KR20220016943A - 항 씨이에이씨에이엠5 단클론 항체 및 그의 제조 방법 및 그의 용도 - Google Patents

항 씨이에이씨에이엠5 단클론 항체 및 그의 제조 방법 및 그의 용도 Download PDF

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웨이 수
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Abstract

인간 암태아 항원-관련 세포부착 분자 5(CEACAM5)에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 및 그의 항원-결합 단편을 개시하며; 상기 항체를 기반으로 하는 키메라 항원 수용체, 및 상기 항체 및 항원-결합 단편의 제조 방법 및 CRECAM5-관련 종양의 치료를 위한 그의 용도를 또한 개시한다.

Description

항 씨이에이씨에이엠5 단클론 항체 및 그의 제조 방법 및 그의 용도
본원은 면역 분야에 속하며, 구체적으로 인간 암태아 항원 세포부착 분자 5(human carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 5, CEACAM5)에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체 및 그의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본원은 또한 항체 및 그의 항원-결합 단편의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.
인간 암태아 항원 세포부착 분자(CEACAM) 패밀리는 염색체 19(q13.1과 13.3 사이)에 위치한 35개의 유전자/위유전자를 포함하여, 1960년대 정도로 일찍 발견되었으며, 이들 중에 단백질을 암호화하는 21개가 존재한다. CEACAM은 부착 분자의 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하며, 그 도메인은 고도로 글리코실화되어 있으며 대개는 1 내지 2개의 면역글로불린 가변 영역-유사 도메인(N 도메인) 및 0 내지 6개의 면역글로불린 불변 영역-유사 도메인을 포함한다. CEACAM 단백질은 세포막상에 위치하며, 여기에서 CEACAM1, CEACAM3 및 CEACAM4는 소수성 막관통 도메인을 통해 세포막에 고정되는 반면; CEACAM5-8은 글리코실-포스파티딜-이노시톨을 통해 세포막에 고정된다. 이들 세포외 도메인은 대개 세포(예를 들어 상피, 내피, 수상돌기 및 백혈구) 사이의 부착 분자로서 작용한다.
CEACAM은 다양한 세포 기능을 수반하며, 세포간의 부착 기능에 기반한 신호 전달을 통해 세포 성장 및 분화를 조절하고, 인슐린 항상성, 혈관형성 및 면역 조절에 중요한 역할을 한다. CEACAM 패밀리의 구성원은 미생물 병원체에 대한 수용체로서의 역할을 포함하여, 다양한 병태생리학적 역할에 관련된다. 이들은 발암현상, 특히 암 검출, 진행 및 전이에 중요한 역할을 한다. CEACAM5(CEA로서 지칭되며, 또한 CD66e로서 공지되어 있다)는 약 180 kDa의 분자량을 갖는 당단백질이다. 7개의 도메인을 함유하는 CEACAM5는 글리코실-포스파티딜-이노시톨(GPI)을 통해 세포막상에 고정된다. 7개의 도메인은 단일의 N-말단 Ig 가변 도메인, 및 Ig 불변 도메인에 상동성인 6개의 도메인(A1-B1-A2-B2-A3-B3)을 포함한다. CEACAM5는 처음에는 태아 조직에서 발현되는 단백질인 것으로 생각되었으며, 이제는 다수의 정상적인 성인 조직에서 확인되었다. 다수 유형의 암에서 CEACAM5의 과발현이 관찰되었다. 예를 들어, CEACAM5는 결장암 환자의 혈액에서 검출될 수 있다. 더욱이, 추가의 연구는 그의 과발현이 다수의 악성 종양과 연관되며, 종종 불량한 예후와 상관있음을 밝혀내었다. 전립선암 및 대장암에서, CEACAM5의 과발현이 또한 발견되며 이는 종양 생물마커로서 사용될 수 있다.
또한, CEACAM5/CEACAM6이 다양한 악성 종양, 예를 들어 유방, 췌장, 난소, 결장, 폐 및 위샘 종양에서 과발현되는 것으로 밝혀졌으며, 종양 침범 및 전이와 관련된다. 간 전이가 개시되는 동안, CEACAM5는 그의 수용체 CEAr에 결합하고, 이들의 상호작용은 염증전 사이토카인, 즉 IL-1, IL-6, IL-10 및 TNFα의 활성화 및 생성으로 이어진다. 간단히, 이들 사이토카인은 간세포 및 쿠퍼 세포의 미세환경뿐만 아니라, 간 정현세포와의 상호작용을 변화시킨다. 이러한 상호작용은 종양 세포 또는 다른 간 세포에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 뇌척수액에서 CSC 및 기타 순환하는 종양 세포의 활력을 촉진하는 것으로 보인다.
이를 바탕으로 암의 예후를 임상적으로 결정하고 암의 진행을 모니터링하기 위해 암 환자의 혈액에서 상승된 CEACAM5 수준을 측정하는 면역학적 분석에서 종양 마커로 CEACAM5를 사용하는 현행 활용에 더하여, CEACAM5는 표적 요법에 잠재적으로 유용한 종양-관련 항원으로 더욱 중요해지고 있다. 암의 표적 면역요법에 CEACAM5를 사용하는 것으로 보고된 두 가지 주요 활용이 있다. 한 가지 활용은 항-CEACAM5 항체를 사용하여, 특히 항체-의존적인 세포독성(ADCC) 또는 보체-의존적인 세포독성(CDC)을 통해 면역 세포의 용해 활성을 촉발하여, CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 제거하고; 다른 활용은 항-CEACAM5 항체 또는 그의 항체 단편을 약물, 독소, 방사성 뉴클레오티드, 면역조절제 또는 사이토카인과 같은 효과기 분자와 접합시켜 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 특이적으로 표적화함으로써 효과기 분자의 치료 효과를 발휘하는 것을 포함한다. CEACAM5가 대장암, 췌장암, 폐암, 위암, 간세포종양, 유방암 및 갑상선암과 같은 일부 고형암에서 우선적으로 과발현된다는 사실을 바탕으로, 현행 연구는 항-CEACAM5 항체의 항원 인식 능력에 초점을 맞추고 있다.
결론적으로, 현행 연구는 CEACAM5를 표적화하는 면역요법이 종양 전이를 억제하는 데 도움이 될 것임을 보여준다. 특히, CEACAM5에 대해 강한 특이성을 갖는 항체는 항체의 표적-외에 의해 야기되는 부작용을 더 잘 피할 수 있다. 예를 들어, CEACAM1 및 CEACAM3, CEACAM8은 호중구 등과 같은 인간 면역계 및 골수에 널리 분포되어 있으며 특정한 CEACAM5 및/또는 CEACAM6 항체는 약물의 가능한 부작용을 줄이고 치료 창을 증가시킬 수 있다.
이를 바탕으로, 보다 높은 친화성과 보다 양호한 특이성을 갖는 항-CEACAM 항체가 요구된다.
본원에서, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 과정은 모두 당해 분야에서 널리 사용되는 통상적인 과정이다. 동시에, 본원의 이해를 돕기 위해 관련 용어의 정의 및 설명을 하기에 제공한다.
용어의 정의
본원에서 "항체"란 용어는 특정 항원에 결합할 수 있는 임의의 면역글로불린, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체 또는 이중특이성(2가) 항체를 포함한다. 자연 그대로의 항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 영역과 제1, 제2 및 제3 불변 영역으로 구성되고; 각각의 경쇄는 하나의 가변 영역과 하나의 불변 영역으로 구성된다. 포유동물의 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 나뉠 수 있고, 포유동물의 경쇄는 λ 또는 κ로 나뉠 수 있다. 항체는 "Y"형으로 제시되며, Y형 구조의 목은 디설파이드 결합으로 연결된 2개 중쇄의 제2 및 제3 불변 영역으로 구성된다. "Y"형 구조의 각 가지는 하나의 경쇄의 가변 영역 및 불변 영역과 연결되는, 중쇄 중 하나의 가변 영역 및 제1 불변 영역을 함유한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 결정한다. 각 쇄의 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 3개의 고가변 영역을 함유한다. 경쇄(L)의 CDR은 VLCDR1, VLCDR2 및 VLCDR3을 포함하고, 중쇄(H)의 CDR은 VHCDR1, VHCDR2 및 VHCDR3을 포함한다. 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편의 CDR 경계는 카밧(Kabat), 코티아(Chothia) 또는 알-라지카니(Al-Lazikani) 넘버링 시스템에 의해 명명되거나 확인될 수 있다. (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, AM, J. Mol. Biol., 273(4): 927 (1997); Chothia, C., etc., J. Mol. Biol., 186(3 ): 651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, AM, J. Mol. Biol., 196: 901 (1987); Chothia, C. et al., Nature, 342(6252): 877-83 (1989 ); Kabat, EA, etc., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 여기에서, 3개의 CDR은 프레임워크 영역(FR)이라 칭하는 연속적인 측면 부분에 의해 분리된다. 프레임워크 영역은 CDR보다 더 고도로 보존되며 스캐폴드를 형성하여 고가변 루프를 지지한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원-결합과 관련되지 않고, 다수의 효과기 기능을 갖는다. 항체는 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열을 기준으로 다수의 범주로 나뉠 수 있다. 항체는 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄를 함유하는 지의 여부에 따라, 5개의 주요 범주 또는 이성질체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 나뉠 수 있다. 다수의 주요 항체 범주는 하위부류, 예를 들어 IgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), IgG3(γ3 중쇄), IgG4(γ4 중쇄), IgA1(α1 중쇄) 또는 IgA2(α2 중쇄) 등으로 추가로 나뉠 수 있다.
본원에서 "항원-결합 단편"이란 용어는 하나 이상의 CDR을 함유하는 항체 부분에 의해 형성된 항체 단편, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 갖지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 비제한적으로, 예를 들어 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디설파이드 결합-안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중-특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 디설파이드 결합-안정화된 이중기능성 항체(ds 디아바디), 단쇄 항체 분자(scFv), scFv 이량체(2가 이중기능성 항체), 2가 단쇄 항체(BsFv), 다중특이성 항체, 카멜화된 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체 및 2가 도메인 항체를 포함한다. 항원-결합 단편은 모 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부의 구현예에서, 항원-결합 단편은 특정한 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 함유할 수 있으며, 이는 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 유래된 프레임워크 영역내에 접목된다.
항체의 "Fab" 단편은 경쇄(가변 및 불변 영역 포함), 및 디설파이드 결합을 통해 결찰되는 중쇄의 가변 영역 및 불변 영역의 일부로 구성되는 항체 분자의 일부를 지칭한다.
"Fab'" 단편은 힌지 영역의 일부를 함유하는 Fab 단편을 지칭한다.
"F(ab')2"는 Fab의 이량체를 지칭한다.
항체의 Fc 분절은 다양한 상이한 효과기 기능, 예를 들어 ADCC 및 CDC를 담당하지만, 항원-결합에는 참여하지 않는다.
항체의 "Fv" 분절은 완전한 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 지칭한다. Fv 단편은 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역으로 구성된다.
"단쇄 Fv 항체" 또는 "scFv"는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역이 직접 결찰되거나 또는 펩티드 쇄를 통해 결찰되는 조작된 항체를 지칭한다(Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85: 5879 (1988)).
"단쇄 항체 Fv-Fc" 또는 "scFv-Fc"는 특정 항체의 Fc 분절에 결찰된 scFv로 구성된 조작된 항체를 지칭한다.
"카멜화된 단일 도메인 항체", "중쇄 항체" 또는 "HCAb(중쇄만의 항체, HCAb)"는 모두 경쇄 없이 2개의 VH 도메인을 함유하는 항체를 지칭한다(Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods. 231(1-2): 25-38 (1999); Muyldermans S., J Biotechnol. 74(4): 277-302 (2001); W094/04678; W094/ 25591; 미국특허 제 6,005,079 호). 중쇄 항체는 원래 낙타과(낙타, 단봉 낙타 및 라마)로부터 유래되었다. 카멜화된 항체는 경쇄가 없지만, 항원-결합 기능이 입증되었다(Hamers Casterman C. et al., Nature 363 (6428): 446-8 (1993); Nguyen VK. et al., "Heavy-chain antibodies in Camelidae: a case of evolutionary innovation, Immunogenetics. 54 (1): 39-47 (2002); Nguyen VK. et al., Immunology. 109 (1): 93-101 (2003)). 중쇄 항체의 가변 영역(VH 도메인)은 획득 면역에 의해 생성된 최소의 공지된 항원-결합 단위이다(Koch-Nolte F. et al., FASEB J.21 (13): 3490-8. Epub (2007)).
"나노바디"는 중쇄 항체로부터 유래된 VH 도메인 및 2개의 불변 영역 CH2 및 CH3으로 구성되는 항체 단편을 지칭한다.
"디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 함유하며, 여기에서 단편은 동일한 폴리펩티드쇄에 결찰된 VH 도메인 및 VL 도메인을 함유한다(Holliger P. et al., Proc Natl. Acad Sci US A. 90(14): 6444-8 (1993); EP404097; W093/11161 참조). 2개 도메인간의 링커가 너무 짧아서 동일한 쇄상의 2개 도메인은 서로 짝을 이룰 수 없고, 이는 2개 도메인이 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 짝을 이루게 하여 2개의 항체 결합 부위를 형성시킨다. 이들 2개의 항체 결합 부위는 동일하거나 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화할 수 있다.
"도메인 항체"는 단지 하나의 중쇄 가변 영역 또는 하나의 경쇄 가변 영역만을 함유하는 항체 단편을 지칭한다. 일부의 경우에, 2개 이상의 VH 도메인이 폴리펩티드 링커에 의해 공유적으로 연결되어 2가 도메인 항체를 형성한다. 2가 도메인 항체의 2개의 VH 도메인은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.
일부 구현예에서, "(dsFv)2"는 3개의 펩티드 쇄를 함유한다: 2개의 VH 유전자가 폴리펩티드 링커에 의해 연결되고, 이들은 디설파이드 결합에 의해 2개의 VL 그룹에 결찰된다.
일부 구현예에서, "이중특이성 ds 이중기능성 항체"는 VL1-VH2(폴리펩티드 링커에 의해 연결된) 및 VH1-VL2(또한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된)를 함유하며, 이 둘은 디설파이드 결합을 통해 VH1과 VL1 사이에서 연결된다.
"이중-특이성 dsFv" 또는 "dsFv-dsFv"는 3개의 폴리펩티드 쇄: VH1-VH2 그룹을 함유하며, 여기에서 이 둘의 중쇄는 폴리펩티드 링커(예를 들어 긴 탄성 링커)에 의해 연결되고, 이들은 디설파이드 결합을 통해 VL1 및 VL2 그룹에 각각 결찰되며, 디설파이드 결합을 통해 짝을 이룬 각각의 중쇄 및 경쇄 쌍은 상이한 항원 특이성을 갖는다.
몇몇 구현예에서, "scFv 이량체"는 2개의 이량체화된 VH-VL(폴리펩티드 링커에 의해 연결된) 그룹을 함유하는, 2가 이중기능성 항체 또는 2가 단쇄 항체(BsFv)이며, 여기에서 하나의 그룹의 VH 및 다른 그룹의 VL은 협력하여 2개의 결합 부위를 형성하고, 2개의 결합 부위는 동일한 항원(또는 에피토프) 또는 상이한 항원(또는 에피토프)을 표적화할 수 있다. 다른 구현예에서, "scFv 이량체"는 VL1-VH2(폴리펩티드 링커에 의해 연결된) 및 VH1-VL2(폴리펩티드 링커에 의해 연결된)를 함유하는 이중-특이성 이중기능성 항체이며, 여기에서 VH1 및 VL1이 협력하고, VH2 및 VL2가 협력하며, 각각의 협력된 쌍은 상이한 항원 특이성을 갖는다.
본원에 사용되는 "완전한 인간"이란 용어는 항체 또는 항원-결합 단편에 적용될 때, 항체 또는 항원-결합 단편이 특정한 아미노산 서열을 갖거나 아미노산 서열로 이루어지고, 여기에서 아미노산 서열이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생성되거나 또는 인간 항체 라이브러리 또는 인간 항체를 암호화하는 다른 서열을 사용하여 비-인간 공급원, 예를 들어 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 유래되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 완전한 인간 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 아미노산 잔기(특히 항원-결합 잔기)를 함유하지 않는다.
본원에 사용되는 "인간화된"이란 용어는 항체 또는 항원-결합 단편에 적용될 때, 비-인간 동물로부터 유래된 CDR, 인간으로부터 유래된 FR 영역, 및 인간으로부터 유래된 불변 영역(적용가능한 경우)을 함유하는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다. 인간화된 항체 또는 항원-결합 단편은 감소된 면역원성을 갖기 때문에, 몇몇 구현예에서 이들을 인간 치료제로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 염소, 양, 기니피그, 또는 햄스터이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체 또는 항원-결합 단편은, CDR 서열이 비-인간임을 제외하고, 인간 서열로 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 인간으로부터 유래된 FR 영역은 상기 영역이 유래된 인간 항체와 동일한 아미노산 서열을 함유하거나, 또는 일부 아미노산 변화, 예를 들어 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산 변화를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산 변화는 단지 중쇄의 FR 영역에서만, 단지 경쇄의 FR 영역에서만, 또는 이 두 쇄 모두에서 존재할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 인간화된 항체는 인간 FR1-3 및 인간 JH 및 JK를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "키메라"란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 하나의 종으로부터 유래되고 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분은 상이한 종으로부터 유래되는 항체 또는 항원-결합 단편을 지칭한다. 예시적인 예에서, 키메라 항체는 인간으로부터 유래된 불변 영역 및 마우스와 같은 비-인간 동물로부터 유래된 가변 영역을 함유할 수 있다.
"암태아 항원 세포부착 분자 5"(CEACAM5, CEA로서 약기됨, 또한 CD66e로서 공지됨; 예를 들어 AAA51967.1/GI: 180223, 702 아미노산을 참조하시오)란 용어는 약 180 kDa의 분자량을 갖는 당단백질을 지칭한다. CEACAM5는 7개의 Ig-유사 도메인을 함유하며, 이들 7개 도메인은 단일의 N-말단 Ig 가변 도메인, 및 Ig 불변 도메인에 상동성인 6개 도메인(A1-B1-A2-B2-A3-B3)을 포함한다. CEACAM은 카복시-말단 글리코실-포스파티딜-이노시톨(GPI)을 통해 세포막상에 고정된다.
본원에서 "특이적으로 결합하다" 또는 "특이적인 결합"은 2개 분자간의 무작위적이지 않은 결합 반응, 예를 들어 항체와 항원간의 반응을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 및/또는 원숭이 암태아 항원 세포부착 분자 5에 특이적으로 결합하며 그의 결합 친화성(KD)은 ≤10-6 M. KD이다. 본원에서, KD는 해리속도 대 결합속도(koff/kon)의 비를 지칭하며, 이를 표면 플라스몬 공명에 의해, 예를 들어 Biacore와 같은 장비를 사용하여 측정할 수 있다.
본원에서 "선택적인 결합"은 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하지만, 또 다른 CEACAM 단백질, 예를 들어 CEACAM1 단백질, CEACAM3 단백질, CEACAM7 단백질에는 실질적으로 결합하지 않거나 또는 현저하게 더 낮은 수준으로 결합함을 지칭한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 유형의 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 경쇄 불변 영역은 κ 쇄이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 각각 인간 IgG1 및 κ 쇄이다.
본원에서, "보존적 치환"이 아미노산 서열에 적용될 때, 이는 하나의 아미노산 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 교체되고, 여기에서 이들이 유사한 물리적, 화학적 성질을 갖는 측쇄를 가짐을 지칭한다. 예를 들어 보존적 치환은 소수성 측쇄를 갖는 아미노산 잔기(예를 들어 Met, Ala, Val, Leu 및 Ile), 중성 친수성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어 Cys, Ser, Thr, Asn 및 Gln), 산성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어 Asp, Glu), 염기성 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어 His, Lys, 및 Arg), 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기(예를 들어 Trp, Tyr, 및 Phe) 사이에서 수행될 수 있다. 보존적 치환은 대개 단백질의 입체형태적 구조를 현저하게 변화시키지 않으며 따라서 단백질의 생물학적 활성을 유지시킬 수 있음이 당해 분야에 공지되어 있다.
"서열 일치성 퍼센트"를 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 적용시킬 때, 이는 서열 정렬을 수행하고 필요한 경우 간격을 도입시켜 일치하는 아미노산(또는 핵산)의 수를 최대화시킨 후, 참조 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 일치하는 후보 서열의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 지칭한다. 보존적 치환의 아미노산 잔기는 일치하는 잔기로서 간주될 수도, 간주되지 않을 수도 있다. 서열 정렬은 아미노산(또는 핵산) 서열의 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위해 당해 분야에 개시된 도구에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 도구의 디폴트 매개변수를 사용하거나, 또는 매개변수를, 예를 들어 적합한 알고리즘을 선택함으로써 정렬의 필요에 따라 적합하게 조절할 수 있다.
본원에 사용된 "T 세포"는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, T 헬퍼 1형 T 세포, T 헬퍼 2형 T 세포, T 헬퍼 17형 T 세포, 및 억제인자 T 세포를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "효과기 기능"은 효과기, 예를 들어 C1 복합체 및 Fc 수용체에 결합하는 항체의 Fc 영역의 생물학적 활성을 지칭한다. 예시적인 효과기 기능은 항체와 C1 복합체상의 C1q와의 상호작용에 의해 유도되는 보체-의존적인 세포독성(CDC), 효과기 세포상의 Fc 수용체에의 항체의 Fc 영역의 결합에 의해 유도되는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC), 및 식세포작용을 포함한다.
본원에서 "암" 또는 "암성 증상"은 종양 또는 악성세포 성장, 증식 또는 전이에 의해 매개되는 임의의 의학적 상태를 지칭하며 고형 종양 및 백혈병과 같은 비-고형 종양을 일으킨다. 본원에서 "종양"은 종양 및/또는 악성 세포의 고형 물질을 지칭한다.
몇몇 상태의 "치료" 또는 "치료법"은 특정 상태를 예방하거나 완화시키거나, 특정 상태의 상승 또는 발생률을 감소시키거나, 특정 상태의 발생 위험성을 감소시키거나, 특정 상태와 연관된 증상의 발생을 예방하거나 지연시키거나, 특정 상태와 연관된 증상을 감소시키거나 종결시키거나, 특정 상태의 완전한 또는 부분적인 역전을 생성시키거나, 특정 상태를 치유하거나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 암의 경우, "치료" 또는 "치료법"은 종양 또는 악성 세포의 성장, 복제 또는 전이를 억제하거나 늦추거나, 또는 상기 중 일부의 임의의 조합을 지칭할 수 있다. 종양의 경우, "치료" 또는 "치료법"은 종양의 전부 또는 일부를 제거하거나, 종양의 성장 및 전이를 억제하거나 늦추거나, 종양의 발생을 예방하거나 지연시키거나, 또는 상기 중 일부의 조합을 포함한다.
"단리된" 물질은 자연 상태에서 인공적으로 변화된 것을 지칭한다. 특정한 "단리된" 물질 또는 성분이 자연에서 존재하는 경우, 이는 그의 원래 상태로부터 변화되었거나 벗어났거나, 또는 이 두 경우 모두이다. 예를 들어 살아있는 동물 중에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않았지만, 이들 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연 상태에서 공존하는 물질로부터 충분히 분리되고 충분히 순수한 상태로 존재하는 경우, 이들은 "단리된" 것으로서 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편의 순도는 적어도 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%이며, 이를 전기영동 방법(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동, 모세관 전기영동), 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 역상 HPLC)에 의해 측정할 수 있다.
본원에서 "벡터"는 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동적으로 삽입되어 단백질이 발현되게 할 수 있는 비히클을 지칭한다. 벡터를 사용하여, 벡터가 운반하는 유전 물질 요소가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예를 들어 효모 인공 염색체(YAC), 세균 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래된 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예를 들어 λ 파지 또는 M13 박테리오파지, 및 동물 바이러스 등을 포함한다. 벡터로서 사용되는 동물 바이러스의 유형은 레트로바이러스(렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어 헤르페스 단순 바이러스) 포함), 폭스바이러스, 바큘로바이러스, 파필로마 바이러스, 파필로마 액포 바이러스(예를 들어 SV40)를 포함한다. 벡터는 발현을 조절하는 다양한 요소, 예를 들어 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인헨서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기원을 또한 함유할 수 있다. 벡터는 또한 세포내로의 진입을 지원하는 성분, 예를 들어 비제한적으로 바이러스 입자, 리포솜, 또는 단백질 쉘을 함유할 수 있다.
본원에서, "숙주 세포"는 외인성 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 본원에 기재된 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 또는 바실러스 서브틸리스, 진균 세포, 예를 들어 효모 세포 또는 아스퍼질러스, 곤충 세포, 예를 들어 S2 드로소필라 세포 또는 Sf9, 또는 동물 세포, 예를 들어 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포 또는 인간 세포를 포함한다.
본원에서, "키메라 항원 수용체"는 CAR로서 지칭되며, 특정한 항원을 인식하기 위한 세포외 도메인(예를 들어 특정한 항원을 인식하고 이에 결합할 수 있는 항원-결합 단편) 및 세포의 내부에 세포외 신호를 전송하기 위한 세포내 도메인(또한 세포내 신호전달 영역, 예를 들어 CD3의 δ 쇄 또는 FcεRIγ의 세포내 부분으로서 지칭된다)을 포함하는, 특정 항원(예를 들어 종양 항원)을 인식할 수 있는 세포 표면 수용체를 지칭한다. 상기와 같은 키메라 항원 수용체를 운반하고 발현하는 T 세포를 CAR-T 세포라 칭하며, 이는 특정한 항원 및 세포외 도메인을 통해서 및 세포외 신호전달 기능에 의해서 특정한 항원을 발현하는 세포(예를 들어 종양 세포)를 인식하고 이에 결합할 수 있으며, 면역 반응을 활성화할 수 있고, 다수의 다양한 효과기를 방출할 수 있으며, 특정한 항원을 발현하는 세포(예를 들어 종양 세포)를 효율적으로 사멸시키고, 이에 의해 치료 효과(예를 들어 종양의 치료)를 발휘할 수 있다.
종래 기술의 단점을 바탕으로, 본원의 주요 목적 중 하나는 보다 강한 특이성과 보다 양호한 선택성을 갖는 항-CEACAM5 항체를 제공하는 것이다. 본원은 또한 항체의 제조 방법 및 용도를 제공하며, 본원의 항-CEACAM5 항체를 종양의 검출 및/또는 치료에 사용할 수 있다.
본원의 항체
하나의 태양에서, 본원은 CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(a) 하기 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 하기의 서열: 서열번호 1, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR1,
(ii) 하기의 서열: 서열번호 2, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및
(iii) 하기의 서열: 서열번호 3, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR3; 및/또는
(b) 하기 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(iv) 하기의 서열: 서열번호 4, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR1,
(v) 하기의 서열: 서열번호 5, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및
(vi) 하기의 서열: 서열번호 6, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR3
을 포함한다.
몇몇 구현예에서, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나에 기재된 치환은 보존적 치환이다.
몇몇 구현예에서, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나에 기재된 CDR은 카밧(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 정의된다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 1 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 2 또는 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 5 또는 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR은 카밧 넘버링 시스템에 따라 정의된다.
하나의 태양에서, 본원은 CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(i) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR1;
(ii) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR2; 및
(iii) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR3; 및/또는
(iv) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR1;
(v) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR2; 및
(vi) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR3
을 포함한다.
몇몇 구현예에서, VH 중에 함유된 3개의 CDR 및/또는 VL 중에 함유된 3개의 CDR은 카밧, IMGT 또는 코티아 넘버링 시스템에 의해 정의된다. 몇몇 구현예에서, VH 중에 함유된 3개의 CDR 및/또는 VL 중에 함유된 3개의 CDR은 카밧 넘버링 시스템에 의해 정의된다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은
(a) 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 7에 나타낸 서열;
(ii) 서열번호 7에 나타낸 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열; 또는
(iii) 서열번호 7에 나타낸 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 일치성을 갖는 서열; 및/또는
(b) 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
(i) 서열번호 8에 나타낸 서열;
(ii) 서열번호 8에 나타낸 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열; 또는
(iii) 서열번호 8에 나타낸 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 일치성을 갖는 서열
을 포함한다.
몇몇 구현예에서, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환은 보존적 치환이다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 영역 서열 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 서열을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 중쇄 생식세포계열 유전자에 의해 암호화된 중쇄 프레임워크 영역 서열, 및/또는 인간 경쇄 생식세포계열 유전자에 의해 암호화된 경쇄 프레임워크 영역 서열을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 7, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타낸 서열을 포함하는 VH 및 서열번호 8 또는 서열번호 17에 나타낸 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 7에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8에 나타낸 서열을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 18에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8에 나타낸 서열을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 16에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 19에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL을 포함한다.
본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 포유동물(예를 들어 쥐 또는 인간) 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역 서열 또는 그의 변체를 포함할 수 있으며, 여기에서 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합; 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH) 또는 그의 변체를 포함하는 중쇄를 가지며, 여기에서 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합; 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖고; 및/또는
몇몇 구현예에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL) 또는 그의 변체를 포함하는 중쇄를 가지며, 여기에서 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합; 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는다.
일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역(CH)의 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 보존적 치환(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 보존적 치환)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 경쇄 불변 영역(CL)의 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 보존적 치환(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 보존적 치환)을 가질 수 있다.
몇몇 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다. 몇몇 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이다.
몇몇 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 κ 경쇄 불변 영역이다. 몇몇 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 인간 κ 경쇄 불변 영역이다.
몇몇 예시적인 구현예에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호 9에 나타낸 중쇄 불변 영역(CH); 및/또는 서열번호 11에 나타낸 경쇄 불변 영역(CL)을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항원-결합 단편은 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 디설파이드-연결된 Fv, scFv, 디아바디, 및 단일 도메인 항체(sdAb)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 항체는 쥐 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 이중특이성 항체, 또는 다중특이성 항체이다.
본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 중에서 선택된 하나 이상의 활성을 갖는다:
(1) CEACAM5 단백질 또는 CEACAM5 단백질을 발현하는 세포에 특이적으로 결합한다;
(2) 기본적으로 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8 단백질 또는 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8 단백질을 발현하는 세포에 결합하지 않는다;
(3) CEACAM6 단백질 또는 CEACAM6 단백질을 발현하는 세포에 단지 약하게 결합하며, 여기에서 결합 친화성은 CEACAM5 단백질 또는 CEACAM5 단백질을 발현하는 세포에 대한 결합 친화성보다 현저하게 낮다;
(4) ADCC 활성을 갖는다;
(5) CEACAM5 단백질을 발현하는 종양 세포(예를 들어 결장암 세포, 위암 세포)를 억제하거나 사멸할 수 있고, 이에 의해 종양 치료 활성을 갖는다.
몇몇 구현예에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질) 또는 비오틴을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본원은 예시적인 항-CEACAM5 항체 UM05-5L 및 hUM05-3을 제공한다.
당업자는 상기 언급한 CDR 서열을 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하도록 변형시키고, 이에 의해 개선된 생물학적 활성, 예를 들어 인간 암태아 항원 세포부착 분자 5에 대한 개선된 결합 친화성을 획득할 수 있음을 알아야 한다. 예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 항체 변체 라이브러리(예를 들어 Fab 또는 FcFv 변체)를 생성 및 발현시키고, 이어서 CEACAM5와 친화성을 갖는 항체를 선별할 수 있다. 또 다른 예에서, 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 CEACAM5에 대한 항체의 결합을 시뮬레이션하고 결합 계면을 형성하는 항체상의 아미노산 잔기를 식별할 수 있다. 이들 잔기의 치환을 피하여 결합 친화성의 감소를 방지하거나, 또는 이들 잔기를 보다 강한 결합을 형성시키는 치환에 대해 표적화할 수 있다. 몇몇 구현예에서, CDR 서열 중 적어도 하나(또는 모든)의 치환은 보존적 치환이다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 항체-결합 단편은 하나 또는 다수의 CDR 서열을 포함하고, 이들 CDR 서열은 서열번호 1-6과 비교하여 적어도 80%(예를 들어 적어도 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%)의 서열 일치성을 가지며, 동시에 모 항체와 비교하여 CEACAM5에 대해 유사하거나 또는 훨씬 더 높은 결합 친화성을 유지한다. 모 항체는 실질적으로 동일한 서열을 갖지만, 그의 상응하는 CDR 서열은 서열번호 1-6에 나열된 서열과 비교하여 100%의 서열 일치성을 갖는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 ≤10-7 M의 결합 친화성(KD)(표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다)으로 CEACAM5에 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 친화성 값을 KD 값에 의해 나타낼 수 있으며, 이는 항원-결합 분자에 대한 항원의 결합이 평형에 도달할 때 해리속도 대 결합속도의 비(koff/kon)를 계산함으로써 획득된다. 항원-결합 친화성(예를 들어 KD)은 당해 분야에 공지된 적합한 방법, 예를 들어 Bicore와 같은 장비의 사용을 포함하는 플라스몬 공명 결합 방법에 의해 대략적으로 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 CEACAM5에 1 ng/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 EC50(즉 절반-결합 농도)으로 결합한다. CEACAM5에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 샌드위치 방법, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블럿, FACS 또는 다른 결합 분석에 의해 측정할 수 있다. 예시적인 예에서, 시험하고자 하는 항체(즉 1차 항체)를 고정화된 CEACAM5 또는 CEACAM5를 발현하는 세포에 결합시키고, 이어서 결합되지 않은 항체를 씻어내고, 표지된 2차 항체(1차 항체에 결합할 수 있다)를 도입시키고, 따라서 결합된 2차 항체가 검출된다. 고정화된 암태아 항원 세포부착 분자 5가 사용되는 경우, 검출을 미세플레이트 판독기상에서 수행하거나, 또는 CEACAM5를 발현하는 세포를 사용하는 경우, FACS 분석을 검출에 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편은 10 ng/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 EC50(즉 50%의 유효 농도)(FACS 분석에 의해 측정됨)으로 CEACAM5에 결합한다.
항체는 CEACAM5에 특이적이다. 몇몇 구현예에서, 항체는 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8에 임의로 결합하지 않고 CEACAM6에, CEACAM5의 경우보다 현저하게 더 낮은 결합 친화성으로 결합한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체를 면역원성 물질, 예를 들어 종양 세포, 정제된 종양 항원, 암호화 면역자극 인자로 형질감염된 세포, 및 종양 백신과 함께 사용할 수 있다. 또한, 항-CEACAM5 항체 및 그의 항원-결합 단편을 표준 화학요법 및 방사선 요법, 표적-기반 소분자 요법, 및 다른 최근 생겨난 면역관문 조절제 요법을 포함한 병용 요법에 포함시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 항체-약물 접합체, 이중특이성 또는 다중특이성 항체의 기본 분자로서 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편은 카멜화된 단쇄 도메인 항체, 디아바디, scFv, scFv 이량체, BsFv, dsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', Fv 단편, Fab, Fab', F(ab')2, ds 디아바디, 나노바디, 도메인 항체 또는 2가 도메인 항체이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역은 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH1-CH2 또는 CH1-CH3 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 불변 영역은 목적하는 성질을 획득하기 위해 하나 이상의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 불변 영역을 하나 또는 다수의 효과기 기능을 감소시키거나 제거하거나, FcRn 수용체 결합을 증대시키거나, 또는 하나 또는 다수의 시스테인 잔기를 도입시키기 위해 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편은 접합체를 추가로 포함한다. 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 다양한 접합체에 연결시킬 수 있을 것으로 여겨진다(예를 들어 문헌["Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, JM Cruse and RE Lewis, Jr. (eds.), Carger Press, New York (1989)]을 참조하시오). 이들 접합체를 공유 결합, 친화성 결합, 포매, 배위 결합, 복합체화, 결합, 혼합 또는 부가와 같은 다른 수단에 의해 항체 또는 항원-결합 단편에 연결시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편을 에피토프 결합 부분 이외의 특정한 부위를 함유하도록 조작할 수 있으며, 이들 부위를 사용하여 하나 또는 다수의 접합체를 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 부위는 하나 또는 다수의 반응성 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 잔기 및 히스티딘 잔기를 포함하여, 접합체에의 공유 부착을 촉진할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 항체를 접합체에 간접적으로 부착시키거나, 또는 또 다른 접합체를 통해 접합체에 부착시킬 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 비오틴에 결합시킬 수 있으며 이어서 2차 접합체(아비딘에 연결된다)에 간접적으로 결합시킬 수 있다. 접합체는 검출성 표지, 약동학적 변형 부분, 정제 부분 또는 세포독성 부분일 수 있다. 검출성 표지의 예는 형광 표지(예를 들어 플루오레세인, 로다민, 단실, 피코에리쓰린 또는 텍사스 레드), 효소 기질 표지(예를 들어 양고추냉이 페록시다제, 알칼리성 포스파타제), 루시페라제, 글루코아밀라제, 리소자임, 글루코스 옥시다제 또는 β-D 갈락토시다제), 안정한 동위원소 또는 방사성동위원소, 발색단 부분, 디곡신, 비오틴/아비딘, DNA 분자 또는 시험용 금을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 접합체는 약동학적 변형 부분, 예를 들어 PEG(항체의 반감기를 연장시키는데 일조한다)일 수 있다. 다른 적합한 중합체는 예를 들어 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합체는 정제된 부분, 예를 들어 자기 비드일 수 있다. "세포독성 부분"은 세포에 유해하거나 또는 세포를 손상시키거나 사멸시킬 수 있는 임의의 작용제일 수 있다. 세포독성 부분의 예는 비제한적으로 패클리탁셀, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시-안트라신-디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신 및 그의 유사체, 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-머캅토구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 다카바진), 알킬화제(예를 들어 클로메틴, 티오테파 클로람부실, 멜팔란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 사이클로포스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 항생제(예를 들어 다우노루비신(이전에는 다우노마이신으로서 공지됨) 및 아드리아마이신), 항생제(예를 들어 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신으로서 공지됨), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 암피실린(AMC)), 및 유사분열억제제(예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함한다.
핵산 분자 및 재조합 방법
본원의 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조할 수 있다, 예를 들어 유전 공학 재조합 기술에 의해 수득할 수 있다. 예를 들어, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 DNA 분자를 화학 합성 또는 PCR 증폭에 의해 수득할 수 있다. 생성되는 DNA 분자를 발현 벡터내에 삽입하고, 이어서 숙주 세포내에 형질감염시킨다. 이어서, 형질감연된 숙주 세포를 특정 조건하에서 배양하고, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시킨다.
본원의 항원-결합 단편을 온전한 항체 분자의 가수분해에 의해 수득할 수 있다(문헌[Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)]; 및 문헌[Brennan et al., Science 229:81 (1985)]을 참조하시오). 또한, 이들 항원-결합 단편을 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성시킬 수 있다(문헌[Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999)]; 문헌[Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)]에 리뷰되어 있다)). 예를 들어, Fab' 단편을 숙주 세포로부터 직접 수득할 수 있으며; Fab' 단편을 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다(Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). 또한, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양 배지로부터 직접 단리할 수 있다. 당업자는 이들 항원-결합 단편을 제조하기 위한 다른 기법을 충분히 알고 있다.
일부 특정한 구현예에서, 본원에 제공된 항-CEACAM5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
1) 물질로서 암태아 항원 세포부착 분자 5를 과발현하는 CHO 세포주로 면역된 Balb/c 마우스를 사용하고, 마우스 골수종 세포주 SP2/0-AG14로부터 비장 세포를 추출하고 융합시켜 항-CEACAM5 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 하이브리도마 세포를 수득하고;
2) 단계 1)에서 수득된 하이브리도마 세포주에서 항-CEACAM5 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유전자를 클로닝 및 발현시키고;
3) 발현 벡터를 제공하고, 발현 벡터는 단계 2)에서 클로닝된 유전자 및 유전자에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하며;
4) 단계 3)에 기재된 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고;
5) 단계 4)에서 수득된 숙주 세포를 배양하고;
6) 분리 및 정제시켜 단클론 항체를 수득한다.
또 다른 태양에서, 본원은 상기 제조 방법에 사용되는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
본원에서, 특정한 항-CEACAM5 항체를 분비하는 인간-마우스 하이브리도마를 제조하고, 항체의 중쇄 및 경쇄 서열(100% 인간 유전자)을 분자 생물학 기법을 사용하여 클로닝하고, 항체가 CHO 세포에 의해 발현되고 생성되도록 항-인간 암태아 항원 세포부착 분자 5 인간 단클론 항체를 구성한다. 기존 항체와 비교하여, 이들 항체는 약물로서 보다 강한 결합 능력 및 특이성을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본원은 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 그의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호 14 및/또는 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 암호화 서열을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 상술한 바와 같은 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터)를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본원의 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 등이다.
몇몇 구현예에서, 벡터는 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역을 암호화하는 제1 뉴클레오티드, 및/또는 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 벡터상에 제공된다.
또 다른 태양에서, 본원은 상술한 바와 같은 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 세포이다. 몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 인간, 쥐, 양, 말, 개 또는 고양이 세포이다. 몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 중국 햄스터 난소 세포이다.
또 다른 태양에서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법을 제공하며, 방법은 상술한 바와 같은 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 숙주 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 회수함을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 분자를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 이중특이성 또는 다중특이성 분자는 CEACAM5에 특이적으로 결합하며, 하나 또는 다수의 다른 표적에 추가로 특이적으로 결합한다. 몇몇 구현예에서, 이중특이성 또는 다중특이성 분자는 제2 표적에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 분자(예를 들어 제2 항체)를 추가로 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 치료제를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 몇몇 구현예에서, 치료제는 세포독성제 중에서 선택된다. 몇몇 구현예에서, 치료제는 알킬화제, 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신-키나제 억제제, 방사성핵종제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 몇몇 구현예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)이다.
당해 분야에 주지된 유전 공학 기법을 사용하여, 본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 상응하는 DNA 암호화 서열로 전환시킬 수 있다. 유전 암호의 축퇴로 인해, 전환에 의해 획득된 DNA 서열은 완전하게 일치할 수는 없지만, 암호화된 단백질 서열은 변하지 않은 채로 남는다.
당해 분야에 주지된 재조합 기법을 사용하여, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 클로닝(DNA의 증폭) 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포내에 도입시킬 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체 및 그의 항원-결합 단편을 당해 분야에 공지된 상동성 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 다양한 벡터를 입수할 수 있다. 벡터 성분은 대개 비제한적으로 하기 중 2개 이상을 포함한다: 신호 서열, 복제 기원, 하나 또는 다수의 마커 유전자, 인헨서 서열, 프로모터(예를 들어 SV40, CMV, EF-1a) 및 전사 종결 서열.
일부 구현예에서, 벡터 시스템은 포유동물, 세균, 효모 시스템 등을 포함하며, 비제한적으로 pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pELpGEMEX, pGEX, pCLpCMV, pEGFP, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS420, pLexA, pACT2를 포함한 플라스미드와 같은 벡터 및 실험실로부터 수득되거나 상업적으로 입수할 수 있는 다른 벡터를 포함할 것이다. 적합한 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터(예를 들어 복제-결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함할 수 있다.
항체 및 그의 항원-결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 클로닝 또는 유전자 발현을 위해 숙주 세포내에 도입시킬 수 있다. 본원에서 벡터 중의 DNA의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물 세포, 효모 또는 상기 언급한 고등 진핵생물 세포이다. 본원에 사용하기에 적합한 원핵생물 세포는 세균, 예를 들어 그람-음성 세균 또는 그람-양성 세균, 예를 들어 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)), 엔테로박터 스페시즈(Enterobacter spp.), 에르위니아 스페시즈(Erwinia spp.), 클렙시엘라 스페시즈(Klebsiella spp.), 프로테우스 스페시즈(Proteus spp.), 살모넬라 스페시즈(Salmonelpla spp.), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 스페시즈(Serratia spp.), 예를 들어 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 시겔라 스페시즈(Shigella spp.), 및 바실러스 스페시즈(Bacillus spp.), 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 슈도모나스 스페시즈(Pseudomonas spp.), 예를 들어 슈노모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다.
원핵생물 세포 외에, 진핵생물 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모가 또한 항체를 암호화하는 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지아에, 또는 빵효모가 가장 통상적으로 사용되는 하등 진핵생물 숙주 미생물이다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 보다 통상적으로 사용되며 본원에 적용가능하다, 예를 들어 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis)(ATCC12424), 클루이베로마이세스 불가리스(Kluyveromyces bulgaricus)(ATCC16045), 클루이베로마이세스 웨이치이(Kluyveromyces weichii)(ATCC24178), 클루이베로마이세스(ATCC56500), 클루이베로마이세스 드로소필라(Kluyveromyces drosophila)(ATCC36906), 클루이베로마이세스 써모톨레란스(Kluyveromyces thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus): 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)(EP402226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP183070); 칸디다(Candida): 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)(EP244234); 뉴로스포라(Neurospora); 슈반 효모, 예를 들어 슈반니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 쿠르불라리아(Curvularia), 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 예를 들어 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 및 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger).
본원에 제공된 글리코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 있다. 다양한 바큘로바이러스 균주 및 그의 변체뿐만 아니라, 하기와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 발견되었다: 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(애벌레), 아에데스 아에지프티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에). 형질감염에 사용되는 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스 및 봄빅스 모리 핵 다면체 바이러스의 Bm-5 변체를 공개적으로 입수할 수 있다. 이들 바이러스는 본원에 사용될 수 있다, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염에 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다.
그러나, 가장 흥미로운 것은 척추 세포이며, 척추 세포의 배양(조직 배양물)이 통상적인 공정이 되었다. 입수가능한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40-형질전환된 원숭이 신장세포주 CV1(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배 신장세포주(293 또는 현탁 배양된 293 세포 서브클론, Graham et al.,]. Gen Virol. 36:59 (1977)); 어린 햄스터 신장세포(B blood, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4216 (1980)); 마우스 세르톨리세포(TM4, Mather JP, Biol. Reprod. 23:243-252 (1980)); 원숭이 신장세포(CV1ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포(W138, ATCC CCL75); 인간 간세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(HepG2)를 포함한다. 몇몇 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 293F 세포이다.
숙주 세포에 항체 및 그의 항원-결합 단편을 생성시킬 수 있는 상기 언급한 발현 또는 클로닝 벡터를 도입시키고, 이를 통상적인 영양 배지에서 배양하였으며, 여기에서 영양 배지는 세포의 프로모터 유도 및 선택적인 형질전환 또는 표적 서열을 암호화하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된다.
항체 및 그의 항원-결합 단편의 생성을 위해 본원에 사용된 숙주 세포를 당해 분야에 주지된 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 배지는 당해 분야에 공지된 적합한 농도의 임의의 다른 필요 첨가제를 추가로 함유할 수 있다. 배지의 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현용 숙주 세포를 선택하기 위해 앞서 사용된 조건이며, 당업자에게 주지되어 있다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내에, 원형질막 주위공간에 생성되거나, 또는 배양 배지로부터 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에 생성되는 경우, 숙주 세포의 미립자 잔사 또는 용해된 단편을 먼저, 예를 들어 원심분리 또는 초음파에 의해 제거한다. 문헌[Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]은 이 콜라이의 원형질막 주위공간내에 분비된 항체의 분리 방법을 기재한다. 간단히, 세포 페이스트를 우라닐 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 PMSF의 존재하에서 30분 넘게 용융시킨다. 원심분리를 수행하여 세포 찌꺼기를 제거한다. 항체가 배양 배지내에 분비되는 경우, 대개는 상업적으로 입수할 수 있는 단백질 농축 필터, 예를 들어 Iamicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 먼저 사용하여 발현 시스템의 상등액을 농축시킨다. 상기 단계 중 어느 하나에서, 단백질 분해를 억제하기 위한 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF, 및 우연한 오염물질의 증식을 방지하기 위한 항생제를 첨가할 수 있다.
세포로부터 생성된 항체를 정제 방법, 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, DEAE-셀룰로스 이온 교환 크로마토그래피 컬럼, 암모늄 설페이트 침전, 염석, 및 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있으며, 여기에서 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 항체의 유형 및 항체 중 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 존재가, 단백질 A가 친화성 리간드로서 적합한지의 여부를 결정한다. 단백질 A를 사용하여 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기반으로 항체를 정제할 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:13 (1983)). 단백질 G는 모든 쥐 동형 및 인간 γ3에 적합하다(Guss et al., EMBO J. 5:1567 1575 (1986)). 아가로스가 가장 통상적으로 사용되는 친화성 리간드 부착 기질이지만, 다른 기질도 또한 사용될 수 있다. 기계적으로 안정한 기질, 예를 들어 조절된 기공 유리 또는 폴리스티렌은 아가로스와 비교하여 보다 빠른 유속 및 보다 짧은 가공 시간을 성취할 수 있다. 항체가 CH3 도메인을 함유하는 경우, 이를 Bakerbond ABX.TM 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N. J.)로 정제할 수 있다. 다른 단백질 정제 기법, 예를 들어 이온 교환 컬럼에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카젤 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어 폴리아스파테이트 컬럼)에 기반한 헤파린 세파로스 크로마토그래피, 크로마토그래피 포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전을, 수득하고자 하는 항체에 따라 정할 수 있다.
임의의 예비 정제 단계 후에, 관심 항체 및 불순물을 함유하는 혼합물을 약 2.5 내지 4.5의 pH를 갖는 용출 완충제를 사용하여, 바람직하게는 저염 농도(예를 들어 약 0 내지 0.25 M의 염 농도)로 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 처리할 수 있다.
약학 조성물 및 치료학적 용도
또 다른 태양에서, 본원은 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원의 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 본원의 면역접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
몇몇 구현예에서, 약학 조성물은 또한 추가적인 약학 활성제를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 추가적인 약학 활성제는 항-종양 활성을 갖는 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자-표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스이다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 분자 또는 면역접합체 및 추가적인 약학 활성제를 별도의 성분으로써 또는 동일한 조성물의 성분으로서 제공한다. 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 추가적인 약학 활성제를 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여할 수 있다.
본원은 항체 및 하나 또는 다수의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 추가로 제공한다.
본원에 개시된 약학 조성물에 사용된 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 약학적으로 허용가능한 액체, 젤 또는 고체 담체, 수성상 매질, 비-수성상 매질, 항균 물질, 등장성 물질, 완충제, 산화방지제, 마취제, 현탁제/분산제, 통합제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 당해 분야에 공지된 다른 성분, 또는 상기 중 임의의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 성분은 예를 들어 산화방지제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 보존제, 윤활제, 풍미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 안정제, 예를 들어 당 및 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다. 적합한 산화방지제는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 나트륨 티오설페이트, 백금, 카탈라제, 시트르산, 시스테인, 머캅토글리세롤, 티오글리콜산, 머캅토소르비톨, 부틸메틸아니솔, 부틸화된 하이드록시톨루엔 및/또는 프로필 갈레이트를 포함할 수 있다. 메티오닌과 같은 하나 또는 다수의 산화방지제가 본원에 개시된 항체를 함유하는 조성물 중에 존재하는 경우, 항체의 산화가 감소될 수 있다. 산화의 감소는 결합 친화성의 감소를 방지하거나 감소시킬 수 있으며, 이는 항체 안정성의 개선 및 저장수명의 연장으로 이어질 수 있다.
더욱 또한, 약학적으로 허용가능한 담체는 예를 들어 수성 매질, 예를 들어 염화 나트륨 주사, 링거액 주사, 등장성 덱스트로스 주사, 멸균수 주사, 또는 글루코스 및 락테이트 링거 주사, 비-수성 매질, 예를 들어 식물-유래된 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 또는 땅콩유, 세균 또는 진균 억제 농도의 항균 물질, 등장성제, 예를 들어 염화 나트륨 또는 글루코스, 완충제, 예를 들어 포스페이트 또는 시트레이트 완충제, 산화방지제, 예를 들어 나트륨 비설파이트, 국소 마취제, 예를 들어 프로카인 하이드로클로라이드, 현탁 보조제 및 분산제, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 또는 폴리비닐피롤리돈, 유화제, 예를 들어 폴리소르베이트 80(트윈-80), 통합 시약, 예를 들어 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸 에테르)테트라아세트산), 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 나트륨 하이드록사이드, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함할 수 있다. 담체로서 항균제를 수회-용량 용기 중의 약학 조성물에 가할 수 있으며, 페놀 또는 크레졸, 수은 제제, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 파라벤, 메르티올레이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 및 트리에틸벤조늄 클로라이드를 포함한다. 적합한 부형제는 예를 들어 수, 염, 글루코스, 글리세롤 또는 에탄올을 포함할 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질은 예를 들어 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해제, 또는 나트륨 아세테이트, 솔비탄 라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 또는 사이클로덱스트린을 포함할 수 있다.
약학 조성물은 액체 용액, 현탁액, 유화액, 환제, 캡슐, 정제, 서방성 제형 또는 분말일 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예를 들어 약제 등급 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 약학 조성물을 주사용 조성물로서 제형화할 수 있다. 주사용 약학 조성물을 임의의 통상적인 형태, 예를 들어 액체 용액, 현탁액, 유화액, 또는 액체 용액, 현탁액 또는 유화액의 생성에 적합한 임의의 고체 형태로 제조할 수 있다. 주사 제제는 현재 사용되는 멸균 및/또는 무-발열원 용액, 사용전에 용매와 합하는 멸균 건조 용매, 예를 들어 동결건조된 분말, 예를 들어 피하 정제, 바로 주사가능한 멸균 현탁액, 사용전에 매질과 합하는 멸균 무수 불용성 생성물, 및 멸균 및/또는 무-발열원 유화액을 포함할 수 있다. 용매는 수성상 또는 비-수성상일 수 있다.
일부 구현예에서, 단위-용량 주사 제제를 앰풀, 튜브, 또는 바늘이 있는 주사기에 패키징한다. 주사 투여용 제제는 모두 멸균성이고 무-발열원이어야 함은 당해 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 적합한 용매에 용해시킴으로써 멸균 동결건조된 분말을 제조할 수 있다. 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 환원된(reconstituted) 용액을 개선시키거나, 또는 분말 또는 환원된 용액을 개선시킬 수 있는 일종의 다른 약물학적 성분을 함유할 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 수, 글루코스, 솔비톨, 프럭토스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세롤, 글루코스, 갈색당 또는 다른 적용가능한 물질을 포함한다. 용매는 완충제, 예를 들어 시트레이트 완충제, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트 완충제, 또는 당업자에게 공지된 다른 완충제를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 완충제의 pH는 중성이다. 용액에 당해 분야에 공지된 표준 조건하에서 후속적인 여과 및 멸균을 수행하고, 이어서 동결건조시켜 이상적인 제형을 수득한다. 하나의 구현예에서, 생성 용매를 작은 바이알에 나누고 동결건조시킨다. 각각의 바이알은 단일 용량 또는 수회 용량의 항-CEACAM5 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 각 바이알 중의 충전량은 각각의 용량 또는 수회 용량에 필요한 경우보다 약간 더 높을 수 있으며(예를 들어 10% 과용량), 따라서 정확한 샘플링 및 정확한 투여를 보장한다. 동결건조된 분말을 적합한 조건하에서, 예를 들어 약 4℃ 내지 실온의 범위에서 보관할 수 있다.
동결건조된 분말을 주사용수로 재-용해시켜 주사 투여용 제제를 수득한다. 하나의 구현예에서, 동결건조된 분말을 멸균 무-발열원수 또는 다른 적합한 액체 담체에서 환원시킬 수 있다. 그의 정확한 양은 선택된 치료법에 의해 결정되며 실험값을 근거로 결정될 수 있다.
항체 유도체화 및 면역접합체
본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 유도체화할 수 있다, 예를 들어 또 다른 분자(예를 들어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)에 연결할 수 있다. 일반적으로, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유도체화(예를 들어 표지화)는 CEACAM5에의 그의 결합에 불리한 영향을 미치지 않을 것이다. 따라서, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 상기와 같은 유도체화 형태를 포함하고자 한다. 예를 들어 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 하나 또는 다수의 다른 분자 그룹, 예를 들어 또 다른 항체(예를 들어 이중특이성 항체를 형성시키기 위해), 검출 시약, 약학 시약, 및/또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 또 다른 분자(예를 들어 아비딘 또는 폴리히스티딘 태그)에의 결합을 매개할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드에 기능적으로 연결시킬 수 있다(화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유 연결 또는 다른 수단에 의해). 또한, 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 또한 화학적 그룹, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸, 또는 글리코실로 유도체화할 수 있다. 이들 그룹을 사용하여 항체의 생물학적 성질을 개선시킬 수 있다, 예를 들어 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다.
따라서, 하나의 태양에서, 본원은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합된 치료제를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 치료제는 세포독성제 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 치료제는 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 및 이들의 임의의 조합 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체(ADC)이다.
키트 및 검출 용도
본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하며, 기본적으로 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8 단백질에 결합하지 않고, CEACAM6 단백질에 단지 약하게 결합한다. 따라서 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출시 보다 높은 특이성 및 정확성을 갖는다.
따라서, 또 다른 태양에서, 본원은 본원의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원의 접합체를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질) 또는 비오틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 특이적으로 인식하는 제2 항체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 항체는 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질), 또는 비오틴을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원의 키트는 상응하는 검출성 표지를 검출되게 하는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출성 표지가 효소인 경우, 키트는 또한 상응하는 효소에 대한 색원성 기질, 예를 들어 양고추냉이 페록시다제의 경우 o-페닐렌디아민(OPD), 및 알칼리성 포스파타제의 경우 테트라메틸벤지딘(TMB), ABTS 또는 루미놀 화합물, 또는 p-니트로페닐 포스페이트(p-NPP) 또는 AMPPD를 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출성 표지가 화학발광 시약(예를 들어 아크리딘 에스테르 화합물)인 경우, 키트는 예비-여기 용액 및/또는 화학발광용 여기 용액을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 키트의 제조에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공하며, 키트는 종양이 CEACAM5를 표적화하는 항-종양 요법에 의해 치료될 수 있는지의 여부를 검출하기 위해 사용된다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지를 갖는다.
몇몇 구현예에서, CEACAM5는 인간 CEACAM5이다.
몇몇 구현예에서, 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본원은 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 생물학적 샘플 중의 CEACAM5의 존재 또는 수준을 검출하는데 사용된다. 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 검출성 표지에 접합된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 표지되지 않은 항체를 포함하며, 표지되지 않은 항체에 결합할 수 있는 표지된 2차 항체를 추가로 포함한다. 키트는 사용 설명서, 및 키트 중의 각각의 성분을 분리시키는 포장재를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 항체를 ELISA 또는 면역크로마토그래피 분석과 같은 샌드위치 분석용 기질 또는 장비에 연결시킨다. 적합한 기질 또는 장비는 예를 들어 미세플레이트 및 시험 페이퍼일 수 있다.
키메라 항원 수용체
또 다른 태양에서, 본원은 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 항원-결합 도메인은 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 항원-결합 도메인은 scFv이다.
몇몇 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포)에 의해 발현된다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 키메라 항원 수용체를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며; 일부 구현예에서 이는 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는데 사용된다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 단리된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)이다.
몇몇 구현예에서, 숙주 세포는 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)이다.
검출 방법 및 치료 방법
다수의 악성 종양에서, CEACAM5의 과발현을 종양 생물마커로서 사용할 수 있다. 따라서, 환자의 혈액 중 CEACAM5의 측정을 암의 예후 및 억제에 사용할 수 있으며, CEACAM5의 표적요법이 또한 잠재적인 암 치료 방법이 되었다. 본원의 항체(예를 들어 UM05-5L 및 hUM05-3)는 높은 친화성과 높은 특이성으로 CEACAM5 단백질에 결합할 수 있고, ADCC 활성을 가지며, 이는 종양 성장을 억제하고 종양 세포를 사멸할 수 있다.
따라서, 또 다른 태양에서, 본원은 또한 CEACAM5를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하고/하거나 종양 세포를 사멸하는 방법을 제공하며, 방법은 종양 세포를 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 면역접합체, 또는 약학 조성물, 또는 키메라 항원 수용체, 또는 숙주 세포와 접촉시킴을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 세포 표면상의 CEACAM5의 발현 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 방법은 종양 세포를 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 면역접합체, 또는 약학 조성물, 또는 키메라 항원 수용체, 또는 숙주 세포와 접촉시켜, 세포 표면상의 CEACAM5의 발현 수준을 감소시킴을 포함하며; 여기에서 세포는 그의 표면상에 CEACAM5를 발현한다.
몇몇 구현예에서, 세포는 CEACAM5를 발현하는 종양 세포이다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 피실험자(예를 들어 인간)에서 종양을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 종양의 예방 및/또는 치료가 필요한 피실험자에게 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 면역접합체, 또는 약학 조성물, 또는 키메라 항원 수용체, 또는 숙주 세포를 투여함을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 종양은 CEACAM5를 발현한다.
몇몇 구현예에서, 종양은 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 수반한다. 몇몇 구현예에서, CEACAM5는 종양 세포의 표면상에서 발현된다.
몇몇 구현예에서, 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 피실험자는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
몇몇 구현예에서, 방법은 항-종양 활성을 갖는 추가적인 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자-표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스를 투여함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 방법은 추가적인 항-종양 요법, 예를 들어 수술, 화학요법, 방사선요법, 표적요법, 면역요법, 호르몬요법, 유전자요법, 또는 완화요법을 투여함을 추가로 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 피실험자(예를 들어 인간)에서 종양의 예방 및 치료를 위한 약제의 제조에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 면역접합체, 또는 약학 조성물, 또는 키메라 항원 수용체, 또는 숙주 세포의 용도를 제공한다.
몇몇 구현예에서, 약제는 추가적인 약학 활성제를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에서, 추가적인 약학 활성제는 항-종양 활성을 갖는 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자-표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스이다.
몇몇 구현예에서, 종양은 CEACAM5를 발현한다.
몇몇 구현예에서, 종양은 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 수반하며; 바람직하게 CEACAM5는 종양 세포의 표면상에서 발현된다.
몇몇 구현예에서, 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에서, 피실험자는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 샘플 중 CEACAM5(예를 들어 인간 CEACAM5)의 존재 또는 양을 검출하는 방법을 제공하며, 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(1) 샘플을 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
(2) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CEACAM5를 포함하는 복합체의 형성을 검출하거나, 또는 복합체의 양을 검출한다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지를 포함한다.
몇몇 구현예에서, CEACAM5는 인간 CEACAM5이다.
또 다른 태양에서, 본원은 또한 종양이 CEACAM5를 표적화하는 항-종양 요법에 의해 치료될 수 있는지의 여부를 결정하는 방법을 제공하며, 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(1) 종양의 세포를 함유하는 샘플을 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
(2) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CEACAM5를 포함하는 복합체의 형성을 검출한다.
몇몇 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출성 표지를 갖는다.
몇몇 구현예에서, CEACAM5는 인간 CEACAM5이다.
몇몇 구현예에서, 종양은 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본원은 또한 치료가 필요한 피실험자에게 치료 유효량의 본원에 기재된 항체를 투여함을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본원에 제공된 항체의 치료 유효량은 당해 분야에 공지된 다양한 인자, 예를 들어 체중, 연령, 과거 병력, 현행 치료, 피실험자의 건강 상태 및 교차-감염 가능성, 알러지, 과민성 및 부작용, 및 투여 경로 및 종양 발생 정도에 따라 변한다. 당업자(예를 들어 의사 또는 수의사)는 이들 또는 다른 조건 또는 요건에 따라 양을 비례적으로 감소시키거나 증가시킬 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본원에 제공된 항체를 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏의 치료 유효 용량으로 투여할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체를 약 50 ㎎/㎏ 이하의 용량으로 투여한다. 일부 구현예에서, 투여 용량은 10 ㎎/㎏ 이하, 5 ㎎/㎏ 이하, 1 ㎎/㎏ 이하, 0.5 ㎎/㎏ 이하, 또는 0.1 ㎎/㎏ 이하이다. 특정한 용량을 다수의 간격으로, 예를 들어 하루에 1회, 하루에 2회 이상, 한 달에 2회 이상, 한 주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 한 달에 1회, 또는 2달 이상 마다 1회로 투여할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 투여 용량은 치료 과정에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 구현예에서 초기 투여 용량이 후속 투여 용량보다 더 높을 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 용량을 치료 과정 동안 투여에 대한 피실험자의 반응에 따라 조절한다.
투여량 섭생을 최적의 반응(예를 들어 치료 반응)을 성취하기 위해 조절할 수 있다. 예를 들어, 투여를 단일 용량으로 또는 일정 기간에 걸쳐 수회의 분할 용량으로 수행할 수 있다.
본원에 개시된 항체를 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 주사 투여(예를 들어 피하 주사, 복강내 주사, 정맥내 점적 주사를 포함한 정맥내 주사, 근육내 주사 또는 피내 주사), 또는 비-주사 투여(예를 들어 경구 투여, 코 투여, 설하 투여, 직장 투여, 또는 국소 투여)에 의해 투여할 수 있다.
몇몇 구현예에서, 항체를 그의 분자 기전과 연관된 질병, 예를 들어 종양 및 암, 예를 들어 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B 세포 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종의 치료에 사용할 수 있다.
용도
본원은 항체의 사용 방법을 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 본원은 치료 유효량의 본원에 기재된 항체를 투여함을 포함하는, 개인에서 항체의 기전과 관련된 상태 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 항체를 단독으로 또는 하나 또는 다수의 다른 치료 수단 또는 물질과 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 항체를 화학요법, 방사선요법, 암 치료 수술(예를 들어 종양 절제), 항바이러스 약물, 하나 또는 다수의 구토방지 약물 또는 화학요법-유발된 합병증에 대한 다른 요법, 또는 암 또는 바이러스에 대한 임의의 다른 치료 물질과 함께 사용할 수 있다. 일부 상기와 같은 구현예에서, 본원에 개시된 항체를 하나 또는 다수의 치료 물질과 함께 사용하는 경우, 이를 하나 또는 다수의 치료 물질과 동시에 투여할 수 있다. 일부 상기와 같은 구현예에서, 항체를 동일한 약학 조성물의 부분으로서 동시에 투여할 수 있다. 그러나, 또 다른 치료 물질과 "함께 사용되는" 항체를 치료 물질과 동시에 또는 동일한 조성물 중에서 투여할 필요는 없다. 본원에서 "함께 사용되는"의 의미는 또한 또 다른 물질 전 또는 후에 투여되는 항체가, 항체 및 제2 물질이 상이한 방식으로 투여된다 하더라도, 치료 물질과 "함께 사용되는" 것으로 간주됨을 포함한다. 가능한 경우, 본원에 개시된 항체와 함께 사용되는 다른 치료 물질을, 상기 다른 치료 물질의 제품 설명을 참조하여 투여하거나, 또는 외과 의사의 처방집 2003(Physicians' Desk Reference, 57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002))을 참조하거나, 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 참조할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료 물질은 암에 대한 면역 반응을 유도하거나 증대시킬 수 있다. 예를 들어, 종양 백신을 사용하여 특정 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 사이토카인 요법을 사용하여 면역계에 대한 종양 항원의 제시를 증가시킬 수 있다. 사이토카인 요법의 예는 비제한적으로 인터페론, 예를 들어 인터페론 α, β 및 γ, 콜로니 자극 인자, 예를 들어 대식세포 CSF, 과립구 대식세포 CSF 및 과립구 CSF, 및 인터류킨, 예를 들어 IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 및 IL-12, 종양 괴사인자, 예를 들어 TNF-α 및 TNF-β를 포함한다. 면역억제 표적을 불활성화시키는 시약을 또한 사용할 수 있으며, 예로는 PD-1 항체, TGF-β 억제제, IL-10 억제제, 및 Fas 리간드 억제제가 있다. 시약의 또 다른 그룹은 종양 또는 암세포에 대한 면역 반응을 활성화시키는 것, 예를 들어 T 세포 활성화(예를 들어 T 세포 공동자극 신호전달 경로, 예를 들어 CTLA-4, ICOS, OX40, 4-1BB 등과 같은 경로)를 증가시키는 것, 및 수지상 세포기능 및 항원 제시를 개선시키는 것을 포함한다.
하기의 실시예는 본원을 보다 양호하게 예시하고자 하며, 본원의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 하기의 특정한 조성물, 물질 및 방법은 모두 전적으로 또는 부분적으로 본원의 범위내에 있다. 이들 특정한 조성물, 물질 및 방법은 본원을 제한하고자 하는 것이 아니라, 본원의 범위내에 있는 특정 구현예를 예시하기 위한 것이다. 당업자는 창의성의 부가 없이 본원의 범위로부터 이탈되지 않고 균등한 조성물, 물질 및 방법을 개발할 수 있다. 본원의 방법에 대해 수행된 다양한 변화는 여전히 본원의 범위내에 있을 수 있음은 물론이다. 본 발명자는 상기와 같은 변화를 본원의 범위내에 포함시키고자 한다.
서열 정보
본원에 관련된 일부 서열의 정보를 하기 표 1에 나타낸다.
[표 1]
일부 서열의 정보
서열
번호 NO:		 서열설명 서열정보
1 UM05-5L VH CDR1 DHTIH
2 UM05-5L VH CDR2 YIYPRDGNTKYNEKFKG
3 UM05-5L VH CDR3 PIYDGYSFDY
4 UM05-5L VL CDR1 RASSSVSYMH
5 UM05-5L VL CDR2 DTSKLAS
6 UM05-5L VL CDR3 QQWTRNPPT
7 UM05-5L VH QVQLQQSDADLVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLECIGYIYPRDGNTKYNEKFKGKATLTADRSSITAYMQLNSLTSEDSAVYFCARPIYDGYSFDYWGQGTTLTVSS
8 UM05-5L VL QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMAAEDAATYYCQQWTRNPPTFGAGTKLELK
9 IgG1 중쇄불변영역 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
10 IgG1 중쇄불변영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 GCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
11 κ 쇄 불변 영역 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
12 κ쇄 불변영역을 암호화하는 뉴클레오티드 CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
13 VH-G4S3-VL QVQLQQSDADLVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLECIGYIYPRDGNTKYNEKFKGKATLTADRSSITAYMQLNSLTSEDSAVYFCARPIYDGYSFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMAAEDAATYYCQQWTRNPPTFGAGTKLELK
14 UM05-5L VH 유전자 CAGGTTCAGCTGCAACAGTCTGACGCTGACTTGGTGAAACCTGGAGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGTCTCTGGCTACACCTTCACTGACCATACTATTCACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGCATTGGATATATTTATCCTAGAGATGGTAATACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGACAGATCCTCCATCACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGACCCATCTATGATGGTTACTCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
15 UM05-5L VL 유전자 CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCCGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGCGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTCGTAACCCACCTACCTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA
16 hUM05-3 VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDHTMHWMQQAPGQGLEWIGLIYPRDGSTIYNEKFQGRATLTADRSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCARPIYDGYSFDYWGQGTLVTVSS
17 hUM05-3 VL QIVLTQSPATLSASPGERATLSCRASSSVSYMHWYQQKPGQAPKRWIYDTSNRATGVPARFSGSGSGTDYTLTISSMEPEDAAVYYCQQWTRNPPTFGQGTKLELK
18 UM05-5L C47W VH QVQLQQSDADLVKPGASVKISCKVSGYTFTDHTIHWMKQRPEQGLEWIGYIYPRDGNTKYNEKFKGKATLTADRSSITAYMQLNSLTSEDSAVYFCARPIYDGYSFDYWGQGTTLTVSS
19 hUM05-3 W47C VH EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDHTMHWMQQAPGQGLECIGLIYPRDGSTIYNEKFQGRATLTADRSTDTAYMELSSLRSEDTAVYFCARPIYDGYSFDYWGQGTLVTVSS
20 hUM05-3 VH CDR1 DHTMH
21 hUM05-3 VH CDR2 LIYPRDGSTIYNEKFQG
22 hUM05-3 VL CDR2 DTSNRAT
이로운 효과
본원의 단클론 항체(예를 들어 UM05-5L, hUM05-3 항체)는 CEACAM5 단백질 또는 CEACAM5 단백질을 발현하는 세포에 높은 특이성과 선택성으로 결합할 수 있으며, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8 단백질에는 실질적으로 결합하지 않고, CEACAM6 단백질에는 단지 약하게 결합한다. 동시에, 항체 UM05-5L은 또한 ADCC 활성을 갖는다. 항체 UM05-5L에 기반하여 구성된 M05-5L-CAR은 인간 T 세포의 표면상에서 발현될 수 있고, 생체내에서 종양 세포를 인식할 수 있으며, 사이토카인을 분비하고, 강한 종양-억제 효과를 갖는다. 따라서, 본원의 단클론 항체(예를 들어 UM05-5L, hUM05-3 항체)는 높은 임상적 적용 가치를 갖는다.
도 1은 본원에서 구성된 CHO 세포주 중의 CEACAM5의 발현 수준을 도시하였으며; 통상적인 CHO 세포와 비교하여, 본원에서 구성된 CHO 세포주 중의 CEACAM5의 발현 수준은 최대 904배였다.
도 2는 ELISA 실험에서 항체 UM05-5L과 CEACAM5 단백질간의 결합 결과를 도시하였다.
도 3은 항체 UM05-5L의 LOVO 세포에의 결합 프로파일을 도시하였다.
도 4a 내지 4b는 리포터 세포주에서 항체 UM05-5L의 ADCC 활성을 도시하였으며; 여기에서 도 4a는 양성 대조군(에르비툭스 항체) 및 음성 대조군의 ADCC 활성을 도시하였고, 도 4b는 UM05-5L의 ADCC 활성을 도시하였다.
도 5a 내지 5b는 유식 세포측정의 결과를 도시하였으며; 여기에서 도 5a는 대조용 T 세포(Mock T)의 발현 효율을 도시하였고, 도 5b는 UM05-5L-CAR의 발현 효율을 도시하였다.
도 6은 UM05-5L-CAR-T 세포를 종양 세포와 혼합한 후의 사이토카인 IFNγ(좌측) 및 IL-2(우측)의 분비를 도시하였다.
도 7은 UM05-5L-CAR-T 세포 대 종양 세포 KATO3의 사멸 결과를 도시하였다.
도 8은 종양 세포 LS174T에 의해 자극된 UM05-5L-CAR-T 세포의 확대를 도시하였다.
도 9는 마우스에서 UM05-5L-CAR-T 세포의 항-종양 효능을 도시하였다.
도 10은 UM05-5L-CAR-T 세포가 주입된 마우스에서 IFNγ의 방출을 도시하였다.
도 11은 LS174T 세포에 대한 인간화된 항체 hUM05-3의 결합 프로파일을 도시하였다.
도 12는 LS174T 세포에 대한 항체 UM05-5L, UM05-5L C47W, hUM05-3 및 hUM05-3 W47C의 결합 프로파일을 도시하였다.
본원은 이제 본원을 예시하고자 하는(본원을 제한하지 않는) 하기의 실시예를 참조하여 기재될 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 분자 생물학 실험 방법 및 면역분석 방법은 기본적으로 문헌[J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 문헌[FM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]을 참조하였으며; 제한 효소를 제품 제조사에 의해 권장되는 조건에 따라 사용하였다. 실시예에서 구체적인 조건이 지시되지 않은 경우, 이는 통상적인 조건 또는 제조사에 의해 권장된 조건에 따라 수행될 것이다. 제조사의 지시 없이 사용된 시약 또는 장비는 모두 상업적으로 구입되는 통상적인 제품이었다. 당업자는 실시예가 본원을 예로서 기재하며, 본원에 의해 청구된 보호 범위를 제한하고자 하지 않음을 안다.
실시예 1: 인간 CEACAM5 단백질에 대한 단클론 항체의 획득
본원에서, CEACAM5 단백질을 과발현하는 CHO 세포주를 구성하였다. 간단히, CEACAM5 플라스미드(Beijing Yiqiao Shenzhou Technology Co., Ltd., HG11077-UT)를 CHO 세포주(ATCC)내에 형질감염시키고 발현시켰다. 플라스미드는 하이그로마이신(Hygromycin)에 내성이었으며, 따라서 상기 플라스미드로 안정하게 형질감염된 세포는 하이그로마이신을 함유하는 배지에서 안정하게 계대배양될 수 있었다. 세포를 채취하고 CEACAM5의 발현을 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, CHO-CEACAM5 세포는 FACS에 의해 검출된 바와 같이, 904-배 증가된 CEACAM5 발현을 나타내었다.
종양 환자로부터 정제된 CHO-CEACAM5 세포 및 CEACAM5 단백질(L2C01001)을 사용하여 표 2의 면역화 스케줄에 따라 5 내지 8주령의 6마리의 Balb/c 마우스(Shanghai Slack)를 면역시켰다.
[표 2]
마우스에서 면역화 스케줄
날짜 작업 항원 항원보강제
1일 복강내 주사에 의한 면역화 CHO-CEACAM5 세포 CFA
26일 복강내 주사에 의한 면역화 CHO-CEACAM5 세포 IFA
49일 복강내 주사에 의한 면역화 CHO-CEACAM5 세포 IFA
91일 복강내 주사에 의한 면역화 CEACAM5 단백질 Gerbu(MM3001)
104일 복강내 주사에 의한 면역화 CEACAM5 단백질 Gerbu(MM3001)
105일 복강내 주사에 의한 면역화 CEACAM5 단백질 Gerbu(MM3001)
106일 복강내 주사에 의한 면역화 CEACAM5 단백질 Gerbu(MM3001)
면역화 후 2일째에, 면역된 마우스의 비장 세포를 채취하고, SP2/0-AG14 세포(ATCC)와 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하고, 적합한 양의 융합된 세포를 96-웰 플레이트상에 도말하였다. 주입 후 약 10일째에, 각 웰의 상등액을 채취하고, 인간 CEACAM5에 대한 하이브리도마 세포에 의해 분비된 마우스 항체의 결합 활성을 ELISA에 의해 검출하였다.
더욱 또한, 강한 양성 ELISA 신호로 검출된 웰의 상등액을 채취하고, LOVO 세포(Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences)에 대한 그의 결합 활성을 유식 세포측정에 의해 검출하였으며, LOVO 세포에 대해 높은 결합 활성을 갖는 하이브리도마 세포를 수득하였다. 이들 세포를 서브클로닝하여 단클론 세포를 수득하였다. 표 3은 일부 하이브리도마 세포의 검출 데이터를 나타내었다.
[표 3]
CEACAM에 대한 하이브리도마 세포의 결합 결과
하이브리도마 세포 ELISA OD 값 LOVO FACS 결합
1-2C5 1.0690 12.1
1-9G3 1.0390 7.01
3-2F3 1.4480 11
3-6F5 1.3520 6.51
3-8C10 2.3030 137
3-8G8 1.9270 82.9
2A10A5 2.392 /
2A10C4 2.434 /
보다 양호한 결합 활성을 갖는 하이브리도마 세포 3-8C10을 서열분석을 위해 선택하였다. 서열분석 후에, 항체를 수득하고, 이를 UM05-5라 명명하였으며, UM05-5 항체의 CDR 서열을 카밧 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991), pages 647-669)을 사용하여 측정하고, 표 4에 나타내었다.
[표 4]
UM05-5 가변 영역 서열
단클론 항체 서열번호
VH VL 넘버링 시스템 HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
UM05-5 7 8 카밧 1 2 3 4 5 6
실시예 2: 인간-마우스 키메라 항체의 제조
표 4의 UM05-5의 서열에 따라, 인간-마우스 키메라 항체를 설계하고 발현시켰으며, UM05-5L이라 명명하였다. 간단히, 마우스 항체 VH 및 VL을 암호화하는 서열을 각각, 인간 IgG1 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열(그의 아미노산 서열을 서열번호 9에 나타내었으며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 나타내었다) 및 κ 쇄 불변 영역 서열(그의 아미노산 서열을 서열번호 11에 나타내었으며, 그의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 12에 나타내었다)에 연결시켜 인간-마우스 키메라 항체 UM05-5L을 수득하였다.
항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 포유동물 세포 발현 벡터 pcDNA3.4에 클로닝하였다. 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터를 리포펙타민 2000 형질감염 시약(Invitrogen)으로 HEK293 세포내에, 2:1의 몰비로 형질감염시키고, 37℃ 및 5% 이산화탄소에서 7일간 배양하였다. 배양 배지 상등액을 수집하고, 상등액 중의 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후에, 항체를 PBS 용액으로 투석하고, 동결-건조시키고, 농축시키고 -20℃에서 보관하였다.
실시예 3: CEACAM5 단백질에의 항체의 결합
96-웰 고-친화성 플레이트를 4℃에서 1 ㎍/㎖, 100 ㎕/웰의 농도로 인간 CEACAM5 단백질 용액으로 코팅하고 밤새 진탕시켰다. 다음날, 이를 먼저 300 ㎕의 PBST(트윈20: 0.5%)로 3회 세척하고, 이어서 100 ㎕/웰의 5% BSA/PBS로 1시간 동안 차단하고, 실온에서 진탕시켰다. 300 ㎕의 PBST로 세척을 3회 수행하였다. 일련의 항체 샘플의 희석액을 PBS로 제조하고, 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 가하고 실온에서 1시간 동안 진탕시켰다. 300 ㎕의 PBST로 세척을 3회 수행하였다. 2차 항체 염소 항-인간 IgG HRP 용액을 제조하고, 100 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 가하고, 실온에서 30분간 진탕시켰다. 300 ㎕의 PBST로 세척을 4회 수행하였다. 100 ㎕/웰의 TMB를 가하여 20분간 색상 전개를 수행하였다. 100 ㎕/웰의 0.6 N H2SO4를 가하여 색상 전개를 정지시키고, OD450 ㎚를 검출하였다. 검출 후에, 결과를 도 2에 도시하였다. CEACAM5 단백질에 대한 키메라 항체 UM05-5L의 결합의 EC50은 105.3 ng/㎖이었다.
실시예 4: CEACAM5를 발현하는 세포에 대한 항체의 결합
유식 세포측정(FACS)을 사용하여 인간 CEACAM5를 자연적으로 발현하는 LOVO 종양 세포 또는 상이한 CEACAM 패밀리 구성원을 과발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 검출하였다. 간단히, 세포를 먼저 수집하고, PBS로 세척하고, 카운트하고, 희석시켜 2*106/㎖ 세포 현탁액을 수득하고; 10 ㎕의 항체 작업 용액을 100 ㎕의 세포 현탁액에 가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 배양하고; PBS로 2회 세척 후에, 상응하는 형광-표지된 2차 항체 염소-항-인간 IgG(H+L)(Invitrogen)를 가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 배양하고, PBS로 2회 세척 후에, 400 ㎕의 FACS 완충제에 현탁시키고, 세포에 대한 항체의 결합 프로파일을 FACS에 의해 검출하였다.
3 ㎍/㎖의 농도에서 상이한 세포에 대한 키메라 항체 UM05-5L 및 대조용 항체 UM05-8(항-CEACAM5 항체, 우리 실험실에서 하이브리도마 방법에 의해 제조됨)의 상등액의 결합 프로파일을 검출하였으며, 여기에서 SW620-CEACAM1은 CEACAM1을 과발현하는 세포이고, SW620-CEACAM3은 CEACAM3을 과발현하는 세포이고, CHO-CEACAM6은 CEACAM6을 과발현하는 세포이고, CHO-CEACAM7은 CEACAM7을 과발현하는 세포이고, CHO-CEACAM8은 CEACAM8을 과발현하는 세포였다. LOVO 세포(CEACEM5를 발현하였다)에 대한 항체의 결합값(FACS의 검출 값)을 100%로 정규화하였으며, 상이한 세포(상이한 CEACAM 단백질을 발현하였다)에 대한 항체의 상대적인 결합 활성을 계산하고 결과를 표 5에 나타내었다.
[표 5]
LOVO 세포 및 상이한 CEACAM 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합
세포 명칭 UM05-5L UM05-8
LOVO 100.00% 100.00%
SW620-CEACAM1 2.01% 120.47%
SW620-CEACAM3 1.29% 91.56%
CHO-CEACAM6 26.60% 69.61%
CHO-CEACAM7 0.38% 13.71%
CHO-CEACAM8 0.40% 61.60%
표 5로부터, 키메라 항체 UM05-5L이 특히 현저한 선택성을 가짐을 알 수 있었다: 상기는 CEACAM5에 높은 친화성으로 결합하였으나, CEACAM1, CEACAM3, CEACAM7, CEACAM8에는 명백하게 결합하지 않았으며, CEACAM6에는 단지 약하게 결합하였다. 통상적인 항체(예를 들어 대조용 항체 UM05-8)는 CEACAM5에 결합할 수 있었으며, 보다 높은 수준에서 CEACAM1, CEACAM3, CEACAM6, CEACAM7 및 CEACAM8에 동시에 결합할 수 있었지만, 선택성을 나타내지 않았다.
더욱 또한, 우리는 FACS를 사용하여, 인간 CEACAM5를 자연적으로 발현하는 LOVO 종양 세포에 결합하는 키메라 항체 UM05-5L의 EC50을 검출하였다. 결과를 도 3에 나타내었으며, 여기에서 LOVO 세포에 결합하는 키메라 항체 UM05-5L의 EC50은 3173 ng/㎖이었다. 상기 결과를 근거로, 키메라 항체 UM05-5L은 CEACAM5에 대해 탁월한 결합 친화성, 특이성 및 선택성을 가졌다.
실시예 5: 항체의 ADCC 활성
표적 세포로서 LOVO 세포를 사용하여, LOVO 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트상에 20,000 세포/웰의 밀도로 접종하고, 37℃ 및 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 2일 째에, 항체 UM05-5L 및 양성 대조용 항체 에르비툭스를 배양 배지 중에 20 ㎍/㎖로 제조하고, 3배까지 희석시켜 8개의 농도를 획득하였다. LOVO 세포의 상등액 배지를 피펫팅에 의해 제거하고, 명시된 농도로 희석된 항체(양성 대조용 항체 에르비툭스, 키메라 항체 UM05-5L 또는 음성 대조용 무관련 항체)를 LOVO 세포에 30 ㎕/웰로 가하였다. 후속적으로, 효과기 세포 Jurkat/ADC((Nanjing Nuoaixin Biotechnology Co., Ltd.)를 LOVO 세포 웰에 120,000 세포/30 ㎕/웰로 도말하고, 37℃ 및 5% CO2에서 16 내지 20시간 동안 배양하였다. 배양 후에, Bright-Glo 키트(Promega, cat.E2620)를 사용하여 효과기 세포에서 루시페라제의 발현 수준을 검출하였다. 루시페라제 수준은 효과기 세포의 ADCC 활성화의 정도를 나타내었다. 도 4a는 양성 대조용 에르비툭스 항체 및 음성 대조용의 ADCC 활성을 도시하였고, 도 4b는 UM05-5L의 ADCC 활성을 도시하였다. 상기 결과를 근거로, UM05-5L은 0.85 ㎍/㎖의 EC50으로 강한 ADCC 활성을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 6: CEACAM5를 표적화하는 CAR-T 세포의 구성
2 및 3세대의 CAR-T 구조에 기반하여, 우리는 CAR-T 인식 항체로서 항-CEACAM5 단쇄 항체를 사용하였으며, 상이한 CEA-CAR 구조의 설계를 수행하기 위해 하나 또는 다수의 공동자극 성분, 예를 들어 41BB, CD28, OX40 등을 사용하였고, 세포를 감염시키고 상응하는 CAR을 발현할 수 있는 렌티바이러스를 생성시키기 위해 상응하는 렌티바이러스 플라스미드를 구성하였다. 렌티바이러스를 사용하여 종양 환자의 말초 혈액으로부터 단리된 T 세포를 감염시키고, 세포막 표면상의 상응하는 CAR 수용체를 발현하는 CAR-T 세포를 생성시킬 수 있었다. 이러한 종류의 CAR-T 세포는 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 유효하게 인식하고 사멸시킬 수 있었다. 시험관내 및 생체내 실험 모두에서, 상기 세포 면역요법은 매우 양호한 안전성 및 효능을 나타내었다.
서열번호 13에 나타낸 바와 같은 단쇄 항체 UM05-5L scFv(VH-G4S3-VL의 순서에서)를 서열 CD8α-CD137-CD3ζ-p2A-tEGFR에 결찰시켜 키메라 항원 수용체 CAR을 구성하고, 이어서 CAR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 렌티바이러스 벡터(Jike Gene, GV401)내에 클로닝하였으며, 벡터를 UM05-5L-CAR이라 명명하였다. 발현 카세트는 EF1a 프로모터-CAR-2A-tEGFR-WPRE였다.
UM05-5L-CAR 렌티바이러스 벡터 및 패키징 플라스미드를 16시간 동안 293T 세포내에 일시적으로 형질감염시키고, 배지를 바꾸고, 배양을 24 내지 48시간 동안 계속하였다. 상등액(렌티바이러스 함유)을 수집하고 -80℃에서 보관하였다.
건강한 사람들로부터 유래된 PBMC 세포를 CD3/28 항체로 24시간 동안 활성화시키고; 렌티바이러스 및 T 세포를 MOI = 3:1에 따라 혼합하고 96시간 동안 배양하고, UM05-5L-CAR의 발현을 PE 형광-표지된 세르비툭스로 검출하였다. 결과를 도 5에 나타내었다. 대조군에 비해(도 5a), UM05-5L-CAR(도 5b)은 인간 T 세포의 표면상에서 잘 발현될 수 있었다.
실시예 7: CEACAM5를 표적화하는 CAR-T 세포의 기능적 평가
1. 사이토카인 방출의 검출
UM05-5L-CAR-T 세포 및 CEACAM5-발현 종양 세포(예를 들어 KATO3 및 LS174T)를 혼합하고, 배지 대조군(단지 UM05-5L-CAR-T 세포만이 사용되었다) 및 CEACAM5 음성 세포 대조군(UM05-5L-CAR-T 세포 및 CEACAM5를 발현하지 않는 세포, 예를 들어 RKO 세포가 사용되었다)을 설정하고; 상기 두 종류의 세포를 1:1의 비로 혼합하고 16시간 동안 배양하고, 상등액 중의 방출된 IFNγ 및 IL2를 검출하였다. 결과를 도 6에 도시하였으며, 여기에서 UM05-5L-CAR-T는 CEACAM5을 발현하는 세포주를 인식하고 사이토카인 IFNγ 및 IL-2의 방출을 유도할 수 있었다.
2. 종양 세포 사멸의 검출
UM05-5L-CAR-T 및 CEACAM5-발현 종양 세포(예를 들어 KATO3)를 혼합하고 96-웰 배양 플레이트에서 명시된 E:T 비(30:1, 10:1, 3:1, 1:1, 0.3:1)로 배양하였다. Promega LDH 검출 키트를 사용하여 배양 상등액 중의 락테이트 데하이드로게나제(LDH)의 방출 기록 데이터를 검출하였다. 종양 세포 사멸의 계산 결과를 도 7에 도시하였다. 도면으로부터 UM05-5L-CAR-T가 종양 세포를 용량-의존적인 방식으로 효율적으로 사멸할 수 있음을 알 수 있었다.
3. 종양 세포에 의해 자극된 증식 실험
UM05-5L-CAR-T 세포 및 CEACAM5-발현 종양 세포(예를 들어 LS174T)를 혼합하고 E:T = 1:1에 따라 72시간 동안(IL2 보충 없이) 배양하고, 그의 증식을 세포 카운팅에 의해 검출하였다. 결과를 도 8에 도시하였다. UM05-5L-CAR-T는 CEACAM5를 발현하는 종양 세포에 의해 자극될 때 효율적으로 증식될 수 있었다.
실시예 8: LS174T 종양 모델의 생체내 약학적 효능 실험
LS174T 세포(ATCC CL-187)를 NSG 마우스(Biocytometer)내에 1x107/마우스로 피하 접종하였다. 종양 부피가 200 내지 400 ㎣에 도달하면, PBS 대조군, 변형되지 않은 T 세포 대조군(Mock T) 또는 UM05-5L CAR-T를 꼬리 정맥을 통해 각각 100 ㎕, 1x107 세포, 및 1x107 tEGFR+세포의 용량으로 투여하였다. 종양 부피 변화를 기록하고 말초 혈액 중 IFNγ 방출을 분석하였다. 결과를 도 9 및 도 10에 도시하였다. UM05-5L은 마우스 중의 LS174T 종양 세포를 인식하고 다량의 IFNγ를 방출하였으며, 그 결과 강한 종양 억제 효과가 생성되었다.
실시예 9: 인간화된 항체의 제조
IMGT 데이터베이스 중의 인간 항체 서열을 사용하여 UM05-5L 항체를 인간화하고, 인간화된 항체를 수득하였으며, 이를 hUM05-3이라 명명하였다. hUM05-3의 구체적인 서열을 표 6에 나타낸다. 항체 제조를 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히, 서열번호 16 및 서열번호 17을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 각각 합성하고, 발현 벡터내에 클로닝하고, HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 배양 후에, 상등액을 수집하고 상등액 중의 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제 후에, 항체를 PBS 용액으로 투석하고, 동결-건조 및 농축시키고, -20℃에서 보관하였다.
[표 6]
hUM05-3 가변 영역 서열
단클론 항체 서열번호
VH VL HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3
hUM05-3 16 17 20 21 3 4 22 6
실시예 10: 인간화된 항체의 결합 능력
LS174T 세포(CEACAM5의 높은 발현을 갖는 종양 세포)를 10% FBS를 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양하였다. LS174T 세포를 TrypLE 트립신으로 절단 후에, 세포를 원심분리하고 2% BSA를 함유하는 DPBS 용액(FACS 완충제, 4℃)에 재현탁시키고; 이어서 세포를 5x105/100 ㎕/웰로 U-모양 바닥 96-웰 플레이트에 가하고, 일련의 항체 희석액을 U-모양 바닥 96-웰 플레이트에 가하고, 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 혼합물을 원심분리하고 생성된 상등액을 버리고; 100 ㎕의 2차 항체(항-인간 IgG Fc-APC)를 각 웰에 가하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 세포를 FACS 완충제로 1회 세척하고, 200 ㎕ FACS 완충제에 재현탁시키고, 형광 신호 값을 BD C6 플러스에서 판독하였다.
실험 결과를 도 11에 도시한다. 결과는 인간화된 항체 hUM05-3이 LS174T 세포에 용량-의존적인 방식으로 결합할 수 있음을 보였다.
실시예 11: 항체의 돌연변이
인간-마우스 키메라 항체 UM05-5L VH의 47번째 아미노산(Cys)을 Trp로 돌연변이시키고, 돌연변이된 항체를 UM05-5L C47W라 명명하고; 인간화된 항체 hUM05-3 VH의 47번째 아미노산(Trp)을 Cys로 돌연변이시키고, 돌연변이된 항체를 hUM05-3 W47C라 명명하였다. 돌연변이된 항체의 가변 영역 서열을 표 7에 나타내었다. 실시예 10에 기재된 바와 같이, LS174T 세포에 결합하는 항체의 능력을 시험하였다. 실험 결과를 도 12 및 표 8에 나타내었다. 결과는 인간-마우스 키메라 항체 UM05-5L 및 인간화된 항체 hUM05-3이 돌연변이 전후에 CEACAM5를 발현하는 세포에 결합할 수 있음을 보였다.
[표 7]
돌연변이된 항체의 서열
VH VL
UM05-5L C47W 서열번호 18 서열번호 8
hUM05-3 W47C 서열번호 19 서열번호 17
[표 8]
항원에 결합하는 능력
단클론 항체 EC50 ㎍/㎖ Emax MFI(평균 형광 강도）
UM05-5L 0.81 79739
UM05-5L C47W 2.46 55153
hUM05-3 0.53 52929
hUM05-3 W47C 1.47 34403
SEQUENCE LISTING <110> BIOTHEUS INC. <120> Anti-CEACAM5 monoclonal antibody and preparation method thereof and use thereof <130> IEC200021PCT <150> 201910481112.6 <151> 2019-06-04 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VH CDR1 <400> 1 Asp His Thr Ile His 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VH CDR2 <400> 2 Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VH CDR3 <400> 3 Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VL CDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VL CDR2 <400> 5 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VL CDR3 <400> 6 Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VH <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ile Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L VL <400> 8 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Ala Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> artificial <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 993 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding IgG1 heavy chain constant region <400> 10 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggaccccc 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993 <210> 11 <211> 107 <212> PRT <213> artificial <220> <223> ┟ chain constant region <400> 11 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 12 <211> 324 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Nucleotide sequence encoding ┟ chain constant region <400> 12 cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagttcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg ttga 324 <210> 13 <211> 240 <212> PRT <213> artificial <220> <223> VH-G4S3-VL <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Cys Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ile Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 130 135 140 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser 165 170 175 Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 195 200 205 Ser Ser Met Ala Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 210 215 220 Thr Arg Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 225 230 235 240 <210> 14 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220> <223> UM05-5L VH gene <400> 14 caggttcagc tgcaacagtc tgacgctgac ttggtgaaac ctggagcttc agtgaagata 60 tcctgcaagg tctctggcta caccttcact gaccatacta ttcactggat gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggaatg cattggatat atttatccta gagatggtaa tactaagtac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca gatcctccat cacagcctac 240 atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagacccatc 300 tatgatggtt actcctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> artificial <220> <223> UM05-5L VL gene <400> 15 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgcc gtgccagctc aagtgttagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggcggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actcgtaacc cacctacctt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <210> 16 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 VH <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Thr Met His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 VL <400> 17 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Arg Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 18 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> UM05-5L C47W VH <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Thr Ile His Trp Met Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Ile Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 W47C VH <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Thr Met His Trp Met Gln Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Cys Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Ile Tyr Asp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 VH CDR1 <400> 20 Asp His Thr Met His 1 5 <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 VH CDR2 <400> 21 Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> artificial <220> <223> hUM05-3 VL CDR2 <400> 22 Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr 1 5

Claims (25)

  1. CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로,
    (a) 하기 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
    (i) 하기의 서열: 서열번호 1, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR1,
    (ii) 하기의 서열: 서열번호 2, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR2, 및
    (iii) 하기의 서열: 서열번호 3, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VH CDR3; 및/또는
    (b) 하기 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
    (iv) 하기의 서열: 서열번호 4, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR1,
    (v) 하기의 서열: 서열번호 5, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR2, 및
    (vi) 하기의 서열: 서열번호 6, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열로 이루어지는 VL CDR3
    을 포함하고;
    바람직하게, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나에 기재된 치환이 보존적 치환이고;
    바람직하게, (i) 내지 (vi) 중 어느 하나에 기재된 CDR이 카밧(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 정의되고;
    바람직하게, 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 1 또는 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 2 또는 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 5 또는 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고;
    바람직하게, 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 2에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 5에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하고;
    바람직하게, 하기 3개의 중쇄 CDR: 서열번호 20에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR1, 서열번호 21에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR2, 및 서열번호 3에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VH CDR3; 및/또는 하기 3개의 경쇄 CDR: 서열번호 4에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR1, 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR2, 및 서열번호 6에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL CDR3을 포함하는
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. CEACAM5 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로,
    (i) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR1;
    (ii) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR2;
    (iii) 서열번호 7, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역(VH) 중에 함유된 바와 같은 VH CDR3; 및/또는
    (iv) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR1;
    (v) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR2;
    (vi) 서열번호 8, 또는 상기와 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역(VL) 중에 함유된 바와 같은 VL CDR3
    을 포함하고; 및/또는
    바람직하게, VH 중에 함유된 3개의 CDR 및/또는 VL 중에 함유된 3개의 CDR이 카밧, IMGT 또는 코티아(Chothia) 넘버링 시스템에 의해 정의되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (a) 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH):
    (i) 서열번호 7에 나타낸 바와 같은 서열;
    (ii) 서열번호 7에 나타낸 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열; 또는
    (iii) 서열번호 7에 나타낸 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 일치성을 갖는 서열; 및/또는
    (b) 하기 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL):
    (iv) 서열번호 8에 나타낸 바와 같은 서열;
    (v) 서열번호 8에 나타낸 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가)를 갖는 서열; 또는
    (vi) 서열번호 8에 나타낸 서열과 비교하여 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 일치성을 갖는 서열
    을 포함하고;
    바람직하게, (ii) 또는 (v)에 기재된 치환이 보존적 치환이고;
    바람직하게, 인간 면역글로불린으로부터 유래된 중쇄 프레임워크 영역 서열 및/또는 경쇄 프레임워크 영역 서열을 포함하고;
    바람직하게, 서열번호 7, 서열번호 16, 서열번호 18 또는 서열번호 19에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8 또는 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL을 포함하고;
    바람직하게,
    (1) 서열번호 7에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8에 나타낸 서열을 갖는 VL;
    (2) 서열번호 18에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 8에 나타낸 서열을 갖는 VL;
    (3) 서열번호 16에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL;
    (4) 서열번호 19에 나타낸 서열을 갖는 VH 및 서열번호 17에 나타낸 서열을 갖는 VL
    을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 면역글로불린으로부터 유래된 불변 영역 또는 그의 변체를 포함하고, 바람직하게,
    (a) 인간 면역글로불린의 중쇄 불변 영역(CH) 또는 그의 변체(여기에서 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합; 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는다); 및/또는
    (b) 인간 면역글로불린의 경쇄 불변 영역(CL) 또는 그의 변체(여기에서 변체는 상기가 유래된 서열과 비교하여 하나 또는 다수의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합(예를 들어 20개 이하, 15개 이하, 10개 이하, 또는 5개 이하 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합; 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가, 또는 이들의 임의의 조합)을 갖는다)
    를 포함하고;
    바람직하게, 중쇄 불변 영역이 IgG 중쇄 불변 영역, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중쇄 불변 영역이고;
    바람직하게, 서열번호 9에 나타낸 바와 같은 중쇄 불변 영역(CH)을 포함하고;
    바람직하게, 경쇄 불변 영역이 κ 경쇄 불변 영역이고;
    바람직하게, 서열번호 11에 나타낸 바와 같은 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는
    항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 디설파이드-연결된 Fv, BsFv, DsFv, (dsFv)2, dsFv-dsFv', scFv, scFv 이량체, 카멜화된 단쇄 도메인 항체, 디아바디, ds 디아바디, 나노바디, 단일 도메인 항체(sdAb), 2가 도메인 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고; 및/또는 항체가 쥐 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 이중특이성 항체 또는 다중특이성 항체인 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    표지를 포함하고; 바람직하게는 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질) 또는 비오틴을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 단리된 핵산 분자로;
    바람직하게, 서열번호 14 또는 서열번호 15에 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  8. 제7항에 따른 핵산 분자를 포함하고; 바람직하게, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 벡터.
  9. 제7항에 따른 핵산 분자 또는 제8항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법으로, 제9항에 따른 숙주 세포를 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 숙주 세포의 배양물로부터 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 회수함을 포함하며;
    바람직하게, 숙주 세포가 포유동물 세포이고; 바람직하게, 숙주 세포가 인간, 쥐, 양, 말, 개 또는 고양이 세포이고; 바람직하게, 숙주 세포가 중국 햄스터 난소 세포인 방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 분자로;
    바람직하게, CEACAM5에 특이적으로 결합하고, 하나 또는 다수의 다른 표적에 추가로 특이적으로 결합하며;
    바람직하게, 제2 표적에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 분자(예를 들어 제2 항체)를 추가로 포함하는 이중특이성 또는 다중특이성 분자.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 연결된 치료제를 포함하는 면역접합체로;
    바람직하게, 치료제가 세포독성제 중에서 선택되고;
    바람직하게, 치료제가 알킬화제, 유사분열 억제제, 항종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    바람직하게, 항체-약물 접합체(ADC)인 면역접합체.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 제12항에 따른 면역접합체, 및 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물로;
    바람직하게, 추가적인 약학 활성제를 또한 포함하고;
    바람직하게, 추가적인 약학 활성제가 항-종양 활성을 갖는 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자 표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스이고;
    바람직하게, 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 이중특이성 또는 다중특이성 분자 또는 면역접합체 및 추가적인 약학 활성제가 별도의 성분으로서 또는 동일한 조성물의 성분으로서 제공되는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 키트로;
    바람직하게, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질) 또는 비오틴을 포함하고;
    바람직하게, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 특이적으로 인식하는 제2 항체를 또한 포함하며;
    바람직하게, 제2 항체가 검출성 표지, 예를 들어 효소(예를 들어 양고추냉이 페록시다제), 방사성핵종, 형광 염료, 발광 물질(예를 들어 화학발광 물질), 또는 비오틴을 또한 포함하는 키트.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 항원-결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체로;
    바람직하게, 항원-결합 도메인이 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게, 항원-결합 도메인이 scFv이고;
    바람직하게, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체의 항원-결합 단편을 포함하고;
    바람직하게, 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포)에 의해 발현되는 키메라 항원 수용체.
  16. 제15항에 따른 키메라 항원 수용체를 암호화하는 단리된 핵산 분자.
  17. 제16항에 따른 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터로; 바람직하게, 키메라 항원 수용체 T 세포를 제조하는데 사용되는 벡터.
  18. 제16항에 따른 단리된 핵산 분자 또는 제17항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포로;
    바람직하게, 면역 효과기 세포(예를 들어 T 세포 또는 NK 세포)이고;
    바람직하게, 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T)인 숙주 세포.
  19. 세포 표면상의 CEACAM5의 발현 수준을 감소시키는 방법으로,
    세포를 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 제12항에 따른 면역접합체, 또는 제13항에 따른 약학 조성물, 또는 제15항에 따른 키메라 항원 수용체, 또는 제18항에 따른 숙주 세포와 접촉시켜, 세포 표면상의 CEACAM5의 발현을 감소시킴을 포함하며; 여기에서 세포가 그의 표면상에서 CEACAM5를 발현하고;
    바람직하게, 세포가 CEACAM5를 발현하는 종양 세포인 방법.
  20. CEACAM5를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하고/하거나 상기 종양 세포를 사멸시키는 방법으로, 상기 종양 세포를 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 제12항에 따른 면역접합체, 또는 제13항에 따른 약학 조성물, 또는 제15항에 따른 키메라 항원 수용체, 또는 제18항에 따른 숙주 세포와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  21. 피실험자(예를 들어 인간)에서 종양을 예방 및/또는 치료하는 방법으로, 상기 예방 및/또는 치료가 필요한 피실험자에게 유효량의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 제12항에 따른 면역접합체, 또는 제13항에 따른 약학 조성물, 또는 제15항에 따른 키메라 항원 수용체, 또는 제18항에 따른 숙주 세포를 투여함을 포함하고;
    바람직하게, 종양이 CEACAM5를 발현하고;
    바람직하게, 종양이 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 수반하고; 바람직하게, CEACAM5가 종양 세포의 표면상에서 발현되고;
    바람직하게, 종양이 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    바람직하게, 피실험자가 포유동물, 예를 들어 인간이고;
    바람직하게, 항-종양 활성을 갖는 추가적인 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자-표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스를 투여함을 또한 포함하고;
    바람직하게, 추가적인 항-종양 요법, 예를 들어 수술, 화학요법, 방사선요법, 표적요법, 면역요법, 호르몬요법, 유전자요법, 또는 완화요법을 투여함을 또한 포함하는 방법.
  22. 피실험자(예를 들어 인간)에서 종양의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제11항에 따른 이중특이성 또는 다중특이성 분자, 또는 제12항에 따른 면역접합체, 또는 제13항에 따른 약학 조성물, 또는 제15항에 따른 키메라 항원 수용체, 또는 제16항에 따른 숙주 세포의 용도로;
    바람직하게, 약제가 추가적인 약학 활성제를 또한 포함하고;
    바람직하게, 추가적인 약학 활성제가 항-종양 활성을 갖는 약물, 예를 들어 알킬화제, 유사분열 억제제, 항-종양 항생제, 대사길항물질, 국소이성화효소 억제제, 티로신 키나제 억제제, 방사성핵종제, 방사성감작제, 혈관형성 방지제, 사이토카인, 분자-표적 약물, 면역관문 억제제 또는 종양용해 바이러스이고;
    바람직하게, 종양이 CEACAM5를 발현하고;
    바람직하게, 종양이 CEACAM5를 발현하는 종양 세포를 수반하며; 바람직하게 CEACAM5가 종양 세포의 표면상에서 발현되고;
    바람직하게, 종양이 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고;
    바람직하게, 피실험자가 포유동물, 예를 들어 인간인 용도.
  23. 샘플 중 CEACAM5(예를 들어 인간 CEACAM5)의 존재 또는 양을 검출하는 방법으로, 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (1) 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
    (2) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CEACAM5를 포함하는 복합체의 형성을 검출하거나, 또는 복합체의 양을 검출하고;
    바람직하게, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출성 표지를 포함하고;
    바람직하게, CEACAM5가 인간 CEACAM5인 방법.
  24. 종양이 CEACAM5를 표적화하는 항-종양 요법에 의해 치료될 수 있는지의 여부를 결정하는 방법으로, 하기의 단계를 포함하는 방법:
    (1) 종양의 세포를 함유하는 샘플을 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
    (2) 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CEACAM5를 포함하는 복합체의 형성을 검출하고;
    바람직하게, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출성 표지를 갖고;
    바람직하게, CEACAM5가 인간 CEACAM5이고;
    바람직하게, 종양이 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  25. 종양이 CEACAM5를 표적화하는 항-종양 요법에 의해 치료될 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 키트의 제조에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도로;
    바람직하게, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출성 표지를 갖고;
    바람직하게, CEACAM5가 인간 CEACAM5이고;
    바람직하게, 종양이 비소세포폐암, 소세포폐암, 신세포암종, 대장암, 난소암, 유방암, 췌장암, 위암, 방광암, 식도암, 중피종, 흑색종, 두경부암, 갑상선암, 육종, 전립선암, 교모세포종, 자궁경부암, 흉선암, 백혈병, 림프종, 골수종, 균상식육종, 메르켈 세포암종 및 기타 혈액 악성종양, 예를 들어 전형적인 호지킨 림프종(CHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종, T 세포/조직구성 B-세포-풍부 림프종, EBV 양성 및 음성 PTLD, 및 EBV 관련 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 형질모세포성 림프종, 림프절 외 NK/T 세포 림프종, 비인두 암종 및 HHV8 관련 원발성 삼출성 림프종, 호지킨 림프종, 중추신경계(CNS) 종양, 예를 들어 원발성 CNS 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 용도.

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