ES2353014T3 - Predicción de la evolución del cáncer. - Google Patents
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Abstract
Método para predecir la recidiva de cáncer en un sujeto tratado para una enfermedad cancerosa que comprende las etapas de: - poner en contacto un ligando de afinidad por la proteína timidina cinasa 1 (TK1) con una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, dicho ligando se une específicamente a dicha proteína TK1; - determinar una cantidad de ligando que se une a dicha proteína TK1 y/o a un complejo que comprende la proteína TK1 en dicha muestra; y - estimar una probabilidad de futura recidiva de cáncer después de al menos un año tras el tratamiento contra el cáncer basándose en dicha cantidad determinada de unión de ligando y sin determinación de un nivel de actividad enzimática de TK1.
Description
Predicción de la evolución del cáncer.
La presente invención se refiere en general a la
monitorización y predicción de enfermedades cancerosas y en
particular a la predicción temprana de la evolución y reaparición de
enfermedades cancerosas.
El cáncer es una causa principal de muerte en
los seres humanos y el número de individuos afectados aumenta cada
año. Aunque los diferentes métodos de tratamiento para el cáncer,
por ejemplo quimioterapia, terapia endocrina, radioterapia y
cirugía, han mejorado tremendamente en las últimas décadas, están
lejos de ser perfectos, en particular para pacientes con estadios
tardíos de cáncer. Por tanto, se ha invertido mucha investigación en
la detección temprana de tumores en pacientes.
Un método usado para la detección del estadio
tumoral y de tumor es la determinación de la proliferación celular
en pacientes. Se ha usado la proporción de células que sintetizan
ADN (células en fase S) en tumores como una medida de su tasa de
proliferación. Las células que sintetizan ADN se han determinado
anteriormente por medio de timidina marcada con radioactividad
(autorradiografía). La incorporación de análogos de halógeno de
timidina (BrdU) y anticuerpos frente a los mismos se han usado junto
con mediciones de ADN citométricas de flujo cuantitativas. La
desventaja del uso de timidina marcada de manera isotópica y BrdU es
que sólo pueden medirse células vivas. Por tanto, estos métodos
sólo se han usado en pacientes seleccionados y en un número
limitado de estudios [Wilson, Acta Oncol., 30:903, 1991].
Además, la técnica de citometría de flujo no puede distinguir entre
las células en proliferación y las que no están en proliferación. La
determinación de células en fase S es incluso más complicada en
tumores, puesto que las células tumorales cancerosas no se apartan,
en su contenido en ADN, de las células benignas [Tribukait, World
J. Urol., 5:108, 1987].
En lugar de medir la propia síntesis de ADN, se
han usado marcadores relacionados con células en proliferación, por
ejemplo, Ki-67 y PCNA (antígeno nuclear de células
en proliferación). Ki-67 se expresa en todos los
estadios del ciclo celular excepto en G0 [Scholzen, J. Cellular
Physiol., 182:311, 2000]. Pueden usarse anticuerpos frente a
Ki-67 en tejidos frescos así como en tejidos
incrustados en parafina y fijados en formalina. Dependiendo de la
tasa de proliferación celular, el PCNA se expresa en todas las
etapas del ciclo celular. El PCNA no es tan sensible para diversas
técnicas de fijación como Ki-67 [Hall, Cell
Tissue Kinet., 25:502, 1990]. Se han sometido a prueba
anticuerpos frente a otros tipos de proteínas y enzimas implicadas
en la síntesis de ADN (ADN polimerasa, ribonucleótido reductasa),
pero con resultados satisfactorios limitados [Wilson, Acta
Oncol., 30:903, 1991].
La timidina cinasa (TK), una enzima de la ruta
de recuperación de pirimidina, cataliza la fosforilación de
timidina para dar timidina monofosfato. La TK en células humanas
aparece en dos formas, una proteína citoplásmica (TK1) y una
mitocondrial (TK2), codificada por diferentes genes. Las TK1 y TK2
humanas se ubican en el cromosoma 17q23.2-q25.3 y
16q22-q23.1, respectivamente. Los transcritos de TK1
codifican para una proteína de 25,5 kDa con regiones altamente
conservadas típicas de nucleósido cinasas. Sin embargo, aún no se
han determinado las estructuras cristalinas de esta familia de
enzimas. La expresión de TK1 se regula por el ciclo celular y la
regulación de TK1 es compleja con niveles de ARNm que alcanzan su
nivel máximo en células en proliferación. El corte y empalme y la
traducción del ARNm de TK1 también varían en las células en
diferentes fases de crecimiento. Principalmente, los niveles de TK1
se regulan mediante mecanismos postraduccionales, en particular
mediante degradación diferencial debido a la expresión de proteasa
altamente activa en células mitóticas. La región
C-terminal de TK1 contiene una secuencia específica,
KEN, que se ha mostrado recientemente que es la señal de la
degradación mitótica de TK1 en la ruta mediada por complejo promotor
de la anafase/ciclosoma Cdhl [Ke, Mol. Cell. Biol., 24: 514,
2004]. La TK2 no se regula por el ciclo celular y es la única enzima
TK encontrada en células en reposo [Wintersberger, Biochem. Soc.
Trans., 25:303, 1997; Sherley, J. Biol. Chem., 263:8350,
1988; He, Cell. Prolif., 24:3, 1991; Kauffman, Mol. Cell.
Biol., 11:2538, 1991; Hengstschläger, J. Biol. Chem.,
269:13836, 1994; Munch-Petersen, J. Biol.
Chem., 266:9032, 1991].
La mayoría de los marcadores mencionados
anteriormente se han usado para identificar células en proliferación
en tejidos. Sin embargo, se ha determinado la actividad de la
timidina cinasa en fracciones de citosol de tejidos como marcador
de proliferación en cáncer de mama humano. En un estudio de 1.692
pacientes con cáncer de mama [Broet, J. Clin. Oncol.,
19:2778, 2000], la alta actividad de TK1 en el citosol se
correlacionaba con una supervivencia más corta así como un mal
resultado del tratamiento endocrino (tamoxifeno) [Foekens,
Cancer Res., 61:1421, 2001]. Además, también se ha usado la
timidina cinasa como un marcador de proliferación celular en suero
midiendo su actividad enzimática.
Debido al acoplamiento estrecho entre la
actividad enzimática de TK sérica (STK) y la alta proliferación, se
considera un marcador sensible y útil para la proliferación celular
y por tanto para la detección de tumores malignos [He, Internal.
J. Biol. Marker, 15: 139, 2000; Zou, Internal. J. Biol.
Marker, 17:135, 2002; He, Biochimica Biophysica Acta,
1289:25, 1996; He, Europ. J. Cell Biol., 70:117, 1996; Wu,
Anticancer Res., 6:4867, 2000; Mao, Cancer Inves.
20:922, 2002; Wang, Analysis Cell. Pathology, 23:11, 2001;
Kuroiwa, J. Immuno. Methods, 253: 1, 2001]. Por tanto, se ha
usado la actividad enzimática de STK como marcador tumoral en
pacientes con diferentes tumores sanguíneos. Sin embargo, se ha
encontrado que la actividad de STK no es un buen marcador en
pacientes con tumores
sólidos.
sólidos.
Más del 95% de la actividad enzimática de STK
corresponde a TK1 mientras menos del 5% corresponde a TK2. La
composición y las propiedades de STK aún no se entienden bien. Los
resultados indican que STK es una forma polimérica de TK1,
probablemente también en complejo con otras proteínas séricas y
tiene un peso molecular total de aproximadamente 700 kDa [Karlström,
Mol. Cell. Biochem, 92:23, 1990].
Usando el análogo de timidina
5-yodo-2'-desoxiuridina
como sustrato, se estableció la actividad de STK como un marcador
de proliferación serológica en 1984 [Gronowich, Br. J.
Cancer, 47:487, 1983] y ahora está disponible como kit de RIA
comercial para radioensayo con [^{125}I] (Sangtec Medical AB,
Estocolmo, Suecia, recientemente adquirido por DiaSorin Inc.). El
ensayo de actividad de STK ha sido útil para la estimación de la
propagación y el pronóstico tumorales en pacientes con leucemia
aguda y leucemia crónica (CLL), linfoma de Hodgkin y de no Hodgkin,
pero no en el caso de tumores sólidos [Gronowich, Int. J.
Cancer, 15:5, 1984]. La actividad enzimática de STK en un
paciente con CLL proporciona información de pronóstico útil con
respecto a ambas respuestas a la terapia y duración de
supervivencia. Aunque el método es relativamente eficaz,
especialmente para enfermedades de leucemia y linfoma, el
5-yodo-2'-desoxiuridina
no es un sustrato específico para la actividad de STK (TK1).
Además, la
[^{125}I]-radio-yodo-desoxiuridina
tiene una semivida corta (cuatro semanas), la actividad enzimática
de STK es altamente sensible a cambios de temperatura y pH, y el
radioensayo requiere equipo especializado (contador de centelleo
\gamma), laboratorio de isótopos y personal altamente cualificado.
Las desventajas de una técnica de radioensayo de este tipo han
limitado probablemente el uso clínico de este ensayo.
Por tanto, se ha desarrollado recientemente un
nuevo kit de actividad de STK basándose en anticuerpos frente al
producto de la reacción de STK. También se han generado anticuerpos
anti-TK1 durante las últimas décadas,
principalmente anticuerpos policlonales para investigación básica y
no para uso comercial. Recientemente, se han desarrollado
anticuerpos mono y policlonales de ratón anti-TK1
para fines clínicos potenciales, es decir para cáncer de mama
[Zhang, Cancer Detección Prev., 25:8, 2001] y cáncer de
pulmón [Voeller, Anti-Cancer Drugs, 12:555,
2001]. Ahora está disponible comercialmente un anticuerpo monoclonal
anti-TK1 para investigación básica, pero no para uso
clínico (QED Bioscience Inc, San Diego, EE.UU., 2003).
En la patente estadounidense n.º 5.698.409
O'Neil da a conocer anticuerpos monoclonales (AcM) generados frente
a la forma tetramérica de 100 kDa enzimáticamente activa de TK1 de
células Raji. Los AcM se usan para determinar sólo esta forma
enzimáticamente activa de TK1 en muestras biológicas de pacientes.
Además, O'Neil tiene que determinar la actividad de TK usando
timidina radiomarcada, además de usar el AcM. Entonces se usan las
actividades de TK1 determinadas para diagnosticar y monitorizar
diversas formas de cáncer. Las propiedades de sus anticuerpos
monoclonales anti-TK1 plantean preguntas sobre la
especificidad de estos anticuerpos, es decir, reaccionan con una
proteína de peso molecular mayor del esperado en inmunotransferencia
de tipo Western de electroforesis en gel de SDS (45 kDa frente a 25
kDa en extractos de células HeLa humanas). Además, los anticuerpos
detectan una proteína en el suero que se produce en otro intervalo
de concentración (más alto) que el encontrado por otros
investigadores en el campo, es decir, se necesita diluir el suero
16.000 veces mientras otros usan suero no diluido. Estos hechos
sugieren que sus anticuerpos reaccionan con otras proteínas además
de TK1 y/o TK2 enzimáticamente activas. Además, el método de O'Neil
se ve afectado por los problemas similares a los del uso del análogo
de timidina radiomarcada comentado anteriormente.
Kuroiwa, et al, [Kuriowa, J. Immuno.
Methods, 253:1, 2001] han desarrollado y sometido a prueba 26
anticuerpos monoclonales anti-TK1. Las propiedades
de estos anticuerpos son más de lo esperado, es decir reaccionan
con una proteína con un peso molecular de 25 kDa en extractos de
HeLa humanas en inmunotransferencia de tipo Western sin reactividad
cruzada notificada con otras proteínas. Cuando se usan estos
anticuerpos en suero de pacientes con tumores sólidos usando ELISA,
no se encontraron diferencias significativas de los niveles de TK1
sérica en comparación con los niveles de TK1 sérica de individuos
sanos.
Es un objetivo general de la presente invención
proporcionar una prueba para la predicción temprana de recidiva de
una enfermedad cancerosa en un sujeto tratado para una enfermedad
cancerosa que comprende las etapas de:
- -
- poner un contacto un ligando de afinidad por la proteína timidina cinasa 1 (TK1) con una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, dicho ligando se une específicamente a dicha proteína TK1;
- -
- determinar una cantidad de ligando que se une a dicha proteína TK1 y/o complejo que comprende proteína TK1 en dicha muestra; y
- -
- estimar una probabilidad de futura recidiva de cáncer después de al menos un año tras el tratamiento contra el cáncer basándose en dicha cantidad determinada de unión de ligando y sin la determinación de un nivel de actividad enzimática de TK1.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un objetivo particular de la presente
invención proporcionar la predicción temprana de aparición o
reaparición local y/o metastásica de tumores en un sujeto después de
al menos un año tras el tratamiento contra el cáncer.
Estos y otros objetivos se cumplen mediante la
invención tal como se define mediante las reivindicaciones de
patente adjuntas.
En resumen, la presente invención implica la
predicción temprana de, o la estimación de la probabilidad de
recidiva de una enfermedad cancerosa en un sujeto diagnosticado de
cáncer y tratado contra el cáncer. La invención se basa en
determinar un nivel de respuesta de unión de un material
inmunorreactivo (MI) que comprende proteína timidina cinasa 1 (TK1)
en una muestra, preferiblemente una muestra de fluido corporal, por
ejemplo muestra de suero sanguíneo, de un sujeto, preferiblemente
un sujeto mamífero y más preferiblemente un sujeto humano, en el
diagnóstico del cáncer y/o tras el tratamiento contra el cáncer (por
ejemplo tras un tratamiento mediante operación, quimioterapia,
terapia endocrina, radioterapia y/o terapia inmunológica). Entonces
se estima la probabilidad de reaparición tumoral basándose
directamente en este nivel de respuesta de unión del MI
determinado.
El nivel de respuesta de unión del MI
determinado puede determinarse en una realización para el sujeto en
múltiples ocasiones en el tiempo. Preferiblemente, una primera toma
de muestra y determinación de respuesta de unión se lleva a cabo no
más tarde de un mes tras el inicio del tratamiento contra el cáncer,
más preferiblemente antes de la finalización del tratamiento, tal
como antes de comenzar el tratamiento contra el cáncer en el
sujeto. Preferiblemente, se toma una segunda muestra del sujeto y se
analiza para determinar el nivel de respuesta de unión del MI tras
comenzar el tratamiento, tal como en el plazo del primer año después
del tratamiento contra el cáncer. Más preferiblemente, se determina
el segundo nivel de respuesta de unión del MI en el sujeto entre un
mes hasta un año, tal como entre un mes y seis meses, o
aproximadamente 3 meses, después de que haya comenzado o ha
finalizado el tratamiento. En cualquier caso, preferiblemente no se
determina el segundo nivel de respuesta de unión del MI hasta que
al menos ha transcurrido una semana, por ejemplo algunas semanas, un
mes, o múltiples meses, desde la determinación del primer nivel de
respuesta de unión del MI en el mismo sujeto.
El sujeto tiene una alta probabilidad de
recidiva tumoral si el segundo nivel de respuesta de unión del MI
es igual a o supera el primer nivel de respuesta de unión del MI, o
expresado de otra manera, la probabilidad de recidiva tumoral es
alta si la razón del segundo (posterior) nivel de respuesta de unión
del MI y el primer nivel de respuesta de unión del MI supera, o es
igual a, uno.
Alternativamente, el nivel de respuesta de unión
del MI determinado en el sujeto podría compararse con un nivel de
respuesta de unión del MI normal, tal como se determina a partir de
muestras de fluidos corporales de sujetos sanos, mediante lo cual
se predice la aparición de tumor local y/o metastásico basándose en
esta comparación.
Preferiblemente, el nivel de respuesta de unión
del MI se determina poniendo en contacto la muestra de fluido
corporal (por ejemplo, suero) con un ligando que tiene afinidad por
la proteína TK1. En una realización preferida de la invención el
ligando es un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo
expuesto en la superficie de la proteína TK1, preferiblemente a una
secuencia inmunogénica definida de la parte
C-terminal de la proteína TK1. Preferiblemente,
este ligando debe poder detectar formas tanto enzimáticamente
activas como inactivas de la proteína TK1 y posiblemente también la
proteína TK1 complejada con otras macromoléculas. Entonces la
cantidad de unión de anticuerpo se mide mediante un método de ensayo
sensible y adecuado, preferiblemente el sistema de ensayo de
transferencia puntual con quimioluminiscencia mejorada (ECL) y más
preferiblemente un sistema de ensayo de transferencia puntual con
ECL de este tipo usando membranas de nitrocelulosa.
A partir de este nivel de respuesta de unión del
MI medido puede determinarse una concentración del MI usando un
patrón, por ejemplo TK1 humana recombinante (rhTK1). En tal caso, se
mide la respuesta de unión usando un anticuerpo
anti-TK1 en muestras con diferentes concentraciones
conocidas de rhTK1 y puede generarse una curva patrón de respuesta
de unión frente a concentración. Entonces una medición del nivel de
respuesta de unión del MI posterior de un sujeto tratado para el
cáncer puede relacionarse con una concentración del MI
correspondiente usando la curva patrón. Entonces la estimación de la
probabilidad de reaparición se basa directamente en esta
concentración del MI.
Esto significa que en la presente invención, la
recidiva de una enfermedad cancerosa en un sujeto tratado contra la
enfermedad se determina basándose en el nivel de respuesta o nivel
de concentración de unión de la proteína TK1 que comprende material
inmunorreactivo. Esto contrasta claramente con las técnicas de la
técnica anterior que usan la actividad de la timidina cinasa para
la predicción de la reaparición tumoral.
Determinando el nivel de respuesta de unión del
MI en un paciente en el plazo de los primeros pocos meses tras el
diagnostico y tratamiento del cáncer, es posible detectar e
identificar aquellos pacientes que corren un alto riesgo de una
recidiva de enfermedad cancerosa posterior (en el plazo de 1 a 3
años, posiblemente hasta 10 años, tras el tratamiento). Por tanto,
la invención permite la detección temprana de aquellos pacientes
que tienen un alto y bajo riesgo de recidiva tumoral, lo que permite
tratamientos diferenciales y aumenta las posibilidades de éxito del
tratamiento y puede prolongar la supervivencia del paciente, pero
también evita tratamientos ineficaces y por tanto innecesarios.
\newpage
La proteína TK1 que comprende material
inmunorreactivo incluye la proteína TK1, por ejemplo proteína TK1
sérica, una forma monomérica y/o polimérica (por ejemplo dimérica,
tetramérica) enzimáticamente activa y/o inactiva de la proteína TK1
y/o la proteína TK1 complejada con otras moléculas, por ejemplo
proteínas, tales como inhibidores.
La invención puede ser aplicable a la mayoría de
tipos de cánceres y está especialmente adaptada para cánceres con
tumores sólidos, tales como cáncer de mama, cáncer gástrico y cáncer
de pulmón.
La invención ofrece las siguientes ventajas:
- -
- Detección temprana de pacientes con cáncer tratados que corren riesgo de recidivas tumorales;
- -
- Permite aumentar las posibilidades de supervivencia aumentadas y la calidad de vida de los pacientes con cáncer.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras ventajas ofrecidas por la presente
invención se apreciarán con la lectura de la descripción más
adelante de las realizaciones de la invención.
La invención junto con los objetivos y ventajas
adicionales de la misma, puede entenderse de la mejor manera
haciendo referencia a la siguiente descripción tomada junto con los
dibujos adjuntos, en los que:
la figura 1 ilustra la correlación entre la
actividad enzimática de timidina cinasa sérica (STK) y la
concentración de la proteína TK1 que comprende material
inmunorreactivo (MI) (STK1) en individuos sanos;
la figura 2 ilustra la concentración del MI
(STK1) en suero de individuos sanos y pacientes humanos con
diferentes tipos de tumores, en la que A representa leucemias, B
representa tumores gástricos, C representa tumores de colon, D
representa tumores de recto, E representa tumores de mama, F
representa tumores de pulmón, G representa linfomas, H representa
hepatomas, I representa tumores cerebrales, J representa otros tipos
de tumores malignos, K representa lesiones benignas morfológicas y L
representa personas sanas;
la figura 3 ilustra la concentración del MI
(STK1) medida mediante inmunotransferencia de tipo Western y
transferencia puntual de un paciente con un cáncer gástrico (P3),
una transferencia puntual de un individuo sano y de TK1 recombinante
humana;
la figura 4 ilustra la correlación entre la
concentración del MI (STK1) y la actividad enzimática de STK en
pacientes con lesiones benignas y tumores malignos antes del
tratamiento contra el cáncer, en la que A representa leucemias, B
representa tumores gástricos, C representa tumores de colon, D
representa tumores de recto, E representa tumores de pulmón, F
representa linfomas, G representa hepatomas, H representa cerebro, I
representa tumores de lesiones benignas morfológicas y J representa
tumores de mama;
la figura 5 ilustra la incidencia acumulativa de
cualquier reaparición en 67 pacientes con cáncer de mama, divididos
en tres grupos iguales que representan concentraciones de STK1
relativas de <0,78, 0,78-1,08 y >1,08, tal
como se define mediante la concentración de STK1 determinada tres
meses tras la cirugía dividida entre la concentración de STK1
correspondiente 21 días tras la cirugía;
la figura 6 es una comparación de la
concentración del MI (STK1), la actividad enzimática de STK y la
concentración de CA 15-3 en suero 3 meses tras la
operación en 37 pacientes con cáncer de mama con (A) y sin (B)
recidiva tumoral de cáncer posterior expresada en porcentaje de
valores medidos 21 días tras la operación; y
la figura 7 es una ilustración de un diagrama de
flujo del método de predicción de recidiva tumoral de la presente
invención.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la
técnica a la que pertenece la presente invención. Para claridad de
la invención, en el presente documento se usa la siguiente
definición.
La "timidina cinasa" (ATP:
timidina-5'-fosfotransferasa,
EC.2.7.1.21 en el sistema de clasificación de la unión
internacional de bioquímica) es una enzima de la ruta de
recuperación de pirimidina y cataliza la fosforilación de timidina
para dar timidina monofosfato. En células humanas, la TK aparece en
dos formas, una forma timidina cinasa 1 (TK1) citoplásmica y una
timidina cinasa 2 (TK2) mitocondrial, codificadas por diferentes
genes. La "actividad enzimática de TK" se refiere al papel de
la TK en catalizar la fosforilación de timidina para dar timidina
monofos-
fato.
fato.
\newpage
"Material inmunorreactivo (MI) que comprende
proteína TK1" se refiere a un material o composición que
comprende la proteína TK1. El material MI podría comprender formas
tanto enzimáticamente activas como inactivas de la proteína TK1,
incluyendo por ejemplo formas de proteína TK1 monoméricas,
poliméricas (por ejemplo diméricas, tetraméricas) y/o todas las
formas de la proteína TK1. El material también puede incluir también
o en su lugar la proteína TK1 (enzimáticamente activa o inactiva)
complejada con otras moléculas, incluyendo proteínas y polipéptidos,
tales como inhibidores y/o activadores.
Según un aspecto de la presente invención se
proporciona un método de predicción temprana de recidiva o
reaparición de una enfermedad cancerosa en un sujeto,
preferiblemente un sujeto mamífero y más preferiblemente un sujeto
humano, tratado contra el cáncer. El método comprende la
determinación de un nivel de respuesta de unión de un material
inmunorreactivo (MI) que comprende la proteína timidina cinasa 1
(TK1) en una muestra del sujeto. Entonces la probabilidad de
aparición o reaparición de un tumor canceroso al menos un año tras
el tratamiento contra el cáncer se estima basándose directamente en
el nivel de respuesta de unión del MI determinado.
En un aspecto particular de la invención el
nivel de respuesta de unión se determina en un material
inmunorreactivo que incluye formas tanto enzimáticamente activas
como inactivas de la proteína TK1. En una realización de la
invención, este nivel de respuesta de unión se expresa como un nivel
de concentración del MI en una muestra de un sujeto usando un
ligando que tiene afinidad por TK1. Entonces la probabilidad de
recidiva del cáncer se estima basándose directamente en el nivel de
concentración del MI determinado.
En una realización de la invención se determina
el nivel de respuesta de unión del MI para el sujeto en múltiples,
es decir al menos dos, ocasiones en el tiempo. Entonces la
probabilidad de recidiva de la enfermedad se basa en una
comparación de estos al menos dos niveles de respuesta de unión. En
una realización preferida de la invención, la primera toma de
muestra y la determinación de respuesta de unión se llevan a cabo no
más tarde de un mes tras el inicio del tratamiento contra el
cáncer, más preferiblemente antes de la finalización del
tratamiento, tal como antes de comenzar el tratamiento contra el
cáncer en el sujeto o en conexión con el diagnóstico de la
enfermedad cancerosa. La al menos segunda muestra se toma
preferiblemente del sujeto y se analiza para determinar el nivel de
respuesta de unión del MI tras comenzar el tratamiento, tal como en
el plazo del primer año después del tratamiento contra el cáncer.
Más preferiblemente, se determina el segundo nivel de respuesta de
unión del MI en el sujeto entre un mes hasta un año, tal como entre
un mes y seis meses, o aproximadamente 3 meses, después de que se
haya comenzado o ha finalizado el tratamiento. Preferiblemente, en
cada caso, el segundo nivel de respuesta de unión del MI no se
determina hasta que ha transcurrido al menos una semana, por
ejemplo algunas semanas, un mes, o múltiples meses, desde la
determinación del primer nivel de respuesta de unión del MI en el
mismo sujeto.
Entonces la predicción de reaparición tumoral se
basa en una comparación de los dos niveles de respuesta de unión
del MI o mediante la investigación de una cantidad derivada de los
mismos. Por ejemplo, el sujeto tiene una alta probabilidad de
recidiva de cáncer si el segundo nivel de respuesta de unión del MI
es igual a o supera el primer nivel de respuesta de unión del MI, o
expresado de otra manera, la probabilidad de recidiva tumoral es
alta si la razón del segundo (posterior) nivel de respuesta de unión
del MI y el primer nivel de respuesta de unión del MI supera, o es
igual a, uno.
Preferiblemente, el nivel de respuesta de unión
del MI en el sujeto se determina periódica o intermitentemente en
varias ocasiones en el tiempo durante y tras el tratamiento contra
el cáncer, por ejemplo tras la operación, tras el inicio del
tratamiento con quimioterapia, tras el inicio del tratamiento con
terapia endocrina, tras el inicio del tratamiento con radioterapia
y/o tras el inicio del tratamiento con terapia inmunológica, en el
paciente. Por tanto, el nivel del MI se determina preferiblemente
durante los primeros años siguientes, por ejemplo hasta los 5 a 10
años siguientes, después del tratamiento para, tan pronto como sea
posible, detectar la evolución de la enfermedad cancerosa en el
sujeto. Sin embargo, para la mayoría de tipos de cáncer, y
especialmente tipos de cáncer con tumor sólido, probablemente el
método de la invención puede detectar cualquier recidiva de cáncer
posterior en el plazo de los primeros 6 meses, tal como en el plazo
de los primeros 3 meses, después del tratamiento contra el cáncer.
Preferiblemente, estos niveles de respuesta de unión posteriores se
comparan con los niveles de respuesta de unión correspondientes
determinados anteriormente para el mismo sujeto, por ejemplo el
primer nivel de respuesta de unión del MI comentado
anteriormente.
En otras palabras, la presente invención puede
predecir en el plazo de los primeros pocos meses (normalmente
0-6 meses, para algunos cánceres 0-3
meses) después del tratamiento contra el cáncer si un sujeto volverá
a tener tumores de nuevo (locales y/o metastásicos). Por tanto,
aunque una enfermedad cancerosa reaparecerá primero en el plazo de
un par de años tras el tratamiento, la invención puede predecir su
recidiva en el plazo de unos pocos meses tras el tratamiento. Por
medio de una predicción temprana de este tipo, puede aplicarse
tratamiento adicional y/o cambio de la estrategia de tratamiento con
el fin de prevenir la aparición de tumor local y/o metastásico
predicho. Además, los sujetos que se predice que puedan tener
posiblemente una recidiva pueden estar bajo estrecha vigilancia
para, tan pronto como sea posible, detectar cualquier tumor nuevo, y
así aumentar las posibilidades de supervivencia del sujeto. La
identificación de pacientes de bajo riesgo con el mismo ensayo
también mejoraría la calidad de vida de los pacientes reduciendo el
riesgo de tratamiento excesivo o tratamientos innecesarios.
En otra realización de la invención, se compara
el nivel de respuesta de unión del MI determinado con un nivel de
respuesta de unión normal, tal como se determina a partir de sujetos
sanos libres de tumores. Entonces la estimación de la probabilidad
de recidiva de cáncer se basa en esta comparación. Por ejemplo, es
posible que la enfermedad experimente recidiva si el nivel del MI
determinado es significativamente mayor que el nivel del MI normal.
Tal como se observó anteriormente, el nivel de respuesta de unión
del MI se determina preferiblemente en múltiples ocasiones
diferentes en el tiempo, comenzando por ejemplo desde antes del
tratamiento contra el cáncer y continuando durante y tras el
tratamiento.
Puede determinarse el nivel de respuesta de
unión del MI del sujeto sano o normal (concentración o cantidad)
que va a compararse con el nivel del MI medido midiendo el nivel de
respuesta de unión del MI en una serie de muestras, preferiblemente
muestras de fluidos corporales, por ejemplo muestras de suero
sanguíneo, de sujetos sanos. Preferiblemente, estos sujetos sanos
no tienen o no han tenido ningún tumor demostrable, es decir no
presentan signo clínico alguno de tumor o enfermedad cancerosa.
Puede determinarse el nivel de respuesta de unión del MI de estos
sujetos control sanos usando los mismos métodos que para la
determinación del nivel de respuesta de unión en el sujeto bajo
investigación, tal como se comenta con más detalle a continuación.
En una realización, el nivel de respuesta de unión del MI normal es
el promedio de los niveles de respuesta de unión del MI medidos a
partir de las series de muestras de sujetos sanos.
El nivel de concentración del MI en sujetos
humanos sanos es de aproximadamente 1 pM o inferior, mientras para
pacientes humanos con tumor el nivel aumenta hasta varios cientos de
pM. Un nivel de concentración del MI determinado de 2 ó 3 pM o por
encima podría determinarse como un nivel anómalo, y por tanto puede
corresponder a la estimación de una probabilidad de evolución de
enfermedad tumoral. Sin embargo, el nivel de concentración que
corresponde a una probabilidad de recidiva de enfermedad cancerosa
puede ser diferente para diferentes tipos de tumores y diferentes
clases de sujetos.
Los métodos de predicción de la técnica
anterior, tal como se muestra a modo de ejemplo por la patente
estadounidense n.º 5.698.409, se basan, tal como se mencionó
brevemente en la sección de antecedentes, en la medición de la
actividad enzimática de TK (y TK1) en muestras de suero. En la
patente identificada anteriormente, O'Neil usa anticuerpos
monoclonales que se unen a la forma tetramérica de 100 kDa
enzimáticamente activa de TK1, probablemente al sitio activo de la
forma tetramérica de 100 kDa de TK1, e inhiben la actividad
enzimática de TK1. Con el fin de predecir la reaparición de un
tumor basándose en la actividad enzimática de TK, O'Neil supone que
hay una correlación directa entre la actividad enzimática de TK
(suero) y el nivel (concentración) de TK1 que comprende material
inmunorreactivo. Tal como se muestra por la presente invención,
existe una correlación de este tipo para individuos humanos sanos,
para pacientes con determinadas enfermedades no cancerosas, por
ejemplo insuficiencia renal, hemorragia e infección pulmonar.
También puede encontrarse una correlación entre la actividad sérica
de TK y la concentración para algunos tipos de cánceres antes del
tratamiento contra el cáncer. Sin embargo, no se ha encontrado una
correlación de este tipo durante o, en particular, tras el
tratamiento contra el cáncer. Una posible explicación para esta
falta de correlación entre la concentración de TK1 sérica (STK1) y
la actividad enzimática de TK sérica (STK) en pacientes con cáncer
podría ser que la concentración de STK1 y la actividad de STK
reflejan diferentes subpoblaciones de timidina cinasa. Además, puede
haber factor(es) de regulación en suero que
controla(n) la concentración del MI/STK1 y/o la actividad
enzimática de STK. Además, también se conoce que la actividad
enzimática de TK es muy sensible a cambios en el pH y la
temperatura.
Por tanto, los métodos de la técnica anterior
que determinan la probabilidad de reaparición tumoral basándose en
la medición de la actividad enzimática de STK (es decir basándose en
una medida en un dominio de actividad enzimática) tras el
tratamiento contra el cáncer, por ejemplo usando los anticuerpos
monoclonales dados a conocer en la patente estadounidense n.º
5.698.409, y la suposición de una correlación entre el nivel
(concentración) de respuesta de unión de STK1 y la actividad
enzimática de STK dan predicciones incorrectas, en particular en
casos de tumores sólidos.
Sin embargo, determinando el nivel o la
concentración de respuesta de unión del MI (STK1) usando los
anticuerpos comentados en esta invención y estimando la evolución
de la enfermedad cancerosa basándose directamente en el nivel o la
concentración de respuesta de unión medidos (es decir una medida en
el dominio de concentración o respuesta de unión), se obtiene una
predicción de enfermedad tumoral mucho más precisa.
La predicción de recidiva de cáncer según la
presente invención se basa en el nivel (concentración o cantidad)
de respuesta de unión del IM, tal como la concentración de la
proteína TK1, en una muestra biológica, preferiblemente una muestra
de fluido corporal, por ejemplo muestra de suero sanguíneo, de un
sujeto. Puede determinarse el nivel de respuesta de unión del MI en
la muestra (suero) de varias maneras diferentes conocidas por el
experto en la técnica usando diferentes ligandos. En una
realización actualmente preferida de la invención, se determina el
nivel de respuesta de unión del MI poniendo en contacto la muestra
con anticuerpos frente a TK especiales y después midiendo la unión
del anticuerpo. Puede medirse esta unión del anticuerpo mediante
varios métodos conocidos en la técnica. Entonces el nivel de
respuesta de unión del MI se relaciona preferiblemente con un
patrón químicamente definido. En una realización actualmente
preferida el patrón es TK1 humana, por ejemplo TK1 humana
recombinante d(rhTK1) aislada y sustancialmente purificada,
que puede preparase tal como se describe por Wang et al.
[Wang, Biochemistry, 38:16993, 1999]. Por tanto, el mismo
anticuerpo (ligando) anti-TK que se usa en la
muestra de un sujeto que va a tratarse para o ya tratado para el
cáncer se usa en muestras de prueba que comprenden diferentes
concentraciones conocidas de rhTK1. Determinando la unión del
anticuerpo en la muestra de prueba respectiva se obtiene una curva
patrón de la correlación entre la unión del anticuerpo y el nivel
de concentración. Entonces puede determinarse la concentración del
MI a partir de la unión del anticuerpo medida y la curva patrón.
Una relación alternativa entre el nivel de concentración y nivel de
respuesta de unión podría ser una función de mapeo que usa una
medida de respuesta de unión del IM determinada como entrada y
salidas de un valor de concentración correspondiente. Puede
determinarse una función de este tipo usando la curva patrón y/o las
muestras de prueba que incluyen rhTK1.
El método de ensayo usado para la unión del
anticuerpo tiene que ser lo suficientemente sensible para detectar
la baja cantidad de MI en los sujetos, especialmente en sujetos
sanos. Preferiblemente, el método de ensayo es lo suficientemente
sensible para detectar niveles de concentración del MI de al menos 1
pM, preferiblemente al menos 0,7 pM, más preferiblemente al menos
0,5 pM, tal como al menos 0,3 pM. Un ejemplo de un método de ensayo
sensible de este tipo es el ensayo de transferencia puntual con
quimioluminiscencia mejorada (ECL). Tal como se conoce en la
técnica, el procedimiento del ensayo de transferencia puntual con
ECL es sustancialmente igual que para la inmunotransferencia de
tipo Western. Básicamente, se aplica suero sanguíneo (u otro fluido
corporal) sobre una membrana por ejemplo, una membrana de
nitrocelulosa. Tras un bloqueo (opcional), se añaden anticuerpos
(anti-TK1) primarios, seguidos por anticuerpos
secundarios biotinilados. Después se sumerge la membrana en una
disolución tampón con H_{2}O_{2} seguido por la incubación con
una disolución tampón con
avidina-HRP-estreptavidina
(avidina-peroxidasa del
rábano-estreptavidina) y/o
estreptavidina-HRP. Entonces se detecta la luz
mediante por ejemplo, una cámara CCD (dispositivo acoplado cargado)
digital o se expone a película de rayos X. El ensayo de
transferencia puntual con ECL puede detectar los niveles de
concentración de menos de 0,3 pM [He, Internal. J. Biol.
Marker, 15:139, 2000].
Otro posible método de ensayo es RIA
(radioinmunoanálisis), en el que se marcan anticuerpos
(anti-TK1) con un isótopo, por ejemplo ^{125}I.
Aunque este método es tan sensible como la transferencia puntual con
ECL, el ^{125}I usado es un isótopo inestable con una semivida de
algunas semanas. Además, habitualmente se requiere un equipo de
detección caro (contador de centelleo \gamma) para la
determinación de unión del anticuerpo.
Los anticuerpos usados en el método de ensayo
del MI tratado anteriormente podrían ser anticuerpos monoclonales
y/o policlonales que se unen específicamente a un epítopo de la
proteína TK1, preferiblemente proteína TK1 de sujetos humanos y más
preferiblemente formas tanto enzimáticamente activas como inactivas
de la proteína TK1 humana. Preferiblemente, se separa el epítopo
(físicamente) del sitio activo de la TK1, es decir, los anticuerpos
no deben afectar o inhibir sustancialmente la actividad enzimática
de TK1 mediante la unión directa al sitio activo. Según la
invención, preferiblemente los anticuerpos se unen específicamente a
la parte C-terminal de la proteína TK1 y más
preferiblemente a la secuencia de la proteína TK1 desde el
aminoácido 179 hasta el aminoácido 234, o una parte de la misma,
por ejemplo una secuencia desde el aminoácido 195 hasta el
aminoácido 225, tal como una secuencia desde el aminoácido 210
hasta el aminoácido 224, o una secuencia polipeptídica que
comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína TK1 desde el
aminoácido 179 hasta el aminoácido 234. Ejemplos de tales
anticuerpos se describen en la patente estadounidense n.º 6.083.707,
cuya enseñanza se incorpora en el presente documento como
referencia en la presente invención. En esta patente estadounidense,
se producen anticuerpos policlonales frente a una secuencia larga
de 15 aminoácidos (KPGEAVAARKLFAPQ, SEQ ID NO: 1 o
acetil-KPGEAVAARKLFAPQ, SEQ ID NO: 2) del extremo
C-terminal de TK1. Los anticuerpos de la invención
se generan, por tanto, frente a partes expuestas de la superficie
(epítopos) de la proteína TK1. Usando un anticuerpo frente a una de
las secuencias comentadas anteriormente, podría determinarse el
nivel de respuesta de unión y nivel de concentración de la proteína
TK1 y posiblemente de la TK1 complejada con otras moléculas. Esto
significa que los anticuerpos de la invención determinan
preferiblemente una cantidad total de la proteína TK1, incluyendo
formas enzimáticamente activas e inactivas de la proteína TK1 y la
proteína TK1 complejada con otras moléculas, que incluyen los
epítopos por los que los anticuerpos tienen afinidad.
Agentes de bloqueo en determinados sueros pueden
prevenir la unión de los anticuerpos a la proteína TK1, por
ejemplo, bloqueando el epítopo al que se une el anticuerpo y/o
cambiando, tras la unión a la proteína TK1 de modo que el epítopo
que se une al anticuerpo se mueve desde una ubicación accesible
(superficie) hasta una ubicación en la que es inaccesible para el
anticuerpo.
La presente invención es aplicable en varios
tipos diferentes de cánceres, incluyendo, pero sin limitarse a,
sarcomas y carcinomas humanos, por ejemplo fibrosarcoma,
mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico,
cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma,
linfangioedoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing,
leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer
pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata,
carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales,
adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de
glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares,
cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico,
carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto
biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de
Wilms, cáncer cervicouterino, tumor testicular, carcinoma pulmonar,
carcinoma pulmonar de células pequeñas, carcinoma de vejiga,
carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma,
craneofaringioma, ependimoma, hemangioblastoma, oligodendroglioma,
melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma, leucemias, por ejemplo
leucemia linfocítica aguda (ALL), y leucemia mielógena aguda
(mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y
eritroleucemia), leucemias crónicas (leucemia mielógena crónica,
leucemia granulocítica crónica y leucemia linfocítica crónica),
policitemia verdadera, linfoma (enfermedad de Hodgkin y enfermedad
de no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström
y enfermedad de cadenas pesadas. La presente invención es aplicable
en particular en la predicción de la evolución de cánceres con tumor
sólido, por ejemplo cáncer de mama y gástrico.
El método de predicción y monitorización tumoral
de la invención se resume en la figura 7. Comenzando con la etapa
S1, se determina un nivel de respuesta de unión de un material
inmunorreactivo (MI) que comprende la proteína TK1 (enzimáticamente
activa e inactiva) en una muestra, preferiblemente muestra de fluido
corporal, por ejemplo muestra de suero sanguíneo, de un sujeto,
preferiblemente un sujeto mamífero y más preferiblemente un sujeto
humano, tratado para el cáncer. Obsérvese que el tratamiento contra
el cáncer no tiene que finalizarse cuando se realiza la toma de
muestra del sujeto. Se determina el nivel de respuesta de unión del
MI usando un ligando, preferiblemente un anticuerpo que se une
específicamente a la proteína TK1, más preferiblemente un
anticuerpo que se une específicamente a la parte
C-terminal de la proteína TK1. En la etapa S2, la
estimación de la probabilidad de recidiva de la enfermedad
cancerosa, por ejemplo tal como se manifiesta mediante la aparición
o reaparición del tumor local y/o metastásico, se realiza basándose
directamente en el nivel de respuesta de unión del MI determinado.
Esta probabilidad puede estimarse basándose en una comparación del
nivel de respuesta de unión del MI determinado con un nivel de
respuesta de unión del MI tal como se determinó anteriormente para
el sujeto o de sujetos sanos.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento del ensayo de transferencia
puntual con ECL es el mismo que para la inmunotransferencia de tipo
Western, con una ligera modificación [He, Internal. J. Biol.
Marker, 15:139, 2000]. Se aplicaron directamente tres \mul de
suero de sangre venosa de tubos sanguíneos no heparinizados sobre
una membrana de nitrocelulosa (HybandTM-C,
Amersham). Se tomaron las muestras de sangre por la mañana entre las
7-9 a.m. de personas que no habían tomado el
desayuno. Puede almacenarse la sangre venosa extraída en los tubos
no heparinizados durante al menos 24 horas a +4ºC, o centrifugarse
a 1.500 g durante 5 min. y después almacenarse a -20ºC durante 5
años y a -80ºC durante más de 10 años. Se usó TK1 humana
recombinante (rhTK1) como un patrón, tal como se describió
inicialmente por He, et al. [He, Europ. J. Cell Biol.,
70:117, 1996] y se modificó tal como se describió por Wang, et
al. [Wang, Biochemistry, 38:16993, 1999]. Se bloqueó la
membrana empleada en tampón TBS (solución salina tamponada con
tris) con leche desnatada con un 10% de grasa durante 4 horas y
después se añadió anticuerpo (anti-TK1) primario y
se incubó a +4ºC durante la noche o a temperatura ambiente durante
dos horas. Tras la incubación con un anticuerpo secundario
biotinilado durante una hora a temperatura ambiente, se sumergió la
membrana en tampón TBS con H_{2}O_{2} al 3% durante 5 min.
Entonces se incubó la membrana en tampón TBS con
avidina-HRP-estreptavidina y se
expuso a una película de rayos X. Se determinó la intensidad de un
único punto sobre la película mediante un densitómetro láser. A
partir de la intensidad de la rhTK1 de concentraciones conocidas,
se volvió a calcular la intensidad del MI y se expresó como pM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se caracterizaron anticuerpos
anti-TK1 mediante inmunotransferencia de tipo
Western, isoelectroenfoque, inmunoprecipitación e
inmunohistoquímica. Los resultados se resumen en la tabla 1 a
continuación. Según las inmunotransferencias de tipo Western, los
anticuerpos monoclonales frente a la secuencia peptídica de 15
aminoácidos de longitud (SEQ ID NO: 2) (mAb1D11 y mAb1E3) o rhTK1
(mAb26-3 y mAb26-5) reconocen la
forma nativa de la proteína TK1 en células tumorales humanas, así
como la proteína TK1 en suero de pacientes con tumores malignos,
pero no la subunidad 25 desnaturalizada de la proteína TK1. No se
encontró ninguna banda en el gel de electroforesis en las células
TK1-negativas, en suero de personas sanas o en
presencia de antígeno de competición. Las pruebas de
inmunoprecipitación indicaron que mAb1E3, aunque no se dirige al
sitio activo de la proteína TK1, afecta a la actividad enzimática
de TK1. mAb26-3+5 y mAb1D11 inhiben la actividad de
TK1 en el sobrenadante constituyendo un inmunocomplejo con la
proteína TK1, que se recoge en el sedimento. El isoelectroenfoque
mostró que la proteína TK1 tiene un valor pI de \approx7,0,
cuando se somete a transferencia con mAb26-3+5. Sin
embargo, no se detectó ninguna banda cuando se sometió a
transferencia con mAb1D11 y mAb1E3. El anticuerpo policlonal de
conejo anti-TK1 (AcP) reconoce la subunidad de 25
kDa en electroforesis en gel de SDS y proporciona un valor pI de
TK1 de \approx8,3. El anticuerpo IgY de pollo
anti-TK1 (SSTK Biotech Inc., China), dirigido frente
a una secuencia de 31 aminoácidos o de los aminoácidos 194 a 225 de
la proteína TK1, reconoce tanto la forma nativa de TK1 y la
subunidad de 25 kDa y proporciona un valor pI de \approx8,3.
Finalmente, los anticuerpos monoclonales (AcM, EE.UU.) frente a la
proteína TK1 completa (QED Bioscience Inc, San Diego, EE.UU.)
reconocen la subunidad de 25 kDa de TK1.
Pueden usarse todos los anticuerpos comentados
anteriormente y presentados en la tabla 1 para tinción
inmunocitoquímica, tanto en líneas celulares como en material
incrustado en parafina. Se ubicó la reacción del anticuerpo
anti-TK1 en el citoplasma de células tumorales. Se
encontró nada o muy poco de tinción en células mutantes que carecen
de la actividad enzimática de TK1, así como en linfocitos en reposo.
Por tanto, pueden usarse los anticuerpos anti-TK1
sometidos a prueba para determinar el nivel y la concentración de
respuesta de unión del MI. Estos anticuerpos también reconocen
diferentes epítopos en la proteína TK1, que identifican
probablemente diversas subpoblaciones de TK1.
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración del MI (STK1) tal como se midió
mediante el inmunoensayo de transferencia puntual con ECL comentado
anteriormente se comparó con la actividad enzimática de STK tal como
se determinó mediante el ensayo RIA en personas sanas y los
resultados se presentan en la figura 1 y la tabla 2. Tanto la
concentración del MI como la actividad enzimática de STK fueron
bajas (inferior a 2 pM y 2 U/l, respectivamente). Hubo una
correlación significativa entre la concentración del MI y la
actividad enzimática de STK (r = 0,67, p<0,01) para estas
personas sanas.
También se determinaron la concentración del MI
y la actividad de STK en pacientes con enfermedades no cancerosas.
En seis de 19 de estos pacientes con insuficiencia renal,
hemorragia, cirrosis de hígado e infección pulmonar y enfermedades
no infecciosas, se elevaron la concentración del MI y la actividad
de STK 1,6 y 1,8 veces, respectivamente, en comparación con los
controles sanos. En un caso de hemorragia y un caso de cirrosis
hepática, la concentración del MI era 5 veces mayor y la actividad
de STK 2-4 veces por encima de los valores de corte
de 2 pM y 2,4 U/l, respectivamente. Hubo una correlación
significativa entre la concentración del MI (STK1) y la actividad
de STK en pacientes con estos tipos de enfermedades no cancerosas
(tabla 2).
En la tabla 2, la correlación y sus valores de
significación se basan en coeficientes de correlación de
Pearson.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las concentraciones del MI
(STK1) de 752 pacientes con tumor con 9 tipos diferentes de tumores
malignos mediante el inmunoensayo de transferencia puntual con ECL y
se encontró que aumentaron hasta 200 veces, en comparación con las
personas sanas. También se midieron las concentraciones del MI en
suero de pacientes con lesiones benignas morfológicas. Los
resultados de las concentraciones medidas se presentan en la figura
2, en la que A representa leucemias, B representa tumores gástricos,
C representa tumores de colon, D representa tumores de recto, E
representa tumores de mama, F representa tumores de pulmón, G
representa linfomas, H representa hepatomas, I representa tumores
de cerebro, J representa otros tipos de tumores malignos, K
representa lesiones benignas morfológicas y L representa personas
sanas. En los pacientes con tumores malignos la concentración del
MI se encontró desde valores casi normales (punto de corte 2 pM)
(29/752) hasta 100 pM (711/752), y en algunos casos hasta 200 pM
(13/752). Por tanto, aproximadamente el 95 por ciento de los
pacientes con tumor maligno muestran concentraciones del MI por
encima de un valor de corte del MI de 2 pM.
También se determinó la actividad enzimática de
STK en paralelo en 264 pacientes con tumor, lesiones benignas,
enfermedades no cancerosas y personas sanas. Mientras que la
concentración del MI variaba extensamente entre los diversos
pacientes, la actividad de STK sólo mostró una variación limitada.
En lesiones benignas, leucemia, cáncer de mama y cáncer gástrico,
se encontró correlación significativa entre la concentración del MI
y la actividad de STK para los pacientes antes de cualquier
tratamiento contra el cáncer (véase la tabla 2). Sin embargo, no se
encontró ninguna correlación para la mayoría de los tipos de tumores
investigados en los individuos no tratados, véase la figura 4.
También se investigó la concentración del MI
(STK1) en 68 pacientes preoperatorios con cáncer del tubo
gastrointestinal con respecto a la presencia o ausencia de
metástasis (sin metástasis (M0) n=46, y metástasis (M1) n=22) y el
grado de diferenciación (diferenciación alta o moderada alta n=56, y
diferenciación baja n= 12) según directrices expuestas en el TNM
clínico (UICC, quinta edición, 1997). Los resultados se resumen en
la tabla 3. Las concentraciones del MI fueron 4,5 veces superiores
en los pacientes con metástasis (M1), en comparación con pacientes
sin metástasis (M0) (p<0,01). La concentración en los pacientes
con tumores diferenciados de manera baja, también era superior, en
comparación con pacientes con tumores diferenciados altamente/de
manera moderadamente alta, aunque no significativamente diferente
(p>0,05).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron las concentraciones del MI
(STK1) y actividades enzimáticas de STK en 43 pacientes con cáncer
gástrico (CG) por medio del inmunoensayo de transferencia puntual
con ECL y mediante el ensayo de actividad RIA, respectivamente. La
figura 3 ilustra una inmunotransferencia de tipo Western y
transferencia puntual de un ejemplo de un paciente con tumor (P3),
una transferencia puntual de un individuo sano (sano) y de
diferentes concentraciones de TK1 recombinante humana (rhTK1). En
la tabla 4 se presentan la concentración de STK1 y los valores de
actividad de STK determinados de pacientes preoperatorios. La
concentración del MI y la actividad de STK se elevaron
significativamente en los pacientes con tumor antes de la
operación.
\vskip1.000000\baselineskip
Treinta y cinco días tras la operación las
concentraciones del MI disminuyeron significativamente en
aproximadamente la mitad en casos libres de tumor, (p = 0,0106),
mientras que las actividades enzimáticas de STK no lo hicieron. En
los pacientes con metástasis (M1), la concentración del MI aumentó
hasta el 173%, 35 tras la operación. No se observó tal aumento en
la actividad enzimática de STK, véase la tabla 5. La concentración
del MI no modificada en pacientes M0 en el día 7 tras la operación
se debe en parte a un aumento en la concentración del MI en conexión
con el traumatismo de la operación (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como es evidente a partir de las tablas 4 y 5,
las concentraciones del MI pueden usarse para monitorizar los
resultados del tratamiento en cáncer gástrico, en contraposición a
la actividad enzimática de STK. Además, el nivel de concentración
del MI, pero no la actividad de STK, puede detectar recidiva de la
enfermedad cancerosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinaron la concentración del MI (STK1)
tal como se midió mediante el inmunoensayo de transferencia puntual
con ECL y las actividades enzimáticas de STK medidas mediante un
ensayo RIA en 24 pacientes con leucemia. Hubo una correlación
significativa entre estos dos parámetros en los pacientes antes de
comenzar el tratamiento (r = 0,44), véase el diagrama A en la figura
4.
De estos 24 pacientes se siguió a 6 durante y
tras el tratamiento. Hubo una reducción en la concentración del MI
en los pacientes que recibieron quimioterapia. Cuando se terminó la
quimioterapia, aumentó la concentración del MI. La actividad
enzimática de STK aún era alta tras comenzar de la terapia, lo que
indica que la concentración del MI es un ensayo más fiable para
predecir el resultado del tratamiento en comparación con la
actividad de STK.
\vskip1.000000\baselineskip
Las concentraciones del MI (STK1) en suero en
una cohorte de 120 pacientes con cáncer de mama, incluidos en un
ensayo clínico controlado de terapia endocrina adyuvante, se
determinaron en 67 de estos pacientes tres meses tras la operación,
usando el anticuerpo IgY de pollo anti-TK1 (véase la
tabla 1). La concentración del MI a los tres meses se relacionó con
la obtenida a los 21 días tras la operación. Doce pacientes
desarrollaron enfermedad cancerosa metastásica distante y 7 tumores
locorregionales como el primer acontecimiento durante un período de
seguimiento medio de 11,6 años.
Se subdividieron los 67 pacientes en tres grupos
de pacientes de igual tamaño con unas concentraciones del MI
relativas de <0,78, 0,78-1,08 o > 1,08, tal
como se determinó dividiendo la concentración del MI a los tres
meses tras la cirugía entre la concentración del MI correspondiente
21 días tras la operación. Un análisis multivariado de pacientes
con cualquier reaparición tumoral (distante o locorregional),
considerando el estado nodular y ER, tamaño del tumor, tratamiento
endocrino y edad, mostró que los pacientes con una concentración
del MI relativa > 1,08 eran significativamente diferentes
estadísticamente a los pacientes que tienen una concentración del
MI relativa de <0,78 (p=0,004). La razón de tasa de riesgo de
desarrollar cualquier reaparición en los pacientes con una
concentración del MI relativa > 1,08 era aproximadamente
6-7 veces superior que en pacientes con las
concentraciones relativas < 0,78.
\vskip1.000000\baselineskip
Las tasas de incidencia acumulativa estimada de
cualquier reaparición a los 5 años fueron 0,09 (IC del 95%:
0,02-0,34), 0,23 (IC del 95%:
0,11-0,49) y 0,48 (IC del 95%:
0,31-0,73) para las concentraciones de STK1
relativas <0,78, 0,78-1,08 y >1,08,
respectivamente, véase la figura 5. Por tanto, una alta
concentración del MI a los 3 meses tras el tratamiento contra el
cáncer, tal como se representa por el grupo > 1,08, es una clara
indicación de una alta probabilidad de reaparición tumoral
(locorregional o distante).
Se determinaron la concentración del MI (STK1) y
la actividad enzimática de STK en 37 de los pacientes. Estos
resultados también se compararon con determinaciones de CA
15-3, que se consideran "el marcador de oro"
dentro del campo de los marcadores tumorales. La figura 6 ilustra
la concentración del MI determinada, la actividad de STK y la
concentración de CA 15-3 a los 3 meses tras la
operación expresadas como porcentaje de valores correspondientes 21
días tras la operación. En 15 pacientes (A) hubo una recidiva de
tumor en el plazo de 1 a 5 años tras la operación, mientras que no
hubo ninguna recidiva tumoral en 22 pacientes (B). Tal como se
muestra en la figura, ya a los 3 meses tras la operación la
concentración del MI era marcadamente superior en un
50-60% de los pacientes (A) que los tumores
desarrollados de nuevo después de 1 a 5 años. Sin embargo, no hubo
ninguna diferencia en las actividades de STK o los valores de CA
15-3 en los pacientes con (A) o sin (B) cualquier
tumor recurrente. La concentración del MI también predijo un
25-30% de los pacientes (B) que posteriormente no
tuvieron enfermedad tumoral recurrente.
Por tanto, se concluye que existe una tendencia
significativa hacia concentraciones del MI relativas superiores en
pacientes que desarrollan enfermedad cancerosa recurrente
locorregional y/o distante, durante el período de seguimiento de
11,6 años. Puede usarse tal información para evitar, prolongar o
cambiar la terapia adyuvante debido a una evaluación de riesgo
mejorada.
Se entenderá por un experto en la técnica que
pueden realizarse diversas modificaciones y cambios a la presente
invención sin apartarse del alcance de la misma, que se define
mediante las reivindicaciones adjuntas.
<110> xi Bao Research AB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Predicción de la evolución del
cáncer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P377PC00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/471.245
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-05-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Timidina cinasa TK1, péptido,
anticuerpos correspondientes y uso de de los mismos en la
determinación de la proliferación tumoral
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
\vskip0.400000\baselineskip
<310> US 6.083.707
\vskip0.400000\baselineskip
<311>
21-04-1995
\vskip0.400000\baselineskip
<312>
02-11-1995
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(15)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 15 aminoácidos del extremo
C-terminal de TK1 de humana con un grupo acetilo
unido al aminoácido 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC-FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Acetil-Lisina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<300>
\vskip0.400000\baselineskip
<302> Timidina cinasa TK1, péptido,
anticuerpos correspondientes y uso de los mismos en la determinación
de la proliferación tumoral
\vskip0.400000\baselineskip
<309>
\vskip0.400000\baselineskip
<310> US 6.083.707
\vskip0.400000\baselineskip
<311>
21-04-1995
\vskip0.400000\baselineskip
<312>
02-11-1995
\vskip0.400000\baselineskip
<313> (1)..(15)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
Claims (13)
1. Método para predecir la recidiva de cáncer en
un sujeto tratado para una enfermedad cancerosa que comprende las
etapas de:
- -
- poner en contacto un ligando de afinidad por la proteína timidina cinasa 1 (TK1) con una muestra de fluido corporal de dicho sujeto, dicho ligando se une específicamente a dicha proteína TK1;
- -
- determinar una cantidad de ligando que se une a dicha proteína TK1 y/o a un complejo que comprende la proteína TK1 en dicha muestra; y
- -
- estimar una probabilidad de futura recidiva de cáncer después de al menos un año tras el tratamiento contra el cáncer basándose en dicha cantidad determinada de unión de ligando y sin determinación de un nivel de actividad enzimática de TK1.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, que
comprende además las etapas de:
- -
- determinar una primera cantidad de unión de ligando en dicho sujeto no más tarde de un mes tras el inicio de dicho tratamiento contra el cáncer; y
- -
- determinar una segunda cantidad de unión de ligando en dicho sujeto tras el inicio de dicho tratamiento contra el cáncer, en el que dicha etapa de estimación comprende estimar dicha probabilidad de futura recidiva de cáncer basándose en dichas primera y segunda cantidades de unión de ligando.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Método según la reivindicación 2, que
comprende además predecir una futura recidiva de cáncer si una razón
de dicha segunda cantidad de unión de ligando y dicha primera
cantidad de unión de ligando supera uno.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el
que dicha primera cantidad de unión de ligando se determina en dicho
sujeto 21 días tras dicho tratamiento contra el cáncer.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que dicha segunda cantidad de unión de
ligando se determina en dicho sujeto en el plazo de uno a seis meses
después de dicho tratamiento contra el cáncer.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicha segunda cantidad de unión de ligando se determina en dicho
sujeto aproximadamente 3 meses después de dicho tratamiento contra
el cáncer.
7. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además las etapas de:
- -
- generar una relación entre una cantidad de unión de ligando y un nivel de concentración de dicha proteína TK1 y/o dicho complejo que comprende la proteína TK1 usando TK1 recombinante; y
- -
- determinar un nivel de concentración a partir de dicha cantidad de unión de ligando y dicha relación generada, en el que dicha etapa de estimación comprende estimar dicha probabilidad de futura recidiva de cáncer basándose en dicho nivel de concentración determinado.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho ligando es un anticuerpo que
se une específicamente a la parte C-terminal de
TK1.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho ligando es un anticuerpo que
se produce frente a una secuencia peptídica seleccionada de:
- -
- secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 1; y
- -
- secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha etapa de determinación de la
unión de ligando comprende la etapa de medir dicha unión de ligando
mediante un inmunoensayo de transferencia puntual con
quimioluminiscencia mejorada (ECL).
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha enfermedad cancerosa es una
enfermedad cancerosa de tumor sólido.
\newpage
12. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha probabilidad de futura
recidiva de cáncer se estima basándose directamente en dicha
cantidad determinada de unión de ligando.
13. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho complejo que comprende la
proteína TK1 es un complejo de dicha proteína TK1 y una proteína o
polipéptido, tal como un inhibidor o activador de dicha proteína
TK1.
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