JPH10512158A

JPH10512158A - 膀胱の核マトリックスタンパク質ならびに細胞増殖性疾患の検出及び治療におけるその使用

Info

Publication number: JPH10512158A
Application number: JP9517422A
Authority: JP
Inventors: ゲッツェンバーグ，ロバート・エイチ; バーンソン，ロバート・アール
Original assignee: ゲッツェンバーグ，ロバート・エイチ; バーンソン，ロバート・アール
Priority date: 1995-11-03
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 1998-11-24
Also published as: BR9607575A; US5866535A; WO1997016206A8; EP0810874A1; CA2209314A1; EP0810874A4; MX9705025A; WO1997016206A1; AU7474696A

Abstract

(57)【要約】膀胱組織での明確な発現を特徴とする核マトリックスタンパク質（ＮＭＰ）を提供する。このＮＭＰは、膀胱の悪性疾患の病期診断およびモニタリングおよび膀胱の細胞増殖性疾患の治療に有用なマーカーである。実質的に精製された、本発明のポリペプチドおよび本発明のＮＭＰをコードしているポリヌクレオチド配列も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】膀胱の核マトリックスタンパク質ならびに細胞増殖性疾患の検出及び治療におけるその使用本発明は、ピッツバーグ大学癌研究所（University of Pittsburgh Cancer In stitute）に対するピッツバーグ大学癌研究所および国立癌研究所（ＮＩＨ）からの助成金 P30 CA47904の援助を受けて行われた。発明の背景本発明は、一般に、本願明細書で「ＮＭＰ」と呼ばれる膀胱の核マトリックスタンパク質に関し、さらに詳細には、細胞増殖性疾患と関連した膀胱の新規核マトリックスタンパク質に関する。膀胱癌の初期診断は、同疾患の有効治療の中枢である。現在、膀胱癌細胞の存在を容易且つ特異的に同定するために利用できる方法は皆無である。広く行われている膀胱癌の診断技術は、病理学者が行う細胞の形態学的検査による膀胱癌細胞の同定である。形質転換した表現型の細胞の顕著な特徴は、核の形の異常、複数の核小体の存在および染色質形成パターンの変化である。核構造の変化は、癌細胞で非常に優勢であるため、多種の癌の形質転換の病理学的マーカーとしてよく使用される。核の形は、その一部は、核の機能的骨格である核マトリックスによって決定される。核マトリックスは、核の形態を決定する核の構造成分であり、組織特異的な三次元様式でDNAを組織立て、遺伝子発現の調節をはじめとする幾つかの核プロセスの調節において中心的な役割を果たす。核マトリックスは、ＤＮＡ複製や転写など、重要な細胞プロセスの調節において中心的な役割を果たすことが実証されている。Getzenberg，J．Cell Biochem．55: 22-31(1994)。核マトリックスは、核の骨格または骨組みであり、末梢ラミナ、末梢細孔複合体、内部リボ核タンパク質ネットワーク、残余核小体から成る。Berezney et al.，Biochem．Biophys．R es．Comm．60: 1410-17(1974)。核マトリックスは、核タンパク質約１０％から成り、実質的に脂質、ＤＮＡおよびヒストンはない。Fey et al.，Critical Rev iews in Eukaryotic Gene Expression 1: 127-44(1991)。既知のＮＭＰの大半は、すべての細胞型および生理学的状態に共通している。幾つかの研究室が、ある細胞型またはある状態に特有のＮＭＰを同定した。有糸分裂促進物質の刺激および分化の誘導により、核マトリックスタンパク質の組成および構造が変化することが証明されている。核マトリックスは、形質転換に関与していることが証明されている幾つかの関連タンパク質を含む。Berezneyは、肝癌の核マトリックスタンパク質を検査して、形質転換においては核マトリックスが変化していることを初めて明らかにした。Berezney et al.，Cancer Res．3 9: 3031-39(1979)．FeyとPenmanは、腎細胞の核マトリックス中間径フィラメント骨格において腫瘍プロモーターが特異的な形態学的サインを誘導することを証明した。Fey et al.，Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 81: 859-66(1984)．続いて、FeyとPenmanは、正常な細胞株と腫瘍形成性細胞株との間でＮＭＰのパターンが異なることを証明した。Fey et al.，loc．cit．85: 121-25(1989)．近年、乳癌細胞株T-47Dから、NM-200.4と呼ばれる核マトリックスタンパク質に対する抗体が作られた。Weidner et al.，Am．J．Path．138: 1293-98(1991)．この抗体は、ヒト乳癌標本ならびに肺癌、甲状腺癌、および卵巣癌の標本と強く反応するが、類似した起源をもつ正常な上皮細胞とは反応せず、ある抗ＮＭＰ抗体を診断道具として使用する可能性が浮上した。同時係属出願第08/015,624号では、正常な背側前立腺を自発性ラット前立腺腺癌と比較したとき、核マトリックスタンパク質組成が変化していることが、Dunn ingラット前立腺癌モデルを使用して証明された。この出願は、参照することによりその全内容が本願明細書に組み込まれるものとする。ヒト前立腺試料を検査したとき、（１）正常な前立腺のみに存在し、且つ前立腺癌にも良性前立腺肥大（ＢＰＨ）にも見られない核マトリックスタンパク質（正常型）、（２）前立腺癌細胞のみに認められ、且つ正常な前立腺およびＢＰＨに見られない核マトリックスタンパク質（前立腺癌型）、および（３）正常試料にもＢＰＨ試料にも存在するが、前立腺癌に存在しない核マトリックスタンパク質が同定された。しかし、膀胱癌に特異的に関連づけられる核マトリックスタンパク質は、これまで、全く同定されていない。発明の概要本発明は、癌性膀胱細胞と正常な膀胱細胞とを識別することができる核マトリックスタンパク質、それらをコードしているポリヌクレオチド配列、およびそれらの使用方法に関する。あらゆる癌性膀胱細胞に存在し、且つ正常な膀胱細胞に存在しない、それぞれＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ− ４、ＢＬＣＡ−５およびＢＬＣＡ−６と呼ばれる６種のタンパク質が発見されており、また正常な膀胱組織に特有な３種のタンパク質（ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ −２、およびＢＬＮＬ−３と呼ばれる）が発見されている。上述のタンパク質は、膀胱の細胞増殖性疾患を診断し、治療を行うのに有用である。好ましい実施態様の詳細な説明１つの態様によれば、本発明は、正常な膀胱細胞に存在するが、癌性膀胱細胞に存在しない精製核マトリックスタンパク質またはそのフラグメント、あるいは正常な膀胱細胞に存在しないが、癌性膀胱細胞に存在する精製核マトリックスタンパク質またはそのフラグメントに関する。詳細には、本発明は、正常な膀胱細胞に存在するが癌性膀胱細胞に存在しない、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択されるタンパク質に関する。さらに、本発明は、正常な膀胱細胞に存在しないが癌性膀胱細胞に存在する、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ−４、ＢＬＣＡ−５およびＢＬＣＡ−６から成る群から選択されるタンパク質に関する。本発明の別の実施態様は、前述の実施態様の上記同定されたＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントをコードしている精製ポリヌクレオチド配列である。別の実施態様は、上述のＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する精製ポリヌクレオチド配列である。別の実施態様は、上述のＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞である。組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、本技術分野で周知の従来技術で実行することが可能である。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、細胞を対数増殖期後に収集し、続いて本技術分野で周知の手順によりＣａＣｌ₂法で処理することによって、ＤＮＡ取り込みができるコンピテント細胞を作成することができる。あるいは、ＭｇＣｌ₂またはＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換は、宿主細胞のプロトプラスト形成後に行うこともできるし、またはエレクトロポレーションによって実施することもできる。宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈殿、微量注入法などの従来の機械的手順、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、あるいはウイルスベクターなど、ＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することが可能である。本発明のＮＭＰをコードしているＤＮＡ配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子など、選択可能な表現型をコードしている第二の外来ＤＮＡ分子とを用いて、真核細胞を共形質転換することもできる。別の方法では、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）やウシパピローマウイルスなどの真核細胞ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一時的に感染させるか形質転換して、そのタンパク質を発現させる。EUKARYOTIC VIRAL VECTORS Gluzman(ed.)，Cold Spring Harbor Laboratory，1982．形質転換宿主によって発現されたＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントの単離および精製は、分離用クロマトグラフィーやモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む免疫学的分離をはじめとする従来の手段によって実行することが可能である。本発明で提供される抗体は、ＮＭＰポリペプチドまたはそのフラグメントと免疫反応することができる。別の実施態様は、上述のポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターである。好ましくは、ベクターはウイルスである。好ましいウイルスはＲＮＡウイルスであり、好ましいＲＮＡウイルスはレトロウイルスである。別の好ましいベクターはリポソームであり、好ましくは、たとえば抗体やリガンドの標的とされる標的特異的リポソームである。別の好ましいベクターはプラスミドである。別の実施態様は、上述のＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントに結合する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。別の実施態様は、患者由来の細胞成分を、細胞増殖性疾患関連の細胞成分に結合する抗体プローブまたは核酸プローブと接触させることを含む、患者の細胞増殖性疾患を検出する方法である。好ましくは、細胞成分は患者の膀胱から採取され、好ましくは核酸である。好ましくは、この核酸は上述のＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントをコードしているＤＮＡである。ＲＮＡも核酸として好ましい。別の好ましい細胞成分は、上述のＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントである。好ましくは、核酸プローブは上述の細胞成分と特異的にハイブリッド形成する。試薬が核酸プローブのとき、細胞成分は好ましく検出できるように標識される。好ましい標識としては、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、酵素などがある。あるいは、細胞成分がＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントの場合、ＮＭＰまたはＮＭＰフラグメントに特異的に結合する抗体を使用する。上述の通り、抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。別の実施態様は、疾患を有する患者に、上述のＮＭＰをコードしている配列を遮断するアンチセンスポリヌクレオチド配列の治療有効量を投与することを含む、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ−４、ＢＬＣＡ−５、ＢＬＣＡ−６、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択されるタンパク質に関連した細胞増殖性疾患を治療する方法である。この実施態様では、細胞増殖性疾患を引き起こす１種以上のＮＭＰの発現を遮断するように治療をデザインする。代替治療法では、アンチセンスポリヌクレオチド配列を使用する代わりに、上述のＮＭＰの１つをコードするポリヌクレオチド配列を使用する。この実施態様では、細胞増殖性疾患を予防または改善する１種以上のＮＭＰを患者に提供するように治療をデザインする。別の治療方法では、１種以上の上記ＮＭＰの機能を遮断することができる抗体を患者に投与する。別の実施態様は、上述のＮＭＰを１種以上コードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、宿主となる患者の細胞内に導入することを含む、遺伝子治療法である。発現ベクターを宿主となる患者の細胞内にイクス・ビボ（ex v ivo）で導入して形質転換細胞を生成し、この形質転換細胞を患者に再び導入するのが好ましい。この目的にとって好ましい発現ベクターはＲＮＡウイルスであり、好ましくはレトロウイルスである。本発明の別の実施態様は、膀胱細胞ＮＭＰの機能を遮断または増強する組成物を同定する方法に関する。本発明の方法は以下のことを含む。（ａ）膀胱細胞と被験組成物が相互に作用できる条件下で、ＮＭＰ含有膀胱細胞を被験組成物と共にインキュベートすることと、（ｂ）被験組成物が膀胱細胞ＮＭＰの機能を遮断するか増強するかを測定すること。別の実施態様は、上述したＮＭＰの１つをコードしているポリヌクレオチド配列に結合する核酸プローブを含む、膀胱の細胞増殖性疾患を検出するためのキットである。上述したように標識による検出を容易にするために、プローブは標識されていることが好ましい。あるいは、キットは、上述のＮＭＰの１つに特異的に結合する抗体を含んでもよい。さらに別の実施態様は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、上述のＮＭＰの１つをコードしている標的ポリヌクレオチド配列を増幅することが可能なキットに、オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。本発明のＮＭＰは、フラグメントおよびその保存的な置換変異型を含む。ＮＭＰの一次アミノ酸配列を僅かに修飾すると、本願明細書に記載のＮＭＰポリペプチドと比較して実質的に同等な活性を有するタンパク質となる。このような修飾は、部位指向性突然変異誘発などにより、計画的であってもよいし、自然に発生したものでもよい。このような修飾としては、活性に必要でないアミノ酸の欠失などがある。上述の修飾によって生じるポリペプチドはすべて、生来のＮＭＰの生物活性が依然として存在するかぎり、本願明細書に含まれる。さらに、１個以上のアミノ酸が欠失すると、その生物活性は著しく変化せずに、結果として生じる分子の構造が修飾される。その結果、より広い有用性を有するより小さい活性分子が発生する。本願明細書で使用する用語「保存的な置換」は、アミノ酸残基を構造的に類似した残基で置換することを表す。保存的な置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの疎水性残基１個と別の残基との置換や、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、またはグルタミンとアスパラギンとの置換など、極性残基１個と別の残基との置換などがある。本発明のペプチドは、たとえば、Merrifield，J．Am．Chem．Soc．85: 2149(1 962)やStewart and Young，SOLID PHASE PEPTIDES SYNTHESIS 27-62(Freeman Publ.，1969)により記載されている周知の固相ペプチド合成法によって合成することができる。本発明のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、ＮＭＰまたはＮＭＰの免疫原フラグメントと免疫反応することができる。要望に応じて、たとえば、ＮＭＰポリペプチドが結合するマトリックスに結合させて溶離することにより、あるいは共通の核マトリックスタンパク質を使用して非特異的抗体を選択的に除去することにより、ポリクローナル抗体をさらに精製することができる。本質的に、異なるエピトープ特異性を有するプールしたモノクローナル抗体、ならびにモノクローナル抗体調製品で本質的に構成される抗体が得られる。本発明で使用する用語「抗体」は、無傷の分子、ならびに機能的に、ＮＭＰのエピトープ決定基と結合することができるＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）₂フラグメントなど、抗体フラグメントを含む。ＮＭＰとの結合を示す抗体結合ドメインを同定して単離する好ましい方法は、バクテリオファージλベクター系である。このベクター系は、大腸菌におけるマウス抗体レパートリー由来のＦａｂフラグメント（Huse et al.，Science 246: 1275-81(1989)参照）、およびヒト抗体レパートリー由来のＦａｂフラグメント（Mullinax et al.，Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 87 : 8095-99(1990)）の組み合せライブラリーを発現するのに使用されてきた。本願明細書で使用する用語「細胞増殖性疾患」は、膀胱の悪性疾患ならびに非悪性（あるいは良性）疾患を表す。この用語は、さらに、膀胱の過形成性疾患を含む。上述の増殖性疾患を含む細胞は多くの場合、周囲の正常組織と形態および遺伝子型が異なるようである。上述の通り、細胞増殖性疾患は、たとえば、本発明のＮＭＰの発現または発現の欠如と関連があると考えられる。細胞周期中の不適当な時期におけるＮＭＰの発現、または不正確な細胞型でのＮＭＰの発現は、細胞増殖性疾患を招く可能性がある。アンチセンスポリヌクレオチドの形のＮＭＰをコードするポリヌクレオチドは、膀胱の過形成および悪性疾患の治療に有用である。細胞増殖性疾患がＮＭＰ発現と関連している場合、（たとえば、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ−４、ＢＬＣＡ−５および／またはＢＬＣＡ−６）、アンチセンスＮＭＰポリヌクレオチド配列またはＮＭＰ結合抗体を膀胱細胞内に導入してＮＭＰの発現または機能若しくはその両者を遮断することができる。あるいは、細胞増殖性疾患が過小発現または突然変異体ＮＭＰポリペプチド（たとえばＢＬＮＬ１〜ＢＬＮＬ３）の発現と関連している場合、欠損ＮＭＰまたは過小発現ＮＭＰをコードしているポリヌクレオチド配列を細胞内に導入することができる。本発明の目的のために、ＮＭＰに特異的な抗体プローブまたは核酸プローブを使用して、ＮＭＰを含むと推測される体液または生物組織中に、ＮＭＰポリペプチド（抗体プローブの場合）またはＮＭＰポリヌクレオチド（核酸プローブの場合）が存在することを検出することが可能である。ＮＭＰ配列中の任意のコーディング配列領域に基づくオリゴヌクレオチドプライマーは、たとえばＰＣＲによる、ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅に有用である。検出可能量の抗原を含む任意の標本を使用することができる。本発明の好ましい試料は、膀胱から採取した組織である。あるいは、膀胱の細胞を含む体液を使用することが可能である。本願明細書で使用する用語「患者」は、哺乳類、好ましくはヒトを指す。感度がより高くなる別の技術では、プローブを低分子量ハプテンとカップリングさせる。次に、これらのハプテンを第二の反応によって特異的に検出することができる。たとえば、アビジンと反応するビオチンやジニトロフェノールなどのハプテン、ピリドキサール、および特定の抗ハプテン抗体と反応することができるフルオレセインを使用することがよくある。上述の、本発明の特定のＮＭＰを発現する細胞またはＮＭＰ関連の細胞増殖性疾患を検出する方法を、臨床的に緩解状態にある患者の残存膀胱癌または他の悪性疾患または良性過形成疾患の検出に使用することができる。さらに、細胞中のＮＭＰポリペプチドを検出する方法は、正常細胞に発現されたＮＭＰと比較して特異的ＮＭＰを発現する細胞を同定することによって細胞増殖性疾患を検出するのに有用である。本発明の方法を使用して、細胞でのＮＭＰ発現を同定することができ、また適当な治療コースを使用することができる（たとえば、ＮＭＰをコードする遺伝子またはＮＭＰのアンチセンス遺伝子による療法、ならびに従来の化学療法）。本発明のＮＭＰの発現パターンは、細胞の悪性の程度とともに変化するため、膀胱組織の試料を一団のＮＭＰ特異的試薬（たとえば、核酸プローブまたはＮＭＰに対する抗体）でスクリーニングして、ＮＭＰの発現を検出し、細胞の悪性の程度を診断することができる。本発明のモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を液相で使用することができるか、または固相キャリヤーに結合することができるイムノアッセイで使用するのに適する。さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、様々な方法で検出できるように標識することができる。本発明のモノクローナル抗体を使用することができるイムノアッセイの種類の例は、直接または間接競合的イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を使用した抗原の検出は、生理学的試料の免疫組織学的アッセイを含め、前進モード、リバースモード、または同時モードのいずれかで実行するイムノアッセイを使用して実施することができる。あるいは、本発明の抗体を使用して、ウエスタンブロットや二次元ゲルなど、電気泳動的に分散させたゲルプロトコールに存在するＮＭＰを検出することができる。本発明のモノクローナル抗体は、多くの異なるキャリヤーに結合することができるため、ＮＭＰの存在を検出することができる。周知のキャリヤーの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、諸アミラーゼ、天然セルロース、改良セルロース、ポリアクリルアミド類、アガロース類および磁鉄鉱などがある。本発明の目的には、キャリヤーの性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。アッセイを実施する際に、ある「ブロッカー」がインキュベーション媒体中に含まれることが望ましい（通常は、標識した可溶性抗体と一緒に加える）。この「ブロッカー」の添加によって、確実に、実験試料に存在する非特異的タンパク質、プロテアーゼ、または、抗ＮＭＰ免疫グロブリンに対する抗ヘテロ親性免疫グロブリンが固相支持体上の抗体または放射標識インディケーター抗体を架橋しない、あるいは破壊しないようにし、擬陽性または擬陰性の結果を得ないようにできる。したがって、「ブロッカー」の選択は、実質的に、本発明に記載のアッセイの特異性の一助となる。アッセイで使用されるものと同じクラスまたはサブクラス（アイソタイプ）の幾つかの関連のない（すなわち非特異的な）抗体（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭなど）を「ブロッカー」として使用することができる。この「ブロッカー」は、適切な感度を維持し、しかも標本中で相互に発生する交差反応タンパク質による望ましくない妨害を阻止するぐらい高いレベル（通常は１〜１００ μg/μl）で使用する。この説明で、用語「エピトープ」は、本発明のモノクローナル抗体と特異的に相互作用することができる任意の決定基を表す。エピトープの決定基は、通常、アミノ酸や糖側鎖など、化学的に活性な分子の表面配置を含み、通常は特異的な三次元の構造特性、ならびに特異的な電荷特性を有する。抗原のin vivo検出に本発明のモノクローナル抗体を使用する場合、検出できるように標識したモノクローナル抗体を、診断上有効な量で投与する。用語「診断上有効な」は、検出できるように標識されたモノクローナル抗体の量が、そのモノクローナル抗体が特異性を示すＮＭＰ抗原を有する部位を検出できるほど十分な量で投与されることを意味する。検出できるように標識されたモノクローナル抗体のin vivo診断のための投与量は、個々人の年齢、性別、病気の程度などの因子に応じて異なる。モノクローナル抗体の投与量は、約０．００１mg/m²から約５００mg/m²まで、好ましくは約０．１mg/m²から約２００mg/m²まで、最も好ましくは約０．１mg/m²から約１０mg/m²まで変化させることができる。このような投与量は、たとえば、多回注入が行われるかどうか、腫瘍数、および他の因子によって変化してもよい。 in vivo診断用造影の場合、利用できる検出機器の種類は、所与の放射性同位元素を選択する上で重要な因子である。選択された放射性同位元素の崩壊のタイプは、所定の機種で検出できなければならない。in vivo診断の場合、放射性同位元素を選択する上でさらに別の重要な因子は、放射性同位元素の半減期が標的による最大取り込みの時期に依然として検出できるほど長いが、宿主に関して心身に有害な放射線が最小限に抑えられほど短いことである。理想的には、in viv o影に使用される放射性同位元素は、粒子放射は欠如しているが、１４０〜２５０keVの範囲で多数の光子を生じるため、これを従来のγカメラで容易に検出することができる。 in vivo診断では、中間官能基を使用して直接または間接に放射性同位元素を免疫グロブリンに結合させることが可能である。金属イオンとして存在する放射性同位元素を免疫グロブリンに結合するのにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの二価官能価キレート化剤および類似した分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合することができる金属イオンの典型的な例は、¹¹¹Ｉｎ、⁹⁷Ｒｕ、⁶⁷Ｇａ、⁶⁸Ｇａ、⁷²Ａｓ、⁸⁹Ｚｒ、および²⁰¹Ｔｌである。本発明のモノクローナル抗体は、in vivo診断用に、磁気共鳴画像診断法（ＭＲＩ）や電子スピン共鳴（ＥＳＲ）のような常磁性同位元素で標識することができる。一般に、診断画像を可視化するための従来の任意の方法を使用することもできる。通常は、カメラ撮像にはγ放射放射性同位元素または陽子放射放射性同位元素が使用され、ＭＲＩには常磁性同位元素が使用される。このような技術に特に有用な元素としては、¹⁵⁷Ｇｄ、⁵⁵Ｍｎ、¹⁶²Ｄｙ、⁵²Ｃｒおよび⁵⁶Ｆｅなどがある。本発明のモノクローナル抗体を使用して、ＮＭＰが関連した細胞増殖性疾患の改善経過をモニタリングすることができる。このように、精液や尿など、様々な体液中に存在するＮＭＰを発現する細胞数の増加または減少あるいはＮＭＰの変化を測定することによって、疾患を改善することに照準を定めた特定の治療方式が有効かどうかを決定することが可能であろう。単独またはエフェクター細胞と組み合せて、本発明のモノクローナル抗体と反応することができるエピトープを含むＮＭＰポリペプチドを発現する細胞増殖性疾患に罹患した動物の免疫療法に、本発明のモノクローナル抗体を使用することもできる。Douillard et al.，Hybridoma 5（Supp．1）: S139(1986)を参照されたい。免疫療法に使用する場合、本発明のモノクローナル抗体は、非標識であってもよく、あるいは治療剤に結合していてもよい。これらの薬剤を、本発明のモノクローナル抗体に直接または間接的にカップリングさせることができる。間接的カップリングの一例は、スペーサー部分を使用する方法である。これらのスペーサー部分は、不溶性または可溶性のいずれであってもよく（Diener et al.，Scien ce 231: 148(1986)を参照）、標的部位で、モノクローナル抗体からの薬剤放出が可能なように選択することができる。免疫療法のための本発明のモノクローナル抗体にカップリングすることができる治療剤の例は、薬剤、放射性同位元素、レクチン類、および毒素類である。本発明のモノクローナル抗体に結合することができる薬剤としては、非タンパク質薬剤ならびにタンパク質薬剤などがある。用語「非タンパク質薬剤」は古典的に、たとえば、マイトマシンＣ、ダウノルビシン、ビンブラスチン、および癌の治療に使用される他薬剤などの薬剤を指す。本発明のモノクローナル抗体と結合することができるタンパク質薬剤としては、免疫調製剤や他の生物学的応答修飾因子などがある。用語「生物学的応答修飾因子」は、本発明のモノクローナル抗体が特異性をもつＮＭＰ関連腫瘍の破壊を増強するような様式での免疫応答の修飾に関与する物質を含む。免疫応答修飾因子の例としては、リンホカイン類などの化合物がある。リンフォカイン類には、腫瘍壊死因子、インターロイキン類、リンホトキシン、マクロファージ活性化因子、遊走阻害因子、コロニー刺激因子、およびインターフェロンが含まれる。本発明のモノクローナル抗体を標識することができるインターフェロンとしては、 αインターフェロン、βインターフェロンおよびγインターフェロンおよびそれらのサブタイプなどがある。本発明の放射性同位元素複合モノクローナル抗体を免疫療法に使用する上で、腫瘍細胞分布ならびに同位元素安定性や放射などの因子によって、ある同位元素が他の同位元素より好ましいことがある。要望に応じて、上述のin vivo診断技術によって腫瘍細胞分布を評価することができる。細胞増殖性疾患によって、一部のエミッターが他のエミッターより好ましいことがある。一般に、免疫療法では、α粒子放射放射性同位元素およびβ粒子放射放射性同位元素が好ましい。たとえば、動物に充実性腫瘍病巣がある場合、⁹⁰Ｙなど、数ミリメートルの組織を透過することができる高エネルギーβエミッターが好ましいと考えられる。これに反して、白血球の場合のように、細胞増殖性疾患が単純な標的細胞から成る場合、²¹²Ｂｉなど、短い範囲の高エネルギーαエミッターが好ましい。治療のための本発明のモノクローナル抗体に結合することができる放射性同位元素の例は、¹²⁵Ｉ、¹³¹ Ｉ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃｕ、²¹²Ｂｉ、²¹¹Ａｔ、²¹²Ｐｂ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁰⁹Ｐｄ、⁶⁵Ｚｎ、および¹⁸⁸Ｒｅである。レクチンは、通常は植物材料から単離されるタンパク質であり、特定の糖部分に結合する。多くのレクチンが細胞を凝集し、リンパ球を刺激することができる。リシンは免疫療法的に使用されてきた有毒なレクチンである。毒性の原因であるリシンのαペプチド鎖が本発明の抗体に結合して、毒性作用の部位特異的送達を可能にする。毒素は、植物、動物または微生物によって産生される有毒な物質であり、十分な量ではしばしば死に至る。ジフテリア毒素は、ジフテリア菌（Corynebacteriu m diphtheria）によって生産され、治療に使用することができる物質である。この毒素は、適当な条件下で分離することができるαサブユニットおよびβサブユニットから成る。毒素Ａ成分は、抗体に結合できるため、ＮＭＰ担持細胞への部位特異的送達に使用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、αインターフェロンと組み合せて使用することができる。この治療様式は、癌腫細胞によるモノクローナル抗体反応性抗原の発現を増加させることにより、癌腫のモノクローナル抗体によるターゲティングを増強する。Greiner et al.，Science 235: 895(1987)。あるいは、本発明のモノクローナル抗体を、たとえばγインターフェロンと組み合せて使用し、その結果エフェクター細胞によるＦｃ受容体の発現を活性化し、且つ増加することにより、エフェクター細胞へのモノクローナル抗体の結合および標的腫瘍細胞の死滅を増進することができる。本発明のモノクローナル抗体を膜内に有するリポソームを使用して、ＮＭＰを発現する腫瘍にリポソームを特異的に送達することも可能である。上述のリポソームは、モノクローナル抗体のほかにも上述のような免疫療法剤を含み、それが腫瘍部位で放出されるように作成することができる。Wolff et al.，Biochemica l et Biophysical Acta 802: 259(1984)。本発明のモノクローナル抗体の投与量の範囲は、悪性疾患の症状が改善される所望の効果を生じるのに十分な量である。投与量は、望ましくない交差反応やアナフィラキシー反応などの副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に、投与量は、患者の年齢、体調、性別、疾患の程度によって変化し、従来技術の一つにより決定することができる。合併症の場合、個々の医師が投与量を調節することができる。投与量は、１日１回以上の投与で、１日または数日間、約０．１mg/kgから約２０００mg/kgまで、好ましくは約０．１mg/kgから約５００m g/kgまで変化させることができる。一般に、本発明のモノクローナル抗体を治療剤と複合させて投与する場合、in vivo診断造影で使用される投与量に匹敵する低用量で使用することができる。本発明のモノクローナル抗体は、注射または時間をかけた漸次灌流により非経口的に投与することができる。本発明のモノクローナル抗体は、単独またはエフェクター細胞と組み合せて、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、体腔内投与、または経皮投与することができる。本発明は、ＮＭＰヌクレオチド配列を使用して、ＮＭＰ関連の細胞増殖性疾患を有する患者を治療する方法も提供する。サプレッサーポリペプチドをコードするＮＭＰヌクレオチド配列は、正常細胞での発現と比較して過小発現であると考えられ、したがって、この配列に向けられた適切な治療技術または診断技術をデザインすることが可能である。それ故、細胞増殖性疾患が悪性疾患と関連したＮＭＰの発現と関連している場合、翻訳レベルでＮＭＰ発現を妨害する核酸配列を使用することができる。この方法は、たとえば、アンチセンス核酸およびリボザイムを使用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸で遮蔽するか、リボザイムで切断するかのいずれかによって、特定のＮＭＰのｍＲＮＡの翻訳を遮断する。細胞増殖性疾患または細胞表現型異常がＮＭＰサプレッサーの過小発現と関連している場合、たとえば、ＮＭＰをコードしている核酸配列（センス）を、この疾患を有する患者に投与することが可能である。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。Weintaub，Scientific American，262: 40(1990) 。細胞では、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリッド形成し、二本鎖分子を形成する。細胞は二重鎖のｍＲＮＡを翻訳しないため、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳を妨害する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは合成が容易であり、且つ標的ＮＭＰ産生細胞内に導入されたとき、より大きい分子より発現の可能性か低いため、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した様式で、他の１本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を介して、ＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を認識してこれを切断する分子を工作することが可能である。Cech，J．Ame r．Med．Assn．260: 3030(1988)。この方法の主な長所は、この分子が配列特異的であるため、特定の配列を含むｍＲＮＡのみが不活性化されることである。リボザイムの基本的な種類は、テトラヒメナ（tetrahymena）型（Hasselhoff ，Nature，334: 585，1988）と「ハンマーヘッド」型の２種類である。テトラヒメナ型リボザイムは長さが塩基４個の配列を認識するが、「ハンマーヘッド型」リボザイムは長さが塩基１１〜１８個の塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、その配列が標的ｍＲＮＡ種に独占的に発生する公算が高い。結果として、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためにはハンマーヘッド型リボザイムはテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基認識配列はそれより短い認識配列よりも好ましい。本発明は、ＮＭＰが介在する細胞増殖性疾患を治療するための遺伝子療法も提供する。このような療法には、増殖性疾患を有する患者の細胞内に適切なＮＭＰポリヌクレオチド配列（アンチセンス鎖またはコード鎖）を導入することが必要である。アンチセンスＮＭＰポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスやリポソームなどの組換え発現ベクターを使用して遂行することができる。ＮＭＰの過小発現または癌関連ＮＭＰの発現と関連した疾患は、それぞれ、コードヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチド配列を使用した遺伝子療法を使用して治療することができる。本願明細書で教示される遺伝子治療に使用することができる様々なウイルスベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、あるいは、好ましくは、レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスである。好ましくは、レトロウイルスベクターは、ネズミレトロウイルスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。外来遺伝子１個を挿入することができるレトロウイルスの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などがあるが、これらに限定されるものではない。さらに幾つかのレトロウイルスベクターは複数の遺伝子を組み込むことができる。上述のベクターはすべて、形質導入細胞を同定して作成することができるように、選択可能なマーカーの遺伝子を転移するか組み込むことができる。特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に関心のあるＮＭＰ配列をウイルスベクターに挿入することによって、たとえば、ベクターを標的特異的にする。たとえば、糖、糖脂質、またはタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを挿入することによって、レトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。好ましいターゲッティングは、抗体を使用してレトロウイルスベクターを標的にすることによって遂行される。組換えレトロウイルスは１個以上の遺伝子が欠けているため、感染性ベクター粒子を産生するためには補助を必要とする。パッケージングシグナルが欠失しているヘルパー細胞株としては、たとえば、Ψ２、ＰＡ３１７、ＰＡ１２などがあるが、これらに限定されるものではない。上述の細胞系は、ゲノムが組み込まれていないため、空のビリオンを産生する。パッケージングシグナルは無傷であるが、構造遺伝子は関心のある他の遺伝子と置換されている細胞内にレトロウイルスベクターを導入した場合、ベクターを組み込んでベクタービリオンを産生することができる。あるいは、ＮＩＨ３Ｔ３または他の組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによって、レトロウイルス構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎvをコードしているプラスミドを用いて直接トランスフェクトすることができる。次に、関心のある遺伝子を含むベクタープラスミドを用いて、これらの細胞をトランスフェクトする。結果として生じた細胞は、レトロウイルスベクターを培地中に放出する。ＮＭＰアンチセンスポリヌクレオチドの他の標的送達システムとしては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水注油乳液をはじめとする脂質系システム、ミセル、混合ミセル、およびリポソームなどがある。リポソームは、in vitroおよびin vivoでの送達媒体として有用な人口膜小胞である。サイズが０．２〜４．０μmの範囲の大きい単一層小胞（ＵＬＶ）は、高分子を含有しているかなりの率の緩衝液をカプセルに入れることができることが判明している。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび無傷のビリオンを水性内部に入れて、生物学的に活性な形で細胞に送達することができる。Fraley et al.，Trends Biochem ．Sci．6: 77(1981)。通常、リポソームの組成は、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質の組み合せであり、通常はステロイド類、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質を使用することも可能である。リポソームの物性は、ｐＨ、イオン強度、および二価陽イオンの有無によって異なる。リポソーム作成に有用な脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、などのホスファチジル化合物、スフィンゴ脂質類、セレブロシド類、およびガングリオシド類などがある。特に有用なものは、脂質部分は炭素原子１４〜１８個を含み、特に炭素原子１６〜１８個を含み、且つ飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質としては、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンなどがある。リポソームのターゲッティングは、解剖学的因子および機械的因子に基づいて分類されてきた。解剖学的分類は、選択性のレベル、たとえば、器官特異性、細胞特異性、細胞小器官特異性に基づいている。機械的ターゲッティングは、受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的ターゲッティングは、洞様毛細管を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するというリポソーム本来の傾向を利用する。一方、能動的ターゲッティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、あるいはタンパク質などの特定のリガンドにリポソームをカップリングさせることによるリポソームの変化、あるいは天然の局在部位以外の器官および細胞型へのターゲッティングを達成するために、リポソームの組成またはサイズを変更することによるリポソームの変化を含む。標的送達システムの表面は、様々な方法で修飾することが可能である。ハイポソーム（hyposomal）標的送達システムの場合、標的リガンドをリポソーム二重構造体と安定した関連で維持するために、リポソームの脂質二重構造体内に脂質群を組み込むことができる。様々な結合基を使用して脂質鎖を標的リガンドに結合させることができる。一般に、標的送達システムの表面に結合している化合物は、標的送達システムが確認して所望の細胞に「向かって進む」ことができるリガンドおよび受容体となる。リガンドは、受容体など、別の化合物に結合する関心のある任意の化合物であってもよい。一般に、特定のエフェクター分子に結合する表面膜タンパク質を受容体と呼ぶ。本発明では、本発明の抗体は好ましい受容体である。抗体を使用して、リポソームを特定の細胞表面リガンドに向けることができ、この場合、ＮＭＰが好ましい。好ましくは、標的組織は膀胱組織である。幾つかの手順を使用して、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体をリポソーム二重構造体に共有結合させることができる。抗体−標的リポソームは、標的細胞の抗原エピトープに効率よく結合するかぎり、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはＦａｂやＦ（ａｂ’）₂など、それらのフラグメントを含めることができる。非経口投与用製剤としては、無菌水溶液または無菌非水溶液、懸濁液、乳液などがある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。水性キャリヤーとしては、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、乳液または懸濁液などがある。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムがあり、乳酸加リンゲル静脈内媒体としては流体および栄養補給物、電解質補給物（リンゲルデキストロースに基づくもの）などがある。保存料、およびたとえば、抗菌薬、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなど、他の添加物も存在してもよい。本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはモノクローナル抗体を含む薬剤または医薬組成物を作成する方法にも関し、この薬剤はＮＭＰ関連の細胞増殖性疾患の治療に使用される。本発明は、下記の実施例によってさらに例示されるが、これらに限定されるものではない。組織の選択ピッツバーグ大学医療センター（University of Pittsburgh Medical center ）で膀胱癌のための手術を受ける患者から膀胱の正常組織試料および腫瘍組織試料を採取した。正常な膀胱は、ピッツバーグ大学病理学部のDr．Michael J．Bec ichを介して臓器回復および教育センター（Center for Organ Recovery and Edu cation(CORE)）から入手した。これらの膀胱により、核マトリックス組成を研究し、正常な器官で染色する機会が得られ、これを正常から腫瘍への形質転換中に現れた変化と比較した。病理学者によって、規定された細胞型のほぼ純粋な個体群を含むと明確に確認された試料のみを使用した。核マトリックス調製膀胱組織およびFey，et al.，J．Cell Biol.，98: 1973-1984，1988およびGet zenberg，et al.，Cancer Res.，51: 6514-6520，1991の教示に従って選択された腫瘍から核マトリックスタンパク質を単離した。組織片を小さい（1mm³）切片に細切し、氷上、2mMバナジルリボヌクレオシド（RNase阻害剤）を含む溶液中で 0.5％Triton X-100と共にテフロン乳棒でホモジナイズして、脂質および可溶性タンパク質を放出させた。抽出物を350ミクロンのナイロンメッシュを通過させて濾過し、0.25Mの硫酸アンモニウムで抽出して可溶性細胞骨格成分を放出させた。25℃でDNase処理を使用して可溶性染色質を除去した。残りの分画は、中間径フィラメントおよび核マトリックスタンパク質を含んでいた。この分画を8M尿素で分解し、主として炭水化物および細胞外マトリックス成分から成る不溶性成分をペレット化した。尿素を透析して除き、中間径フィラメントを再び集めて遠心分離で除去した。核マトリックスタンパク質をエタノール沈殿させた。すべての溶液が、セリンプロテアーゼを阻害するための用時調製した1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、0.3μMのアプロトニン、1μMのロイペプチンおよび1μMのペプスタチンを含んでいた。この分画のタンパク質に対する抗体を作成し、核および単離核マトリックス分画に独占的に局在することを証明した。0.1Nの水酸化ナトリウム中にタンパク質を再懸濁し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むクーマシープラス（Coomassie Plus）タンパク質アッセイ試薬キット（Pierce ，Rockford，IL）を標準として使用することによって、タンパク質組成を決定した。二次元ゲル電気泳動の場合、エタノール沈殿させたＮＭＰを、9Mの尿素、65mM の3-[(3-クロルアミドプロピル)-ジメチル-アンモニオ]-1-プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、2.2％の両性電解質および140mMのジチオトレイトールから成る試料緩衝液に溶解した。ＮＭＰを含む最終的なペレットは、総細胞タンパク質 1％未満であった。高解像二次元電気泳動 Investigator 2-Dゲルシステム（Oxford Glycosystems，Bedford，MA）を使用して、高解像二次元ゲル電気泳動を実行した。簡単に記述すると、1.5時間の前電気泳動後、1mm×18cm管ゲルを使用して18,000V-hで一次元等電点電気泳動を実施した。管ゲルを押出して１mmドデシル硫酸ナトリムDuracryl（Oxford Glycosy stems，Bedford，MA）高引張強さポリアクリルアミド電気泳動スラブゲルの上面に載せ、12℃に定温調節して約5時間、ゲルを電気泳動に供した。50％メタノールと10％酢酸でゲルを固定した。完全に洗浄して再度水和した後、ゲルを50mMのリン酸塩（pH7.2）で緩衝化してから5％のグルタルアルデヒドおよび5mMのジチオトレイトールで処理した。ゲルを銀染色（Accurate Chemical Co.，Inc.，Wes tbury，NY）で染色するか、以下の通りにＰＶＤＦ（Immobilon，Millipore Corp oration）に転移させた。核マトリックスタンパク質50μgを各ゲルにロードした。タンパク質分子量標準はDiversified Biotechnology(Newton Center，MA)のSi lver Standardsであった。Gallaro-Schlesiwger，Inc．(Carle Place，NY)およびSigma Chemical Co．(St．Louis，MO)のカルバミル化標準を使用して等電点を決定した。各試料について複数のゲルを実行し、異なる時に複数の試料を実行した。１種の試料の全てのゲルで、明確で且つ再現性のあるタンパク質スポットのみを核マトリックス成分を実際に表すものとして計数した。BioImage電気泳動分析システム（BioImage Electrophoresis Analysis System（BioImage，Ann Arbor，M I））を使用してゲルを分析すると、ゲル間でタンパク質スポットが適合するのでゲルとタンパク質スポットをデータベースにする。以下のＮＭＰを同定した。上記各タンパク質の名称を、第１図〜第５図に示すゲルに示す。さらに、以下の予備調査的配列データが得られている。ＢＬＣＡ−１はアミノ酸配列ＬＡＫＩＶＬを含む。ＢＬＣＡ−４はアミノ酸配列ＥＩＳＱＬＮＡＧおよびＶＹＥＤＩＭＱＫを含む。ＢＬＣＡ−６は、アミノ酸配列ＳＬＤＬＤＬＩＩＡＥＶＫを含む。本発明を、その特定の実施態様を参照しながら詳細に記載してきたが、本発明の範囲および精神から逸脱せずに、本発明に様々な変更および修飾を行うことができることは、当業者に明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者バーンソン，ロバート・アールアメリカ合衆国、15232−1429 ペンシルヴァニア、ピッツバーグ、ペンブローク・プレイス 5200

Claims

【特許請求の範囲】１．正常な膀胱細胞に存在するが、癌性膀胱細胞に存在しない、あるいは、正常な膀胱細胞に存在しないが、癌性膀胱細胞に存在する精製核マトリックスタンパク質またはそのフラグメント。２．前記タンパク質が、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択される請求項１に記載のタンパク質またはフラグメント。３．前記タンパク質が、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ−４、ＢＬＣＡ−５およびＢＬＣＡ−６から成る群から選択される請求項１に記載のタンパク質またはフラグメント。４．請求項１に記載のタンパク質またはフラグメントをコードしている精製ポリヌクレオチド配列。５．請求項４に記載のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成する精製ポリヌクレオチド配列。６．請求項４に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞。７．請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。８．前記ベクターが、ウイルスである請求項７に記載のベクター。９．前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスである請求項８に記載のベクター。１０．前記ＲＮＡウイルスが、レトロウイルスである請求項９に記載のベクター。１１．前記ベクターが、リポソームである請求項７に記載のベクター。１２．前記リポソームが、標的特異的である請求項１１に記載のベクター。１３．前記リポソームが、抗体の標的とされる請求項１２に記載のベクター。１４．前記ベクターが、プラスミドである請求項７に記載のベクター。１５．請求項１に記載のタンパク質に結合する抗体。１６．患者に由来する細胞成分を、細胞増殖性疾患関連の細胞成分に結合する試薬と接触させることを含む、患者の細胞増殖性疾患を検出する方法。１７．前記細胞成分を前記患者の膀胱から採取する請求項１６に記載の方法。１８．前記細胞成分が、核酸である請求項１７に記載の方法。１９．前記核酸が、ＤＮＡである請求項１８に記載の方法。２０．前記核酸が、ＲＮＡである請求項１８に記載の方法。２１．前記細胞成分が、タンパク質である請求項１７に記載の方法。２２．前記試薬が、プローブである請求項１６に記載の方法。２３．前記プローブが、核酸である請求項２２に記載の方法。２４．前記プローブが、抗体である請求項２２に記載の方法。２５．前記抗体が、ポリクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。２６．前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項２４に記載の方法。２７．前記プローブが、検出できるように標識されている請求項２２に記載の方法。２８．前記標識が、放射性同位元素、生物発光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレート、および酵素から成る群から選択される請求項２７に記載の方法。２９．ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ−４、ＢＬＣＡ −５、ＢＬＣＡ−６、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択されたタンパク質と関連した細胞増殖性疾患を治療する方法であって、前記タンパク質の機能を遮断または増強する試薬の治療有効量を、疾患を有する患者に投与することを含む方法。３０．前記試薬が、アンチセンスポリヌクレオチド配列である請求項２９に記載の方法。３１．前記試薬が、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ− ４、ＢＬＣＡ−５、ＢＬＣＡ−６、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択されたタンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列である請求項２９に記載の方法。３２．前記試薬が、抗体である請求項２９に記載の方法。３３．前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項３２に記載の方法。３４．前記細胞増殖性疾患が、膀胱組織に存在する請求項２９に記載の方法。３５．請求項１に記載のタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、宿主となる患者の細胞内に導入することを含む遺伝子治療の方法。３６．前記発現ベクターを前記宿主となる患者の細胞内にイクス・ビボ（ex v ivo）で導入し、形質転換細胞を生成し、この形質転換細胞を前記患者に再導入する請求項３５に記載の方法。３７．前記発現ベクターが、ＲＮＡウイルスである請求項３６に記載の方法。３８．前記ＲＮＡウイルスが、レトロウイルスである請求項３７に記載の方法。３９．前記患者がヒトである請求項３６に記載の方法。４０．膀胱細胞のＮＭＰの機能を遮断または増強する組成物を同定する方法であって、（ａ）膀胱細胞と被験組成物が相互に作用できる条件下で、ＮＭＰを含有する膀胱細胞を被験組成物とインキュベーションすることと、（ｂ）前記被験組成物が前記膀胱細胞のＮＭＰの機能の遮断または増強を引き起こすかどうかを測定することとを含む方法。４１．前記ＮＭＰが、ＢＬＣＡ−１、ＢＬＣＡ−２、ＢＬＣＡ−３、ＢＬＣＡ −４、ＢＬＣＡ−５、ＢＬＣＡ−６、ＢＬＮＬ−１、ＢＬＮＬ−２、およびＢＬＮＬ−３から成る群から選択される請求項４０に記載の方法。４２．測定される効果が、ＮＭＰの機能の遮断である請求項４０に記載の方法。４３．測定される効果が、ＮＭＰの機能の増強である請求項４０に記載の方法。４４．請求項１に記載のタンパク質またはフラグメントを同定するためのプローブ、あるいは、請求項１に記載のタンパク質またはフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列を同定するためのプローブを含む請求項１に記載のタンパク質と関連した細胞増殖性疾患の検出に有用なキット。４５．前記プローブが、前記タンパク質またはフラグメントに結合することができる抗体である請求項４４に記載のキット。４６．前記プローブが、タンパク質またはフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成することができるポリヌクレオチドプローブである請求項４４に記載のキット。４７．前記タンパク質またはフラグメントをコードしているポリヌクレオチド配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーが入っている容器をさらに含む請求項４６に記載のキット。