JP2022536114A - 抗ｃｅａｃａｍ５モノクローナル抗体およびその調製方法およびその使用 - Google Patents

抗ｃｅａｃａｍ５モノクローナル抗体およびその調製方法およびその使用 Download PDF

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Abstract

ヒト癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合し得るモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片が開示され、前記抗体に基づくキメラ抗原受容体ならびに前記抗体および抗原結合性断片を調製する方法ならびにＣＥＡＣＡＭ５関連腫瘍を処置するためのその使用も開示される。

Description

技術分野
本出願は、免疫性の分野に属する、具体的には、ヒト癌胎児性抗原細胞接着分子５（ｈｕｍａｎ ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ５：ＣＥＡＣＡＭ５）に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合性断片に関する。本出願はまた、抗体およびその抗原結合性断片の調製方法および使用に関する。
背景
ヒト癌胎児性抗原細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）ファミリーは、１９６０年代には早くも発見され、１９番染色体（ｑ１３．１と１３．３との間）に位置する３５種の遺伝子／偽遺伝子を含み、その中にタンパク質をコードする２１種がある。ＣＥＡＣＡＭは、接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そのドメインは、高度にグリコシル化され、普通、１～２つの免疫グロブリン可変領域様ドメイン（Ｎドメイン）および０～６つの免疫グロブリン定常領域様ドメインを含む。ＣＥＡＣＡＭタンパク質は、細胞膜上に位置し、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３およびＣＥＡＣＡＭ４は、疎水性膜貫通ドメインを介して細胞膜上に固定され、一方で、ＣＥＡＣＡＭ５～８は、グリコシル－ホスファチジル－イノシトールを介して細胞膜上に固定される。これらの細胞外ドメインは普通、細胞（例えば、上皮、内皮、樹状突起および白血球）間接着分子として作用する。
ＣＥＡＣＡＭは、さまざまな細胞機能に関与し、細胞間の接着機能に基づくシグナル伝達を介して細胞成長および分化を調節し、インスリンホメオスタシス、血管新生および免疫調節において重要な役割を果たす。ＣＥＡＣＡＭファミリーのメンバーは、病原性微生物の受容体として含む、さまざまな病態生理学の役割に関与する。それらは、がん発生において、特に、がん検出、進行および転移において重要な役割を果たす。ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡと呼ばれる、ＣＤ６６ｅとしても知られる）は、約１８０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質である。７つのドメインを含有するＣＥＡＣＡＭ５は、グリコシル－ホスファチジル－イノシトール（ＧＰＩ）を介して細胞膜上に固定される。７つのドメインは、単一のＮ末端Ｉｇ可変ドメインおよびＩｇ定常ドメインと相同な６つのドメイン（Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３）を含む。ＣＥＡＣＡＭ５は元々、胎児組織において発現されるタンパク質であると考えられており、今では、いくつかの正常な成体組織において同定されている。ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現は、多数の種類のがんにおいて観察されている。例えば、ＣＥＡＣＡＭ５は、結腸がんを有する患者の血液において検出され得る。さらに、さらなる研究が、その過剰発現は多数の悪性腫瘍と関連しており、不十分な予後と相関していることが多いということを決定した。前立腺がんおよび結腸直腸がんでは、ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現はまた、腫瘍バイオマーカーとしても見出され、使用することができる。
さらに、ＣＥＡＣＡＭ５／ＣＥＡＣＡＭ６はまた、さまざまな悪性腫瘍、例えば、乳房、膵臓、卵巣、結腸、肺および胃腺腫瘍において過剰発現されるとわかっており、腫瘍浸潤および転移と関連している。肝臓転移の開始の際、ＣＥＡＣＡＭ５は、その受容体ＣＥＡｒに結合し、その相互作用は、炎症性サイトカイン、主に、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αの活性化および生成につながる。簡潔に述べると、これらのサイトカインは、肝細胞およびクッパー細胞の微小環境ならびに肝類洞細胞（ｈｅｐａｔｉｃ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｃｅｌｌｓ）とのその相互作用を変化させる。これらの相互作用は、腫瘍細胞または他の肝細胞に影響を及ぼすだけでなく、脳脊髄液においてＣＳＣおよび他の循環腫瘍細胞の活力を促進するとも思われる。
これに基づいて、がんの予後を臨床的に決定し、がんの進行をモニタリングするために、がん患者の血液におけるＣＥＡＣＡＭ５レベルの上昇を測定する免疫学的アッセイにおいて腫瘍マーカーとしてＣＥＡＣＡＭ５を使用するという現在の適用に加えて、ＣＥＡＣＡＭ５が、標的化療法の潜在的に有用な腫瘍関連抗原であることがより重要となる。がんにおいて標的化免疫療法のためにＣＥＡＣＡＭ５を使用することが報告されている２つの主要な適用がある。一方の適用は、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を使用して、特に、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）による免疫細胞の溶解活性を引き起こし、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を排除し、もう一方の適用は、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその抗体断片にエフェクター分子、例えば、薬物、毒素、放射活性ヌクレオチド、免疫調節物質またはサイトカインをコンジュゲートして、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とし、それによって、エフェクター分子の治療効果を発揮することを含む。ＣＥＡＣＡＭ５は、一部の固形腫瘍、例えば、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、胃がん、肝細胞腫瘍、乳がんおよび甲状腺がんにおいて優先的に過剰発現されるという事実に基づいて、現在の研究は、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体の抗原認識能に焦点が当てられている。
結論として、現在の研究は、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする免疫療法が、腫瘍転移を阻害するのに役立つであろうことを示す。特に、ＣＥＡＣＡＭ５に対して強い特異性を有する抗体は、オフターゲットの抗体によって引き起こされる副作用をより良好に避けることができる。例えば、ＣＥＡＣＡＭ１およびＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ８は、ヒト免疫系および骨髄、例えば、好中球などにおいて広く分布しており、特定のＣＥＡＣＡＭ５および／またはＣＥＡＣＡＭ６抗体は、薬物のあり得る副作用を低減でき、処置手段を増大できる。
これに基づいて、より高い親和性およびより良好な特異性を有する抗ＣＥＡＣＡＭ抗体に対する需要がある。
発明の内容
本出願では、特に断りのない限り、本明細書において使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、本明細書において使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学の実験手順はすべて、対応する分野で広く使用される日常的な手順である。同時に、本出願をより良好に理解するために、関連用語の定義および説明を以下に提供する。
用語の定義
「抗体」という用語は、本出願において、特異的抗原に結合できる任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性（二価）抗体を含む。天然の無傷の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有する。各重鎖は、１つの可変領域と、第１、第２および第３の定常領域から構成され、各軽鎖は、１つの可変領域と、１つの定常領域から構成される。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμにわけることができ、哺乳動物軽鎖は、λまたはκにわけることができる。抗体は、「Ｙ」型で提示され、Ｙ型構造のネックは、ジスルフィド結合によって連結されている２つの重鎖の第２および第３の定常領域から構成される。「Ｙ」型構造の各アームは、１つの重鎖に可変領域および第１の定常領域を含有し、これらは、１つの軽鎖の可変領域および定常領域と連結している。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合を決定する。各鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域を含有する。軽鎖（Ｌ）のＣＤＲは、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含み、重鎖（Ｈ）のＣＤＲは、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２およびＶＨＣＤＲ３を含む。本出願において開示される抗体およびその抗原結合性断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ番号付けシステムによって名付けるまたは同定することができる（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ， Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．、Ｌｅｓｋ， ＡＭ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７３巻（４号）：９２７頁（１９９７年）、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１８６巻（３号）：６５１～６３頁（１９８５年）、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．およびＬｅｓｋ，ＡＭ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻（６２５２号）：８７７～８３頁（１９８９年）、Ｋａｂａｔ， ＥＡら、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））。ここで、３つのＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる連続した副次的な部分によってわけられている。フレームワーク領域は、ＣＤＲよりも高度に保存されており、超可変ループを支持するための足場を形成する。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合と関連していないが、複数のエフェクター機能を有する。抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいていくつかのカテゴリーにわけることができる。それらがα、δ、ε、γおよびμ重鎖を含有するかに従って、抗体を５つの主要なカテゴリーまたは異性体にわけることができる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。いくつかの主要な抗体カテゴリーをサブクラス、例えば、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などにさらにわけることができる。
「抗原結合性断片」という用語は、本出願において、１つもしくは複数のＣＤＲを含有する抗体部分によって形成される抗体断片または抗原に結合するが、完全な抗体構造を有さない任意の他の抗体断片を指す。抗原結合性断片の例として、限定されるものではないが、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異的ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド結合によって安定化された二官能性抗体（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価二官能性抗体）、二価単鎖抗体（ＢｓＦｖ）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合性断片は、親抗体と同一抗原に結合できる。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、特定のヒト抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含有する場合があり、これらは、１つまたは複数の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域中に接合される。
抗体の「Ｆａｂ」断片とは、抗体分子の一部を指し、軽鎖（可変および定常領域を含む）およびジスルフィド結合によって結合されている重鎖の可変領域と定常領域の一部から構成される。
「Ｆａｂ’」断片とは、ヒンジ領域の一部を含有するＦａｂ断片を指す。
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、Ｆａｂの二量体を指す。
抗体のＦｃセグメントは、さまざまな異なるエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣに関与するが、抗原結合には加わらない。
抗体の「Ｆｖ」セグメントとは、完全抗原結合部位を含有する最小の抗体断片を指す。Ｆｖ断片は、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域から構成される。
「単鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域が直接結合されている、またはペプチド鎖を介して結合されている操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８５巻：５８７９頁（１９８８年））。
「単鎖抗体Ｆｖ－Ｆｃ」または「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」とは、ある特定の抗体のＦｃセグメントに結合されているｓｃＦｖから構成される操作された抗体を指す。
「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ（重鎖のみの抗体、ＨＣＡｂ）」はすべて、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２３１巻（１－２）：２５～３８頁（１９９９年）、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４巻（４号）：２７７～３０２頁（２００１年）、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１、米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は元々、ラクダ類（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）に由来するものであった。その軽鎖が失われているが、ラクダ化抗体は、確認された抗原結合機能を有する（Ｈａｍｅｒｓ Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３巻（６４２８号）：４４６～８頁（１９９３年）、Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら、「Ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃａｍｅｌｉｄａｅ： ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ． ５４巻（１号）：３９～４７頁（２００２年）、Ｎｇｕｙｅｎ ＶＫ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． １０９巻（１号）：９３～１０１頁（２００３年））。重鎖抗体の可変領域（ＶＨドメイン）は、獲得免疫によって生成される最も小さい既知抗原結合性ユニットである（Ｋｏｃｈ－Ｎｏｌｔｅ Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２１巻（１３号）：３４９０～８頁 Ｅｐｕｂ （２００７年））。
「ナノボディ」とは、重鎖抗体に由来するＶＨドメインおよび２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３から構成される抗体断片を指す。
「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を含有し、断片は、同一ポリペプチド鎖に結合されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ． ９０巻（１４号）：６４４４～８頁（１９９３年）、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ９３／１１１６１を参照）。２つのドメインの間のリンカーは、同一鎖上の２つのドメインが互いに対を形成できないように短く、このため、２つのドメインは、他の鎖の相補的ドメインと対を形成して、２つの抗体結合部位を形成するように強いられる。これらの２つの抗体結合部位は、同一または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とすることができる。
「ドメイン抗体」とは、１つの重鎖可変領域または１つの軽鎖可変領域のみを含有する抗体断片を指す。一例では、２つ以上のＶＨドメインが、ポリペプチドリンカーによって共有結合によって連結されて、二価ドメイン抗体を形成する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同一または異なる抗原を標的とすることができる。
一部の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖を含有する：２つのＶＨ遺伝子は、ポリペプチドリンカーによって連結され、それらは、ジスルフィド結合によって２つのＶＬ群にライゲートされている。
一部の実施形態では、「二重特異性ｄｓ二官能性抗体」は、ＶＬ１－ＶＨ２（ポリペプチドリンカーによって連結された）およびＶＨ１－ＶＬ２（同様にポリペプチドリンカーによって連結された）を含有し、２つは、ジスルフィド結合によってＶＨ１とＶＬ１との間に連結されている。
「二重特異的ｄｓＦｖ」または「ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ」は、３つのポリペプチド鎖：ＶＨ１－ＶＨ２群を含有し、２つの重鎖は、ポリペプチドリンカー（例えば、長い弾性のリンカー）によって連結され、それらはそれぞれ、ジスルフィド結合によってＶＬ１およびＶＬ２群にライゲートされ、ジスルフィド結合を用いて対形成された重鎖および軽鎖の各対は、異なる抗原特異性を有する。
ある特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、二量体化されたＶＨ－ＶＬ（ポリペプチドリンカーによって連結された）グループを含有する二価二官能性抗体または二価単鎖抗体（ＢｓＦｖ）であり、一方のグループのＶＨおよびもう一方のグループのＶＬは、協力して２つの結合部位を形成し、２つの結合部位は、同一抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的とすることができる。他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＬ１－ＶＨ２（ポリペプチドリンカーによって連結された）およびＶＨ１－ＶＬ２（ポリペプチドリンカーによって連結された）を含有する二重特異的二官能性抗体であり、ＶＨ１およびＶＬ１が協力し、ＶＨ２およびＶＬ２が協力し、各協力した対は、異なる抗原特異性を有する。
本出願において使用される「完全ヒト」という用語について、抗体または抗原結合性断片に適用される場合には、抗体または抗原結合性断片が、ある特定のアミノ酸配列を有する、またはアミノ酸配列からなり、アミノ酸配列は、ヒトもしくはヒト免疫細胞によって産生されるか、または非ヒト供給源、例えば、ヒト抗体ライブラリーを使用するトランスジェニック非ヒト動物に由来する抗体のアミノ酸配列またはヒト抗体をコードする他の配列に対応することを指す。一部の実施形態では、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体に由来するアミノ酸残基（特に、抗原結合性残基）を含有しない。
本明細書において使用される「ヒト化」という用語について、抗体または抗原結合性断片に適用される場合には、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域およびヒトに由来する定常領域（適用可能である場合）を含有する抗体または抗原結合性断片を指す。ヒト化抗体または抗原結合性断片は、低減された免疫原性を有するので、ある特定の実施形態ではヒト治療薬として使用できる。一部の実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットまたはハムスターなどの哺乳動物である。一部の実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合性断片は、ＣＤＲ配列が非ヒトである点を除いて、本質的にヒト配列からなる。一部の実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、由来するヒト抗体と同一アミノ酸配列を含有し得るか、またはいくつかのアミノ酸変化、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１つ以下のアミノ酸変化を含有し得る。一部の実施形態では、アミノ酸変化は、重鎖のＦＲ領域中にのみ、軽鎖のＦＲ領域中にのみ、または両方の鎖に存在し得る。一部の好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトＦＲ１～３およびヒトＪＨおよびＪＫを含む。
「キメラ」という用語は、本出願において使用される場合、重鎖および／または軽鎖の一部がある種に由来し、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる種に由来する抗体または抗原結合性断片を指す。例示的例では、キメラ抗体は、ヒト由来の定常領域およびマウスなどの非ヒト動物由来の可変領域を含有し得る。
「癌胎児性抗原細胞接着分子５」（ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡと略され、ＣＤ６６ｅとしても知られる；例えば、ＡＡＡ５１９６７．１／ＧＩ：１８０２２３、７０２個のアミノ酸を参照）とは、約１８０ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質を指す。ＣＥＡＣＡＭ５は、７つのＩｇ様ドメインを含有し、これらの７つのドメインは、Ｉｇ定常ドメインと相同である、単一のＮ末端Ｉｇ可変ドメインおよび６つのドメイン（Ａ１－Ｂ１－Ａ２－Ｂ２－Ａ３－Ｂ３）を含む。ＣＥＡＣＡＭは、カルボキシ末端グリコシル－ホスファチジル－イノシトール（ＧＰＩ）を介して細胞膜に固定される。
「特異的に結合する」または「特異的結合」とは、本出願において、２つの分子間の非無作為結合反応、例えば、抗体と抗原との間の反応を指す。一部の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトおよび／またはサル癌胎児性抗原細胞接着分子５に特異的に結合し、その結合親和性（ＫＤ）は、≦１０－６Ｍ．ＫＤである。本出願において、ＫＤとは、結合速度に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、これは、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用して表面プラズモン共鳴によって測定できる。
「選択的結合」とは、本出願において、本出願の抗体またはその抗原結合性断片が、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合するが、別のＣＥＡＣＡＭタンパク質、例えば、ＣＥＡＣＡＭ１タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ３タンパク質、ＣＥＡＣＡＭ７タンパク質に実質的に結合しないか、または有意により低いレベルで結合することを指す。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体の重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１型のものである。一部の実施形態では、本出願において記載される抗体の軽鎖定常領域は、κ鎖である。一部の実施形態では、本出願において記載される抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、それぞれ、ヒトＩｇＧ１およびκ鎖である。
本出願において、「保存的置換」は、アミノ酸配列に適用される場合には、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基と置き換えられ、それらが、同様の物理的および化学的特性を有する側鎖を有することを指す。例えば、保存置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の間、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）の間で実施され得る。保存的置換は普通、タンパク質のコンホメーション的構造において大幅な変化を引き起こさない、したがって、タンパク質の生物活性は保持され得るということは、当技術分野で公知である。
「配列同一性パーセント」がアミノ酸配列（または核酸配列）に適用される場合には、配列アラインメントが実施され、同一アミノ酸（または核酸）の数を最大化するために必要な場合に間隔が導入された後の、参照配列のアミノ酸（または核酸）残基と同一である候補配列のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージを指す。保存的置換のアミノ酸残基は、同一残基と考えられる場合も、考えられない場合もある。配列アラインメントは、アミノ酸（または核酸）配列の配列同一性パーセントを決定するための当技術分野で開示されるツールによって実施できる。当業者は、ツールのデフォルトパラメータを使用できる、またはアラインメントの必要性に従って適宜、例えば、適したアルゴリズムを選択することによってパラメータを調整できる。
本出願において使用される「Ｔ細胞」には、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞および抑制性Ｔ細胞が含まれる。
「エフェクター機能」とは、本出願で使用される場合、そのエフェクター、例えば、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体に結合する抗体のＦｃ領域の生物活性を指す。例示的エフェクター機能には、抗体の、Ｃ１複合体上のＣ１ｑとの相互作用によって誘導される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、エフェクター細胞上のＦｃ受容体への抗体のＦｃ領域の結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および食作用が含まれる。
本出願において「がん」または「がん性症状」とは、腫瘍または悪性細胞成長、増殖または転移によって媒介され、固形腫瘍および非固形腫瘍、例えば白血病を引き起こす任意の医学的状態を指す。本出願において「腫瘍」とは、腫瘍および／または悪性細胞の固形物質を指す。
ある特定の状態の「処置」または「療法」は、ある特定の状態を防ぐことまたは軽減すること、ある特定の状態の増加もしくは発生速度を低減すること、ある特定の状態の発生のリスクを低減することおよびある特定の状態と関連する症状の発生を防ぐこともしくは遅延すること、ある特定の状態と関連する症状を低減することもしくは終結させること、ある特定の状態の完全もしくは部分回復を促進すること、ある特定の状態を治癒することまたはそれらの任意の組合せを含む。がんについては、「処置」または「療法」は、腫瘍もしくは悪性細胞の成長、再生成もしくは転移を阻害もしくは減速することまたは上記のもののうちいくつかの任意の組合せを指す場合がある。腫瘍については、「処置」または「療法」は、腫瘍のすべてもしくは一部を取り除くこと、腫瘍の成長および転移を阻害もしくは減速すること、腫瘍の発生を防ぐもしくは遅延することまたは上記のもののうちいくつかの組合せを含む。
「単離された」材料とは、その天然状態から人工的に変更されていることを指す。ある特定の「単離された」物質または成分が天然に現れる場合、それはその元の状態から変更されているか、またはそれから逸脱している、または両方である。例えば、生存している動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、その天然状態で共存する物質から十分にわけられ、十分に純粋な状態で存在する場合には、それらは「単離され」ていると考えることができる。一部の実施形態では、抗体およびその抗原結合性断片の純度は、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であり、これは、電気泳動法（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣ）によって決定できる。
「ベクター」とは、本出願において、タンパク質が発現されることを可能にするように、ある特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に挿入され得るビヒクルを指す。ベクターを使用して、保持する遺伝物質エレメントが宿主細胞において発現され得るように、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトできる。例えば、ベクターには、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、バクテリオファージ、例えば、λファージもしくはＭ１３バクテリオファージおよび動物ウイルスなどが含まれる。ベクターとして使用される動物ウイルスの種類には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、乳頭腫空胞ウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメントおよびレポーター遺伝子を含む、発現を制御するさまざまなエレメントを含有し得る。さらに、ベクターはまた、複製起点も含有し得る。ベクターはまた、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質シェルを含む、細胞に侵入するのを補助する成分を含有し得る。
本出願において、「宿主細胞」とは、外来性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入される細胞を指す。本出願において記載される宿主細胞として、限定されるものではないが、原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、真菌細胞、例えば、酵母細胞またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、昆虫細胞、例えば、Ｓ２ショウジョウバエ細胞またはＳｆ９または動物細胞、例えば、線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞が挙げられる。
本出願において、「キメラ抗原受容体」は、ＣＡＲと呼ばれ、特異的抗原を認識するための細胞外ドメイン（例えば、特異的抗原を認識し、結合できる抗原結合性断片）および細胞外シグナルを細胞の内側に伝達するための細胞内ドメイン（細胞内シグナル伝達領域とも呼ばれる、例えば、ＣＤ３のδ鎖またはＦｃεＲＩγの細胞内部分）を含む、特異的抗原（例えば、腫瘍抗原）を認識できる細胞表面受容体を指す。このようなキメラ抗原受容体を保持し、発現するＴ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞と呼ばれ、これは、細胞外ドメインによって特異的抗原および細胞（例えば、腫瘍細胞）を認識し、結合でき、細胞内シグナル伝達機能によって、免疫応答を活性化でき、多数の種々のエフェクターを放出でき、特異的抗原を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）を効率的に殺滅し、それによって、治療効果（例えば、腫瘍の処置）を発揮できる。
先行技術の欠点に基づいて、本出願の主要な目的のうちの１つは、より強力な特異性およびより良好な選択性を有する抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を提供することである。本出願はまた、抗体の調製方法および使用を提供し、本出願の抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体は、腫瘍の検出および／または処置のために使用できる。
本出願の抗体
一態様では、本出願は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、
（ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉ）以下の配列：配列番号１またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
（ｉｉ）以下の配列：配列番号２またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、および
（ｉｉｉ）以下の配列：配列番号３またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
ならびに／または、
（ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：
（ｉｖ）以下の配列：配列番号４またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
（ｖ）以下の配列：配列番号５またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および
（ｖｉ）以下の配列：配列番号６またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つにおいて記載される置換は、保存的置換である。
ある特定の実施形態では、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つにおいて記載されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って定義される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１もしくは配列番号２０で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２もしくは配列番号２１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５もしくは配列番号２２で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号２０で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。
ある特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って定義される。
一態様では、本出願は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供し、抗体またはその抗原結合性断片は、
（ｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ１もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｉｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ２もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｉｉｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ３もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および／または、
（ｉｖ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ１もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
（ｖ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ２もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および
（ｖｉ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ３もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨ中に含有される３つのＣＤＲおよび／またはＶＬ中に含有される３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される。ある特定の実施形態では、ＶＨ中に含有される３つのＣＤＲおよび／またはＶＬ中に含有される３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、
（ａ）以下：
（ｉ）配列番号７で示される配列、
（ｉｉ）配列番号７で示される配列と比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｉｉｉ）配列番号７で示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列
から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）
および／または
（ｂ）以下：
（ｉｖ）配列番号８で示される配列、
（ｖ）配列番号８で示される配列と比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
（ｖｉ）配列番号８で示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列
から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
ある特定の実施形態では、（ｉｉ）または（ｖ）に記載される置換は、保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト免疫グロブリンに由来する重鎖フレームワーク領域配列および／または軽鎖フレームワーク領域配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト重鎖生殖系列遺伝子によってコードされる重鎖フレームワーク領域配列および／またはヒト軽鎖生殖系列遺伝子によってコードされる軽鎖フレームワーク領域配列を含む。
ある特定の例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１８または配列番号１９で示される配列を含むＶＨおよび配列番号８または配列番号１７で示される配列を含むＶＬを含む。
ある特定の例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７で示される配列を有するＶＨおよび配列番号８で示される配列を有するＶＬを含む。ある特定の例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１８で示される配列を有するＶＨおよび配列番号８で示される配列を有するＶＬを含む。ある特定の例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１６で示される配列を有するＶＨおよび配列番号１７で示される配列を有するＶＬを含む。ある特定の例示的実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１９で示される配列を有するＶＨおよび配列番号１７で示される配列を有するＶＬを含む。
本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）免疫グロブリンまたはそのバリアントに由来する定常領域配列を含む場合があり、バリアントは、それが由来する配列と比較して、１個または数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ（例えば、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個または最大で５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ）を有する。
ある特定の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト免疫グロブリンまたはそのバリアントの重鎖定常領域（ＣＨ）を含む重鎖を有し、バリアントは、それが由来する配列と比較して、１個または数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ（例えば、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個または最大で５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ）を有する。
ある特定の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト免疫グロブリンまたはそのバリアントの軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む軽鎖を有し、バリアントは、それが由来する配列と比較して、１個または数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ（例えば、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個または最大で５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ）を有する。
一部の実施形態では、重鎖定常領域（ＣＨ）のバリアントは、それが由来する配列と比較して、１個または数個のアミノ酸の保存的置換（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸の保存的置換）を有し得る。
一部の実施形態では、軽鎖定常領域（ＣＬ）のバリアントは、それが由来する配列と比較して、１個または数個のアミノ酸の保存的置換（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸の保存的置換）を有し得る。
ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。
ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、軽鎖定常領域は、ヒトκ軽鎖定常領域である。
ある特定の例示的実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９で示される重鎖定常領域（ＣＨ）および／または配列番号１１で示される軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディおよび単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。
本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、以下：
（１）ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質またはＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を発現する細胞に特異的に結合すること、
（２）ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８タンパク質またはＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８タンパク質を発現する細胞に基本的に結合しないこと、
（３）ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質またはＣＥＡＣＡＭ６タンパク質を発現する細胞に弱くのみ結合し、結合親和性は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質またはＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を発現する細胞に対する結合親和性よりも有意に低いこと、
（４）ＡＤＣＣ活性を有すること、
（５）ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を発現する腫瘍細胞（例えば、結腸がん細胞、胃がん細胞）を阻害または殺滅可能であり、それによって、腫瘍処置活性を有すること
から選択される１つまたは複数の活性を有する。
ある特定の実施形態では、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、標識を含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンを含む。
ある特定の実施形態では、本出願は、例示的抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体ＵＭ０５－５ＬおよびｈＵＭ０５－３を提供する。
当業者ならば、上記のＣＤＲ配列を、１個または複数のアミノ酸の置換を含むように改変し、それによって、改善された生物活性、例えば、ヒト癌胎児性抗原細胞接着分子５に対する改善された結合親和性を得ることができるということは理解するはずである。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、抗体バリアントライブラリー（例えば、ＦａｂまたはＦｃＦｖバリアント）を生成および発現させ、次いで、ＣＥＡＣＡＭ５との親和性を有する抗体をスクリーニングすることができる。別の例では、コンピュータソフトウェアを使用して、抗体のＣＥＡＣＡＭ５への結合をシミュレートし、結合境界面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定できる。これらの残基の置換は、結合親和性の低下を防ぐために避けられる場合があり、またはこれらの残基を、より強力な結合を形成するための置換のための標的とすることができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ配列中の少なくとも１つ（またはすべて）の置換は、保存的置換である。
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、１つまたはいくつかのＣＤＲ配列を含み、これらのＣＤＲ配列は、配列番号１～６と比較して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有し、同時に、その親抗体と比較して、ＣＥＡＣＡＭ５に対して同様の、またはさらにより高い結合親和性を保持する。親抗体は、実質的に同一の配列を有するが、その対応するＣＤＲ配列は、配列番号１～６に列挙される配列と比較して、１００％の配列同一性を有する。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体または抗原結合性断片は、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合でき、≦１０－７Ｍの結合親和性（ＫＤ）を有し、これは、表面プラズモン共鳴によって測定できる。結合親和性値は、ＫＤ値によって表すことができ、これは、抗原の抗原結合性分子への結合が平衡に達したときの結合速度に対する解離速度の比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）の算出によって得られる。抗原結合親和性（例えば、ＫＤ）は、当技術分野で公知の適した方法、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器の使用を含むプラズモン共鳴結合法によっておおよそ決定できる。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体または抗原結合性断片は、ＣＥＡＣＡＭ５に、１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのＥＣ５０（すなわち、半結合濃度）で結合する。抗体または抗原結合性断片のＣＥＡＣＡＭ５への結合は、当技術分野で公知の方法、例えば、サンドイッチ法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳまたは他の結合アッセイによって決定できる。例示的一例では、試験されるべき抗体（すなわち、一次抗体）が、固定されたＣＥＡＣＡＭ５またはＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞に結合され、次いで、結合されていない抗体が洗浄除去され、一次抗体に結合できる標識された二次抗体が導入され、その結果、結合された二次抗体が検出される。固定された癌胎児性抗原細胞接着分子５が使用される場合には、検出はマイクロプレートリーダーで実施でき、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞が使用される場合には、検出のためにＦＡＣＳ分析を使用できる。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体または抗原結合性断片は、ＣＥＡＣＡＭ５に１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬ（ＦＡＣＳ分析によって決定された）のＥＣ５０（すなわち、５０％の有効濃度）で結合する。
抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５に対して特異的である。ある特定の実施形態では、抗体は、任意選択で、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８に結合せず、ＣＥＡＣＡＭ６にＣＥＡＣＡＭ５のものよりも有意に低い結合親和性で結合する。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体は、免疫学的物質、例えば、腫瘍細胞、精製された腫瘍抗原、免疫賦活性因子をコードするものがトランスフェクトされた細胞および腫瘍ワクチンと組み合わせて使用できる。さらに、標準化学療法および放射線療法、標的ベースの小分子療法および他の新たに出現した免疫チェックポイントモジュレーター療法を含む併用療法に、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体およびその抗原結合性断片を含めることができる。一部の実施形態では、抗体およびその抗原結合性断片を、抗体－薬物コンジュゲート、二重特異性または多価抗体の基本分子として使用できる。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体およびその抗原結合性断片は、ラクダ化単一鎖ドメイン抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディ、ナノボディ、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。
一部の実施形態では、本出願において記載される抗体は、免疫グロブリン定常領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１－ＣＨ２またはＣＨ１－ＣＨ３領域を含む。一部の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、所望の特性を得るために１つまたは複数の改変をさらに含み得る。例えば、定常領域は、１つまたはいくつかのエフェクター機能を低減または排除するために、ＦｃＲｎ受容体結合を増強するために、または１個もしくは数個のシステイン残基を導入するために改変され得る。
一部の実施形態では、抗体およびその抗原結合性断片は、コンジュゲートをさらに含む。本出願の抗体またはその抗原結合性断片をさまざまなコンジュゲートに連結できるということが考えられる（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＪＭ ＣｒｕｓｅおよびＲＥ Ｌｅｗｉｓ， Ｊｒ．（編）、Ｃａｒｇｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９年）を参照）。これらのコンジュゲートを、他の手段、例えば、共有結合、親和性結合、包理、配位結合、複合体形成、結合、混合または付加によって抗体または抗原結合性断片に連結できる。一部の実施形態では、本出願において開示される抗体および抗原結合性断片を、エピトープ結合部分以外の特定の部位を含有するように操作でき、これらの部位を使用して、１つまたはいくつかのコンジュゲートに結合できる。例えば、このような部位は、コンジュゲートへの共有結合を促進するために１個または数個の反応性アミノ酸残基、例えば、システイン残基およびヒスチジン残基を含み得る。ある特定の実施形態では、抗体は、コンジュゲートに間接的に結合され得る、または別のコンジュゲートを介してコンジュゲートに結合され得る。例えば、抗体またはその抗原結合性断片は、ビオチンに結合し、次いで、アビジンに連結されている第２のコンジュゲートに間接的に結合できる。コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態改変部分、精製部分または細胞傷害性部分であり得る。検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼまたはβ－Ｄガラクトシダーゼ）、安定な同位元素または放射性同位元素、発色団部分、ジゴキシン、ビオチン／アビジン、試験のためのＤＮＡ分子または金を挙げることができる。ある特定の実施形態では、コンジュゲートは、薬物動態改変部分、例えば、抗体の半減期を延長するのに役立つＰＥＧであり得る。他の適したポリマーとして、例えば、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマーなどが挙げられる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、精製された部分、例えば、磁性ビーズであり得る。「細胞傷害性部分」は、細胞にとって有害であるか、または細胞に損傷を与えることができるか、もしくは殺滅できる任意の薬剤であり得る。細胞傷害性部分の例として、限定されるものではないが、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシ－アントラシン（ａｎｔｈｒａｃｉｎ）－ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－メルカプトグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシル、ダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、クロルメチン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス－ジクロロジアミン白金（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン抗生物質（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシンとして知られる）およびアドリアマイシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシンとして知られる）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアンピシリン（ＡＭＣ））および細胞分裂抑制薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
核酸分子および組換え法
本出願の抗体は、例えば、遺伝子工学組換え技術によって得られる当技術分野で公知の種々の方法によって調製できる。例えば、本出願の抗体またはその抗原結合性断片をコードするＤＮＡ分子を、化学合成またはＰＣＲ増幅によって得ることができる。得られたＤＮＡ分子を、発現ベクター中に挿入し、次いで、宿主細胞中にトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトされた宿主細胞を特定の条件下で培養し、本出願の抗体またはその抗原結合性断片を発現させる。
本出願の抗原結合性断片は、無傷の抗体分子を加水分解することによって得ることができる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４巻：１０７～１１７頁（１９９２年）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照）。さらに、これらの抗原結合性断片はまた、組換え宿主細胞によって直接産生され得る（Ｈｕｄｓｏｎ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１巻：５４８～５５７頁（１９９９年）、Ｌｉｔｔｌｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ、２１巻：３６４～３７０頁（２０００年）に概説されている）。例えば、Ｆａｂ’断片は、宿主細胞から直接得ることができ、Ｆａｂ’断片を、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成できる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３～１６７頁（１９９２年））。さらに、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片はまた、組換え宿主細胞培養培地から直接単離できる。当業者ならば、これらの抗原結合性断片を調製するための他の技術を十分に承知している。
一部の特定の実施形態では、本出願において提供される抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその抗原結合性断片の調製方法は、以下のステップ：
１）材料として癌胎児性抗原細胞接着分子５を過剰発現するＣＨＯ細胞株を用いて免疫処置されたＢａｌｂ／ｃマウスを使用して、脾臓細胞を抽出し、マウス骨髄腫細胞株ＳＰ２／０－ＡＧ１４と融合して、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその抗原結合性断片を発現可能なハイブリドーマ細胞株を得るステップと、
２）ステップ１）において得られたハイブリドーマ細胞株において抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその抗原結合性断片の遺伝子をクローニングし、発現させるステップと、
３）発現ベクターを提供し、発現ベクターが、ステップ２）においてクローニングされた遺伝子および遺伝子に作動可能にライゲートされた発現制御配列を含むステップと、
４）ステップ３）に記載された発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
５）ステップ４）において得られた宿主細胞を培養するステップと、
６）モノクローナル抗体を得るために分離および精製するステップと
を含む。
別の態様では、本出願は、上記の調製方法において使用されるハイブリドーマ細胞株を提供する。
本出願において、特定の抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体を分泌するヒト－マウスハイブリドーマが調製され、抗体の重鎖および軽鎖配列（１００％ヒト遺伝子）が、分子生物学技術を使用することによってクローニングされ、抗ヒト癌胎児性抗原細胞接着分子５ヒトモノクローナル抗体が構築され、その抗体がＣＨＯ細胞によって発現され、産生される。既存の抗体と比較して、薬物としてのこれらの抗体は、より強力な結合能および特異性を有する。
別の態様では、本出願は、本出願の抗体もしくはその抗原結合性断片、またはその重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１４および／または配列番号１５で示されるようなヌクレオチドコード配列を含む。
別の態様では、本出願は、上記のような単離された核酸分子を含む、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。ある特定の実施形態では、本出願のベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージなどである。
ある特定の実施形態では、ベクターは、本出願の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変領域をコードする第１のヌクレオチド配列および／または本出願の抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変領域をコードする第２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同一または異なるベクターで提供される。
別の態様では、本出願は、上記のような単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌまたはネコ細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。
別の態様では、上記のような宿主細胞を抗体またはその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で培養することおよび宿主細胞の培養物から抗体またはその抗原結合性断片を回収することを含む、本出願の抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法が提供される。
別の態様では、本出願はまた、抗体またはその抗原結合性断片を含む二重特異性または多重特異性分子を提供する。ある特定の実施形態では、二重特異性または多重特異性分子は、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合し、さらに１つまたはいくつかの他の標的に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、二重特異性または多重特異性分子は、第２の標的に対する第２の結合特異性を有する少なくとも１つの分子（例えば、第２の抗体）をさらに含む。
別の態様では、本出願はまた、抗体またはその抗原結合性断片と、抗体またはその抗原結合性断片にコンジュゲートされた治療薬とを含む免疫複合体を提供する。ある特定の実施形態では、治療薬は、細胞傷害性薬剤から選択される。ある特定の実施形態では、治療薬は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシン－キナーゼ阻害剤、放射性核種剤およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、免疫複合体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
当技術分野で周知の遺伝子工学技術を使用して、本出願において記載される抗体およびその抗原結合性断片のアミノ酸配列を、対応するＤＮＡコード配列に変換できる。遺伝暗号の縮重のために、変換によって得られたＤＮＡ配列は、完全に一致しない場合があるが、コードされるタンパク質配列は変更されていないままである。
当技術分野で周知の組換え技術を使用して、抗体およびその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターをクローニング（ＤＮＡの増幅）または遺伝子発現のために宿主細胞中に導入することができる。別の実施形態では、抗体およびその抗原結合性断片は、当技術分野で公知の相同組換え法によって調製できる。さまざまなベクターが利用可能である。ベクター成分は普通、限定されるものではないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つまたはいくつかのマーカー遺伝子、エンハンサー配列、プロモーター（例えば：ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１ａ）および転写終結配列のうち２つ以上を含む。
一部の実施形態では、ベクター系として、哺乳動物、細菌、酵母系などが挙げられ、限定されるものではないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＬｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＬｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２を含むプラスミドなどのベクター、および実験室から得ることができるまたは市販されている他のベクターを含む。適したベクターとして、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。
抗体およびその抗原結合性断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞中に導入できる。本出願においてベクターにおいてＤＮＡをクローニングする、または発現させるのに適した宿主細胞は、原核細胞、酵母または上記の高等真核細胞である。本出願において使用するのに適した原核細胞として、真正細菌、例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、腸内細菌科（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属の菌種、エルウィニア属の菌種、クレブシエラ属の菌種、プロテウス属の菌種、サルモネラ属の菌種、例えば、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属の菌種、例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および赤痢菌属の菌種およびバチルス属の菌種、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属の菌種、例えば、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびストレプトマイセス属が挙げられる。
原核細胞に加えて、真核細胞の微生物、例えば、糸状菌または酵母も、抗体をコードするベクターをクローニングする、または発現させるための宿主細胞として使用できる。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはパン酵母は、最もよく使用される低級真核細胞宿主微生物である。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス属宿主、例えば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロミセス・ブルガリクスス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロミセス・ウェイチー（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｗｅｉｃｈｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロミセス・テルモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）およびクルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＥＰ４０２２２６）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）、カンジダ属、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）（ＥＰ２４４２３４）、アカパンカビ属、シュワン酵母、例えば、シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）および糸状菌、例えば、アカパンカビ属、アオカビ属、カーブラリア属およびアスペルギルス属、例えば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などの多数の他の属、種および株が、本出願においてより一般的に使用され、適用可能である。
本出願において提供されるグリコシル化抗体またはその抗原結合性断片を発現するのに適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞における例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。さまざまなバキュロウイルス株およびそのバリアントならびに対応する許容昆虫宿主細胞が、以下：ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）（カイコ）などの宿主から発見されている。オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスおよびカイコ核多角体病ウイルスのＢｍ－５バリアントなど、トランスフェクションに使用されるさまざまなウイルス株は、公的に入手可能である。これらのウイルスは、本出願において使用できる、特に、ヨトウガ細胞にトランスフェクトするために使用できる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用できる。
しかし、最も興味深いものは、脊髄細胞であり、脊髄細胞の培養（組織培養）は、日常的な操作となっている。利用可能な哺乳動物宿主細胞の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株ＣＶ１（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胚性腎臓細胞株（２９３または懸濁培養された２９３細胞サブクローン、Ｇｒａｈａｍら）． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ３６巻：５９頁（１９７７年））、若年ハムスター腎臓細胞（Ｂ血液、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４２１６頁（１９８０年））、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ ＪＰ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２３巻：２４３～２５２頁（１９８０年））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３巻：４４～６８頁（１９８２年））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞およびヒト肝臓がん細胞株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。ある特定の好ましい実施形態では、宿主細胞は、２９３Ｆ細胞である。
宿主細胞に、抗体およびその抗原結合性断片を生成できる上記の発現またはクローニングベクターを導入し、従来の栄養培地で培養し、栄養培地は、プロモーター誘導および細胞の選択的形質転換または標的配列をコードする遺伝子の増幅にとって適しているように改変する。
抗体およびその抗原結合性断片を生成するために本出願において使用される宿主細胞は、当技術分野で周知のさまざまな培地で培養できる。培地は、任意の他の必要な添加物を当技術分野で公知の適当な濃度でさらに含有し得る。培地の条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために宿主細胞を選択するためにこれまでに使用された条件であり、当業者には周知である。
組換え技術を使用する場合には、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内に産生される場合も、培養培地中に直接分泌される場合もある。抗体が細胞内に産生される場合には、宿主細胞の粒子状の残渣または溶解した断片をまず、例えば、遠心分離または超音波によって除去する。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３～１６７頁（１９９２年）には、大腸菌の細胞膜周辺腔中に分泌された抗体を分離する方法が記載されている。簡潔に述べると、細胞ペーストを酢酸ウラニル（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびＰＭＳＦの存在下で３０分より長く融解する。遠心分離を実施して、細胞片を除去する。抗体が培養培地中に分泌される場合には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＩａｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットが普通、発現系の上清を濃縮するために最初に使用される。前記のステップのいずれにおいても、プロテアーゼ阻害剤、例えば、タンパク質分解を阻害するためのＰＭＳＦおよび偶発的な汚染物質の増殖を妨げるための抗生物質が添加される場合がある。
細胞から産生される抗体を、精製法、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ－セルロースイオン交換クロマトグラフィーカラム、硫酸アンモニウム沈殿、塩析およびアフィニティークロマトグラフィーによって精製でき、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。抗体の種類および抗体中の任意の免疫グロブリンＦｃドメインの存在によって、プロテインＡが親和性リガンドとして適しているかが決定される。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製できる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ６２巻：１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソフォームおよびヒトγ３に適している（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ． ５巻：１５６７ １５７５（１９８６年））。アガロースは、最も一般的に使用される親和性リガンド付着マトリックスであるが、他のマトリックスも使用できる。機械的に安定な物質、例えば、制御細孔ガラスまたはポリスチレンは、アガロースと比較して、より速い流速およびより短い処理時間を達成できる。抗体がＣＨ３ドメインを含有する場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ． Ｔ． Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ． Ｊ．）を用いて精製できる。取得する必要がある抗体に従って、イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿法、逆相ＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂に基づくヘパリンセファロースクロマトグラフィー（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトグラフィーフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術を決定することもできる。
任意の予備的精製ステップの後、目的の抗体および不純物を含有する混合物を、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩濃度）で、約２．５～４．５のｐＨを有する溶出バッファーを使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって処置できる。
医薬組成物および治療的使用
別の態様では、本出願は、本出願の抗体もしくはその抗原結合性断片、本出願の二重特異性もしくは多重特異性分子または本出願の免疫複合体と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態では、医薬組成物はまた、さらなる薬学的に活性な薬剤を含み得る。
ある特定の実施形態では、さらなる薬学的に活性な薬剤は、抗腫瘍活性を有する薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスである。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体およびさらなる薬学的に活性な薬剤が、別個の成分として、または同一組成物の成分として提供される。本出願の抗体またはその抗原結合性断片およびさらなる薬学的に活性な薬剤は、同時に、別個にまたは逐次投与できる。
本出願は、抗体および１種または数種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
本出願において開示される医薬組成物において使用される薬学的に許容される担体として、例えば、薬学的に許容される液体、ゲルまたは固体担体、水相培地、非水相培地、抗菌物質、等張性物質、バッファー、抗酸化物質、麻酔、懸濁剤／分散剤、組込み剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質、当技術分野で公知の他の成分または上記のものの任意の組合せを挙げることができる。
適した成分として、例えば、抗酸化物質、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、防腐剤、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または安定剤、例えば、糖およびシクロデキストリンを挙げることができる。適した抗酸化物質として、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルを挙げることができる。１種または数種の抗酸化物質、例えば、メチオニンが、本出願において開示される抗体を含有する組成物中に存在する場合には、抗体の酸化が低減され得る。酸化の低減は、結合親和性の低下を防ぐまたは低減し、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を延長することができる。
さらに、薬学的に許容される担体として、例えば、水性培地、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル溶液注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液またはグルコースおよび乳酸リンゲル注射液、非水性培地、例えば、植物由来硬化油、綿実油、コーン油、ゴマ油またはピーナッツ油、細菌または真菌阻害濃度の抗菌物質、等張剤、例えば、塩化ナトリウムまたはグルコース、バッファー、例えば、リン酸またはクエン酸バッファー、抗酸化物質、例えば、重硫酸ナトリウム、局所麻酔薬、例えば、塩酸プロカイン、懸濁助剤および分散剤、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ－８０）、組込み試薬、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）四酢酸）、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げることができる。複数回用量容器中の医薬組成物に、担体として抗菌剤を添加でき、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀調製物、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルパラベン、メルチオレート、塩化ベンズアルコニウムおよびトリエチルベンゾニウムクロリドが挙げられる。適した賦形剤として、例えば、水、塩、グルコース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。適した非毒性補助物質として、例えば、乳化剤、ｐＨバッファー、安定剤、可溶化剤または酢酸ナトリウム、ラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエートまたはシクロデキストリンを挙げることができる。
医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤または散剤であり得る。経口調製物は、標準担体、例えば、医薬品等級マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射用組成物として製剤化される。注射用医薬組成物は、任意の従来形態、例えば、液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは液体溶液、懸濁液もしくはエマルジョンを生成するのに適した任意の固体形態で調製できる。注射調製物は、現在使用されている滅菌および／または発熱物質不含溶液、使用前に溶媒と組み合わされる滅菌乾燥溶媒（ｓｏｌｖｅｎｄ）、例えば、皮下錠剤を含む凍結乾燥粉末、注射用に準備された滅菌懸濁液、使用前に媒体と組み合わされる滅菌乾燥不溶性製品ならびに滅菌および／または発熱物質不含エマルジョンを含み得る。溶媒は、水相または非水相であり得る。
一部の実施形態では、単位用量注射調製物は、アンプル、チューブまたはニードルを備えたシリンジにパッケージングされる。注射投与のためのすべての調製物が無菌であり、発熱物質不含であるべきであるということは当技術分野で公知である。
一部の実施形態では、滅菌凍結乾燥散剤は、本出願において開示される抗体またはその抗原結合性断片を適した溶媒中に溶解することによって調製できる。溶媒は、散剤もしくは散剤から調製された再構成された溶液の安定性を改善できる、または散剤もしくは再構成された溶液を改善できるある種の他の薬理学的成分を含有し得る。適した賦形剤として、限定されるものではないが、水、グルコース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセロール、グルコース、ブラウンシュガーまたは他の適用可能な物質が挙げられる。溶媒は、バッファー、例えば、クエン酸バッファー、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムバッファーまたは当業者に公知の他のバッファーを含み得る。一実施形態では、バッファーのｐＨは、中性である。溶液は、当技術分野で公知の標準条件下でその後の濾過および滅菌法に付され、次いで、凍結乾燥されて、理想の製剤が得られる。一実施形態では、得られた溶媒は、小バイアルにわけられ、凍結乾燥される。各バイアルは、抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体またはその抗原結合性断片またはそれらの組合せの単回用量または複数回用量を含有し得る。各バイアル中の充填量は、正確なサンプリングおよび正確な投与を確実にするために、各用量または複数回用量のために必要なものよりもわずかに高い場合がある（例えば、１０％過剰用量）。凍結乾燥散剤は、適当な条件下で、例えば、約４℃～室温の範囲において保存できる。
凍結乾燥散剤は、注射水を用いて再溶解されて、注射投与のための調製物が得られる。一実施形態では、凍結乾燥散剤は、滅菌発熱物質不含水または他の適した液体担体で再構成できる。その正確な量は、選択された療法によって決定され、経験値に基づいて決定され得る。
抗体誘導体化および免疫複合体
本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、誘導体化できる、例えば、別の分子（例えば、別のポリペプチドまたはタンパク質）に連結できる。一般に、抗体またはその抗原結合性断片の誘導体化（例えば、標識）は、ＣＥＡＣＡＭ５へのその結合に有害に影響を及ぼさない。したがって、本出願の抗体またはその抗原結合性断片はまた、このような誘導体化形態を含むように意図される。例えば、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、１つまたはいくつかの他の分子群、例えば、別の抗体（例えば、二重特異性抗体を形成するために）、検出試薬、医薬品試薬および／または抗体もしくはその抗原結合性断片の別の分子（例えば、アビジンまたはポリヒスチジンタグ）への結合を媒介可能なタンパク質もしくはポリペプチドに機能的に連結できる（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合連結または他の手段によって）。さらに、本出願の抗体またはその抗原結合性断片はまた、化学基、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルまたはエチルまたはグリコシルを用いて誘導体化できる。これらの基を使用して、抗体の生物学的特性を改善する、例えば血清半減期を増大することができる。
したがって、一態様では、本出願は、本出願において記載される抗体またはその抗原結合性断片および抗体またはその抗原結合性断片にコンジュゲートされた治療薬を含む免疫複合体を提供する。
ある特定の実施形態では、治療薬は、細胞傷害性薬剤から選択される。
ある特定の実施形態では、治療薬は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤およびそれらの任意の組合せから選択される。
ある特定の実施形態では、免疫複合体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。
キットおよび検出使用
本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合でき、基本的にＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８タンパク質に結合せず、ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質に弱くのみ結合する。したがって、本出願の抗体またはその抗原結合性断片は、検出においてより高い特異性および正確性を有する。
したがって、別の態様では、本出願は、本出願の抗体またはその抗原結合性断片または本出願のコンジュゲートを含むキットを提供する。
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンを含む。
一部の実施形態では、キットは、抗体またはその抗原結合性断片を特異的に認識する第２の抗体をさらに含む。
一部の実施形態では、第２の抗体は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンをさらに含む。
一部の実施形態では、本出願のキットは、対応する検出可能な標識が検出されることを可能するための試薬をさらに含み得る。例えば、検出可能な標識が酵素である場合には、キットはまた、対応する酵素の発色基質、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼのｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳもしくはルミノール化合物またはアルカリホスファターゼのｐ－ニトロフェニルホスフェート（ｐ－ＮＰＰ）もしくはＡＭＰＰＤを含み得る。例えば、検出可能な標識が、化学発光試薬（例えば、アクリジンエステル化合物）である場合には、キットは、化学発光のための事前励起溶液および／または励起溶液をさらに含み得る。
別の態様では、本出願はまた、キットの製造における抗体またはその抗原結合性断片の使用を提供し、キットは、腫瘍がＣＥＡＣＡＭ５を標的とする抗腫瘍療法によって処置され得るかを決定するために使用される。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を保有する。
ある特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５である。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症（ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｓ）、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫（Ｔ ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ Ｂ－ｃｅｌｌ－ｒｉｃｈ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤ（ＥＢＶ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ＰＴＬＤ）ならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（ＥＢＶ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、形質芽球性リンパ腫（ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｉｃ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫（ｅｘｔｒａｎｏｄａｌ ＮＫ／Ｔ ｃｅｌｌ Ｌｙｍｐｈｏｍａ）、上咽頭がん（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）およびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫（ＨＨＶ８－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｉｍａｒｙ ｅｘｕｄａｔｉｖｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫からなる群から選択される。
本出願は、抗体またはその抗原結合性断片を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、生体サンプルにおけるＣＥＡＣＡＭ５の存在またはレベルを検出するために使用される。生体サンプルは、細胞または組織を含み得る。
一部の実施形態では、キットは、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、キットは、非標識抗体を含み、非標識抗体に結合可能な標識された二次抗体をさらに含む。キットは、使用のための説明書およびキット中で各成分を分離する包装紙をさらに含み得る。
一部の実施形態では、抗体はサンドイッチアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫クロマトグラフィーアッセイのための基質または機器に連結される。適した基質または機器は、例えば、マイクロプレートおよび試験紙であり得る。
キメラ抗原受容体
別の態様では、本出願はまた、抗体またはその抗原結合性断片の抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体の抗原結合性断片を含む。
ある特定の実施形態では、キメラ抗原受容体は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される。
別の態様では、本出願はまた、キメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子を提供する。
別の態様では、本出願はまた、単離された核酸分子を含むベクターを提供し、一部の実施形態では、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を調製するために使用される。
別の態様では、本出願はまた、単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）である。
検出方法および処置方法
多数の悪性腫瘍では、ＣＥＡＣＡＭ５の過剰発現を腫瘍バイオマーカーとして使用できる。したがって、患者の血液におけるＣＥＡＣＡＭ５の測定は、がんの予後および管理のために使用でき、ＣＥＡＣＡＭ５の標的化療法はまた、有望ながん処置方法になった。本出願の抗体（例えば、ＵＭ０５－５ＬおよびｈＵＭ０５－３）は、高親和性および高特異性でＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に結合でき、腫瘍増殖を阻害でき、腫瘍細胞を殺滅できるＡＤＣＣ活性を有する。
したがって、別の態様では、本出願はまた、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害し、および／または腫瘍細胞を殺滅する方法を提供し、これは、腫瘍細胞を、有効量の抗体もしくはその抗原結合性断片または二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体または医薬組成物またはキメラ抗原受容体または宿主細胞と接触させることを含む。
別の態様では、本出願はまた、細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５の発現レベルを低減する方法を提供し、これは、腫瘍細胞を、有効量の抗体もしくはその抗原結合性断片または二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体または医薬組成物またはキメラ抗原受容体または宿主細胞と接触させて、細胞表面上のＣＥＡＣＡＭ５の発現レベルを低減することを含み、細胞は、その表面にＣＥＡＣＡＭ５を発現する。
ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞である。
別の態様では、本出願はまた、対象（例えば、ヒト）において腫瘍を予防および／または処置する方法を提供し、方法は、それを必要とする対象に、有効量の抗体もしくはその抗原結合性断片または二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体または医薬組成物またはキメラ抗原受容体または宿主細胞を投与することを含む。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を含む。ある特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５は、腫瘍細胞の表面上に発現される。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫，Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
ある特定の実施形態では、方法は、抗腫瘍活性を有するさらなる薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスを投与することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、方法は、さらなる抗腫瘍療法、例えば、手術、化学療法、放射線療法、標的化療法、免疫療法、ホルモン療法、遺伝子療法または対症療法を施すことをさらに含む。
別の態様では、本出願はまた、対象（例えば、ヒト）における腫瘍の予防および／処置のための医薬の製造における、抗体もしくはその抗原結合性断片または二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体または医薬組成物またはキメラ抗原受容体または宿主細胞の使用を提供する。
ある特定の実施形態では、医薬は、さらなる薬学的に活性な薬剤をさらに含む。
ある特定の実施形態では、さらなる薬学的に活性な薬剤は、抗腫瘍活性を有する薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスである。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を含み、好ましくは、ＣＥＡＣＡＭ５は、腫瘍細胞の表面に発現される。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ－細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
別の態様では、本出願はまた、サンプル中のＣＥＡＣＡＭ５（例えば、ヒトＣＥＡＣＡＭ５）の存在または量を検出する方法を提供し、これは、以下のステップ：
（１）サンプルを抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
（２）抗体またはその抗原結合性断片およびＣＥＡＣＡＭ５を含む複合体の形成を検出するステップ、または複合体の量を検出するステップと
を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を含む。
ある特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５である。
別の態様では、本出願はまた、腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする抗腫瘍療法によって処置され得るかを決定する方法を提供し、これは、以下のステップ：
（１）腫瘍の細胞を含有するサンプルを、抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
（２）抗体またはその抗原結合性断片およびＣＥＡＣＡＭ５を含む複合体の形成を検出するステップと
を含む。
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を保有する。
ある特定の実施形態では、ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５である。
ある特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択される。
本出願はまた、本出願において記載される抗体の治療上有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む治療方法を提供する。
本出願において提供される抗体の治療上有効量は、当技術分野で公知のさまざまな因子、例えば、体重、年齢、過去の病歴、現在の処置、対象の健康状態および交差感染の可能性、アレルギー、過敏症および副作用ならびに投与経路および腫瘍の発達程度に応じて変わる。当業者（例えば、医師または獣医）ならば、これらまたは他の条件または必要に従って比例して量を低減または増大できる。
ある特定の実施形態では、本出願において提供される抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの間の治療上有効な用量で投与され得る。一部の実施形態では、抗体は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与される。一部の実施形態では、投与用量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の用量は、複数の間隔、例えば、１日１回、１日２回以上、月に２回以上、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、月に１回または２ヶ月以上に１回で投与され得る。ある特定の実施形態では、投与用量は、処置の過程につれて変わり得る。例えば、ある特定の実施形態では、最初の投与用量は、その後の投与用量よりも高いものであり得る。一部の実施形態では、投与用量は、処置の過程の間の投与に対する対象の応答に従って調整される。
投与レジメンは、最適応答（例えば、処置応答）を達成するように調整され得る。例えば、投与は、単回用量でまたは一定期間にわたる複数回の分割用量で実施され得る。
本出願において開示される抗体は、当技術分野で公知の方法、例えば、注射投与（例えば、皮下注射、腹膜内注射、静脈内点滴を含む静脈内注射、筋肉内注射または皮内注射）または非注射投与（例えば、経口投与、鼻腔投与、舌下投与、直腸投与または局所投与）によって投与され得る。
ある特定の実施形態では、抗体を、腫瘍およびがん、例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫を含む、その分子機構と関連する疾患の処置のために使用できる。
利用
本出願は、抗体を使用する方法をさらに提供する。
一部の実施形態では、本出願は、個体における抗体の機序と関連する状態または疾患を処置する方法であって、本明細書に記載される抗体の治療上有効量を投与することを含む方法を提供する。
本出願において開示される抗体は、単独で、または１種もしくは数種の他の治療手段または物質と組み合わせて投与できる。例えば、本出願において開示される抗体は、化学療法、放射線療法、がん処置手術（例えば、腫瘍切除）、抗ウイルス薬、１種または数種の制吐薬または化学療法誘導性合併症のための他の療法またはがんもしくはウイルスのための任意の他の治療物質と組み合わせて使用できる。一部のこのような実施形態では、本出願において開示される抗体が、１種または数種の治療物質と組み合わせて使用される場合、１種または数種の治療物質と同時に投与され得る。一部のこのような実施形態では、抗体は、同一医薬組成物の一部として同時に投与され得る。しかし、別の治療物質と「組み合わせて使用される」抗体は、治療物質と同時に、または同一組成物中で投与される必要はない。本出願における「組み合わせて使用される」の意味はまた、別の治療物質よりも前または後に投与される抗体も、抗体および第２の物質が異なる方法で投与される場合であっても、治療物質と「組み合わせて使用される」と考えられることを含む。可能であれば、本出願において開示される抗体と組み合わせて使用される他の治療物質は、他の治療物質の製品説明書を参照することによって投与され得る、または医師用添付文書集２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版； Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ； ＩＳＢＮ： １５６３６３４４５７； 第５７版（２００２年１１月））を参照、または当技術分野で公知の他の方法を参照。
一部の実施形態では、治療物質は、がんに対する免疫応答を誘導または増強する場合がある。例えば、腫瘍ワクチンを使用して、ある特定の腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導できる。サイトカイン療法を使用して、免疫系に対する腫瘍抗原の提示を増大できる。サイトカイン療法の例として、限定されるものではないが、インターフェロン、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、コロニー刺激因子、例えば、マクロファージＣＳＦ、顆粒球マクロファージＣＳＦおよび顆粒球ＣＳＦならびにインターロイキン、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１およびＩＬ－１２、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－βが挙げられる。免疫抑制標的を不活化する試薬も使用でき、例として、ＰＤ－１抗体、ＴＧＦ－β阻害剤、ＩＬ－１０阻害剤およびＦａｓリガンド阻害剤が挙げられる。試薬の別の群として、腫瘍またはがん細胞に対する免疫応答を活性化するもの、例えば、Ｔ細胞活性化を増大するもの（例えば、Ｔ細胞補助刺激シグナル伝達経路、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４－１ＢＢなどといった経路）ならびに樹状細胞機能および抗原提示を改善するものが挙げられる。
以下の実施例は、本出願をより良好に例示するように意図され、本出願の範囲を制限すると解釈されてはならない。以下の特定の組成物、材料および方法のすべては、全体でまたは一部で、本出願の範囲内にある。これらの特定の組成物、材料および方法は、本出願を制限するように意図されるものではなく、単に、本出願の範囲内の特定の実施形態を例示するのみである。当業者ならば、創造性を加えることなく、本出願の範囲から逸脱することなく同等の組成物、材料および方法を開発できる。本出願の方法に行われる種々の変更は、依然として本出願の範囲内であり得るということは理解されるべきである。本発明者らは、このような変更を本出願の範囲内に含むことを意図する。
配列情報
本出願中に含まれるいくつかの配列の情報が、以下の表１に示されている。
Figure 2022536114000001
Figure 2022536114000002
有益な効果
本出願のモノクローナル抗体（例えば、ＵＭ０５－５Ｌ、ｈＵＭ０５－３抗体）は、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質またはＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を発現する細胞に高い特異性および選択性で結合でき、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８タンパク質に実質的に結合せず、ＣＥＡＣＡＭ６タンパク質と弱くのみ結合する。同時に、抗体ＵＭ０５－５Ｌはまた、ＡＤＣＣ活性を有する。抗体ＵＭ０５－５Ｌに基づいて構築されたＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲは、ヒトＴ細胞の表面に発現されることができ、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を認識し、サイトカインを分泌でき、強力な腫瘍阻害効果を有する。したがって、本出願のモノクローナル抗体（例えば、ＵＭ０５－５Ｌ、ｈＵＭ０５－３抗体）は、高い臨床適用価値を有する。
従来のＣＨＯ細胞と比較した、本出願において構築されたＣＨＯ細胞株におけるＣＥＡＣＡＭ５の発現レベルを示した図である。本出願において構築されたＣＨＯ細胞株におけるＣＥＡＣＡＭ５の発現レベルは、最大９０４倍であった。 ＥＬＩＳＡ実験における抗体ＵＭ０５－５ＬとＣＥＡＣＡＭ５タンパク質との間の結合結果を示した図である。 抗体ＵＭ０５－５ＬのＬＯＶＯ細胞への結合プロファイルを示した図である。 図４ａおよび図４ｂはレポーター細胞株における抗体ＵＭ０５－５ＬのＡＤＣＣ活性を示した図である。図４ａは、陽性対照（アービタックス抗体）および陰性対照のＡＤＣＣ活性を示し、図４ｂは、ＵＭ０５－５ＬのＡＤＣＣ活性を示した。 図５ａおよび図５ｂはフローサイトメトリーの結果を示した図である。図５ａは、対照Ｔ細胞（モックＴ）の発現効率を示し、図５ｂは、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲの発現効率を示した。 ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍細胞と混合された後の、サイトカインＩＦＮγ（左）およびＩＬ－２（右）の分泌を示した図である。 腫瘍細胞ＫＡＴＯ３に対するＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅結果を示した図である。 腫瘍細胞ＬＳ１７４Ｔによって刺激されたＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の拡大増殖を示した図である。 マウスにおけるＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を示した図である。 ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞を注射されたマウスにおけるＩＦＮγの放出を示した図である。 ヒト化抗体ｈＵＭ０５－３のＬＳ１７４Ｔ細胞への結合プロファイルを示した図である。 抗体ＵＭ０５－５Ｌ、ＵＭ０５－５Ｌ Ｃ４７Ｗ、ｈＵＭ０５－３およびｈＵＭ０５－３ Ｗ４７Ｃの、ＬＳ１７４Ｔ細胞への結合プロファイルを示した図である。
本発明を実施するための具体的なモデル
本出願をここで、本出願を例示することを意図した（本出願を制限しない）以下の実施例を参照して説明する。
特に断りのない限り、本出願において使用される分子生物学実験法およびイムノアッセイ法は、基本的にはＪ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年およびＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｏｍｐｉｌｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、１９９５年を参照し、制限酵素は、製品製造業者によって推奨された条件に従って使用した。実施例において具体的な条件が示されなかった場合、従来の条件または製造業者によって推奨される条件に従って実施されるべきである。製造業者の指示なく使用された試薬または機器は、すべて商業的に購入された従来製品であった。当業者ならば、実施例は、本出願を例によって説明するのであって、本出願によって特許請求される保護の範囲を制限することを意図するものではないということは承知している。
実施例１
ヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に対するモノクローナル抗体の獲得
本出願では、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質を過剰発現するＣＨＯ細胞株を構築した。簡潔に述べると、ＣＥＡＣＡＭ５プラスミド（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｙｉｑｉａｏ Ｓｈｅｎｚｈｏｕ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、ＨＧ１１０７７－ＵＴ）を、ＣＨＯ細胞株（ＡＴＣＣ）中にトランスフェクトし、発現させた。プラスミドは、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）に対して耐性であり、その結果、このプラスミドを安定にトランスフェクトされた細胞は、ハイグロマイシンを含有する培地において安定に継代され得た。細胞を選びとり、ＣＥＡＣＡＭ５の発現を測定した。図１に示されるように、ＣＨＯ－ＣＥＡＣＡＭ５細胞は、ＦＡＣＳによって検出されたように９０４倍増大したＣＥＡＣＡＭ５発現を示した。
ＣＨＯ－ＣＥＡＣＡＭ５細胞および腫瘍患者から精製されたＣＥＡＣＡＭ５タンパク質（Ｌ２Ｃ０１００１）を使用して、５～８週齢の６個体のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｌａｃｋ）を、表２における免疫処置スケジュールに従って免疫処置した。
Figure 2022536114000003
免疫処置後２日目に、免疫処置されたマウスの脾臓細胞を採取し、ＳＰ２／０－ＡＧ１４細胞（ＡＴＣＣ）と融合して、ハイブリドーマ細胞を調製し、適当な量の融合細胞を９６ウェルプレートにプレーティングした。融合の約１０日後、各ウェルの上清を採取し、ハイブリドーマ細胞によって分泌されたマウス抗体のヒトＣＥＡＣＡＭ５への結合活性を、ＥＬＩＳＡによって検出した。
さらに、強力な陽性ＥＬＩＳＡシグナルによって検出されたウェルから上清を採取し、ＬＯＶＯ細胞（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）へのその結合活性をフローサイトメトリーによって検出し、ＬＯＶＯ細胞への高い結合活性を有するハイブリドーマ細胞を得た。これらの細胞をサブクローニングして、モノクローナル細胞を得た。表３に、いくつかのハイブリドーマ細胞の検出データを示した。
Figure 2022536114000004
より良好な結合活性を有するハイブリドーマ細胞３－８Ｃ１０を、シーケンシングのために選択した。シーケンシング後、抗体を得、ＵＭ０５－５と名付け、ＵＭ０５－５抗体のＣＤＲ配列をＫａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９９１年）、６４７～６６９頁）を使用して決定し、表４に示した。
Figure 2022536114000005
実施例２
ヒト－マウスキメラ抗体の調製
表４中のＵＭ０５－５の配列に従って、ヒト－マウスキメラ抗体を設計し、発現させ、ＵＭ０５－５Ｌと名付けた。簡潔に述べると、マウス抗体ＶＨおよびＶＬをコードする配列を、それぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（そのアミノ酸配列は、配列番号９で示されており、そのヌクレオチド配列は、配列番号１０で示されていた）およびκ鎖定常領域配列（そのアミノ酸配列は、配列番号１１で示されており、そのヌクレオチド配列は、配列番号１２で示されていた）をコードする配列に連結して、ヒト－マウスキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌを得た。
抗体の重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ哺乳動物細胞発現ベクターｐｃＤＮＡ３．４中にクローニングした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２：１のモル比で用いて、重鎖発現ベクターおよび軽鎖発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、３７℃および５％二酸化炭素で７日間培養した。培養培地上清を収集し、上清中の抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製後、抗体をＰＢＳ溶液を用いて透析し、凍結乾燥し、濃縮し、－２０℃で保存した。
実施例３
抗体のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質への結合
９６ウェル高親和性プレートを、１μｇ／ｍＬの濃度を有するヒトＣＥＡＣＡＭ５タンパク質溶液１００μＬ／ウェルを用い、４℃でコーティングし、一晩振盪した。翌日、まず３００μＬのＰＢＳＴ（Ｔｗｅｅｎ２０：０．５‰）を用いて３回洗浄し、次いで、１００μＬ／ウェルの５％ ＢＳＡ／ＰＢＳを用いて１時間ブロッキングし、室温で振盪した。３００μＬのＰＢＳＴを用いて洗浄を３回実施した。抗体サンプルの一連の希釈溶液をＰＢＳを用いて調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で１時間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴを用いて洗浄を３回実施した。二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ溶液を調製し、１００μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、室温で３０分間振盪した。３００μＬのＰＢＳＴを用いて洗浄を４回実施した。１００μＬ／ウェルのＴＭＢを添加して、２０分間発色を実施した。１００μＬ／ウェルの０．６Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して、発色を停止し、ＯＤ４５０ｎｍを検出した。検出後、結果を図２に示した。キメラ抗体ＵＭ０５－５ＬのＣＥＡＣＡＭ５タンパク質への結合のＥＣ５０は、１０５．３ｎｇ／ｍＬであった。
実施例４
ＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞への抗体の結合性
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、天然にヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現するＬＯＶＯ腫瘍細胞への、または種々のＣＥＡＣＡＭファミリーメンバーを過剰発現する細胞への抗体の結合を検出した。簡潔に述べると、細胞をまず収集し、ＰＢＳで洗浄し、カウントし、希釈して、２×１０６個／ｍｌの細胞懸濁液を得、１００μｌの細胞懸濁液に１０μｌの抗体溶液を添加し、４℃で３０分間、暗所でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、対応する蛍光標識された二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、４℃で３０分間、暗所でインキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、４００μｌのＦＡＣＳバッファーに懸濁し、細胞への抗体の結合プロファイルをＦＡＣＳによって検出した。
３μｇ／ｍＬの濃度のキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌおよび対照抗体ＵＭ０５－８（抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体、本発明者らの実験室においてハイブリドーマ法によって調製された）の上清の種々の細胞への結合プロファイルを検出し、ここで、ＳＷ６２０－ＣＥＡＣＡＭ１はＣＥＡＣＡＭ１を過剰発現する細胞であり、ＳＷ６２０－ＣＥＡＣＡＭ３はＣＥＡＣＡＭ３を過剰発現する細胞であり、ＣＨＯ－ＣＥＡＣＡＭ６はＣＥＡＣＡＭ６を過剰発現する細胞であり、ＣＨＯ－ＣＥＡＣＡＭ７はＣＥＡＣＡＭ７を過剰発現する細胞であり、ＣＨＯ－ＣＥＡＣＡＭ８はＣＥＡＣＡＭ８を過剰発現する細胞であった。ＬＯＶＯ細胞（ＣＥＡＣＥＭ５を発現した）への抗体の結合値（すなわち、ＦＡＣＳの検出値）を１００％として正規化し、種々の細胞（種々のＣＥＡＣＡＭタンパク質を発現した）への抗体の相対結合活性を算出し、結果を表５に示した。
Figure 2022536114000006
表５から、キメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌは、特に顕著な選択性を有しており、ＣＥＡＣＡＭ５に高親和性で結合したが、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８には明らかに結合せず、ＣＥＡＣＡＭ６に弱くのみ結合したことがわかる。通常の抗体（例えば、対照抗体ＵＭ０５－８）はＣＥＡＣＡＭ５に結合できたが、同時に、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７およびＣＥＡＣＡＭ８により高いレベルで結合し、選択性を示さなかった。
さらに、本発明者らは、ＦＡＣＳを使用して、天然にヒトＣＥＡＣＡＭ５を発現したＬＯＶＯ腫瘍細胞へのキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌ結合のＥＣ５０を検出した。結果は図３に示され、ＬＯＶＯ細胞へのキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌ結合のＥＣ５０は、３１７３ｎｇ／ｍＬであった。上記の結果に基づいて、キメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌは、ＣＥＡＣＡＭ５に対して優れた結合親和性、特異性および選択性を有していた。
実施例５
抗体のＡＤＣＣ活性
標的細胞としてＬＯＶＯ細胞を使用して、ＬＯＶＯ細胞を２０，０００個細胞／ウェルの密度で９６ウェル細胞培養プレートでインキュベートし、３７℃および５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。２日目に、抗体ＵＭ０５－５Ｌおよび陽性対照抗体アービタックスを培養培地で２０μｇ／ｍｌで調製し、３回まで希釈して、８種の濃度を得た。ＬＯＶＯ細胞の上清培地をピペッティングによって除去し、指定の濃度に希釈した抗体（陽性対照抗体アービタックス、キメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌまたは陰性対照の無関係の抗体）を、３０μＬ／ウェルでＬＯＶＯ細胞に添加した。その後、エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ／ＡＤＣ（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｎｕｏａｉｘｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．）を、１２０，０００個細胞／３０μＬ／ウェルでＬＯＶＯ細胞ウェル中にプレーティングし、３７℃および５％ ＣＯ２で１６～２０時間インキュベートした。インキュベーション後、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログＥ２６２０）を使用して、エフェクター細胞におけるルシフェラーゼの発現レベルを検出した。ルシフェラーゼレベルは、エフェクター細胞のＡＤＣＣ活性化の程度を表した。図４ａは、陽性対照アービタックス抗体および陰性対照のＡＤＣＣ活性を示し、図４ｂは、ＵＭ０５－５ＬのＡＤＣＣ活性を示した。上記の結果に基づいて、ＵＭ０５－５Ｌが強力なＡＤＣＣ活性を有し、０．８５μｇ／ｍＬのＥＣ５０を有したことがわかる。
実施例６
ＣＥＡＣＡＭ５を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の構築
第２および第３世代のＣＡＲ－Ｔ構造に基づいて、本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ認識抗体として抗ＣＥＡＣＡＭ５単鎖抗体を使用し、１つまたはいくつかの共刺激成分、例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０および他のものを使用して、種々のＣＥＡ－ＣＡＲ構造の設計を実施し、対応するレンチウイルスプラスミドを構築して、細胞に感染でき、対応するＣＡＲを発現できるレンチウイルスを作製した。レンチウイルスを使用して、腫瘍患者の末梢血から単離されたＴ細胞に感染させ、細胞膜表面に対応するＣＡＲ受容体を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞を生成できた。この種のＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を効率的に認識し、殺滅できた。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験の両方で、この細胞性免疫療法は、極めて良好な安全性および有効性を示した。
配列番号１３で示されるような単鎖抗体ＵＭ０５－５Ｌ ｓｃＦｖ（ＶＨ－Ｇ４Ｓ３－ＶＬの順の）を、配列ＣＤ８α－ＣＤ１３７－ＣＤ３ζ－ｐ２Ａ－ｔＥＧＦＲにライゲートして、キメラ抗原受容体ＣＡＲを構築し、次いで、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列をレンチウイルスベクター（Ｊｉｋｅ Ｇｅｎｅ、ＧＶ４０１）にクローニングし、ベクターをＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲと名付けた。発現カセットは、ＥＦ１ａプロモーター－ＣＡＲ－２Ａ－ｔＥＧＦＲ－ＷＰＲＥであった。
Ｕ０５－５Ｌ－ＣＡＲレンチウイルスベクターおよびパッケージングプラスミドを、２９３Ｔ細胞に１６時間一過性にトランスフェクトし、培地を交換し、培養を２４～４８時間継続した。上清（レンチウイルスを含有する）を収集し、－８０℃で保存した。
健常な人に由来するＰＢＭＣ細胞を、ＣＤ３／２８抗体を用いて２４時間活性化し、レンチウイルスおよびＴ細胞を、ＭＯＩ＝３：１に従って混合し、９６時間培養し、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲの発現をＰＥ蛍光標識されたセツキシマブを用いて検出した。結果は、図５に示された。対照（図５ａ）と比較して、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ（図５ｂ）は、ヒトＴ細胞の表面で十分に発現できた。
実施例７
ＣＥＡＣＡＭ５を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の機能的評価
１．サイトカイン放出の検出
ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＥＡＣＡＭ５発現性腫瘍細胞（例えば、ＫＡＴＯ３およびＬＳ１７４Ｔ）を混合し、培地対照（すなわち、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞のみを使用した）およびＣＥＡＣＡＭ５陰性細胞対照（すなわち、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＥＡＣＡＭ５を発現しない細胞、例えば、ＲＫＯ細胞を使用した）を設定し、２種類の細胞を１：１の比で混合し、１６時間培養し、上清中の放出されたＩＦＮγおよびＩＬ２を検出した。結果を図６に示した。ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔは、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞株を認識でき、サイトカインＩＦＮγおよびＩＬ－２の放出を誘導できた。
２．腫瘍細胞の殺滅の検出
ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－ＴおよびＣＥＡＣＡＭ５発現性腫瘍細胞（例えば、ＫＡＴＯ３）を混合し、９６ウェル培養プレートにおいて、指定のＥ：Ｔ比（３０：１、１０：１、３：１、１：１、０．３：１）で培養した。Ｐｒｏｍｅｇａ ＬＤＨ検出キットを使用して、培養上清における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出記録データを検出した。腫瘍細胞の殺滅の算出結果を、図７に示した。図から、ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔが、腫瘍細胞を効率的に用量依存的に殺滅したことがわかる。
３．腫瘍細胞によって刺激された増殖実験
ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＣＥＡＣＡＭ５発現性腫瘍細胞（例えば、ＬＳ１７４Ｔ）を、Ｅ：Ｔ＝１：１に従って混合し、７２時間培養し（ＩＬ２補給を伴わない）、細胞カウンティングによってその増殖を検出した。結果を、図８に示した。ＵＭ０５－５Ｌ－ＣＡＲ－Ｔは、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞によって刺激された場合に、効率的に増殖できた。
実施例８
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍モデルのｉｎ ｖｉｖｏ薬学的有効性実験
ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＬ－１８７）を、ＮＳＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）中に１×１０７個／マウスで皮下に播種した。腫瘍体積が２００～４００ｍｍ３に達したときに、ＰＢＳ対照、未改変Ｔ細胞対照（モックＴ）またはＵＭ０５－５Ｌ ＣＡＲ－Ｔを、それぞれ、１００μｌの用量、１×１０７個細胞および１×１０７個ｔＥＧＦＲ＋細胞で尾静脈を介して投与した。腫瘍体積変化を記録し、末梢血におけるＩＦＮγ放出を分析した。結果は、図９および図１０に示された。ＵＭ０５－５Ｌは、マウスにおいてＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を認識し、多量のＩＦＮγを放出し、強力な腫瘍抑制効果をもたらした。
実施例９
ヒト化抗体の調製
ＩＭＧＴデータベース中のヒト抗体配列を使用して、ＵＭ０５－５Ｌ抗体をヒト化し、ヒト化抗体を得、これをｈＵＭ０５－３と名付けた。ｈＵＭ０５－３の特定の配列が表６に示されている。抗体調製を実施例２に記載されるとおりに実施した。簡潔に述べると、配列番号１６および配列番号１７をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ合成し、発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させた。培養後、上清を収集し、上清中の抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。精製後、抗体をＰＢＳ溶液を用いて透析し、凍結乾燥し、濃縮し、－２０℃で保存した。
Figure 2022536114000007
実施例１０
ヒト化抗体の結合能
ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＣＥＡＣＡＭ５の高発現を有する腫瘍細胞）を、１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＬＳ１７４Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥトリプシンを用いて消化した後、細胞を遠心分離し、２％ ＢＳＡを含有するＤＰＢＳ溶液（ＦＡＣＳバッファー、４℃）に再懸濁し、次いで、細胞を５×１０５個／１００μＬ／ウェルでＵ型底９６ウェルプレートに添加し、抗体の一連の希釈溶液をＵ型底９６ウェルプレートに添加し、混合物を４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を遠心分離し、得られた上清を廃棄し、各ウェルに１００μｌの二次抗体（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＡＰＣ）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファーを用いて１回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、蛍光シグナル値をＢＤ Ｃ６ ｐｌｕｓで読み取った。
実験結果は図１１に示されている。結果は、ヒト化抗体ｈＵＭ０５－３は、ＬＳ１７４Ｔ細胞に用量依存的に結合できたということを示した。
実施例１１
抗体の突然変異
ヒト－マウスキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌ ＶＨの４７番目のアミノ酸（Ｃｙｓ）を、Ｔｒｐに突然変異させ、突然変異された抗体をＵＭ０５－５Ｌ Ｃ４７Ｗと名付け、ヒト化抗体ｈＵＭ０５－３ ＶＨの ４７番目のアミノ酸（Ｔｒｐ）をＣｙｓに突然変異させ、突然変異された抗体をｈＵＭ０５－３ Ｗ４７Ｃと名付けた。突然変異された抗体の可変領域配列を、表７に示した。実施例１０に記載されるように、ＬＳ１７４Ｔ細胞への抗体結合の能力を試験した。実験結果を、図１２および表８に示した。結果は、ヒト－マウスキメラ抗体ＵＭ０５－５Ｌおよびヒト化抗体ｈＵＭ０５－３は、突然変異の前および後にＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞に結合できたということを示した。
Figure 2022536114000008
Figure 2022536114000009

Claims (25)

  1. ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
    （ａ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
    （ｉ）以下の配列：配列番号１またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ１、
    （ｉｉ）以下の配列：配列番号２またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ２、および
    （ｉｉｉ）以下の配列：配列番号３またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＨ ＣＤＲ３
    ならびに／または、
    （ｂ）以下の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
    （ｉｖ）以下の配列：配列番号４またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ１、
    （ｖ）以下の配列：配列番号５またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ２、および
    （ｖｉ）以下の配列：配列番号６またはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列からなるＶＬ ＣＤＲ３
    を含み、
    好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載される前記置換は、保存的置換であり、
    好ましくは、（ｉ）～（ｖｉ）のいずれか１つに記載される前記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って定義され、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１もしくは配列番号２０で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２もしくは配列番号２１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５もしくは配列番号２２で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、以下の３つの重鎖ＣＤＲ：配列番号２０で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号２１で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ２および配列番号３で示されるような配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、ならびに／または以下の３つの軽鎖ＣＤＲ：配列番号４で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号２２で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ２および配列番号６で示されるような配列を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む、
    抗体またはその抗原結合性断片。
  2. ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
    （ｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ１もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
    （ｉｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ２もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
    （ｉｉｉ）配列番号７で示されるような重鎖可変領域（ＶＨ）中に含有されるようなＶＨ ＣＤＲ３もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、および／または、
    （ｉｖ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ１もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
    （ｖ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ２もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、
    （ｖｉ）配列番号８で示されるような軽鎖可変領域（ＶＬ）中に含有されるようなＶＬ ＣＤＲ３もしくはそれと比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２もしくは３個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列
    を含み、
    ならびに／または、
    好ましくは、前記ＶＨ中に含有される前記の３つのＣＤＲおよび／または前記ＶＬ中に含有される前記の３つのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって定義される、抗体またはその抗原結合性断片。
  3. （ａ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
    （ｉ）配列番号７で示されるような配列、
    （ｉｉ）配列番号７で示される配列と比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
    （ｉｉｉ）配列番号７で示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列
    および／または
    （ｂ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
    （ｉｖ）配列番号８で示されるような配列、
    （ｖ）配列番号８で示される配列と比較して１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加）を有する配列、または
    （ｖｉ）配列番号８で示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列
    を含み、
    好ましくは、（ｉｉ）または（ｖ）に記載される前記置換は、保存的置換であり、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、ヒト免疫グロブリンに由来する重鎖フレームワーク領域配列および／または軽鎖フレームワーク領域配列を含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１８または配列番号１９で示される前記配列を有するＶＨおよび配列番号８または配列番号１７で示される前記配列を有するＶＬを含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、
    （１）配列番号７で示される前記配列を有するＶＨおよび配列番号８で示される前記配列を有するＶＬ、
    （２）配列番号１８で示される前記配列を有するＶＨおよび配列番号８で示される前記配列を有するＶＬ、
    （３）配列番号１６で示される前記配列を有するＶＨおよび配列番号１７で示される前記配列を有するＶＬ、
    （４）配列番号１９で示される前記配列を有するＶＨおよび配列番号１７で示される前記配列を有するＶＬ
    を含む、請求項１または２に記載の記抗体またはその抗原結合性断片。
  4. ヒト免疫グロブリンまたはそのバリアントに由来する定常領域を含み、
    好ましくは、
    （ａ）ヒト免疫グロブリン、または、それが由来する配列と比較して、１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加もしくはそれらの任意の組合せ（例えば、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個もしくは最大で５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加もしくはそれらの任意の組合せ、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加もしくはそれらの任意の組合せ）を有するバリアントの、重鎖定常領域（ＣＨ）、および／あるいは、
    （ｂ）ヒト免疫グロブリン、または、それが由来する配列と比較して、１個もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加もしくはそれらの任意の組合せ（例えば、最大で２０個、最大で１５個、最大で１０個もしくは最大で５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加もしくはそれらの任意の組合せ、例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加またはそれらの任意の組合せ）を有するバリアントの、軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
    好ましくは、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域であり、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号９で示されるような前記重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、
    好ましくは、前記軽鎖定常領域は、κ軽鎖定常領域であり、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１１で示されるような軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 前記抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合されたＦｖ、ＢｓＦｖ、ＤｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ラクダ化単一鎖ドメイン抗体、ダイアボディー、ｄｓダイアボディー、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、二価ドメイン抗体からなる群から選択され、および／または、前記抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体である、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  6. 標識を含み、好ましくは、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片またはその重鎖可変領域および／もしくは軽鎖可変領域をコードする単離された核酸分子であって、
    好ましくは、配列番号１４または配列番号１５で示されるようなヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
  8. 請求項７に記載の核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、クローニングベクターまたは発現ベクターである、ベクター。
  9. 請求項７に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  10. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を調製する方法であって、請求項９に記載の宿主細胞を、前記抗体またはその抗原結合性断片の発現を可能にする条件下で培養することおよび前記宿主細胞の培養物から前記抗体またはその抗原結合性断片を回収することを含み、
    好ましくは、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞が、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌまたはネコ細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、方法。
  11. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む二重特異性または多重特異性分子であって、
    好ましくは、ＣＥＡＣＡＭ５に特異的に結合し、さらに１つまたはいくつかの他の標的に特異的に結合し、
    好ましくは、第２の標的に対する第２の結合特異性を有する少なくとも１つの分子（例えば、第２の抗体）をさらに含む、二重特異性または多重特異性分子。
  12. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、前記抗体またはその抗原結合性断片に結合した治療薬とを含む免疫複合体であって、
    好ましくは、前記治療薬は、細胞傷害性薬剤から選択され、
    好ましくは、前記治療薬は、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種剤およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され、
    好ましくは、前記免疫複合体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である、免疫複合体。
  13. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１１に記載の二重特異性もしくは多重特異性分子または請求項１２に記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む医薬組成物であって、
    好ましくは、追加の薬学的活性剤をさらに含み、
    好ましくは、前記追加の薬学的活性剤は、抗腫瘍活性を有する薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスであり、
    好ましくは、前記抗体もしくはその抗原結合性断片、二重特異性もしくは多重特異性分子または免疫複合体および前記追加の薬学的活性剤は、別個の成分として、または同一組成物の成分として提供される、医薬組成物。
  14. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を含むキットであって、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンを含み、
    好ましくは、前記キットは、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片を特異的に認識する第２の抗体をさらに含み、
    好ましくは、前記第２の抗体は、検出可能な標識、例えば、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、放射性核種、蛍光色素、発光物質（例えば、化学発光物質）またはビオチンをさらに含む、キット。
  15. 請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の抗原結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、
    好ましくは、前記抗原結合性ドメインは、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
    好ましくは、前記抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖであり、
    好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片を含み、
    好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）によって発現される、キメラ抗原受容体。
  16. 請求項１５に記載のキメラ抗原受容体をコードする単離された核酸分子。
  17. 請求項１６に記載の単離された核酸分子を含むベクターであって、好ましくは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を調製するために使用される、ベクター。
  18. 請求項１６に記載の単離された核酸分子または請求項１７に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
    好ましくは、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）であり、
    好ましくは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）である、宿主細胞。
  19. 細胞の表面上のＣＥＡＣＡＭ５の発現レベルを低減する方法であって、前記細胞と、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１１に記載の二重特異性もしくは多重特異性分子または請求項１２に記載の免疫複合体または請求項１３に記載の医薬組成物または請求項１５に記載のキメラ抗原受容体または請求項１８に記載の宿主細胞とを接触させて、前記細胞の前記表面上のＣＥＡＣＡＭ５の発現を低減することを含み、前記細胞は、前記細胞の前記表面上にＣＥＡＣＡＭ５を発現する細胞であり、
    好ましくは、前記細胞は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞である、方法。
  20. ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞の成長を阻害し、および／または前記腫瘍細胞を殺滅する方法であって、前記腫瘍細胞と、有効量の請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１１に記載の二重特異性もしくは多重特異性分子または請求項１２に記載の免疫複合体または請求項１３に記載の医薬組成物または請求項１５に記載のキメラ抗原受容体または請求項１８に記載の宿主細胞とを接触させることを含む、方法。
  21. 対象（例えば、ヒト）において腫瘍を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１１に記載の二重特異性もしくは多重特異性分子または請求項１２に記載の免疫複合体または請求項１３に記載の医薬組成物または請求項１５に記載のキメラ抗原受容体または請求項１８に記載の宿主細胞を投与することを含み、
    好ましくは、前記腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現するものであり、
    好ましくは、前記腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を含み、好ましくは、前記ＣＥＡＣＡＭ５は、前記腫瘍細胞の前記表面に発現され、
    好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択され、
    好ましくは、前記対象は、哺乳動物、例えばヒトであり、
    好ましくは、前記方法は、抗腫瘍活性を有する付加的薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスを投与することをさらに含み、
    好ましくは、前記方法は、さらなる抗腫瘍療法、例えば、手術、化学療法、放射線療法、標的化療法、免疫療法、ホルモン療法、遺伝子療法または対症療法を施すことをさらに含む、方法。
  22. 対象（例えば、ヒト）における腫瘍の前記予防および／処置のための医薬の製造における、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合性断片または請求項１１に記載の二重特異性もしくは多重特異性分子または請求項１２に記載の免疫複合体または請求項１３に記載の医薬組成物または請求項１５に記載のキメラ抗原受容体または請求項１６に記載の宿主細胞の使用であって、
    好ましくは、前記医薬は、追加の薬学的活性剤をさらに含み、
    好ましくは、前記追加の薬学的活性剤は、抗腫瘍活性を有する薬物、例えば、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射性核種、放射線増感剤、抗血管新生剤、サイトカイン、分子標的化薬物、免疫チェックポイント阻害剤または腫瘍溶解性ウイルスであり、
    好ましくは、前記腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現し、
    好ましくは、前記腫瘍は、ＣＥＡＣＡＭ５を発現する腫瘍細胞を含み、好ましくは、前記ＣＥＡＣＡＭ５は、前記腫瘍細胞の表面に発現され、
    好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択され、
    好ましくは、前記対象は、哺乳動物、例えばヒトである、使用。
  23. サンプル中のＣＥＡＣＡＭ５（例えば、ヒトＣＥＡＣＡＭ５）の存在または量を検出する方法であって、以下のステップ：
    （１）前記サンプルを請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
    （２）前記抗体またはその抗原結合性断片およびＣＥＡＣＡＭ５を含む複合体の形成を検出するステップ、または前記複合体の前記量を検出するステップと
    を含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を含み、
    好ましくは、前記ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５である、方法。
  24. 腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする抗腫瘍療法によって処置されることが可能であるかを決定する方法であって、以下のステップ：
    （１）前記腫瘍の細胞を含有するサンプルを、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと、
    （２）前記抗体またはその抗原結合性断片およびＣＥＡＣＡＭ５を含む複合体の形成を検出するステップと
    を含み、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を保有し、
    好ましくは、前記ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択される、方法。
  25. 腫瘍が、ＣＥＡＣＡＭ５を標的とする抗腫瘍療法によって処置されることが可能であるかを決定するためのキットの製造における、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合性断片の使用であって、
    好ましくは、前記抗体またはその抗原結合性断片は、検出可能な標識を保有し、
    好ましくは、前記ＣＥＡＣＡＭ５は、ヒトＣＥＡＣＡＭ５であり、
    好ましくは、前記腫瘍は、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞がんおよび他の血液悪性腫瘍、例えば、定型のホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球性Ｂ細胞多発性リンパ腫、ＥＢＶ陽性および陰性ＰＴＬＤならびにＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、上咽頭がんおよびＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫からなる群から選択される、使用。
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