TWI719969B - 抗-ｃｅａｃａｍ６抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供重組的抗原-結合區和抗體及含有此抗原-結合區之功能性片段，其對人類和食蟹獼猴(Macaca fascicularis)CEACAM6(癌胚抗原相關細胞黏附分子6,CD66c，非專一性交叉反應抗原，NCA,NCA-50/90)具專一性，且不會與密切相關之人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應。本發明進一步係提供產生此種抗體之方法。
此等抗體，因此可用於治療癌症和其他與CEACAM6表現有關的病症及症狀。本發明亦提供編碼前述抗體之核酸序列、含有彼等之載體、醫藥組成物及含有使用說明之套組。

Description

抗-CEACAM6抗體及其用途
本發明係提供重組的抗原-結合區和抗體及含有此抗原-結合區之功能性片段，其對人類和食蟹獼猴(Macaca fascicularis)CEACAM6(癌胚抗原相關細胞黏附分子6,CD66c，非專一性交叉反應抗原，NCA,NCA-50/90)具專一性，且因此不會與密切相關之人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著地交叉反應。本發明進一步係提供產生此種抗體之方法。
此等抗體，因此可用於治療癌症和其他與CEACAM6表現有關的病症和症狀。本發明亦提供編碼前述抗體之核酸序列、含有彼等之載體、醫藥組成物及含有使用說明之套組。
抗體治療為一有效及臨床上已建立的各種癌症(包括實體腫瘤)之治療。例如，HERCEPTIN®已成功地用於治療乳癌而RITUXAN®對於B-細胞相關癌症類型為有效的。開發新穎成功的抗體治療最重要的為分離抗細胞表面蛋白之抗體，而該抗細胞表面蛋白已發現係擇優地表現在目標細胞上(例如癌細胞、免疫細胞等)，其能在功能上修飾對應受體之活性。
用於免疫細胞活化及因此用於癌症免疫治療之免疫檢測點分子的抗體阻斷為臨床上確證有效的方法。在2011年，CTLA-4阻斷抗體易普利單抗(Ipilimumab)，FDA已核准作為轉移性黑色素瘤之2線治療(Yervoy)。另外的實例為阻斷PD-1/PD-L1軸，就此已核准數種藥物或目前處於臨床開發且其於黑色素瘤、RCC和肺癌之顯赫的臨床反應已有報告提出(Henick et al., Expert Opin Ther Targets.2014 Dec；18(12)：1407-20))。
癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM)家族屬於免疫球蛋白(Ig)超基因家族且一般具有經辨識為N區之類可變(V)區。N區接著為無或至高6個類恆定C2 Ig區(稱為A或B)。這些胞外區為CEACAM功能性所需為同嗜性和異嗜性細胞間黏附分子(Obrinck,Curr Opin Cell Biol.1997 Oct；9(5)：616-26)或為人類和嚙齒類病原受體(Kuespert et al.,Curr Opin Cell Biol.2006 Oct；18(5)：565-71；Voges et al.,PLoS One.2012；7(6)：e39908)。CEACAM受體係聯結成二聚體或寡聚體或與其他夥伴在細胞膜多重聯結且因此調節重要功能。除了在人類組織表現外，CEACAM基因家族在27種其他的哺乳動物物種中為高保守性及最佳地係描述於小鼠、大鼠、牛、狗、鴨嘴獸和負鼠中(Kammerer and Zimmermann,BMC Biol.2010 Feb 4；8：12)。CEACAM之最佳特徵性生物功能為經由同嗜性和異嗜性相互作用來支持細胞黏附，包括在分化作用及形成三維組織結構、血管新生、細胞凋亡、腫瘤抑制和轉移中的角色(Kuespert et al.,Curr Opin Cell Biol.2006 Oct；18(5)：565-71)。更詳細的家族成員係描述於其他的評論中(Horst and Wagener,Handb Exp Pharmacol.2004；(165)：283-341；Gray-Owen and Blumberg,Nat Rev Immunol.2006 Jun；6(6)：433-46)。
CEACAM6(癌胚抗原相關細胞黏附分子6,CD66c，非專一性交叉反應抗原，NCA,NCA-50/90)為一糖基化磷脂醯肌醇(GPI)-連結的細胞表面蛋白，其帶有一個N-區和2個類C2區，係經由其具有各種膜受體(其中有一些已鑑定出)的胞外區，媒介許多可能的順式或反式導向的CEACAM相互作用(Beauchemin and Arabzadeh,Cancer Metastasis Rev.2013 Dec；32(3-4)：643-71)。
CEACAM6係表現在各種正常人類組織，例如結腸(Blumenthal et al.,BMC Cancer,2007,Jan 3；7：2.)、肺(Kolla et al.,Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 296：L1019-L1030)和粒細胞(Kuroki et al.,Biochem Biophys Res Commun.1992 Jan 31；182(2)：501-6)之表皮上。在粒細胞系中，CEACAM6係表現在粒細胞成熟的所有階段，但早期細胞特化的前驅細胞除外(Strickland et al.,J Pathol.2009 Jul；218(3)：380-90)；Schölzel et al.,American Journal of Pathology,156(2),595-605)。CEACAM6並未表現在嚙齒類(Beauchemin et al.,Exp Cell Res.1999 Nov 1；252(2)：243-9)。
就數種癌症，CEACAM6表現已有描述。在結腸癌中，55%的案例CEACAM6為上調的且為能讓病患再細分成低風險和高風險族群的獨立預後因子(Jantscheff et al.,J Clin Oncol.2003 Oct 1；21(19)：3638-46)。在胰腺癌中，發現92%(n=82)的分析樣本為陽性的，同時在高度PanIN病灶上比在低度病灶上CEACAM6表現更普遍(Duxbury et al.,Ann Surg.2005 Mar；241(3)：491-6)。此項在另一個研究中確認了，其中>90%的侵入性胰腺癌(受檢115個中有110個)顯示充沛(過度)表現CEACAM6(Strickland et al.,J Pathol.2009 Jul；218(3)：380-90)。此外，Blumenthal等人提出CEACAM6表現在乳房腫瘤、胰臟腫瘤、卵巢腺癌、肺腺癌、淋巴結轉移瘤和乳房腫瘤、結腸腫瘤和肺腫瘤之轉移瘤中(Blumenthal et al.,BMC Cancer.2007 Jan 3；7：2)。
其他人亦有提出CEACAM6表現在乳癌中(Maraqa et al.,Clin Cancer Res.2008 Jan 15；14(2)：405-11；Poola et al.,Clin Cancer Res.2006 Aug 1；12(15)：4773-83；Balk-Moller et al.,Am J Pathol.2014 Apr；184(4)：1198-208)；Tsang et al.,Breast Cancer Res Treat.2013 Nov；142(2)：311-22)。此外已有提出CEACAM6表現在多發性骨髓瘤(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)、胃癌(Deng et al.,Genet Mol Res.2014 Sep 26；13(3)：7686-97)和頭頸癌中(Cameron et al.,Mol Cancer.2012 Sep 28；11：74)。
實驗證據支持了CEACAM6為轉移之重要調節因子的角色。Kim等人已顯示，使用CEACAM6-專一性siRNA分別減弱LoVo細胞中CEACAM6表現或增加其在HCT116細胞中的表現，經由胞外基質阻礙或擴大侵入性(Kim et al.,Clin Chim Acta.2013 Jan 16；415：12-9)。抑制CEACAM6表現使得上皮鈣黏素(E-cadherin)促進子活性升高。Blumenthal等人顯示，CEACAM5和CEACAM6造成CRC轉移性傳播，其在活體內可被單株抗體阻斷(Blumenthal et al.,BMC Cancer.2007 Jan 3；7：2)。亦顯示，CEACAM6係表現在能形成富含幹細胞之結腸細胞球體的結腸癌樣本中CD133-陽性細胞， 就其增生、群落形成潛力以及活體內腫瘤發生潛力在其靜默後，明顯受阻(Gemei et al.,Cancer.2013 Feb 15；119(4)：729-38)。在乳癌中，其顯示他莫西芬(tamoxifen)阻抗的樣本為CEACAM6過度表現且CEACAM6為一疾病發生之明顯的預測因子(Maraqa et al.,Clin Cancer Res.2008 Jan 15；14(2)：405-11)。在MMU1-他莫西芬-阻抗的MCF7細胞衍生物中，siRNA媒介的CEACAM6靜默反轉了內分泌抗性、這些細胞的非錨定依賴性和侵入性質(Lewis-Wambi et al.,Eur J Cancer.2008 Aug；44(12)：1770-9)。在肺腺癌中，CEACAM6表現明顯與不良的臨床結果有關(Kobayashi et al.,Br J Cancer.2012 Nov 6；107(10)：1745-53)。在胰臟癌中，以siRNA靜默CEACAM6反轉了Mia(AR)胰臟腫瘤細胞之獲得性失巢凋亡(anoikis)抗性。Capan2胰臟癌中CEACAM6之過度表現擴大吉西他濱(gemcitabine)阻抗，而在BxPC3細胞中siRNA-媒介的抑制CEACAM6表現，藉由以Src依賴的方式調節AKT活性增加其對此藥物的化療敏感性(Duxbury et al.,Cancer Res.2004 Jun 1；64(11)：3987-93)。這些效應對應了具有c-src活性和基質金屬蛋白酶(MMP9)表現之高CEACAM6表現細胞之侵入性增加(Duxbury et al.,Br J Cancer.2004 Oct 4；91(7)：1384-90)。
對抗腫瘤相關抗原之T-細胞反應在許多腫瘤中已有描述(Beckhove et al.,J Clin Invest.2004 Jul；114(1)：67-76；Choi et al.,Blood.2005 Mar 1；105(5)：2132-4；Sommerfeldt et al.,Cancer Res.2006 Aug 15；66(16)：8258-65；Schmitz-Winnenthal et al.,Cancer Res.2005 Nov 1；65(21)：10079-87.；Jäger et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Apr 25；97(9)：4760-5；Romero et al.,Adv Immunol.2006；92：187-224)且通常造成腫瘤特異性記憶T細胞堆積在淋巴器官或在血液中(Choi et al.,Blood.2005 Mar 1；105(5)：2132-4；Feuerer et al.,Nat Med.2001 Apr；7(4)：452-8；Letsch et al.,Cancer Res.2003 Sep 1；63(17)：5582-6)。然而，T細胞反抗自體的腫瘤細胞之能力一般為低的(Horna and Sotomayor,Curr Cancer Drug Targets.2007 Feb；7(1)：41-53)；Yang and Carbone,Adv Cancer Res.2004；92：13-27)。許多腫瘤具有阻斷T細胞效應子之能力，其限制了腫瘤免疫療法之效用。就廣泛的各種癌症，已驗證T-細胞對腫瘤細胞的無反應性(Pardoll,Nat Immunol.2012 Dec；13(12)：1129-32)。
CEACAM6亦促進CD8+ T細胞反應之調節。最近，Witzens-Harig等人在表現數種CEACAM家族成員之多發性骨髓瘤中驗證了以抗-CEACAM6 mAbs治療或siRNA靜默CEACAM6，恢復了T細胞抗惡性血漿細胞之反應性，其顯示CEACAM6在CD8+ T細胞反應調節中的角色(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)。到目前，已鑑別出T細胞上一CEACAM6之受體。然而，CEACAM6陽性骨髓瘤細胞與T細胞之共培養，造成調節T細胞訊號事件，包括SHP磷酸酶被CEACAM6連接所活化(Lin and Weiss,J Cell Sci.2001 Jan；114(Pt 2)：243-4；Latour et al.,Mol Cell Biol.1997 Aug；17(8)：4434-41；Wen et al.,J Immunol.2010 Dec 1；185(11)：6413-9)。CEACAM6不具有內在的訊號傳遞能力，且其抑制能力據推測係藉由與T細胞表面上的受體結合所媒介。此一受體可能為例如CEACAM1，就其調節先天性和適應性免疫反應之機制已有描述。CEACAM1(CD66a)具有一含有免疫受體酪胺酸抑制(ITIM)模體之胞質尾區。CEACAM1係儲存在胞內囊泡中且在T細胞活化後(24h至72h)快速具體化並表現在T細胞表面，於該處其在與表現在目標細胞上的配體同嗜性和異嗜性結合後，媒介了T細胞效應子功能之阻斷(Gray-Owen and Blumberg,Nat Rev Immunol.2006 Jun；6(6)：433-46)。此結合之性質為未知的且可能係與其他CEACAM同嗜性和異嗜性結合或與胞外基質之其他組份、生長因子受體、整合素或鈣黏素結合。CEACAM1和CEACAM1間的異嗜性相互作用已有報告提出(Ortenberg et al.,Mol Cancer Ther.2012 Jun；11(6)：1300-10)。例如，CEACAM1和CEACAM5，以及CEACAM6和CEACAM8間的異嗜性CEACAM相互作用已有描述(Cavallaro and Christofori,Nat Rev Cancer.2004 Feb；4(2)：118-32)。
如上所述，CEACAM6為一癌症免疫治療中非常吸引人的治療介入目標。如上所示，CEACAM6為一高同源蛋白家族的成員。減輕CEACAM6免疫抑制之適合人類治療的抗體，因此必須能區別CEACAM6和其他旁系同源蛋白，如各自展現不同功能和組織分布之CEACAM1、CEACAM3、CEACAM5，以約束其作用模式並侷限化於CEACAM6並避免不欲的不良 副作用。
因為CEACAM6不僅是表現在腫瘤細胞上而且亦表現在正常組織(特別是粒細胞以及，例如肺和胃腸細胞之上皮細胞-Chan and Stanners,Mol Ther.2004 Jun；9(6)：775-85；Strickland et al.,J Pathol.2009 Jul；218(3)：380-90)，能預測治療抗體之不良副作用性質是非常重要的。此項格外重要，因為預期的作用模式將是抑制免疫抑制，亦即一種免疫活化，其可能造成嚴重的危害(CD28超拮抗劑TGN1412試驗之事件；Suntharalingam et al.,N Engl J Med.2006 Sep 7；355(10)：1018-28)。所以在對粒細胞之直接效應之上的免疫系統間接效應需要小心評估。為了能發展人類治療抗體及預測性臨床前耐受性試驗，此抗體展現對毒物學相關物種之相關交叉反應性為重要的，就CEACAM6對非人類靈長類之情況，優先地為食蟹獼猴。
作為一先決條件，治療抗體需要以高親和力與細胞上的人類CEACAM6結合，選擇性與CEACAM6結合(不與任何旁系同源物結合)，在一數量級之單價KD內與猴子CEACAM6交叉反應(在非抗體親抗原結合條件下以低表面密度於一毒物學猴子模型事件中安全地反映正常組織上的結合)，於與人類CEACAM6上的類似表位結合，能減輕CEACAM6-媒介的免疫抑制，在人類治療上為非致免疫性(亦即人類或人源化抗體)，夠穩定而得以進行臨床開發，作為長時間內可調配和儲存之醫藥。後者為重要的，因為較早注意到物理性降解(特別是聚集作用)可能增進對治療蛋白的免疫反應(Hermeling et al.,Pharm Res.2004 Jun；21(6)：897-903)以及聚集作用係與未摺疊的IgG及其熱穩定性密切相關(Vermeer and Norde,Biophys J.2000 Jan；78(1)：394-404)。
有數種抗-CEACAM6抗體存在。其大部份為非人類試劑抗體，其有許多為多株抗體。對人類CEACAM6之專一性和選擇性以及對猴子CEACAM6之交叉反應性在大部分的案例中並未揭示或為未知的。
針對CEACAM6之治療抗體亦為本項技術所知。某些對人類CEACAM6不具選擇性(例如來自Immunomedics之MN-3，來自Neogenix之Neo201/h16C3；二者另外係與人類CEACAM5結合)。訊號區抗體2A3及融合變體(WO2012040824及Niu et al.,J Control Release.2012 Jul 10；161(1)：18-24)並未找出有關選擇性及對猴子CEACAM6之交叉反應性的特性。
明顯對猴子CEACAM6具交叉反應性之選擇性抗-CEACAM6抗體並未揭示(Strickland et al.,J Pathol.2009 Jul；218(3)：380-90)。
鼠科抗體9A6(Genovac/Aldevron)為唯一經描述能調節CEACAM6之免疫抑制活性的抗體(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)。9A6抑制了CEACAM6之免疫抑制活性，導致活體外T細胞的細胞激素分泌及活體內抗腫瘤效用增加(Khandelwal et al.,Poster Abstract 61,Meeting Abstract from 22nd Annual International Cancer Immunotherapy Symposium October 6-8,2014,New York City,USA)。雖然其選擇性似乎為適當的，但先前並未找出有關其對猴子CEACAM6之交叉反應性的特性。此外，其鼠科本質預先排除了人類之直接治療應用。
如實例中所示，抗體9A6與重組的人類CEACAM6結合但並未偵測到與重組的普通獼猴或食蟹獼猴CEACAM6結合。為了比較，亦檢測Neo201-hIgG1。此抗體展現與人類和猴子CEACAM6的高親和力結合。但Neo201與人類CEACAM5和CEACAM6結合且因此對CEACAM6不具專一性。
總言之，對於包括下列特質之治療性單株抗體有高度需求：
i. 此抗體為人類CEACAM6之高親和力結合劑。
ii. 此抗體對CEACAM6具選擇性，但不與任何旁系同源物結合，特別是CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5。
iii. 此抗體在一數量級之單價KD內對猴子CEACAM6具交叉反應性。
iv. 此抗體在人類治療中為非致免疫性，亦即其為一人類或人源化抗體。
v. 此抗體能減輕CEACAM6-媒介的免疫抑制。
此一抗體在先前技術中並不存在。與人類CEACAM6之N-端1區結合的9A6為能減輕CEACAM6-媒介的免疫抑制作用之唯一已知抗-CEACAM6抗體，除了為小鼠抗體之外，尚缺乏與猴子CEACAM6的交叉反應性。Neo201係與CEACAM6之N-端1區外部的不同區結合。已公開的Neo201-hIgG1的治療效用係以ADCC為基礎(Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research；2011 Apr 2-6；Orlando,FL.Philadelphia(PA)：AACR：Du et al.,Cancer Res April 15,2011；71(8 Supplement)：4582)。
本發明者們假定減輕CEACAM6-媒介的免疫抑制作用係與N-端1區結合相關。但產生與CEACAM6之N-端1區結合的抗體導致具挑戰的選擇性問題。
圖1中的序列比對顯示，在整個胞外區中人類CEACAM6和人類CEACAM3、人類CEACAM5及人類CEACAM1之高程度的蛋白序列相似性。目標區(人類CEACAM6之1區)與其他CEACAM特別相似。其亦反映在表7中。人類CEACAM6的旁系同源物(例如CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5)比食蟹獼猴同源物與人類CEACAM6更加地類似。事實上，在人類和食蟹獼猴CEACAM6中，於初級序列的N端區僅有2個位置為相同的，但在其他人類旁系同源物中胺基酸為不同的(圖1中以星號標出)。
令人意外的，本發明者們能發現產生包括全部所欲的選擇性和功能特性之抗體的方法。
本發明係關於對人類和食蟹獼猴CEACAM6蛋白展現高親和力，且不會與密切相關的人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應之抗體，或其抗原結合的抗體片段，或其變體。此項係表示該抗體，或其抗原結合的抗體片段，或其變體對CEACAM6具有選擇性。所提供的抗體係與N-端1區結合，其在這些蛋白中為高度保守的。
本發明之抗-CEACAM6抗體能在活體外改變腫瘤特異性T細胞之細胞激素特質朝向更具細胞毒性及/或特徵為增加IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌之活化表型。因此，本發明之抗體能減輕CEACAM6-媒介的免疫抑制，及引發免疫活化，其最終在活體內產生抗-腫瘤效用。
本發明之抗體，或其抗原結合的抗體片段，或其變體干擾CEACAM6和CEACAM1相互作用，其可能為一調節先天性和適應性免疫反應之機制。
本發明之抗體因此係適合治療癌症以及其轉移，特別是CEACAM6表現腫瘤，例如結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胰臟癌、胃癌、乳癌及多發性骨髓瘤。
本發明描述了有別於現有的抗-CEACAM6抗體之抗體，其中其能在一數量級之單價KD內與人類和食蟹獼猴CEACAM6結合(在非抗體親抗原結合條件下以低表面密度於一毒物學猴子模型事件中安全地反映正常組織上的結合)且不會與密切相關的旁系同源物CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5顯著交叉反應。所以這些抗體適用於食蟹獼猴之臨床前毒物學研究，評估其安全性樣貌。因為CEACAM6不僅表現在腫瘤細胞中亦表現在正常組織中(特別是粒細胞以及，例如肺和胃腸細胞之上皮細胞-Chan and Stanners,Mol Ther.2004 Jun；9(6)：775-85；Strickland et al.,J Pathol.2009 Jul；218(3)：380-90)，能預測治療抗體之不良副作用性質是非常重要的。此項格外重要，因為預期的作用模式將是抑制免疫抑制，亦即一種免疫活化，其可能造成嚴重的危害(CD28超拮抗劑TGN1412試驗之事件)，所以在對粒細胞之直接效應之上的免疫系統間接效應需要小心評估。
最佳之本發明抗-CEACAM6抗體係如表1所述，其特徵為其結構特性。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括1、2、3、4、5、8、10、15或更多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、 Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129。
本發明之抗-CEACAM6抗體可與已知的藥物共投予，在某些情況下此抗體本身可經修飾。例如，抗體可與細胞毒性劑、免疫毒素、毒性基團或放射性同位素接合，而可能進一步增加效用。
本發明進一步係提供作為診斷惡性或發育異常症狀之工具的抗體，而在該症狀中，相較於正常組織，CEACAM6表現為升高的。提供與一可偵測標記接合的抗-CEACAM6抗體。較佳的標記為放射性標記、酵素、發色團或螢光基團。
本發明亦關於編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸，表現本發明抗體或其抗原結合片段之細胞，製造本發明抗體或其抗原結合片段之方法，使用本發明抗體或其抗原結合片段抑制發育異常細胞生長的方法，以及使用本發明抗體或其抗原結合片段治療和偵測癌症之方法。
本發明亦關於分離的核酸序列，其各自可編碼對CEACAM6表位具專一性之前述抗體或其抗原結合片段。本發明之核酸適用於重組製造抗體或其抗原結合片段。因此，本發明亦關於含有本發明核酸序列之載體和宿主細胞。
本發明之組成物可用於治療性或預防性應用。本發明因此係包括一包含本發明抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受載劑或賦形劑之醫藥組成物。在一相關方面，本發明係提供治療與不欲的CEACAM6表現細胞存在有關的病症或症狀之方法。在一較佳的實施例中，前述病症為癌症。此方法係包含投予有此需要之對象一有效量之醫藥組成物的步驟，而該醫藥組成物係含有所述或文中所預期的本發明抗體。
再者，本發明係關於產生此類抗體之方法。本發明係提供使用抗體庫分離一或多個專一與CEACAM6結合之此抗體庫成員的說明。此外，本發 明係提供將小鼠免疫接種以製造雜交瘤細胞株之說明，而該雜交瘤細胞株係分泌專一與CEACAM6結合及與食蟹獼猴CEACAM6交叉反應之抗體。本發明亦提供將專一與CEACAM6結合之鼠科抗體人源化的說明
本發明之詳細說明
本發明係以發現對CEACAM6具有專一性親和力且可遞送治療利益給一對象之新穎抗體為基礎。本發明之抗體，其可為人類、人源化或嵌合的，可用於許多情況，其將更完整描述於文中。
定義
除非另有說明，否則所有文中所用的技術和科學術語係具有如本發明所屬技術之一般技術者所正常理解之相同意義。然而，下列參考文獻可提供熟習本發明所屬技術者許多用於本發明之術語的一般定義，並可參照或使用只要此等定義係與本項技術一般所理解之意義相符。此等參考文獻包括，但不限於Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；Hale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)；及Lackie et al.,The Dictionary of Cell & Molecular Biology(3d ed.1999)；及Cellular and Molecular Immunology,Eds.Abbas,Lichtman and Pober,2nd Edition,W.B.Saunders Company。本項技術之一般技術者可取得的任何額外的技術資源，其係提供具有本項技術一般所理解意義之文中所用的術語定義，皆可查看。就本發明之目的，係進一步定義下列術語。另外的術語係定義於說明書之他處。除非另有明確指出否則，如文中及所附的申請專利範圍中所用，單數型「一」和「此」係包括多數型的指示物。因此，例如，有關「一基因」係指二或多種基因並包括熟習本項技術者所知之其同等物，諸如此類。
術語「多肽」和「蛋白」在文中交換使用係指胺基酸殘基的聚合物。此等術語係適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應的天然生成胺基酸之人工化學模擬物之胺基酸聚合物，以及天然生成胺基酸聚合物和非天然生成胺基酸聚合物。除非另有指出，否則特定的多肽序列亦隱含其保守性修飾變體。
胺基酸文中可藉由其一般所知的三字母符號或IUPAC-IUB生化命名委員會所建議的單字母符號來指稱。核苷酸同樣地可藉由其一般所接受的單字母碼來指稱。
如文中所用「CEACAM6」係指「癌胚抗原相關細胞黏附分子6」，亦稱為「CD66c」(分化群66c)，或非專一性交叉反應抗原，或NCA，或NCA-50/90。CEACAM6為一涉及細胞-細胞黏附之糖基化磷脂醯肌醇(GPI)-連結的細胞表面蛋白。CEACAM6高度表現在不同腫瘤細胞的表面，例如結腸癌、胰臟癌、乳癌和肺癌。
一人類CEACAM6之參照序列可得自UniProtKB/Swiss-Prot資料庫登錄號為P40199.3(SEQ-ID NO：179=TPP-4639)，包括訊號胜肽(位置1-34)和胜肽鏈(位置321-344)。在位置239(G與V交換)觀察到單一核苷酸多型。此人類CEACAM6之成熟胞外區係由SEQ-ID No：179位置35-320的胺基酸所組成。
人類CE4CAM6(SEQ-ID NO：179)
Figure 105108621-A0202-12-0012-1
食蟹獼猴的CEACAM6蛋白序列由本發明者們演繹出並以TPP-4189(SEQ-ID No：177)表示。食蟹猴CEACAM6的成熟胞外區係由SEQ-ID No：177位置35-320的胺基酸所組成。
食蟹猴CEACAM6(SEQ-ID NO：177)
Figure 105108621-A0202-12-0012-2
Figure 105108621-A0202-12-0013-3
人類和食蟹獼猴CEACAM6之區域組織係如下(以UniProtKB/Swiss-Prot資料庫序列登錄號P40199.3為基礎及分別為SEQ-ID NO：179=TPP-4639 & SEQ-ID No：177=TPP-4189)：
Figure 105108621-A0202-12-0013-4
人類CEACAM1全長蛋白可得自UniProtKB/Swiss-Prot資料庫之登錄號P13688.2(SEQ-ID No：173=TPP-4185)。人類CEACAM1的成熟胞外區係由SEQ-ID No：173位置35-428的胺基酸所組成。
人類CEACAM1(SEQ-ID NO：173)
Figure 105108621-A0202-12-0013-6
Figure 105108621-A0202-12-0014-8
人類CEACAM3全長蛋白可得自UniProtKB/Swiss-Prot資料庫之登錄號P40198.2(SEQ-ID No：175=TPP-4187)。人類CEACAM3的成熟胞外區係由SEQ-ID No：175位置35-155的胺基酸所組成。
人類CEACAM3(SEQ-ID NO：175)
Figure 105108621-A0202-12-0014-9
人類CEACAM5全長蛋白可得自UniProtKB/Swiss-Prot資料庫之登錄號P06731.3(SEQ-ID No：176=TPP-4188)。人類CEACAM5的成熟胞外區係由SEQ-ID No：176位置35-682的胺基酸所組成。
人類CEACAM5(SEQ-ID NO：176)
Figure 105108621-A0202-12-0014-7
Figure 105108621-A0202-12-0015-10
術語「抗-CEACAM6抗體」和「與CEACAM6結合之抗體」係指能以足夠的親和力結合CEACAM6使得抗體可用做以CEACAM6為標靶之診斷及/或治療劑的抗體。在一實施例中，抗-CEACAM6抗體與不相關非-CEACAM6蛋白結合的程度，如以表面電漿共振(SPR)所測，係低於此抗體與CEACAM6結合的約5%，或較佳地低於約2%。在特定的實施例中，與CEACAM6結合的抗體係具有
Figure 105108621-A0202-12-0015-411
1μM、
Figure 105108621-A0202-12-0015-412
100nM、
Figure 105108621-A0202-12-0015-413
10nM、
Figure 105108621-A0202-12-0015-414
1nM、
Figure 105108621-A0202-12-0015-415
0.1nM、
Figure 105108621-A0202-12-0015-416
0.01nM、or
Figure 105108621-A0202-12-0015-417
0.001nM(例如10-8M或更低，例如從10-8M至10-13M，例如從10-9M至10-13M)之解離常數(KD)。在特定的實施例中，抗-CEACAM6抗體係與一CEACAM6表位結合，其在不同物種的CEACAM6中為保守性的。
術語「抗體」如文中所用，希望係指免疫球蛋白分子，較佳地係由典型地以雙硫鍵互相連接之四條多肽鏈，二條重(H)鏈和二條輕(L)鏈所組成。各重鏈係由一重鏈可變區(文中縮寫為VH)和一重鏈恆定區所組成。重鏈恆定區可包括，例如三個區CH1、CH2和CH3。各輕鏈係由一輕鏈可變區(文中縮寫為VL)和一輕鏈恆定區所組成。輕鏈恆定區係由一個區(CL)所組成。VH和VL區可進一步細分為高可變區，稱為互補決定區(CDR)，其間散佈著較保守性區域，稱為框架區(FR)。各VH和VL典型地係由三個CDR和至高四個FR所組成，以下列順序由胺基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如文中所用，術語「互補決定區」(CDR；例如CDR1、CDR2和CDR3)係指抗體可變區之胺基酸殘基其存在為抗原結合所必須。各可變區典型地具有三個經鑑定為CDR1、CDR2和CDR3之CDR區。各互補決定區可包括來自Kabat所定義之「互補決定區」的胺基酸殘基(例如輕鏈可變區中約殘基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)，及重鏈可變區31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immulological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))及/或來自「高變環」之殘基(例如輕鏈可變區中約殘基26-32(L1)， 50-52(L2)和及91-96(L3)，以及重鏈可變區中26-32(H1),53-55(H2)和96-101(H3)(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。在某些情況下，互補決定區可包括來自根據Kabat所定義的CDR區和高變環之胺基酸。
依照其重鏈恆定區的胺基酸序列，完整抗體可分成不同的「種類」。有五類完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中數類可再細分成「亞類」(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。用於本發明之較佳的免疫球蛋白種類為IgG。
對應不同種類抗體之重鏈恆定區分別稱為[α]、[δ]、[ε]、[γ]和[μ]。不同種類之免疫球蛋白的亞單位結構和三維構型已熟知。如文中所用抗體為習知的抗體和其功能片段。
抗體/免疫球蛋白之「功能片段」或「結合抗原之抗體片段」特此係定義為保留抗原-結合區之抗體/免疫球蛋白的片段(例如IgG之可變區)。抗體之「抗原-結合區」典型地係在一或多個抗體之高變區中所發現，例如CDR1、-2及/或-3區；然而可變「框架」區亦可在抗原結合上扮演重要角色，例如提供CDR支架。較佳地，「抗原-結合區」係包括可變輕(VL)鏈的至少胺基酸殘基4至103及可變重(VH)鏈之5至109，更佳地VL之胺基酸殘基3至107及VH之4至111，特佳地為完整的VL和VH鏈(VL之胺基酸位置1至109及VH之1至113；編號係根據WO 97/08320)。
本發明之「功能片段」或「抗原結合之抗體片段」或「抗體片段」包括，但不限於Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；單區抗體(DAb)、線性抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及多專一性，例如由抗體片段所形成的雙-和三-專一性抗體(C.A.K Borrebaeck,editor(1995)Antibody Engineering(Breakthroughs in Molecular Biology),Oxford University Press；R.Kontermann & S.Duebel,editors(2001)Antibody Engineering(Springer Laboratory Manual),Springer Verlag)。「多專一性」和「多功能性」以外的抗體，請了解係使其各自結合位置為相同的。F(ab’)2或Fab可經工程化以便將發生在CH1和CL區之間的分子內雙硫鍵相互作用減至最低或完全移除。
術語「Fc」區文中係用來定義一含有至少一部份恆定區之免疫球蛋白重鏈的C-端區。此術語包括天然序列Fc區和變體Fc區。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區從Cys226，或從Pro230延伸至重鏈羧基端。然而，Fc區之C-端離胺酸(Lys447)可能存在或不存在。除非文中另有指出，否則Fc區或恆定區之胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
涵蓋在本發明中之抗體或抗原結合抗體片段的變體為其中保有抗體或抗原結合抗體片段之結合活性的分子。
涵蓋在本發明中之「結合蛋白」有例如抗體模擬物，例如Affibodies、Adnectins、Anticalins、DARPins、Avimers、Nanobodies(參見Gebauer M.et al.,Curr.Opinion in Chem.Biol.2009；13：245-255；Nuttall S.D.et al.,Curr.Opinion in Pharmacology 2008；8：608-617)。
「人類」抗體或其抗原結合片段特此係定義為非嵌合(例如非人源化)及非來自(整體或部份)非人類物種之抗體或其抗原結合片段。人類抗體或其抗原結合片段可衍生自人類或可為合成的人類抗體。「合成的人類抗體」文中係定義為具有，整體或部份，在矽中衍生自合成序列之序列的抗體，而該合成序列係以已知的人類抗體分析為基礎。在矽中人類抗體序列或其片段之設計，例如，可藉由分析人類抗體或抗體片段序列之資料庫及利用從其所得來的資料規劃多肽序列來進行。人類抗體或其抗原結合片段之另外的實例為，由分離自人類來源的抗體序列資料庫之核酸所編碼者(例如此資料庫係以採集自人類天然來源之抗體為基礎)。人類抗體之實例包括Söderlind et al.,Nature Biotech.2000,18：853-856中所述之抗體。
「人源化抗體」或其人源化抗原結合片段文中係定義為(i)衍生子非人類來源(例如帶有異源性免疫系統之基因轉殖小鼠)，其抗體係以人類生殖系序列為基準；(ii)其中非人類抗體之框架區的胺基酸係藉由基因工程與人類胺基酸序列部份交換，或(iii)CDR-稼接的，其中可變區的CDR係來自非人類來源，而一或多個可變區之框架為人類來源且恆定區(若有)為人類來源的。
「嵌合抗體」或其抗原結合片段在文中係定義為其中可變區係衍生自非人類來源且某些或全部恆定區係衍生自人類來源之抗體。
術語「單株抗體」如文中所用係指得自實質上同源抗體之群族的抗體，亦即排除可能的突變，例如自然發生的突變，包括此群族之個別抗體為相同的，其可少量存在。因此，術語「單株」係指抗體的特性並非離散抗體的混合物。與多株抗體製備物相反的，其典型地係包括針對不同決定位(表位)之不同抗體，單株抗體製備物之單株抗體係針對抗原上的單一決定位。除了其專一性之外，典型地其中未被其他免疫球蛋白汙染之單株抗體製備物為有利的。術語「單株」並不應解釋為需要藉由任何特定方法製造抗體。術語單株抗體特言之係包括嵌合、人源化和人類抗體。
「分離的」抗體為經鑑定並與其表現細胞的組份分離之抗體。細胞的污染組份為可能干擾抗體之診斷或治療用途的物質，且可包括酵素、荷爾蒙和其他蛋白質或非蛋白質溶質。
「分離的」核酸為經鑑定並與其天然環境的組份分離之核酸。分離的核酸包括一包含在細胞中的核酸分子，而該細胞一般含有核酸分子，但此核酸分子係存在染色體外或位於與其天然染色體所在處不同的染色體位置。
如文中所用，抗體「專一結合」，「具專一性」或「專一辨識」感興趣抗原，例如腫瘤相關的多肽抗原標靶，為以足夠的親和力與抗原結合使得此抗體可以表現之抗原的細胞或組織為標靶用作治療劑，且不會顯著地與其他蛋白交叉反應或不會顯著地與前述抗原標靶之同源物和變體(例如突變型、剪接變體或蛋白分解之截短型)以外的蛋白交叉反應。術語「專一辨識」或「專一結合」或對特定多肽或特定多肽標靶上的表位「具專一性」，如文中所用可例如藉由抗體或其抗原結合片段，其對抗原具有低於約10-4M，另一種選擇低於約10-5M，另一種選擇低於約10-6M，另一種選擇低於約10-7M，另一種選擇低於約10-8M，另一種選擇低於約10-9M，另一種選擇低於約10-10M，另一種選擇低於約10-11M，另一種選擇低於約10-12M或更低之單價KD，來表示。若一抗體能分辨此抗原和一或多種參照抗原，則此抗體係「專一結合」，「具專一性」或「專一辨識」抗原。就其最一般的 形式，「專一結合」，「與其專一結合」，「具專一性」或「專一辨識」係指抗體分辨感興趣抗原和不相關抗原之能力，如例如依照下列方法之一來測定。此等方法包括，但不限於表面電漿共振(SPR)、西方墨點、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-試驗和胜肽掃描。例如，可進行標準的ELISA分析。可藉由標準顯色來進行評分(例如二級抗體與辣根過氧化酶以及四甲基聯苯胺與過氧化氫。在特定孔槽中的反應係藉由光學密度來評分，例如於450nm。典型的背景(=陰性反應)可為0.1OD；典型的陽性反應可為1OD。此項表示陽性/陰性差異系大於5-倍、10-倍、50-倍，及較佳地大於100-倍。典型地，結合專一性之測定係藉由使用非單一參照抗原，而是一組約3至5種不相關抗原來進行，例如奶粉、BSA、運鐵蛋白等等。
「結合親和力」或「親和力」係指一分子之單一結合位置及其結合夥伴間非共價相互作用的強度總合。除非另有指出，否則，如文中所用，「結合親和力」係指反映配對結合(例如一抗體和一抗原)成員之間1：1相互作用的內在結合親和力。解離常數「KD」一般係用來描述分子(例如抗體)與其結合夥伴(例如抗原)之間的親和力，亦即配體與特定蛋白結合之緊密性。配體-蛋白親和力係受到二分子間之非共價分子間相互作用所影響。親和力可藉由本項技術中已知的常用方法來測量，包括文中所述之方法。在一實施例中，「KD」或「KD值」根據本發明係藉由使用表面電將共振分析使用適合的裝置，包括(但不限於)Biacore儀器如Biacore T100、Biacore T200、Biacore 2000、Biacore 4000、Biacore 3000(GE Healthcare Biacore,Inc.)，或ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad Laboratories,Inc.)來測量。
如文中所用，術語「表位」包括能與免疫球蛋白或T-細胞受體結合的任何蛋白決定位。表位決定位通常係由化學活性表面分子團例如胺基酸或糖側基鏈或其組合所組成，且通常具有特定的三維結構特性，以及特定的帶電特性。
「與相同表位結合的抗體」為一參照抗體或與參照抗體「競爭結合的抗體」，係指在一競爭分析中一抗體以10%、20%、30%、40%、50%或更高阻斷參照抗體與其抗原結合之抗體，及相反地，在一競爭分析中此參照抗體以10%、20%、30%、40%、50%或更高阻斷此抗體與其抗原結合。文 中提供一示例的競爭分析。
「與目標蛋白Z之一表位結合的抗體，其中該表位係包括胺基酸殘基X1、X2、X3...」為一抗體，其係包括5Å內的原子，擇優地4Å內，在此抗體與其目標蛋白結合後，目標蛋白Z之該胺基酸殘基X1、X2、X3...的原子。此等表位可如實例16所示範，藉由使用X-光晶體結構來測定。
「抗體-依賴的細胞媒介細胞毒性」或「ADCC」係指一種細胞毒性形式，其中所分泌的Ig結合Fcγ受體(FcγRs)係存在特定的細胞毒性細胞上(例如NK細胞、嗜中性細胞和巨噬細胞)，使得這些細胞毒性效應子細胞能專一與帶有抗原的標靶細胞結合及隨後，例如以細胞毒素殺死此標靶細胞。為了評估感興趣抗體之ADCC活性，可進行活體外ADCC分析，例如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號，或美國專利第6,737,056號(Presta)中所述。可用於此等分析之效應子細胞包括PBMC和NK細胞。
「補體依賴的細胞毒性」或「CDC」係指在補體的存在係下標靶細胞之溶離。經典補體路徑之活化係藉由補體系統(C1q)的第一組份與(適當亞類的)抗體結合啟動，其係與其同源抗原結合。就評估補體活化，可進行CDC分析，例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。具有改變的Fc區胺基酸序列的多肽變體(具有變異Fc區之多肽)及增加或降低的C1q結合係描述於，例如美國專利第6,194,551 B1號及WO 1999/51642中。
如文中所用，「裸抗體」係指未接合一異源性基團(例如細胞毒性基團)或放射性標記之抗體。此裸抗體可存在醫藥組合物中。
術語「免疫接合物」(可交換地稱為「抗體-藥物接合物」或「ADC」)係指與一或多個細胞毒性劑或細胞生長抑制劑，例如化療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素，細菌、真菌、植物或動物來源之酵素性活性毒素或其片段)、放射性同位素(亦即放射性接合物)接合之抗體。免疫接合物已用於癌症治療中細胞毒性劑，亦即殺死或抑制細胞生長或增生之藥物的局部遞送(例如Liu et al.,Proc Natl.Acad.Sci.(1996),93,8618-8623))。免疫接合物能靶向遞送藥物基團至腫瘤，並胞內累積在其內，其中免疫接合藥物之全身性給藥可能對正常細胞及/或組織產生不可接受的毒性量。用於 抗體-毒素接合物中的毒素包括細菌毒素例如白喉毒素，質物毒素例如蓖麻毒素，小分子毒素例如格爾德黴素(geldanamycin)。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制來發揮其細胞毒性效應。
「序列一致性百分比(%)」分別就參照聚核苷酸或多肽序列，係定義為在對齊比對序列和導入缺位，若需要，以達到最大序列一致性百分比後，一候選序列中核酸或胺基酸殘基分別與參照聚核苷酸或多肽序列中的核酸或胺基酸殘基相同之百分比。保守性取代並不視為序列一致性的部份。較佳的為無缺位比對。就測定胺基酸序列一致性百分比目的之比對可用本項技術之技術內的各種方式來進行，例如使用公開可取得的電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習本項技術者可決定適用於比對序列的參數，包括在整個所比較的全長序列內需要達到最大比對之任何演算法。
「序列同源性」係指相同或代表保守性胺基酸取代之胺基酸的百分比。
術語「成熟抗體」或「成熟抗原結合片段」例如成熟Fab變體，係包括對一特定抗原，例如目標蛋白之胞外區，具有較強結合力-亦即以增加的親和力結合-之抗體或抗體片段的衍生物。成熟為鑑別小數目突變的方法，例如在抗體或抗體片段的六個CDR內導致此親和力增加。成熟法為用於將突變導入抗體之分子生物法及用於鑑別此改良結合劑之篩選的組合。
「拮抗」抗體或「阻斷」抗體為明顯抑制(部分或完全)其結合的抗原之生物活性的抗體。
「促效」抗體或具有「促效活性」之抗體為與其標靶結合並引發各別標靶之活化(部分或完全)，其例如導致訊號傳遞路徑或由各別標靶所媒介的生物效應(部分或完全)活化之抗體。「促效」抗體或具有「促效活性」之抗體如文中所用為一可模擬至少其中一種感興趣多肽之功能活性的抗體。
術語「醫藥調配物」/「醫藥組成物」係指以讓包含在其中的活性成份之生物活性起作用之形式，且其不含有對投予此調配物之對象具有不可接受毒性之另外組份的製備物。
術語「載體」，如文中所用，係指能繁衍與其相連之另外核酸的核酸分 子。此術語包括作為自複製核酸結構之載體以及併入其所導入之宿主細胞基因體的載體。特定的載體能引導其操作上連接的核酸表現。此等載體在文中係稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養」係交換使用並指以導入外生性核酸之細胞，包括此等細胞的子代。宿主細胞包括「轉化體」、「轉化細胞」、「轉染體」、「轉染細胞」和「轉導細胞」，其包括初級轉化/轉染/轉導細胞及從其衍生的子代與傳代的數目無關。子代在胺基酸含量上可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。文中係包括於原始轉化細胞中篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。
本發明之抗體
本發明係關於專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，且其因此不會與密切相關的人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應。
本發明之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與CEACAM6之成熟胞外區和食蟹獼猴CEACAM6之成熟胞外區專一結合，且不會與密切相關的人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5之成熟胞外區顯著交叉反應。成熟胞外區可為部份表現在細胞表面之全長蛋白以及可溶性蛋白(天然生成或重組表現的)。
本發明之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與包括人類CEACAM6之成熟胞外區及/或食蟹獼猴CEACAM6之成熟胞外區的蛋白專一結合，且不會與僅包括密切相關的人類CEACAM1及/或人類CEACAM3及/或人類CEACAM5之成熟胞外區的蛋白顯著交叉反應。
本發明一實施例係提供對人類和食蟹獼猴CEACAM6具專一性之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係指此抗體與人類和食蟹獼猴CEACAM6交叉反應。
本發明一實施例係提供對CEACAM6具選擇性之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係指這些抗體不會與密切相關的CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5顯著交叉反應。
本發明另外的實施例係提供與人類CEACAM6結合及以類似的親和力 與另外的物種(其包括，但不限於猴子)之CEACAM6交叉反應的抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。較佳地，該另外的物種為非-人類靈長類，例如食蟹獼猴、普通獼猴、猩猩、大猩猩、黑猩猩。最佳地，此抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與人類CEACAM6結合並與食蟹猴CEACAM6交叉反應。
與抗原1(Ag1)結合的單株抗體會與抗原2(Ag2)交叉反應，當二種抗原之EC50及/或KD值在類似範圍內時。在本揭示文中，當Ag1之親和力與Ag2之親和力比率等於或小於10(
Figure 105108621-A0202-12-0023-418
10)及等於或大於(
Figure 105108621-A0202-12-0023-419
0.1)時，與Ag1結合的單株抗體會與Ag2交叉反應，其表示，以二抗原之親和力係於相同實驗設定以相同方法所測為條件，對Ag1和Ag2的親和力差異不超過10的因數(親和力係在一數量級的單價KD之內)。
因此，本發明之抗體具有對人類CEACAM6與對食蟹獼猴CEACAM6之親和力比例係等於或小於10(
Figure 105108621-A0202-12-0023-420
10)及等於或大於0.1(
Figure 105108621-A0202-12-0023-421
0.1)，其表示對人類和食蟹獼猴CEACAM6之親和力差異不超過10的因數(親和力係在一數量級的單價KD之內)。因此，本發明抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體根據本發明可用於猴子中所進行的毒物學研究，因為在猴子中所觀察到的毒性樣貌應與貼近人類中預期的可能不良效應。
與抗原1(Ag1)結合的單株抗體不會與抗原3(Ag3)「顯著交叉反應」，當二種抗原的親和力非常不同時。若結合反應(分析中所測量的結合訊號)太低，則對Ag3的親和力可能無法測量。在本發明應用中，當在相同的實驗設定及相同的抗體濃度下，單株抗體對Ag3之結合反應(分析中所測量的結合訊號)係低於5%，較佳地低於相同單株抗體對Ag1之結合反應的2%時，與Ag1結合的單株抗體不會與抗原3(Ag3)「顯著交叉反應」。在施行上，所用的抗體濃度可為EC50或KD或達到以Ag1獲得飽和平穩狀態所需要的濃度。
根據本發明，此等抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體不會與人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應。
本發明一較佳的實施例具有
Figure 105108621-A0202-12-0023-422
400nM，較佳地
Figure 105108621-A0202-12-0023-423
200nM，另一種選擇較佳地
Figure 105108621-A0202-12-0023-424
100nM之對人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6的親和力，其 係以重組的CEACAM6之單價親和力(參見實例2)所測，如表13、表18和表20中所述。
根據本發明，此等抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)及食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)(親和力係在一數量級的單價KD之內)。CEACAM6 1區亦稱為N區。
本發明一實施例係提供以在一數量級之內的親和力(單價KD)專一與人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)及專一與食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)結合之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。最佳地為對人類CEACAM6 1區和食蟹獼猴CEACAM6 1區二者具有KD
Figure 105108621-A0202-12-0024-425
100nM之親和力的抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。
本發明之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係專一與包括人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)及/或食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)之蛋白結合。
本發明之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係專一與包括人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)及/或食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)之蛋白結合而且不會與密切相關的人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應。
本發明之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係專一與包括人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)及/或食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)之蛋白結合而且不會與僅包括密切相關的人類CEACAM1及/或人類CEACAM3及/或人類CEACAM5之成熟胞外區的蛋白顯著交叉反應。
本發明一實施例係提供抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係專一與CEACAM6之成熟胞外區及食蟹獼猴CEACAM6之成熟胞外區結合，並與9A6抗體(Genovac/Aldevron)競爭在人類CEACAM6上的結合且不會與密切相關的人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5之成熟胞 外區顯著交叉反應。
本發明一實施例係提供抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係專一與人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)和食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)結合並與9A6抗體(Genovac/Aldevron)競爭在人類CEACAM6上的結合。
本發明一實施例係提供專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合，及干擾CEACAM6和CEACAM1相互作用之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。相較於實例所提供的單獨CEACAM6與CEACAM1之典型結合分析，當預成抗體-CEACAM6-複合物之結合訊號大於20%，較佳地大於50%下降時，則抗體係干擾CEACAM6和CEACAM1相互作用。干擾CEACAM6和CEACAM1相互作用可能為調節先天性和適應性免疫反應之機制。
本發明一實施例係提供專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合，及具有免疫調節活性之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。「免疫調節」為調整免疫反應至所欲的程度如免疫增強、免疫抑制或引發免疫耐受性。「免疫調節抗體」藥物為一免疫反應修飾劑，其係刺激或抑制對治療疾病，例如癌症或抗發炎之免疫反應。本發明係提供一抗-CEACAM6免疫調節抗體，如實例11所示，其係阻斷CEACAM6，一種癌細胞上免疫細胞抑制配體，以及可能其他包括免疫系統組份之細胞，其造成免疫標記表現性質改變及使T細胞活化狀態趨向抗-腫瘤T細胞再活化及有效的抗癌免疫反應。與CEACAM6 1區結合的抗體為較佳的。
本發明一實施例係提供抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合，及能減輕腫瘤抗原專一性T細胞之CEACAM6媒介的免疫抑制，如以腫瘤抗原專一性T細胞之IFN-γ分泌或分泌IFN-γ的活化T細胞數目所測量。若相較於對照樣本，一抗體在腫瘤專一性T細胞與腫瘤細胞共培養中產生IFN-γ分泌增加>1.2，較佳地>1.5倍，則此抗-CEACAM6抗體能減輕腫瘤抗原專一性T細胞之CEACAM6媒介的免疫抑制。較佳地此腫瘤抗原專一性T細胞為CD8+T細胞。較佳的抗體不會與密切相關的CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5 顯著交叉反應且係與CEACAM6 1區結合。在生存素-胜肽專一性CD8+T細胞與KS腫瘤細胞之共培養中藉由本發明抗體阻斷CEACAM6，其相較於以同型匹配對照物治療的對照樣本，產生IFN-γ分泌增加>1.5倍(圖5和圖6)。
本發明一實施例係提供抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體，其係專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合，且其能改變腫瘤抗原專一性T細胞之細胞激素特質趨向更具細胞毒性及/或特徵為增加IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌之活化表型。較佳地此腫瘤抗原專一性T細胞為CD8+T細胞且該表型為增加IFN-γ和IL-2及TNF-α分泌。若相較於以同型匹配對照物治療的對照樣本，一抗體在腫瘤專一性CD8+T細胞與腫瘤細胞之共培養中產生IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌增加>1.2，較佳地>1.5倍，則該抗-CEACAM6抗體能改變腫瘤抗原專一性T細胞之細胞激素特質趨向更具細胞毒性及/或活化表型。在生存素-胜肽專一性T細胞與KS腫瘤細胞之共培養中藉由本發明抗體阻斷CEACAM6，其相較於以同型匹配對照物治療的對照樣本，產生IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌增加>1.5倍(圖6)。
本發明一實施例係提供與廣大範圍不同的CEACAM6表現細胞株，包括(但不限於)如實例中所示的細胞結合之抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。這些實例包括來自許多腫瘤來源的人類細胞株(例如NSCLC,SCLC、CRC、PancCA、BreastCA、GastricCA、多發性骨髓瘤、頸部、皮膚癌，其代表先前於文獻中所述的癌症適應症為CEACAM6陽性(參見introduction or review Beauchimen and Arabzadeh,Cancer Metastasis Rev.2013 Dec；32(3-4)：643-71)。
本發明一實施例係提供對人類給藥為安全的抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體。較佳地此等抗體為嵌合、人源化或人類。最佳的人源化或人類抗體。
然而在特定分析中，本發明抗體之表現以鼠科IgG為較佳；例如藉由使用鼠科抗體或人類-小鼠嵌合抗體可更容易分析人類樣本之免疫組織化學。
本發明另外的實施例係提供作為診斷惡性或發育異常症狀之工具的抗 體，其中，相較於正常組織，CEACAM6表現為升高的或其中CEACAM6係由細胞表面流出且在血清中變成可偵測的。所提供的為與一可偵測標記接合的抗-CEACAM6抗體。較佳的標記為放射性標記、酵素、發色團或螢光基團。
在整個文件中，所提到的本發明之下列較佳抗-CEACAM6抗體係如表1中所述。
Figure 105108621-A0202-12-0027-11
描述於表1中之較佳的本發明抗體或其抗原結合片段之序列進一步係 提供及解釋於圖8。
TPP-3308係代表包括一相當於SEQ ID NO：43之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：44之輕鏈區的抗體。
TPP-3310係代表包括一相當於SEQ ID NO：57之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：5之輕鏈區的抗體。
TPP-3714係代表包括一相當於SEQ ID NO：129之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：130之輕鏈區的抗體。
TPP-3323係代表包括一相當於SEQ ID NO：85之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：86之輕鏈區的抗體。
TPP-3820係代表包括一相當於SEQ ID NO：143之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：144之輕鏈區的抗體。
TPP-3821係代表包括一相當於SEQ ID NO：157之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：158之輕鏈區的抗體。
TPP-3322係代表包括一相當於SEQ ID NO：71之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：72之輕鏈區的抗體。
TPP-3707係代表包括一相當於SEQ ID NO：115之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：116之輕鏈區的抗體。
TPP-3705係代表包括一相當於SEQ ID NO：101之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：102之輕鏈區的抗體。
在另一較佳的實施例中，此抗體或抗原結合片段係包括重鏈或輕鏈CDR序列，其較佳地，與至少一「TPP-2971」、「TPP-3186」、「TPP-3187」、「TPP-3308」、「TPP-3310」、「TPP-3322」、「TPP-3323」、「TPP-3705」、「TPP-3707」、「TPP-3714」、「TPP-3820」、「TPP-3821」抗體之對應CDR序列有至少50%、55%、60% 70%、80%、90%、95%相同，或分別與「TPP-2971」、「TPP-3186」、「TPP-3187」、「TPP-3308」、「TPP-3310」、「TPP-3322」、「TPP-3323」、「TPP-3705」、「TPP-3707」、「TPP-3714」、「TPP-3820」、「TPP-3821」之VH或VL序列有至少50%、60%、70%、80%、90%、92%或95%相同。
在另一較佳的實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段係包括至少 一個如表1所述之CDR序列或至少一個如表1所述之可變重鏈或可變輕鏈序列。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：4(H-CDR1)、SEQ ID NO：5(H-CDR2)和SEQ ID NO：6(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：8(L-CDR1)、SEQ ID NO：9(L-CDR2)和SEQ ID NO：10(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：34(H-CDR1)、SEQ ID NO：35(H-CDR2)和SEQ ID NO：36(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：38(L-CDR1)、SEQ ID NO：39(L-CDR2)和SEQ ID NO：40(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：48(H-CDR1)、SEQ ID NO：49(H-CDR2)和SEQ ID NO：50(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：52(L-CDR1)、SEQ ID NO：53(L-CDR2)和SEQ ID NO：54(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：120(H-CDR1)、SEQ ID NO：121(H-CDR2)和SEQ ID NO：122(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：124(L-CDR1)、SEQ ID NO：125(L-CDR2)和SEQ ID NO：126(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：24(H-CDR1)、SEQ ID NO：25(H-CDR2)和SEQ ID NO：26(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：28(L-CDR1)、SEQ ID NO：29(L-CDR2)和SEQ ID NO：30(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：76(H-CDR1)、SEQ ID NO：77(H-CDR2)和SEQ ID NO：78(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：80(L-CDR1)、SEQ ID NO：81(L-CDR2)和SEQ ID NO：82(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：134(H-CDR1)、SEQ ID NO：135(H-CDR2)和SEQ ID NO： 136(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：138(L-CDR1)、SEQ ID NO：139(L-CDR2)和SEQ ID NO：140(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：148(H-CDR1)、SEQ ID NO：149(H-CDR2)和SEQ ID NO：150(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：152(L-CDR1)、SEQ ID NO：153(L-CDR2)和SEQ ID NO：154(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：62(H-CDR1)、SEQ ID NO：63(H-CDR2)和SEQ ID NO：64(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：66(L-CDR1)、SEQ ID NO：67(L-CDR2)和SEQ ID NO：68(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：14(H-CDR1)、SEQ ID NO：15(H-CDR2)和SEQ ID NO：16(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：18(L-CDR1)、SEQ ID NO：19(L-CDR2)和SEQ ID NO：20(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：106(H-CDR1)、SEQ ID NO：107(H-CDR2)和SEQ ID NO：108(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：110(L-CDR1)、SEQ ID NO：111(L-CDR2)和SEQ ID NO：112(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
在一較佳的實施例中本發明抗體或其抗原結合片段係包括一包含SEQ ID NO：92(H-CDR1)、SEQ ID NO：93(H-CDR2)和SEQ ID NO：94(H-CDR3)之重鏈抗原結合區，以及包括一包含SEQ ID NO：96(L-CDR1)、SEQ ID NO：97(L-CDR2)和SEQ ID NO：98(L-CDR3)之輕鏈抗原結合區。
抗體序列的差異不僅在其補體決定區(CDR)內，亦在框架(FR)中。這些序列差異係編碼在不同V-基因。人類抗體生殖系譜已完全定序出。有約50種功能性VH生殖系基因，根據序列同源性其可分成6個亞家族VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6(Tomlinson et al.,1992,J.Mol.Biol.227,776-798； Matsuda & Honjo,1996,Advan.Immunol.62,1-29)。約40種功能性VL κ基因，包括7種亞家族為已知的(Cox et al.,1994,Eur.J.Immunol.24,827-836；Barbie & Lefranc,1998,Exp.Clin.Immunogenet.15,171-183)：Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ和Vκ7。文中所揭示的分別為屬於人類VH2亞家族之本發明抗體的重鏈及屬於人類Vκ1亞家族之本發明抗體的輕鏈。已知屬於相同亞家族之抗體的框架序列為密切相關的，例如包括人類VH3亞家族成員的抗體全部享有相當的穩定性(Honegger et al.,2009,Protein Eng Des Sel.22(3)：121-134)。本項技術中已知抗體之CDR可稼接在不同的框架上而仍保有對應原始抗體之特定性質。CDR已成功地嫁接在屬於不同物種之框架上以及屬於不同亞家族之相同物種的框架上。在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段係包括至少一個如表1所述之本發明抗體的CDR序列及一人類可變鏈框架序列。
在一較佳的實施例中，本發明抗體或抗原結合片段係包括一如表1所述之本發明抗體的可變輕鏈或包含可變輕鏈之L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3序列的輕鏈抗原結合區，及一可變重鏈或包含可變重鏈之H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3序列的重鏈抗原結合區，以及一人類可變輕鏈和人類可變重鏈框架序列。
在一最佳實施中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：3(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：7(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：33(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：37(VL)所示之可變輕鏈。3
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：119(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：123(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：23(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：27(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：75(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：79(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：133(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：137(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：147(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：151(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：13(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：17(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：61(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：65(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：105(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：109(VL)所示之可變輕鏈。
在一最佳實施例中，本發明抗體或其抗原結合片段係包括一如SEQ ID NO：91(VH)所示之可變重鏈及一如SEQ ID NO：95(VL)所示之可變輕鏈。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括1、2、3、4、5、8、10、15或更多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、 Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129 of SEQ ID NO：179，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括1、2、3、4、5、8、10、15或更多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129 of SEQ ID NO：179，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129 of SEQ ID NO：179，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該人類CEACAM6之表位係包括1、2、3、4、5、8、10、15或更多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129 of SEQ ID NO：179，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在某些實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括1、2、3、4、5、8、10、15或更多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、 Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
在特定的實施例中，本發明之抗-CEACAM6抗體係與一人類CEACAM6之表位相互作用，例如結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係和包括如SEQ ID NO：47(VH)所示之可變重鏈序列及如SEQ ID NO：51(VL)所示之可變輕鏈序列的抗體，競爭與CECEAM6相結合，且其中該抗體或其抗原結合的抗體片段或其變體係與包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
本發明之抗體可為IgG(免疫球蛋白G，例如IgG1 IgG2、IgG3、IgG4)或IgA、IgD、IgE、IgM，而抗體片段可為例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH或scFv。本發明抗體片段，因此，可含有以如文中述之一或多種方式表現之抗原結合區。
在一較佳的實施例中，本發明之抗體或抗原結合的抗體片段為單株抗體。
在某些實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段，或編碼彼等之核酸為分離的。分離的生物組份(例如核酸分子或蛋白，例如抗體)為實質上與生物體之細胞中其他生物組份分開或純化，其中該組份為天然生成的，例如其他的染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白及胞器。此術語亦包含在宿主細胞中以重組表現所製備的核酸和蛋白，以及化學合成的核酸。
抗體產生
本發明之抗體可衍生自重組抗體庫，其係以從大量健康自願者的抗體 中所分離的胺基酸序列為基礎，例如使用n-CoDeR®技術將全人類CDR再組合成新的抗體分子(Carlson & Söderlind,Expert Rev Mol Diagn.2001 May；1(1)：102-8)，或另一種選擇，例如抗體庫，如Hoet RM et al.,Nat Biotechnol 2005；23(3)：344-8)中所述之全人類抗體噬菌體表現庫可用於分離CEACAM6-專一性抗體。分離自人類抗體庫之抗體或抗體片段在文中係視為人類抗體或人類抗體片段。
人類抗體可進一步藉由將一免疫原投予一經改造、反應抗原挑戰而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的基因轉殖動物來製備。此等動物典型地係含有全部或部份人類免疫球蛋白基因座，其係取代內生性免疫球蛋白基因座，或其係存在染色體外或隨機整併至該動物的染色體中。例如，基因工程小鼠之免疫接種，除了其他外，可進行hMAb小鼠之免疫接種(例如VelocImmune mouse®或XENOMOUSE®)。
使用雜交瘤技術可產生另外的抗體(例如，參見Köhler and Milstein Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-7)，產生例如鼠科、大鼠或兔抗體，其可轉變成嵌合或人源化抗體。人源化抗體和其製造方法請參見，例如Almagro and Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，及進一步描述於，例如Riechmann et al.,Nature 332：323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337, 7,527,791, 6,982,321，和7,087,409號；Kashmiri et al.,Methods 36：25-34(2005)(描述專一性決定區(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重修」)；Dall' Acqua et al.,Methods 36：43-60(2005)(描述「FR洗牌」)；和Osboum et al.,Methods 36：61-68(2005)及Klimka et al.,Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR洗牌之「導向選擇」法)。
提供使用重組抗體庫和小鼠免疫接種結合後續免疫接種產生抗體之實例。
本發明另一方面係提供產生專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合，不會與人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應之抗體的方法。本發明一實施例係提供產生抗-CEACAM6抗體之方法，其特徵為包括下列步驟：以食蟹獼猴CECAM6 1 區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)免疫接種動物，優選地小鼠，測定與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6專一結合之抗體的胺基酸序列，接著視需要人源化或產生嵌合抗體，並表現該抗體。表現系統可為重組的或無細胞表現系統。適用於重組表現的宿主細胞為原核細胞和真核細胞。較佳的為哺乳動物表現系統。
胜肽變體
本發明之抗體或抗原結合片段不限於文中所提供的特定胜肽序列。相反地，本發明亦具體呈現這些多肽的變體。有關本揭示文及習知可取得的技術和參考文獻，熟習工作者應能製備、檢測和利用文中所揭示之抗體的功能性變體，而了解這些具有與CEACAM6結合之能力的變體係落在本發明之範圍內。
關於文中所揭示的胜肽序列，變體可包括，例如具有至少一個改變的補體決定區(CDR)(高變)及/或框架(FR)(可變)區/位置之抗體。
藉由改變CDR或FR區內的一或多個胺基酸殘基，熟習工作者可例行地產生突變或衍生的抗體序列，其例如可針對抗原就新穎的或改良性質進行篩選。
本發明另一較佳的實施例為其中VH和VL序列係如表1中所示作選擇之抗體或抗原結合片段。熟習工作者可使用表1的資料來設計在本發明範圍內的胜肽變體。較佳的，變體係藉由改變一或多個CDR區內的胺基酸來建構；變體亦可具有一或多個改變的框架區。亦可在框架區內進行改變。例如，可改變胜肽FR區，其相較於生殖系序列，在殘基中有一變異。
另一種選擇，熟習工作者應能藉由比較文中所揭示的胺基酸序列與相同種類的此等抗體之已知序列，進行相同分析，使用，例如Knappik A.,et al.,JMB 2000,296：57-86所述之製程。
再者，可藉由使用一抗體作為起始點進行進一步最適化，藉由多樣化抗體中的一或多個胺基酸殘基，較佳地一或多個CDR中的胺基酸殘基，藉由就具有改良性質的變體篩選所收集的抗體變體，而得到變體。特佳的為多樣化VL及/或VH之CDR3中的一或多個胺基酸殘基。多樣化可，例如藉由使用三核苷酸(TRIM)突變技術合成一批DNA分子來進行(Virnekäs B. et al.,Nucl.Acids Res.1994,22：5600.)。抗體或其抗原結合片段包括帶有修飾/變異之分子，其包括，但不限於，例如導致半衰期改變(例如Fc部份之修飾或連接另外的分子例如PEG)，親和力改變或ADCC或CDC活性改變之修飾。
保守性胺基酸變體
可製造保留文中所述的抗體胜肽序列之整個分子結構的多肽變體。有鑒於個別胺基酸之性質，熟習工作者應能了解某些合理的取代。例如，以涉及的殘基之極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性及/或兩性性質為基礎，可進行胺基酸取代，亦即「保守性取代」。
例如，(a)非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；(b)極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；(c)帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；及(d)帶負電(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。取代作用典型地可在(a)-(d)群中進行。此外，甘胺酸和脯胺酸可以其擾亂α-螺旋之能力為基準取代另外的胺基酸。同樣地，特定的胺基酸，例如丙胺酸、半胱胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、組胺酸和離胺酸更常在α-螺旋中發現，而纈胺酸、異白胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸和蘇胺酸更常在β-摺板中發現。甘胺酸、絲胺酸、天門冬胺酸、天門冬醯胺酸和脯胺酸通常交替發現。某些較佳的取代可在下列基群中進行：(i)S和T；(ii)P和G；以及(iii)A、V、L和I。若有已知遺傳碼和重組以及合成的DNA技術，熟習技術的科學家可容易地建構編碼保守性胺基酸變體之DNA。
糖基化變體
當此抗體包括一Fc區，與其連接的碳水化合物可能改變。由哺乳動物細胞所產生的天然抗體典型地係包括一支鏈、雙觸角寡醣，其一般係藉由N-鏈連與Asn297相連接(使用Fc區之CH2結構域的Kabat EU編號)；參見，例如Wright et al.Trends Biotechnol.15：26-32(1997)。
在特定的實施例中，文中所提供的抗體係經改變以增加或降低抗體糖基化的程度。添加或刪除一抗體之糖基化位置可方便地藉由改變表現系統 (例如宿主細胞)及/或藉由改變胺基酸序列來製造或移除一或多個糖基化位置來進行。
在本發明一實施例中，具有降低的效應子功能之無糖基化抗體或抗體衍生物可藉由在一原核細胞宿主中表現來製備。適合的原核細胞宿主包括，但不限於結腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的各菌種。
在一實施例中，係提供具有降低效應子功能之抗體變體，其特徵為在該抗體Fc部份之CH2區的保守N-連接位置有一修飾。在本發明一實施例中，此修飾係包括在重鏈糖基化位置之突變，以防止該位置之糖基化。因此，在本發明一較佳的實施例中，此無糖基化抗體或抗體衍生物可藉由重鏈糖基化位置之突變，亦即使用Kabat EU編號N297之突變及於適當的宿主細胞中表現來製備。
在本發明另外的實施例中，無糖基化抗體或抗體衍生物係具有降低的效應子功能，其中在該抗體或抗體衍生物Fc部份之CH2區的保守N-連接位置之修飾係包括移除CH2區聚糖-亦即去糖基化。這些無糖基抗體可藉由習用的方法及然後酵素性去糖基化來產生。用於抗體之酵素性去糖基化已為本項技術所知(例如Winkelhake & Nicolson(1976),J Biol Chem.251(4)：1074-80)。
在本發明另外的實施例中，去糖基化可使用糖基化抑制劑衣黴素(tunicamycin)來進行(Nose & Wigzell(1983),Proc Natl Acad Sci USA,80(21)：6632-6)。亦即，此修飾為在該抗體Fc部份之CH2區的保守N-連接位置防止糖基化。
在一實施例中，係提供具有一碳水化合物結構之抗體變體，而該碳水化合物結構係缺乏與Fc區連接(直接或間接)之岩藻糖。例如，在此等抗體中，岩藻糖的量可從1%至80%，從1%至65%，從5%至65%或從20%至40%。岩藻糖的量係藉由計算Asn297之糖鏈內岩藻糖的平均量，相對於連接Asn 297的所有糖結構總和(例如複合、混合之和高甘露糖結構)來測定，例如，如WO 2008/077546中所述以MALDI-TOF質譜測量。Asn297係指 位於Fc區之約297位置的天門冬醯胺酸殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，由於抗體中的小序列變異，Asn297亦可能位於297位置之上游或下游約±3個胺基酸，亦即在位置294和300之間。此岩藻糖基化變體可能具有改良的ADCC功能。
關於「去岩藻糖化」或「缺乏岩藻糖」抗體之刊物的實例包括：Okazaki et al.J Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)。
能產生去岩藻糖化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白岩藻糖化之Lec13 CHO細胞(Ripka et al.Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；and WO 2004/056312)，及基因剔除細胞株，例如α-1,6-岩藻糖移轉酶基因、FUT8基因剔除CHO細胞(參見，例如Yamane-Ohnuki et al.Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006))。
進一步係提供具有對分寡醣之抗體變體，例如其中與抗體Fc區連接的雙觸角寡醣係被GlcNAc對分。此等抗體變體具有降低的岩藻糖基化及/或改良的ADCC功能。此等抗體變體之實例係描述於，例如WO 2003/011878；美國專利第6,602,684號；及US 2005/0123546中。
亦提供在與Fc區連接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。此等抗體變體可能具有改良的CDC功能。此等抗體變體係描述於，例如WO1997/30087；WO1998/58964；及WO1999/22764中。
Fc區變體
在特定的實施例中，可將一或多個胺基酸修飾(例如取代)導入文中所提供的抗體Fc區(例如，人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，藉此產生一Fc區變體。
在特定的實施例中，本發明係涵蓋一具有某些但非全部效應子功能之抗體變體，使其成為一所欲的候選抗體，供其中活體內半衰期為重要的但特定效應子功能(例如補體和ADCC)並非必要或有害之應用。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認降低/消耗的CDC及/或ADCC活性。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保此抗體係缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。在某些實施例中，可改變Fc區，產 生改變的(亦即，增進或減少)C1q結合及/或補體依賴的細胞毒性(CDC)。
在特定的實施例中，本發明係涵蓋具有增加或降低的半衰期之抗體變體。具有增加的半衰期及增進新生兒Fc受體(FcRn)結合之抗體，其造成母體IgG轉移到胎兒(Guyer et al.,J Immunol.117：587(1976)及Kim et al.,J Immunol.24：249(1994))，係描述於US2005/0014934(Hinton et al.)。這些抗體係包括一Fc區，其內具有一或多個增進Fc區與FcRn結合之取代。
抗體-藥物接合物(ADC)
本發明亦提供抗體-藥物接合物(ADC，免疫接合物)，其係包括與一或多個細胞毒性劑，例如化療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素，細菌、真菌、植物、人類或動物來源之酵素性活性毒素或其片段)或放射性同位素接合之抗-CEACAM6抗體。
在一實施例中，免疫接合物為一抗體-藥物接合物(ADC)其中抗體係與一或多個藥物接合，其包括(但不限於)類美坦素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020、5,416,064號及歐洲專利EP0425235)；奥里斯他汀(auristatin)例如單甲基奥里斯他汀藥物基團DE和DF(MMAE和MMAF)(參見美國專利第5,635,483和5,780,588及7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；a卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物；蒽環類例如柔紅黴素(daunomycin)或艾黴素(doxorubicin)；甲氨喋呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)例如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉洛他賽(larotaxel)、歐洲紫杉醇(tesetaxel)和歐塔紫杉醇(Ortataxel)；單端孢黴毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另外的實施例中，免疫接合物係包括與一酵素活性毒素或其片段接合之如文中所述的抗體，其包括(但不限於)白喉毒素A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、菌麻毒素A鏈(ricin A chain)、相思豆毒蛋白A鏈(abrin A chain)，蒴蓮根毒素A鏈(modeccin A chain)、α帚麯黴素(alphasarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(P API、P APII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、 絲林黴素(mitogellin)、局限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、伊諾黴素(enomycin)和單端孢黴毒素(tricothecenes)。
在另外的實施例中，免疫接合物係包括與一放射性原子接合之如文中所述的抗體而形成一放射性接合物。可取得各種放射性同位素供製造放射性接合物。實例包括227Th、225Ac、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212Pb和Lu的放射性同位素。當放射性接合物係用於偵測時，其可含有一用於閃爍造影研究之放射活性原子，例如Tc99m，或用於核磁共振(NMR)造影之自旋標記，例如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
可使用各種雙功能蛋白偶合劑，例如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亞胺基硫烷(IT)、亞胺酸酯的雙功能衍生物(如己二亞胺二甲酯HCl)、活性酯(如二琥珀醯亞胺辛二酸酯)、醛類(如戊二醛)、雙-疊氮化合物(例如雙(對-疊氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，來製造抗體和細胞毒性劑之接合物。
連接子可為促進細胞中細胞毒性藥物釋放之「可裂解連接子」。例如，酸敏感連接子、胜肽酶敏感連接子、光敏感連接子、二甲基連接子或含二硫化物之連接子(Chari et al.,Cancer Res.52：12 7-131(1992)。
文中免疫接合物或ADC明確地係涵蓋(但不限於)以交鏈試劑所製備的接合物，該等交鏈試劑係包括(但不限於)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB以及SVSB(琥珀醯亞胺-(4-乙烯碸)苯甲酸酯)，其可從市面上獲得(例如，得自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
本發明之DNA分子
本發明亦關於編碼本發明之抗體或其抗原結合片段之DNA分子。用於表現抗體的DNA序列係如表32所示。這些序列在特定的情況下係針對哺乳動物表現進行最適化。本發明之DNA分子不限於文中所揭示的序列，並 且包括其變體。本發明內的DNA變體可就其在雜交中的生理性質來描述。熟習工作者應了解，使用核酸雜交技術，DNA可用於鑑別其補體以及，因為DNA為雙股的，其同等物或同源物。亦應了解，雜交可以低於100%互補性發生。然而，若選擇適當條件，雜交技術可就其與特定探針的結構相關性為基礎，用於分辨DNA序列。就有關此等條件的指南，請參見Sambrook et al.,1989 supra and Ausubel et al.,1995(Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,& Struhl,K.eds.(1995).Current Protocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons)。
二個聚核苷酸序列間的結構類似性可以二序列相互雜交之條件的「嚴格性」作為函數來表示。如文中所用，術語「嚴格性」係指條件不利於雜交之程度。嚴格的條件強烈不利於雜交，且僅結構上最相關的分子可於此條件下彼此雜交。相反地，非嚴格條件有利於具有較低程度結構相關性之分子雜交。雜交嚴格性因此直接與二個核酸序列的結構關係相關聯。
雜交嚴格性為許多因子的函數，包括整個DNA濃度、離子強度、溫度、探針大小和擾亂氫鍵結合之試劑的存在。促進雜交的因子包括高DNA濃度、高離子強度、低溫、較長探針和無擾亂氫鍵結合之試劑。雜交典型地係以二相來進行：「結合」相和「清洗」相。
功能上均等的DNA變體
又另一種本發明範圍內的DNA變體可就其編碼的產物來描述。由於遺傳密碼的退化，這些功能上均等的聚核苷酸其特徵為，其係編碼相同胜肽序列之事實。
請了解，文中所提供的DNA分子之變體可以數種方式來建構。例如，其可建構為完全合成的DNA。有效合成寡核苷酸之方法可廣泛取得。參見Ausubel et al.,section 2.11,Supplement 21(1993)。重疊的寡核苷酸可藉由Khorana et al.,J.Mol.Biol.72：209-217(1971)首先提出的方法來合成及組合；亦參見Ausubel et al.,supra,Section 8.2。合成的DNA較佳地係以在基因的5'和3'端工程化的合宜限制位置來設計，以幫助選殖到適當的載體。
如所示，產生變體係以文中所揭示的DNA之一開始及然後導入定位突變。參見Ausubel et al.，前文，chapter 8,Supplement 37(1997)。在一典型的 方法中，係將目標DNA選殖到一單股DNA噬菌體載體。將單股DNA分離並與含有所欲核苷酸改變之寡核苷酸雜交。合成互補股並將雙股的噬菌體導入一宿主中。某些所產生的子代將含有所欲的突變，其可使用DNA定序來確認。此外，可取得增加子代噬菌體為所欲的突變物之可能性的各種方法。這些方法已為本領域所熟知並可從市面上購得供產生此等突變物。
重組的DNA結構和表現
本發明進一步係提供包括一或多個本發明核苷酸序列之重組的DNA結構(參見表32)。本發明之重組結構可用於連接載體，例如質體、噬菌體或病毒載體，將編碼本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體之DNA分子插入其中。
文中所提供的抗體、抗原結合部份或其變體可藉由於一宿主細胞中重組表現編碼輕鏈和重鏈或其部份之核酸序列來製備。就重組表現一抗體、抗原結合部份或其變體，可以一或多個帶有編碼輕鏈和重鏈或其部份之DNA片段的重組表現載體轉染宿主細胞，使得此輕鏈和重鏈表現在此宿主細胞中。使用標準的重組DNA法離製備及/或獲得編碼輕鏈和重鏈之核酸，將這些核酸併入重組表現載體中並將載體導入宿主細胞，例如該等Sambrook,Fritsch and Maniatis(eds.),Molecular Cloning；A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.et al.(eds.)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,(1989)及Boss等人之美國專利第4,816,397號中所述。
此外，編碼重鏈及/或輕鏈可變區之核酸序列可，例如，轉變成編碼全長抗體鏈、Fab片段或scFv之核酸序列。VL-或VH-編碼DNA片段可操作上連接(s使得由DNA片段所編碼的胺基酸序列係在框內)另外的編碼，例如抗體恆定區或柔性連接子之DNA片段。人類重鏈和輕鏈恆定區之序列已為本項技術所知(參見，例如Kabat,E.A.,el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242)且涵蓋這些區的DNA片段可藉由標準的PCR增幅來取得。
就製造一編碼scFv之聚核苷酸序列，VH-和VL-編碼核酸可操作上連 接另外的編碼柔性連接子之片段，使得此VH和VL序列可以連續單鏈蛋白表現，其中此VL和VH區係藉由柔性連接子相連(參見，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.,Nature(1990)348：552-554)。
就表現抗體、抗原結合片段或其變體，可使用標準的重組DNA表現方法(參見，列如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。例如，編碼所欲多肽之DNA可插入表現載體中，然後將其轉染至適合的宿主細胞。適合的宿主細胞為原核和真核細胞。原核宿主細胞之實例有，例如細菌，真核宿主細胞之實例有酵母菌、昆蟲和昆蟲細胞、植物和植物細胞、基因轉殖動物或哺乳動物細胞。在某些實施例中，編碼重鏈和輕鏈的DNA係插入分開的載體。在其他的實施例中，編碼重鏈和輕鏈的DNA係插入相同的載體。請了解，表現載體的設計，包括選擇調節序列係受到例如選擇的宿主細胞；所希望的蛋白表現量以及該表現是否為持續性或誘導性等因子所影響。
因此，本發明之一實施例亦為包括此載體或核酸分子之宿主細胞，因而此宿主細胞可為高等真核宿主細胞，例如哺乳動物細胞，低等真核宿主細胞，例如酵母菌細胞，且可為原核細胞，例如細菌細胞。
本發明另外的實施例為使用此宿主細胞製造抗體及抗原結合片段之方法，其包括於適合的條件下培養此宿主細胞並回收該抗體。
因此本發明另外的實施例為以本發明之宿主細胞製造本發明抗體及將這些抗體純化到至少95%重量比之均勻性。
細菌表現
用於細菌用途之有用的表現載體係藉由將編碼所欲蛋白之DNA序列與適合的轉錄起始和終止訊號共同於可操作的閱讀相中以一功能性啟動子插入來建構。此載體將包括一或多個可選擇標記和一複製源用以確保載體之維護，若需要，提供宿主內的增幅。適用於轉化的原核宿主包括(但不限於)結腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)以及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)的各菌種。
細菌載體可為，例如噬菌體、質體或噬粒。這些載體可含有一選擇性標記及一衍生自市售質體之細菌性複製源，其典型地係含有熟知的選殖載體pBR322(ATCC 37017)之元素。在轉化適合的宿主細胞株及宿主細胞株生長至適合的細胞密度後，以適當方法(例如溫度變換或化學誘導)去阻遏/誘導所選的啟動子並將細胞另再培養一段時間。典型地係以離心、物理或化學方法破壞來收取細胞，並保留產生的粗萃取物進行進一步的純化。
在細菌系統中，許多表現載體可依照所表現蛋白之希望用途有利地作選擇。例如，當欲產生大量此一蛋白時，就產生抗體或篩選胜肽庫，例如可容易純化之針對高表現量的融合蛋白產物的載體為所希望的。
因此，本發明一實施例為一表現載體，其係包括編碼本發明之新穎抗體的核酸序列。
本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體包括天然純化的產物，化學合成製程之產物及以重組技術由原核宿主，包括，例如結腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙氏桿菌以及假單胞菌屬、鏈黴菌屬和葡萄球菌屬的各菌種，較佳地結腸桿菌細胞所製造的產物。
哺乳動物表現
用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳的調節序列包括針對哺乳細胞中高量蛋白表現之病毒元素，例如衍生自巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒之啟動子及/或增強子。抗體的表現可為持續的或調節性(例如藉由加入或移除小分子誘導劑，例如四環黴素結合Tet系統所誘導)。就病毒調節元素及其序列之進一步說明，請參見Stinski之U.S.5,168,062，Bell等人之U.S.4,510,245及Schaffner等人之U.S.4,968,615。重組表現載體亦可包括複製源和可選擇標記(參見，例如U.S.4,399,216、4,634,665和U.S.5,179,017)。適合的可選擇標記包括賦予抗藥性之基因例如G418、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、殺稻瘟菌素(blasticidin)、zeocin/博莱黴素(bleomycin)或甲胺蝶呤(methotrexate)或利用已導入載體的宿主細胞上營養缺陷之可選擇標記，例如麩醯胺酸合成酶(Bebbington et al.,Biotechnology(N Y).1992 Feb；10(2)：169-75)。例如，二 氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予抗甲胺喋呤抗性，neo基因係賦予抗G418抗性，來自土麴黴(Aspergillus terreus)之bsd基因係賦予抗殺稻瘟菌素之抗性，嘌呤黴素N-乙醯基-轉移酶係賦予抗嘌呤黴素之抗性，Sh ble基因產物係賦予抗zeocin之抗性及抗潮黴素係由結腸桿菌抗潮黴素基因(hyg或hph)所賦予。可選擇的標記如DHFR或麩醯胺酸合成酶亦可用於聯合MTX和MSX之增幅技術。
表現載體轉染至宿主細胞可使用標準技術來進行，例如電穿孔、核轉染、鈣-磷酸鹽沉澱、脂質轉染、聚陽離子為基礎之轉染，例如聚乙烯亞胺(PEI)-為基礎的轉染及DEAE-葡聚醣轉染。
用於文中所提供的表現抗體、其抗原結合片段或其變體之適合的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)例如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV[包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220及Urlaub et al.,Cell.1983 Jun；33(2)：405-12，與DHFR選擇性標記一起使用，例如，如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621中所述；及Fan et al.,Biotechnol Bioeng.2012 Apr；109(4)：1007-15中作為示例的其他基因剔除細胞、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、HEK293細胞、HKB11細胞、BHK21細胞、CAP細胞、EB66細胞及SP2細胞。
表現在表現系統中亦可為過渡性或半穩定性，例如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-Freestyle、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO Freestyle、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T細胞(例如Durocher et al.,Nucleic Acids Res.2002 Jan 15；30(2)：E9)。
在某些實施例中，表現載體係經設計使得表現的蛋白分泌至宿主細胞生長的培養基中。可使用純化方法從培養基回收此抗體、其抗原結合片段或其變體。
純化
本發明抗體或其抗原結合片段或其變體可藉由熟知的方法從重組細胞培養中回收及純化，其包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沉澱、酸萃取、蛋白A 層析、、蛋白G層析、陰離子或陽離子交換層析、磷酸-纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集素(lectin)層析。亦可應用高效液相層析(「HPLC」)進行純化。參見，例如Colligan,Current Protocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science,John Wiley & Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如第1,4,6,8,9,10章，各自係以全文引用方式併入本文中。
本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體包括天然純化的產物，化學合成製程之產物及以重組技術由真核宿主細胞，例如酵母菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞所製造的產物。依照重組生產製程中所用的宿主，本發明之抗體可糖基化或可非糖基化。此等方法係描述於許多標準試驗室手冊中，例如Sambrook，前文，Sections 17.37-17.42；Ausubel，前文，第10,12,13,16,18和20章。
在較佳的實施例中，如，例如以勞理法(Lowry method)、UV-Vis光譜法或以SDS-毛細管凝膠電泳(例如於Caliper LabChip GXII,GX 90或Biorad Bioanalyzer裝置上)所測，抗體係純化至(1)大於95%重量比的抗體，及在另一較佳的實施例中係大於99%重量比，(2)足以得到N-端或內部胺基酸序列的至少15個殘基之程度，或(3)以SDS-PAGE於還原或非還原條件下使用考馬斯亮藍，或較佳地銀染色，純化至均質。分離的天然生成抗體包括原本在重組細胞內的抗體，因為至少有一種的抗體自然環境組份不存在。然而，一般而言，分離的抗體係以至少一純化步驟來製備。
治療方法
治療方法係涉及於有此需要的對象中投予一治療上有效量之本發明所述的抗體或其抗原結合片段或其變體。「治療上有效」量據此係定義為抗體或抗原結合片段之量為降低CEACAM6陽性細胞之增生或在此對象的治療區域降低CEACAM6表現腫瘤大小之足夠量-以單一劑量或根據單獨或與其他治療劑組合之多劑量療法，其導致有害的症狀減輕，且該量為毒物學上可耐受的。此對象可為人類或非-人類動物(例如，兔、大鼠、小鼠、狗、猴子或其他低層級靈長類)。
本發明一實施例係提供一抗體或其抗原結合片段用作為醫藥品。
本發明一實施例係提供一抗體或其抗原結合片段，用作為治療癌症之醫藥品。在一較佳的實施例中，此癌症為腫瘤，及在一最佳實施例中，此癌症為實體腫瘤。
本發明一實施例係將此抗體或其抗原結合片段用於製造醫藥品供治療一疾病。本發明一實施例係將此抗體或其抗原結合片段用於製造醫藥品供治療癌症。在一較佳的實施例中此癌症為腫瘤，及在一最佳實施例中，此癌症為實體腫瘤。
本發明抗體或其抗原結合片段可用於各種具有異常CEACAM6-訊號傳遞之情況中作為治療或診斷工具，例如細胞增生病症，例如癌症或纖維化疾病。特別適合以本發明抗體治療之病症和症狀有實體腫瘤，例如乳房、呼吸道、腦、生殖器官、尿道、肝、皮膚、頭和頸部、甲狀腺、副甲狀腺之癌症及其遠端轉移。這些病症亦包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。
消化道腫瘤包括(但不限於)肛門、結腸、大常直腸、食道、膽、胃、胰臟、直腸、小腸和唾腺癌。
食道癌之實例包括(但不限於)食道細胞癌和腺癌，以及鱗狀細胞癌、平滑肌肉瘤、惡性黑色素瘤、橫紋肌肉瘤和淋巴瘤。
胃癌之實例包括(但不限於)腸內型和擴散型胃腺癌。
胰臟癌之實例包括(但不限於)導管腺癌、腺癌和胰臟內分泌腫瘤。
乳癌之實例包括(但不限於)三陰性乳癌、侵入性乳管癌、侵入性乳小葉癌、乳管原位癌和乳小葉原位癌。
呼吸道癌症之實例包括(但不限於)小細胞和非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤。
腦癌之實例包括(但不限於)腦幹和下視丘膠質瘤、小腦和大腦星形細胞瘤、膠質母細胞瘤、髓質母細胞瘤、小腦室管膜瘤以及神經外胚瘤和松果體腫瘤。
男性生殖器官之腫瘤包括(但不限於)前列腺和睪丸癌。女性生殖器官之腫瘤包括(但不限於)子宮內膜癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和陰門癌，以及尿到肉瘤。
卵巢癌之實例包括(但不限於)漿液性腫瘤、內膜樣瘤、黏液性囊腺癌、 顆粒細胞瘤、塞-萊二氏細胞瘤、含睾丸細胞之卵巢腺瘤。
子宮頸癌之實例包括(但不限於)鱗狀細胞癌、腺癌、腺鱗狀癌、小細胞癌、神經內分泌瘤、透明細胞癌和乳頭狀腺癌。
尿道之腫瘤包括(但不限於)膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管、尿道及遺傳和偶發乳頭狀腎癌。
腎癌之實例包括(但不限於)腎細胞癌、泌尿上皮細胞癌、腎小球旁細胞瘤(腎素瘤)、腎血管平滑肌脂肪瘤、腎嗜酸細胞瘤、腎集尿管癌(Bellini duct carcinoma)、透明細胞肉瘤、威廉氏瘤(Wilms' tumor)。
膀胱癌之實例包括(但不限於)過渡上皮細胞癌、鱗狀細胞癌、腺癌、肉瘤和小細胞癌。
眼癌包括(但不限於)眼內黑色素瘤和視網膜母細胞瘤。
肝癌之實例包括(但不限於)肝細胞癌(有或無纖維板層樣變異之肝細胞癌)、膽管癌(肝內型膽管癌)及混合型肝細胞膽管癌。
皮膚癌包括(但不限於)鱗狀細胞癌、卡波氏肉瘤、惡性黑色素瘤、默克細胞皮膚癌及非黑色素瘤皮膚癌。
頭頸癌包括(但不限於)頭和頸之鱗狀細胞癌、喉頭、下咽、鼻咽、口咽癌、唾腺癌、嘴唇和口腔癌及鱗狀細胞癌。
淋巴癌包括(但不限於)AIDS-相關的淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、勃氏淋巴瘤、何杰金淋巴瘤和中樞神經系統的淋巴瘤。
肉瘤包括(但不限於)軟組織的肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。
白血病包括(但不限於)急性骨髓母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓性白血病和髮細胞白血病。
在一較佳的實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段係適用於治療或診斷包括在下列組成之群中的癌症疾病之治療或診斷方法：結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胰臟癌、胃癌、乳癌和多發性骨髓瘤。
此外，本發明抗體或其抗原結合片段亦可作為治療或診斷工具用於各種其中涉及CEACAM6之其他病症，例如(但不限於)流行性感冒、克隆氏 症、發炎性腸道疾病、乾癬、肺囊狀纖維化、預防細菌擴散至胃腸道、創傷、出血性灼傷、手術、中風、心肌梗塞、敗血症、肺炎、感染和癌症之疫苗接種、慢性病毒感染。
上述之疾病以在人類中已被完整定性，但在其他動物，包括哺乳動物中亦存有類似病因學，並可藉由投予本發明醫藥組成物來治療。
本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體可與已知的醫藥品共投予，且在某些情況下此抗體本身可經修飾。例如抗體或其抗原結合片段或其變體可與一細胞毒性劑或放射性同位素接合而可能進一步增加效用。
本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體可以單獨的醫藥劑或與一或多種另外的治療劑組合給藥，其中該組合不會造成不可接受的有害效應。此組合治療包括單一醫藥劑量調配物之給藥，而該調配物係含有本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體及一或多種另外的治療劑，以及本發明之抗體和另外的治療以個別分開的醫藥劑量調配物來給藥。例如，本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體和一治療劑可以單一液體組成物一起投予病患，或各藥劑可以分開的劑量調配物來給藥。
當使用分開的劑量調配物時，本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體及一或多種另外的治療劑可於基本上相同的時間(例如同時)或於分開錯開的時間(例如先後)給藥。
特言之，本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體可固定或分開與其他抗腫瘤劑，例如烷化劑、抗代謝物、植物衍生的抗腫瘤劑、荷爾蒙治療劑、拓樸異構酶抑制劑、免疫藥物、抗體、抗體藥物、生物反應修飾劑、抗血管新生化合物、細胞治療及其他抗腫瘤藥物，包括(但不限於)喜樹鹼(camptothecin)衍生物、激酶抑制劑、標靶藥，組合使用。
就此，下列為可與本發明之抗體組合使用之第二藥劑實例的非限定列表：烷化劑包括(但不限於)氮芥N-氧化物、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosfamide)、、噻替派(thiotepa)、雷莫司汀(ranimustine)、尼莫司汀(nimustine)、替莫唑胺(temozolomide)、六甲密胺(altretamine)、阿扎丙宗(apaziquone)、brostallicin、苯達莫司汀(bendamustine)、卡莫司汀(carmustine)、雌莫司汀 (estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、葡磷醯胺(glufosfamide)、馬磷醯胺(mafosfamide)、苯達莫司汀(bendamustine)及二溴衛矛醇(mitolactol)；鉑配位烷基化化合物包括但不限於順鉑、卡鉑、依他鉑(eptaplatin)、洛鉑(lobaplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑或沙鉑(satraplatin)；抗代謝物包括(但不限於)甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤核苷、巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)單獨或與甲醯四氫葉酸(leucovorin)組合、呋氟啶(tegafur)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷硬脂酸鹽(cytarabine ocfosfate)、依諾他濱(enocitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、氟達拉濱(fludarabine)、5-阿札胞苷(5-azactidine)、卡培他濱(capecitabine)、克拉曲濱(cladribine)、克羅拉濱(clofarabine)、地西他濱(decitabine)、依氟鳥氨酸(eflornithine)、乙炔基胞苷、胞嘧啶阿糖胞苷、羥基脲、TS-1、美法蘭(melphalan)、奈拉濱(nelarabine)、諾拉曲塞(nolatrexed)、ocfosfite、培美曲唑二鈉(disodium premetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、吡利曲索(pelitrexol)、雷替曲賽(reltitrexed)、triapine、三甲曲沙(trimetrexate)、阿糖腺苷(vidarabine)、長春新鹼(vincristine)和長春瑞濱(vinorelbine)；荷爾蒙治療劑包括(但不限於)依西美坦(exemestane)、亮丙瑞林(Lupron)、阿那曲唑(anastrozole)、度骨化醇(doxercalciferol)、法倔唑(fadrozole)、福美坦(formestane)、11β-羥基類固醇脫氫酶I型抑制劑、17α-羥化酶/17,20裂解酶抑制劑例如醋酸阿比特龍(Abiraterone Acetate)、5-α還原酶抑制劑例如菲那雄胺(finasteride)和愛普列特(epristeride)，抗雌激素例如如他莫西芬檸檬酸鹽(tamoxifen citrate)和氟維司群(fulvestrant)、Trelstar、托瑞米芬(toremifene)、雷洛西芬(raloxifene)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)，抗雄激素，例如比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、米非司酮(mifepristone)、尼魯米特(nilutamide)、Casodex和抗黃體素(anti-progesterone)及其組合；植物衍生的抗腫瘤物質包括，例如該等選自有絲分裂抑制劑，例如埃博黴素(epothilone)，如沙戈匹隆(sagopilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)和埃博黴素B、長春氟寧(vinflunine)、長春鹼(vinblastine)、多西紫杉醇(docetaxel)及太平洋紫杉醇；細胞毒性拓樸異構酶抑制劑包括(但不限於)阿柔比星(aclarubicin)、艾黴 素(doxorubicin)、氨萘非特(amonafide)、貝洛替康(belotecan)、喜樹鹼、10-羥基喜樹鹼、9-胺基喜樹鹼、氟替康(diflomotecan)、伊立替康(Irinotecan)、拓普康(topotecan)、艾特哢林(edotecarin)、表柔比星(epimbicin)、依託泊甙(etoposide)、依沙替康(exatecan)、吉馬替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、吡柔比星(pirambicin)、吡蒽醌(pixantrone)、盧比替康(rubitecan)、索布佐生(sobuzoxane)、他氣泊苷(tafluposide)和拓撲替康(topotecan)及其組合；免疫藥物包括干擾素，例如干擾素α、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素β、干擾素γ-1a或干擾素γ-n1、GM-CSF及其它的免疫增強劑，例如L19-IL2和其他IL2衍生物、非格司亭(filgrastim)、蘑菇多糖(lentinan)、裂皺菌素(sizofilan)、TheraCys、烏苯美司(ubenimex)、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、BAM-002、氮烯咪胺(dacarbazine)、達克珠單抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉妥單抗(gemtuzumab)、奧佐米星(ozogamicin)、替伊莫單抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、來諾拉提(lenograstim)、蘑菇多糖、黑色素瘤疫苗(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、沙莫司亭(sargramostim)、他索納明(tasonermin)、泰克白介素(tecleukin)、胸腺拉新(thymalasin)、托西莫單抗(tositumomab)、維魯利秦(virulizin)、依帕珠單抗(epratuzumab)、米妥莫單抗(mitumomab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(pemtumomab)、Provenge；ALNX6000、烏瑞蘆單抗(Urelumab)、PF-005082566、Galunisertib、AZ10606120、NF340、BMS-777607；免疫藥物亦包括針對免疫檢查點調節劑或共抑制受體之藥物，其包括(但不限於)CTLA-4、PD1、PD-L1、B7-H3受體、B7-H4受體、BTLA、TIM3、LAG3、KIRDL、2B4、VISTA、CD244、CD160、TIGIT、CEACAM1、CEACAM5、HHLA2。特言之，某些此等藥物為易普利單抗(Ipilimumab)、曲美木單抗(Tremelimumab)、納武單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)、Pidilizumab、AMP-224、AMP-514、PDR001、MDX1105、BMS-936,559、Atezolizumab、Medi4736、Avelumab、MSB0010718C、MGA271、IMP321、BMS-986,016、巴維昔單抗(Bavituximab)、MNRP1685A、希樂葆(Celecoxib)、PF-04418948、RQ-15986； 免疫藥物亦包括針對共刺激受體之活化劑的藥物，其包括(但不限於)CD28、ICOS、4-1BB、OX40、CD27、KIRDS、GITR、HVEM、TNFRSF25、CD40L.TMIGD2、TIM-1、CEACAM1、CEACAM5。這些藥物中有CP-870893、魯卡木單抗(Lucatumumab)、達西珠單抗(Dacetuzumab)、抗-OX40、MEDI0562、MEDI6469、MEDI6383、CDX-1127、TRX518、Varlilumab；免疫藥物亦包括調節Treg活性之藥物，其包括(但不限於)FOXP3、CD25、CCR4。在這些藥物中有達昔單抗(daclizumab)；免疫藥物亦包括針對調節骨髓衍生的抑制細胞之活性的藥劑，其包括(但不限於)CSF1R。實例有emactuzumab、Taladafil；免疫藥物亦包括調節先天免疫反應之藥劑，包括針對類鐸受体之藥劑，其包括(但不限於)TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、NGK2A、NKG2D。這些藥物有，例如咪喹莫特(Imiquimod)、CPG7909(PF-3512676、CPG2006)；MGN1703、SD-101、hiltonol(Poly ICLC)、抗-NGK2A(IPH2201)、OM-174、852A、VTX-2337、IMO-2055；免疫藥物亦包括調節先天免疫細胞反應之藥劑，其包括(但不限於)CSF-1、CSF1R、KIR、ILTs、LIRs、MICA、MICB、CD244、CCL2、CD47。特言之，某些此等藥物為抗-KIR(IHP2101；IPH2101；1-7F9)；利利單抗(Lirilumab)(IPH2012；BMS-986,015)；卡魯單抗(Carlumab)(CNTO888)、IMC-CS4、FPA008、PLX3397、ARRY-382、CC-90002、抗-CD47(Hu5F9-G4)、BLZ945；免疫藥物亦包括免疫細胞再定向之藥劑，其包括(但不限於)雙專一性抗體、Darts例如抗B7-H3、Bites例如CD19xCD3；例如Removab抗-EPCAMxCD3xFC、NK細胞靶向藥劑；免疫藥物亦包括調節腫瘤微環境及改善免疫細胞浸潤和反應的藥劑，其包括疫苗和輔助劑且不限於GVAX、FVAX；就此，疫苗係包括以樹突細胞為基礎之疫苗、病毒疫苗、mRNA為基礎的疫苗、多肽為基礎的疫苗；免疫藥物亦包括改善免疫細胞浸潤之藥劑，其包括(但不限於)IFN-g、IL15、IL21、IL2、CXCR4、CXCl12。某些此等藥劑為得尼考新 (Denenicokin)(BMS982、470)、ALT-803、hetIL15、烏洛克單抗(Ulocuplumab)、BKT140、CXCR2-專一性單抗、AD3100、Maravirox、PF-4136309；免疫藥物亦包括改善APC和T細胞之啟動和活化之藥劑和形式，其包括針對但不限於m-TOR GSK3β抑制劑、承載DC(例如Provenge)、放射線治療、外粒子束放射線之藥劑；免疫藥物亦包括犬尿胺酸路徑調節劑，其包括針對但不限於IDO1、IDO2、TDO之藥劑。在這些藥物中有INCB024360、Indoximod(NLG8189；1甲基-D-色胺酸、D-1MT)、GDC-0919、NLG919、LM10；免疫藥物亦包括腺苷路徑調節劑，其包括針對但不限於CD39、CD73、A2A受體、A2B受體之藥物。此等藥物包括化合物9、NCX-4016、AT38、SCH58261、SCH420814、PSB1115、ARL67176、AMPCP；免疫藥物亦包括TGFbeta/ALK5路徑調節劑。此等藥物包括OY2157299、EW-7187；免疫藥物亦包括Sting活化劑；生物反應修飾劑為修飾活有機體或生物反應防禦機制的藥物，例如組織細胞存活、生長或分化，使其具有抗腫瘤活性；些藥劑包括，例如雲芝多糖(krestin)、蘑菇多糖(lentinan)、西佐糖(sizofiran)、溶鏈菌(picibanil)、ProMune和烏苯美司(ubenimex)；抗血管新生化合物包括(但不限於)阿昔曲丁(acitretin)、阿柏西普(aflibercept)、血管生長抑素(angiostatin)、阿普利汀(aplidine)、阿斯拓(asentar)、阿西替尼(axitinib)、貝伐單抗(bevacizumab)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninat)、斯冷替(cilengtide)、考布他汀(combretastatin)、血管內皮抑素(endostatin)、芬維A胺(fenretinide)、溴氯呱喹酮(halofuginone)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠單抗(ranibizumab)、瑞比瑪斯特(rebimastat)、西地尼布(recentin)、瑞莫伐(removab)、瑞復美(revlimid)、索拉非尼(sorafenib)、角鯊胺(squalamine)、舒尼替尼(sunitinib)、替拉替尼(telatinib)、沙利竇邁(thalidomide)、烏可蘭(ukrain)、瓦他拉尼(vatalanib)、維他命(vitaxin)；抗血管新生劑亦包括VEGF抑制劑，其包括(但不限於)索拉非尼 (sorafenib)、瑞格非尼(regorafenib)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、西地尼布(recentin)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninat)、瓦他拉尼(vatalanib)、帕唑帕尼(pazopanib)和雷珠單抗(ranibizumab)；抗體藥物包括(但不限於)曲妥珠單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗(rituximab)、替斯利單抗(ticilimumab)、易普利單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、Pidilizumab、RG-7446/MPDL3280A、BMS-936559(MDX1105)、德瓦魯單抗(Durvalumab)(Medi-4736)、MSB-0010718C、魯西單抗(lumiliximab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、阿塞西普(atacicept)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)和阿侖單抗(alemtuzumab)；抗體藥物亦包括抗體藥物接合物，但不限於該靶向Mesothelin、C4.4A、FGFR2、HER2、PSMA；抗體藥物亦包括釷靶向接合物，但不限於該等靶向Mesothelin、C4.4A、FGFR2、HER2、PSMA、CEACAM6；抗體藥物亦包括雙專一性(或多專一性)抗體形式，其包括(但不限於)gG及雙專一性(或多專一性)抗體片段以及蛋白融合物及其接合物(例如CrossMab、DAF(2in1)、DAF(4in1)、DutaMab、DT-IgG、KiH組合的IgG、電荷配對組合的IgG、KiH-commonLC、Fab-臂交換、SEEDbody、Triomab、LUZ-Y、Fcab、κλ-mAb、正交Fab、DVD-IgG、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH-IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig、Zybody、DVI-IgG(4in1)、雙-奈米抗體、BiTE、雙抗體、DART、DART-Fc、TandAb、sc雙抗體、sc雙抗體-CH3、雙抗體-CH3、三抗體、微型抗體、微抗體、TriBi微抗體、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四價HCAb、sc雙抗體-Fc、雙抗體-Fc、串接scFv-Fc、內抗體、塢閘融合(Dock and Lock fusion)、ImmTAC、HSAbody、sc雙抗體-HAS、串接scFv-毒素、IgG-IgG、Cov-X-Body、scFv1-PEG-scFv2及其他)；抗體藥物亦包括藉由重組技術所產生具有類抗體結合性質的重組蛋白， 例如但不限於DARPIN分子；細胞治療包括(但不限於)從癌症患者分離腫瘤浸潤淋巴細胞，例如活體外刺激T細胞，例如Sipuleucel-T；細胞治療包括(但不限於)從癌症患者分離腫瘤浸潤淋巴細胞，例如Sipuleucel-T及帶有嵌合抗原受體(CAR)之基因工程T細胞，例如CD19-CAR-T細胞；CAR-Her2-T-細胞；其他的抗癌劑包括，例如(但不限於)阿利維A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)、貝沙羅汀(bexarotene)、波替單抗(bortezomib)、波生坦(bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、依昔舒林(exisulind)、福莫司汀(fotemustine)、依班膦酸(ibandronic acid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、I-天門冬醯胺酶、丙卡巴肼(procarbazine)、氮烯咪胺(dacarbazine)、羥基脲(hydroxycarbamide)、培加帕酶(pegaspargase)、噴司他汀(pentostatin)、他扎羅汀(tazarotne)、TLK-286、萬坷(velcade)、硝酸鎵、堪佛司非米德(canfosfamide)、darinaparsin和維甲酸(tretinoin)、PI3065、TG100-115；EGFR(HER1)抑制劑，例如西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗、維必施(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)和Zactima；HER2抑制劑，例如拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗(pertuzumab)；mTOR抑制劑，例如temsirolimus、西羅莫司(sirolimus)/雷帕黴素(Rapamycin)和依維莫司(everolimus)；c-Met抑制劑；PI3K抑制劑，例如PI3K抑制劑1(2-胺基-N-[7-甲氧基-8-(3-嗎福啉-4-基丙氧基)-2,3-二氫咪唑并[1,2-c]喹唑啉-5-基]嘧啶-5-甲醯胺二鹽酸鹽(參見WO 2012/136553之實例1和2的化合物)及AKT抑制劑；CDK抑制劑，例如roscovitine和flavopiridol；紡錘體組裝檢查點抑制劑和靶向抗有絲分裂劑，例如PLK抑制劑、Aurora抑制劑(例如，Hesperadin)、檢查點激酶抑制劑和KSP抑制劑； BRAFV600E抑制劑，例如Vemurafenib、達拉非尼(Dabrafenib)；HDAC抑制劑，例如帕比司他(panobinostat)、vorinostat、MS275、belinostat和LBH589；HSP90和HSP70抑制劑；蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(bortezomib)和卡菲佐米(carfilzomib)；絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑包括MEK抑制劑和Raf抑制劑，例如所拉菲尼；法尼基轉移酶抑制劑例如替吡法尼(tipifarnib)；酪胺酸激酶抑制劑，例如達沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotibib)、瑞格非尼(regorafenib)、博舒替尼(bosutinib)、索拉菲尼(sorafenib)、貝伐單抗、舒尼替尼(Sunitinib)、西地尼布(cediranib)、阿西替尼(axitinib)、阿柏西普(aflibercept)、替拉替尼(telatinib)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、丙胺酸布立尼布(brivanib alaninate)、帕唑帕尼(pazopanib)、雷珠單抗、瓦他拉尼(vatalanib)、西妥昔單抗、帕尼單抗、維必施(vectibix)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、曲妥珠單抗(tratuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)和c-Kit抑制劑；維生素D受體促效劑；Bcl-2蛋白抑制劑，例如obatoclax、奧利默森鈉(oblimersen sodium)和棉子酚(gossypol)；分化群20受体拮抗劑，例如，利妥昔單抗；核糖核苷酸還原酶抑制劑，例如，吉西他濱(gemcitabine)；腫瘤壞死因子細胞凋亡誘導的配體受體1促效劑，例如，馬帕木單抗(mapatumumab)；腫瘤壞死因子相關細胞凋亡誘導的配體受體2促效劑，例如，來沙木單抗(lexatumumab)、可那木單抗(conatumumab)、CS-1008,PRO95780；5-羥基色胺受體拮抗劑，例如，rEV598、紮利羅登(xaliprode)、鹽酸帕洛諾司瓊(Palonosetron hydrochloride)、格拉司瓊(granisetron)、Zindol和AB-1001； 整合素抑制劑，包括α5-β1整合素抑制劑，例如，E7820、JSM 6425、伏洛昔單抗(volociximab)和血管內皮抑素(endostatin)；雄激素受體拮抗劑，包括，例如，癸酸諾龍(nandrolone decanoate)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、Android、Prost-aid、andromustine、比卡魯胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、apo-環丙孕酮(apo-cyproterone)、apo-氟他胺(apo-flutamide)、氯地孕酮乙酸鹽(chlormadinone acetate)、安得卡(Androcur)、Tabi、環丙孕酮乙酸鹽(cyproterone acetate)和尼魯米特(nilutamide)；芳香酶抑制劑，例如，阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、睾內脂(testolactone)、依西美坦(exemestane)、胺基魯米特(minoglutethimide)和福美坦(formestane)；基質金屬蛋白酶抑制劑；此外，本發明抗體可與造成致免疫細胞死亡之模態組合，其包括(但不限於)紫外光、氧化處理、熱休克、靶向和非靶向放射線治療、紫草醌(shikonin)、高靜水壓、溶瘤病毒和光動力療法；此外，本發明抗體可與造成致免疫細胞死亡之藥劑組合，其包括(但不限於)舒尼替尼、JAK抑制劑、蒽環類、艾黴素、米托蒽醌、奧沙利鉑和環磷醯胺、靶向和非靶向微管蛋白解聚抑制劑(如，例如奧利斯達汀(auristatins)和類美坦素(maytansinoids))；本發明之化合物亦可與放射線治療及/或手術介入結合用於治療癌症；再者，本發明抗體可直接使用或用於組成物、研究和診斷中，或作為分析參照標準等，其已為本項技術所熟知；
診斷方法
抗-CEACAM6抗體或其抗原結合片段可用於偵測CEACAM6-表現腫瘤之存在。在各種生物樣本包括血清和組織活檢樣本中，含CEACAM6之細胞或流出的CEACAM6之存在，可用抗-CEACAM6抗體來偵測。此外，抗-CEACAM6抗體可用於各種造影法中，例如以99Tc(或其他同位素)接合抗體之免疫閃爍成像。例如，類似使用111In接合抗-PSMA抗體所述之造影法來偵測胰臟癌或卵巢癌(Sodee et al.,Clin.Nuc.Med.21：759-766,1997)。 可使用的另外偵測方法為藉由將本發明抗體與一適合的同位素接合之正子攝影(參見Herzog et al.,J.Nucl.Med.34：2222-2226,1993)。
醫藥組成物及給藥
就治療任何前述病症，用於本發明之醫藥組成物可以習用的方式使用一或多種生理上可接受載劑或賦形劑來調配。本發明之抗體或其抗原結合片段可藉由任何適合的方法來給藥，依照所欲治療的病症可不同。可能的給藥路徑包括非經腸(例如肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下)，肺內和鼻內，且若需要，用於局部免疫抑制治療、病灶內給藥。此外，本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體可藉由脈衝輸注給藥，例如以漸減的抗體給劑。較佳地，係以注射來給劑，最佳地靜脈內或皮下注射，部份係依照簡短或慢性給藥而定。投予的量將依照各種因素而定，例如臨床癥狀、個體的體重、是否有給予其他藥物。熟習技術者應了解，給藥路徑將依照所治療的病症或症狀而變。
本發明一實施例為包括抗-CEACAM6抗體或其抗原結合片段或其變體，單獨或與至少一種其他試劑，例如安定化合物組合之醫藥組成物，其可以任何無菌、生物相容的醫藥載劑，包括(但不限於)食鹽水、緩衝食鹽水、右旋糖和水來給藥。另一實施例為包括一CEACAM6結合抗體或其抗原結合片段及適合治療CEACAM6相關疾病例如癌症之另外醫藥活性化合物的醫藥組成物。任何這些分子可單獨投予病患或與其他的試劑、藥物或荷爾蒙組合於其中混合賦形劑或醫藥上可接受載劑之醫藥組成物來給藥。在本發明一實施例中，此醫藥上可接受載劑為醫藥上惰性的。
本發明亦關於醫藥組成物之給藥。此給藥係以口服或非經腸來進行。非經腸遞送之方法包括局部、動脈內(直接送至腫瘤)、肌肉內、皮下、骨髓腔內、硬膜內、心室內、靜脈內、腹膜內或鼻內給藥。除了活性成份外，這些醫藥組成物可含有適合的醫藥上可接受載劑，包括幫助活性化合物加工成醫藥上可使用的製備物之賦形劑和佐劑。就調配和給藥技術之進一步詳情可參見最近版本之Remington's Pharmaceutical Sciences(Ed.Maack Publishing Co,Easton,Pa.)。
用於口服給藥之醫藥組成可使用本項技術所熟知的醫藥上可接受載劑 以適合口服給藥之劑量來調配。此等載劑能將醫藥組成物調配成錠劑、片劑、糖衣錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，供病患攝取。
口服使用之醫藥製備物可經由將活性化合物與固體賦形劑組合來製得，視需要研磨所生成的混合物及若需要，在加入適合的佐劑後將混合物加工成顆粒，得到錠劑或糖衣錠錠心。適合的賦形劑有碳水化合物或蛋白填充劑，例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；來自玉米、小麥、米、馬鈴薯或其他植物之澱粉；纖維素例如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；及膠類包括阿拉伯膠和黃蓍膠；及蛋白，例如明膠和膠原蛋白。若需要，可加入崩解劑或增溶劑，例如交鏈聚乙烯吡咯酮、瓊脂、藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。
糖衣錠心可以適合的膜衣例如濃縮糖溶液來提供，其亦可含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯酮、卡波普膠(carbopol gel)、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆溶液和適合的有機溶劑或溶劑混合物。染料或顏料可加入錠劑或糖衣錠膜衣中供產品辨識或作為活性化合物量之特徵，亦即劑量。
可用口服給藥的醫藥製備物包括明膠所製造的推入配合膠囊以及由明膠所製造的軟式密封膠囊及膜衣例如甘油或山梨醇。推入配合的膠囊可含有與填充劑或結著劑例如乳糖或澱粉，潤滑劑例如滑石或硬脂酸鎂及視需要安定劑混合的活性成份。在軟式膠囊中，活性化合物可在有或無安定劑下，溶解或懸浮在適合的液體中，例如油脂、液體石蠟或液體聚乙二醇。
用於非經腸給藥的醫藥調配物包括活性化合物之水溶液。就注射，本發明之醫藥組成物可調配於水溶液中，較佳地生理上相容的緩衝液例如漢克溶液(Hank's solution)、林格氏液(Ringer's solution)，或生理緩衝食鹽水。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之物質，例如羧甲基纖維素、山梨醇或聚葡糖。另外，活性化合物之懸浮液可製備成適合的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括油脂例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或三酸甘油酯或微脂體。視需要，懸浮液亦可含有適合的安定劑或增加化合物溶解度而得以製備高濃縮溶液之試劑。
就局部或鼻內給藥，係在調配中使用適合滲透特定屏障之滲透劑。此等滲透劑一般已為本項技術所知。
本發明之醫藥組成物可以本項技術中已知的方式來製造，例如藉由習用的混合、溶解、造粒、製造糖衣錠、細磨、乳化、包膠、誘陷或凍乾法來製造。
醫藥組成物可以鹽來提供並可用酸來形成，其包括(但不限於)鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸等。鹽類更易於溶解在水性或及他質子性溶劑中，其為對應游離鹼形式。在其他情況，較佳的製備物可為1mM-50mM組胺酸或磷酸或Tris、0.1%-2%蔗糖及/或2%-7%甘露醇pH範圍4.5至7.5中之凍乾粉末，視需要包括另外的物質如聚山梨醇酯，其係在使用前與緩衝劑混合。
在以一可接受載劑製備包括本發明化合物之醫藥組成物後，其可置於適合的容器中並標示所治療的適應症。就抗-CEACAM6抗體或其抗原結合片段之給藥，此標示應包括量、頻率和給藥方法。
套組
本發明進一步係關於醫藥包裝及套組，其係包括填入一或多種前述本發明組成物成份的一或多個容器。與此容器結合的可為由規範醫藥或生物產品之製造、使用或販賣的政府機構所規定的注意事項，以顯示經產品製造、使用或販賣之機構所核可用於人類給藥。
治療上有效劑量
適用於本發明之醫藥組成物包括其中活性成份係以有效量包含在內以達到所希望的目的，亦即治療特癥為CEACAM6表現之特定疾病。
有效劑量的測定係完全在熟習本項技術者的能力內。
測量本發明新穎抗體或其抗原結合片段或其變體之治療上有效量，大部份將依特定的病患特質、給藥路徑和所欲治療的病症性質而定。通用指南可參見，例如國際醫藥法規協合會之刊物及REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第27和8章，484-528頁(18th ed.,Alfonso R.Gennaro,Ed.,Easton,Pa.：Mack Pub.Co.,1990)。更特言之，測定治療上有效量將依照此等因子例如醫藥品的毒性和效用而定。毒性可使用本項技術中熟知的方法來測定並可參見前述參考文獻。效用可利用相同的指南聯合下列實例中所述的方法來測定。
就任何化合物，治療上有效量起初可以細胞培養分析，例如腫瘤細胞，或以動物模型，通常為小鼠、兔、狗、豬或猴子來預估。動物模型亦用來達到所欲的濃度範圍和給藥路徑。此等資訊然後可用於決定人類之有效劑量和給藥路徑。
治療上有效量係指改善癥狀或症狀之抗體或其抗原結合片段的量。此等化合物之治療效用和毒性可藉由標準醫藥製程以細胞培養或實驗動物來測定，例如ED50(在50%群族的治療上有效劑量)及LD50(50%群族的致死劑量)。治療和毒性效應間的劑量比率為治療指數，且其可以ED50/LD50比率來表示。具有大的治療指數之醫藥組成物為較佳的。從細胞培養分析和動物研究所得來的數據可用於調配供人類使用的劑量範圍。此等化合物的劑量較佳地係落在包括ED50具有極小或無毒性之循環濃度範圍內。依照所用的劑型、病患的敏感性及給藥路徑，劑量係在此範圍內變化。
確切的劑量係由醫師考量所治療的病患來選擇。劑量和給藥可調整以提供足夠量的活性基團或維持所欲效用。可列入考慮的另外因素包括疾病的嚴重性，例如腫瘤大小和位置；病患的年齡、體重和性別；飲食、給藥的時間和頻率、藥物組合、對治療的反應、敏感性及耐受性/反應。依照特定調配物之半衰期和清除率，長效的醫藥組成物應，例如每3至4天、每週、每二周一次或每三周一次給藥。
依照給藥路徑，正常劑量可從0.1至100,000微克來變化。特定劑量和遞送方法之指南係提供於文獻中。參見美國專利第4,657,760號；或第5,206,344號；或第5,225,212號。熟習本項技術者將應用與蛋白或其抑制劑不同的聚核苷酸調配物。同樣地，遞送聚核苷酸或多肽將對特定細胞、症狀、位置等具專一性。放射線標定抗體之較佳的專一活性範圍可從0.1至10mCi/mg的蛋白(Riva et al.,Clin.Cancer Res.5：3275-3280,1999；Ulaner et al.,2008 Radiology 246(3)：895-902)。
本發明另一較佳的實施例為：
1. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其係專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合。
2. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其係專一與人類CEACAM6之成熟胞外區(以SEQ-ID No：179位置35-320的胺基酸表示)及食蟹獼猴CEACAM6之成熟胞外區(SEQ-ID No：177位置35-320的胺基酸表示)結合。
3. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其係專一與人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)和食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)結合。。
4. 一種分離的抗體或其抗原結合片段，其係專一與包括人類CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：179之胺基酸35-142表示)之蛋白及與包括食蟹獼猴CEACAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)之蛋白結合。
5. 根據實施例1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其不會與人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5顯著交叉反應。
6. 根據實施例1至5中任一項之抗體或其抗原結合片段，其能與人類和食蟹獼猴CEACAM6，或其成熟胞外區或其1區結合且該親和力係在一數量級之單價KD內。
7. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係與9A6抗體(Genovac/Aldevron)競爭在人類CEACAM6之結合。
8. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係干擾CEACAM6和CEACAM1相互作用。
9. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其能改變腫瘤抗原專一性T細胞的細胞激素性質趨向特徵為增加IFN-γ之活化表型，較佳地，相較於對照組樣本，係增加
Figure 105108621-A0202-12-0065-426
1.5倍(1.5倍或更高)。
10. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其能誘發免疫調節。
11. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其能減緩腫瘤抗原專一性T細胞之CEACAM6媒介的免疫抑制，如以腫瘤抗原專一性T細胞之IFN-γ分泌或IFN-γ分泌的活化T細胞數目所測量。
12. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其能改變腫瘤抗原專一性T細胞的細胞激素性質趨向更具細胞毒性及/或特徵為增加IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌之活化表型，較佳地，相較於對照組樣本，係增加
Figure 105108621-A0202-12-0066-427
1.5倍(1.5倍或更高)的IFN-γ及/或IL-2及/或TNF-α分泌。
13. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括一或多個由下列組成之群中選出的胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
14. 根據實施例13之抗體或其抗原結合片段，其係與一人類CEACAM6之表位結合，其中該表位係包括下列胺基酸殘基：SEQ ID NO：179之Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129。
15. 根據實施例13或14之抗體或其抗原結合片段，其係與一包括Ile63Leu突變之人類CEACAM6蛋白結合而不會與包括Ile63Phe突變(根據SEQ-ID：179之編號)之人類CEACAM6蛋白結合。
16. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，係包括：i. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：48之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：49之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：50之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：52之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：53之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：54之L-CDR3，或ii. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：106之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：107之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：108之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：110之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：111之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：112之L-CDR3，或iii. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：4之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：5之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：6之 H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：8之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：9之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：10之L-CDR3，或iv. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：34之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：35之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：36之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：38之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：39之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：40之L-CDR3，或v. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：120之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：121之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：122之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：124之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：125之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：126之L-CDR3，或vi. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：24之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：25之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：26之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：28之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：29之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：30之L-CDR3，或vii. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：76之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：77之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：78之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：80之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：81之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：82之L-CDR3，或viii. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：134之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：135之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：136之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：138之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：139之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：140之L-CDR3，或 ix. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：148之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：149之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：150之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：152之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：153之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：154之L-CDR3，或x. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：14之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：15之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：16之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：18之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：19之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：20之L-CDR3，或xi. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：62之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：63之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：64之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：66之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：67之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：68之L-CDR3，或xii. 一重鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：92之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：93之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：94之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：96之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：97之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：98之L-CDR3。
17. 根據前述實施例中任一項之抗體或其抗原結合片段，係包括：i. 一以SEQ ID NO：47表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：51表示之可變輕鏈序列，或ii. 一以SEQ ID NO：105表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：109表示之可變輕鏈序列，或iii. 一以SEQ ID NO：3表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：7表示之可變輕鏈序列，或iv. 一以SEQ ID NO：33表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：37表示之可變輕鏈序列，或 v. 一以SEQ ID NO：119表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：123表示之可變輕鏈序列，或vi. 一以SEQ ID NO：23表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：27表示之可變輕鏈序列，或vii. 一以SEQ ID NO：75表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：79表示之可變輕鏈序列，或r viii. 一以SEQ ID NO：133表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：137表示之可變輕鏈序列，或ix. 一以SEQ ID NO：147表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：151表示之可變輕鏈序列，或x. 一以SEQ ID NO：13表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：17表示之可變輕鏈序列，或xi. 一以SEQ ID NO：61表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：65表示之可變輕鏈序列，或xii. 一以SEQ ID NO：91表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：95表示之可變輕鏈序列。
18. 根據前述實施例中任一項之抗體，其為一IgG抗體。
19. 根據實施例18之抗體，係包括：i. 一相當於SEQ ID NO：57之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：58之輕鏈區，或ii. 一相當於SEQ ID NO：115之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：116之輕鏈區，或iii. 一相當於SEQ ID NO：43之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：44之輕鏈區，或iv. 一相當於SEQ ID NO：129之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：130之輕鏈區，或v. 一相當於SEQ ID NO：85之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：86之輕鏈區，或 vi. 一相當於SEQ ID NO：143之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：144之輕鏈區，或vii. 一相當於SEQ ID NO：157之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：158之輕鏈區，或viii. 一相當於SEQ ID NO：71之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：72之輕鏈區，或ix. 一相當於SEQ ID NO：101之重鏈區和一相當於SEQ ID NO：102之輕鏈區。
20. 根據實施例1至17中任一項之抗原結合片段，其為一scFv、Fab、Fab’片段或a F(ab’)2片段。
21. 根據前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其為一單株抗體或抗原結合片段。
22. 根據前述實施例中任一項之抗體或抗原結合片段，其為人類、人源化或嵌合抗體或抗原結合片段。
23. 一種抗體-藥物接合物，係包括根據實施例1至22中任一項之抗體或其抗原結合片段。
24. 一種分離的核酸序列，其係編碼根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段。.
25. 一種載體，係包括一根據實施例24之核酸序列。
26. 一種分離的細胞，其係表現根據實施例1至22中任一項之分離的抗體或抗原結合片段及/或包括根據實施例24之核酸或根據實施例25之載體。
27. 根據實施例26之分離的細胞，其中該細胞為一原核細胞或真核細胞。
28. 一種製造根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段之方法，其包括培養根據實施例27之細胞及純化抗體或抗原結合片段。
29. 根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物，係用作為醫藥品。
30. 根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物，係用作為診斷劑。
31. 根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物，係用作為治療癌症之醫藥品。
32. 根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物，係用於製造醫藥品供治療一疾病。
33. 根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物，係用於製造醫藥品供治療癌症。
34. 一種醫藥組成物，係包括根據實施例1至22中任一項之抗體或抗原結合片段或根據實施例23之抗體-藥物接合物。
35. 一種根據實施例34之醫藥組成物與一或多種治療活性化合物之組合物。
36. 一種治療與不欲的CEACAM6存在有關的病症或症狀之方法，其包括於有此需要的對象中投予一有效量的根據實施例34之醫藥組成物或根據實施例35之組合物。
37. 一種製備專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合之抗-CEACAM6抗體之方法，該方法係包括以包含食蟹獼猴CECAM6 1區(以SEQ-ID NO：177之胺基酸35-142表示)之蛋白免疫接種一動物，優選地小鼠，測定專一與人類CEACAM6和食蟹獼猴CEACAM6結合之抗體的胺基酸序列，接著視需要人源化或產生嵌合抗體，並重組表現該抗體。
圖1：人類CEACAM6旁系同源物以及食蟹獼猴CEACAM6同源物之胞外區的蛋白序列比對。數字係表示移除訊號胜肽序列後之胺基酸位置。在人類和獼猴CEACAM6中初級序列之N端位置為相同，但在其他人類旁系同源物中此位置胺基酸為不同的，係以星號標出。N-端1區則加框線。
圖2：TPP-2971之VL和VH可變區的胺基酸序列。嫁接到人類框架之序列係以加底線之粗黑字標出。根據Kabat定義之CDR係以斜體字書寫。灰色陰影字體係代表TPP-3187與TPP-2971相比較之序列差異。
圖3：TPP-3310和TPP-3714之VL及VH可變區的胺基酸序列。衍生自TPP-2971之鼠科CDR的序列係以加底線之粗黑字標出。根據Kabat定義之CDR係以斜體字書寫。抗體TPP-3310和TPP-3714在VH框架內二個不同的胺基酸係以加底線之非粗黑字標出。
圖4：TPP-3820和TPP-3821之VL和VH可變區的胺基酸序列。衍生自TPP-3187之鼠科CDR的序列係以加底線之粗黑字標出。根據Kabat定義之CDR係以斜體字書寫。抗體TPP-3820和TPP-3821在VH框架內二個不同的胺基酸係以加底線之非粗黑字標出。
圖5：活體外抗-CEACAM6抗體對生存素胜肽專一性T細胞之IFN-γ分泌及此分泌程度的藥理學效應。A+B.生存素胜肽專一性T細胞和KS腫瘤細胞之IFN-γ ELISpot分析。將10,000個KS腫瘤細胞與2,500個生存素TC共培養20h。共培養中抗體濃度為30μg/ml。C.生存素胜肽專一性TC和KS腫瘤細胞之IFN-γ ELISA分析。將10,000個KS腫瘤細胞與20,000個生存素TC共培養20h。共培養中抗體濃度為30μg/ml。X-軸係顯示所試驗之不同條件：在A中：1=10,000個KS細胞；2=2,500個T細胞；3=無抗體治療；4=同型匹配抗體對照；5=TPP-3470(9A6-hIgG2)6=TPP-3323；在B中：1=10,000個KS細胞；2=2,500個T細胞；3=無抗體治療；4=同型匹配抗體對照；5=TPP-3470(9A6-hIgG2)6=TPP-3310；7=TPP-3707；在C中：1=10,000KS細胞；2=20,000T細胞；3=無抗體治療；4=同型匹配抗體對照；5=TPP-3470(9A6-hIgG2)6=TPP-3310；7=TPP-3707；Y-軸係相當每孔之IFN-γ點-計數(在A和B中)或以pg/ml表示之IFN-γ濃度(在C中)。星號係代表根據不成對、雙尾的學生t試驗之統計上顯著結果。誤差線(error bar)代表SEM。
圖6：活體外抗-CEACAM6抗體對生存素胜肽專一性T細胞之細胞激素分泌(IFN-γ、IL-2和TNF-α)的藥理學效應。B. IL-2 Luminex分析。C. TNFa Luminex分析。生存素胜肽專一性TC和KS腫瘤細胞之Luminex細胞激素分析。將10,000個KS腫瘤細胞與20,000個生存素TC共培養20h。共培養中抗體濃度為30μg/ml。X-軸係描繪所試驗的不同條件：1=10,000個KS細胞；2=20,000個T細胞；3=無抗體治療；4=同型匹配抗體對照；5= TPP-3470(9A6-hIgG2)6=TPP-3310；7=TPP-3707；Y-軸係相當以pg/ml表示之細胞激素濃度。
圖7：活體內抗-CEACAM6抗體對腫瘤生長之效應。s.c.接種2 x 106個KS乳癌細胞。在第23和27天，i.v.注射腫瘤-抗源專一性T細胞(生存素胜肽專一性)於第22、24、26和28天i.p.投予200μg的抗-CEACAM6抗體或匹配的同型對照物。每2-3天評估腫瘤生長。誤差線代表SEM。Y-軸=腫瘤表面積(mm2)；X-軸=天數；TC=生存素胜肽專一性T細胞。1=PBS-治療；2=以T細胞和同型匹配抗體對照治療；3=以T細胞和TPP-3470(9A6-hIgG2)治療；4=以T細胞和TPP-3310治療；5=以T細胞和TPP-3707治療。
圖8：較佳的本發明抗-CEACAM6抗體之註解序列。提供的是IgG之重鏈和輕鏈以及所選抗體之VH和VL區的蛋白及DNA序列。在序列重要區以下為註解(全長IgG之VH和VL區，以及CDR區(H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3、L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3))。
圖9：卡通呈現與Fab片段APP-1574(重鏈和輕鏈分別為深灰色和淡灰色)結合之人類CEACAM6的單一N-端1區(TPP-1794，白色)。
圖10：圖9中所示之詳細蛋白介面。選擇的殘基係如圖9以標簽呈現及著色。編號係對應TPP-1794(SEQ-ID NO：169)。
圖11：使用生存素胜肽專一性CD8+ T細胞之xCELLigence細胞毒性分析。
A. 20,000個KS乳癌腫瘤細胞與20,000個生存素專一性T細胞共培養。B. 40,000個HCT-116-hC6腫瘤細胞與20,000個生存素專一性T細胞共培養。監測細胞毒性~100h。使用30μg/ml最終濃度之抗體：#1，添加T細胞的時間點；#2，僅腫瘤細胞；#3，無抗體；#4，同型匹配抗體對照；#5，抗-PD-L1 Ab為人類IgG2；#6,TPP-3470 9A6 Ab為人類IgG2；#7 TPP-3310 hIgG2。星號係代表根據不成對、雙尾的學生t試驗之統計上顯著結果。X,x-軸，時間(小時)；Y,Y-軸，正常化細胞指數。
圖12：使用胰臟癌之病患-衍生的T細胞(TIL-12)之xCELLigence細胞毒性分析。
A和B：10,000個HCC2935腫瘤細胞與50,000個胰臟癌浸潤淋巴細胞(TIL-12)共培養。監測細胞毒性~150h。抗-CD3 x EpCAM雙專一性mAb(0.25ng/ml)加入共培養中以引導T細胞對抗腫瘤細胞，與HLA無關。
A：#1，添加T細胞；#2僅腫瘤細胞；#3，無抗體；#4，同型匹配抗體對照；#5，抗-PD-L1 Ab為人類IgG2；#6,TPP-3470；#7 TPP-3310；使用30μg/ml之抗體。
B：濃度依賴之TPP-3310-媒介的效應：#1，添加T細胞；#2，僅腫瘤細胞；#3,T0.07μg/ml之PP-3310 at；#4,0.02μg/ml之TPP-3310；#5,50μg/ml之同型匹配抗體對照；#6,0.021μg/ml之TPP-3310；#7,0.062μg/ml之TPP-3310；#8,1.85μg/ml之TPP-3310；#9,5.5μg/ml之TPP-3310；#10,16.67μg/ml之TPP-3310；#11,50μg/ml之TPP-3310；X,x-軸，時間(小時)；Y,Y-軸，正常化細胞指數。
實例
本發明進一步係以下列實例來描述。此等實例係單獨提供藉由參照特定的實施例來說明本發明。這些示例，在說明本發明特定方面的同時，並非描述所揭示的本發明範圍之限制或局限。
除非另有詳細說明，否則所有的實例係使用標準技術來進行，其已為熟習本項技術者所熟知且為例行常規。下列實例之例行分子生物技術可如標準實驗室手冊所述來進行，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989。
實例1：猴子CEACAM6序列&工具產生
所用的抗原和參照化合物之蛋白序列之概述係提供於表2中：
Figure 105108621-A0202-12-0074-12
Figure 105108621-A0202-12-0075-13
Figure 105108621-A0202-12-0076-14
人類CEACAM之蛋白序列係得自UniProtKB/TrEMBL資料庫：人類CEACAM6(P40199)、人類CEACAM1(P13688)、人類CEACAM3(P40198)、人類CEACAM5(P06731)、人類CEACAM8(P31997)、人類 CEACAM19(Q7Z692)。普通獼猴(恆河猴)CEACAM6之蛋白序列亦可取得(F6YVW1)。食蟹獼猴(食蟹猴)CEACAM6之蛋白序列係由公開可取得的核苷酸序列，藉由a)應用一般內含子/外顯子剪接規則b)比較不同的猴子/靈長類蛋白序列及c)保存人類/靈長類/猴子間的基因體結構所推論。食蟹猴CEACAM6係以TPP-4189表示。
CEACAM之重組胞外區係得自市售來源或內部所製造。就此，胞外區係在C端附加一Xa因子裂解位置、人類IgG1 Fc片段以及His標籤並使用標準過渡轉染程序表現在HEK293細胞。蛋白係由細胞培養上清液經由蛋白-A和粒徑篩析層析法所純化。若其中需要移除Fc-部份，則根據製造商建議以Xa因子裂解(例如來自Hematologic Technologies Inc.之Xa因子蛋白酶HTI No.HCXA-0060)及隨後以蛋白-A和粒徑篩析層析法純化。若其中需要生物素化蛋白，則使用市售生物素化套組(例如來自Pierce #21347之EZ-Link Amine-PEG3-Biotin)並以市售套組來定出生物素化的程度(例如來自Pierce #28005之生物素定量套組(Biotin Quantitation Kit))。
製造人類CEACAM6之訊號N-端1區為使用pET28a載體(Novagen)於結腸桿菌BL21 DE3之6x His融合蛋白結構。以IPTG於37℃誘發至隔夜後，分離重組蛋白並從包含體重摺。在重摺之前，以含有150mM NaCl,1mM EDTA,0.1% Tween20之Tris緩衝液pH 8.5沖洗包含體並溶於含有8M尿素及無清潔劑的相同緩衝液中。將溶液緩慢稀釋(1：10)至含500mM精胺酸之50mM CHES pH 9.2並於4℃培養16h。以30mM Tris緩衝液pH 8.5,150mM NaCl於Superdex 75上進行標準鎳-NTA層析及粒徑篩析層析法，完成純化。
9A6鼠科IgG1抗體(GM-0509)係得自Genovac並與人類IgG1和人類IgG2嵌合。人類IgG1或人類IgG2之Neo201蛋白序列的基礎為US20130189268。所有的抗體係使用標轉過渡轉染程序表現於HEK293細胞中並由細胞培養上清液經由蛋白-A和粒徑篩析層析法所純化。
產生表現不同全長人類CEACAM-受體之穩定的HeLa細胞株。因此轉染下列受體之序列：人類CEACAM1(TPP-4185)、人類CEACAM3(TPP-4187)、人類CEACAM5(TPP-4188)、人類CEACAM6(TPP-4639)、 人類CEACAM8(TPP-4190)、人類CEACEAM19(TPP-4186)或食蟹猴CEACAM6(TPP-4189)。如以FACS分析所確認，HeLa細胞株不會將任何這些受體內生性表現在表面，且表面表現僅在轉染各別CEACAM-受體後可被偵測。簡言之，將表現結構選殖至以UCOE為基礎的載體(EMD Millipore Corporation)並於HeLa細胞中轉染。以潮黴素選擇後，以總細胞溶離物之西方墨點以及細胞表面之FACS染色，使用適合抗體篩選適合的安定選殖株(人類CEACAM1：#MAB22441來自R&D Systems；人類CEACAM5：#MAB41281來自R&D Systems；人類CEACAM6：#MAB3934來自R&D Systems；人類CEACAM8：ab90294來自abcam；人類CEACAM19：#NBP1-70494來自Novus；人類CEACAM3：AF4166來自R&D Systems；食蟹猴CEACAM6：Neo201-hIgG1)。
實例2：免疫調節9A6-mIgG1抗體之定性
9A6作為免疫調節在文獻中已有描述(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)。此抗體係就其對其他人類CEACAM之親和力、選擇性及其對猴子CEACAM6之交叉反應性、其對CEACAM6上的特定區之專一結合性及其對其他人類CEACAM之選擇性加以定性。
使用表面電漿共振(SPR)之親和力測量
使用配置有連續S感應晶片CM5(GE Healthcare Biacore,Inc.)之Biacore T100、Biacore T200或Biacore 4000儀器(GE Healthcare Biacore,Inc.)進行定量結合分析之表面電漿共振(SPR)實驗。結合分析係於25℃以分析緩衝液HBS-EP+(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05%界面活性劑P20)來進行。以經由胺偶合化學共價固定化於晶片表面之抗-hIgG捕捉抗體來捕捉抗體。偶合試劑(1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、乙醇胺-HCl pH 8.5)係使用來自胺偶合套組(GE Healthcare,product code BR-1000-50)。使用的抗-hIgG、抗-mIgG捕捉抗體和固定化緩衝液(10mM乙酸鈉pH 5.0)係分別來自人類抗體捕捉套組(GE Healthcare,BR-1008-39)和小鼠抗體捕捉套組(GE Healthcare,BR-1008-38)。將新鮮配製的0.2M EDC和0.05M NHS以10μl/min流速通過晶片表面420秒，活化感應晶片表面，接著以5μl/min流速注射抗-hIgG 或抗-mIgG捕捉抗體(以固定化緩衝液溶解至25μg/ml)歷時180秒。以10μl/min流速注射1莫耳濃度的乙醇胺溶液歷時420秒，阻斷過量的活化基團。
使用CEACAM抗原作為分析物來測定K D值。以10μl/min流速捕捉抗體20秒，之後注射各分析物。就動力學親和力測定，係以60μl/min流速注射溶於分析緩衝液(參見上文)之介於1.56至200nM各種濃度的人類CEACAM1、人類CEACAM3、人類CEACAM5、人類CEACAM6、食蟹獼猴CEACAM6、食蟹獼猴CEACAM6-1區蛋白3分鐘，並監測解離10分鐘。
所得到的感測圖為雙重-參照，亦即線上參照細胞校正接著減去緩衝液樣本。K D值係以解離(k d)和結合(k a)率常數之比率為基礎所計算，其係藉由整體擬合感測圖以一階1：1朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)於Biacore Evaluation Software Package(Biacore T100/T200/4000 Evaluation Software,GE Healthcare Biacore,Inc.)中執行所得來。
SPR之三明治競爭實驗
SPR之三明治競爭實驗係以類似上述方式作小修改來進行。首先，將所分析的各抗體經由胺偶合(詳情請參見上文)共價固定在感應器表面。就檢測不同的抗體是否競爭與特定CEACAM抗原結合，係藉由於固定化抗體上注射來捕捉各別的抗原，及隨後立刻注射用於競爭之試驗第二抗體。若第二抗體與結合第一抗體之抗原結合(+)，則二種抗體並非顯示競爭，而反過來，若注射第二抗體無觀察到結合(-)，則二種抗體係競爭類似的表位。
使用ELISA55之區域定位研究
為了闡明專一性表位之資料，係設計、表現和純化數種嵌合區結構。簡言之，將野生型人類CEACAM6序列與人類IgG1 Fc片段進行C-端融合，表現在HEK293細胞並由細胞培養上清液經由蛋白-A和粒徑篩析層析法所純化(TPP-1790)。為了創造不同區嵌合體，因此在一Fc-融合的人類CEACAM6中將一單一區的人類序列以對應的普通獼猴序列置換(F6YVW1)。由此創造出三種不同區的嵌合體hDom1-hDom2-mDom3(TPP-1793)、hDom1-mDom2-hDom3(TPP-1792)和mDom1-hDom2-hDom3(TPP-1791)，與野生型普通獼猴Fc融合結構共同作為對照組(TPP-1306)。 除了嵌合體外，係如上述從結腸桿菌製造人類CEACAM6之單一1區(TPP-1794)。
使用ELISA分析進行抗體的區域專一性之定位： 就ELISA分析，將Fc-融合區嵌合體和單一1區塗覆在Nunc MaxiSorb盤上並以SmartBlock溶液阻斷。以IgG-濃度系列(1nM-1000nM)培養1h後，以PBS/T清洗培養盤。經由抗-人類IgG(Fab專一性)-過氧化酶抗體(A0293,Sigma)偵測，進行IgGs與CEACAM6區結構之結合分析。依照標準方法以AmplexRed(A12222,Invitrogen)進行螢光偵測。
ELISA-為基礎的結合分析
使用ELISA來定性抗體與各種CEACAM旁系同源物和同源物之結合。於37℃將黑色384-孔盤以2μg/ml(Candor)之塗覆緩衝液塗覆上25μl/孔之各種CEACAM蛋白製備物歷時1h。以PBS/0.05% Tween-20清洗一次後，於37℃將孔槽以100% Smart Block(Candor)阻斷1小時。以PBS/0.05% Tween-20清洗三次後，加入範圍從2μg/ml至2ng/ml之溶於PBS/0.05% Tween-20/10% Smart Block的抗體連續稀釋液並將測定盤於室溫培養1h。以PBS/0.05% Tween-20清洗三次後，加入適合的二級抗體。就帶有人類Fc之蛋白例如TPP-1173偵測，係使用以1：10.000稀釋之抗-人類IgG HRP(Sigma A0170)。就帶有小鼠Fc之蛋白例如TPP-1744和抗小鼠IgG HRP(ThermoScientific 31432)偵測，係使用1：10.000稀釋。使用PBS/0.05% Tween-20/10%Smart Block作為稀釋緩衝液。將測定盤於室溫培養1h。清洗三次後，將測定盤以Amplex Red(Life Technologies)展色並於590nm的發射波長讀取螢光。使用GraphPad Prism 6.0軟體，使用四參數非線性曲線擬合來計算EC50值。
結果
就測量9A6與人類CEACAM6之單價親和力及評估其對猴子CEACAM6之交叉反應性，係如上所述進行SPR實驗。結果如表3所示：
Figure 105108621-A0202-12-0081-15
如所示，9A6-mIgG1可以高親和力(22nM)與重組的人類CEACAM6結合。然而，無偵測到與普通獼猴CEACAM6結合。為了比較，亦試驗Neo201-hIgG1。此抗體對人類和猴子CEACAM6二者展現高親和力。總言之，9A6對人類CEACAM6展現高親和力但對猴子CEACAM6無交叉反應性。
就定位9A6在CEACAM6上之結合區，係如上述以ELISA評估在不同人類/猴子嵌合體上的結合。為了能與Neo201-hIgG1(TPP-1173)比較，係將9A6與人類IgG1(TPP-1745)嵌合。結果係如表4所示：
Figure 105108621-A0202-12-0081-16
9A6能與野生型人類CEACAM6及與使用普通獼猴CEACAM6之2或3區的嵌合體結合。然而，其無法與使用普通獼猴CEACAM6之1區的嵌 合體或與野生型普通獼猴CEACAM6結合。與此相相符的，其能與人類CEACAM6之單一1區結合。相反的，Neo201-hIgG1與所有的試驗型結合，但人類CEACAM6之單一1區除外。結論，9A6係與人類CEACAM6之N-端1區結合。
為了實體化此結果，係如上述進行一競爭實驗。結果如表5所示。
Figure 105108621-A0202-12-0082-17
從表5明顯可看出，9A6-mIgG1和Neo201-hIgG1不會相互競爭與人類CEACAM6結合。此項與位於1區外部之Neo201已公開的表位相符。
就分析9A6對不同CEACAM6同源物之選擇性並得以與Neo201-hIgG1作比較，係將9A6與hIgG1嵌合(TPP-1745)。如上述進行一ELISA結合實驗，得到列於表6之EC50值：
Figure 105108621-A0202-12-0082-18
確認了9A6對人類CEACAM6之高親和性結合。與使用恆河猴CEACAM6之SPR實驗相符，9A6亦無法與食蟹猴CEACAM6結合。然而 其對CEACAM6具有選擇性，因為並未觀察到與人類CEACAM3或CEACAM5結合。
相反的，Neo201-hIgG1對人類CEACAM6展現類似的高親和性結合並且甚至對食蟹猴CEACAM6具交叉反應性。此項係表示選擇性降低，因為其亦對人類CEACAM5展現高親和性結合。
實例3：CEACAM之蛋白序列比對
人類CEACAM6之成熟胞外形式(UniProtKB/Swiss-Prot：P40199.3之胺基酸35-320)係由不同的區所組成：N-端1區(根據www.uniprot.org，UniProtKB/Swiss-Prot：P40199.3之胺基酸35-142)、2區(根據www.uniprot.org UniProtKB/Swiss-Prot：P40199.3之胺基酸145-232)及3區(根據www.uniprot.org，UniProtKB/Swiss-Prot：P40199.3之胺基酸237-314)。因為目標為辨識對CEACAM6之N-端1區具選擇性、高親和性以及對食蟹猴CEACAM6具交叉反應性之抗體，因此評估將所欲的性質組合於一分子中之可能性。
就此，係將人類CEACAM6之N-端1區的蛋白序列使用Blastp演算法(NCBI)使用標準設定，與其他蛋白相比較，用以鑑別最相關的CEACAM6同源物。將人類CEACAM6(UniProtKB/Swiss-Prot：P40199.3之胺基酸35-320)、人類CEACAM1(UniProtKB/Swiss-Prot：P13688.2之胺基酸35-428)、人類CEACAM3(UniProtKB/Swiss-Prot：P40198.2之胺基酸35-155)、人類CEACAM5(UniProtKB/Swiss-Prot：P06731.3之胺基酸35-417)和食蟹獼猴CEACAM6(TPP-4189之胺基酸35-320)的(部份)成熟胞外區使用「Global Alignment-Wilbur and Lipman(fast)」以Phylosopher軟體(Genedata)比對。比對係如圖1所示。使用Vector NTI軟體(Life Technologies)測定人類CEACAM6之N-端1區與其他N-端區之序列一致性百分比(根據比對)。這些結果係如表7所示。
Figure 105108621-A0202-12-0083-429
Figure 105108621-A0202-12-0084-20
圖1之序列比對顯示人類CEACM6和人類CEACAM3、人親CEACAM5及人類CEACAM1在整個胞外區具有非常高程度的蛋白序列相似性。目標區(人類CEACAM6之1區)與其他CEACAM特別相似，其亦反映在表7中。人類CEACAM6之旁系同源物比食蟹獼猴同源物更加類似人類CEACAM6。事實上，在初級序列的N-端區僅有2個位置在人類和食蟹獼猴CEACAM6中為相同的，但與其他人類旁系同源物之此位置的胺基酸不同(圖1中以星號標出)。
結論：鑑別出對人類CEACAM6之N-端1區具選擇性但又對猴子CEACAM6具交叉反應性的的高親和性抗體具有高挑戰性。
實例4：以噬菌體表現產生抗體
就鑑別人類抗-CEACAM6抗體，係基本上如早先所述進行來自DYAX之人類Fab-噬菌體庫FAB-300之各種選擇(Hoet et al.,2005；Huang et al.,2006)。如表8中所彙整，應用至高4輪噬菌體選擇的不同策略，使用來自人類和食蟹猴之生物素化Fc-標定的重組CEACAM6(TPP-1436 & TPP-2443)，塗覆在鏈黴親和素-微珠上，以及在細胞表面表現高量內生性目標蛋白之人類腫瘤細胞株KPL-4(Kurebayashi et al.,Br J Cancer.1999 Feb；79(5-6)：707-17)。此外，在各蛋白目標選擇前，如所示，包括比對CEACAM5(TPP-1438；hC5)和CEACAM1(TPP-1437；hC1)(脫靶)或重組人類IgG1-Fc(Fc)之結合劑消耗。例如，在策略A中，在塗覆人類CEACAM1的微珠(hC1)消耗後，則完成人類CEACAM6(hC6)的第一輪淘選。將所產生的輸出分割並將一部份用於第二和第三輪的人類CEACAM6之選擇。另一部份則用於KPL-4細胞上的第二輪淘選、第三輪人類CEACAM6及最後第四輪KLP-4細胞淘選。在策略C中，使用小鼠mAb 9A6-mIgG1(TPP-1744)進行特異性溶離步驟。
Figure 105108621-A0202-12-0085-21
以所述的Fab-噬菌體ELISA(Hoet et al.,Nat Biotechnol.2005 Mar；23(3)：344-8)或以CEACAM6-表現細胞之FACS-分析，針對靶向和脫靶的結合劑，篩選來自不同回合選擇之增豐的噬菌體池。針對基因III-移除和後續ELISA中之可溶性Fab之ELISA-篩選，選擇帶有不同有利性質之噬菌體池。將所產生的sFab-hits之DNA定序並將獨特代表物以KPL-4細胞之FACS-分析就細胞結合定性(表9)。在某些策略中，本發明之噬菌體結合劑係直接再選殖至IgG。
Figure 105108621-A0202-12-0085-430
 +++：>1000事件@~2.2μg/ml sFab ++：>100事件@~2.2μg/ml sFab +：>100事件@~6.7μg/ml sFab 0：閥值以下表9：獨特sFab-hits之FACS-滴定：
使用Octet RED384儀器(Pall ForteBio Corp.)藉由生物薄膜干涉技術，分析所選的噬菌體表現、純化的Fab片段(參見表9之列表)與人類CEACAM1(TPP-1437)、人類CEACAM5(TPP-1438)和人類CEACAM6(TPP-1436)之生物素化變體的結合。將生物素化抗原載入親和鏈黴素(SA)生物感測器上(ForteBio Part number 18-5019)及在分析緩衝液之基線平衡步驟後(PBS添補0.1%(w/v)BSA,0.02%(v/v)Tween20和0.05%(v/v)疊氮鈉；ForteBio Part number 18-5032)，監測以分析緩衝液稀釋至200nM最終濃度的Fab歷時300秒，接著300秒的解離階段。
來自表9之對應的純化Fab片段亦展現與人類CEACAM6結合，但不與人類CEACAM5或人類CEACAM1結合。
為了分析Fab是否和9A6競爭與人類CEACAM6結合，係進行一競爭實驗。本處，係將生物素化人類CEACAM6(TPP-1436)載入SA生物感測器並將Fab的結合反應與得自以9A6-mIgG1(TPP-1744)使其飽和的承載Fab的結合反應相比較(如實例1中所述)。若在9A6的存在下結合反應明顯降低或消除，則其係強烈的表示所試驗的Fab係與類似9A6之表位結合。
令人驚訝地，所有試驗的Fab皆能和9A6競爭與人類CEACAM6結合。
將Fab序列重整成人類IgG1形式進行進一步的定性。
藉由SPR以類似實例2所述的實驗製程，測定重整的抗體對重組人類CEACAM6(TPP-1436)之親和力(單價K D )。藉由整體擬合感測圖以一階1：1朗繆爾結合模型或以穩態親和力分析於Biacore Evaluation Software Package(Biacore T100/T200/4000 Evaluation Software.)中執行來評估感測圖。結果係如表10所示：
Figure 105108621-A0202-12-0087-24
從表10明顯的，抗體展現相當低的單價親和力，最低值(最高親和力)為TPP-1679之76nM。就其選擇性和與食蟹猴CEACAM6之交叉反應性係以ELISA結合實驗分析三種展現最高單價親和力之IgG(以類似實例2中所給的方法來進行)。
Figure 105108621-A0202-12-0087-25
總言之，得到具有相當差的單價親和力之抗體。此項可能為避免與其他旁系同源物結合之權衡。又，選擇性特質通常為不足的(參見表11中的TPP-1679 & TPP-1669)。從所有試驗的抗體，TPP-1678為唯一對重組食蟹 猴CEACAM6具有非常邊際的交叉反應性(參見表11)之抗體。
結論，在無進一步熟化下，使用噬菌體表現並未得到治療上有用的抗-CEACAM6抗體。
實例5：噬菌體衍生的抗體之抗體熟化
為了得到具有所欲親和力、選擇性和交叉反應性特質之抗體，係將某些噬菌體衍生的抗體進行親和力-熟化。
因此，將TPP-1669、TPP-1678和TPP-1679之所有的CDR胺基酸位置個別隨機化。表現所產生的變體並藉由結合ELISA以細胞上清液評估與多個CEACAM家族成員(人類CEACAM6、食蟹猴CEACAM6、人類CEACAM3和人類CEACAM5)之結合。
就TPP-1669，個別的熟化增進與食蟹猴CEACAM6之結合，在無同時增進與其他人類CEACAM家族成員之結合下，同樣無法鑑別。
就TPP-1679，鑑別出數個個別熟化，其增進與人類CEACAM6結合，無隨附增進與其他人類CEACAM家族成員結合，並產生含有所有可能排列的重組庫。表現對應變體為人類IgG2同型，純化並類似實例2所述之實驗程序以SPR評估與多個CEACAM家族成員之結合。表12係彙整由此方法所得到之所選抗體的性質。
Figure 105108621-A0202-12-0088-431
Figure 105108621-A0202-12-0089-27
表12所得到的結果指出親和力和選擇性增進完全非常可能。然而，其亦強調得到食蟹猴CEACAM6交叉反應性結合劑之挑戰，其至少係在一數量級內接近對人類CEACAM6之單價親和力。
就TPP-1678，鑑別出數個個別熟化，在無較大隨附增進與其他人類CEACAM家族成員結合下，其增進與人類CEACAM6和食蟹猴CEACAM6結合，並產生含有數種排列的重組庫。對應變體係以人類IgG2同型表現，純化並類似實例2所述之實驗程序以SPR評估與多個CEACAM家族成員之結合(彙整於表13中)。
亦藉由結合ELISA(單價結合，生物素化CEACAM蛋白)測定這些抗體的結合特性：使用以塗覆緩衝液(Candor)稀釋1：440之抗體-人類IgG(Sigma,I2136)於37℃塗覆黑色384-孔Maxisorp盤(Nunc)歷時1小時。以PBS/0.05% Tween-20清洗1次後，將測定盤於37℃以100% SmartBlock(Candor)阻斷1小時。清洗3次後，將溶於PBS/0.05% Tween-20/10% SmartBlock之2μg/ml的相關抗體加入盤中。將測定盤於室溫培養1小時。清洗3次後，加入以PBS/0.05% Tween-20/10% SmartBlock連續稀釋的相關生物素化CEACAM蛋白並將測定盤於室溫培養1小時。清洗3次後加入溶於PBS/0.05% Tween-20/10% SmartBlock之1μg/ml的鏈黴親和素-過氧化酶(Sigma,S5512)並將測定盤於室溫培養30分鐘。清洗3次後，將測定盤以Amplex Red(Life Technologies)展色並於590nm的發射波長讀取螢光。使用GraphPad Prism 6.0軟體，使用四參數非線性曲線擬合來計算EC50值。
鑑別具有實質上增進的親和力、選擇性和交叉反應性特質之變體，如表13和14所彙整為以此法所得到之所選抗體。
Figure 105108621-A0202-12-0090-447
Figure 105108621-A0202-12-0090-29
 表14：結合ELISA之選擇性/交叉反應性分析：EC50值以nM表示
結論，使用TPP-1678前驅物，可能得到極少對人類CECACAM6具高親和性之抗體，其係真正對食蟹猴CEACAM6具交叉反應性且對CEACAM6具選擇性：藉由比較對應的EC50值，判斷TPP-3707與人類CEACAM6的結合大於與人類CEACAM3結合約730-倍(TPP-3705為620-倍)。
實例6：藉由小鼠免疫接種產生抗體
就產生抗CEACAM6之小鼠單株抗體，係以施用於Balb/小鼠之免疫原為基礎進行二個不同的足底免疫接種策略(表15之策略A和B)。在各策略中，小鼠係以5次注射經由或腹膜內施予抗原，如表15中所述。策略A係集中在以食蟹猴CEACAM6-1區免疫接種，而策略B係基於來自人類和食蟹猴之全長胞外區的組合作為免疫原。
足底之免疫接種係以注射5次1μg抗源為基礎，每週一次。腹膜內路徑之免疫接種係以二周4次IP注射(10μg的抗原)接著追加一次靜脈注射為基礎。
Figure 105108621-A0202-12-0091-432
最後一次注射後4天，根據標準方法將小鼠淋巴結或脾細胞融合(例如Köhler and Milstein Nature.1975 Aug 7；256(5517)：495-7)。以ELISA使用生物素化抗原和脫靶蛋白進行所產生的雜交瘤-選殖株篩選(如表16所列)。更詳言之，於4℃將微量滴定盤塗覆上山羊抗小鼠抗體至隔夜。隔天沖洗滴定盤並於室溫以5% BSA阻斷2h，接著另外的沖洗步驟。將20μl的雜交瘤上清液於室溫以生物素化抗原培養1h，並將混合物轉置於已塗覆的孔槽，接著一培養步驟(室溫下1h)。清洗滴定盤後，於室溫加入抗-鏈黴親和素-HRP接合物歷時30min。最後，清洗孔槽，並加入50μl TMB讓顏色反應展開並以稱式判讀儀記錄。
Figure 105108621-A0202-12-0092-31
令人驚訝地，僅策略A產生的選殖株顯示有關人類&食蟹猴CEACAM6交叉反應性以及選擇性之有利性質。此外，從二個策略得到某些物種專一性的選植株。
將ELISA選擇陽性的候選物以至少3回合選殖進行次選殖並藉由蛋白A層析從腹水以較大量製造。
來自小鼠免疫接種的抗體亦在細胞情況下就與CEACAM6結合進行定性。將過度表現人類或食蟹猴CEACAM6之HeLa-細胞以來自雜交瘤之上清液或純化的mIg，用於FACS實驗(參見實例1)。以非轉染的HeLa-細胞作為負對照。表17係彙整來自ELISA和FACS-分析之經鑑定候選物的特質：
Figure 105108621-A0202-12-0092-32
Figure 105108621-A0202-12-0093-33
以SPR分析為純化的mIgG將得到的鼠科抗體就有關其單價親和力(K D )、其對其他人類旁系同源物之選擇性及其對食蟹猴CEACAM6之交叉反應性程度更緊密定性。
SPR係類似實例2中所述的實驗程序來進行。
結果係彙整於表18：
Figure 105108621-A0202-12-0093-34
對於TPP-2969&TPP-2970觀察到有未解決的不符合處：在起初的ELISA和FACS分析中其顯現對食蟹猴CEACAM6專一性，而在後來的SPR 實驗中，其亦展現與重組的人類CEACAM6結合。
總結：以食蟹猴CEACAM6N-端1區(APP-325)免疫接種小鼠意外地產生某些抗體(例如TPP-3186、TPP-2971,TPP-3187)，其真正具有人類-食蟹猴CEACAM6交叉反應性且同時具有相關其他人類旁系同源物之選擇性。就治療目的，親和力係在可接受的範圍內，但其鼠科來源和相關的致免疫性預先排除了人類中的治療用途。
實例7：抗體人源化
為了產生適合人類治療用途的抗體，係將選擇的鼠科抗體人源化。
藉由定序個別抗體雜交瘤細胞之抗體cDNA測定所選的鼠科雜交瘤-衍生抗體之序列(參見表17)。根據定序結果，TPP-3100和TPP-3186為相同的。TPP-3101產生一單一重鏈但二條輕鏈序列。TPP-2971和TPP-3187具高相似性。其有四個胺基酸不同(參見圖2)。
將抗體TPP-2971和TPP-3187之破解的鼠科VH和VL序列根據Kabat定義藉由嫁接CDR至人類生殖系框架加以人源化。但例外的，HCDR2係部份嫁接。因為根據Kabat定義此CDR非常長(16個胺基酸)，所以僅嫁接前面9個胺基酸。這些胺基酸代表根據Chothia定義與HCDR2相同的HCDR2部份(根據Kabat和Chothia之CDR定義請參見：Andre C.R.Martin,“Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains" in Antibody Engineering(Springer Lab Manuals),Eds.：Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。
人類生殖系框架係以鼠科框架片FW1、FW2、FW3和FW4與人類VH和VL組以及J元件生殖系序列之類似性搜尋為基礎來選擇。將鼠科CDR嫁接至最相配的生殖系序列(CDR除外)，其就VL為IGKV1-9*01和IGKJ2*01(一致性69.6%,FW1；86.7%,FW2；71.9%,FW3；80.0%,FW4)而就VH為IGHV2-70*01和IGHJ6*01((一致性：73.3%(TPP-2971)及70.0%(TPP-3187),FW1；85.7%,FW2；71.9%,FW3；90.9%,FW4))。從VBASE2數據組衍生用於類似性搜尋之生殖系序列(Retter I,Althaus HH,Münch R,Müller W：VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005 Jan 1；33(Database issue)：D671-4)。最相似地生殖系序列之命名係採用IMGT 系統(Lefranc,M.-P.,Giudicelli,V.,Ginestoux,C.,Jabado-Michaloud,J.,Folch,G.,Bellahcene,F.,Wu,Y.,Gemrot,E.,Brochet,X.,Lane,J.,Regnier,L.,Ehrenmann,F.,Lefranc,G.and Duroux,P.IMGT®,the international ImMunoGeneTics information system®.Nucl.Acids Res,37,D1006-D1012(2009)；doi：10.1093/nar/gkn838))。
產生二種衍生自TPP-2971之人源化序列的變體：TPP-3310和TPP-3714。相較於鼠科原始物，在TPP-3310的VH中J元件係保持不變，而在TPP-3714之VH中J元件則變成完全類人類生殖系(參見圖3)。在人源化序列中並未發現糖基化位置或不成對的半胱胺酸。
此外，產生二種衍生自TPP-3187之人源化序列的變體：TPP-3820和TPP-3821(參見圖4)。相較於TPP-3714，TPP-3820之VH在HFW1的30位置含有蘇胺酸取代絲胺酸，及在HFW2的46位置含有甘胺酸取代丙胺酸，而VL在LCDR3的位置92和93含有天門冬醯胺酸殘基取代二個絲胺酸殘基。這四個胺基酸交換反映了TPP-3187和TPP-2971之鼠科原始物序列間的差異。
TPP-3821之可變區VH係與TPP-3714相同，而相較於VL TPP-3714，在LCDR3的位置92和93含有二個天門冬醯胺酸殘基取代二個絲胺酸殘基。這二個胺基酸交換反映了TPP-3187和TPP-2971之鼠科原始物序列間CDR中的差異。在TPP-3820和TPP-3821序列中並未發現糖基化位置或不成對的半胱胺酸殘基。
嵌合的和人源化抗體之親和力測定及三明治競爭實驗係藉由SPR以類似實例2所述的實驗程序來進行，且其結果係彙整於表19和表20中：
Figure 105108621-A0202-12-0095-35
Figure 105108621-A0202-12-0096-36
Figure 105108621-A0202-12-0096-37
選擇性和交叉反應性分析係藉由結合ELISA(單價，生物素化CEACAM蛋白)以類似實例5中所提供的方法來進行。所得到結果係彙整於表21中。
Figure 105108621-A0202-12-0096-433
Figure 105108621-A0202-12-0097-39
表19之結果顯示TPP-2971、TPP-3186 & TPP-3187係競爭人類CEACAM6上的相同或類似表位如同9A6-hIgG2。表20和表21之結果係強調具有真正交叉反應性與人類&食蟹猴CEACAM6的高親和力結合，同時對CEACAM6具選擇性且不會與CEACAM6旁系同源物結合。
結論，人源化完全成功，其中抗體展現甚致高於其鼠科前驅物之親和力，使其能用於人類治療用途。
實例8：細胞上之選擇性CEACAM6結合
為了驗證抗-CEACAM6抗體與真實抗原之結合和選擇性，係藉由FACS實驗檢測抗體與不同細胞之細胞表面上的天然CEACAM6之結合。
CEACAM6選擇性係於以不同CEACAM-受體(人類CEACAM1、人類CEACAM3、人類CEACAM5、人類CEACAM6、人類CEACAM8、人類CEACAM19和食蟹猴CEACAM6-參見實例1)轉染的HeLa-細胞盤上檢測，與HeLa野生型細胞之結合相比較，其顯示為CEACAM6陰性。測定與轉染人類和食蟹猴CEACAM6之HeLa細胞結合的EC50值。結果如表22所示。
就FACS實驗，係將HeLa野生型細胞以RPMI-1640,10% FCS培養，而CEACAM-受體轉染的HeLa細胞係接受額外的0.5%僅大黴素(Gentamycin)(stock 10mg/ml,Fa.PAA)和200μg/ml潮黴素B(stock 50mg/ml,Invitrogen)。將細胞以Ca2+/Mg2+之PBS無清洗3次及非酵素性以EDTA解離緩衝液(Gibco)從培養盤分離出。以冷的FACS緩衝液(無Ca2+/Mg2+之PBS及熱失活的3%FCS)清洗細胞並使用機器(Invitrogen)計數。植入每孔105個細胞並以個別的初級抗體(5μg/ml)於盤式震盪器上以4℃培養1h。然後以FACS緩衝液清洗細胞(400g,5’)二次，懸浮於含二級抗體(PE-抗-小鼠或抗-人類IgG,1：150稀釋，Dianova #115-115-164,#109-115-098)之100μl中並於盤式震盪器上以4℃另再培養1h。清洗2次後，將細胞再懸浮於100μl FACS 緩衝液並於FACS Canto II機器(Beckton Dickinson)或FACS Array(Beckton Dickinson)上分析。
就EC50分析，係使用範圍從0.1nM至100nM之漸增濃度的初級抗體。藉由中位數螢光強度訊號對濃度作圖(對數比例尺)，測定半數最大結合值(EC50)。使用Graph Pad prism分析軟體進行曲線擬合。
Figure 105108621-A0202-12-0098-434
Figure 105108621-A0202-12-0099-41
抗-CEACAM6抗體亦以FACS分析來檢測其與內生性表現CEACAM6之不同癌細胞株的結合。根據美國菌種中心(ATCC)所提供的方法培養細胞株。所觀察到的結合訊號為專一性的，因為非結合同型對照並未產生螢光訊號之位移。半數最大結合(EC50)值係在低納摩爾(nanomolar)範圍(表23)。
Figure 105108621-A0202-12-0099-435
 *所有細胞株係來自公共組織銀行，例如美國菌種中心等，但KS乳癌細胞除外其係由Dr.Brigitte Gückel(University of Tübingen)所提供。表23：抗-CEACAM6抗體與內生性CEACAM6陽性腫瘤細胞株之結合(EC50值)
結論，對於鼠科TPP-2971、TPP-3100、TPP-3186 & TPP-3187抗體以及人類TPP-3820、TPP-3821、TPP-3310、TPP-3714 & TPP-3707抗體，驗證了與人類真實細胞-表面CEACAM6選擇性結合(與其他人類旁系同源物無結合)。這些抗體與人類CEACAM6之結合與9A6對人類CEACAM6表現細胞株相當。就TPP-3310，已驗證一類似9A6-hIgG2與人類腫瘤細胞株上內生性表現的CEACAM6之結合。
本發明之抗體亦以與人類受體結合相當，單位數至次納摩爾結合EC50範圍的親和力與食蟹猴CEACAM6結合，而9A6與細胞表面上的食蟹猴CEACAM6無結合係偵測至100nM。此結果顯示本發明抗體對人類和食蟹猴CEACAM6之真實交叉反應性，而9A6明確地優先與人類CEACAM6結合。
實例9：熱穩定分析
使用差示掃描量熱法(DSC)使用VP-毛細DSC系統(MicoCal Inc.)以0.137mL的細胞量來調查IgG的熱穩定性。將所有的樣本以DPBS pH.7.4稀釋至0.5mg/mL最終濃度並使用無蛋白之緩衝液對照組作為參照。將樣本以120℃/h的掃描速率從20℃掃描至120℃。所產生的熱分析圖以藉由減去緩衝液對照掃描校正並使用Origin 7.0數據分析(OriginLab Corp.)就蛋白濃度正常化。藉由將DSC數據與Origin所配置的非線性迴歸常規擬合(「Non-2-state：Cursor init」)，得到熔化溫度。
Figure 105108621-A0202-12-0100-436
 表24：Fab區之熱穩定性
所測量的全部IgG在Fab區內皆顯示高熱安定性。TPP-3310和TPP-3714的熱穩定性非常高且顯然超過TPP-3470(9A6-hIgG2)的熱穩定性。此項係另人意外的，因為高熱安定性係與具有VH3框架之抗體相關(Honegger et al.,2009,Protein Eng Des Sel.22(3)：121-134)。
相較於TPP-3470(9A6-hIgG2)，高熱穩定性為TPP-3310和TPP-3174之較佳醫藥適合性的象徵(穩定性越佳，聚集的傾向越低，致免疫性風險越低)。
實例10：干擾CEACAM6和CEACAM1間的相互作用
已假設在活化的T細胞上CEACAM1可能反式為CEACAM6之結合夥伴(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)：在CEACAM中之反式和順式同嗜性和異嗜性相互作用已有描述，例如CEACAM1和CEACAM5之間，或CEACAM6和CEACAM8之間。CEACAM1係表現的活化的T細胞上，CEACAM1連接和磷酸化招募了含SH2-區蛋白質酪胺酸磷酸酶1(SHP1)。SHP1將ZAP70去磷酸化，其造成TCR訊號傳遞之抑制。藉此，CEACAM1連接導致在活化後10分鐘之內早期抑制了T-細胞活化。
再者，CEACAM5在抑制天然殺手(NK)細胞對抗結腸直腸癌細胞之反應的角色已有報告提出(Zheng et al.,PLoS One.2011；6(6)：e21146)，其可能係以其與表現在NK細胞的抑制性CEACAM1異嗜性結合為基礎。
因此，藉由一結合ELISA使用重組蛋白檢測直接的CEACAM6-CEACAM1相互作用。在建立可偵測CEACAM1和CEACAM6間之適度但專一的相互作用初步實驗後，使用下列方法：於37℃將黑色384-孔Maxisorb盤(Nunc)塗覆上溶於塗覆緩衝液(Candor)之1μg/ml CEACAM1(R&D Systems,TPP-1437)歷時1h或未塗覆作為一對照組。以PBS/0.05% Tween-20清洗1次，將孔槽於37℃以100% Smart Block(Candor)阻斷1h。在一分開的測定盤中，將以PBS/0.05% Tween-20,10% SmartBlock連續稀釋的感性趣抗體於RT以2μg/ml CEACAM6-Fc(TPP-1790)培養1h。將阻斷的測定盤清洗3次並加入預形成的抗體-CEACAM6-複合物。將測定盤於RT培養1h。清洗3次後，以1：10.000加入抗-人類IgG HRP(Sigma A1070) 並將測定盤於RT培養1h。清洗3次後，將測定盤以Amplex Red(Life Technologies)展色並以590nm的發射波長讀取螢光。
Figure 105108621-A0202-12-0102-44
如表25所示，其可能與所有試驗的抗體競爭CEACAM6與CEACAM1的相互作用，但TPP-3688除外(Neo201-hIgG2).
結論，此觀察係與下列假設相符：a)活化T細胞上的CEACAM1為CEACAM6可能的相互作用夥伴，導致抑制T細胞，b)CEACAM6的N-端D1區牽涉CEACAM1和CEACAM6間的相互作用，及c)本發明抗體能干擾CEACAM6-CEACAM1相互作用。
實例11：活體外抑制CEACAM6之免疫抑制活性
最近CEACAM6在腫瘤細胞上的免疫抑制功能已於活體外(Witzens-Harig et al.,Blood 2013 May 30；121(22)：4493-503)及活體內(Khandelwal et al.,Poster Abstract 61,Meeting Abstract from 22nd Annual International Cancer Immunotherapy Symposium October 6-8,2014,New York City,USA)進行研究。市售的9A6抗體(Genovac/Aldevron)顯示能抑制CEACAM6的免疫抑制活性，在活體外藉由T細胞增進細胞激素分泌及活體內的抗腫瘤效用。
為了研究本發明抗體對CEACAM6之免疫抑制效應，係進行模型腫瘤細胞與模型腫瘤抗原-專一性T細胞選殖株之共培養實驗： 藉由Brackertz等人所述的程序產生腫瘤抗原專一性T細胞(Brackertz et al.,Blood Cancer J.2011 Mar；1(3)：e11)。簡言之，從周邊血液單核細胞經由CD8-專一性磁性-活力細胞分類分離生存素專一性CD8+T細胞。將分離的HLA-A2-CD8+T細胞以承載10μg的HLA-限制胜肽表位生存素95-104之同種異體HLA-A2+樹突細胞(ELTLGEFLKL)重複刺激。刺激後，將增生的T細胞以HLA-A2/生存素95-104多聚體染色(A*02：01 391 LMLGEFLKL Survivin 96-104 labeled with APC,ProImmune Limited,#F391-4A-E)，FACS分類及於96-孔盤中以限制稀釋選殖。
T細胞選殖株擴增係藉由培養2 x 105個T細胞選植株和由5 x 107個放射線照射的PBMC(30Gy)和1 x 107個放射線照射的LCL組成的餵養細胞(這些類B淋巴母細胞，其係以EBV-轉染的猴子細胞株(B95/8,ATTC)藉由EBV轉導來自健康捐贈者之周邊血液B細胞所產生，如描述於Brackertz et al.,Blood Cancer J.2011 Mar；1(3)：e11 and Dissertation Andreas Moosmann,Ludwig-Maximilians-University Munich,Germany,2002)，來自不同捐贈者(100-150Gy)，於40ml含麩醯胺酸、10%人類血清(人類AB serum,Valley Biomedical,Inc,#HP1022)、1%青黴素/鏈黴素(Life Technologies)的RPMI-1640培養基(Sigma-Aldrich)在37℃和5%CO2下進行。擴增係在50U/ml IL-2(Proleukin,Novartis,#1003780)、2.5ng/ml IL-15(rhIL-15-CF R&D #247_IL-025/CF)和30ng/ml抗-人類CD3抗體(OKT3 eBiosciences 16-0037-85)的存在下發生，歷經14天。將KS人類乳癌細胞株(得自Dr.Brigitte Gückel(University of Tübingen,Germany))以含10% FCS(FBS Superior,Biochrom)和1%青黴素/鏈黴素之DMEM(Sigma-Aldrich)於37℃和5% CO2下培養。
為了分析抗-CEACAM6抗體在活體外對CEACAM6之免疫抑制功能的調節活性，係將生存素-胜肽專一性CD8+ T細胞選植株與CEACAM6+、HLA-A2+和生存素+人類乳癌細胞株KS一起共培養，並以IFN-γ分泌作為T細胞活性的輸出值以IFN-γ ELISpot或IFN-γ ELISA來測量。
就共培養，係將KS腫瘤細胞使用PBS-EDTA非酵素分離5min，離心，清洗及計數。以X-Vivo-20(Lonza)調整細胞濃度至1 x 105個細胞/ml並將細 胞以抗-CEACAM6抗體或同型匹配對照抗體於冰上預處理10min。培養步驟之後，將10,000個KS標靶細胞以三重複分別直接種入IFN-γ-ELISpot或U-96-孔ELISA盤。在此期間，收取生存素-胜肽專一性T細胞，以X-Vivo-20清洗並以KS標靶細胞上指出的細胞數種入。腫瘤細胞、抗-CEACAM6抗體和T細胞的共培養係於37℃培養20-40h。根據製造商的說明展開IFN-γ ELISpot盤(MABTECH：人類干擾素γ #3420-3PT之ELISpot分析，抗體mAB 1-D1K抗-IFNg、mAB 7-B6-1-生素物、鏈黴親和素Steptavivin-ALP、BCIP/NBT及ELISpot #3650-10之基質)和IFN-γ-ELISA(BD人類IFN-γ ELISA Set #555142)。將ELISpot盤以C.T.L.ELISpot盤式判讀儀計數並以Tecan Infinite M200盤式判讀儀測量ELISA盤的光學密度。若相較於同型匹配抗體對照物，正對照TPP-3470(9A6-hIgG2)為統計上顯著的，則實驗係視為有效的。
KS腫瘤細胞與生存素-胜肽專一性CD8+T細胞在抗-CEACAM6抗體的存在下共培養，相較於未經抗-CEACAM6抗體處理或經同型匹配對照抗體處理的樣本，造成T細胞之IFN-γ產生為統計上顯著地增加(圖5)
結論，如生存素-胜肽專一性CD8+T細胞的IFN-γ分泌或IFN-γ分泌的活化T細胞數目所測，具食蟹猴交叉反應性之抗體TPP-3310、TPP-3707和TPP-3323能減輕腫瘤抗原專一性T細胞之CEACAM6媒介的免疫抑制達到與TPP-3470(9A6-hIgG2)相同程度。
實例12：由抗-CEACAM6抗體處理過的T細胞所分泌之細胞激素/化學激活素性質之分析
為了研究抗-CEACAM6抗體對人類T細胞細胞激素/化學激活素性質對增進細胞素性和有效抗腫瘤免疫反應之效應，係進行模型腫瘤細胞和模型腫瘤抗原專一性T細胞選植株之共培養實驗的Luminex-多重細胞激素分析。
產生生存素-胜肽專一性CD8+細胞選擇株並如實例11所述於活體外擴增。如實例11所述進行腫瘤細胞培養和ELISA共培養。
共培養20h後，將培養盤以1400rpm離心10min並收集上清液。使用MILLIPLEX人類細胞激素/化學激活素磁珠盤-預混合38 Plex分析物 (Merck Millipore #HCYTMAG-60K-PX38)於BioPlex100系統(Bio-Rad)上根據製造商的說明進行多重分析。以Bio-Plex Manager 6.0計算標準曲線和濃度。相較於同型匹配抗體對照組，若正對照TPP-3470(9A6-hIgG2)為增加>1.5x，則實驗係視為有效的。
在生存素-胜肽專一性T細胞與KS腫瘤細胞之共培養中，相較於經同型匹配對照物處理的對照樣本，以本發明抗體阻斷CEACAM6造成IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌增加>1.5倍(圖6)。
結論，具食蟹猴交叉反應性之抗體TPP-3310和TPP-3707能改變抗原專一性T細胞之細胞激素性質朝向更具細胞毒性和特徵為增加IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌增加之活化表型，如Luminex多重分析所測達到與TPP-3470(9A6-hIgG2)相同之程度。
實例13：過繼性T細胞轉移KS模型中抗-腫瘤效用
抗-CEACAM6抗體(9A6；Genovac/Aldevron)之抗腫瘤效用已在活體內於過繼性人類T細胞轉移系統中研究過，其中腫瘤-抗原專一性人類T細胞係於活體外擴增並與抗-CEACAM6抗體共注射至帶有人類異種移植腫瘤之裸小鼠中(Khandelwal et al.,Poster Abstract 61,Meeting Abstract from 22nd Annual International Cancer Immunotherapy Symposium October 6-8,2014,New York City,USA)。
為了研究本發明抗體對抗腫瘤效用之效應，係進行下列過繼性T細胞轉移實驗：產生生存素-胜肽專一性CD8+ T細胞並如實例11所述於活體外擴增。
將6至8週大的雌性NOD-Scid小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/J；Charles River,France)以皮下注射2 x 106個KS腫瘤細胞(參見實例11)。在第16天進行小鼠的隨機化並將腫瘤表面積低於40mm2之小鼠排除(無腫瘤)。將小鼠(n=每組8-10隻小鼠)於第23和27天以5 x 106個生存素-胜肽專一性T細胞選植株之過繼性轉移來治療。在第22、24、26和28天i.p.投予200μg的抗-CEACAM6抗體TPP-3740、TPP-3707、PP-3310或個別的同型匹配對照抗體。對照組係以PBS取代T細胞和抗體來注射。以游標尺測量皮下生長的腫瘤及然後使用「長x寬」的公式計算表面積。僅其中在整個研究期 間，媒劑-治療的小鼠對照組具有穩定和顯著的腫瘤表面積和腫瘤體積增加，實驗才視為有效。實驗結果可能受到難以控制的參數影響：不僅在活體生長的KS細胞株證明為可變的，而且在小鼠中人類T細胞的存活以及T細胞浸潤至腫瘤亦具有相當可觀的變異。
相較於注射同型匹配對照物之T細胞或PBS對照組，生存素-胜肽專一性T細胞之過繼性轉移與試驗的抗-CEACAM6抗體之組合降低腫瘤負荷(圖7)。使用TPP-3740(9A6-hIgG2)觀察到類似效用。
結論，在使用生存素-胜肽專一性CD8+T細胞和KS腫瘤之過繼性T細胞轉移模型中，具食蟹猴交叉反應性之抗體TPP-3310和TPP-3707與TPP-3470(9A6-hIgG2)具有相同程度的抗腫瘤效用。
實例14：CEACAM6陽性的腫瘤細胞株和腫瘤組織
CEACAM6表現在各種癌症上，其為以CEACAM6免疫調節抗體治療之可能的目標適應症。因此，以FACS分析就CEACAM6表現檢測不同起源的癌細胞株及其代表不同癌症。結果係如表26所示。
將從公開組織銀行，例如美國菌種中心(ATCC)等所得到的癌細胞株根據提供者的說明加以培養。
將細胞以無Ca2+/Mg2+之PBS清洗3次及以EDTA解離緩衝液(Gibco)非酵素性從培養盤分離出。以冷的FACS緩衝液(無Ca2+/Mg2+之PBS及熱失活的3% FCS)清洗細胞並使用細胞計數器countess機器(Invitrogen)計數。每孔植入105個細胞並以小鼠單株抗體9A6(TPP-1744；5μg/ml)或純化的NA/LE小鼠IgG1同型對照抗體(BD Pharmingen #553447(5μg/ml)於盤式震盪器上以4℃培養1h。然後以FACS緩衝液清洗細胞(400g,5’)二次，再懸浮於含PE-標定的抗小鼠二級抗體(1：150稀釋，Dianova #115-115-164)之100μl中並於盤式震盪器上以4℃另再培養1h。清洗2次後，將細胞再懸浮於100μl FACS緩衝液並於FACS Canto II機器(Beckton Dickinson)或FACS Array(Beckton Dickinson)上分析。所觀察到的結合訊號為專一性的，因為非結合同功型對照並未產生螢光訊號之位移(表26)。
Figure 105108621-A0202-12-0107-45
Figure 105108621-A0202-12-0108-46
Figure 105108621-A0202-12-0109-47
Figure 105108621-A0202-12-0110-48
Figure 105108621-A0202-12-0111-49
結論，CEACAM6係表現在代表各種癌症之細胞株(例如結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、小細胞肺癌(SCLC)、胰臟癌、胃癌、乳癌和多發性骨髓瘤)其構成以CEACAM6免疫調節抗體及其他反應修飾劑(例如胜肽、小分子、入工支架結著劑等)治療之可能的目標適應症。
實例15：與人類和食蟹猴CEACAM6單一1區結合
為了檢測本發明抗體是否可與分離的人類和食蟹猴CEACAM6之單一1區結合，係如實例1進行SPR實驗。
如實例1所述類似TPP-1794，製造食蟹猴CEACAM6(TPP-2453)之單一N-端1區：
Figure 105108621-A0202-12-0112-50
SEQ-ID NO：180(TPP-2453)
Figure 105108621-A0202-12-0112-448
以SPR，類似實例1所述的實驗程序測定本發明抗體對人類和食蟹猴CEACAM6之組合的單一1區之親和力(單價K D )，且係如表27所示。
Figure 105108621-A0202-12-0112-51
結論，本發明抗體以相當的親和力與人類和食蟹猴CEACAM6之N-端1區結合。
實例16：人類CEACAM6單一N-端1區與Fab片段APP-1574複合之X- 光晶體結構
測定與TPP-3310相關Fab片段(稱為APP-1574)結合之人類CEACAM6單一N-端1區(TPP-1794；SEQ ID NO 169)的晶體結構。
為了幫助Fab片段產生，係製造PP-3310為人類IgG1變體(稱為TPP-5468，參見表28)。木瓜蛋白酶裂解TPP-5468及隨後純化，產生APP-1574。此Fab片段係包括TPP-3310之可變區(VH和VL)(參見表28)。
Figure 105108621-A0202-12-0113-52
如實例1之詳情，CEACAM6 1區係從大腸桿表現及重摺。Fab-片段係藉由以木瓜蛋白酶消化抗體來產生，接著形成複合物。然後應用蛋白結晶學產生與APP-1574 Fab結合的人類CEACAM6單一N-端1區之原子解析，用以定義表位。
蛋白製造
如實例1所述製造人類CEACAM6之單一N-端1區(TPP-1794；SEQ-ID 169)為6x His融合蛋白結構。在複合物形成之前將蛋白濃縮至6.7mg/ml。
藉由木瓜蛋白酶裂解，得到對應的TPP-5468之Fab-片段(人類IgG1)。將1mg的抗體與50μl固定化木瓜蛋白酶(ThermoFisher #20341)於消化緩衝液中(20mM磷酸鈉pH 7.0,10mM EDTA,20mM半胱胺酸-HCl)混合並於37℃持續攪拌下培養4h。藉由離心移除固定化木瓜蛋白酶及藉由通過MabSelectSURE(GE Healthcare,#11-0034-89 AC)將產生的Fc-片段和非裂解IgG移出。將溢流道中的Fab-片段進一步經由徑篩析層析法以30mM Tris緩衝液pH 8.5,150mM NaCl於Superdex 75上純化並濃縮至7.2mg/ml。
就複合物形成，對於人類CEACAM6 N-端1區，係將純化的Fab-片段和人類CEACAM6 N-端1區以1 Fab比1.4人類CEACAM6 N-端1區之比例於4℃混合1h。將形成的蛋白複合物藉由徑篩析層析法以30mM Tris緩衝液pH 8.5,150mM NaCl於Superdex 75上分離並在結晶前進一步濃縮至21.2mg/ml。
結晶和結構測定
將人類CEACAM6之單一N-端1區和Fab片段APP-1574的複合物濃縮至21.2mg/ml以20,000g離心10分鐘並進行結晶篩選。藉由於20℃懸滴蒸氣擴散讓用於數據收集的晶體生長。詳言之，將0.2μl的複合物與0.2μl含100mM檸檬酸三鈉pH 4.9、19%(w/v)PEG 4000和10%(v/v)異丙醇之儲池液混合。然後讓液滴與80μl相同的儲池液平衡。在數據收集前，以液態氮將晶體急速冷卻。
以光束線14-1於BESSY II同步放射源(Synchrotron Source)(Helmholtz Zentrum Berlin)收集繞射數據並使用XDS處理(Kabsch,W.XDS.Acta Cryst.D66,125-132(2010)。將人類CEACAM6單一N-端1區-Fab片段APP-1574複合物之數據以空間群P1處理至2.7Å，其中晶胞大小a=64.7Å,b=65.2Å,c=78.6Å,α=66.1°,β=87.2°和γ=88.5°。藉由分子置換使用PHASER複合物解出複合物之結構(McCoy AJ et al,J Appl Cryst(2007).40,658-674)。以人類CEACAM6單一N-端1區和Fab的內部結構作為搜尋模型。最終模型係以COOT建構(Emsley,P.et al,Acta Cryst D66,486-501(2010))並使用CCP4改進(Winn,M.D.et al.Acta.Cryst.D67,235-242(2011))。
表位係定義為人類CEACAM6單一N-端1區之殘基，其含有在5Å內的原子至Fab片段APP-1574中的任何原子，係以NCONT於CCP4套裝程式所鑑定(Winn,M.D.et al.Acta.Cryst.D67,235-242(2011))並列於表29中)。人類CEACAM6單一N-端1區-Fab片段APP-1574複合物之不對稱單位(晶體之最小獨特單位)有二種複製體。僅二種複製體共有的該等抗體-接觸殘基才列為表位殘基。
表位
人類CEACAM6單一N-端1區-Fab片段APP-1574複合物的晶體結構係用於鑑別CEACAM6上的Fab片段APP-1574之表位。人類CEACAM6單一N-端1區上與Fab片段APP-1574的相互作用表面係由數個連續和非連續(亦即非相連的)序列所形成；即如表29所詳述之殘基Pro59、Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Gly64、Val83、Ile84、Gly85、Thr86、Gln88、Thr90、Pro91、Ile125、Ser127、Asp128和Leu129(根據SEQ-ID：179編號； TPP-4639)。
非常近直接接觸的為具有至少一個原子為3.6Å或離抗體較不遠的殘基。這些殘基為：Gln60、Asn61、Arg62、Ile63、Val83、Ile84、Gly85、Thr90、Ser127、Asp128和Leu129(根據SEQ-ID：179編號；TPP-4639)。
這些來自示例三維構象表位之殘基係由Fab片段APP-1574所變識(圖9和10)。
Figure 105108621-A0202-12-0115-437
Figure 105108621-A0202-12-0116-54
CEACAM6 N-端1區殘基係如SEQ ID NO 169中編號。抗體殘基係以其線性胺基酸序列(SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：184)為基礎所編號並將對應鏈標出(“H”為重鏈，“L”為輕鏈)。本處所顯示的人類CEACAM6單一N-端1區殘基具有至少一個5Å原子對任何Fab片段APP-1574內的任何原子，以解釋可能的水媒介之相互作用。
當小心地分析表位時，明顯的人類CEACAM6之異白胺酸-63(根據SEQ-ID NO：179)為表位的中樞部份。此異白胺酸側鏈具有與APP-1574良好的形狀互補。模型指出，在食蟹猴CEACAM6此位置的白胺酸可能為空間上可容納的且將不會擾亂相互作用。此項解釋了對食蟹猴CEACAM6活性保留的結合活性且為人類-食蟹猴交叉反應性之基礎。相反地，在此位置的苯丙胺酸(如在人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5中)不為空間上可容納的並將導致結合活性喪失。此項為CEACAM6選擇性之 基礎。
藉此，辨識異白胺酸-63(根據SEQ-ID NO：179)代表目標CEACAM間之最顯要的「選擇性調諧劑」。人類CEACAM6之APP-1574辨識模型最佳利用中靶和脫靶間的關鍵殘基差異。在N-端1區複合物中先前的TPP-1679之Fab片段結構分析(其選擇性性質為不足的，參見實例4)亦鑑別異白胺酸-63(根據SEQ-ID NO：179)為可能的選擇性開關(數據未顯示)。然而，因為TPP-1679之分子辨識機制為不同的，其中白胺酸-63(根據SEQ-ID NO：179)係位在結合位置周圍，其難以利用。
總結，結合劑，其除了其他形成表位的殘基外(表29)亦最佳利用選擇性&交叉反應性決定殘基CEACAM6的異白胺酸-63(根據SEQ-ID O：179)並仍能容納在該位置之白胺酸，但非苯丙胺酸，將具有CEACAM6選擇性但同時具有人類-食蟹猴CEACAM6交叉反應性。
突變
為了證實在結合研究中的發現和結構分析的預測，係產生下列人類CEACAM6之N-端1區的突變：
Figure 105108621-A0202-12-0117-55
 表30：用於突變結合研究的蛋白之胺基酸序列
將蛋白表現於大腸桿菌中，如實例1所述重摺並純化。以ELISA法測定對1區野生型蛋白和二個單一突變之比較活性。將1.5ug/ml蛋白之PBS溶液塗覆於384 Nunc MaxiSorp盤(Sigma,P6491)至隔夜。將測定盤以PBS/T清洗並以Smart block(CANDOR Bioscience GmbH,113125)阻斷。隨後，將TPP-3310、TPP-1679和一同型對照抗體之連續稀釋液施用於孔槽。以PBS/T清洗後，以抗人類IgG Fc POD(Sigma,A0170)和10μM Amplex Red溶液(Thermo,A12222)偵測結合的抗體。經由螢光(激發光535nm/發射光590nm)偵測陽性結合訊號。表32係顯示TPP-3310對1區野生型蛋白和異白胺酸63(如SEQ-ID NO：179)突變成白胺酸(如食蟹猴)之結合活性。胺基酸位置63(如SEQ-ID NO：179)突變成苯丙胺酸(如人類CEACAM1、人類CEACAM3和人類CEACAM5)造成結合活性完全喪失。使用TPP-1679(參見實例4)作為驗證CEACAM6 N-端1區蛋白之有效重摺的對照組，觀察到其對表31中所有試驗抗原係以類似程度結合。
Figure 105108621-A0202-12-0118-56
結論，真正的人類-食蟹猴CEACAM6交叉反應性抗體TPP-3310，其在同時對其他人類旁系同源物具選擇性，能耐受I63L取代(根據SEQ-ID：179)(相當食蟹猴CEACAM6殘基)但無法耐受I63F取代(根據SEQ-ID：179)(人類旁系同源物CEACAM1、CEACAM3和CEACAM5中的對應殘基)在 人類CEACAM6 N-端1區的情況下，係與從X-光結晶學所得到的結果一致並證實吾等之預測。
實例17：在CEACAM6抗體的存在下T細胞媒介的細胞毒性之分析
抗-CEACAM6抗體對T細胞媒介的細胞毒性之效應係以細胞毒性實驗將CEACAM6陽性腫瘤細胞和不同來原衍生的T細胞共培養進行研究。這些T細胞為CD8+生存素T細胞或來自胰臟癌病患衍生的T細胞。就殺死這些腫瘤細胞實驗，係使用一阻抗為基礎的細胞毒性分析(xCELLigence)。
產生生存素-胜肽專一性CD8+ T細胞選植株並如實例11所述於活體外擴增。由手術從腫瘤組織的新鮮初級培養分離胰臟癌腫瘤浸潤的淋巴細胞株(TIL)。簡言之，將新鮮的初生組織物質切成小塊並置於小碟中以含2%人類血清白蛋白、2.5μg/ml Fungizone、20μg/ml僅大黴素、1%青黴素/鏈黴素之X-Vivo-15培養基(Lonza)以6000IU/IL-2培養10-18天。然後收取來自上清液的細胞並冷凍或直接用於「快速擴增法」(REP)中。就TIL之快速擴增，係將冷凍的TIL緩緩融化並於完全淋巴細胞培養基CLM RPMI-1640(Life Technologies #21875034)、10%人類AB血清(MILAN Analytica #000083)、1%青黴素/鏈黴素(Life Technologies #15140122)、1% ml HEPES(Life Technolgies #15630056)、0.01% β-巰基乙醇[儲存液50mM](Life Technologies #31350010))以6000IU/ml IL-2.以0.6*106個細胞/ml培養1天。收取TIL並以1：100比率以來自3個不同捐贈者之60Gy放射線照射的餵養PBMC於400ml REP培養基中(50% CLM混合50% AIM-V無血清培養基(Gibco #12055091)，其含有3000IU/ml IL-2和30ng/ml OKT-3抗體(eBioscience #16-0037-85))以G-REX-100燒瓶(Wilson Wolf#80500S)擴增。培養細胞並如Jin et al.,J Immunother.2012 Apr；35(3)：283-92中所述分裂。14天後，收取細胞或冷凍並將冷凍物分成等份。在共培養細胞毒性分析之前，將TIL各等份緩緩融化並於含6000IU/ml IL-2之CLM中培養1天及於無IL-2之CLM中培養1天。
根據標準方法和供應者說明培養腫瘤細胞。
以一阻抗為基礎的細胞毒性分析(xCELLigence)系統分析T細胞媒介的細胞毒性。在此無標定的分析系統中，係直接及持續於一段約100-150h的 期間長時間(即時)測量細胞毒性。附著的腫瘤細胞係黏附在96-孔E-盤底部的微電極(E-Plate VIEW 96 PET；ACEA Biosciences #ID：H000568)，其改變這些電級的電阻。此項係在無因次「細胞指數」增加時所監測。在腫瘤細胞附著後(~24h)，將抗體和T細胞加到孔槽中，若T細胞發揮了細胞毒性活性，則其造成腫瘤細胞溶離並從電極脫離。此脫離改變了孔槽的阻抗並測量到「細胞指數」或「正常化細胞指數」降低，其為正常化至T細胞加入之時間點的「細胞指數」。單獨T細胞不會影響電極的電阻抗且因此僅測量到腫瘤細胞的細胞溶解(Peper et al,J Immunol Methods.2014 Mar；405：192-8)。
在第一實驗中，吾等建立了在此分析系統中所觀察到的殺死腫瘤細胞為T細胞劑量依賴的且對不同的腫瘤細胞：T細胞比率和不同的T細胞來源為有效的(生存素-胜肽專一性CD8+T細胞，來自胰臟癌病患的TIL)。
然後吾等研究了抗-CEACAM6抗體對生存素T細胞之細胞溶解效用的效應。因此，將CEACAM6陽性乳癌KS或CEACAM6轉染的結腸癌HCT-116(HCT116-hC6)加到96-孔盤歷時24h，之後以不同的細胞比率加入生存素-胜肽專一性T細胞和抗-CEACAM6 mAb。接著共培養~100h的時間。在這些實驗中，吾等觀察到在抗-CEACAM6抗體TPP-3310和TPP-3470的存在下在二種細胞株中~21%增進的T細胞依賴細胞毒性。此等結果係以一細胞比例示例性顯示在圖11 A和B)中。顯著地，單獨的生存素-胜肽專一性CD8+T細胞已顯示45-62%的高細胞毒性影響，其最可能係由於培養的T細胞預活化且因此被認為背景細胞溶解。總結，把之前ELISA分析中所觀察到的IFN-γ分泌增加轉化成大約24h內共培養的細胞毒性效應。吾等結論出，以抗-CEACAM6抗體治療CEACAM6陽性的腫瘤細胞造成促增生存素-胜肽專一性CD8+T細胞媒介的殺死二種腫瘤細胞。
在後續的實驗中，吾等檢測了CEACAM6抗體對胰臟癌病患-衍生的TIL細胞之細胞溶離活性的效應。因此，將CEACAM6陽性的肺癌細胞株HCC2935加到96-孔盤中並培養24h。然後，在CEACAM6抗體(30μg/ml)和雙專一性抗體抗-CD3 x抗-EPCAM IgG(0.25ng/ml)的存在下加入不同比率的TIL(Marmé et al.,Int J Cancer.2002 Sep 10；101(2)：183-9；Salnikov et al.,J Cell Mol Med.2009 Sep；13(9B)：4023-33)進行HLA-依賴的T細胞媒介殺死腫瘤細胞。在抗-CEACAM6抗體TPP-3310和TPP-3470的存在下，吾等觀察到阻抗完全下降，其在同型匹配的對照抗體之存在下並未觀察到。此阻抗的下降係解釋為完全細胞溶離殺死目標細胞株HCC2935。在一另外的實驗中，可驗證CEACAM6抗體TPP-3310的效用為劑量依賴的並測定出0.62-0.21μg/ml之IC50值。圖12係示例性顯示TIL-12之結果。
總結，這些實驗顯示，本發明之CEACAM6抗體具有有效阻斷免疫抑制受體CEACAM6及增進不僅模型T細胞還有病患衍生的腫瘤浸潤淋巴細胞對CEACAM6陽性腫瘤細胞之細胞毒性效用的潛在性。
序列表
Figure 105108621-A0202-12-0121-57
Figure 105108621-A0202-12-0122-58
Figure 105108621-A0202-12-0123-59
Figure 105108621-A0202-12-0124-60
Figure 105108621-A0202-12-0125-61
Figure 105108621-A0202-12-0126-62
Figure 105108621-A0202-12-0127-63
Figure 105108621-A0202-12-0128-64
Figure 105108621-A0202-12-0129-65
Figure 105108621-A0202-12-0130-66
<110> 德商拜耳製藥股份有限公司(Bayer Pharma AG) 德國癌症研究中心(DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM(DKFZ))
<120> 抗-CEACAM6抗體及其用途
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<141> 2016-03-21
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<151> 2015-03-23
<160> 186
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1173,h16C3-hIgG1,重鏈
<400> 1
Figure 105108621-A0305-02-0134-1
Figure 105108621-A0305-02-0135-2
Figure 105108621-A0305-02-0136-3
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1173,h16C3-hIgG1,輕鏈
<400> 2
Figure 105108621-A0305-02-0136-4
Figure 105108621-A0305-02-0137-5
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,VH
<400> 3
Figure 105108621-A0305-02-0137-6
Figure 105108621-A0305-02-0138-7
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,HCDR1
<400> 4
Figure 105108621-A0305-02-0138-11
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,HCDR2
<400> 5
Figure 105108621-A0305-02-0138-8
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,HCDR3
<400> 6
Figure 105108621-A0305-02-0138-10
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,VL
<400> 7
Figure 105108621-A0305-02-0138-9
Figure 105108621-A0305-02-0139-12
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,LCDR1
<400> 8
Figure 105108621-A0305-02-0139-13
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,LCDR2
<400> 9
Figure 105108621-A0305-02-0139-14
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 10
Figure 105108621-A0305-02-0139-15
<210> 11
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,重鏈
<400> 11
Figure 105108621-A0305-02-0140-16
<210> 12
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2971,792.15H12C9,輕鏈
<400> 12
Figure 105108621-A0305-02-0140-17
Figure 105108621-A0305-02-0141-18
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,VH
<400> 13
Figure 105108621-A0305-02-0141-19
Figure 105108621-A0305-02-0142-20
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,HCDR1
<400> 14
Figure 105108621-A0305-02-0142-21
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,HCDR2
<400> 15
Figure 105108621-A0305-02-0142-22
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,HCDR3
<400> 16
Figure 105108621-A0305-02-0142-23
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,VL
<400> 17
Figure 105108621-A0305-02-0142-24
Figure 105108621-A0305-02-0143-25
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,LCDR1
<400> 18
Figure 105108621-A0305-02-0143-26
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,LCDR2
<400> 19
Figure 105108621-A0305-02-0143-27
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,LCDR3
<400> 20
Figure 105108621-A0305-02-0144-28
<210> 21
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,重鏈
<400> 21
Figure 105108621-A0305-02-0144-29
<210> 22
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3186,792.11G2D10,輕鏈
<400> 22
Figure 105108621-A0305-02-0144-30
Figure 105108621-A0305-02-0145-31
<210> 23
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,VH
<400> 23
Figure 105108621-A0305-02-0145-32
Figure 105108621-A0305-02-0146-33
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,HCDR1
<400> 24
Figure 105108621-A0305-02-0146-36
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,HCDR2
<400> 25
Figure 105108621-A0305-02-0146-34
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,HCDR3
<400> 26
Figure 105108621-A0305-02-0146-35
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,VL
<400> 27
Figure 105108621-A0305-02-0147-37
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,LCDR1
<400> 28
Figure 105108621-A0305-02-0147-38
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 29
Figure 105108621-A0305-02-0147-39
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,LCDR3
<400> 30
Figure 105108621-A0305-02-0148-40
<210> 31
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,重鏈
<400> 31
Figure 105108621-A0305-02-0148-41
<210> 32
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3187,792.15C4F4,輕鏈
<400> 32
Figure 105108621-A0305-02-0149-42
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 33
Figure 105108621-A0305-02-0149-43
Figure 105108621-A0305-02-0150-44
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 34
Figure 105108621-A0305-02-0150-45
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 35
Figure 105108621-A0305-02-0150-46
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 36
Figure 105108621-A0305-02-0150-47
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 37
Figure 105108621-A0305-02-0151-48
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 38
Figure 105108621-A0305-02-0151-49
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 39
Figure 105108621-A0305-02-0151-51
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 40
Figure 105108621-A0305-02-0152-53
<210> 41
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,VH
<400> 41
Figure 105108621-A0305-02-0152-54
<210> 42
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,VL
<400> 42
Figure 105108621-A0305-02-0152-56
<210> 43
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 43
Figure 105108621-A0305-02-0153-57
Figure 105108621-A0305-02-0154-58
<210> 44
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 44
Figure 105108621-A0305-02-0155-59
<210> 45
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 45
Figure 105108621-A0305-02-0156-60
<210> 46
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3308,TPP-2971X1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 46
Figure 105108621-A0305-02-0157-61
<210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,VH
<400> 47
Figure 105108621-A0305-02-0157-63
Figure 105108621-A0305-02-0158-64
<210> 48
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 48
Figure 105108621-A0305-02-0158-65
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 49
Figure 105108621-A0305-02-0158-66
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 50
Figure 105108621-A0305-02-0158-67
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,VL
<400> 51
Figure 105108621-A0305-02-0158-68
Figure 105108621-A0305-02-0159-69
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 52
Figure 105108621-A0305-02-0159-70
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 53
Figure 105108621-A0305-02-0159-71
<210> 54
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 54
Figure 105108621-A0305-02-0159-72
<210> 55
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,VH
<400> 55
Figure 105108621-A0305-02-0160-304
<210> 56
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,VL
<400> 56
Figure 105108621-A0305-02-0160-77
<210> 57
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 57
Figure 105108621-A0305-02-0160-78
Figure 105108621-A0305-02-0161-79
Figure 105108621-A0305-02-0162-80
<210> 58
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 58
Figure 105108621-A0305-02-0162-81
Figure 105108621-A0305-02-0163-82
<210> 59
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 59
Figure 105108621-A0305-02-0163-83
Figure 105108621-A0305-02-0164-84
<210> 60
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3310,TPP-2971HU1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 60
Figure 105108621-A0305-02-0164-85
Figure 105108621-A0305-02-0165-86
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,VH
<400> 61
Figure 105108621-A0305-02-0165-87
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,HCDR1
<400> 62
Figure 105108621-A0305-02-0166-88
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,HCDR2
<400> 63
Figure 105108621-A0305-02-0166-89
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,HCDR3
<400> 64
Figure 105108621-A0305-02-0166-90
<210> 65
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,VL
<400> 65
Figure 105108621-A0305-02-0166-91
Figure 105108621-A0305-02-0167-92
<210> 66
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,LCDR1
<400> 66
Figure 105108621-A0305-02-0167-93
<210> 67
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,LCDR2
<400> 67
Figure 105108621-A0305-02-0167-94
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,LCDR3
<400> 68
Figure 105108621-A0305-02-0167-95
<210> 69
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,VH
<400> 69
Figure 105108621-A0305-02-0167-97
Figure 105108621-A0305-02-0168-98
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,VL
<400> 70
Figure 105108621-A0305-02-0168-99
<210> 71
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,重鏈
<400> 71
Figure 105108621-A0305-02-0168-100
Figure 105108621-A0305-02-0169-101
Figure 105108621-A0305-02-0170-102
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,輕鏈
<400> 72
Figure 105108621-A0305-02-0170-103
Figure 105108621-A0305-02-0171-104
<210> 73
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,重鏈
<400> 73
Figure 105108621-A0305-02-0171-105
Figure 105108621-A0305-02-0172-106
<210> 74
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3322,TPP-3186X1-hIgG2,輕鏈
<400> 74
Figure 105108621-A0305-02-0172-107
<210> 75
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,VH
<400> 75
Figure 105108621-A0305-02-0173-108
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,HCDR1
<400> 76
Figure 105108621-A0305-02-0173-109
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,HCDR2
<400> 77
Figure 105108621-A0305-02-0174-110
<210> 78
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,HCDR3
<400> 78
Figure 105108621-A0305-02-0174-111
<210> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,VL
<400> 79
Figure 105108621-A0305-02-0174-113
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,LCDR1
<400> 80
Figure 105108621-A0305-02-0175-114
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,LCDR2
<400> 81
Figure 105108621-A0305-02-0175-115
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,LCDR3
<400> 82
Figure 105108621-A0305-02-0175-116
<210> 83
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,VH
<400> 83
Figure 105108621-A0305-02-0175-117
<210> 84
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hTgG2,VL
<400> 84
Figure 105108621-A0305-02-0176-118
<210> 85
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,重鏈
<400> 85
Figure 105108621-A0305-02-0176-119
Figure 105108621-A0305-02-0177-120
Figure 105108621-A0305-02-0178-121
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,輕鏈
<400> 86
Figure 105108621-A0305-02-0178-122
Figure 105108621-A0305-02-0179-123
<210> 87
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,重鏈
<400> 87
Figure 105108621-A0305-02-0179-124
Figure 105108621-A0305-02-0180-125
<210> 88
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3323,TPP-3187X1-hIgG2,輕鏈
<400> 88
Figure 105108621-A0305-02-0180-127
<210> 89
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3688,h16C3-hIgG2 κ,重鏈
<400> 89
Figure 105108621-A0305-02-0180-126
Figure 105108621-A0305-02-0181-128
Figure 105108621-A0305-02-0182-130
<210> 90
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3688,h16C3-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 90
Figure 105108621-A0305-02-0182-131
Figure 105108621-A0305-02-0183-132
<210> 91
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,VH
<400> 91
Figure 105108621-A0305-02-0183-133
Figure 105108621-A0305-02-0184-134
<210> 92
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 92
Figure 105108621-A0305-02-0184-136
<210> 93
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 93
Figure 105108621-A0305-02-0184-137
<210> 94
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 94
Figure 105108621-A0305-02-0185-138
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,VL
<400> 95
Figure 105108621-A0305-02-0185-139
<210> 96
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 96
Figure 105108621-A0305-02-0186-140
<210> 97
<211> 7
<212> PRRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 97
Figure 105108621-A0305-02-0186-141
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 98
Figure 105108621-A0305-02-0186-142
<210> 99
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,VH
<400> 99
Figure 105108621-A0305-02-0186-144
<210> 100
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,VL
<400> 100
Figure 105108621-A0305-02-0187-146
<210> 101
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 101
Figure 105108621-A0305-02-0187-147
Figure 105108621-A0305-02-0188-148
Figure 105108621-A0305-02-0189-149
<210> 102
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 102
Figure 105108621-A0305-02-0189-150
Figure 105108621-A0305-02-0190-151
<210> 103
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 103
Figure 105108621-A0305-02-0190-152
Figure 105108621-A0305-02-0191-153
<210> 104
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3705,090E-M007-A09-Mat1-hIgG2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 104
Figure 105108621-A0305-02-0191-155
<210> 105
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,VH
<400> 105
Figure 105108621-A0305-02-0191-156
Figure 105108621-A0305-02-0192-157
<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 106
Figure 105108621-A0305-02-0192-159
<210> 107
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 107
Figure 105108621-A0305-02-0192-158
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 108
Figure 105108621-A0305-02-0193-160
<210> 109
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,VL
<400> 109
Figure 105108621-A0305-02-0193-161
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 110
Figure 105108621-A0305-02-0193-162
<210> 111
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 111
Figure 105108621-A0305-02-0194-163
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 112
Figure 105108621-A0305-02-0194-164
<210> 113
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,VH
<400> 113
Figure 105108621-A0305-02-0194-168
<210> 114
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,VL
<400> 114
Figure 105108621-A0305-02-0194-167
Figure 105108621-A0305-02-0195-169
<210> 115
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 115
Figure 105108621-A0305-02-0195-170
Figure 105108621-A0305-02-0196-171
Figure 105108621-A0305-02-0197-172
<210> 116
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 116
Figure 105108621-A0305-02-0197-173
Figure 105108621-A0305-02-0198-174
<210> 117
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 117
Figure 105108621-A0305-02-0198-175
Figure 105108621-A0305-02-0199-176
<210> 118
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3707,090E-M007-A09-Mat2-hIgG2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 118
Figure 105108621-A0305-02-0199-178
<210> 119
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,VH
<400> 119
Figure 105108621-A0305-02-0199-177
Figure 105108621-A0305-02-0200-179
<210> 120
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2κ,HCDR1
<400> 120
Figure 105108621-A0305-02-0200-180
<210> 121
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 121
Figure 105108621-A0305-02-0200-181
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 122
Figure 105108621-A0305-02-0200-182
<210> 123
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,VL
<400> 123
Figure 105108621-A0305-02-0201-183
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 124
Figure 105108621-A0305-02-0201-184
<210> 125
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 125
Figure 105108621-A0305-02-0201-185
Figure 105108621-A0305-02-0202-186
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 126
Figure 105108621-A0305-02-0202-189
<210> 127
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,VH
<400> 127
Figure 105108621-A0305-02-0202-188
<210> 128
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,VL
<400> 128
Figure 105108621-A0305-02-0202-190
<210> 129
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 129
Figure 105108621-A0305-02-0203-191
Figure 105108621-A0305-02-0204-192
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 130
Figure 105108621-A0305-02-0205-193
<210> 131
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 131
Figure 105108621-A0305-02-0206-195
<210> 132
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3714,TPP-2971HU2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 132
Figure 105108621-A0305-02-0207-198
<210> 133
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,VH
<400> 133
Figure 105108621-A0305-02-0207-199
Figure 105108621-A0305-02-0208-200
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 134
Figure 105108621-A0305-02-0208-201
<210> 135
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 135
Figure 105108621-A0305-02-0208-202
<210> 136
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 136
Figure 105108621-A0305-02-0208-203
<210> 137
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,VL
<400> 137
Figure 105108621-A0305-02-0208-204
Figure 105108621-A0305-02-0209-205
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 138
Figure 105108621-A0305-02-0209-207
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 139
Figure 105108621-A0305-02-0209-206
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 140
Figure 105108621-A0305-02-0210-208
<210> 141
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,VH
<400> 141
Figure 105108621-A0305-02-0210-210
<210> 142
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,VL
<400> 142
Figure 105108621-A0305-02-0210-212
<210> 143
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 143
Figure 105108621-A0305-02-0210-213
Figure 105108621-A0305-02-0211-214
Figure 105108621-A0305-02-0212-215
<210> 144
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 144
Figure 105108621-A0305-02-0212-216
Figure 105108621-A0305-02-0213-217
<210> 145
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,重鏈
<400> 145
Figure 105108621-A0305-02-0213-218
Figure 105108621-A0305-02-0214-219
<210> 146
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3820,3187HU1-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 146
Figure 105108621-A0305-02-0214-220
Figure 105108621-A0305-02-0215-221
<210> 147
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,VH
<400> 147
Figure 105108621-A0305-02-0215-222
<210> 148
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,HCDR1
<400> 148
Figure 105108621-A0305-02-0216-223
<210> 149
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,HCDR2
<400> 149
Figure 105108621-A0305-02-0216-224
<210> 150
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,HCDR3
<400> 150
Figure 105108621-A0305-02-0216-226
<210> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,VL
<400> 151
Figure 105108621-A0305-02-0216-225
Figure 105108621-A0305-02-0217-227
<210> 152
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,LCDR1
<400> 152
Figure 105108621-A0305-02-0217-228
<210> 153
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,LCDR2
<400> 153
Figure 105108621-A0305-02-0217-229
<210> 154
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,LCDR3
<400> 154
Figure 105108621-A0305-02-0217-230
<210> 155
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,VH
<400> 155
Figure 105108621-A0305-02-0218-231
<210> 156
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,VL
<400> 156
Figure 105108621-A0305-02-0218-232
<210> 157
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 157
Figure 105108621-A0305-02-0218-233
Figure 105108621-A0305-02-0219-234
Figure 105108621-A0305-02-0220-235
<210> 158
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 158
Figure 105108621-A0305-02-0220-236
Figure 105108621-A0305-02-0221-237
<210> 159
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,重鏈
<400> 159
Figure 105108621-A0305-02-0221-238
Figure 105108621-A0305-02-0222-239
<210> 160
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-3821,3187HU2-hIgG2 κ,輕鏈
<400> 160
Figure 105108621-A0305-02-0222-240
Figure 105108621-A0305-02-0223-241
<210> 161
<211> 532
<212> PRT
<213> 普通獼猴(恆河猴)
<400> 161
Figure 105108621-A0305-02-0223-242
Figure 105108621-A0305-02-0224-243
Figure 105108621-A0305-02-0225-244
<210> 162
<211> 292
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Figure 105108621-A0305-02-0225-245
Figure 105108621-A0305-02-0226-246
<210> 163
<211> 404
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Figure 105108621-A0305-02-0226-247
Figure 105108621-A0305-02-0227-248
Figure 105108621-A0305-02-0228-249
<210> 164
<211> 657
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Figure 105108621-A0305-02-0228-250
Figure 105108621-A0305-02-0229-251
Figure 105108621-A0305-02-0230-252
Figure 105108621-A0305-02-0231-253
<210> 165
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1790,hCeacam6-WT-Fc-6xHis
<400> 165
Figure 105108621-A0305-02-0231-254
Figure 105108621-A0305-02-0232-255
Figure 105108621-A0305-02-0233-256
<210> 166
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1791,hCeacam6-Dom1-MacMu1-Xa-Fc-His
<400> 166
Figure 105108621-A0305-02-0233-257
Figure 105108621-A0305-02-0234-258
Figure 105108621-A0305-02-0235-259
<210> 167
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1792,hCeacam6-Dom2-MacMu1-Xa-Fc-His
<400> 167
Figure 105108621-A0305-02-0236-260
Figure 105108621-A0305-02-0237-261
Figure 105108621-A0305-02-0238-262
<210> 168
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1793,hCeacam6-Dom3-MacMu1-Xa-Fc-His
<400> 168
Figure 105108621-A0305-02-0238-263
Figure 105108621-A0305-02-0239-264
Figure 105108621-A0305-02-0240-265
<210> 169
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1794,hCeacam6-Dom1-8xHis(E.coli)
<400> 169
Figure 105108621-A0305-02-0240-266
Figure 105108621-A0305-02-0241-267
<210> 170
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2443,cyno CEACAM-6-Xa-Fc-His
<400> 170
Figure 105108621-A0305-02-0241-268
Figure 105108621-A0305-02-0242-269
Figure 105108621-A0305-02-0243-270
<210> 171
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-2452,食蟹猴Ceacam6-Dom1-Xa-Fc-His
<400> 171
Figure 105108621-A0305-02-0243-271
Figure 105108621-A0305-02-0244-272
Figure 105108621-A0305-02-0245-273
<210> 172
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Figure 105108621-A0305-02-0245-274
<210> 173
<211> 526
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Figure 105108621-A0305-02-0246-275
Figure 105108621-A0305-02-0247-276
Figure 105108621-A0305-02-0248-277
<210> 174
<211> 300
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Figure 105108621-A0305-02-0248-278
Figure 105108621-A0305-02-0249-279
<210> 175
<211> 252
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Figure 105108621-A0305-02-0249-280
Figure 105108621-A0305-02-0250-281
<210> 176
<211> 702
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Figure 105108621-A0305-02-0250-282
Figure 105108621-A0305-02-0251-283
Figure 105108621-A0305-02-0252-284
Figure 105108621-A0305-02-0253-285
<210> 177
<211> 344
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴(食蟹猴)
<400> 177
Figure 105108621-A0305-02-0253-286
Figure 105108621-A0305-02-0254-287
Figure 105108621-A0305-02-0255-288
<210> 178
<211> 349
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Figure 105108621-A0305-02-0255-289
Figure 105108621-A0305-02-0256-290
<210> 179
<211> 344
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
Figure 105108621-A0305-02-0256-291
Figure 105108621-A0305-02-0257-292
Figure 105108621-A0305-02-0258-293
<210> 180
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹獼猴CEACAM6-1區-His
<400> 180
Figure 105108621-A0305-02-0258-294
<210> 181
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-5468-重鏈
<400> 181
Figure 105108621-A0305-02-0259-295
Figure 105108621-A0305-02-0260-296
<210> 182
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-5468-輕鏈
<400> 182
Figure 105108621-A0305-02-0261-297
<210> 183
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APP-1574-重鏈(Fab)
<400> 183
Figure 105108621-A0305-02-0262-298
Figure 105108621-A0305-02-0263-299
<210> 184
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APP-1574-輕鏈(Fab)
<400> 184
Figure 105108621-A0305-02-0263-300
Figure 105108621-A0305-02-0264-301
<210> 185
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-8697,hCEACAM6-1區-His-I30L
<400> 185
Figure 105108621-A0305-02-0264-302
<210> 186
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-8698,hCEACAM6-1區-His-I30F
<400> 186
Figure 105108621-A0305-02-0265-303

Claims (16)

  1. 一種抗體或其抗原結合片段，係包括一重鏈抗原結合區，其包括一包含SEQ ID NO：48之H-CDR1、一包含SEQ ID NO：49之H-CDR2和一包含SEQ ID NO：50之H-CDR3，以及一輕鏈抗原結合區其包括一包含SEQ ID NO：52之L-CDR1、一包含SEQ ID NO：53之L-CDR2和一包含SEQ ID NO：54之L-CDR3。
  2. 根據請求項1之抗體或其抗原結合片段，係包括一以SEQ ID NO：47表示之可變重鏈序列及一以SEQ ID NO：51表示之可變輕鏈序列。
  3. 根據請求項1之抗體或其抗原結合片段，其為一IgG抗體。
  4. 根據請求項1之抗體或其抗原結合片段，係包括一以SEQ ID NO：57表示之重鏈區和一以SEQ ID NO：58表示之輕鏈區。
  5. 一種抗體-藥物接合物，係包括根據請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  6. 一種分離的核酸，其係編碼根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段。
  7. 一種載體，係包括一根據請求項6之核酸。
  8. 一種分離的細胞，其係表現根據請求項1至4中任一項之分離的抗體或抗原結合片段及/或包括根據請求項6之核酸或根據請求項7之載體。
  9. 根據請求項8之分離的細胞，其中該細胞為一原核細胞或真核細胞。
  10. 一種製造根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段之方法，其包括培養根據請求項9之細胞及純化抗體或抗原結合片段。
  11. 根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段或根據請求項5之抗體-藥物接合物，係用作為醫藥品。
  12. 根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段或根據請求項5之抗體-藥物接合物，係用作為診斷劑。
  13. 根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段或根據請求項5之抗體-藥物接合物，係用作為治療癌症之醫藥品。
  14. 一種醫藥組成物，係包括根據請求項1至4中任一項之抗體或抗原結合片段或根據請求項5之抗體-藥物接合物。
  15. 一種根據請求項14之醫藥組成物與一或多種治療活性化合物之組合。
  16. 一種有效量的根據請求項14之醫藥組成物或根據請求項15之組合的用途，其用於製造治療癌症之醫藥品。
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