CN117147860A - 尿液肝素辅助因子ii及其多肽片段在系统性红斑狼疮中的应用 - Google Patents

尿液肝素辅助因子ii及其多肽片段在系统性红斑狼疮中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种尿液肝素辅助因子II（Heparin cofactor II）及其多肽片段的应用，具体为尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在制备用于系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等应用。SLE是由自身免疫介导的，以免疫炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病，多数呈隐匿起病，常累及机体多个系统。本发明通过研究证实，尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在SLE活动期患者中表达升高。可用于SLE患者的各种目的应用检测。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液肝素辅助因子II及其多肽片段。

Description

尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在系统性红斑狼疮中的 应用
技术领域
本发明涉及尿液肝素辅助因子II及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在SLE诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等应用。
背景技术
系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一种可累及全身多脏器的自身免疫性结缔组织疾病，好发于生育年龄女性。依据流行病学统计研究显示，我国SLE的患病率为70／10万人，妇女中则高达113／10万人。该病病因尚未十分明确，SLE常呈隐匿性起病，临床表现复杂多样，鼻梁和双颧颊部呈蝶形分布的红斑是SLE特征性的改变。SLE的皮肤损害还包括光敏感、脱发、手足掌面和甲周红斑、盘状红斑、雷诺现象等。除此之外，SLE病程发展还常涉及机体多个系统，尤其以重要脏器系统受累为著，如狼疮肾炎、神经精神狼疮、心包积液、血液及消化系统损害。可见，对于该病患者及时的诊断、有效的病情监测以及针对性的治疗尤为重要。
肝素辅助因子II（Heparin cofactor II, HC-II）和AT-III均属于Serpin家族，由肝脏合成分泌到血液中，在体液抗凝系统中发挥主要抗凝作用。在完整血管内皮内AT-III起主要抗凝作用，而在血管外组织及炎症反应中由HC-II主导作用。在我们的研究中，HC-II和AT-III在SLE活动期患者尿液中表达上调，而HC-II表达差异更显著，可能在SLE活动期以HC-II参与的抗凝血作用为主。本研究SLE活动期患者肝素辅助因子II在尿液中含量升高。
与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻SLE患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助SLE患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在制备用于SLE诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等的应用
优选地，所述尿液肝素辅助因子II的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示（MKHSLNALLI FLIITSAWGG SKGPLDQLEK GGETAQSADP QWEQLNNKNL SMPLLPADFH KENTVTNDWIPEGEEDDDYL DLEKIFSEDD DYIDIVDSLS VSPTDSDVSA GNILQLFHGK SRIQRLNILN AKFAFNLYRVLKDQVNTFDN IFIAPVGIST AMGMISLGLK GETHEQVHSI LHFKDFVNAS SKYEITTIHN LFRKLTHRLFRRNFGYTLRS VNDLYIQKQF PILLDFKTKV REYYFAEAQI ADFSDPAFIS KTNNHIMKLT KGLIKDALENIDPATQMMIL NCIYFKGSWV NKFPVEMTHN HNFRLNEREV VKVSMMQTKG NFLAANDQEL DCDILQLEYVGGISMLIVVP HKMSGMKTLE AQLTPRVVER WQKSMTNRTR EVLLPKFKLE KNYNLVESLK LMGIRMLFDKNGNMAGISDQ RIAIDLFKHQ GTITVNEEGT QATTVTTVGF MPLSTQVRFT VDRPFLFLIY EHRTSCLLFMGRVANPSRS）；或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述制剂为SLE患者尿液肝素辅助因子II及其多肽片段检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合肝素辅助因子II及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
优选地，所述检测方法包括直接检测肝素辅助因子II及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述检测方法包括直接检测肝素辅助因子II及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
优选地，所述标准品包括肝素辅助因子II标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：肝素辅助因子II质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
发明人首先收集了健康人、SLE活动期患者（aSLE）和稳定期患者（sSLE）的尿液标本，4000r/min离心5min后，吸取上清，采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，进行SDS-PAGE酶解。尿液样本的Label-free质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将SLE组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行鉴定，利用数据库检索得到差异蛋白肝素辅助因子II。发明人利用Western Blot免疫印迹试验对SLE患者和健康人尿液中的肝素辅助因子II及其含量进行了验证。
本发明通过研究证实肝素辅助因子II及其多肽片段在SLE活动期患者的尿液中呈高表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液肝素辅助因子II及其多肽片段可用于SLE的辅助诊断或病情监测。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液肝素辅助因子II及其多肽片段。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在SLE患者及健康对照组中含量图。
图2是尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在SLE患者及健康对照组中WesternBlot免疫印迹试验结果图。
具体实施方式
实施例1 尿液标本的收集与处理
选取SLE患者作为SLE组，选取同期健康体检者作为正常对照组。收集各组研究对象入院后的新鲜晨尿样本30ml，不能正常排尿者收集其早晨导尿管中尿液，置于干燥、洁净的容器内。将收集的尿液标本4000r/min离心5min后，吸取上清，每管2ml分装，-80℃冰箱保存。
实施例2 质谱分析和尿液多肽的筛选
对尿液样品蛋白提取，并对提取的蛋白浓度进行测定。尿液样本的质谱分析由OrbitrapFusion型质谱完成。将实验组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算。组间比较采用t-test进行差异分析，以蛋白表达量差异在1.5倍以上且经统计检验P<0.05作为参考标准筛选差异表达蛋白。
实施例3 差异多肽的鉴定及分析
使用的数据库为Uniprot_Homo数据库，产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理，检索参数设置见表1。
实施例4 尿液肝素辅助因子II的验证
Label-free质谱分析结果显示肝素辅助因子II在SLE活动期患者的尿液中高表达，其在SLE患者及健康对照组尿液中的含量如图1所示，使用Western Blot免疫印迹试验对SLE患者和健康人尿液中的肝素辅助因子II进行检测，结果如图2所示。肝素辅助因子II在各组间表达具有显著性差异。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110> 张 曼
<120> 尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在系统性红斑狼疮中的应用
<130> 22PHCII -CN
<140> 22PHCII -CN
<141> 2022-02-17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 499
<212> PRT
<213> Human Urine
<400> 1
Met Lys His Ser Leu Asn Ala Leu Leu Ile Phe Leu Ile Ile Thr Ser
1 5 10 15
Ala Trp Gly Gly Ser Lys Gly Pro Leu Asp Gln Leu Glu Lys Gly Gly
20 25 30
Glu Thr Ala Gln Ser Ala Asp Pro Gln Trp Glu Gln Leu Asn Asn Lys
35 40 45
Asn Leu Ser Met Pro Leu Leu Pro Ala Asp Phe His Lys Glu Asn Thr
50 55 60
Val Thr Asn Asp Trp Ile Pro Glu Gly Glu Glu Asp Asp Asp Tyr Leu
65 70 75 80
Asp Leu Glu Lys Ile Phe Ser Glu Asp Asp Asp Tyr Ile Asp Ile Val
85 90 95
Asp Ser Leu Ser Val Ser Pro Thr Asp Ser Asp Val Ser Ala Gly Asn
100 105 110
Ile Leu Gln Leu Phe His Gly Lys Ser Arg Ile Gln Arg Leu Asn Ile
115 120 125
Leu Asn Ala Lys Phe Ala Phe Asn Leu Tyr Arg Val Leu Lys Asp Gln
130 135 140
Val Asn Thr Phe Asp Asn Ile Phe Ile Ala Pro Val Gly Ile Ser Thr
145 150 155 160
Ala Met Gly Met Ile Ser Leu Gly Leu Lys Gly Glu Thr His Glu Gln
165 170 175
Val His Ser Ile Leu His Phe Lys Asp Phe Val Asn Ala Ser Ser Lys
180 185 190
Tyr Glu Ile Thr Thr Ile His Asn Leu Phe Arg Lys Leu Thr His Arg
195 200 205
Leu Phe Arg Arg Asn Phe Gly Tyr Thr Leu Arg Ser Val Asn Asp Leu
210 215 220
Tyr Ile Gln Lys Gln Phe Pro Ile Leu Leu Asp Phe Lys Thr Lys Val
225 230 235 240
Arg Glu Tyr Tyr Phe Ala Glu Ala Gln Ile Ala Asp Phe Ser Asp Pro
245 250 255
Ala Phe Ile Ser Lys Thr Asn Asn His Ile Met Lys Leu Thr Lys Gly
260 265 270
Leu Ile Lys Asp Ala Leu Glu Asn Ile Asp Pro Ala Thr Gln Met Met
275 280 285
Ile Leu Asn Cys Ile Tyr Phe Lys Gly Ser Trp Val Asn Lys Phe Pro
290 295 300
Val Glu Met Thr His Asn His Asn Phe Arg Leu Asn Glu Arg Glu Val
305 310 315 320
Val Lys Val Ser Met Met Gln Thr Lys Gly Asn Phe Leu Ala Ala Asn
325 330 335
Asp Gln Glu Leu Asp Cys Asp Ile Leu Gln Leu Glu Tyr Val Gly Gly
340 345 350
Ile Ser Met Leu Ile Val Val Pro His Lys Met Ser Gly Met Lys Thr
355 360 365
Leu Glu Ala Gln Leu Thr Pro Arg Val Val Glu Arg Trp Gln Lys Ser
370 375 380
Met Thr Asn Arg Thr Arg Glu Val Leu Leu Pro Lys Phe Lys Leu Glu
385 390 395 400
Lys Asn Tyr Asn Leu Val Glu Ser Leu Lys Leu Met Gly Ile Arg Met
405 410 415
Leu Phe Asp Lys Asn Gly Asn Met Ala Gly Ile Ser Asp Gln Arg Ile
420 425 430
Ala Ile Asp Leu Phe Lys His Gln Gly Thr Ile Thr Val Asn Glu Glu
435 440 445
Gly Thr Gln Ala Thr Thr Val Thr Thr Val Gly Phe Met Pro Leu Ser
450 455 460
Thr Gln Val Arg Phe Thr Val Asp Arg Pro Phe Leu Phe Leu Ile Tyr
465 470 475 480
Glu His Arg Thr Ser Cys Leu Leu Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro
485 490 495
Ser Arg Ser

Claims (9)

1.尿液肝素辅助因子II及其多肽片段在制备用于SLE诊断、鉴别诊断、病情程度与活动性判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液肝素辅助因子II的氨基酸序列包括SEQ ID NO:1所示；或由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列衍生的，且与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为SLE患者尿液肝素辅助因子II及其多肽片段检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合肝素辅助因子II及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测肝素辅助因子II及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测方法包括直接检测肝素辅助因子II及其多肽片段或其相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述标准品包括肝素辅助因子II标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：肝素辅助因子II控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。
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