に相当する重鎖領域および配列番号１３０に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３３２３は、配列番号８５に相当する重鎖領域および配列番号８６に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３８２０は、配列番号１４３に相当する重鎖領域および配列番号１４４に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３８２１は、配列番号１５７に相当する重鎖領域および配列番号１５８に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３３２２は、配列番号７１に相当する重鎖領域および配列番号７２に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３７０７は、配列番号１１５に相当する重鎖領域および配列番号１１６に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
ＴＰＰ−３７０５は、配列番号１０１に相当する重鎖領域および配列番号１０２に相当する軽鎖領域を含む抗体を表す。
さらに好ましい実施形態では、抗体または抗原結合断片が、抗体「ＴＰＰ−２９７１」、「ＴＰＰ−３１８６」、「ＴＰＰ−３１８７」、「ＴＰＰ−３３０８」、「ＴＰＰ−３３１０」、「ＴＰＰ−３３２２」、「ＴＰＰ−３３２３」、「ＴＰＰ−３７０５」、「ＴＰＰ−３７０７」、「ＴＰＰ−３７１４」、「ＴＰＰ−３８２０」、「ＴＰＰ−３８２１」の少なくとも１つの好ましくは対応するＣＤＲ配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％同一である、または「ＴＰＰ−２９７１」、「ＴＰＰ−３１８６」、「ＴＰＰ−３１８７」、「ＴＰＰ−３３０８」、「ＴＰＰ−３３１０」、「ＴＰＰ−３３２２」、「ＴＰＰ−３３２３」、「ＴＰＰ−３７０５」、「ＴＰＰ−３７０７」、「ＴＰＰ−３７１４」、「ＴＰＰ−３８２０」、「ＴＰＰ−３８２１」それぞれのＶＨもしくはＶＬ配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９２％もしくは９５％同一である重鎖または軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、表１に示される少なくとも１つのＣＤＲ配列または少なくとも１つの可変重鎖もしくは可変軽鎖配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号５（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号６（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３４（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号３５（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号３６（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号３８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号３９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号４０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４８（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号４９（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号５０（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号５２（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号５３（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号５４（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１２０（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１２１（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１２２（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号１２４（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１２５（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１２６（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２４（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号２５（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号２６（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号２８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号２９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号３０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号７７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号７８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号８０（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号８１（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号８２（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３４（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１３５（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１３６（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号１３８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１３９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１４０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４８（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１４９（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１５０（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号１５２（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１５３（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１５４（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号６２（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号６３（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号６４（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号６６（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号６７（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号６８（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１５（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１６（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号１８（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１９（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号２０（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１０６（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号１０７（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号１０８（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号１１０（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号１１１（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号１１２（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９２（Ｈ−ＣＤＲ１）、配列番号９３（Ｈ−ＣＤＲ２）および配列番号９４（Ｈ−ＣＤＲ３）を含む重鎖抗原結合領域を含み、配列番号９６（Ｌ−ＣＤＲ１）、配列番号９７（Ｌ−ＣＤＲ２）および配列番号９８（Ｌ−ＣＤＲ３）を含む軽鎖抗原結合領域を含む。
抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）内だけでなく、フレームワーク（ＦＲ）においても配列が異なる。これらの配列の相違は、異なるＶ遺伝子にコードされている。ヒト抗体生殖系列レパートリーは完全に配列決定されている。配列相同性により６つのサブファミリーＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５およびＶＨ６に分類することができる約５０個の機能的ＶＨ生殖系列遺伝子が存在する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６−７９８；Ｍａｔｓｕｄａ＆Ｈｏｎｊｏ，１９９６，Ａｄｖａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６２，１−２９）。７つのサブファミリーを含む約４０個の機能的ＶＬκ遺伝子が知られている（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，８２７−８３６；Ｂａｒｂｉｅ＆Ｌｅｆｒａｎｃ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１５，１７１−１８３）：Ｖκ１、Ｖκ２，Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖκ５、Ｖκ６およびＶκ７。ヒトＶＨ２サブファミリーに属する本発明の抗体の重鎖およびヒトＶκ１サブファミリーに属する本発明の抗体の軽鎖がそれぞれ本明細書で開示される。同じサブファミリーに属する抗体のフレームワーク配列は密接に関連していることが知られており、例えば、ヒトＶＨ３サブファミリーメンバーを含む抗体は全て同程度の安定性を共有する（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２２（３）：１２１−１３４）。対応する起源抗体の特別な特徴を維持しながら、抗体由来のＣＤＲを異なるフレームワークに移植することができることが、当技術分野で周知である。ＣＤＲは、異なる種に属するフレームワークならびに異なるサブファミリーに属する同じ種のフレームワークにうまく移植されてきた。さらなる実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片が、表１に示される本発明の抗体の少なくとも１つのＣＤＲ配列およびヒト可変鎖フレームワーク配列を含む。
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片が、表１に示される本発明の可変軽鎖のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３配列を含む可変軽鎖または軽鎖抗原結合領域と、可変重鎖抗体のＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３配列を含む可変重鎖または重鎖抗原結合領域と、ヒト可変軽鎖およびヒト可変重鎖フレームワーク配列とを含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号７によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号３３によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号３７によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１１９によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号１２３によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号２７によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７５によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号７９によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３３によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号１３７によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号１５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１３によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号１７によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号６１によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号６５によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１０５によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号１０９によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
非常に好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９１によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号９５によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含む。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個、２個、３個、４個、５個、８個、１０個、１５個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個、２個、３個、４個、５個、８個、１０個、１５個またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合する。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個、２個、３個、４個、５個、８個、１０個、１５個またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合する。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合する。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合し、前記抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合し、前記抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個、２個、３個、４個、５個、８個、１０個、１５個またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合し、前記抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
一定の実施形態では、本発明の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体がヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープと相互作用する、例えばこれに結合し、前記エピトープが配列番号１７９のＰｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含み、前記抗体、または抗原結合抗体断片、またはその変異体が配列番号４７によって示される可変重鎖配列（ＶＨ）および配列番号５１によって示される可変軽鎖配列（ＶＬ）を含む抗体とＣＥＣＥＡＭ６との結合について競合し、前記抗体、またはその抗原結合抗体断片、またはその変異体がＩｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、Ｉｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない（配列番号１７９による番号付け）。
本発明の抗体はＩｇＧ（免疫グロブリンＧ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭであり得、抗体断片は例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨまたはｓｃＦｖであり得る。したがって、本発明の抗体断片は、本明細書に記載される１つまたは複数の方法で挙動する抗原結合領域であってもよいし、これを含んでもよい。
好ましい実施形態では、本発明の抗体または抗原結合抗体断片がモノクローナルである。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合断片、またはこれらをコードする核酸が単離される。単離された生物学的成分（核酸分子または抗体などのタンパク質など）は、成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分、例えば他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質およびオルガネラから実質的に分離または精製されたものである。この用語はまた、宿主細胞ならびに化学的に合成された核酸における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質も包含する。
抗体作成
本発明の抗体は、例えば、完全ヒトＣＤＲ新たな抗体分子に組み込むｎ−ＣｏＤｅＲ（登録商標）技術を用いて、多数の健康なボランティアの抗体から単離されたアミノ酸配列に基づく組換え抗体ライブラリーから得ることができる（Ｃａｒｌｓｏｎ＆Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００１ Ｍａｙ；１（１）：１０２−８）。あるいは、例えばＨｏｅｔ ＲＭ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３（３）：３４４−８に記載される完全ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーとしての抗体ライブラリーを用いて、ＣＥＡＣＡＭ６特異的抗体を単離することができる。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書中のヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
ヒト抗体は、抗原投与に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を含む完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによってさらに調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるまたは染色体外に存在もしくは動物の染色体に無作為に組み込まれたヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含む。例えば、遺伝子操作されたマウスの免疫化、特にｈＭＡｂマウス（例えば、ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（登録商標）またはＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標））の免疫化を行うことができる。
さらなる抗体は、ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５−７参照）を用いて作成することができ、例えば、マウス、ラットまたはウサギ抗体をもたらし、これをキメラまたはヒト化抗体に変換することができる。ヒト化抗体およびそれらを作成する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号明細書、第７５２７７９１号明細書、第６９８２３２１号明細書および第７０８７４０９号明細書；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）移植を記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「表面再生」を記載している）；Ｄａｌｌ’ Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載している）；ならびにＯｓｂｏｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１−６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載している）にさらに記載されている。
組換え抗体ライブラリーを用いた抗体の作成およびその後のヒト化と組み合わせたマウスの免疫化の例が提供される。
ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない、ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体を作成する方法を提供することが、本発明のさらなる態様である。カニクイザルＣＥＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）で、動物、好ましくはマウスを免疫化するステップと、ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体のアミノ酸配列を決定するステップと、場合により引き続いてキメラ抗体をヒト化または作成するステップと、前記抗体を発現するステップとを含むことを特徴とする抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を作成する方法を提供することが本発明の実施形態である。発現系は組換え発現系または無細胞発現系であり得る。組換え発現に適した宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。哺乳動物発現系が好ましい。
ペプチド変異体
本発明の抗体または抗原結合断片は、本明細書で提供される特定のペプチド配列に限定されない。むしろ、本発明はこれらのポリペプチドの変異体も具体化する。本開示ならびに従来利用可能な技術および参考文献を参照して、当業者は、ＣＥＡＣＡＭ６に結合する能力を有するこれらの変異体が本発明の範囲内に入ることを認識しながら、本明細書に開示される抗体の機能的変異体を調製、試験および利用することができるだろう。
変異体は、例えば、本明細書に開示されるペプチド配列に対して少なくとも１つの変化した相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を有する抗体を含むことができる。
ＣＤＲまたはＦＲ領域の１個または複数のアミノ酸残基を変化させることにより、当業者は、突然変異したまたは多様化した抗体配列を作成し、これを、例えば、新規なまたは改善された特性について、抗原に対してスクリーニングすることができる。
本発明のさらに好ましい実施形態は、ＶＨおよびＶＬ配列が表１に示されるように選択される抗体または抗原結合断片である。当業者は、表１のデータを使用して、本発明の範囲内にあるペプチド変異体を設計することができる。変異体が１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変化させることによって構築されることが好ましく；変異体はまた１つまたは複数の変化したフレームワーク領域を有し得る。フレームワーク領域を変化させてもよい。例えば、生殖系列配列と比較して残基に逸脱がある場合にペプチドＦＲドメインを変化させてもよいだろう。
あるいは、当業者は、例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＭＢ ２０００，２９６：５７−８６に記載されている手順を用いて、本明細書に開示されるアミノ酸配列をこのような抗体の同じクラスの公知の配列と比較することによって同じ分析をすることができるだろう。
さらに、抗体中の１個または複数のアミノ酸残基、好ましくは１つまたは複数のＣＤＲ中のアミノ酸残基を多様化し、得られた抗体変異体のコレクションを改善した特性を有する変異体についてスクリーニングすることによって、さらなる最適化のための出発点として１つの抗体を用いることによって変異体を得ることができる。ＶＬおよび／またはＶＨのＣＤＲ３中の１個または複数のアミノ酸残基の多様化が特に好ましい。例えば、トリヌクレオチド突然変異誘発（ＴＲＩＭ）技術を用いてＤＮＡ分子のコレクションを合成することによって、多様化を行うことができる（Ｖｉｒｎｅｋａｓ Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２：５６００．）。抗体またはその抗原結合断片は、それだけに限らないが、例えば、変化した半減期（例えば、Ｆｃ部分の修飾もしくはＰＥＧなどのさらなる分子の付着）、変化した結合親和性、または変化したＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性をもたらす修飾を含む修飾／バリエーションを有する分子を含む。
保存的アミノ酸変異体
本明細書に記載される抗体ペプチド配列の分子構造全体を保存するポリペプチド変異体を作成することができる。個々のアミノ酸の特性を考えると、いくつかの合理的な置換が当業者によって認識されるであろう。アミノ酸置換、すなわち「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行うことができる。
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれ；（ｂ）極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれ；（ｃ）正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれ；（ｄ）負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。置換は、典型的には、群（ａ）〜（ｄ）内で行うことができる。さらに、グリシンおよびプロリンは、α−ヘリックスを破壊するその能力に基づいて互いに置換されていてもよい。同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンなどの一定のアミノ酸はαヘリックスでより一般的に見られる一方、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびトレオニンはβひだ折れシートでより一般的に見られる。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギンおよびプロリンは、一般的に順番に見られる。いくつかの好ましい置換は、以下の基：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；および（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬとＩの間で行われ得る。既知の遺伝暗号ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術があれば、熟練した科学者は保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
グリコシル化変異体
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＫａｂａｔ ＥＵ番号付けを用いたＡｓｎ２９７へのＮ結合によって一般に結合される分岐鎖の二分岐オリゴ糖を含む；例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。
一定の実施形態では、本明細書で提供される抗体が、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるよう変化している。グリコシル化部位の抗体への付加または欠失は、発現系（例えば、宿主細胞）を変化させることによって、および／または１つもしくは複数のグリコシル化部位が作製もしくは除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって好都合に達成され得る。
本発明の一実施形態では、エフェクター機能が低下したアグリコシル抗体または抗体誘導体が原核宿主での発現によって調製される。適当な原核宿主には、それだけに限らないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種々の種が含まれる。
一実施形態では、前記抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中の保存されたＮ結合部位での修飾を特徴とする、エフェクター機能が低下した抗体変異体が提供される。本発明の一実施形態では、修飾が重鎖グリコシル化部位でのグリコシル化を防ぐための重鎖グリコシル化部位での突然変異を含む。したがって、本発明の１つの好ましい実施形態では、アグリコシル抗体または抗体誘導体が、重鎖グリコシル化部位の突然変異、すなわちＫａｂａｔ ＥＵ番号付けを用いたＮ２９７の突然変異によって調製され、適当な宿主細胞中で発現される。
本発明の別の実施形態では、アグリコシル抗体または抗体誘導体が低下したエフェクター機能を有し、前記抗体または抗体誘導体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中の保存されたＮ結合部位の修飾がＣＨ２ドメイングリカンの除去すなわち、脱グリコシル化を含む。これらのアグリコシル抗体は、従来の方法によって作成され、次いで、酵素的に脱グリコシル化され得る。抗体の酵素的脱グリコシル化の方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ＆Ｎｉｃｏｌｓｏｎ（１９７６），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５１（４）：１０７４−８０）。
本発明の別の実施形態では、グリコシル化阻害剤であるツニカマイシン（Ｎｏｓｅ＆Ｗｉｇｚｅｌｌ（１９８３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８０（２１）：６６３２−６）を用いて脱グリコシル化を達成することができる。すなわち、この修飾は、前記抗体のＦｃ部分のＣＨ２ドメイン中の保存されたＮ結合部位でのグリコシル化の防止である。
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、このような抗体中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号パンフレットに記載されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の和に対するＡｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって測定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、抗体の軽微な配列変異により、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流、すなわち２９４位と３００位との間に位置し得る。このようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。
「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例としては、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。
脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；および国際公開第２００４／０５６３１２号パンフレット）およびノックアウト細胞株、例えばα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）参照）が挙げられる。
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている、二分オリゴ糖を含む抗体変異体がさらに提供される。このような抗体変異体は、フコシル化の減少および／またはＡＤＣＣ機能の改善を有し得る。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号パンフレット；米国特許第６６０２６８４号明細書；および米国特許出願第２００５／０１２３５４６明細書に記載されている。
Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号パンフレット；国際公開第１９９８／５８９６４号パンフレット；および国際公開第１９９９／２２７６４号パンフレットに記載されている。
Ｆｃ領域変異体
一定の実施形態では、本明細書で提供される抗体のＦｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）に１つまたは複数のアミノ酸修飾（例えば、置換）を導入して、Ｆｃ領域改変体を作成することができる。
一定の実施形態では、本発明は、抗体変異体を、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（補体およびＡＤＣＣなど）が不要または有害な用途のための望ましい候補にするいくつかの、但し全てではないエフェクター機能を有する抗体変異体を企図する。インビトロおよび／またはインビボ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（したがっておそらくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確保することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の変化（すなわち、改善または減少のいずれか）をもたらすＦｃ領域の改変が行われる。
一定の実施形態では、本発明は、半減期が増加または減少した抗体変異体を企図する。半減期が増加し、胎児への母性ＩｇＧの移行を担う新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６） ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号明細書（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含む。
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）
本発明はまた、化学療法剤または薬物、増殖抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、ヒトもしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはこれらの断片）、または放射活性同位体などの１つまたは複数の細胞傷害剤に結合した抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を含む抗体−薬物複合体（ＡＤＣ、免疫複合体）を提供する。
一実施形態では、免疫複合体が、抗体が、それだけに限らないが、マイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号明細書、第５４１６０６４号明細書および欧州特許第０４２５２３５号明細書参照）；オーリスタチン、例えばモノメチルオーリスタン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号明細書および第５７８０５８８号明細書および第７４９８２９８号明細書参照）；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体；アントラサイクリン、例えばダウノマイシンまたはドキソルビシン；メトトレキサート；ビンデシン；タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル；トリコテセン；ならびにＣＣ１０６５を含む１種または複数の薬物と結合している抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）である。
別の実施形態では、免疫複合体が、それだけに限らないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む酵素的に活性な毒素またはその断片に結合した本明細書に記載される抗体を含む。
別の実施形態では、免疫複合体が、放射性複合体を形成する放射性原子に結合した本明細書に記載される抗体を含む。放射性複合体の製造には、種々の放射性同位体が利用可能である。例としては、２２７Ｔｈ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２ＰｂおよびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性複合体を検出に使用する場合、放射性複合体はシンチグラフィー研究のための放射性原子、例えばＴｃ９９ｍ、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング用のスピン標識、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含むことができる。
抗体および細胞傷害剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を用いて作成することができる。
リンカーは、細胞傷害性薬物の細胞中への放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーがある（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２ ７−１３１（１９９２））。
本明細書の免疫複合体またはＡＤＣは明確に、それだけに限らないが、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣおよびスルホＳＭＰＢ、および（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ．、米国から）商業的に入手可能なＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含む架橋リンカー試薬を用いて調製されたこのような複合体を企図する。
本発明のＤＮＡ分子
本発明はまた、本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードするＤＮＡ分子に関する。発現された抗体に使用されるＤＮＡ配列を表３２に示す。これらの配列は、一定の場合、哺乳動物発現のために最適化される。本発明のＤＮＡ分子は、本明細書に開示される配列に限定されず、その変異体も含む。本発明内のＤＮＡ変異体は、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照して記載され得る。当業者は、ＤＮＡが二本鎖、その等価物またはホモログであるので、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いてＤＮＡを使用してその相補体を同定することができることを認識するであろう。ハイブリダイゼーションは、１００％未満の相補性で起こり得ることも認識されるであろう。しかしながら、条件の適切な選択があれば、ハイブリダイゼーション技術を用いて、特定のプローブに対するそれらの構造的関連性に基づいてＤＮＡ配列を区別することができる。このような条件に関する手引きについては、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，＆ Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９５）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）を参照されたい。
２つのポリヌクレオチド配列間の構造的類似性は、２つの配列が互いにハイブリダイズする条件の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書中で使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、条件がハイブリダイゼーションを嫌う程度を指す。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌い、このような条件下では最も構造的に関連する分子のみが互いにハイブリダイズする。逆に、非ストリンジェントな条件は、より低い程度の構造的関連性を示す分子のハイブリダイゼーションに有利である。そのため、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造的関係と直接相関する。
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ全体の濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の存在を含む多くの因子の関数である。ハイブリダイゼーションを促進する因子には、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低温、長いプローブサイズおよび水素結合を破壊する薬剤の非存在が含まれる。ハイブリダイゼーションは、典型的には、「結合」段階および「洗浄」段階の２つの段階で行われる。
機能的に等価なＤＮＡ変異体
本発明の範囲内のさらに別のクラスのＤＮＡ変異体は、それらがコードする産物を参照して記載することができる。これらの機能的に等価なポリヌクレオチドは、それらが遺伝暗号の縮重のために同じペプチド配列をコードするという事実を特徴とする。
本明細書で提供されるＤＮＡ分子の変異体をいくつかの異なる方法で構築することができることが認識される。例えば、変異体を完全合成ＤＮＡとして構築することができる。オリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法は、広く入手可能である。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎ ２．１１，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１（１９９３）を参照されたい。重複オリゴヌクレオチドは、Ｋｈｏｒａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７２：２０９−２１７（１９７１）によって最初に報告された様式で合成し、組み立てることができる；上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｃｔｉｏｎ ８．２も参照されたい。合成ＤＮＡは、好ましくは適当なベクターへのクローニングを容易にするために遺伝子の５’末端および３’末端で操作された好都合な制限部位を用いて設計される。
示されるように、変異体を作成する方法は、本明細書に開示されるＤＮＡの１つから開始し、次いで、部位特異的変異誘発を行うことである。上記のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３７（１９９７）を参照されたい。典型的な方法では、標的ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡバクテリオファージビヒクルにクローニングする。一本鎖ＤＮＡを単離し、所望の（１又は複数の）ヌクレオチド変化を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。相補鎖を合成し、二本鎖ファージを宿主に導入する。得られた子孫のうちのいくつかは、所望の変異体を含み、これはＤＮＡ配列決定を用いて確認することができる。さらに、子孫ファージが所望の突然変異体となる可能性を高める種々の方法が利用可能である。これらの方法は当業者に周知であり、このような変異体を作成するためにキットが市販されている。
組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する（表３２参照）。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体をコードするＤＮＡ分子が挿入されているベクター、例えばプラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターに関連して使用することができる。
本明細書で提供される抗体、抗原結合部分、またはその変異体は、宿主細胞中の軽鎖および重鎖またはその一部をコードする核酸配列の組換え発現によって調製することができる。抗体、抗原結合部分、またはその変異体を組換え的に発現させるために、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現されるように、軽鎖および／または重鎖あるいはその一部をコードするＤＮＡ断片を有する１つまたは複数の組換え発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすることができる。標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および／または取得し、これらの核酸を組換え発現ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）およびＢｏｓｓらによる米国特許第４８１６３９７号明細書に記載されているものに導入する。
さらに、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列を、例えば全長抗体鎖、Ｆａｂ断片をコードする核酸配列またはｓｃＦｖに変換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、例えば、抗体定常領域または可動性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に（２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にあるように）作動可能に連結することができる。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｌ ａｌ．（１９９１） Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。
ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作成するために、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸を、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって接続されたＶＨおよびＶＬ配列が連続した一本鎖タンパク質として発現され得るように、可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０） ３４８：５５２−５５４参照）。
抗体、その抗原結合断片、またはその変異体を発現させるために、標準的な組換えＤＮＡ発現方法を使用することができる（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）参照）。例えば、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、これを適当な宿主細胞にトランスフェクトすることができる。適当な宿主細胞は原核細胞および真核細胞である。原核宿主細胞の例は、例えば、細菌であり、真核宿主細胞の例は、酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを別々のベクターに挿入する。他の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを同じベクターに挿入する。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルおよび発現が構成的であるかまたは誘導的であるかどうかなどの因子によって影響されることが理解される。
そのため、本発明の実施形態はまた、ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞であり、宿主細胞が高等真核生物宿主細胞（哺乳動物細胞など）、下等真核生物宿主細胞（酵母細胞など）であってもよく、原核細胞（細菌細胞など）であってもよい。
本発明の別の実施形態は、適当な条件下で宿主細胞を培養するステップと、前記抗体を回収するステップとを含む、抗体および抗原結合断片を作成するために宿主細胞を使用する方法である。
そのため、本発明の別の実施形態は、本発明の宿主細胞を用いた本発明の抗体の作成およびこれらの抗体の少なくとも９５重量％均質性までの精製である。
細菌の発現
細菌使用のための有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、適当な翻訳開始および終止シグナルと共に、機能的プロモーターを用いて作動可能な読み取り段階で挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするために、および所望であれば宿主内での増幅を提供するために、１つまたは複数の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。形質転換に適した原核宿主には、それだけに限らないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の種々の種が含まれる。
細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはファージミドに基づくものであり得る。これらのベクターは、典型的には周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）のエレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含むことができる。適当な宿主株の形質転換および適当な細胞密度への宿主株の増殖後、選択されたプロモーターを、適当な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）によって抑制解除／誘導し、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離によって回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。
細菌系では、発現されるタンパク質を意図する用途に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体の作成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、大量のこのようなタンパク質を産生する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいだろう。
そのため、本発明の実施形態は、本発明の新規な抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体は、天然精製産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌とシュードモナス、ストレプトマイセスおよびブドウ球菌属の種々の種、好ましくは大腸菌細胞を含む原核生物宿主から組換え技術によって作成される産物を含む。
哺乳動物の発現
哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞中での高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。抗体の発現は、構成的であっても調節されていてもよい（例えば、Ｔｅｔ系と組み合わせたテトラサイクリンなどの小分子誘導物質の添加または除去により誘導可能）。ウイルス調節エレメントおよびその配列のさらなる説明については、例えば、Ｓｔｉｎｓｋｉによる米国特許第５１６８０６２号明細書、Ｂｅｌｌらによる米国特許第４５１０２４５号明細書およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによる米国特許第４９６８６１５号明細書を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含むことができる（例えば、米国特許第４３９９２１６号明細書、第４６３４６６５号明細書および米国特許第５１７９０１７号号明細書参照）。適当な選択マーカーには、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン／ブレオマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する遺伝子、あるいはベクターを導入した宿主細胞上で、グルタミンシンテターゼなどの栄養要求性を利用する選択マーカー（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．１９９２ Ｆｅｂ；１０（２）：１６９−７５）が含まれる。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与し、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来のｂｓｄ遺伝子はブラストサイジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物は、ゼオシンに対する耐性を付与し、ハイグロマイシンに対する耐性は、大腸菌ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇまたはｈｐｈ）によって付与される。ＤＨＦＲまたはグルタミンシンテターゼなどの選択マーカーも、ＭＴＸおよびＭＳＸと併せて増幅技術に有用である。
発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、電気穿孔、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、ポリカチオンベースのトランスフェクション、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどの標準的な技術を用いて行うことができる。
本明細書で提供される抗体、その抗原結合断片、またはその変異体を発現するのに適した哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ［例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２） Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０およびＵｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１９８３ Ｊｕｎ；３３（２）：４０５−１２に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞ならびにＦａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２ Ａｐｒ；１０９（４）：１００７−１５に例示される他のノックアウト細胞を含む］などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＡＰ細胞、ＥＢ６６細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。
発現はまた、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３−６Ｅ、ＨＥＫ２９３−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＨＫＢ１１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、２９３ＥＢＮＡＬＴ７５、ＣＨＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５、ＣＨＯＳ−ＸＥ、ＣＨＯ−３Ｅ７またはＣＡＰ−Ｔ細胞などの発現系において一過性または半安定（ｓｅｍｉ−ｓｔａｂｌｅ）であり得る（例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２ Ｊａｎ １５；３０（２）：Ｅ９）。
いくつかの実施形態では、発現ベクターが、発現されたタンパク質が宿主細胞を増殖している培養培地に分泌されるよう設計される。抗体、その抗原結合断片またはその変異体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培養培地から回収することができる。
精製
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体を、それだけに限らないが、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に使用することもできる。例えば、それぞれ全体的に参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｒ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）、例えば１、４、６、８、９、１０章を参照されたい。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体は、天然精製産物、化学合成手順の産物、ならびに例えば酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主から組換え技術によって作成される産物を含む。組換え作成手順で使用される宿主に応じて、本発明の抗体をグリコシル化することができる、または非グリコシル化することができる。このような方法は、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ、１７．３７〜１７．４２節、上記のＡｕｓｕｂｅｌ、１０、１２、１３、１６、１８および２０章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
好ましい実施形態では、抗体が、（１）例えばＬｏｗｒｙ法、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法もしくはＳＤＳ−毛管ゲル電気泳動（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ、ＧＸ ９０もしくはＢｉｏｒａｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ装置）によって測定される９５重量％超の抗体まで、さらに好ましい実施形態では、９９重量％超まで、（２）Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質になるまで精製される。単離された天然抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内で原位置で抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
治療的方法
治療的方法は、治療上有効量の本発明によって企図される抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体を治療を、必要とする対象に投与するステップを含む。これにより、「治療上有効」量は、有害状態の緩和につながるが、毒物学的に許容される、単回用量として、または複数回用量レジメンにより、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、ＣＥＡＣＡＭ６陽性細胞の増殖を減少させる、または対象の治療領域におけるＣＥＡＣＡＭ６発現腫瘍のサイズを減少させるのに十分な量である抗体または抗原結合断片の量として定義される。対象は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下等霊長類）であり得る。
医薬品として使用するための抗体またはその抗原結合断片を提供することが本発明の実施形態である。
がんを治療するための医薬品としての使用するための抗体またはその抗原結合断片を提供することが本発明の実施形態である。好ましい実施形態では、がんが腫瘍であり、非常に好ましい実施形態では、がんが固形腫瘍である。
疾患を治療するための医薬品の製造において抗体またはその抗原結合断片を使用することが本発明の実施形態である。
がんを治療するための医薬品の製造において抗体またはその抗原結合断片を使用することが本発明の実施形態である。好ましい実施形態では、がんが腫瘍であり、非常に好ましい実施形態では、がんが固形腫瘍である。
本発明の抗体またはその抗原結合断片を、異常なＣＥＡＣＡＭ６シグナル伝達を有する種々の状況、例えばがんまたは線維性疾患などの細胞増殖性障害において、治療ツールまたは診断ツールとして使用することができる。本発明の抗体による治療に特に適している障害および状態は、乳房、気道、脳、生殖器官、消化管、尿路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺のがんおよびそれらの遠隔転移などの固形腫瘍である。これらの障害には、リンパ腫、肉腫および白血病も含まれる。
消化管の腫瘍には、それだけに限らないが、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺のがんが含まれる。
食道がんの例としては、それだけに限らないが、食道細胞がんおよび腺がん、ならびに扁平上皮細胞がん、平滑筋肉腫、悪性黒色腫、横紋筋肉腫およびリンパ腫が挙げられる。
胃がんの例としては、それだけに限らないが、腸型および散在型胃腺がんが挙げられる。
膵臓がんの例としては、それだけに限らないが、腺管がん、腺扁平上皮がんおよび膵臓内分泌腫瘍が挙げられる。
乳がんの例としては、それだけに限らないが、トリプルネガティブ乳がん、浸潤性乳管がん、浸潤性小葉がん、腺管上皮内がんおよび非浸潤性小葉がんが挙げられる。
気道のがんの例としては、それだけに限らないが、小細胞および非小細胞肺がんならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が挙げられる。
脳がんの例としては、それだけに限らないが、脳幹および視床下部膠腫、小脳および大脳星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、上衣腫ならびに神経外胚葉および松果体腫瘍が挙げられる。
男性生殖器の腫瘍には、それだけに限らないが、前立腺がんおよび精巣がんが含まれる。女性生殖器の腫瘍には、それだけに限らないが、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん、膣がんおよび外陰がんならびに子宮肉腫が含まれる。
卵巣がんの例としては、それだけに限らないが、漿液性腫瘍、子宮内膜腫瘍、粘液性嚢胞腺がん、顆粒膜細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫および男化腫瘍が挙げられる。
子宮頸がんの例としては、それだけに限らないが、扁平上皮がん、腺がん、腺扁平上皮がん、小細胞がん、神経内分泌腫瘍、ガラス状細胞がんおよび絨毛腺がんが挙げられる。
尿路の腫瘍には、それだけに限らないが、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道、ならびに遺伝性および散発性の乳頭状腎がんが含まれる。
腎臓がんの例としては、それだけに限らないが、腎細胞がん、尿路上皮細胞がん、傍糸球体細胞腫瘍（腎腫）、血管膠腫、腎膨大細胞腫、ベリーニ管がん、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉腎腫およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
膀胱がんの例としては、それだけに限らないが、移行上皮がん、扁平上皮がん、腺がん、肉腫および小細胞がんが挙げられる。
眼のがんには、それだけに限らないが、眼内黒色腫および網膜芽腫が含まれる。
肝臓がんの例としては、それだけに限らないが、肝細胞がん（線維層状型変異体を伴うまたは伴わない肝細胞がん腫）、胆管細胞がん（肝内胆管がん）および混合型肝細胞胆管細胞がんが挙げられる。
皮膚がんには、それだけに限らないが、扁平上皮細胞がん、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞皮膚がんおよび非黒色腫皮膚がんが含まれる。
頭頸部がんには、それだけに限らないが、頭頸部の扁平上皮がん、喉頭がん、下咽頭がん、鼻咽頭がん、口腔咽頭がん、唾液腺がん、口唇および口腔がん、ならびに扁平上皮がんが含まれる。
リンパ腫には、それだけに限らないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫が含まれる。
肉腫には、それだけに限らないが、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫が含まれる。
白血病には、それだけに限らないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリーセル白血病が含まれる。
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片が、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膵臓がん、胃がん、乳がんおよび多発性骨髄腫からなる群に含まれるがん疾患を治療または診断するための治療または診断方法に適している。
さらに、本発明の抗体またはその抗原結合断片は、ＣＥＡＣＡＭ６が関与する種々の他の障害、例えば、それだけに限らないが、肺感染症、例えばインフルエンザ、クローン病、炎症性腸疾患、乾癬、肺嚢胞性線維症における治療または診断ツール、胃腸管への細菌結合、外傷、出血熱傷、外科手術、脳卒中、心筋梗塞、敗血症、肺炎、感染症およびがんに対するワクチン接種、慢性ウイルス感染症の予防として使用することもできる。
上記障害は、ヒトにおいてよく特徴付けられているが、哺乳動物を含む他の動物においても同様の病因で存在し、本発明の医薬品組成物を投与することによって治療することができる。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体は、公知の医薬品と同時投与されてもよく、いくつかの例では、抗体自体が修飾されてもよい。例えば、抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体を、細胞傷害剤または放射性同位体に結合して、効力を潜在的にさらに増加させることができるだろう。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体は、唯一の医薬品として、または組み合わせが許容できない副作用を引き起こさない１種もしくは複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与することができる。この併用療法は、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体と、１種または複数の追加の治療薬とを含有する単一の医薬投与製剤の投与、ならびに本発明および各追加の治療薬のそれ自体の別個の医薬投与製剤の投与を含む。例えば、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体と治療薬が単一液体組成物で一緒に患者に投与され得る、または各薬剤が別々の投与製剤で投与され得る。
別個の投与製剤が使用される場合、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体と１種または複数の追加の治療薬は、本質的に同時に（例えば、同時に）または別々に交互に（例えば、順次）投与され得る。
特に、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物由来抗腫瘍薬、ホルモン療法薬、トポイソメラーゼ阻害剤、免疫学的物質（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、抗体、抗体薬物、生物学的応答調節物質、抗血管新生化合物、細胞療法薬およびそれだけに限らないが、カンプトテシン誘導体、キナーゼ阻害剤、標的化薬物を含む他の抗腫瘍薬物などの他の抗腫瘍剤との一定のまたは別個の組み合わせで使用され得る。
これに関して、以下は、本発明の抗体と組み合わせて使用され得る第２の薬剤の例の非限定的リストである：
アルキル化剤には、それだけに限らないが、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロミド、アルトレタミン、アパジコン、ブロスタリシン、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルフォスファミド、マホスファミド、ベンダムスチンおよびミトラクトールが含まれ；白金配位アルキル化化合物には、それだけに限らないが、シスプラチン、カルボプラチン、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチンおよびサトラプラチンが含まれる；
代謝拮抗薬には、それだけに限らないが、メトトレキサート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、単独またはロイコボリンと組み合わせた５−フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、メルファラン、ネララビン、ノラトレキシド、オクホスファイト（ｏｃｆｏｓｆｉｔｅ）、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ペリトレキソール、ラルチトレキセド、トリアピン、トリメトレキサート、ビダラビン、ビンクリスチンおよびビノレルビンが含まれる；
ホルモン療法薬には、それだけに限らないが、エキセメスタン、Ｌｕｐｒｏｎ、アナストロゾール、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、ホルメスタン、１１−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１阻害剤、１７−αヒドロキシラーゼ／１７，２０リアーゼ阻害剤、例えば酢酸アビラテロン、５−αレダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリドおよびエプリステリド、抗エストロゲン薬、例えばクエン酸タモキシフェンおよびフルベストラント、Ｔｒｅｌｓｔａｒ、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール、抗アンドロゲン薬、例えばビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、Ｃａｓｏｄｅｘ、ならびに抗プロゲステロン、ならびにこれらの組み合わせが含まれる；
植物由来抗腫瘍物質には、例えば、有糸分裂阻害剤、例えば、エポチロン、例えばサゴピロン、イクサベピロンおよびエポチロンＢ；ビンブラスチン、ビンフルニン、ドセタキセルおよびパクリタキセルから選択されるものが含まれる；
細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害剤には、それだけに限らないが、アクラルビシン、ドキソルビシン、アモナファイド、ベロテカン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ジフロモテカン、イリノテカン、トポテカン、エドテカリン、エピルビシン、エトポシド、エキサテカン、ジャイマテカン、ラルトテカン、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピキサントロン、ルビテカン、ソブゾキサン、タフルポシドおよびこれらの組み合わせが含まれる；
免疫学的物質には、インターフェロン、例えばインターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａおよびインターフェロンγ−ｎ１、ＧＭ−ＣＳＦならびに他の免疫増強剤、例えばＬ１９−ＩＬ２および他のＩＬ２誘導体、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、ＴｈｅｒａＣｙｓ、ウベニメクス、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、黒色腫ワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン（ｔｅｃｌｅｕｋｉｎ）、チマラシン（ｔｈｙｍａｌａｓｉｎ）、トシツモマブ、Ｖｉｍｌｉｚｉｎ、エプラツズマブ、ミツモマブ、オレゴボマブ、ペムツモマブおよびＰｒｏｖｅｎｇｅ；ＡＬＮＸ６０００、Ｕｒｅｌｕｍａｂ、ＰＦ−００５０８２５６６、Ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ、ＡＺ１０６０６１２０、ＮＦ３４０、ＢＭＳ−７７７６０７が含まれる；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ３受容体、Ｂ７−Ｈ４受容体、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＫＩＲＤＬ、２Ｂ４、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＨＬＡ２を含む免疫チェックポイントモジュレーターまたは同時阻害受容体に向けられた薬物も含まれる。具体的には、これらの薬物のいくつかはイピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＰＤＲ００１、ＭＤＸ１１０５、ＢＭＳ−９３６５５９、アテゾリズマブ、Ｍｅｄｉ４７３６、アベルマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＧＡ２７１、ＩＭＰ３２１、ＢＭＳ−９８６０１６、バビツキシマブ、ＭＮＲＰ１６８５Ａ、セレコキシブ、ＰＦ−０４４１８９４８、ＲＱ−１５９８６である；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＫＩＲＤＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、ＣＤ４０Ｌ．ＴＭＩＧＤ２、ＴＩＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ５に向けられた薬物を含む同時刺激受容体の活性剤が含まれる。これらの薬物の中には、ＣＰ−８７０８９３、ルカツムマブ、ダセツズマブ、抗ＯＸ４０、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、ＣＤＸ−１１２７、ＴＲＸ５１８、バルリルマブがある；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２５、ＣＣＲ４に向けられるものを含むＴｒｅｇ活性を調節する薬剤も含まれる。これらの薬剤の中にはダクリズマブがある；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＣＳＦ１Ｒに向けられるものを含む骨髄由来サプレッサー細胞の活性を調節する薬剤も含まれる。一例はエマツズマブ、タラダフィルである；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＮＧＫ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄを含むＴｏｌｌ様受容体に向けられる薬剤を含む先天性免疫細胞応答を調節する薬剤も含まれる。これらの薬物は、例えばイミキモド、ＣＰＧ７９０９（ＰＦ−３５１２６７６、ＣＰＧ２００６）；ＭＧＮ１７０３、ＳＤ−１０１、ヒルトノール（ポリＩＣＬＣ）、抗ＮＧＫ２Ａ（ＩＰＨ２２０１）、ＯＭ−１７４、８５２Ａ、ＶＴＸ−２３３７、ＩＭＯ−２０５５である；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ１Ｒ、ＫＩＲ、ＩＬＴ、ＬＩＲ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ２４４、ＣＣＬ２、ＣＤ４７に向けられる薬物を含む先天性免疫細胞応答を調節する薬物も含まれる。具体的には、これらの薬物のいくつかは、抗ＫＩＲ（ＩＨＰ２１０１；ＩＰＨ２１０１；１−７Ｆ９）；リリルマブ（ＩＰＨ２０１２；ＢＭＳ−９８６０１５）；カルルマブ（ＣＮＴＯ８８８）、ＩＭＣ−ＣＳ４、ＦＰＡ００８、ＰＬＸ３３９７、ＡＲＲＹ−３８２、ＣＣ−９０００２、抗ＣＤ４７（Ｈｕ５Ｆ９−Ｇ４）、ＢＬＺ９４５である；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、二重特異性抗体、例えば、Ｂ７−Ｈ３に対するＤａｒｔｓ、例えばＣＤ１９ｘＣＤ３に対するＢｉｔｅｓ；例えば、Ｒｅｍｏｖａｂ抗ＥＰＣＡＭｘＣＤ３ｘＦＣ、ＮＫ細胞標的化剤を含む免疫細胞再標的化剤も含まれる；
免疫学的物質には、ワクチンおよびアジュバントを含む腫瘍微小環境を調節し、免疫細胞浸潤および応答を改善する薬剤も含まれ、ＧＶＡＸ、ＦＶＡＸに限定されない；
これに関して、ワクチンは、樹状細胞ベースのワクチン、ウイルスワクチン、ｍＲＮＡベースのバクシン（ｖａｘｘｉｎｅ）、マルチペプチドベースのワクチンを含む；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣｌ１２を含む免疫細胞浸潤を改善する薬剤も含まれる。これらの薬物のいくつかは、Ｄｅｎｅｎｉｃｏｋｉｎ（ＢＭＳ９８２４７０）、ＡＬＴ−８０３、ｈｅｔＩＬ１５、Ｕｌｏｃｕｐｌｕｍａｂ、ＢＫＴ１４０、ＣＸＣＲ２特異的ｍａｂ、ＡＤ３１００、Ｍａｒａｖｉｒｏｘ、ＰＦ−４１３６３０９である；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ｍ−ＴＯＲＧＳＫ３β阻害剤、負荷ＤＣ（例えば、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）、放射線療法、外部ビーム放射に向けられた薬物を含むＡＰＣおよびＴ細胞のプライミングおよび活性化を改善する薬剤または治療法も含まれる；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯに向けられた薬物を含むキヌレニン経路モジュレーターも含まれる。これらの薬物の中には、ＩＮＣＢ０２４３６０、インドキシモド（ＮＬＧ８１８９；１−メチル−Ｄ−トリプトファン、Ｄ−１ＭＴ）、ＧＤＣ−０９１９、ＮＬＧ９１９、ＬＭ１０がある；
免疫学的物質には、それだけに限らないが、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２Ａ受容体、Ａ２Ｂ受容体に向けられた薬物を含むアデノシン経路モジュレーターも含まれる。このような薬物には、化合物９、ＮＣＸ−４０１６、ＡＴ３８、ＳＣＨ５８２６１、ＳＣＨ４２０８１４、ＰＳＢ１１１５、ＡＲＬ６７１７６、ＡＭＰＣＰが含まれる；
免疫学的物質には、ＴＧＦβ／ＡＬＫ５経路モジュレーターも含まれる。このような薬物には、ＯＹ２１５７２９９、ＥＷ−７１８７が含まれる；
免疫学的物質には、Ｓｔｉｎｇ活性化剤も含まれる；
生物学的応答調節物質は、生物の防御機構または組織細胞の生存、増殖もしくは分化などの生物学的応答を改変して、抗腫瘍活性を有するようにする物質である；このような薬剤には、例えば、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニル、ＰｒｏＭｕｎｅおよびウベニメクスが含まれる；
抗血管新生化合物には、それだけに限らないが、アシトレチン、アフリベルセプト、アンジオスタチン、アプリジン、アセンタール（ａｓｅｎｔａｒ）、アキシチニブ、ベバシズマブ、ブリバニブアラニネート、シレンジタイド、コンブレタスタチン、エンドスタチン、フェンレチニド、ハロフジノン、パゾパニブ、ラニビズマブ、レビマスタット、レセンチン、レゴラフェニブ、レモバブ、レブリミド、ソラフェニブ、スクアラミン、スニチニブ、テラチニブ、サリドマイド、ウクライン、バタラニブおよびビタキシンが含まれる；
抗血管新生薬には、それだけに限らないが、ソラフェニブ、レボラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、レセンチン、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、ブリバニブアラニネート、バタラニブ、パゾパニブおよびラニビズマブを含むＶＥＧＦ阻害剤も含まれる；
抗体薬物には、それだけに限らないが、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、チシリムマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ＲＧ−７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ１１０５）、デュルバルマブ（Ｍｅｄｉ−４７３６）、ＭＳＢ−００１０７１８Ｃ、ルミリキシマブ、カツマキソマブ、アタシセプト、オレゴボマブ、パニツムマブおよびアレムツズマブが含まれる；
抗体薬物には、それだけに限らないが、メソテリン、Ｃ４．４Ａ、ＦＧＦＲ２、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡを標的とするものを含む抗体薬物複合体も含まれる；
抗体薬物には、トリウム標的化複合体、それだけに限らないが、メソテリン、Ｃ４．４Ａ、ＦＧＦＲ２、ＨＥＲ２、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ６を標的とするものも含まれる；
抗体薬物には、それだけに限らないが、二重特異性（または多重特異性）ＩｇＧおよび二重特異性（または多重特異性）抗体断片ならびにそれらのタンパク質融合物および複合体（例えばＣｒｏｓｓＭａｂ、ＤＡＦ（２ｉｎ１）、ＤＡＦ（４ｉｎ１）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ−ＩｇＧ、ＫｉＨａｓｓｅｍｂｌｅｄ ＩｇＧ、電荷対会合ＩｇＧ、ＫｉＨ−ｃｏｍｍｏｎＬＣ、Ｆａｂ−アーム交換、ＳＥＥＤボディ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ−Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ−ｍＡｂ、直交Ｆａｂ、ＤＶＤ−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｈ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−（Ｌ）ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ，Ｈ）−Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）−Ｖ、Ｖ（Ｈ）−ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）−Ｖ、Ｖ（Ｌ）−ＩｇＧ、ＫＩＨ−ＩｇＧ−ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４−Ｉｇ、Ｚｙボディ、ＤＶＩ−ＩｇＧ（４ｉｎ１）、ジ−ナノボディ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＤＡＲＴ−Ｆｃ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ダイアボディ−ＣＨ３、トリプルボディ、ミニ抗体、ミニボディ、ＴｒｉＢｉミニボディ、ｓｃＦｖ−ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＣＨ−ＣＬ−ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ−ＫＩＨ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ダイアボディ−Ｆｃ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、細胞内抗体、ドックアンドロック融合体（Ｄｏｃｋ ａｎｄ Ｌｏｃｋ ｆｕｓｉｏｎ）、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳＡｂｏｄｙ、ｓｃダイアボディ−ＨＡＳ、タンデムｓｃＦｖ−毒素、ＩｇＧ−ＩｇＧ、Ｃｏｖ−Ｘ−ボディ、ｓｃＦｖ１−ＰＥＧ−ｓｃＦｖ２など）を含む二重特異性（または多重特異性）抗体フォーマットも含まれる；
抗体薬物には、それだけに限らないが、ＤＡＲＰＩＮ分子などの抗体様結合特性を有する組換え作成技術によってされる組換えタンパク質も含まれる；
細胞療法薬には、それだけに限らないが、生体外で刺激されたＴ細胞、例えばシプロイセルＴなどのがん患者から単離された腫瘍浸潤リンパ球が含まれる；
細胞療法薬には、それだけに限らないが、シプロイセルＴなどのがん患者から単離された腫瘍浸潤リンパ球およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する遺伝子操作されたＴ細胞、例えばＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞；ＣＡＲ−Ｈｅｒ２−Ｔ細胞が含まれる；
例えば、アリトレチノイン、アンプリジェン、アトラセンタンベキサロテン、ボルテゾミム、ボセンタン、カルシトリオール、エクシスリンド、フォテムスチン、イバンドロン酸、ミルテフォシン、ミトキサントロン、Ｉ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、ベルケイド、硝酸ガリウム、カンフォスファミド、ダリナパルシンおよびトレチノイン、ＰＩ３０６５、ＴＧ１００−１１５を含む他の抗がん剤；
ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）阻害剤、例えばセツキシマブ、パニツムマブ、ベクティビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびＺａｃｔｉｍａ；
ＨＥＲ２阻害剤、例えばラパチニブ、トラツズマブおよびペルツズマブ；
ｍＴＯＲ阻害剤、例えばテムシロリムス、シロリムス／ラパマイシンおよびエベロリムス；
ｃ−Ｍｅｔ阻害剤；
ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えばＰＩ３Ｋ阻害剤１（２−アミノ−Ｎ−［７−メトキシ−８−（３−モルホリン−４−イルプロポキシ）−２，３−ジヒドロイミダゾ［１，２−ｃ］キナゾリン−５−イル］ピリミジン−５−カルボキサミド二塩酸塩（国際公開第２０１２／１３６５５３号パンフレット実施例１および２の化合物を参照）およびＡＫＴ阻害剤；
ＣＤＫ阻害剤、例えばロスコビチンおよびフラボピリドール；
紡錘体形成チェックポイント阻害剤および標的化有糸分裂阻害剤、例えばＰＬＫ阻害剤、Ａｕｒｏｒａ阻害剤（例えば、ヘスペラジン）、チェックポイントキナーゼ阻害剤およびＫＳＰ阻害剤；
ＢＲＡＦＶ６００Ｅ阻害剤、例えばベムラフェニブ、ダブラフェニブ；
ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、パノビノスタット、ボリノスタット、ＭＳ２７５、ベリノスタットおよびＬＢＨ５８９；
ＨＳＰ９０およびＨＳＰ７０阻害剤；
プロテアソーム阻害剤、例えばボルテゾミブおよびカルフィルゾミブ；
ＭＥＫ阻害剤およびＲａｆ阻害剤を含むセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブ；
ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、チピファルニブ；
例えば、ダサチニブ、ニロチニブ、レゴラフェニブ、ボスチニブ、ソラフェニブ、ベバシズマブ、スニチニブ、セジラニブ、アキシチニブ、アフリベルセプト、テラチニブ、イマチニブメシラート、ブリバニブアラニネート、パゾパニブ、ラニビズマブ、ベタラニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベクティビックス、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、トラツズマブ、ペルツズマブおよびｃ−Ｋｉｔ阻害剤を含むチロシンキナーゼ阻害剤；
ビタミンＤ受容体アゴニスト；
Ｂｃｌ−２タンパク質阻害剤、例えばオバトクラックス、オブリメルセンナトリウムおよびゴシポール；
分化抗原群２０受容体アンタゴニスト、例えばリツキシマブ；
リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えばゲムシタビン；
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体１アゴニスト、例えばマパツムマブ；
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド受容体２アゴニスト、例えばレキサツムマブ、コナツムマブ、ＣＳ−１００８、ＰＲＯ９５７８０；
５−ヒドロキシトリプタミン受容体アンタゴニスト、例えば、ｒＥＶ５９８、キサリプロード（ｘａｌｉｐｒｏｄｅ）、パロノセトロン塩酸塩、グラニセトロン、ＺｉｎｄｏｌおよびＡＢ−１００１；
例えばＥ７８２０、ＪＳＭ ６４２５、ボロシキシマブおよびエンドスタチンなどのα５−β１インテグリン阻害剤を含むインテグリン阻害剤；
例えば、デカン酸ナンドロロン、フルオキシメステロン、Ａｎｄｒｏｉｄ、Ｐｒｏｓｔ−ａｉｄ、アンドロムスチン、ビカルタミド、フルタミド、アポシプロテロン、アポフルタミド、酢酸クロルマジノン、Ａｎｄｒｏｃｕｒ、Ｔａｂｉ、酢酸シプロテロンおよびニルタミドを含むアンドロゲン受容体アンタゴニスト；
アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール、レトロゾール、テストラクトン、エキセメスタン、アミノ−グルテチミドおよびホルメスタン；
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；
さらに、本発明の抗体は、それだけに限らないが、紫外線、酸化処理、熱ショック、標的および非標的放射線療法、シコニン、高静水圧、腫瘍溶解性ウイルスおよび光線力学療法を含む免疫原性細胞死を引き起こす治療法と組み合わせることができる；
さらに、本発明の抗体は、それだけに限らないが、スニチニブ、ＪＡＫ２阻害剤、アントラサイクリン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチンおよびシクロホスファミド、標的および非標的微小管不安定化薬（例えば、オーリスタチンおよびメイタンシノイドなど）を含む免疫原性細胞死を引き起こす薬剤と組み合わせることができる；
本発明の化合物はまた、放射線療法および／または外科的介入と併せてがん治療に使用することもできる。
さらに、本発明の抗体は、それ自体または組成物で、研究および診断にまたは当技術分野で周知の分析基準標準などとして利用することができる；
診断方法
抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体またはその抗原結合断片を、ＣＥＡＣＡＭ６発現腫瘍の存在を検出するために使用することができる。ＣＥＡＣＡＭ６含有細胞または血清および組織生検標本を含む種々の生物学的試料中に脱落したＣＥＡＣＡＭ６の存在を、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体で検出することができる。さらに、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を、９９Ｔｃ（または他の同位体）結合抗体を用いた免疫シンチグラフィーなどの種々のイメージング法に使用することができる。例えば、１１１Ｉｎ結合抗ＰＳＭＡ抗体を用いて記載されるものと同様のイメージングプロトコルを用いて、膵臓または卵巣がんを検出することができる（Ｓｏｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２１：７５９−７６６，１９９７）。使用することができる別の検出方法は、本発明の抗体を適当な同位体と結合させることによる陽電子放出断層撮影法である（Ｈｅｒｚｏｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３４：２２２２−２２２６，１９９３参照）。
医薬組成物および投与
前記障害のいずれかを治療するために、本発明により使用するための医薬組成物を、１種または複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて従来の様式で製剤化することができる。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、治療される障害の種類に応じて変化し得る任意の適当な手段によって投与することができる。可能な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下）、肺内および鼻腔内、ならびに局所免疫抑制治療のために所望であれば、病変内投与が含まれる。さらに、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体を、例えば抗体の用量を減少させて、パルス注入によって投与することができる。好ましくは、一部は投与が短時間であるか慢性であるかに応じて、注射、最も好ましくは静脈内または皮下注射によって投与を行う。投与される量は、臨床症状、個体の体重、他の薬物を投与するかどうかなどの種々の因子に依存する。当業者は、投与経路が治療される障害または状態に応じて変化することを認識するであろう。
本発明の一実施形態は、それだけに限らないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水を含む任意の滅菌生体適合性医薬担体で投与することができる、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体を、単独で、または少なくとも１種の他の薬剤、例えば、安定化化合物と組み合わせて含む医薬組成物である。さらなる実施形態は、ＣＥＡＣＡＭ６結合抗体またはその抗原結合断片と、がんなどのＣＥＡＣＡＭ６関連疾患を治療するのに適したさらなる薬学的に活性な化合物とを含む医薬組成物である。これらの分子のいずれかを、単独で、または（１又は複数の）賦形剤もしくは薬学的に許容される担体と混合されている医薬組成物で、他の薬剤、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与することができる。本発明の一実施形態では、薬学的に許容される担体が薬学的に不活性である。
本発明はまた、医薬組成物の投与に関する。このような投与は、経口的または非経口的に達成される。非経口送達の方法には、局所、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内または鼻腔内投与が含まれる。有効成分に加えて、これらの医薬組成物は、賦形剤および薬学的に使用することができる製剤への活性化合物の加工を容易にする助剤を含む適当な薬学的に許容される担体を含み得る。製剤および投与の技術に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に見出すことができる。
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与に適した投薬量の当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて製剤化することができる。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化することを可能にする。
所望により、適当な助剤を添加して、錠剤または糖衣錠コアを得た後に、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、場合により得られた混合物を粉砕し、顆粒混合物を加工することによって経口使用のための医薬製剤を得ることができる。適切な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物からのデンプン；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにタンパク質、例えばゼラチンおよびコラーゲンである。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
糖衣錠コアに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに適当な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい濃縮糖溶液などの適切なコーティングを施すことができる。製品識別のため、または活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。
経口的に使用することができる医薬製剤には、ゼラチン製の押し込み式カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングでできた軟質密封カプセルが含まれる。プッシュフィット（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カプセルは、充填剤または結合剤（ラクトースまたはデンプンなど）、潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの）、および場合により安定剤と混合された有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、活性化合物を、安定剤を含むまたは含まない脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に溶解または懸濁することができる。
非経口投与のための医薬製剤には、活性化合物の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物を、水溶液、好ましくは生理学的適合性緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液または生理学的緩衝化生理食塩水中に製剤化することができる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。さらに、活性化合物の懸濁液を、適当な油性注射懸濁液として調製することができる。適当な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルまたはトリグリセリドなど）、またはリポソームが含まれる。懸濁液が、化合物の溶解度を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする適当な安定剤または薬剤を含有してもよい。
局所または経鼻投与のために、浸透すべき特定の障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、当技術分野において一般的に知られている。
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程によって、当技術分野で公知の様式で製造することができる。
医薬組成物は、塩として提供することができ、それだけに限らないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む酸を用いて形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒中により可溶性である傾向がある。他の場合では、好ましい製剤が、使用前に緩衝液と混合される、ポリソルベートなどの追加の物質を含んでいてもよい、ｐＨ範囲が４．５〜７．５の１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジンまたはリン酸塩またはＴｒｉｓ、０．１％〜２％のスクロースおよび／または２％〜７％のマンニトール中の凍結乾燥粉末であり得る。
許容される担体中に製剤化された本発明の化合物を含む医薬組成物を調製した後、これらを適当な容器に入れ、示される状態の治療用にラベルを付けることができる。抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体またはその抗原結合断片を投与するために、このようなラベルには、投与の量、頻度および方法が含まれるだろう。
キット
本発明はさらに、本発明の上記組成物の成分の１種または複数で充填された１つまたは複数の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。ヒト投与用の製品の製造、使用または販売の機関による承認を反映する、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式での通知がこのような（１又は複数の）容器に伴われ得る。
治療上有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物は、有効成分が意図された目的、すなわちＣＥＡＣＡＭ６発現を特徴とする特定の疾患状態の治療を達成するのに有効な量で含まれる組成物を含む。
有効用量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
本発明の新規な抗体、またはその抗原結合断片、またはその変異体の治療上有効量を決定することは、主として、特定の患者の特徴、投与経路、および治療される障害の性質に依存する。一般的な手引きは、例えばハーモナイゼーション国際会議の刊行物およびＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ｃｈａｐｔｅｒｓ ２７ ａｎｄ ２８，ｐｐ．４８４−５２８（１８ｔｈ ｅｄ．，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９９０）に見出され得る。より具体的には、治療上有効量を決定することは、医薬品の毒性および効力などの因子に依存する。毒性は、当技術分野で周知の方法を用いて決定することができ、前記参考文献に見出すことができる。効力は、実施例で以下に記載される方法と併せて同じ手引きを使用して決定することができる。
いずれの化合物についても、治療上有効用量を、細胞培養アッセイ、例えば新生細胞、または動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、ブタまたはサルで最初に推定することができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量および投与経路を決定することができる。
治療上有効用量とは、症状または状態を改善する抗体またはその抗原結合断片の量を指す。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）によって決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、比ＥＤ５０／ＬＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒト使用のための投与量の範囲を定式化するのに使用する。このような化合物の投与量は、好ましくは毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形、患者の感受性および投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与量は、治療される患者を考慮して個々の医師によって選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮に入れることができる追加の因子には、疾患状態の重症度、例えば腫瘍の大きさおよび位置；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度、（１又は複数の）薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐容性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、例えば、３〜４日毎、毎週、２週間に１回、または３週間に１回投与され得る。
通常の投与量は、投与経路に応じて、０．１〜１０００００μｇ、最大で約１０ｇの総用量まで変化し得る。特定の投与量および送達方法に関する手引きが文献に提供されている。米国特許第４６５７７６０号明細書；第５２０６３４４号明細書；または第５２２５２１２号明細書を参照されたい。当業者は、タンパク質またはその阻害剤とは異なるポリヌクレオチド用の製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的である。放射性標識抗体に好ましい比活性は、０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇのタンパク質に及び得る（Ｒｉｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５：３２７５−３２８０，１９９９；Ｕｌａｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ ２４６（３）：８９５−９０２）。
本発明のさらに好ましい実施形態は以下である：
１． ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
２． ヒトＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメイン（配列番号１７９の３５〜３２０位のアミノ酸によって表される）およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外ドメイン（配列番号１７７の３５〜３２０位のアミノ酸によって表される）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
３． ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
４． ヒトＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２によって表される）を含むタンパク質およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１（アミノ配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表される）を含むタンパク質に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
５． ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない、実施形態１から４のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
６． ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６、またはその成熟細胞外ドメイン、またはそのドメイン１に結合することができ、親和性が一桁以内の一価ＫＤである、実施形態１から５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
７． ヒトＣＥＡＣＡＭ６上への結合について９Ａ６抗体（Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）と競合する実施形態１から６のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
８． ＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を妨害する、実施形態１から７のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
９． 対照試料と比較してＩＦＮ−γ分泌増加、好ましくは≧１．５倍（１．５倍以上）の増加を特徴とするより活性化された表現型に向けて腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることができる、実施形態１から８のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
１０． 免疫調節を誘導することができる、実施形態１から９のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
１１． 腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌またはＩＦＮ−γ分泌活性化Ｔ細胞の数のいずれかによって測定される腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を緩和することができる、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
１２． 対照試料と比較してＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−α分泌増加、好ましくはＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２および／またはＴＮＦ−α分泌の≧１．５倍（１．５倍以上）の増加を特徴とするより細胞傷害性および／または活性化された表現型に向けて腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることができる、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
１３． ヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合する実施形態１から１２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含む抗体またはその抗原結合断片。
１４． ヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合する実施形態１３に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む抗体またはその抗原結合断片。
１５． Ｉｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、配列番号１７９番号付けによるＩｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない、実施形態１３または１４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
１６． ｉ．配列番号４８を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号４９を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号５０を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号５２を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号５３を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号５４を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉ． 配列番号１０６を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１１０を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１１を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１１２を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｉｉ． 配列番号４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｖ． 配列番号３４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号３５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号３６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号３８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号３９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号４０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖ． 配列番号１２０を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１２１を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１２２を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１２４を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１２５を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１２６を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉ． 配列番号２４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号２５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号２６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号２８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号２９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号３０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉ． 配列番号７６を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号７７を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号７８を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号８０を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号８１を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号８２を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｖｉｉｉ． 配列番号１３４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１３５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１３６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１３８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１３９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１４０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｉｘ． 配列番号１４８を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１４９を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１５０を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１５２を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１５３を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１５４を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘ． 配列番号１４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号２０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘｉ． 配列番号６２を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号６３を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号６４を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号６６を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号６７を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号６８を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
ｘｉｉ． 配列番号９２を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号９３を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号９４を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号９６を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号９７を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号９８を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域
を含む実施形態１から１５のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片。
１７． ｉ．配列番号４７によって示される可変重鎖配列と配列番号５１によって示される可変軽鎖配列、または
ｉｉ． 配列番号１０５によって示される可変重鎖配列と配列番号１０９によって示される可変軽鎖配列、または
ｉｉｉ． 配列番号３によって示される可変重鎖配列と配列番号７によって示される可変軽鎖配列、または
ｉｖ． 配列番号３３によって示される可変重鎖配列と配列番号３７によって示される可変軽鎖配列、または
ｖ． 配列番号１１９によって示される可変重鎖配列と配列番号１２３によって示される可変軽鎖配列、または
ｖｉ． 配列番号２３によって示される可変重鎖配列と配列番号２７によって示される可変軽鎖配列、または
ｖｉｉ． 配列番号７５によって示される可変重鎖配列と配列番号７９によって示される可変軽鎖配列、または
ｖｉｉｉ． 配列番号１３３によって示される可変重鎖配列と配列番号１３７によって示される可変軽鎖配列、または
ｉｘ． 配列番号１４７によって示される可変重鎖配列と配列番号１５１によって示される可変軽鎖配列、または
ｘ． 配列番号１３によって示される可変重鎖配列と配列番号１７によって示される可変軽鎖配列、または
ｘｉ． 配列番号６１によって示される可変重鎖配列と配列番号６５によって示される可変軽鎖配列、または
ｘｉｉ． 配列番号９１によって示される可変重鎖配列と配列番号９５によって示される可変軽鎖配列
を含む実施形態１から１６のいずれか１つ記載の抗体またはその抗原結合断片。
１８． ＩｇＧ抗体である、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の抗体。
１９． ｉ． 配列番号５７に相当する重鎖領域と配列番号５８に相当する軽鎖領域、または
ｉｉ． 配列番号１１５に相当する重鎖領域と配列番号１１６に相当する軽鎖領域、または
ｉｉｉ． 配列番号４３に相当する重鎖領域と配列番号４４に相当する軽鎖領域、または
ｉｖ． 配列番号１２９に相当する重鎖領域と配列番号１３０に相当する軽鎖領域、または
ｖ． 配列番号８５に相当する重鎖領域と配列番号８６に相当する軽鎖領域、または
ｖｉ． 配列番号１４３に相当する重鎖領域と配列番号１４４に相当する軽鎖領域、または
ｖｉｉ． 配列番号１５７に相当する重鎖領域と配列番号１５８に相当する軽鎖領域、または
ｖｉｉｉ． 配列番号７１に相当する重鎖領域と配列番号７２に相当する軽鎖領域、または
ｉｘ． 配列番号１０１に相当する重鎖領域と配列番号１０２に相当する軽鎖領域
を含む、実施形態１８に記載の抗体。
２０． ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片である、実施形態１から１７のいずれか１つに記載の抗原結合断片。
２１． モノクローナル抗体または抗原結合断片である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
２２． ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合断片である、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片。
２３． 実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
２４． 実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸配列。
２５． 実施形態２４に記載の核酸配列を含むベクター。
２６． 実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片を発現するおよび／または実施形態２４に記載の核酸もしくは実施形態２５に記載のベクターを含む単離細胞。
２７． 原核細胞または真核細胞である、実施形態２６に記載の単離細胞。
２８． 実施形態２７に記載の細胞を培養するステップと、前記抗体または抗原結合断片を精製するステップとを含む、実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片を作成する方法。
２９． 医薬品として使用するための実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体。
３０． 診断剤として使用するための実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体。
３１． がんを治療するための医薬品として使用するための実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体。
３２． 疾患を治療するための医薬品の製造における実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体。
３３． がんを治療するための医薬品の製造における実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体。
３４． 実施形態１から２２のいずれか１つに記載の抗体または抗原結合断片、または実施形態２３に記載の抗体−薬物複合体を含む医薬組成物。
３５． 実施形態３４に記載の医薬組成物と１種または複数の治療活性化合物の組み合わせ。
３６． ＣＥＡＣＡＭ６の望ましくない存在に関連する障害または状態を治療する方法であって、有効量の実施形態３４に記載の医薬組成物または実施形態３５に記載の組み合わせを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
３７． ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を調製する方法であって、配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表されるカニクイザルＣＥＣＡＭ６ドメイン１を含むタンパク質で、動物、好ましくはマウスを免疫化するステップと、ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体のアミノ酸配列を決定するステップと、場合により引き続いてキメラ抗体をヒト化または作成するステップと、前記抗体を組換え発現するステップとを含む方法。
［実施例］
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。実施例は、特定の実施形態を参照して本発明を説明するためだけに提供される。これらの例示は、本発明の特定の一定の態様を例示するものであるが、開示される発明の範囲を限定も制限もしない。
全ての実施例は、他に詳細に記載されている場合を除いて、当業者に周知であり日常的である標準的な技術を用いて実施した。以下の実施例の日常的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９．などの標準的な実験室マニュアルに記載されているように行うことができる。
［実施例１］
サルＣＥＡＣＡＭ６配列およびツール作成
使用される抗原および基準化合物のタンパク質配列の概要を表２に提供する。
Figure 2018510636
Figure 2018510636
Figure 2018510636
ヒトＣＥＡＣＡＭのタンパク質配列はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬデータベースから得た：ヒトＣＥＡＣＡＭ６（Ｐ４０１９９）、ヒトＣＥＡＣＡＭ１（Ｐ１３６８８）、ヒトＣＥＡＣＡＭ３（Ｐ４０１９８）、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（Ｐ０６７３１）、ヒトＣＥＡＣＡＭ８（Ｐ３１９９７）、ヒトＣＥＡＣＡＭ１９（Ｑ７Ｚ６９２）。ＣＥＡＣＡＭ６のアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（アカゲザル）タンパク質配列も入手可能であった（Ｆ６ＹＶＷ１）。共通のイントロン／エキソンスプライシング規則を適用すること、ｂ）異なるサル／霊長類タンパク質配列と比較すること、およびｃ）ヒト／霊長類／サル間のゲノム構造を保存することによって、ＣＥＡＣＡＭ６のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（カニクイザル）タンパク質配列を公的に入手可能なヌクレオチド配列から推定した。カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６はＴＰＰ−４１８９によって表される。
ＣＥＡＣＡＭの組換え細胞外ドメインを、商業的供給源から得た、または社内で作成した。この目的のために、細胞外ドメインに、第Ｘａ因子切断部位、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片ならびにＨｉｓタグをＣ末端に付加し、標準的な一過性トランスフェクション手順を用いてＨＥＫ２９３細胞で発現させた。タンパク質を、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製した。Ｆｃ部分を除去する必要がある場合、タンパク質を製造者の推奨による第Ｘａ因子（例えば、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．ＨＴＩ Ｎｏ．ＨＣＸＡ−００６０の第Ｘａ因子プロテアーゼ）で切断し、その後、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。ビオチン化タンパク質が必要な場合、市販のビオチン化キットを使用し（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ＃２１３４７のＥＺ−Ｌｉｎｋ Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ３−Ｂｉｏｔｉｎ）、ビオチン化の程度を市販のキットによって特徴付けた（例えばＰｉｅｒｃｅ＃２８００５のＢｉｏｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）。
ヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一Ｎ末端ドメイン１を、ｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３中で６ｘＨｉｓ融合タンパク質構築物として作成した。３７℃でＩＰＴＧを用いて一晩誘導した後、組換えタンパク質を単離し、封入体からリフォールディングした。リフォールディングの前に、封入体を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５中で洗浄し、８Ｍ尿素を含有し、界面活性剤を含有しない同じ緩衝液中で可溶化した。溶液を、５００ｍＭアルギニンを含有する５０ｍＭ ＣＨＥＳ ｐＨ９．２中にゆっくり希釈し（１：１０）、４℃で１６時間インキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５上の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中での標準ニッケル−ＮＴＡクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを行って精製を達成した。
９Ａ６マウスＩｇＧ１抗体（ＧＭ−０５０９）をＧｅｎｏｖａｃから得て、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２にキメラ化した。ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２のいずれかとしてのＮｅｏ２０１タンパク質配列の基礎は米国特許出願公開第２０１３０１８９２６８号明細書であった。全ての抗体を、標準的な一過性トランスフェクション手順を用いてＨＥＫ２９３細胞中で発現させ、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィーを介して細胞培養上清から精製した。
様々な全長ヒトＣＥＡＣＡＭ受容体を発現する安定なＨｅＬａ細胞株を作成した。そのため、以下の受容体の配列をトランスフェクトした：ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＴＰＰ−４１８５）、ヒトＣＥＡＣＡＭ３（ＴＰＰ−４１８７）、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（ＴＰＰ−４１８８）、ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−４６３９）、ヒトＣＥＡＣＡＭ８（ＴＰＰ−４１９０）、ヒトＣＥＡＣＥＡＭ１９（ＴＰＰ−４１８６）またはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−４１８９）。ＨｅＬａ細胞株は、ＦＡＣＳ分析によって確認されたように、表面上でこれらの受容体のいずれも内因的に発現せず、それぞれのＣＥＡＣＡＭ受容体のトランスフェクション後にのみ表面発現を検出することができた。手短に言えば、発現構築物をＵＣＯＥベースのベクター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）にクローニングし、ＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。ハイグロマイシンで選択した後、適当な抗体（ヒトＣＥＡＣＡＭ１：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの＃ＭＡＢ２２４４１；ヒトＣＥＡＣＡＭ５：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの＃ＭＡＢ４１２８１；ヒトＣＥＡＣＡＭ６：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓの＃ＭＡＢ３９３４；ヒトＣＥＡＣＡＭ８：ａｂｃａｍのａｂ９０２９４；ヒトＣＥＡＣＡＭ１９：Ｎｏｖｕｓの＃ＮＢＰ１−７０４９４；ヒトＣＥＡＣＡＭ３：Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍｓのＡＦ４１６６；カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６：Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１）を用いて、全細胞溶解物のウエスタンブロッティングならびに細胞表面のＦＡＣＳ染色によって適当な安定な抗体をスクリーニングした。
［実施例２］
免疫調節性９Ａ６−ｍＩｇＧ１抗体の特性評価
９Ａ６抗体は、免疫調節性であるとして文献に記載されている（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）。この抗体を、その親和性、他のヒトＣＥＡＣＡＭに対するその選択性、サルＣＥＡＣＡＭ６に対するその交差反応性、ＣＥＡＣＡＭ６上の一定のドメインへのその特異的結合、および他のヒトＣＥＡＣＡＭに対するその選択性に関して特徴付けた。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いた親和性測定
定量的結合分析のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐｓ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を備えたＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００またはＢｉａｃｏｒｅ ４０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて行った。結合アッセイを、アッセイ緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）を用いて２５℃で行った。アミン結合化学を介してチップ表面に共有結合的に固定された抗ｈＩｇＧ捕捉抗体で抗体を捕捉した。アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、製品記号ＢＲ−１０００−５０）からアミンカップリング用試薬（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、エタノールアミン−ＨＣｌ ｐＨ８．５）を使用した。ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００８−３９）およびマウス抗体捕捉キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１００８−３８）からそれぞれ、抗ｈＩｇＧ、抗ｍＩｇＧ捕捉抗体および固定化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０）を使用した。センサーチップ表面を、０．２ＭのＥＤＣおよび０．０５ＭのＮＨＳの新たに調製した溶液をチップ表面上に１０μｌ／分の流量で４２０秒間通過させることによって活性化し、引き続いて抗ｈＩｇＧまたは抗ｍＩｇＧ捕捉抗体（固定化緩衝液中に２５μｇ／ｍｌに溶解）を５μｌ／分の流量で１８０秒間注入した。過剰の活性化された基を、エタノールアミンの１モル濃度溶液を１０μｌ／分の流量で４２０秒間注入することによってブロッキングした。
ＣＥＡＣＡＭ抗原を分析物として使用してＫＤ値を決定した。各分析物を注入する前に、抗体を１０μｌ／分の流量で２０秒間捕捉した。動態学的親和性測定のために、アッセイ緩衝液（上記参照）中の１．５６〜２００ｎＭの間の種々の濃度のヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３、ヒトＣＥＡＣＡＭ５、ヒトＣＥＡＣＡＭ６、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６−ドメイン１タンパク質を、６０μｌ／分の流量で３分間捕捉抗体上に注入し、解離を１０分間監視した。
得られたセンサーグラムを二重に参照した、すなわち、インライン基準セル補正、引き続いてバッファ試料減算を行った。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアパッケージ（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００／Ｔ２００／４０００評価ソフトウェア、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）で実施された一次１：１ラングミュア結合モデルでセンサーグラムを全体的に当てはめることによって得られた解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数の比に基づいてＫＤ値を計算した。
ＳＰＲによるサンドイッチ競争実験
ＳＰＲによるサンドイッチ競争実験を、上に概説したのと同様の様式で、わずかな修正を加えて行った。最初に、分析すべき各抗体を、アミンカップリングを介してセンサー表面に共有結合的に固定化した（詳細は上記参照）。異なる抗体が一定のＣＥＡＣＡＭ抗原との結合について競合するかどうかを調べるために、それぞれの抗原を固定化抗体上への注入によって捕捉させ、その後、競合について試験すべき二次抗体を直ちに注入した。第２の抗体が、第１の抗体が結合した抗原に結合する場合（＋）、両抗体は競合を示さず、逆も同様であり、第２の抗体の注入によって結合が観察されない場合（−）、両抗体は類似のエピトープについて競合する。
ＥＬＩＳＡを用いたドメインマッピング研究
特定のエピトープ情報を解明するために、いくつかのキメラドメイン構築物を設計し、発現させ、精製した。手短に言えば、野生型ヒトＣＥＡＣＡＭ６配列を、ＨＥＫ２９３細胞で発現させたヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片とＣ末端融合させ、プロテインＡおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＴＰＰ−１７９０）を介して上清から精製した。異なるドメインキメラを作成するために、Ｆｃ融合ヒトＣＥＡＣＡＭ６において、単一ドメインのヒト配列を対応するアカゲザル配列（Ｆ６ＹＶＷ１）によって置き換えた。これにより、対照（ＴＰＰ−１３０６）としての野生型アカゲザルＦｃ融合体とともに、３つの異なるドメインキメラであるｈＤｏｍ１−ｈＤｏｍ２−ｍＤｏｍ３（ＴＰＰ−１７９３）、ｈＤｏｍ１−ｍＤｏｍ２−ｈＤｏｍ３（ＴＰＰ−１７９２）およびｍＤｏｍ１−ｈＤｏｍ２−ｈＤｏｍ３（ＴＰＰ−１７９１）が得られた。キメラに加えて、ヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一ドメイン１を、大腸菌（ＴＰＰ−１７９４）から上記のように作成した。
抗体のドメイン特異性のマッピングを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて行った：
ＥＬＩＳＡ分析のために、Ｆｃ融合ドメインキメラおよび単一ドメイン１をＮｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｂプレート上にコーティングし、ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ溶液でブロッキングした。ＩｇＧ濃度系列（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄した。ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン構築物に結合したＩｇＧの分析を、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）−ペルオキシダーゼ抗体（Ａ０２９３、Ｓｉｇｍａ）を介した検出を通して達成した。蛍光検出を、標準プロトコルにしたがって、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（Ａ１２２２２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。
ＥＬＩＳＡベースの結合分析
ＥＬＩＳＡを使用して種々のＣＥＡＣＡＭパラログおよびオルソログへの抗体の結合を特徴付けた。黒色３８４ウェルプレートを、３７℃で１時間、コーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ）中２μｇ／ｍｌの種々のＣＥＡＣＡＭタンパク質調製物２５μｌ／ウェルでコーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄した後、ウェルを３７℃で１時間、１００％Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ）でブロッキングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌに及ぶＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ中の抗体の希釈系列を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、適当な二次抗体を添加した。ＴＰＰ−１１７３などのヒトＦｃを有するタンパク質を検出するために、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ０１７０）を１：１０．０００希釈で使用した。ＴＰＰ−１７４４などのマウスＦｃを有するタンパク質を検出するために、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ３１４３２）を１：１０．０００希釈で使用した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋを希釈緩衝液として使用した。プレートを室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、プレートをＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で展開し、蛍光を５９０ｎｍの発光波長で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して、４パラメータの非線形曲線当てはめを用いてＥＣ５０値を計算した。
結果
ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する９Ａ６の一価親和性を測定し、サルＣＥＡＣＡＭ６に対するその交差反応性を評価するために、ＳＰＲ実験を上に概説されるように行った。結果を表３に示す：
Figure 2018510636
示されるように、９Ａ６−ｍＩｇＧ１は、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ６に高い親和性（２２ｎＭ）で結合することができる。しかしながら、アカゲザルＣＥＡＣＡＭ６への結合は検出されなかった。比較のために、Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１も試験した。この抗体は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６とサルＣＥＡＣＡＭ６の両方に対する高親和性結合を示した。要約すると、９Ａ６は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する高親和性結合を示すが、サルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性ではない。
ＣＥＡＣＡＭ６上の９Ａ６の結合ドメインをマッピングするために、異なるヒト／サルキメラに対する結合を、上に概説されるようにＥＬＩＳＡによって評価した。Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１（ＴＰＰ−１１７３）と比較することができるように、９Ａ６をヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ−１７４５）にキメラ化した。結果を表４に示す：
Figure 2018510636
９Ａ６は野生型ヒトＣＥＡＣＡＭ６、およびアカゲザルＣＥＡＣＡＭ６のドメイン２または３を使用するキメラに結合することができる。しかしながら、９Ａ６はアカゲザルＣＥＡＣＡＭ６のドメイン１または野生型アカゲザルＣＥＡＣＡＭ６を使用するキメラに結合することができない。これと一致して、９Ａ６はヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一ドメイン１に結合することができる。対照的に、Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一ドメイン１を除いて、試験した全ての形態に結合する。結論として、９Ａ６はヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１に結合する。
結果を実証するために、競合実験を上に概説するように行った。結果を表５に示す。
Figure 2018510636
表５から明らかなように、９Ａ６−ｍＩｇＧ１およびＮｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合について互いに競合しない。これはドメイン１の外側に存在するＮｅｏ２０１の公開エピトープと一致する。
異なるＣＥＡＣＡＭ６オルソログに対する９Ａ６の選択性を分析し、Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１との比較を可能にするために、９Ａ６をｈＩｇＧ１（ＴＰＰ−１７４５）にキメラ化した。上に概説されるように行ったＥＬＩＳＡ結合実験で、表６に列挙されるＥＣ５０値が得られた：
Figure 2018510636
ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する９Ａ６の高親和性結合が確認された。アカゲザルＣＥＡＣＡＭ６を用いたＳＰＲ実験と一致して、９Ａ６もカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に結合できない。しかしながら、ヒトＣＥＡＣＡＭ３またはＣＥＡＣＡＭ５への結合は観察されなかったので、９Ａ６はＣＥＡＣＡＭ６に対して選択的である。
対照的に、Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する同様の高親和性結合を示し、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性でさえある。Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ１はヒトＣＥＡＣＡＭ５に対する高親和性結合も示すので、これは低下した選択性で起こる。
［実施例３］
ＣＥＡＣＡＭのタンパク質配列アラインメント
ヒトＣＥＡＣＡＭ６の成熟細胞外形態（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９９．３のアミノ酸３５〜３２０）は、異なるドメイン：Ｎ末端ドメイン１（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇによる、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９９．３のアミノ酸３５〜１４２）、ドメイン２（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇによる、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９９．３のアミノ酸１４５〜２３２による）およびドメイン３（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇによる、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９９．３のアミノ酸２３７〜３１４）からなる。目的は、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して交差反応性であるが、ＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１に対して選択的で高親和性の抗体を同定することであったため、１個の分子に所望の特性を組み合わせる可能性を評価した。
この目的のために、ヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１のタンパク質配列を、標準設定を用いてＢｌａｓｔｐアルゴリズム（ＮＣＢＩ）を用いて他のタンパク質と比較して、最も関連性の高いＣＥＡＣＡＭ６ホモログを同定した。ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９９．３のアミノ酸３５〜３２０）、ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１３６８８．２のアミノ酸３５〜４２８）、ヒトＣＥＡＣＡＭ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４０１９８．２のアミノ酸３５〜１５５）、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０６７３１．３のアミノ酸３５〜４１７）およびカニクイザル（カニクイザル）ＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−４１８９のアミノ酸３５〜３２０）の（部分）成熟細胞外ドメインを、Ｐｈｙｌｏｓｏｐｈｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｅｄａｔａ）の「Ｇｌｏｂａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ−Ｗｉｌｂｕｒ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（ｆａｓｔ）」を用いて整列させた。アライメントを図１に示す。ヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１の他のＮ末端ドメインに対する配列同一性割合（アラインメントによる）を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて決定した。結果を表７に示す。
Figure 2018510636
図１の配列アライメントは、細胞外領域全体にわたるヒトＣＥＡＣＭ６およびヒトＣＥＡＣＡＭ３、ヒトＣＥＡＣＡＭ５およびヒトＣＥＡＣＡＭ１のタンパク質配列の非常に高度の類似性を示している。標的領域（ヒトＣＥＡＣＡＭ６のドメイン１）は、他のＣＥＡＣＡＭと特に類似しており、これは表７にも反映されている。ヒトＣＥＡＣＡＭ６のパラログは、カニクイザルのオルソログよりもヒトＣＥＡＣＡＭ６にはるかに類似している。実際、一次配列のＮ末端領域には、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６では同一であるが、他のヒトパラログのこの位置のアミノ酸とは異なる位置が２つしかない（図１中でアスタリスクで示される）。
結論として、選択的であるがサルＣＥＡＣＡＭ６に対して依然として交差反応性であるヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１に対する高親和性抗体を同定することは非常に困難である。
［実施例４］
ファージディスプレイによる抗体作成
ヒト抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を同定するために、ＤＹＡＸからのヒトＦａｂ−ファージライブラリーＦＡＢ−３００による種々の選択を本質的に以前に記載されたように実施した（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６）。表８に要約されるように、ストレプトアビジン−ビーズ上にコーティングされたヒトおよびカニクイザル（ＴＰＰ−１４３６およびＴＰＰ−２４４３）由来のビオチン化Ｆｃ−タグ組換えＣＥＡＣＡＭ６ならびにヒト腫瘍細胞株ＫＰＬ−４（Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９９ Ｆｅｂ；７９（５−６）：７０７−１７）（これは細胞表面上で多量の内因性標的タンパク質を発現している）を用いて、最大４ラウンドのファージ選択による異なる戦略を使用した。さらに、ＣＥＡＣＡＭ５（ＴＰＰ−１４３８；ｈＣ５）およびＣＥＡＣＡＭ１（ＴＰＰ−１４３７；ｈＣ１）（オフターゲット）または組換えヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｆｃ）に対するバインダーの枯渇を、タンパク質標的の各選択の前に示されるように含めた。例えば、戦略Ａでは、ヒトＣＥＡＣＡＭ１コーティングビーズ（ｈＣ１）上の枯渇後に、ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ｈＣ６）上で第１ラウンドのパニングを行った。得られた産物を分割し、一方の部分をヒトＣＥＡＣＡＭ６上の第２および第３ラウンドの選択のために使用した。他方の部分を、ＫＰＬ−４細胞上の第２ラウンドのパニング、ヒトＣＥＡＣＡＭ６上の第３ラウンド、およびＫＬＰ−４細胞上の最後の第４のパニングラウンドに使用した。戦略Ｃでは、マウスｍＡｂ ９Ａ６−ｍＩｇＧ１（ＴＰＰ−１７４４）を用いて特異的溶出ステップを行った。
Figure 2018510636
異なるラウンドの選択から濃縮したファージプールを、ＣＥＡＣＡＭ６発現細胞に対する記載されている（Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ；２３（３）：３４４−８）Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析によって標的およびオフターゲットに対するバインダーについてスクリーニングした。好都合なプロファイルを有するファージプールを、遺伝子ＩＩＩの除去およびその後のＥＬＩＳＡにおける可溶性ＦａｂのＥＬＩＳＡスクリーニングのために選択した。得られたｓＦａｂヒットのＤＮＡを配列決定し、ＫＰＬ−４細胞でのＦＡＣＳ分析によって特有の代表を細胞結合について特徴付けた（表９）。いくつかの戦略では、本発明によるファージバインダーをＩｇＧに直接再クローニングした。
Figure 2018510636
ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＴＰＰ−１４３７）、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（ＴＰＰ−１４３８）およびヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１４３６）のビオチン化変異体に対する、ファージディスプレイ選択され、精製されたＦａｂ断片（表９のリスト参照）の結合を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ３８４機器（Ｐａｌｌ ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｃｏｒｐ．）を用いてバイオレイヤー干渉法（ｂｉｏｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）によって分析した。ビオチン化抗原をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｐａｒｔ ｎｕｍｂｅｒ １８−５０１９）にロードし、アッセイ緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および０．０５％（ｖ／ｖ）アジ化ナトリウムを補足したＰＢＳ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｐａｒｔ番号１８−５０３２）へのベースライン平衡ステップ後、アッセイ緩衝液に希釈したＦａｂの２００ｎＭの最終濃度への結合を３００秒間監視し、引き続いて３００秒の解離期を監視した。
表９からの対応する精製Ｆａｂフラグメントも、ヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合を示したが、ヒトＣＥＡＣＡＭ５にもヒトＣＥＡＣＡＭ１にも結合は示さなかった。
ＦａｂがヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合について９Ａ６と競合するかどうかを分析するために、競合実験を行った。ここでは、ビオチン化ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１４３６）をＳＡバイオセンサーにロードし、Ｆａｂの結合反応を、９Ａ６−ｍＩｇＧ１（ＴＰＰ−１７４４）で飽和したロードＣＥＡＣＡＭ６で得られたＦａｂの結合反応と比較した（実施例１に概説）。９Ａ６の存在下での結合応答が有意に減少または消失する場合、これは、試験されたＦａｂが９Ａ６のエピトープと類似のエピトープに結合するという強い示唆である。
驚くべきことに、試験した全てのＦａｂが、ヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合について９Ａ６と競合することができた。
さらなる特性評価のために、Ｆａｂ配列をヒトＩｇＧ１フォーマットに再フォーマット化した。
組換えヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１４３６）に対して再フォーマット化された抗体の親和性（一価ＫＤ）を、実施例２に記載される実験手順と同様にＳＰＲによって決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００／４０００評価ソフトウェア）パッケージで実施された一次１：１ラングミュア結合モデルまたは定常状態親和性分析でセンサーグラムを全体的に当てはめることによってセンサーグラムを評価した。結果を表１０に示す：
Figure 2018510636
表１０から明らかなように、抗体はかなり低い一価親和性を示し、最低値（最高親和性）はＴＰＰ−１６７９については７６ｎＭであった。最も高い一価親和性を示す３つのＩｇＧを、ＥＬＩＳＡ結合実験（実施例２に示されるプロトコルと同様に行った）で、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対するそれらの選択性および交差反応性に関して分析した。
Figure 2018510636
要約すると、かなり低い一価親和性を有する抗体が得られた。これは、他のパラログへの結合を回避することによるトレードオフとなり得るだろう。それでも、選択性プロファイルはしばしば不十分である（表１１のＴＰＰ−１６７９およびＴＰＰ−１６６９参照）。試験した全ての抗体から、ＴＰＰ−１６７８が組換えカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して非常にわずかな交差反応性を有する唯一のものである（表１１参照）。
結論として、さらなる成熟なしにファージディスプレイを用いて得られた治療上有用な抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体はなかった。
［実施例５］
ファージディスプレイ由来抗体の抗体成熟
所望の親和性、選択性および交差反応性プロファイルを有する抗体を得るために、いくつかのファージディスプレイ由来抗体を親和性成熟させた。
そのため、ＴＰＰ−１６６９、ＴＰＰ−１６７８およびＴＰＰ−１６７９の全てのＣＤＲアミノ酸位置を個々に無作為化した。得られた変異体を発現させ、細胞上清中で結合ＥＬＩＳＡによって、複数のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバー（ヒトＣＥＡＣＡＭ６、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５）への結合について評価した。
ＴＰＰ−１６６９については、他のヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合を同時に増強することなくカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６への結合を増強する個々の突然変異を同定することはできなかった。
ＴＰＰ−１６７９については、他のヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合を付随して増強することなくヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合を増強するいくつかの個々の突然変異が同定され、全ての可能な順列を含む組換えライブラリーを作成した。対応する変異体をヒトＩｇＧ２アイソタイプとして発現させ、精製し、実施例２に記載される実験手順と同様にＳＰＲにより複数のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合について評価した。表１２は、この方法によって得られた選択された抗体の特性を要約している。
Figure 2018510636
表１２で得られた結果は、親和性および選択性の増強が十分可能であることを示している。しかしながら、これはまた、ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対する一価親和性に少なくとも１桁以内のカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６交差反応性バインダーを得るという課題を強調している。
ＴＰＰ−１６７８については、他のヒトＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合を付随して大きく増強することなくヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６への結合を増強するいくつかの個々の突然変異が同定され、いくつかの順列を含む組換えライブラリーを作成した。対応する変異体をヒトＩｇＧ２アイソタイプとして発現させ、精製し、実施例２に記載される実験手順と同様にＳＰＲにより複数のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーへの結合について評価した（表１３に要約）。
これらの抗体の結合特性を、結合ＥＬＩＳＡ（一価結合、ビオチン化ＣＥＡＣＡＭタンパク質）によっても決定した：抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ２１３６）のコーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ）中１：４４０希釈液を用いて黒色３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）を３７℃で１時間コーティングした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄した後、プレートを３７℃で１時間、１００％Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ）でブロッキングした。３回洗浄後、２μｇ／ｍｌの関連する抗体をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ中のプレートに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、関連するビオチン化ＣＥＡＣＡＭタンパク質のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ中の一連の希釈系列を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。３回の洗浄後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ中の１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓ５５１２）を添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。３回洗浄した後、プレートをＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で展開し、蛍光を５９０ｎｍの発光波長で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０ソフトウェアを使用して、４パラメータの非線形曲線当てはめを用いてＥＣ５０値を計算した。
実質的に改善された親和性、選択性および交差反応性プロファイルを有する変異体を、この方法によって得られた選択された抗体について表１３および表１４に要約されるように同定した。
Figure 2018510636
Figure 2018510636
結論として、ＴＰＰ−１６７８前駆体を使用して、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対して真の交差反応性であり、ＣＥＡＣＡＭ６に対して選択的であるヒトＣＥＣＡＣＡＭ６に対するわずかな高親和性ヒト抗体を得ることが可能であった：ＴＰＰ−３７０７のヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合は対応するＥＣ５０値を比較することによって判断した場合、ヒトＣＥＡＣＡＭ３への結合よりも約７３０倍優れている（ＴＰＰ−３７０５については６２０倍）。
［実施例６］
マウス免疫化による抗体作成
適用ＣＥＡＣＡＭ６に対するマウスモノクローナル抗体を作成するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスに施用した免疫原の配列に基づいて２つの異なる免疫化戦略を実施した（表１５の戦略ＡおよびＢ）。各戦略内で、マウスを、表１５に示されるように、５ラウンドの注射にわたって、抗原の足蹠または腹腔内施用を介して免疫化した。戦略Ａは、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６−Ｄｏｍａｉｎ１による免疫化に焦点を当てていたが、戦略Ｂは、免疫原としてのヒトとカニクイザル由来の全長細胞外ＣＥＡＣＡＭ６の組み合わせに基づいていた。
足蹠による免疫化は、１週間に１回、１μｇの抗原を５回注射することに基づいていた。腹腔内経路による免疫化は、隔週４回のＩＰ注射（抗原１０μｇ）、引き続いて静脈内注射による１回の追加免疫に基づいていた。
Figure 2018510636
最後の注射の４日後、マウスのリンパ節または脾臓細胞を標準的な方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｎａｔｕｒｅ．１９７５ Ａｕｇ ７；２５６（５５１７）：４９５−７）によって融合した。得られたハイブリドーマクローンのスクリーニングを、ビオチン化抗原およびオフターゲットタンパク質を用いてＥＬＩＳＡで行った（表１６に列挙）。より詳細には、マイクロタイタープレートを４℃で一晩、ヤギ抗マウス抗体でコーティングした。翌日、プレートを洗浄し、室温で２時間５％ＢＳＡでブロッキングし、引き続いて別の洗浄ステップを行った。ハイブリドーマ上清２０μｌをビオチン化抗原と共に室温で１時間インキュベートし、混合物をコーティングウェルに移し、引き続いてインキュベーションステップ（室温で１時間）を行った。プレートを洗浄した後、抗ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲートを室温で３０分間添加した。最後に、ウェルを洗浄し、ＴＭＢ５０μｌを添加して発色反応を生じさせ、プレートリーダーに記録した。
Figure 2018510636
驚くべきことに、戦略Ａのみが、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６交差反応性ならびに選択性に関して好ましいプロファイルを示すクローンをもたらした。さらに、いくつかの種特異的クローンが両戦略から得られた。
ＥＬＩＳＡによって陽性に選択された候補を、少なくとも３回のクローニングラウンドにわたってサブクローニングし、プロテインＡクロマトグラフィーにより腹水からより多量に作成した。
マウス免疫化由来の抗体を、細胞の状況においてＣＥＡＣＡＭ６への結合についても特徴付けた。ヒトまたはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現するＨｅＬａ細胞を、ハイブリドーマまたは精製されたｍＩｇ由来の上清のいずれかを用いたＦＡＣＳ実験に使用した（実施例１参照）。トランスフェクションされていないＨｅＬａ細胞は陰性対照として役立った。表１７はＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析から同定された候補のプロファイルを要約している：
Figure 2018510636
得られたマウス抗体を、精製ｍＩｇＧとしてＳＰＲ分析によりその一価親和性（ＫＤ）、他のヒトパラログに対する選択性およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する交差反応性の程度に関してより厳密に特徴付けた。
ＳＰＲは実施例２に記載される実験手順と同様に実施した。
結果を表１８に要約する：
Figure 2018510636
ＴＰＰ−２９６９およびＴＰＰ−２９７０については未解決の矛盾が観察された：最初のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析では、これらはカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６特異的であるように思われたが、後のＳＰＲ実験では、組換えヒトＣＥＡＣＡＭ６への結合も示した。
要約すると、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメイン１（ＡＰＰ−３２５）によるマウスの免疫化は、驚くべきことに、真にヒト−カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６交差反応性であり、同時に他のヒトパラログに関して選択的であるいくつかの抗体（例えば、ＴＰＰ−３１８６、ＴＰＰ−２９７１、ＴＰＰ−３１８７）をもたらした。これらの親和性は、治療目的の許容できる範囲内であるが、そのマウス起源および関連する免疫原性は、ヒトにおける治療用途を妨げる。
［実施例７］
抗体のヒト化
ヒトにおける治療用途に適した抗体を作成するために、選択されたマウス抗体をヒト化した。
マウスハイブリドーマ由来抗体の選択された配列を、それぞれのハイブリドーマ細胞株の抗体ｃＤＮＡを配列決定することによって決定した（表１７参照）。配列決定の結果によると、ＴＰＰ−３１００とＴＰＰ−３１８６は同一である。ＴＰＰ−３１０１は、単一重鎖であるが、２つの軽鎖配列を生じた。ＴＰＰ−２９７１とＴＰＰ−３１８７は非常に類似していた。これらは４個のアミノ酸が異なっていた（図２参照）。
抗体ＴＰＰ−２９７１およびＴＰＰ−３１８７の解読されたマウスＶＨおよびＶＬ配列を、Ｋａｂａｔの定義にしたがってヒト生殖系列フレームワークにＣＤＲを移植することによってヒト化した。例外として、ＨＣＤＲ２は部分的に移植した。このＣＤＲはＫａｂａｔの定義によると非常に長く（１６個のアミノ酸）、最初の９個のアミノ酸のみを移植した。これらのアミノ酸は、Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるとＨＣＤＲ２と同一であるＨＣＤＲ２の一部を表す（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲの定義については、Ａｎｄｒｅ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ” ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌｓ），Ｅｄｓ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ参照）。
ヒト生殖系列フレームワークは、マウスフレームワーク部分ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のヒトＶＨおよびＶＬならびにＪエレメント生殖系列配列のセットとの類似性検索に基づいて選択した。ＶＬについてはＩＧＫＶ１−９＊０１およびＩＧＫＪ２＊０１（同一性６９．６％、ＦＷ１；８６．７％、ＦＷ２；７１．９％、ＦＷ３；８０．０％、ＦＷ４）ならびにＶＨについてはＩＧＨＶ２−７０＊０１およびＩＧＨＪ６＊０１（（同一性：７３．３％（ＴＰＰ−２９７１）および７０．０％（ＴＰＰ−３１８７）、ＦＷ１；８５．７％、ＦＷ２；７１．９％、ＦＷ３；９０．９％、ＦＷ４））であった最良一致生殖系列配列（ＣＤＲを除く）にマウスＣＤＲを移植した。類似性検索に適用された生殖系列配列は、ＶＢＡＳＥ２データセットから得た（Ｒｅｔｔｅｒ Ｉ，Ａｌｔｈａｕｓ ＨＨ，Ｍｕｎｃｈ Ｒ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ：ＶＢＡＳＥ２，ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｖ ｇｅｎｅ ｄａｔａｂａｓｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ １；３３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１−４）。最も類似した生殖系列配列に割り当てられた名称は、ＩＭＧＴシステムからとった（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｇｉｎｅｓｔｏｕｘ，Ｃ．，Ｊａｂａｄｏ−Ｍｉｃｈａｌｏｕｄ，Ｊ．，Ｆｏｌｃｈ，Ｇ．，Ｂｅｌｌａｈｃｅｎｅ，Ｆ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｇｅｍｒｏｔ，Ｅ．，Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．，Ｌａｎｅ，Ｊ．，Ｒｅｇｎｉｅｒ，Ｌ．，Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ，Ｆ．，Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｇ．ａｎｄ Ｄｕｒｏｕｘ，Ｐ．ＩＭＧＴ（登録商標），ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３７，Ｄ１００６−Ｄ１０１２（２００９）；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｎ８３８））。
ＴＰＰ−２９７１由来のヒト化配列の２つの変異体：ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３７１４を作成した。ＴＰＰ−３３１０のＶＨでは、マウス始祖と比較してＪエレメントは変化しないままであったが、ＴＰＰ−３７１４のＶＨでは、Ｊエレメントが完全にヒト生殖細胞様にされていた（図３参照）。グリコシル化部位も不対合システインもヒト化配列中に見られなかった。
さらに、ＴＰＰ−３１８７由来のヒト化配列の２つの変異体：ＴＰＰ−３８２０およびＴＰＰ−３８２１を作成した（図４参照）。ＴＰＰ−３７１４と比較して、ＴＰＰ−３８２０のＶＨは、ＨＦＷ１の３０位にセリンの代わりにトレオニンおよびＨＦＷ２の４６位にアラニンの代わりにグリシンを含んでいた一方、ＶＬはＬＣＤＲ３の９２位および９３位に２個のセリン残基の代わりに２個のアスパラギン残基を含んでいた。これらの４つのアミノ酸交換は、ＴＰＰ−３１８７およびＴＰＰ−２９７１のマウス始祖配列間の相違を反映している。
ＴＰＰ−３８２１の可変ドメインＶＨはＴＰＰ−３７１４と同一であるが、ＶＬはＴＰＰ−３７１４と比較してＬＣＤＲ３の９２位および９３位に２個のセリン残基の代わりに２個のアスパラギン残基を含んでいた。これらの２つのアミノ酸交換は、ＴＰＰ−３１８７およびＴＰＰ−２９７１のマウス始祖配列間のＣＤＲの相違を反映している。グリコシル化部位も不対システイン残基もＴＰＰ−３８２０およびＴＰＰ−３８２１の配列中に見られなかった。
キメラ化抗体およびヒト化抗体の親和性決定およびサンドイッチ競合実験を、実施例２に記載される実験手順と同様にＳＰＲによって行い、結果を表１９および表２０に要約する：
Figure 2018510636
Figure 2018510636
選択性および交差反応性分析を、実施例５で提供されるプロトコルと同様に結合ＥＬＩＳＡ（一価、ビオチン化ＣＥＡＣＡＭタンパク質）によって行った。得られた結果を表２１に要約する。
Figure 2018510636
表１９の結果は、ＴＰＰ−２９７１、ＴＰＰ−３１８６およびＴＰＰ−３１８７が、９Ａ６−ｈＩｇＧ２と同一または類似のヒトＣＥＡＣＡＭ６上のエピトープについて競合することを示している。表２０および表２１の結果は、ＣＥＡＣＡＭ６に選択的であり、ＣＥＡＣＡＭ６パラログには結合しないが、真の交差反応性を有するヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する高親和性結合を強調している。
結論として、ヒト化は完全に成功し、抗体はマウス前駆体よりもずっと高い親和性を示し、ヒトにおける治療用途可能にした。
［実施例８］
細胞上の選択的ＣＥＡＣＡＭ６結合
真正抗原に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の結合および選択性を実証するために、抗体を、ＦＡＣＳ実験によって種々の細胞株の細胞表面上の天然ＣＥＡＣＡＭ６への結合について試験した。
ＣＥＡＣＡＭ６陰性であることが示されたＨｅＬａ野生型細胞の結合と比較して、種々のＣＥＡＣＡＭ受容体（ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３、ヒトＣＥＡＣＡＭ５、ヒトＣＥＡＣＡＭ６、ヒトＣＥＡＣＡＭ８、ヒトＣＥＡＣＡＭ１９およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６−実施例１参照）でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞のパネルについてＣＥＡＣＡＭ６選択性を試験した。ＥＣ５０値を、ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６トランスフェクトＨｅＬａ細胞への結合について決定した。結果を表２２に示す。
ＦＡＣＳ実験のために、ＨｅＬａ野生型細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＣＳで培養し、ＣＥＡＣＡＭ受容体トランスフェクトＨｅＬａ細胞はさらに０．５％ゲンタマイシン（ストック１０ｍｇ／ｍｌ、Ｆａ．ＰＡＡ）および２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（ストック５０ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を受容した。細胞をＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋で３回洗浄し、ＥＤＴＡ解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で非酵素的に培養プレートから剥がした。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋および熱不活性化３％ＦＣＳ）で洗浄し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ機（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。１ウェル当たり１０５個の細胞を蒔き、プレートシェーカー上でそれぞれの一次抗体（５μｇ／ｍｌ）と４℃で１時間、インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し（４００ｇ、５’）、二次抗体（ＰＥ−抗マウスまたは抗ヒトＩｇＧ、１：１５０希釈、Ｄｉａｎｏｖａ＃１１５−１１５−１６４、＃１０９−１１５−０９８）を含有する１００μｌに再懸濁し、プレートシェーカー上４℃でさらに１時間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。
ＥＣ５０分析のために、一次抗体を、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲の増加濃度で使用した。半最大結合値（ＥＣ５０）を、中央蛍光強度シグナルを濃度（対数スケール）に対してプロットすることによって決定した。データの曲線当てはめは、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄプリズム分析ソフトウェアを用いて行った。
Figure 2018510636
Figure 2018510636
抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を、ＦＡＣＳ分析によってＣＥＡＣＡＭ６を内因的に発現する異なるがん細胞株への結合についても試験した。細胞株を、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）によって提供されるプロトコルにしたがって培養した。観察された結合シグナルは、非結合アイソタイプ対照が蛍光シグナルをシフトさせなかったため特異的であった。半最大結合（ＥＣ５０）値は、低ナノモル範囲にある（表２３）。
Figure 2018510636
結論として、マウスＴＰＰ−２９７１、ＴＰＰ−３１００、ＴＰＰ−３１８６およびＴＰＰ−３１８７抗体ならびにヒトＴＰＰ−３８２０、ＴＰＰ−３８２１、ＴＰＰ−３３１０、ＴＰＰ−３７１４およびＴＰＰ−３７０７抗体について、ヒト真正細胞表面ＣＥＡＣＡＭ６への選択的結合が証明された（他のヒトパラログへの結合はない）。ヒトＣＥＡＣＡＭ６に対するこれらの抗体の結合は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６発現細胞株上の９Ａ６に匹敵する。ＴＰＰ−３３１０については、ヒト腫瘍細胞株上の内因的発現ＣＥＡＣＡＭ６への９Ａ６−ｈＩｇＧ２と同様の結合が実証された。
本発明の抗体はまた、一桁未満〜サブナノモルの結合ＥＣ５０範囲においてヒト受容体と同等の結合活性でカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に結合する一方、細胞表面上のカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６への９Ａ６の結合は１００ｎＭまで検出されなかった。この結果は本発明の抗体についてのヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に対する真の交差反応性を示す一方、９Ａ６は明らかにヒトＣＥＡＣＡＭ６に優先的に結合する。
［実施例９］
熱安定性分析
０．１３７ｍＬのセル体積を有するＶＰ−キャピラリーＤＳＣシステム（ＭｉｃｏＣａｌ Ｉｎｃ．）を用いる示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、ＩｇＧの熱安定性を調べた。全ての試料をＤＰＢＳ ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、タンパク質を含まない緩衝液対照を基準として使用した。１２０℃／時間の走査速度で２０℃から１２０℃まで試料を走査した。得られたサーモグラムを、緩衝液基準走査の減算によって補正し、Ｏｒｉｇｉｎ ７．０データ分析（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐ．）を用いてタンパク質濃度について正規化した。ＤＳＣデータをＯｒｉｇｉｎに付属の非線形回帰ルーチン（「Ｎｏｎ−２−ｓｔａｔｅ：Ｃｕｒｓｏｒ ｉｎｉｔ」）に当てはめることによって融点を得た。
Figure 2018510636
測定されたＩｇＧの全てがＦａｂドメイン内で高い熱安定性を示す。ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３７１４の熱安定性は著しく高く、ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）の熱安定性をはるかに上回っている。高い安定性はＶＨ３フレームワークを有する抗体と関連しているので（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２２（３）：１２１−１３４）、これは驚くべきことである。
高い熱安定性は、ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）（より優れた安定性、凝集傾向が少なく、免疫原性のリスクが低い）と比較して、ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３１７４のより優れた薬学的適合性を示す。
［実施例１０］
ＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１との間の相互作用の妨害
ＣＥＡＣＡＭ１が、活性化Ｔ細胞上トランスでＣＥＡＣＡＭ６の結合パートナーであり得ると仮定されている（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）：ＣＥＡＣＡＭ間のトランスおよびシスホモ親和性およびヘテロ親和性相互作用は、例えばＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ８の間で記載されている。ＣＥＡＣＡＭ１は活性化Ｔ細胞上に提示され、ＣＥＡＣＡＭ１連結およびリン酸化がＳＨ２ドメイン含有タンパク質チロシンホスファターゼ１（ＳＨＰ１）を動員する。ＳＨＰ１は、ＺＡＰ７０を脱リン酸化し、ＴＣＲシグナル伝達の阻害をもたらす。それにより、ＣＥＡＣＡＭ１連結が、活性化後１０分以内にＴ細胞活性化の早期阻害をもたらす。
さらに、結腸直腸がん細胞に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答の阻害におけるＣＥＡＣＡＭ５の役割が報告されており（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（６）：ｅ２１１４６）、これはＮＫ細胞上で発現される阻害性ＣＥＡＣＡＭ１に対するそのヘテロ親和性結合に基づき得るだろう。
そのため、直接的ＣＥＡＣＡＭ６−ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を、結合ＥＬＩＳＡで組換えタンパク質を用いて試験した。予備的実験でＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ６の穏やかであるが特異的な相互作用を検出することができることを確立した後、以下のプロトコルを使用した：黒色３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｂ ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ）を３７℃で１時間、コーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ）中１μｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＴＰＰ−１４３７）でコーティングした、または対照としてコーティングしないままにした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で１回洗浄した後、ウェルを３７℃で１時間、１００％Ｓｍａｒｔ Ｂｌｏｃｋ（Ｃａｎｄｏｒ）でブロッキングした。別々のプレートで、対象となる抗体のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％ＳｍａｒｔＢｌｏｃｋ中希釈系列を、２μｇ／ｍｌのＣＥＡＣＡＭ６−Ｆｃ（ＴＰＰ−１７９０）と共に室温で１時間インキュベートした。ブロッキングしたプレートを３回洗浄し、予め形成した抗体−ＣＥＡＣＡＭ６−複合体を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ Ａ１０７０）を１：１０．０００で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後、プレートをＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で展開し、蛍光を５９０ｎｍの発光波長で読み取った。
Figure 2018510636
表２５に示されるように、ＴＰＰ−３６８８（Ｎｅｏ２０１−ｈＩｇＧ２）を除いて試験した全ての抗体がＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用に競合することが可能であった。
結論として、この知見は、ａ）活性化Ｔ細胞上のＣＥＡＣＡＭ１が、Ｔ細胞の阻害をもたらすＣＥＡＣＡＭ６の可能な相互作用パートナーである、ｂ）ＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端Ｄ１ドメインがＣＥＡＣＡＭ１とＣＥＡＣＡＭ６の間の相互作用に関係している、およびｃ）本発明の抗体がＣＥＡＣＡＭ６−ＣＥＡＣＡＭ１相互作用を妨害することができるという仮説に一致する。
［実施例１１］
インビトロでのＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制活性の阻害
腫瘍細胞に対するＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制機能が最近インビトロ（Ｗｉｔｚｅｎｓ−Ｈａｒｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１３ Ｍａｙ ３０；１２１（２２）：４４９３−５０３）およびインビボ（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ６１，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ２２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｃｔｏｂｅｒ ６−８，２０１４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）で研究された。市販の９Ａ６抗体（Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）は、ＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制活性を阻害し、インビトロでのＴ細胞によるサイトカイン分泌の増強およびインビボでの抗腫瘍効果をもたらすことができることが示された。
ＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制活性に対する本発明の抗体の効果を試験するために、モデル腫瘍細胞株とモデル腫瘍抗原特異的Ｔ細胞クローンの共培養実験を行った：
腫瘍−抗原特異的Ｔ細胞を、Ｂｒａｃｋｅｒｔｚら（Ｂｒａｃｋｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１１ Ｍａｒ；１（３）：ｅ１１）に記載される手順によって作成した。手短に言えば、サバイビン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８特異的磁気活性化細胞選別を介して末梢単核細胞から単離した。単離したＨＬＡ−Ａ２−ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０μｇのＨＬＡ制限ペプチドエピトープサバイビン９５−１０４（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ）を負荷した同種異系ＨＬＡ−Ａ２＋樹状細胞で繰り返し刺激した。刺激後、増殖Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２／サバイビン９５−１０４多量体（ＡＰＣ、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ、＃Ｆ３９１−４Ａ−Ｅで標識したＡ＊０２：０１ ３９１ ＬＭＬＧＥＦＬＫＬサバイビン９６−１０４）で染色し、ＦＡＣＳ選別し、９６ウェルプレートでの限界希釈によってクローニングした。
２×１０５個のＴ細胞クローンと種々のドナー（１００〜１５０Ｇｙ）からの５×１０７個の照射ＰＢＭＣ（３０Ｇｙ）および１×１０７個の照射ＬＣＬ（ＥＢＶ感染サル細胞株（Ｂ９５／８、ＡＴＴＣ）による健常ドナーからの末梢血Ｂ細胞のＥＢＶ形質導入によって作成されたこれらのＢリンパ芽球様細胞株、Ｂｒａｃｋｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１１ Ｍａｒ；１（３）：ｅ１１ ａｎｄ Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ａｎｄｒｅａｓ Ｍｏｏｓｍａｎｎ，Ｌｕｄｗｉｇ−Ｍａｘｉｍｉｌｉａｎｓ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，２００２に記載）で構成されるフィーダー細胞を、グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０％ヒト血清（ヒトＡＢ血清、Ｖａｌｌｅｙ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ、＃ＨＰ１０２２）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地４０ｍｌ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養することによって、Ｔ細胞クローン増殖を行った。５０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、＃１００３７８０）、２．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（ｒｈＩＬ−１５−ＣＦ Ｒ＆Ｄ＃２４７＿ＩＬ−０２５／ＣＦ）および３０ｎｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １６−００３７−８５）の存在下で１４日間増殖を培養した。ＫＳヒト乳がん細胞株（Ｄｒ．ＢｒｉｇｉｔｔｅＧｕｃｋｅｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｕｂｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から入手）を、１０％ＦＣＳ（ＦＢＳ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
インビトロでのＣＥＡＣＡＭ６の免疫抑制機能に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の調節活性を分析するために、サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンをＣＥＡＣＡＭ６＋、ＨＬＡ−Ａ２＋およびサバイビン＋ヒト乳がん細胞株ＫＳと共に共培養し、Ｔ細胞活性についての読み取りとしてのＩＦＮ−γ分泌を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔまたはＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡのいずれかによって測定した。
共培養のために、ＫＳ腫瘍細胞を、ＰＢＳ−ＥＤＴＡを用いて５分間非酵素的に剥離し、遠心分離し、洗浄し、計数した。細胞濃度をＸ−Ｖｉｖｏ−２０（Ｌｏｎｚａ）で１×１０５個細胞／ｍｌに調節し、細胞を抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体またはアイソタイプ適合対照抗体を用いて氷上で１０分間前処理した。インキュベーションステップの後、１００００個のＫＳ標的細胞を、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔまたはＵ−９６−Ｗｅｌｌ ＥＬＩＳＡプレートにそれぞれ３連で直接播種した。その間に、サバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞を採取し、Ｘ−Ｖｉｖｏ−２０で洗浄し、ＫＳ標的細胞上に示される細胞数に播種した。腫瘍細胞、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体およびＴ細胞の共培養物を３７℃で２０〜４０時間インキュベートした。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭＡＢＴＥＣＨ：ヒトインターフェロンγ＃３４２０−３ＰＴ、抗体ｍＡＢ１−Ｄ１Ｋ抗ＩＦＮｇ、ｍＡＢ７−Ｂ６−１−ビオチン、ステプトビビン−ＡＬＰ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ＋ＥＬＩＳｐｏｔ＃３６５０用基質−１０についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）およびＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ（ＢＤヒトＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ＃５５５１４２）を製造者の指示にしたがって展開した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートをＣ．Ｔ．Ｌ．ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーで計数し、ＥＬＩＳＡプレートの光学濃度をＴｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダーで測定した。陽性対照ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）がアイソタイプ適合抗体対照と比較して統計学的に有意である場合、実験を有効であるとみなした。
抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の存在下でのＫＳ腫瘍細胞とサバイビンペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養は、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体で処理していない、またはアイソタイプ適合対照抗体で処理した試料と比較して、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の統計学的に有意な増加をもたらした（図５）。
結論として、カニクイザル交差反応性抗体ＴＰＰ−３３１０、ＴＰＰ−３７０７およびＴＰＰ−３３２３は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のＣＥＡＣＡＭ６媒介性免疫抑制を、サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌またはＩＦＮ−γ分泌活性化Ｔ細胞の数のいずれかによって測定されるように、ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）と同程度に緩和することができた。
［実施例１２］
抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体で処理したＴ細胞によって分泌されるサイトカイン／ケモカインプロファイルの分析
改善された細胞傷害性および有効な抗腫瘍免疫応答に向けたヒトＴ細胞サイトカイン／ケモカインプロファイルに対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の効果を試験するために、モデル腫瘍細胞株およびモデル腫瘍抗原特異的Ｔ細胞クローンの共培養実験のＬｕｍｉｎｅｘベースのマルチプレックスサイトカイン分析を行った。
サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを作成し、実施例１１に記載されるようにインビトロで増殖させた。腫瘍細胞培養およびＥＬＩＳＡ共培養を実施例１１に記載されるように行った。
２０時間の共培養の後、プレートを１４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。製造業者の指示にしたがって、ＢｉｏＰｌｅｘ１００システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でＭＩＬＬＩＰＬＥＸヒトサイトカイン／ケモカイン磁気ビーズパネル−プレミックス３８ Ｐｌｅｘ分析物（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＨＣＹＴＭＡＧ−６０Ｋ−ＰＸ３８）用いて多重分析を行った。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ６．０を用いて標準曲線および濃度を計算した。陽性対照ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）がアイソタイプ適合抗体対照と比較して１．５倍超増加した場合、実験を有効であるとみなした。
サバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞とＫＳ腫瘍細胞の共培養における本発明の抗体によるＣＥＡＣＡＭ６の遮断によって、アイソタイプ適合対照で処理した対照試料と比較してＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌の１．５倍超の増加がもたらされる（図６）。
結論として、カニクイザル交差反応性抗体ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３７０７は、ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）と同程度のＬｕｍｉｎｅｘベースの多重分析によって測定されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−αの増加を特徴とするより細胞傷害性および活性化表現型に向けてサバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることができる。
［実施例１３］
養子Ｔ細胞移植ＫＳモデルにおける抗腫瘍効果
抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体（９Ａ６；Ｇｅｎｏｖａｃ／Ａｌｄｅｖｒｏｎ）の抗腫瘍効果は、腫瘍抗原特異的ヒトＴ細胞をインビトロで増殖させ、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体と共にヒト異種移植片腫瘍を有するヌードマウスに同時注入する養子ヒトＴ細胞移植系においてインビボで研究されている（Ｋｈａｎｄｅｌｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｓｔｅｒ Ａｂｓｔｒａｃｔ ６１，Ｍｅｅｔｉｎｇ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ２２ｎｄ Ａｎｎｕａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｏｃｔｏｂｅｒ ６−８，２０１４，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）。
抗腫瘍効果に対する本発明の抗体の効果を試験するために、以下の養子Ｔ細胞移動実験を行った：
サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを作成し、実施例１１に記載されるようにインビトロで増殖させた。
６〜８週齢の雌ＮＯＤ−Ｓｃｉｄマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、フランス）に２×１０６個のＫＳ腫瘍細胞を皮下注射した（実施例１１参照）。１６日目にマウスの無作為化を実施し、４０ｍｍ２未満の腫瘍表面を有するマウスを除外した（＝腫瘍がない）。マウス（１群当たりｎ＝８〜１０匹のマウス）を２３日目および２７日目に５×１０６個のサバイビンペプチド特異的Ｔ細胞クローンの静脈内養子移植で処理した。抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体ＴＰＰ−３７４０、ＴＰＰ−３７０７、ＴＰＰ−３３１０またはそれぞれのアイソタイプ適合対照抗体２００μｇを、２２日目、２４日目、２６日目および２８日目に腹腔内投与した。対照群には、Ｔ細胞および抗体の代わりにＰＢＳを注射した。皮下に成長した腫瘍をキャリパーで測定し、次いで、表面を式「長さ×幅」を用いて計算した。ビヒクル処理対照群のマウスが試験の全期間を通じて腫瘍表面および腫瘍体積の安定した有意な増加を示した実験のみを有効とみなした。実験結果は、制御が困難なパラメータの影響を受けている可能性がある：ＫＳ細胞株のインビボ増殖が可変的であることが分かっただけでなく、マウス中のヒトＴ細胞の生存、腫瘍へのＴ細胞浸潤もかなりの変動を示した。
試験した抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体と組み合わせたサバイビン−ペプチド特異的Ｔ細胞の養子移植は、適合アイソタイプ対照またはＰＢＳ対照群を注射したＴ細胞と比較して、腫瘍量を減少させた（図７）。同様の効果が、ＴＰＰ−３７４０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）を用いて観察された。
結論として、カニクイザル交差反応性抗体ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３７０７は、サバイビンペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＫＳ腫瘍を用いた養子Ｔ細胞移植モデルにおいて、ＴＰＰ−３４７０（９Ａ６−ｈＩｇＧ２）と同程度の抗腫瘍効果を示した。
［実施例１４］
ＣＥＡＣＡＭ６陽性である腫瘍細胞株および腫瘍組織
ＣＥＡＣＡＭ６は、ＣＥＡＣＡＭ６免疫調節抗体による治療の潜在的標的適応症である種々のがんで発現される。そのため、異なる起源の種々のがんを表すがん細胞株を、ＦＡＣＳ分析によってＣＥＡＣＡＭ６発現について試験した。結果を表２６に示す。
アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などの公的組織バンクから取得したがん細胞株を、提供者の指示にしたがって培養した。
細胞をＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋で３回洗浄し、ＥＤＴＡ解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で非酵素的に培養プレートから剥がした。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋および熱不活性化３％ＦＣＳ）で洗浄し、細胞カウンタＣｏｕｎｔｅｓｓ機（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。１ウェル当たり１０５個の細胞を蒔き、プレートシェーカー上４℃で１時間、マウスモノクローナル抗体９Ａ６（ＴＰＰ−１７４４；５μｇ／ｍｌ）または精製ＮＡ／ＬＥマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３４４７）と共にインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し（４００ｇ、５’）、ＰＥ標識抗マウス二次抗体（１：１５０希釈、Ｄｉａｎｏｖａ＃１１５−１１５−１６４）を含有する１００μｌに再懸濁し、プレートシェーカー上４℃でさらに１時間インキュベートした。２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに再懸濁し、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはＦＡＣＳ Ａｒｒａｙ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。観察された結合シグナルは、非結合アイソタイプ対照が蛍光シグナルをシフトさせなかったため特異的であった（表２６）。
Figure 2018510636
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結論として、ＣＥＡＣＡＭ６は、ＣＥＡＣＡＭ６免疫調節抗体および他の応答修飾因子（例えば、ペプチド、小分子、人工足場結合剤など）による治療の潜在的な標的適応症を構成する種々のがん（例えば、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膵臓がん、胃がん、乳がんおよび多発性骨髄腫）を表す細胞株で発現される。
［実施例１５］
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の単一ドメイン１への結合
本発明の抗体がヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の単離された単一ドメイン１に結合することができるかどうかを試験するために、ＳＰＲ実験を実施例１のように行った。
カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−２４５３）の単一のＮ末端ドメイン１を、ＴＰＰ−１７９４と同様にして実施例１に記載されるように作成した：
Figure 2018510636
配列番号１８０（ＴＰＰ−２４５３）
ＭＱＬＴＩＥＳＲＰＦＮＶＡＥＧＫＥＶＬＬＬＡＨＮＬＰＱＮＴＬＧＦＮＷＹＫＧＥＲＶＤＡＫＲＬＩＶＡＹＶＩＧＴＱＱＴＴＰＧＰＡＨＳＧＲＥＭＩＹＳＮＡＳＬＬＩＱＮＶＴＱＮＤＴＧＳＹＴＬＱＡＩＫＥＤＬＶＴＥＥＡＴＧＲＦＷＶＹＰＥＬＧＳＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ
ヒトおよびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６の組換え単一ドメイン１に対する本発明の抗体の親和性（一価ＫＤ）を、実施例１に記載される実験手順と同様にＳＰＲによって決定し、表２７に示す。
Figure 2018510636
結論として、本発明の抗体は、同等の親和性でＣＥＡＣＡＭ６のヒトとカニクイザルＮ末端ドメイン１の両方に結合する。
［実施例１６］
ＦａｂフラグメントＡＰＰ−１５７４との複合体であるヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１のＸ線結晶構造
ＴＰＰ−３３１０に関連するＦａｂ断片（ＡＰＰ−１５７４と呼ばれる）に結合したヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１７９４；配列番号１６９）の単一Ｎ末端ドメイン１の結晶構造を決定した。
Ｆａｂ断片の産生を促進するために、ＴＰＰ−３３１０をヒトＩｇＧ１変異体（ＴＰＰ−５４６８と呼ばれる、表２８参照）として作成した。ＴＰＰ−５４６８のパパイン切断およびその後の精製により、ＡＰＰ−１５７４が得られる。このＦａｂ断片は、ＴＰＰ−３３１０の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む（表２８参照）。
Figure 2018510636
実施例１に詳述されるように、ＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１を大腸菌から発現させ、リフォールディングした。抗体をパパインで消化し、引き続いて複合体を形成することによってＦａｂ断片を作成した。次いで、タンパク質結晶学を使用して、ＡＰＰ−１５７４ Ｆａｂに結合したヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一Ｎ末端ドメイン１について原子分解を生じさせてエピトープを定義した。
タンパク質作成
ヒトＣＥＡＣＡＭ６（ＴＰＰ−１７９４；配列番号１６９）の単一Ｎ末端ドメイン１を、実施例１に記載されるように６ｘＨｉｓ融合タンパク質構築物として作成した。複合体形成の前に、タンパク質を６．７ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
ＴＰＰ−５４６８（ヒトＩｇＧ１）の対応するＦａｂ断片を、プロテアーゼパパインによる切断によって得た。抗体１ｍｇを、消化緩衝液（２０ｍＭリン酸Ｎａ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭシステイン−ＨＣｌ）中の固定化パパイン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃２０３４１）５０μｌと混合し、連続的に攪拌しながら３７℃で４時間インキュベートした。固定化パパインを遠心分離によって除去し、得られたＦｃ断片および非切断ＩｇＧをＭａｂＳｅｌｅｃｔＳＵＲＥ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃１１−００３４−８９ ＡＣ）を通過させることによって除去した。フロースルー中のＦａｂ断片を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５上の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でのサイズ排除クロマトグラフィーを介してさらに精製し、７．２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
複合体形成のために、精製されたＦａｂ断片およびヒトＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメイン１を、４℃で１時間、１ヒトＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメインに対して１Ｆａｂ対１．４ヒトＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメイン１の比で混合した。得られたタンパク質複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５上の３０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でのサイズ排除クロマトグラフィーによって単離し、結晶化前に２１．２ｍｇ／ｍｌにさらに濃縮した。
結晶化と構造決定
ヒトＣＥＡＣＡＭ６の単一Ｎ末端ドメイン１とＦａｂ断片ＡＰＰ−１５７４の複合体を２１．２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、２００００ｇで１０分間遠心分離し、結晶化についてスクリーニングした。データ収集のための結晶を、２０℃でハンギングドロップ蒸気拡散法によって成長させた。詳細には、複合体０．２μｌを、１００ｍＭクエン酸三ナトリウムｐＨ４．９、１９％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００および１０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールを含有するリザーバー溶液０．２μｌと混合した。次いで、液滴を同じリザーバー溶液８０μｌに対して平衡化させた。データ収集の前に、結晶を液体窒素中でフラッシュ冷却した。
ＢＥＳＳＹ ＩＩ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｈｅｌｍｈｏｌｔｚ Ｚｅｎｔｒｕｍ Ｂｅｒｌｉｎ）のビームライン１４−１で回折データを収集し、ＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．ＸＤＳ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５−１３２（２０１０））を用いて処理した。ヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１−Ｆａｂ断片ＡＰＰ−１５７４複合体のデータを、セル寸法ａ＝６４．７Å、ｂ＝６５．２Å、ｃ＝７８．６Å、α＝６６．１°、β＝８７．２°およびγ＝８８．５°の空間群Ｐ１で２．７Åに処理した。複合体の構造を、ヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１およびＦａｂの組織内構造を検索モデルとして使用して、ＰＨＡＳＥＲ（ＭｃＣｏｙ ＡＪ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｐｐｌ Ｃｒｙｓｔ（２００７）．４０，６５８−６７４）を用いて分子置換によって解析した。最終モデルをＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ Ｄ６６，４８６−５０１（２０１０））で構築し、ＣＣＰ４（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６７，２３５−２４２（２０１１））を用いて精製した。
エピトープを、ＣＣＰ４プログラム群でＮＣＯＮＴによって同定されたＦａｂ断片ＡＰＰ−１５７４（（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６７，２３５−２４２（２０１１））および表２９に列挙）の任意の原子まで５Å以内の原子を含有するヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１の残基として定義した。非対称単位（結晶中の最小の特有の単位）にヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１−Ｆａｂ断片ＡＰＰ−１５７４複合体の２つのコピーが存在する。両方のコピーに共通する抗体接触残基のみをエピトープ残基として列挙する。
エピトープ
ヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１−Ｆａｂ断片ＡＰＰ−１５７４複合体の結晶構造を使用して、ＣＥＡＣＡＭ６上のＦａｂ断片ＡＰＰ−１５７４のエピトープを同定した。Ｆａｂ断片ＡＰＰ−１５７４によるヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１上の相互作用表面は、いくつかの連続および不連続（すなわち、非隣接）配列；すなわち、表２９に詳述される残基Ｐｒｏ５９、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｇｌｙ６４、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ８６、Ｇｌｎ８８、Ｔｈｒ９０、Ｐｒｏ９１、Ｉｌｅ１２５、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９（配列番号１７９；ＴＰＰ−４６３９による番号付け）によって形成される。
抗体から３．６Å以下離れた少なくとも１つの原子を有する残基が極めて密接に直接接触している。これらの残基は、Ｇｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９（配列番号１７９；ＴＰＰ−４６３９による番号付け）である。
これらの残基は、Ｆａｂ断片ＡＰＰ−１５７４によって認識される代表的な三次元立体配座エピトープを形成する（図９および１０）。
Figure 2018510636
Figure 2018510636
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ＣＥＡＣＡＭ６Ｎ末端ドメイン１残基を配列番号１６９のように番号付けした。抗体残基を、その直鎖アミノ酸配列（配列番号１８３および配列番号１８４）に基づいて番号付けし、対応する鎖を標識する（重鎖については「Ｈ」、軽鎖については「Ｌ」）。ヒトＣＥＡＣＡＭ６単一Ｎ末端ドメイン１残基が、ＦａｂフラグメントＡＰＰ−１５７４の任意の原子まで５Åの少なくとも１個の原子を有することがここで示され、潜在的な水媒介相互作用を説明した。
エピトープを慎重に分析すると、ヒトＣＥＡＣＡＭ６のイソロイシン６３（配列番号１７９による）がエピトープの中心部であることが明らかになる。イソロイシン側鎖は、ＡＰＰ−１５７４と相補的な良好な形状を有する。モデル化は、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６のこの位置にあるロイシンが立体的に収容され、相互作用を妨げないことを示している。これは、カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６活性に対する保持された結合活性を説明し、ヒト−カニクイザル交差反応の基礎となる。対照的に、この位置のフェニルアラニン（ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５のように）は立体的に収容できず、結合活性の喪失をもたらす。これがＣＥＡＣＡＭ６選択性の基礎となる。
それにより、イソロイシン−６３（配列番号１７９による）の認識は、標的ＣＥＡＣＡＭ間の最も重要な「選択性チューナー」となる。ヒトＣＥＡＣＡＭ６のＡＰＰ−１５７４認識様式は、標的とオフターゲットとの間の重要な残基の差異を最適に利用する。Ｎ末端ドメイン１との複合体のＴＰＰ−１６７９のＦａｂ断片（選択性プロファイルが不十分である、実施例４参照）の構造の以前の分析も同様に、イソロイシン６３（配列番号１７９による）を潜在的選択性スイッチとして同定した（データは示さず）。しかしながら、ＴＰＰ−１６７９による分子認識機構が異なり、イソロイシン６３（配列番号１７９による）が結合部位周辺に位置するため、利用するのが困難であった。
要約すると、エピトープを形成する他の残基（表２９）に加えて、ＣＥＡＣＡＭ６の選択性および交差反応性決定残基であるイソロイシン６３（配列番号１７９による）との結合も最適に利用してよく、フェニルアラニンではなく、その位置にあるロイシンの収容を可能にするバインダーは、ＣＥＡＣＡＭ６選択性であるが、同時にヒト−カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６交差反応性である。
突然変異誘発
結合試験における構造分析の所見および予測を実証するために、ヒトＣＥＡＣＡＭ６のＮ末端ドメイン１の以下の突然変異体を作成した：
Figure 2018510636
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タンパク質を実施例１に記載されるように大腸菌で発現させ、リフォールディングし、精製した。ドメイン１野生型タンパク質および２つの単一突然変異に対する比較結合活性を、ＥＬＩＳＡ法によって決定した。ＰＢＳ中１．５ｕｇ／ｍｌタンパク質溶液を、３８４ Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｓｉｇｍａ、Ｐ６４９１）に一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ／Ｔで洗浄し、Ｓｍａｒｔ ｂｌｏｃｋ（ＣＡＮＤＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ、１１３１２５）でブロッキングした。その後、ＴＰＰ−３３１０、ＴＰＰ−１６７９およびアイソタイプ対照抗体の希釈系列をウェルに加えた。ＰＢＳ／Ｔで洗浄した後、結合した抗体を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤ（Ｓｉｇｍａ、Ａ０１７０）および１０μ ＭＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ１２２２２）で検出した。陽性結合シグナルを、蛍光（励起５３５ｎｍ／発光５９０ｎｍ）を介して検出した。表３２は、ドメイン１野生型タンパク質に対するＴＰＰ−３３１０の結合活性およびイソロイシン６３（配列番号１７９のような）のロイシン（カニクイザルのような）への突然変異を示す。アミノ酸位置６３（配列番号１７９のような）のフェニルアラニン（ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５のような）への突然変異は、結合能力の完全な喪失をもたらす。ＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメイン１タンパク質の効率的なリフォールディングの実証のための対照として、表３１で試験した全ての抗原と類似の程度の結合が観察されたＴＰＰ−１６７９を使用した（実施例４参照）。
Figure 2018510636
結論として、同時に他のヒトパラログに関して選択的である真のヒト−カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６交差反応性抗体ＴＰＰ−３３１０は、ヒトＣＥＡＣＡＭ６ Ｎ末端ドメイン１の文脈で、Ｉ６３Ｌ置換（配列番号１７９による）（カニクイザルＣＥＡＣＡＭ６残基に相当する）を許容することができたが、Ｉ６３Ｆ置換（配列番号１７９による）（ヒトパラログＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ５の対応する残基）を許容することはできず、Ｘ線結晶学から得られた結果と一致し、本発明者らの予測を実証した。
［実施例１７］
ＣＥＡＣＡＭ６抗体存在下でのＴ細胞媒介性細胞傷害の分析
Ｔ細胞媒介性細胞傷害に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の効果を、ＣＥＡＣＡＭ６陽性腫瘍細胞および異なる供給源由来のＴ細胞との共培養による細胞傷害性実験で試験した。これらのＴ細胞はＣＤ８＋サバイビンＴ細胞または膵臓がん由来の患者由来Ｔ細胞のいずれかであった。これらの腫瘍細胞死滅実験のために、インピーダンスに基づく細胞傷害性アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）システムを使用した。
サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンを作成し、実施例１１に記載されるようにインビトロで増殖させた。膵臓がん腫瘍浸潤リンパ球細胞株（ＴＩＬ）を、外科手術からの腫瘍組織の新鮮な初代培養から単離した。要約すると、新鮮な初代組織材料を小片に切断し、６０００ＩＵ／ＩＬ−２の２％ヒト血清アルブミン、２．５μｇ／ｍｌ Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ）中小皿で１０〜１８日間培養した。その後、上清から細胞を採取し、凍結または「急速拡大プロトコル」（ＲＥＰ）に直接使用した。ＴＩＬの急速拡大のために、凍結したＴＩＬを穏やかに解凍し、６０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含む完全リンパ球培地ＣＬＭ ＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃２１８７５０３４）、１０％ヒトＡＢ血清（ＭＩＬＡＮ Ａｎａｌｙｔｉｃａ＃００００８３）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃１５１４０１２２）、１％ ｍｌ ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ＃１５６３００５６）、０．０１％β−メルカプトエタノール［ストック５０ｍＭ］（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃３１３５００１０）中で１日間、０．６×１０６個細胞／ｍｌで培養した。ＴＩＬを採取し、Ｇ−ＲＥＸ−１００ Ｆｌａｓｋｓ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ＃８０５００Ｓ）中、４００ｍｌ ＲＥＰ培地（３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２および３０ｎｇ／ｍｌ ＯＫＴ−３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃１６−００３７−８５）を含有する５０％ＡＩＭ−Ｖ無血清培地（Ｇｉｂｃｏ ＃１２０５５０９１）と混合した５０％ＣＬＭ）で、３人の異なるドナーからの６０Ｇｙ照射フィーダーＰＢＭＣと１：１００の比で拡大させた。Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２ Ａｐｒ；３５（３）：２８３−９２に記載されているように、細胞を培養し、分裂させた。１４日後、細胞を採取し、アリコートで凍結した。共培養細胞傷害性アッセイの前に、ＴＩＬの個々のアリコートを緩やかに解凍し、６０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２を含有するＣＬＭ中で２日間およびＩＬ−２を含まないＣＬＭ中で１日間、０．６×１０６個細胞／ｍｌで培養した。
腫瘍細胞を、標準的なプロトコルおよび提供者の指示にしたがって培養した
Ｔ細胞媒介性細胞傷害を、インピーダンスに基づく細胞傷害性アッセイ（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ）システムで分析した。このラベルフリーアッセイシステムでは、細胞傷害性を、約１００〜１５０時間の長い時間（リアルタイム）にわたって直接かつ連続的に測定する。接着腫瘍細胞を９６ウェルＥプレート（Ｅ−Ｐｌａｔｅ ＶＩＥＷ ９６ ＰＥＴ；ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃ＩＤ：Ｈ０００５６８）の底部の微小電極に取り付け、これによりこれらの電極の電気インピーダンスが変化する。これを無次元の「セルインデックス」の増加として監視する。腫瘍細胞の接着（約２４時間）後、抗体およびＴ細胞をウェルに添加し、Ｔ細胞が細胞傷害活性を及ぼすと、腫瘍細胞の溶解および電極からの剥離が生じる。この剥離はウェルのインピーダンスを変化させ、「セルインデックス」またはＴ細胞添加の時点に正規化された「セルインデックス」である「正規化セルインデックス」の減少として測定される。Ｔ細胞単独では電極の電気インピーダンスに影響を与えず、したがって腫瘍細胞の細胞溶解のみが測定される。（Ｐｅｐｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ｍａｒ；４０５：１９２−８）
最初の実験で、本発明者らは、このアッセイ系で観察される腫瘍細胞死滅がＴ細胞用量依存性であり、異なる腫瘍細胞：Ｔ細胞の比および異なるＴ細胞源（サバイビンペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、膵臓がん患者由来のＴＩＬ）に働くことを確立した。
次いで、本発明者らは、サバイビンＴ細胞の細胞溶解効果に対する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の効果を試験した。そのため、サバイビンペプチド特異的Ｔ細胞を抗ＣＥＡＣＡＭ６ ｍＡｂと一緒に種々の細胞比で添加する前に、ＣＥＡＣＡＭ６陽性乳がんＫＳまたはＣＥＡＣＡＭ６トランスフェクト結腸がんＨＣＴ−１１６（ＨＣＴ１１６−ｈＣ６）を９６ウェルプレートに２４時間添加した。共培養を約１００時間の期間続けた。これらの実験で、本発明者らは、両細胞株上、約２１％の抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３４７０が存在下で改善されたＴ細胞依存性細胞傷害性を観察した。結果を１つの細胞比について例示的に図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。注目すべきことに、サバイビン−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞単独で、４５〜６２％の高い細胞傷害効果を既に示しており、これはおそらく培養されたＴ細胞の予備活性化によるので、バックグラウンド細胞溶解とみなされる。要約すると、以前のＥＬＩＳＡアッセイで観察されたＩＦＮ−γ分泌の増加は、共培養の約２４時間以内の細胞傷害性効果となる。本発明者らは、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体によるＣＥＡＣＡＭ６陽性腫瘍細胞の治療が、両腫瘍細胞株のサバイビンペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性死滅改善をもたらすと結論づける。
その後の実験で、本発明者らは、膵臓がんの患者由来ＴＩＬ細胞の細胞溶解活性に対するＣＥＡＣＡＭ６抗体の効果を試験した。そのため、ＣＥＡＣＡＭ６陽性肺がん細胞株ＨＣＣ２９３５を９６ウェルプレートに添加し、２４時間培養した。次いで、ＣＥＡＣＡＭ６抗体（３０μｇ／ｍｌ）および二重特異性抗体抗ＣＤ３ｘ抗ＥＰＣＡＭ ＩｇＧ（０．２５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で異なる比でＴＩＬを添加して（Ｍａｒｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００２ Ｓｅｐ １０；１０１（２）：１８３−９；Ｓａｌｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００９ Ｓｅｐ；１３（９Ｂ）：４０２３−３３）ＨＬＡ非依存性Ｔ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を可能にした。抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体ＴＰＰ−３３１０およびＴＰＰ−３４７０の存在下で、本発明者らは、アイソタイプ適合対照抗体の存在下で観察されなかったインピーダンスの完全な低下を観察した。インピーダンスの低下は、標的細胞株ＨＣＣ２９３５の完全な細胞溶解性死滅として解釈される。さらなる実験で、ＣＥＡＣＡＭ６抗体ＴＰＰ−３３１０の効果が用量依存性であり、０．６２〜０．２１μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が決定されることを実証することができた。図１２はＴＩＬ−１２の結果を例示的に示している。
要約すると、これらの実験は、本発明のＣＥＡＣＡＭ６抗体が、免疫抑制受容体ＣＥＡＣＡＭ６を有効に遮断し、ＣＥＡＣＡＭ６陽性腫瘍細胞に対してモデルＴ細胞だけでなく、患者由来の腫瘍浸潤リンパ球の細胞傷害効果を改善する可能性を有することを示している。
［配列表］
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Claims (28)

  1. ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 配列番号１７９のアミノ酸３５〜１４２および配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表されるＣＥＡＣＡＭ６ドメイン１に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  3. ヒトＣＥＡＣＡＭ１、ヒトＣＥＡＣＡＭ３およびヒトＣＥＡＣＡＭ５と有意には交差反応しない、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. ＣＥＡＣＡＭ６とＣＥＡＣＡＭ１の相互作用を妨害する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  5. 対照試料と比較してＩＦＮ−γ分泌増加、好ましくは≧１．５倍の増加を特徴とするより活性化された表現型に向けて腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のサイトカインプロファイルを変化させることができる、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. ヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合する請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが配列番号１７のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９からなる群から選択される１個または複数のアミノ酸残基を含む抗体またはその抗原結合断片。
  7. ヒトＣＥＡＣＡＭ６のエピトープに結合する請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、前記エピトープが配列番号１７９のＧｌｎ６０、Ａｓｎ６１、Ａｒｇ６２、Ｉｌｅ６３、Ｖａｌ８３、Ｉｌｅ８４、Ｇｌｙ８５、Ｔｈｒ９０、Ｓｅｒ１２７、Ａｓｐ１２８およびＬｅｕ１２９のアミノ酸残基を含む抗体またはその抗原結合断片。
  8. Ｉｌｅ６３Ｌｅｕ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合し、配列番号１７９によるＩｌｅ６３Ｐｈｅ突然変異を含むヒトＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に結合しない、請求項６または７に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  9. ｉ．配列番号４８を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号４９を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号５０を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号５２を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号５３を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号５４を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｉｉ．配列番号１０６を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１０７を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１０８を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１１０を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１１１を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１１２を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｉｉｉ．配列番号４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｉｖ．配列番号３４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号３５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号３６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号３８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号３９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号４０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｖ．配列番号１２０を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１２１を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１２２を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１２４を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１２５を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１２６を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｖｉ．配列番号２４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号２５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号２６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号２８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号２９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号３０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｖｉｉ．配列番号７６を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号７７を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号７８を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号８０を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号８１を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号８２を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｖｉｉｉ．配列番号１３４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１３５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１３６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１３８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１３９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１４０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｉｘ．配列番号１４８を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１４９を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１５０を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１５２を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１５３を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号１５４を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｘ．配列番号１４を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号１５を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号１６を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号１８を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号１９を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号２０を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｘｉ．配列番号６２を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号６３を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号６４を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号６６を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号６７を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号６８を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域、または
    ｘｉｉ．配列番号９２を含むＨ−ＣＤＲ１、配列番号９３を含むＨ−ＣＤＲ２および配列番号９４を含むＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖抗原結合領域と配列番号９６を含むＬ−ＣＤＲ１、配列番号９７を含むＬ−ＣＤＲ２および配列番号９８を含むＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖抗原結合領域
    を含む請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  10. ｉ．配列番号４７によって示される可変重鎖配列と配列番号５１によって示される可変軽鎖配列、または
    ｉｉ．配列番号１０５によって示される可変重鎖配列と配列番号１０９によって示される可変軽鎖配列、または
    ｉｉｉ．配列番号３によって示される可変重鎖配列と配列番号７によって示される可変軽鎖配列、または
    ｉｖ．配列番号３３によって示される可変重鎖配列と配列番号３７によって示される可変軽鎖配列、または
    ｖ．配列番号１１９によって示される可変重鎖配列と配列番号１２３によって示される可変軽鎖配列、または
    ｖｉ．配列番号２３によって示される可変重鎖配列と配列番号２７によって示される可変軽鎖配列、または
    ｖｉｉ．配列番号７５によって示される可変重鎖配列と配列番号７９によって示される可変軽鎖配列、または
    ｖｉｉｉ．配列番号１３３によって示される可変重鎖配列と配列番号１３７によって示される可変軽鎖配列、または
    ｉｘ．配列番号１４７によって示される可変重鎖配列と配列番号１５１によって示される可変軽鎖配列、または
    ｘ．配列番号１３によって示される可変重鎖配列と配列番号１７によって示される可変軽鎖配列、または
    ｘｉ．配列番号６１によって示される可変重鎖配列と配列番号６５によって示される可変軽鎖配列、または
    ｘｉｉ．配列番号９１によって示される可変重鎖配列と配列番号９５によって示される可変軽鎖配列
    を含む請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  11. ＩｇＧ抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
  12. ｉ．配列番号５７に相当する重鎖領域と配列番号５８に相当する軽鎖領域、または
    ｉｉ．配列番号１１５に相当する重鎖領域と配列番号１１６に相当する軽鎖領域、または
    ｉｉｉ．配列番号４３に相当する重鎖領域と配列番号４４に相当する軽鎖領域、または
    ｉｖ．配列番号１２９に相当する重鎖領域と配列番号１３０に相当する軽鎖領域、または
    ｖ．配列番号８５に相当する重鎖領域と配列番号８６に相当する軽鎖領域、または
    ｖｉ．配列番号１４３に相当する重鎖領域と配列番号１４４に相当する軽鎖領域、または
    ｖｉｉ．配列番号１５７に相当する重鎖領域と配列番号１５８に相当する軽鎖領域、または
    ｖｉｉｉ．配列番号７１に相当する重鎖領域と配列番号７２に相当する軽鎖領域、または
    ｉｘ．配列番号１０１に相当する重鎖領域と配列番号１０２に相当する軽鎖領域
    を含む、請求項１から５および請求項９から１０のいずれか一項に記載の抗体。
  13. ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片またはＦ（ａｂ’）２断片である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗原結合断片。
  14. モノクローナル抗体または抗原結合断片である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  15. ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体または抗原結合断片である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片を含む、抗体−薬物複合体。
  17. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸配列。
  18. 請求項１７に記載の核酸配列を含むベクター。
  19. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を発現するおよび／または請求項１７に記載の核酸もしくは請求項１８に記載のベクターを含む単離細胞。
  20. 原核細胞または真核細胞である、請求項１９に記載の単離細胞。
  21. 請求項２０に記載の細胞を培養するステップと、前記抗体または抗原結合断片を精製するステップとを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片を作成する方法。
  22. 医薬品として使用するための請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片、または請求項１６に記載の抗体−薬物複合体。
  23. 診断剤として使用するための請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片、または請求項１６に記載の抗体−薬物複合体。
  24. がんを治療するための医薬品として使用するための請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片、または請求項１６に記載の抗体−薬物複合体。
  25. 請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片、または請求項１６に記載の抗体−薬物複合体を含む医薬組成物。
  26. 請求項２５に記載の医薬組成物と１種または複数の治療活性化合物の組み合わせ。
  27. ＣＥＡＣＡＭ６の望ましくない存在に関連する障害または状態を治療する方法であって、有効量の請求項２５に記載の医薬組成物または請求項２６に記載の組み合わせを、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
  28. ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体を調製する方法であって、配列番号１７７のアミノ酸３５〜１４２によって表されるカニクイザルＣＥＣＡＭ６ドメイン１を含むタンパク質で、動物、好ましくはマウスを免疫化するステップと、ヒトＣＥＡＣＡＭ６およびカニクイザルＣＥＡＣＡＭ６に特異的に結合する抗体のアミノ酸配列を決定するステップと、場合により引き続いて抗体をヒト化またはキメラ抗体を作成するステップと、前記抗体を組換え発現するステップとを含む方法。
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