ES2320585T3 - Autoanticuerpos contra anexinas utilizados como marcadores para el cancer de pulmon. - Google Patents
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Abstract
Uso de una proteína anexina seleccionada de Anexina I y Anexina II para detectar autoanticuerpos para antígeno de proteína anexina en una muestra biológica derivada de un sujeto sospechoso de tener cáncer de pulmón.
Description
Autoanticuerpos contra anexinas utilizados como
marcadores para el cáncer de pulmón.
La presente invención se refiere al uso de
proteínas anexinas, para la detección de autoanticuerpos para
proteínas anexinas, como indicador de diagnóstico, predictivo o
pronóstico de cáncer de pulmón. La invención se demuestra mediante
ejemplos en los que se han observado niveles elevados de
autoanticuerpos circulantes reactivos contra proteínas anexinas en
los sueros de sujetos con cáncer.
Se ha demostrado que varias proteínas celulares
aparecen con niveles aumentados en los fluidos corporales de
sujetos con diferentes tipos de cáncer. Los niveles aumentados de
tales proteínas en sujetos con cáncer proporcionan ensayos
diagnósticos y pronósticos para determinar la presencia de cáncer.
Por ejemplo, los niveles en suero elevados del antígeno específico
de la próstata (PSA) se usan con frecuencia como un indicador de la
presencia de cáncer de próstata en hombres.
Se conoce que los autoanticuerpos para proteínas
celulares normales o modificadas se producen por pacientes en
ciertas enfermedades tales como las enfermedades autoinmunitarias y
los trastornos relacionados con el sistema cardiovascular, en
algunos casos incluso antes de que la enfermedad haya producido
síntomas manifiestos. También existe una evidencia creciente de una
respuesta inmunitaria humoral al cáncer en seres humanos, tal como
se demuestra por la identificación de anticuerpos contra varios
antígenos intracelulares y de superficie en pacientes con diversos
tumores (Gourevitch et al., 1995, Br. J. Cancer
72:934-938; Yamamoto et al., 1996, Int. J.
Cancer, 69:283-289; Stockert et al., 1998, J.
Exp Med. 187:1349-1354; Gure et al., 1998,
Cancer Res. 58:1034-1041). Por ejemplo, las
alteraciones somáticas en el gen p53 obtienen una respuesta humoral
en el 30-40% de los pacientes afectados (Soussi,
1996, Immunol. Today 17:354-356). En algunos casos,
la detección de anticuerpos anti-p53 puede ser
anterior al diagnóstico del cáncer (Lubin et al., 1995, Nat.
Med. 7:701-702; Cawley et al., 1998,
Gastroenterology 115:19-27). La patente de los
EE.UU. nº 5.405.749 da a conocer un método para detectar un
autoantígeno de la retinopatía asociada al cáncer y para someter a
ensayo el suero del paciente para identificar un autoanticuerpo
para el autoantígeno. Además, se han observado aumentos en las
tasas relativas de la síntesis de las proteínas citoesqueléticas
principales en la superficie de las células leucémicas y de los
linfocitos transformados por mitógenos y los virus de
Epstein-Barr (Bachvaroff, R.J. et al., 1980,
Proc. Natl Acad. Sci. 77:4979-4983).
La mayoría de los antígenos derivados de tumores
que se han identificado y que obtienen una respuesta humoral no son
los productos de genes mutados. Incluyen antígenos de diferenciación
y otros productos génicos que se sobreexpresan en tumores (Old y
Chen, 1998, J. Exp. Med. 187:1163-1167). No está
claro por qué sólo un subconjunto de pacientes con un tipo de tumor
desarrollan una respuesta humoral para un antígeno en particular.
Los factores que influyen en la respuesta inmunitaria pueden incluir
la variabilidad entre individuos en las moléculas del complejo de
histocompatibilidad principales. También es posible que las
proteínas puedan volverse inmunogénicas tras sufrir una
modificación posterior a la traducción, un proceso que puede ser
variable entre tumores de un tipo similar.
El cáncer de pulmón es el cáncer más común en
los Estados Unidos y asciende a más de un cuarto (28%) de los
fallecimientos por cáncer en los EE.UU. (Travis et al., 1996,
Cancer 77:2464-2470). Se han identificado varias
alteraciones moleculares que incluyen la amplificación de
c-myc, mutaciones de Ki-ras o p53
que pueden afectar al comportamiento del tumor (Mao et al.,
1994, Cancer Res 54:1634-1637, Mills et al.,
1995, J. Natl. Cancer Inst. 87:1056-1060, Gao et
al., 1997, Carcinogenesis 18:473-478). Se ha
informado acerca de autoanticuerpos séricos contra los oncogenes
del producto y los genes supresores del tumor, tales como
c-myc (Ben-Mahrez et al.,
1990, Int. J. Cancer 46:35-38),
c-myb (Sorokine et al., 1991, Int. J. Cancer
47:665-669),
c-erbB-2 (Pupa et al., 1993,
Cancer Res 53:5864-5866), ras (Takahashi et
al., 1995, Clin. Cancer 1:107) y p53 (Peyrat et al.,
1995, Lancet 345:621-622; Iizasa et al.,
1998, Cancer Immunol. Immunother. 46:345-349) en
pacientes con diversas enfermedades malignas. Se ha informado acerca
de autoanticuerpos contra los productos del oncogén
L-myc en un 10% de los sueros de pacientes con
cáncer de pulmón (Yamamoto et al., 1996, Int. J. Cancer
69:283-289). También se han detectado
autoanticuerpos séricos contra p53 en sueros de pacientes con
cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Iizasa et
al., 1998, Cancer Immunol. Immunother.
46:345-349). Los títulos de suero elevados de los
autoanticuerpos anti-p53 estaban presentes en
aproximadamente el 20% de los casos de (NSCLC), y la incidencia de
estos autoanticuerpos refleja la presencia de mutaciones de p53 y
una sobreexpresión de p53 (Yamamoto et al., 1996, Int. J.
Cancer 69:283-289).
La detección de autoanticuerpos para antígenos
celulares y la identificación de proteínas que han obtenido
autoanticuerpos se han llevado a cabo usando una diversidad de
enfoques. Por ejemplo, el antígeno nuclear de proliferación celular
(PCNA) se describió primeramente como un antígeno nuclear que unía
anticuerpos de algunos pacientes con lupus eritematoso (Miyachi,
K., Fritzler, M.J., y Tan, E.M., 1978, J. Immunol
121:2228-2234). Posteriormente se observó que los
linfocitos restantes no reaccionaron con el anticuerpo, al contrario
que los linfocitos estimulados por mitógeno que mostraron tinción
nuclear. Esto último condujo a la identificación de la proteína,
denominada PCNA que se reconoce por este autoanticuerpo en el lupus
(Tan, E.M., Ogata, K., y Takasaki, Y., 1987, J. Rheumatol.,
13:89-96). En algunos otros casos, las proteínas
candidatas se seleccionan e investigan con respecto a su capacidad
para inducir anticuerpos en pacientes, tal como se investigó para
p53 (Crawford, L.V., Firm, D.C., Bulbrook, R.D., 1984, Int J Cancer
30:403-408). Además, una técnica denominada SEREX
se basa en análisis serológicos de genotecas de expresión de ADNc
recombinante para identificar antígenos tumorales (Old, L., et
al. 1998, J. Exp. Med. 187:1163-1167). De este
modo, se han seguido muchos enfoques para buscar proteínas contra
las que puedan producirse anticuerpos.
Las anexinas son una familia de proteínas que se
unen a fosfolípidos dependientes de calcio que se expresan de forma
ubicua en diferentes tipos de tejidos y células de eucariotas
superiores e inferiores (Benz, J. y Hofmann, A, 1997, Biol. Chem
378:177-183). Se han identificado al menos doce
proteínas anexinas. Entre las múltiples funciones sugeridas para la
familia de proteínas anexinas, las que implican a las proteínas en
la regulación de la exocitosis siguen siendo las más convincentes
(Donnelly, SR y Moss SE, Cell, 1997, Mol. Life Sci
53:533-538). Una proteína anexina típica se
caracteriza por dos rasgos definidos, (i) unión a fosfolípidos
dependiente de Ca^{2+}; y (ii) en presencia de un elemento de
secuencia conservada de aproximadamente 70 aminoácidos que se
repite cuatro u ocho veces en un miembro dado de la familia.
Estudios inmunocitoquímicos de anexinas han demostrado que residen
subadyacentes a las membranas plasmáticas, cerca de los orgánulos
intracelulares que secuestran calcio (Gerke, V y Moss, SE, 1997,
Biochimica et Biophysica Acta 1357:129-154). Las
propiedades físicas asociadas a las anexinas incluyen inhibición de
la fosfolipasa A_{2}, actividad anticoagulante, unión a proteínas
citoesqueléticas, agregación de membranas y vesículas y actividad de
canal selectiva de calcio. Se ha encontrado que los niveles
aumentados de anexina se asocian a varias enfermedades que incluyen
la esclerosis múltiple y la neuritis experimental.
Kraus, M. et al en J. Immunoassay, 13
(3), (1992), 411-439 describen el desarrollo de
inmunoensayos para determinar cuantitativamente autoanticuerpos
contra 6 miembros de la familia de anexinas. Resultados preliminares
obtenidos de sueros de pacientes con melanoma maligno demostraron
una presencia bastante frecuente de autoanticuerpos. Sin embargo,
concluyen que el significado patofisiológico de tales
autoanticuerpos es todavía desconocido.
Bastian, B.C et al en J Dermatol Science,
8 (1994) 194-202 observaron que los autoanticuerpos
dirigidos contra diversas anexinas podían detectarse tanto en los
grupos control como en los grupos enfermos, sin manifestar ninguna
correlación significativa con ninguno de los estados de enfermedad,
que incluían enfermedades autoinmunitarias, psoriasis, úlcera de
pierna, melanoma maligno y enfermedades diversas.
Bastion, B.C. en CMLS Cellular & Molecular
Life Sciences, 53 (b), (1997), 554-556 describe la
detección de autoanticuerpos contra varias anexinas en pacientes
con enfermedades autoinmunitarias tales como lupus sistémico
eritematoso, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del
intestino.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar métodos de detección para la valoración diagnóstica y
pronóstica de cáncer de pulmón, para la identificación de sujetos
con predisposición a cáncer, y la monitorización de pacientes
sometidos a tratamiento de cáncer, basándose en la detección de
niveles elevados de autoanticuerpos frente a anexina en muestras
biológicas de sujetos.
La presente invención se refiere a la valoración
diagnóstica y el pronóstico de cáncer mediante la detección de
autoanticuerpos para antígenos de proteínas anexinas en el suero de
sujetos con cáncer de pulmón o con lesiones de pulmón
precancerosas. La detección de niveles séricos aumentados de
autoanticuerpos para proteínas anexinas constituye una estrategia
novedosa para la selección, el diagnóstico y el pronóstico del
cáncer.
La presente invención proporciona el uso de
antígenos de proteínas anexinas en inmunoensayos diseñados para
detectar la presencia de autoanticuerpos séricos para antígenos de
proteínas anexinas. Tales inmunoensayos se utilizan para el
diagnóstico y el pronóstico de cáncer de pulmón. Según la invención,
la medición de los niveles de autoanticuerpos frente a anexina en
un suero de un sujeto puede usarse para el diagnóstico temprano de
cáncer. Además, puede usarse la monitorización de los niveles de
autoanticuerpos séricos con un fin pronóstico para representar la
progresión de la enfermedad.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los niveles de expresión de Anexina I y II
están aumentados en las muestras de tejido tumoral derivadas de
sujetos con adenocarcinoma pulmonar o cáncer de pulmón de células
escamosas. Adicionalmente, se detectaron niveles aumentados de
autoanticuerpos contra Anexina I y II en el suero de sujetos con
adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de células escamosas. El hecho
de encontrar que los niveles de proteínas anexinas y
autoanticuerpos frente a anexina están aumentados en las muestras
derivadas de sujetos con cáncer proporciona una base para el
desarrollo de métodos diagnósticos y pronósticos así como de medios
para monitorizar la eficacia de diversos tratamientos terapéuticos
del cáncer.
Figura 1. Electroforesis en gel bidimensional de
lisados de células A549. Se tiñó el gel con plata para visualizar
las proteínas.
Figura 2. Inmunotransferencia (Western blot) de
una separación en gel bidimensional de un lisado de células A549
tratadas con suero de un paciente con cáncer de pulmón. Se observó
reactividad en un grupo de manchas de proteínas contiguas
denominado A1 con un pI de entre 6,3 y 6,8 y un peso molecular de 37
kDa.
Figura 3. Inmunorreactividad de IgM contra
proteínas de cáncer de pulmón. Inmunotransferencia de una separación
en gel bidimensional de lisados de A549 tratadas con suero de
pacientes con cáncer de pulmón. Posteriormente se incubaron las
membranas con un anticuerpo IgM antihumano de oveja conjugado con
peroxidasa de rábano picante.
Figura 4. Inmunorreactividad del subtipo de IgG
contra sueros de pacientes con cáncer de pulmón. Inmunotransferencia
de una separación en gel bidimensional de lisados de A549 con suero
de pacientes con cáncer de pulmón. Posteriormente se hibridaron las
membranas con anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 antihumanos de
ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante.
Figura 5. Especificidad de anticuerpos IgG de A1
y A2 para sueros de pacientes con cáncer de pulmón. Se hibridaron
las membranas que contenían lisados de A549 con sueros de pacientes
con melanoma, cáncer de mama, cáncer de hígado o cáncer de esófago.
Ninguno de los sueros mostró inmunorreactividad basada en IgG contra
A2. Se observaron proteínas A1 con sueros de pacientes con cáncer
de esófago (5/8), cáncer de mama (1/11), pero estaban ausentes con
sueros de pacientes con melanoma (0/7) y cáncer de hígado
(0/11).
Figura 6. Los anticuerpos
anti-Anexina I y anti-Anexina II son
inmunorreactivos contra las proteínas en las manchas de A1 y A2,
respectivamente.
La presente invención consigue un objetivo
sumamente deseable, concretamente proporcionar métodos para la
evaluación diagnóstica y pronóstica de sujetos con cáncer de pulmón
y la identificación de sujetos que muestran una predisposición a
desarrollar cáncer de pulmón. Los ensayos de la invención comprenden
métodos diseñados para detectar la presencia de autoanticuerpos
frente a anexina, en muestras de suero u otras muestras biológicas
de un sujeto. Para los fines de la presente invención, las proteínas
anexinas se caracterizan por un motivo canónico en el que un tramo
de aproximadamente 70 aminoácidos se repite al menos cuatro veces
(Wallner, B.P. et al., 1986, Nature
320:77-80; Weber, K. y Johnson, N., 1986, FEBS Lett.
203:95-98; Saris, C.J.M. et al., 1986, Cell
46:201-212; Huang K.S. et al., 1986, Cell
46:191-199).
Anexina I y II y péptidos derivados de las
mismas, se purifican y utilizan para detectar en un suero de un
sujeto la presencia de autoanticuerpos circulantes para tales
antígenos de proteína, mediante ensayos inmunoabsorbentes sensibles
y rápidos o mediante otros procedimientos.
Los métodos pueden llevarse a cabo, por ejemplo,
utilizando kits diagnósticos previamente empaquetados que
comprenden un fragmento de proteína anexina o de proteína antigénica
para la detección de autoanticuerpos frente a anexina en una
muestra derivada de un sujeto.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que los niveles de proteínas anexinas I y II están
aumentados en el adenocarcinoma y los tumores de pulmón de células
escamosas derivados de sujetos con cáncer. Adicionalmente, se han
detectado niveles aumentados de autoanticuerpos circulantes
reactivos contra proteínas anexinas en el suero de sujetos que
tienen adenocarcinoma y tumores de pulmón de células escamosas.
Pueden usarse mediciones de los niveles de
proteínas anexinas en muestras derivadas de un sujeto para el
diagnóstico temprano de enfermedades tales como el cáncer. Por otra
parte, pueden usarse la monitorización y cuantificación de los
niveles de proteína anexina con un fin pronóstico para representar
la progresión de la enfermedad y para valorar la eficacia de los
agentes usados para tratar a un sujeto con cáncer.
La detección de proteínas anexinas en una
muestra de un sujeto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de
varios métodos. Los métodos diagnósticos preferidos para la
detección de proteínas anexinas en la muestra biológica de un
sujeto pueden incluir, por ejemplo, inmunoensayos en los que las
proteínas anexinas se detectan por su interacción con un anticuerpo
específico de anexina. Los anticuerpos pueden usarse para detectar
cuantitativa o cualitativamente la presencia de anexinas o
fragmentos antigénicos de las mismas. Además, pueden usarse
reactivos distintos a los anticuerpos, tales como, por ejemplo,
polipéptidos que se unen específicamente a proteínas anexinas en
ensayos para detectar el nivel de expresión de proteína anexina.
Alternativamente, la detección de proteínas anexinas puede llevarse
a cabo mediante la detección y medición de los niveles de las
propiedades biológicas asociadas a las proteínas anexinas, tales
como por ejemplo, la fosfolipasa A, y la actividad
anticoagulante.
Los inmunoensayos incluyen sistemas de ensayo
que usan técnicas tales como inmunotransferencias,
radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas), inmunoensayos de intercalación ("sandwich"), ensayos
de inmunoprecipitación, reacciones con precipitina, reacciones con
precipitina por difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos
de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos
inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos
con proteína A, para nombrar solamente algunos.
Se obtiene una muestra biológica que puede
contener proteínas anexinas, tales como tejido de pulmón u otro
tejido biológico, de un sujeto sospechoso de tener un cáncer o
riesgo de cáncer en particular. Se solubilizan alícuotas de tejidos
completos, o células, usando cualquiera de una diversidad de
combinaciones de solubilización conocidas por los expertos en la
técnica. Por ejemplo, puede solubilizarse un tejido mediante la
adición de un tampón de lisis que comprende (por litro) urea 8 M,
20 ml de tensioactivo Nonidet P-40, 20 ml de
anfólitos (pH 3,5-10), 20 ml de
2-mercaptoetanol, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo
(PMSF) 0,2 mM en agua destilada desionizada.
Los inmunoensayos para detectar la expresión de
la proteína anexina comprenden normalmente poner en contacto la
muestra biológica, tal como una muestra de tejido derivada de un
sujeto, con un anticuerpo anti-anexina en
condiciones tales que pueda producirse una reacción de unión
antígeno-anticuerpo inmunoespecífica, y detectar o
medir la magnitud de cualquier unión inmunoespecífica por el
anticuerpo. En un aspecto específico, puede usarse una unión de
anticuerpo de este tipo, por ejemplo, para detectar la presencia y
la producción aumentada de proteínas anexinas en las que la
detección de la producción aumentada de proteínas anexinas es una
indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de proteína
anexina en una muestra biológica se comparan con normas
establecidas para individuos normales que coinciden en edad y sexo y
para sujetos con una diversidad de estados de enfermedad no
cancerígenos o precancerígenos.
La muestra biológica, tal como un extracto de
tejido, se pone en contacto con un soporte o portador de fase
sólida, tal como nitrocelulosa, para inmovilizar cualquier proteína
presente en la muestra. Luego se lava el soporte con tampones
adecuados seguido de un tratamiento con un anticuerpo específico de
anexina marcado de manera detectable. Luego se lava el soporte de
fase sólida con el tampón una segunda vez para eliminar anticuerpos
no unidos. La cantidad de anticuerpos unidos en el soporte sólido se
determina entonces según métodos bien conocidos. Los expertos en la
técnica podrán determinar las condiciones de ensayo opcionales para
cada determinación empleando la experimentación habitual.
Una de las maneras en las que los anticuerpos
frente a anexina pueden marcarse de manera detectable es ligando el
anticuerpo a una enzima, tal como para el uso en un inmunoensayo
enzimático (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent
Assay (ELISA)", 1978, Diagnostic Horizons 2:1-7,
Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD;
Voller, A., et al., 1978, J. Clin. Pathol.
31:507-520; Butler, J.E., 1981, Meth. Enzymol.
73:482-523). La enzima que se une al anticuerpo
reaccionará con un sustrato apropiado, preferiblemente un sustrato
cromogénico, de manera que produzca un resto químico que pueda
detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos,
fluorimétricos o visuales. Las enzimas que pueden usarse para marcar
el anticuerpo de manera detectable incluyen, pero no se limitan a,
peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. La detección
puede llevarse a cabo también mediante métodos colorimétricos que
emplean un sustrato cromogénico para la enzima.
La detección de anticuerpos frente a anexina
puede llevarse a cabo también usando una diversidad de otros
métodos. Por ejemplo, marcando los anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos de manera radioactiva, es posible detectar la expresión
de la proteína anexina a través del uso de un radioinmunoensayo
(RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of
Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isótopo
radioactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un
contador gamma o un contador de centelleo o mediante
autorradiografía.
El anticuerpo también puede marcarse con un
compuesto fluorescente. Entre los compuestos de marcado fluorescente
usados más comúnmente se encuentran el isocianato de fluoresceína,
la rodamina, ficoeritrina y fluorescamina. Asimismo, puede usarse
un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo frente a
anexina. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina
detectando la presencia de luminiscencia. Compuestos de
bioluminiscencia importantes para los fines de marcado son la
luciferina, luciferasa y aequorina.
Los niveles de proteínas anexinas en muestras
biológicas pueden analizarse mediante electroforesis bidimensional
en gel. Los expertos en la técnica conocen los métodos de
electroforesis bidimensional. Las muestras biológicas, tales como
muestras de tejidos, se cargan sobre geles electroforéticos para una
separación de isoelectroenfoque en la primera dimensión que separa
proteínas basándose en la carga. Pueden utilizarse varias
preparaciones en gel de primera dimensión que incluyen geles en
tubo para separaciones basadas en anfólitos portadores o tiras de
gel para separaciones basadas en gradientes inmovilizados. Tras la
separación de primera dimensión, las proteínas se transfieren al
segundo gel de dimensión, siguiendo un procedimiento de equilibrado
y se separan usando la SDS PAGE que separa las proteínas basándose
en el peso molecular. Cuando se comparan las muestras biológicas
derivadas de diferentes sujetos, se preparan múltiples geles a
partir de muestras biológicas individuales (incluyendo muestras de
controles normales).
Tras la separación, se transfieren las proteínas
desde los geles bidimensionales a las membranas usadas comúnmente
para la realización de inmunotransferencias. Las técnicas para la
realización de inmunotransferencias y la visualización posterior de
proteínas también se conocen bien en la técnica (Sambrook et
al, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición,
volumen 3, 1989, Cold Spring Harbor). Pueden usarse los
procedimientos habituales, o pueden modificarse los procedimientos
tal como se conoce en la técnica para la identificación de
proteínas de un tipo en particular, tales como las muy básicas o
ácidas, o solubles en lípidos, etc. (Véase, por ejemplo, Ausubel,
et al., 1999, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
& Sons, Inc., N.Y.). Los anticuerpos que se unen a las
proteínas anexinas se utilizan en una etapa de incubación, tal como
en el procedimiento de análisis de inmunotransferencia. Un segundo
anticuerpo específico para el primer anticuerpo se utiliza en el
procedimiento de análisis de inmunotransferencia para visualizar las
proteínas que reaccionaron con el primer anticuerpo.
\newpage
La detección de niveles de proteína anexina en
muestras biológicas también puede usarse para monitorizar la
eficacia de los agentes anticancerígenos potenciales durante el
tratamiento. Por ejemplo, el nivel de producción de proteína
anexina puede determinarse antes y durante el tratamiento. La
eficacia del agente puede seguirse comparando la expresión de
anexina a lo largo del tratamiento. Los agentes que muestran
eficacia son los que reducen el nivel de producción de proteína
anexina a medida que progresa el tratamiento con el agente.
Se han detectado niveles elevados de proteínas
anexinas en muestras de tejidos derivadas de pacientes con
adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón de células escamosas.
En particular, se detectaron niveles aumentados de Anexina I y II
en muestras derivadas de pacientes con cáncer de pulmón. La
detección y/o medición cuantitativa de proteínas anexinas en
muestras biológicas puede usarse para detectar sujetos que presentan
riesgo de desarrollar ciertos tipos de cáncer u otros trastornos
proliferativos en los que se sobreexpresan las proteínas anexinas.
Además, pueden usarse las diferencias cualitativas en el patrón de
incidencia en los diferentes fluidos séricos o biológicos de
diferentes miembros de la familia de anexina de proteínas como un
indicador de detección, diagnóstico o pronóstico de cáncer o riesgo
de cáncer.
La presente invención proporciona el diagnóstico
y pronóstico de cáncer de pulmón basándose en la detección de
autoanticuerpos frente a anexina circulantes en un sujeto. El método
obtiene validez mediante el uso de una muestra biológica de un
sujeto con cáncer y de controles que coinciden en edad y sexo, sin
cáncer. Una muestra biológica que puede contener autoanticuerpos,
tal como suero, se obtiene de un sujeto sospechoso de tener un
cáncer en particular o sospechoso de tener predisposición a
desarrollar cáncer. Un fluido orgánico similar se obtiene de un
sujeto control que no tiene cáncer.
La medición de autoanticuerpos reactivos contra
los antígenos de proteína anexina puede usarse para el diagnóstico
temprano de enfermedades tales como cáncer de pulmón. Por otra
parte, la monitorización de los niveles de autoanticuerpos puede
usarse de manera pronóstica para representar la progresión de la
enfermedad. La detección de autoanticuerpos en una muestra de suero
de un paciente puede llevarse a cabo mediante varios métodos. Tales
métodos incluyen inmunoensayos que incluyen, pero no se limitan a,
sistemas de ensayo que usan técnicas tales como
inmunotransferencias, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de intercalación
("sandwich"), ensayos de inmunoprecipitación, reacciones con
precipitina, reacciones con precipitina por difusión en gel,
ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de
fijación del complemento, ensayos inmu-
norradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, para nombrar solamente algunos.
norradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con proteína A, para nombrar solamente algunos.
Un inmunoensayo de este tipo se lleva a cabo por
un método que comprende poner en contacto una muestra de suero
derivada de un sujeto con una muestra que contiene los antígenos de
proteína anexina en condiciones tales que pueda producirse una
reacción de unión antígeno-anticuerpo
inmunoespecífica, y detectar o medir la magnitud de cualquier unión
inmunoespecífica por el autoanticuerpo. En un aspecto específico,
una unión de este tipo de un autoanticuerpo por secciones
tisulares, por ejemplo, puede usarse para detectar la presencia de
un autoanticuerpo en el que la detección de un autoanticuerpo es una
indicación de un estado de enfermedad. Los niveles de
autoanticuerpos en una muestra de suero se comparan con los niveles
presentes en una muestra de suero análoga de un sujeto que no tiene
el trastorno.
Los inmunoensayos pueden llevarse a cabo de
diversas maneras. Por ejemplo, un método para llevar a cabo tales
ensayos implica anclar la proteína anexina a un soporte sólido y
detectar los anticuerpos anti-anexina unidos
específicamente a la misma. Las proteínas anexinas que deben
utilizarse en los ensayos de la invención pueden prepararse a
través de técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica.
Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica para una proteína
anexina o un fragmento antigénico de la misma pueden crearse
mediante ingeniería genética para dar un vector de expresión
apropiado para una preparación a gran escala de proteína anexina.
Puede ser ventajoso crear proteínas de fusión que puedan facilitar
el marcado, inmovilización o detección de proteína anexina. Véanse,
por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, N.Y. Alternativamente, la proteína anexina
puede purificarse a partir de fuentes naturales, por ejemplo,
purificarse a partir de células, usando las técnicas de separación
de proteínas bien conocidas en la técnica. Tales técnicas de
purificación pueden incluir, pero no se limitan a la cromatografía
con tamiz molecular y/o cromatografía de intercambio de iones. En la
práctica, se utilizan de manera conveniente placas de microtítulo
como soporte sólido para las proteínas anexinas. Las superficies
pueden prepararse de antemano y almacenarse.
La presente invención se demuestra mediante
ejemplos en los que se han detectado niveles elevados de
autoanticuerpos circulantes reactivos contra diversos antígenos de
proteína anexina en los sueros de pacientes con cáncer. Puede
usarse la detección y/o medición cuantitativa de autoanticuerpos
anti-anexina circulantes en suero para detectar
sujetos con riesgo de padecer cáncer u otros trastornos
proliferativos en los que los niveles de proteína anexina están
aumentados.
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Las proteínas anexinas pueden usarse también
como antígenos para inmunizar pacientes que padecen enfermedades
caracterizadas por la producción de los antígenos de proteína
anexina. La estimulación de una respuesta inmunológica para tales
antígenos, pretende provocar un ataque más eficaz en las células
tumorales; tal como, entre otros, inhibir el crecimiento de células
tumorales o facilitar la destrucción de células tumorales. La
identificación de autoanticuerpos para antígenos de proteína
anexina asociados a cánceres particulares proporciona una base para
el inmunoterapia de la enfermedad.
El paciente puede inmunizarse con los antígenos
de proteína anexina para provocar una respuesta inmunitaria que
facilite la destrucción de células tumorales o la inhibición del
crecimiento de células tumorales. Los antígenos de proteína anexina
pueden prepararse usando los métodos descritos anteriormente para la
purificación de proteínas.
Puede usarse un inmunógeno que comprende un
antígeno de proteína anexina purificado para el que el paciente con
cáncer ha desarrollado autoanticuerpos, para provocar una respuesta
inmunitaria. Para la administración, el antígeno de proteína
anexina debe formularse con un adyuvante adecuado con el fin de
potenciar la respuesta inmunológica para el antígeno de proteína.
Adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, geles
minerales, por ejemplo, hidróxido de aluminio, sustancias
tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos,
polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, y adyuvantes humanos
potencialmente útiles tales como BCG (bacilos de
Calmett-Guerin) y (Corynebacterium
parvum). Pueden usarse muchos métodos para introducir las
formulaciones derivadas anteriormente; incluyendo, pero sin
limitarse a, formulaciones orales, intradérmicas, intramusculares,
intraperitoneales, intravenosas y subcutáneas.
Los ensayos descritos en el presente documento
pueden llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando kits diagnósticos
previamente empaquetados, que comprenden al menos un péptido de
anexina (para la detección de autoanticuerpos frente a Anexina) que
pueden usarse convenientemente, por ejemplo, en la práctica clínica
para diagnosticar trastornos tales como cáncer.
Un kit comprende componentes para detectar y/o
medir anticuerpos IgG humanos dirigidos hacia antígeno de anexina.
Como un ejemplo, en el que los anticuerpos se detectan y/o miden
mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), tales
componentes pueden comprender antígeno diana, en forma de al menos
uno y preferiblemente una pluralidad de diferentes antígenos de
anexina o epítopos de los mismos, ligados a una fase sólida, y un
medio para detectar un anticuerpo humano unido a antígeno diana.
Tales medios para la detección pueden ser, por ejemplo, un
anticuerpo dirigido hacia la región constante de IgG humana (por
ejemplo, anticuerpo IgG anti-humano de conejo), que
puede en sí marcarse de manera detectable (por ejemplo, con un
marcador radioactivo, fluorescente, colorimétrico o enzimático), o
que puede detectarse mediante un anticuerpo secundario marcado (por
ejemplo, anticuerpo anti-conejo de cabra).
Usando los métodos de la presente invención, se
detectó la reactividad contra las proteínas anexinas en sueros
obtenidos de sujetos con cáncer. Se encontró que las muestras de
suero de los sujetos con cáncer eran reactivas contra las proteínas
anexinas. Además, se observaron niveles aumentados en la producción
de proteínas anexinas en muestras tisulares derivadas de sujetos
con cáncer.
Todos los reactivos de cultivo celular,
incluyendo el medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, que
contiene L-glutamina, piruvato de sodio y
clorhidrato de piridoxina), la solución salina tamponada con fosfato
(PBS) de Dulbecco, suero bovino fetal y penicilina/estreptomicina
se obtuvieron de GIBCO-BRL (Grand Island, N.Y.). Se
obtuvieron anticuerpos monoclonales anti-Anexina I y
II de ratón de ICN (Costa Mesa, C.A). Se compraron anticuerpos
monoclonales IgM anti-humanos de ratón en la empresa
Sigma Chemical (St. Louis, MO). Se adquirieron anticuerpos IgG1,
IgG2, IgG3 e IgG4 anti-humanos de ratones conjugados
con peroxidasa de rábano picante en la empresa Zymed (San
Francisco, CA). Se obtuvieron anticuerpos IgG
anti-humanos de oveja conjugados con peroxidasa de
rábano picante y anticuerpos monoclonales IgG
anti-ratón, el kit ECL (de quimioluminiscencia
intensificada) y la película Hyperfilm MP de Amersham (Arlington
Heights, IL). Se compraron membranas Immobilon-P de
PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) en Millipore Corp.
(Bedford, Mass.). La acrilamida usada en la primera electroforesis
dimensional, la urea, el persulfato de amonio y la PDA (piperazina
diacrilamida) se compraron todos en Bio-Rad
(Rockville Center, N.Y.). La acrilamida usada en la segunda
electroforesis dimensional se compró en Serva (Crescent Chemical,
Hauppauge, N.Y.) y los anfólitos portadores (pH de 4 a 8) y el
NP-40 se compraron ambos en Gallard/Schlessinger
(Carle Place, N.Y.). Todos los demás reactivos y productos químicos
se obtuvieron o bien de Fisher o bien de Sigma y eran de la mayor
pureza disponible.
Se cultivaron líneas celulares de adenocarcinoma
humano A549 a 37ºC en una incubadora humidificada con el 6% de
CO_{2} en DMEM complementado con 10% de suero bovino fetal, 100
U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Se hicieron pases
semanales de las células hasta que habían alcanzado una confluencia
del 70-80%.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo tejido tumoral fresco en el momento
del diagnóstico (por ejemplo, tejido de biopsia) de pacientes con
cáncer de pulmón. El protocolo experimental fue aprobado por el
"Institutional Review Board for Approved Research Involving Human
Subjects" (Consejo de revisión institucional para la
investigación aprobada que implica sujetos humanos) de la
Universidad de Michigan. Antes del estudio se obtuvo el
consentimiento informado de los pacientes (o de sus familias). Tras
la escisión, se congeló inmediatamente el tejido tumoral a -80ºC,
tras lo cual se solubilizaron cantidades reducidas de tejido tumoral
en tampón de solubilización y se conservaron a -80ºC hasta su uso.
Se lisaron las células cultivadas por adición de 200 \mul de
tampón de solubilización que comprendía urea 8 M,
NP-40 al 2%, anfólitos portadores al 2% (pH de 4 a
8), \beta-mercaptoetanol al 2% y PMSF 10 mM, y se
recogieron usando un rascador de células. Tras añadir 100 \mul
adicionales de tampón de solubilización, se transfirió la
disolución que contenía los extractos celulares a tubos de microfuga
y se conservaron a -80ºC hasta su uso.
Se separaron proteínas derivadas a partir de
extractos, tanto de células cultivadas como de tumores sólidos, en
dimensiones tal como se describió previamente (Strahler et
al., 1989, Two-dimensional polyacrylamide gel
electrophoresis of proteins. En "Protein Structure: A Practical
Approach" T.E. Creighton (ed.) IRL Press, Oxford, R.U., págs.
65-92), con algunas modificaciones. Brevemente, tras
la lisis celular en tampón de solubilización, se aplicaron 35
\mul de alícuotas de células cultivadas o de tejido tumoral
solubilizadas derivadas de aproximadamente 2,5 x 10^{6} células
sobre geles de isoenfoque. Se llevó a cabo un isoelectroenfoque
usando anfólitos portadores con un pH de 4 a 8 a 700 V durante 16
h, seguido de 1000 V durante 2 h adicionales. Se cargó el gel de
tubo de primera dimensión sobre un casete que contenía el gel de
segunda dimensión, tras equilibrado en un tampón de muestra de
segunda dimensión (Tris 125 mM (pH 6,8), que contenía glicerol al
10%, SDS al 2%, ditiotreitol al 1% y azul de bromofenol). Para la
separación de segunda dimensión, se usó un gradiente de acrilamida
de desde el 11% hasta el 14%, y las muestras se sometieron a
electroforesis hasta que la parte delantera del colorante había
alcanzado el extremo opuesto del gel. Se transfirieron las proteínas
separadas a una membrana de PVDF Immobilon-P. Se
visualizaron los patrones de proteína en algunos geles mediante
tinción con plata, y en algunas membranas
Immobilon-P mediante tinción de las membranas con
azul de Coomassie. Se incubaron las membranas no teñidas preparadas
para la hibridación con tampón de bloqueo (que comprendía solución
salina tamponada con Tris (TBS) que contenía el 1,8% de leche en
polvo desnatada y el 0,1% de Tween 20) durante 2 h, luego se lavó y
se incubó con suero obtenido o bien de pacientes, o con suero
control normal (300 \mul de suero, a una dilución de 1:100)
durante 1 h a temperatura ambiente. Tras tres lavados con tampón de
bloqueo, se incubaron las membranas con un anticuerpo IgG
anti-humano de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano picante (a una dilución de 1:1000) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Se lavaron las membranas 5 veces con TBS que
contenía el 0,1% de Tween 20, una vez en TBS, se incubaron
brevemente en ECL y se expusieron a Hyperfilm^{TM} MP durante
10-30 min. Se compararon directamente los patrones
visualizados tras la hibridación con los sueros de pacientes, tanto
con las inmunotransferencias teñidas con azul de Commassie de la
misma muestra para determinar la correlación con proteínas, así
como con los patrones obtenidos de la hibridación de las
inmunotransferencias derivadas de la misma muestra con los sueros
de pacientes con otros tumores sólidos o sueros control para
determinar la especificidad de los autoantígenos. Alternativamente,
se incubaron membranas con un anticuerpo IgM
anti-humano de oveja conjugado con peroxidasa de
rábano picante y se procesaron para incubaciones con un anticuerpo
IgG anti-humano.
Adicionalmente, se caracterizaron las manchas de
proteína tanto en los tumores como en los lisados de las líneas
celulares de adenocarcinoma de pulmón que se visualizaron con los
sueros de paciente, pero no con los sueros control. Se sometieron
los lisados celulares de A549 a PAGE 2-D, tras lo
cual se transfirieron las proteínas separadas a membranas
Immobilon-P y posteriormente se tiñeron con azul de
Commassie. Se cortaron las manchas de proteína de interés de la
membrana y se sometieron a una secuenciación de aminoácidos
N-terminal y análisis espectrométrico de masa. Se
utilizaron las secuencias resultantes y masas peptídicas para
búsquedas en bases de datos para una identificación proteica.
Se utilizaron dos anticuerpos monoclonales de
anti-Anexina I y II. Se usaron estos anticuerpos
primarios a una dilución de 1:5000 en ensayos de
inmunotransferencia y se procesaron para incubaciones con sueros de
paciente.
Se separaron proteínas celulares de A549
mediante PAGE 2-D y se transfirieron a membranas de
PVDF Immobilon-P. Para el análisis de
inmunotransferencia, se trató cada membrana con una muestra de
suero. Las muestras incluían sueros obtenidos en el momento del
diagnóstico de 18 pacientes con adenocarcinoma de pulmón, 11
pacientes con carcinoma de pulmón de células escamosas, 4 con
carcinoma de pulmón de células pequeñas, 2 con carcinoma de pulmón
de células grandes, 19 con cáncer de pulmón sin clasificar; 37
pacientes con otros tipos de cáncer (11 con cáncer de mama, 7 con
melanoma, 11 con cáncer de hígado, y 8 con cáncer de esófago; y de
15 sujetos sanos sin historia previa de cáncer o enfermedad
autoinmunitaria.
\newpage
En la figura 1 se muestra un ejemplo de un gel
de 2-D de células A549 teñidas con plata. La
hibridación de las membranas usando sueros de paciente como
anticuerpo primario e IgG anti-humano de oveja como
anticuerpo secundario revelaron patrones variables de reactividad
entre sueros de paciente con cáncer de pulmón. Las hibridaciones
duplicadas dieron como resultado patrones similares. En general, se
observaron diversas manchas reactivas con la mayoría de los sueros.
Se observaron algunas de las manchas reactivas con sueros control y
de este modo, se consideró que representaban una reactividad no
específica. Otros se restringieron a sueros de paciente con cáncer
de pulmón. Lo más destacable entre estos últimos fue su intensa
reactividad en un grupo de manchas de proteínas contiguas
denominado A1, con un pI de entre 6,3 y 6,8 y un PM de 37 kDa
(figura 2), que se observó con sueros de 8 de 18 pacientes con
adenocarcinoma de pulmón, 4 de 11 pacientes con carcinoma de pulmón
de células escamosas, 1 de 4 pacientes con carcinoma de pulmón de
células pequeñas, y 2 de 19 pacientes con cáncer de pulmón sin
clasificar y que estaba ausente en membranas de A549 hibridadas con
sueros de individuos normales. Un segundo grupo de manchas de
proteínas contiguas denominado A2 (figura 3), con un pI de entre
7,2 y 7,8 y un PM de aproximadamente 36 kDa se observó con sueros de
7 de 18 pacientes con adenocarcinoma de pulmón, 3 de 11 pacientes
con carcinoma de pulmón de células escamosas, 2 de 4 pacientes con
carcinoma de pulmón de células pequeñas, y 6 de 19 pacientes con
cáncer de pulmón sin clasificar pero estaban ausentes en sueros de
individuos normales. En total, 11 de 18 sueros de pacientes con
adenocarcinoma de pulmón y 6 de 11 sueros de pacientes con
carcinoma de pulmón de células escamosas y 3 de 4 con carcinoma de
pulmón de células pequeñas mostraron reactividad hacia A1 y/o
A2.
Para determinar si los sueros que mostraron
inmunorreactividad basada en IgG contra proteínas A1 y/o A2 también
mostraron inmunorreactividad basada en IgM, se incluyeron en este
análisis el suero de tres pacientes con adenocarcinoma de pulmón
que mostró inmunorreactividad basada en IgG contra A1 y/o A2 y de
dos controles negativos. Se hibridaron membranas que contenían
lisados de A549 con sueros de paciente y control y posteriormente se
incubaron con un anticuerpo IgM anti-humano de
oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante. Sólo el suero de
paciente que mostró reactividad basada en IgG contra A1 y A2 mostró
reactividad basada en IgM contra estas dos proteínas de conjunto
contiguas (figura 3).
Para determinar el subtipo de IgG de sueros que
mostraron inmunorreactividad basada en IgG contra proteínas A1 y/o
A2, se incluyeron en este análisis el suero de tres pacientes con
adenocarcinoma de pulmón que mostró inmunorreactividad de IgG
contra las proteínas A1 y/o A2 y de dos controles negativos. Se
hibridaron membranas que contenían lisados de A549 con sueros de
paciente y control y posteriormente se incubaron con un anticuerpo
IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 anti-humano de ratón
conjugado con peroxidasa de rábano picante. Sólo los sueros de
paciente que mostraron reactividad basada en IgG contra A1 y/o A2
mostraron reactividad basada en IgG1 contra estos dos conjuntos
contiguos de proteínas (figura 4).
Se hibridaron membranas que contenían lisados de
A549 con sueros de pacientes con melanoma, cáncer de mama, cáncer
de hígado o cáncer de esófago. Ninguno de los sueros mostró
inmunorreactividad basada en IgG contra las proteínas A2 y A1 con
sueros de pacientes con cáncer de esófago (5/8) (figura 5), con
sueros de pacientes con cáncer de mama (1/11), pero estaban
ausentes en sueros de pacientes con melanoma (0/7) y cáncer de
hígado (0/11).
Para determinar la identidad de las proteínas A1
y A2, se prepararon membranas adicionales de lisados celulares de
adenocarcinoma de pulmón de A549 y se visualizaron las proteínas
mediante tinción con azul de Commassie. Se cortaron las manchas de
A1 y A2 de las membranas, se eluyeron y se sometieron a digestión
con tripsina. Se analizaron fragmentos peptídicos mediante
espectrometría de masas. Para secciones contiguas, se cortaron las
denominadas A1a, A1b (justo a la izquierda de A1a, es decir, más
ácida), A1c (justo a la izquierda de A1b, es decir, más ácida) y
A1d (justo a la izquierda de A1c, es decir, más ácida) de las
inmunotransferencias. Estas cuatro áreas comprendieron, en total,
toda la región A1 que era inmunorreactiva. Los análisis
espectrométricos de masas de los péptidos derivados de estas
secciones revelaron que las variantes de Anexina I y Anexina II
eran las isoformas de Anexina I predominantes presentes excepto la
sección A1a que no produjo ningún resultado. Para las proteínas A2,
se cortaron dos secciones contiguas, denominadas A2a y A2b (justo a
la izquierda de A1b, es decir más ácida) de las
inmunotransferencias. Los análisis espectrométricos de masa de los
péptidos derivados de estas secciones revelaron que la variante de
Anexina II (A2a) y la variante de Anexina II (A2b) eran las
isoformas de Anexina II predominantes presentes. Adicionalmente, las
manchas de A1 y A2 se cortaron de las membranas y se sometieron a
secuenciación N-terminal directa. Dado que las
anexinas estaban bloqueadas de forma N-terminal por
acetilación, no se obtuvieron resultados.
Para confirmar que las manchas de A1 y A2
consistían en una mezcla de Anexina I y Anexina II respectivamente,
se hibridaron membranas preparadas a partir de ambas líneas
celulares de adenocarcinoma de A549 con o bien un anticuerpo
monoclonal de ratón comercialmente disponible que reacciona con
Anexina I, o bien con el anticuerpo monoclonal frente a Anexina II
de ratón. Se compararon los patrones de inmunorreactividad obtenidos
tanto con las inmunotransferencias teñidas con azul Commassie del
mismo tipo de lisado celular como con los patrones de
inmunorreactividad observados con sueros de pacientes con cáncer de
pulmón. Los anticuerpos anti-Anexina I, y
anti-Anexina II inmunorreaccionaron con las
proteínas en las manchas de A1 y A2 visualizadas respectivamente
con sueros de pacientes con cáncer de pulmón (figura 6).
Sorprendentemente, se observaron diversas manchas inmunorreactivas
de bajo peso molecular adicionales resultado de la hibridación de
ambos anticuerpos monoclonales anti-Anexina I y II
utilizados. Estas manchas no han mostrado inmunorreactividad con
ningún suero de paciente sometido a ensayo.
Claims (3)
1. Uso de una proteína anexina seleccionada de
Anexina I y Anexina II para detectar autoanticuerpos para antígeno
de proteína anexina en una muestra biológica derivada de un sujeto
sospechoso de tener cáncer de pulmón.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que se
usa la proteína anexina para diagnosticar adenocarcinoma de pulmón
o carcinoma de pulmón de células escamosas.
3. Uso según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que la muestra biológica es una sección de
tejido o muestra de suero.
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