EP1428028A2 - Identifizierung von antigenen durch xenogene, allogene oder autologe antikörper-vermittelte präzipitation - Google Patents

Identifizierung von antigenen durch xenogene, allogene oder autologe antikörper-vermittelte präzipitation

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EP1428028A2
EP1428028A2 EP02798721A EP02798721A EP1428028A2 EP 1428028 A2 EP1428028 A2 EP 1428028A2 EP 02798721 A EP02798721 A EP 02798721A EP 02798721 A EP02798721 A EP 02798721A EP 1428028 A2 EP1428028 A2 EP 1428028A2
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EP
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protein
antibodies
cells
serum
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Definitions

  • the present invention describes a method (here called AMIDA, for antibody-mediated identification of antigens) for the identification of antigens which are associated with diseases in which a humoral immune response is formed and thus specific antibodies are formed.
  • AMIDA antibody-mediated identification of antigens
  • This method is based on the precipitation of antigens from cell lysates or bacterial, parasite and / or niral preparations mediated by autologous, allogeneic or xenogeneic antibodies with autologous, allogeneic and / or xenogenic sera, ascites or pleural fluids.
  • the induction of an immune response which goes hand in hand with the production of antibodies, is the only basic requirement for the use of AMIDA.
  • the method is therefore particularly suitable for identifying tumor antigens, but also for those antigens which are associated with autoimmune disorders or bacterial, viral and parasitic infections.
  • antigens as used in this description means structures against which an organism forms antibodies because they are foreign to its immune system. Knowledge of the most specific antigens is an important prerequisite for diagnosis and immunotherapy of tumor patients and people suffering from, for example, an autoimmune disease or a chronic infection. Such antigens, which are more or less specific to the respective disease, enable the detection and targeting in vivo and in vitro of tumor cells, of cells that are the target of an autoimmune reaction as well as infected cells and infectious organisms.
  • the present application describes a method for isolating and identifying antigens that are targets of a humoral immune response.
  • Tumor-specific antibodies are adequate tools for isolating the antigens they recognize.
  • Known antigens such as MAGE-1 and tyrosinase have been cloned by SEREX.
  • SEREX tyrosinase
  • completely new antigens were identified, the best known being NY-ESO-1, the expression of which in healthy tissue is limited to testes and ovaries, but which is also used in a variety of cancers, such as melanoma, but also on breasts and blisters -, prostate and hepatocellular carcinomas, is expressed.
  • the SEREX technology comprises the following steps:
  • SEREX The main disadvantages of the SEREX process are that it is very time-consuming and technically and methodologically complicated. The processing period for a single tumor biopsy can easily be up to six months.
  • Another problem of SEREX is the heterologous expression of the cDNAs obtained from the tumor biopsies in E. coli: Since post-translational modifications such as glycosylation, which can be essential for the detection of antigens by antibodies, do not or do not take place differently in bacteria, the detection of Antigens not guaranteed at all.
  • post-translational modifications such as glycosylation, which can be essential for the detection of antigens by antibodies, do not or do not take place differently in bacteria, the detection of Antigens not guaranteed at all.
  • the different steps of reverse transcription, cloning and transcription represent potential sources of error, so that SEREX as a whole is a technology that has a certain potential, but is error-prone and time-consuming.
  • the method according to the invention is an effective method for isolating and identifying antigens and works with a species-specific, xenogeneic or autologous system by using antibodies from serum, ascites and / or pleural fluid.
  • the advantages of the method according to the invention are manifold: First, the system is not based on the external expression of cDNAs in bacterial or eukaryotic recipient cells, but rather enables direct screening in the native context, i.e. in tumor cells, in diseased tissues or in bacteria, viruses or parasites themselves This is of particular importance since the ectopic expression of antigens in unrelated eukaryotic recipient cells or bacteria does not adequately mimic the actual situation in the donor cells (eg cells of a primary tumor). Post-translational modifications, such as glycosylation, can change depending on the expression System differentiate and do not occur at all in bacteria. However, glycosylation can be essential for the detection of antigens.
  • the method according to the invention can be established as high-throughput and semi-automated technology, which enables the examination of materials from several patients in parallel.
  • the procedure is fast and it is realistic to isolate and fully identify a tumor-associated protein within a comparatively very short period of about 1-2 weeks.
  • the method according to the invention is suitable for the examination of a large number of antigens: primarily tumor antigens, but also also antigens which are associated with autoimmune diseases and bacterial, parasitic or viral infections.
  • the technique is also suitable, for example, for examining antigens that are involved in autoimmune diseases.
  • the proteins and structures that are the target of the autoimmune reaction are often not known.
  • the use of the method according to the invention can also enable deeper insights into some clinical pictures in the case of autoimmune diseases.
  • the method according to the invention in chronic diseases which are caused by a known pathogenic agent.
  • Tissue from a sick patient but also an animal model with different mouse strains can be used.
  • Mouse strains that are resistant or non-resistant to a particular bacterial infection serve to characterize the humoral response, which is responsible for protection against the pathogen in the resistant mouse strain.
  • the use of human tissue enables the results / antigens obtained from the animal models to be checked and thus the identification of therapeutically interesting antigens.
  • Infection with various parasites (e.g. plasmodia) or viruses (e.g. the family of herpes viruses) also leads to an immune response, in the course of which if specific antibodies are formed.
  • the method according to the invention can thus also be used in the case of such diseases in order to identify new antigens and thus to improve the therapy.
  • tumor antigens, autoantigens and immunogenic bacterial, parasitic or viral proteins can be used in many ways: (i) Dendritic cells or B cells can be loaded with them and thus used to activate specific T cells, (ii) It can be produce monoclonal and bispecific antibodies, which are of great benefit for the diagnosis of a disease and the therapy of patients.
  • the method according to the invention thus represents a new and promising tool for examining the humoral reaction of patients with a large number of diseases and can make a decisive contribution to the development of new therapies for these diseases.
  • the method according to the invention for finding antigens comprises the following steps:
  • a donor obtains a biopsy of the tissue of interest and uses it to make a protein lysate; if cultures of bacteria, parasites or viruses are used, these are also lysed.
  • the protein lysate is then incubated with allogeneic, xenogeneic and / or autologous serum, ascites and / or pleural fluid, each of which contains antibodies which have been raised to a humoral immune response or an autoimmune response to the antigens in order to specifically bind the antibodies to the to achieve antigens recognized by them in the protein lysate.
  • the antigen-antibody complexes are then separated off and the antigens specifically bound to the antibodies are identified by suitable methods.
  • antigen means any substance or structure with which antibodies can react specifically.
  • antigen is understood to mean in particular a substance or structure, upon detection of which the vertebrate organism reacts with an immune response.
  • antigen means in particular a tumor anti- gene or a target antigen of humoral immune response, which is associated with autoimmune diseases and infections - both bacterial and viral or parasitic.
  • autologous means that the donor of the cell material to be examined and the donor of the serum containing antibodies are identical.
  • allogeneic means that the donor of the cell material to be examined and the donor of the serum containing antibodies are not identical, but are genetically differential, but both belong to the same species.
  • xenogen means that the donor of the cell material to be examined and the donor of the serum containing antibodies are not identical and do not belong to the same species.
  • autologous system is the preferred system in the present invention
  • sera, ascites and / or pleural fluid containing allogeneic or xenogeneic antibodies can also be used.
  • Many antigens, especially tumor markers, which occur species-specifically, can be identified in this way without being dependent on autologous donor serum.
  • a xenogeneic application of this method is, for example, the incubation of a bacterial or viral lysate with sera from infected host organisms.
  • serum is to be understood as the liquid phase of the blood obtained, which contains soluble antibodies and other soluble serum proteins.
  • a donor is understood to be an individual in whom the method according to the invention is intended to find antigens by means of antibodies contained in xenogenic, allogeneic or autologous sera, ascites or pleural fluid. This includes primarily mammals and humans, but also infectious organisms, microorganisms or cell lines.
  • Autoimmune diseases are understood to mean autoaggressive diseases in which T cells and antibodies are formed in the course of an immune response, which ne substances (autoantigens) are directed.
  • autoimmune diseases include Hashimoto's tyreoiditis, pernicious anemia, chronic gastritis, addis on disease, systemic lupus erythematosus, multiple sclerosis, and many others.
  • the method according to the invention is used when the target antigens of the humoral response are not sufficiently known and researched.
  • antibodies which are directed against immunoglobulins of the donor for example the IgG subclass, are additionally added.
  • these additionally added antibodies are coupled to a carrier material and thus serve as a bridge between this carrier material (for example Sepharose) and the antibodies contained in the serum.
  • a desired antibody subclass can thus (if desired) be specifically bound to the support material.
  • a protein lysate according to the present invention can be prepared as follows: cells are lysed using detergents (e.g. Triton-XIOO or NP40), i.e. the cell membranes are completely opened. The insoluble cell components are then centrifuged off while many proteins are in solution.
  • detergents e.g. Triton-XIOO or NP40
  • the protein lysate is fractionated before the incubation step.
  • This fractionation can include, for example, a separation into membrane parts and cytoplasmic parts. The two fractions can then be used separately for the further implementation of the process. Fractionations allow a further specification of the isolated antigens and a simplified technical implementation, since fewer antigens can be separated. For the same purpose, fractionations can also be used to enrich individual cellular compartments. As an alternative to centrifugation, fractionation according to protein size can also be carried out using exclusion columns.
  • the antibodies used according to the invention are preferably bound to a carrier material. This applies both to the autologous / allogeneic / used in the incubation step xenogenic serum, ascites or pleural fluid containing antibodies, as well as for any additional antibodies which may be used and which are directed against immunoglobulins of the donor.
  • the binding to a carrier material enables the later separation of the antigen-antibody complexes via centrifugation, if, for example, Sepharose beads are coated with the antibodies and, due to their density, sink downward. Sepharose, Sepharose Protein A, Sepharose Protein G, Agarose Protein A, or Agarose Protein G can be used as carrier materials.
  • the protein lysate is pre-incubated with the carrier material. In this way, proteins can be removed from the lysate that bind non-specifically to the carrier material and would subsequently make analysis more difficult.
  • the antibodies are covalently bound to the carrier material.
  • a covalent bond generally takes place through amide bonds between amino and carboxyl groups of the proteins or through the formation of disulfide bridges from two SH groups in each case.
  • the reagents used here are, for example, difluoronirrobenzene, cyanogen bromide, formaldehyde, glutaraldehyde, hydroxysuccinimide esters and imidates. Dimethylpimelimidate is preferably used as the imidate.
  • Information on the covalent binding of antibodies to a matrix using dimethylpimelimidate can be found in: A one step purisscation of membrane protein using a high efficiency immunomatrix.
  • the antigen-antibody complexes can be separated off by centrifugation if the antibodies are bound to a carrier material.
  • the antibody-antigen complexes which form when incubating lysates with serum can alternatively be separated off using protein A or protein G-coated columns.
  • General information on immunoprecipitation can be found in the above-mentioned publication (Journal of Biological Chemistry) and in Purisscation of anti-thyroglobulin IgGfrom human serum. Clin. Chem. Lab. Med. 2000 Jul. 38 (7), pp. 597 - 602.
  • the detection of the antigens specifically bound to the antibodies preferably comprises the separation of the separated complexes by electrophoretic methods.
  • a two-dimensional electrophoresis is preferably used here.
  • the proteins are first separated according to their isoelectric point in an immobilized pH gradient and then according to their size in a conventional SDS-PAGE (Görg A, Obermaier C, Boguth G, Härder A, slice B, Wildgruber R, Weiss W. " The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. "Electrophoresis 2000 Apr; 21 (6): 1037-53).
  • electrophoresis is understood to mean the transport of charged particles under the influence of an electric field as a function of their shape, size and charge, and of temperature, viscosity and field strength.
  • Gels such as polyacrylamide are preferably used as supports for electrophoresis.
  • the proteins are treated after the electrophoretic separation with dyes such as Coomassie blue, silver, Ponceau red or with fluorescent or luminescent reagents.
  • the proteins of interest for example protein spots or bands
  • a protease digestion for example trypsin
  • the proteins of interest can also be cut out, subjected to protease digestion and sequenced, for example, by classic methods such as Edman degradation.
  • Mass spectrometry is carried out, for example, using MALDI-ToF spectrometers (Matrix Assisted Laser Disposition Ionization / Time of Flight), but among other things ESI (electrospray ionization, also as nanoscale ESI), EI (electron impact ionization, quadrupole), CI (chemical ionization) and FAB (fast atom bombardment) can be used.
  • MALDI-ToF spectrometers Microx Assisted Laser Disposition Ionization / Time of Flight
  • ESI electrospray ionization, also as nanoscale ESI
  • EI electron impact ionization, quadrupole
  • CI chemical ionization
  • FAB fast atom bombardment
  • proteins can be radiolabelled, as is done by adding 35 S-methionine or 32 P- ⁇ ATP before lysis or by subsequent iodination of proteins. As a result, these proteins are labeled and can be shear separation can be visualized using an X-ray film or another suitable method.
  • the proteins are transferred to a nitrocellulose or a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane after electrophoresis. These proteins are then detected by staining and then isolated from the membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the specific antigens identified by this method are preferably compared with suitable controls:
  • Such controls are, in particular, lysates from healthy cell material from the same donor and / or the analysis of the serum itself. This sample is also interesting for the detection of seminal proteins which are specifically present in tumor patients in the serum are.
  • the donors of the material for the production of protein-containing lysates are mammals,. especially humans, primates and rodents, but also infectious organisms such as parasites, bacteria and viruses. Mammals, in particular humans, primates and rodents, such as mice, rats, hamsters or rabbits, are used as donors of autologous / allogeneic / xenogenic sera, ascites or pleural fluids.
  • the pictures show:
  • GHD-1 lymphocytes (A), monocytes (B) and tumor cells (C) were incubated with the autologous sera before or after BiUH therapy.
  • Bound antibodies were detected using a human IgG3-specific secondary PE-conjugated antibody.
  • the BiUII therapy had a strong induction of Antibodies result, which specifically bound to GHD-1 tumor cells, but not to lymphocytes and monocytes. A representative experiment of three is shown.
  • FIG. 2 A schematic of the AMIDA screening technology.
  • FIG. 3 A FACS analysis of the CK8 expression of carcinoma cell lines.
  • GHD-1 tumor cells were either treated untreated (ie not permeabilized) or permeabilized with the CK8-specific antibody 1E8 in combination with a FITC-labeled secondary antibody.
  • B. The displayed non-germinated cell lines were stained with the CK8-specific antibody 1E8 in combination with a FITC-conjugated secondary antibody.
  • dead cells were delimited according to their propidium iodide uptake and excluded from the analysis (except for 3A, permeabilized cells). A representative experiment of three is shown.
  • FIG. 4 Immunostaining of CK8 on carcinoma cell lines.
  • A. Cytospins of the carcinoma cell lines FaDu and PCI-1 were stained with a CK8-specific antibody in combination with a peroxidase-conjugated secondary antibody.
  • B. equal to A.), except that a FITC-conjugated secondary antibody was used (green).
  • the cellular DNA was stained using the intercalating dye bis-benzamidine (blue). A representative experiment of three is shown.
  • FIG. 5 A FACS analysis of CK8 expression on primary carcinoma cells.
  • A. Single cell suspensions of carcinoma biopsies of the head and neck area were generated and stained with CK8 or EpCAM-specific antibodies in combination with a secondary FITC-conjugated antibody. The cells were delimited according to their propidium iodide uptake (upper histograms). Living, Pl-negative cells were positive for Ep-CAM and CK8 (middle histograms). Dead cells (PI positive) were EpCAM negative, but expressed CK8 in high and heterogeneous amounts (lower histograms). The representative results of one out of six patients are shown.
  • the GHD-1 cell line was generated from a tumor biopsy of a hypopharyngeal carcinoma and cultivated in standard cell culture medium (DMEM, supplemented with 10% fetal calf serum).
  • DMEM standard cell culture medium
  • Single cell suspensions from primary carcinoma biopsies of the head and neck area were obtained as follows: The biopsies were comminuted and incubated for 2 hours at 37 ° C on a tumble mixer in DMEM, the collagenase (2mg / ml; type 8 Sigma) and DNAse I (0.2 mg / ml; type TV, Sigma) contained. The cells were then washed twice in PBS and resuspended in PBS supplemented with 3% fetal calf serum for subsequent immunostaining and flow cytometry analysis.
  • Non-permeabilized cells (5x10 5 per sample) were incubated with the human CK8-specific antibody 1E8 (Hiss Diagnostics, Germany) for two hours on ice, washed in PBS containing 3% fetal calf serum, and with FITC-labeled secondary antibody (1 hour, on ice) colored. The analysis was carried out using a FACScalibur device (Becton Dickinson, Germany). Alternatively, the cells were fixed (1% paraformaldehyde, 10 minutes) and permeabilized (Triton 0.2%, 20 minutes) before staining. In all experiments, the cells were stained with propidium iodide to isolate vital / intact and permeabilized cells.
  • Biopsies of primary carcinomas were crushed and homogenized using a 100 ⁇ m Zeil filter (Falcon). The cells were washed once in PBS. Primary tumor cells or GHD-1 cells (1x10 7 cells) were in hypotonic buffer containing 10mM HEPES (pH7.9), 10mM KC1, 1.5mM MgCl 2 , 0, 1mM EGTA and 0.5mM DTT for 30 minutes incubated. The cells were then mechanically comminuted with a 25G cannula and the particle fraction was centrifuged off (3000 g; 4 ° C.).
  • the supernatant representing the cytoplasmic fraction was mixed with 1% triton and protease inhibitors and the pellet (membrane fraction) was resuspended in a triple volume of PBS containing 1% triton and protease inhibitors.
  • the immunoprecipitation was carried out with Sepharose beads, which were precoated with an anti-human IgG3 antibody (only in the case of GHD-1 lysates), and patient sera (overnight, 4 ° C., tumbler mixer).
  • the beads were then washed extensively in 50mM Tris buffer, resuspended in 2D lysis buffer (1 IM urea, 4% CHAPS, 1% DTT, 2.5mM EDTA and 2.5mM EGTA) and centrifuged at 42000g (1 hour, 4 ° C).
  • the proteins in the supernatant were separated by isoelectric focusing and using immobilized pH gradients pH 3-10 or 4-7 (ff G strips, Amersham) and separated according to their molecular weight in a 12.5-13% SDS polyacrylamide gel.
  • the proteins were visualized by Coomassie or silver staining, the proteins were isolated, digested with trypsin (2.5ng / ⁇ l; Promega) and analyzed in a MALDI-ToF mass spectrometer (Bruker). The corresponding proteins were identified using the Mascot Science database.
  • the present invention is a system designed to isolate and identify antigens expressed, for example, in primary tumor cells, which are targets for a humoral immune response.
  • a single cell suspension was first generated from a biopsy of a primary hypopharynx carcinoma. The cells were then lysed and the proteins obtained (see above). The lysates were incubated for 3h with Sepharose Protein A beads to make them non-specific remove binding proteins from the lysate. Autologous serum antibodies were layered on Sepharose Protein A beads and used for the immunoprecipitation (IP) of the tumor protein lysates.
  • IP immunoprecipitation
  • the immunoprecipitated proteins were separated in a two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) according to their isoelectric point and molecular weight.
  • the following control IPs were analyzed in parallel: (i) beads that were only coated with serum, (ii) lysates from autologous normal cells (here leukocytes), which were immunoprecipitated with the same serum antibodies, and (iii) the protein lysate incubated with untreated Sepharose beads and immunoprecipitated to define proteins that bound non-specifically to the Sepharose beads.
  • Hsc70 heat shock cognate protein 70
  • G ⁇ 78 glucose-regulated protein 78
  • CK8, CK9 keratins 8 and 9
  • BiUII Characterization of the induced humoral anti-tumor reaction using AMT
  • BiUII is one such bispecific antibody that was tested in a phase I / H clinical study in patients with hypopharyngeal carcinomas. Sera were collected from these patients before and after therapy and tumor biopsies were obtained in order to generate tumor cell lines. The induction of a tumor-specific humoral immune response in a flow cytometric analysis could be demonstrated when comparing pre- and post-therapy sera of patient GHD-1.
  • the BiUII therapy induced a strong humoral immune reaction against the autologous tumor cell line in this patient, as demonstrated by the presence of autoantibodies of the IgG3 subclass in the post-therapy serum, which bound to the autologous tumor cells. In contrast, no increase in antibody binding to autologous lymphocytes or monocytes was observed ( Figure 1). The BiUII treatment thus resulted in an increased tumor-specific humoral response.
  • AMIDA was carried out in patient GHD-1 as follows: Pre- and post-therapy sera were layered separately on Sepharose-A- ⁇ IgG3 beads and incubated with lysed membrane fractions of autologous GHD-1 cells. The immunoprecipitated proteins were separated by 2D-PAGE, analyzed after tryptic digestion by mass spectrometry and identified using the Mascot Science protein database. The purpose of this experiment was twofold: first to characterize the BiUTI-induced humoral immune response, and second to use AMIDA under conditions where a humoral immune response had been demonstrated. AMIDA screening in patient GHD-1 led to the differential immunoprecipitation of proteins, which were shown as 9 different protein spots in 2D-PAGE.
  • CK8 is a cytoplasmic protein that is expressed in single-layer epithelia and some types of carcinoma (Southgate, 1999, 13) and that forms intermediate filaments intracellularly as a heterodimer with CK18.
  • CK8 has a molecular weight (MW) of approx. 53 kDa and a calculated isoelectric point (pl) of 5.36, which corresponds to the MW and pl matches as estimated from the AMIDA results.
  • Protein spots 5, 6 and 7 were identified as human immunoglobulin (Ig) lambda and Ig kappa chains, a result that additionally underlines the induction of a humoral response following BiUII therapy.
  • the two remaining spots 8 and 9 are proteins for which there is no entry in the database.
  • CK8 is actually a strictly intracellular protein
  • the immunoprecipitation of CK8 from a protein lysate of the autologous tumor cells by autoantibodies indicates the ectopic, namely surface expression of CK8 on these cells.
  • unpermeabilized GHD-1 cells were first stained with a CK8-specific antibody in combination with a FITC-conjugated secondary antibody and the cell surface expression of CK8 was then determined in a FACScalibur flow cytometer.
  • CK8 A weak but constant expression of CK8 was always detectable on the surface of living and non-permeabilized GHD-1 cells.
  • the amount of membrane-standing CK8 represented a smaller fraction compared to cytoplasmic CK8, as was detectable in permeabilized cells (FIG. 3a).
  • the human embryonic renal epithelial cell line HEK293 transformed by the adenoviral oncogenes E1A and E1B used as a control, whereby no CK8 could be detected on the surface of HEK293 cells.
  • E-FABP epidermal fatty acid binding protein
  • CK8 staining pattern of the FaDu and PCI-1 carcinoma cell lines was determined by immunohistochemistry and immunofluorescence by non-permeabilizing Cells were stained with a CK8-specific antibody. This resulted in punctiform staining patterns with high local concentrations of CK8 on the plasma membranes (FIG. 4). An overlapping staining pattern was observed in double-staining experiments with an antibody against the membrane-bound pan-carcinoma antigen EpCAM, which additionally confirms the membrane localization of CK8 (data not shown).
  • Membrane-bound CK8 could not be detected on EpCAM-negative cells that were present in these biopsies. Dead cells were defined based on the uptake of PI and showed a strong and heterogeneous CK8 staining pattern, which probably reflects a cytoplasmic staining of CK8 in dead cells, as was also observed in permeabilized cell lines. In summary, the results presented allow the conclusion that CK8 in squamous cell carcinoma experiences ectopic expression on the cell surface, whereas such expression is not observed in normal cells.
  • CK8 for Breast carcinoma cells report where it serves as a membrane receptor for plasminogen and its activator (tissue type plasminogen activator, tPA) (Hembrough, 1996; Cell-surface cytokeratin 8 is the major plasminogen receptor on breast cancer cells and is required for the accelerated activation of cell -associated plasminogen by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem 271 (41), 25684-91 and Hembrough et. al., 1995 A cytokeratin 8-like protein with plasminogen-binding activity is present on the external surfaces of hepatocytes, HepG2 cells and breast carcinoma cell lines. J Cell Sei 108 (3), 1071-82).
  • CK8 is believed to mediate the creation of a "protease system" on the membrane that tumor cells could use to invade and remodel the surrounding tissue.
  • Table 1 Estimated molecular weights and isoelectric points of proteins isolated from ten protein spots that were reproducibly performed on AMIDA screenings with material from patient GHD-1.
  • B.b. Borrelia burgdorferi
  • B.b.w d transmitted by tick bite (Ixodes ricinus) and, in the case of a lack of or inadequate treatment, can cause persistent and chronic arthritis (Lyme arthritis).
  • chronic heart and brain infections can occur, which result in carditis or encephallitis (Steere, 1997; Steere, 2001).
  • Lyme disease could be studied using mouse models.
  • H2 haplotype of the main histocompatibility complex of mice
  • H2 susceptibility to a Borrelia infection
  • the immune response against Bb and the molecular basis for susceptibility are not fully understood.
  • the response of the helper (CD4 +) T cells is a decisive factor in the pathogenesis of Lyme Arthritis (LA): the activation of a Thl response, which is characterized by the formation of piO-inflammatory cytokines such as IFN-gamma, leads to the induction of LA.
  • LA Lyme Arthritis
  • the activation of type 2 helper T cells, and thus the formation of IL4 has a protective effect in the pathogenesis of LA (Keane- Myers and Nickell, 1995a; Keane-Myers and Nickeil, 1995b; Matyniak et al., 1995).
  • JJ 4 is an essential cytokine for the activation and maturation of B cells, so that the induction of a humoral response to Bb was suspected and could also be confirmed experimentally. Only a few of the reactivities against Bb in mice are characterized, like the two membrane proteins Osp C and Ospl7 (Pohl-Koppe et al., 2001), although protective antibodies are formed (McKisic and Barthold, 2000).
  • AMIDA technology was used to investigate the humoral response in resistant BALB / c mice before and after Bb infection.
  • Living borrelia (3xl0 8 ) were taken up in lysis buffer (PBS, 1% Triton X-100) and insoluble components were pelleted by centrifugation.
  • lysis buffer PBS, 1% Triton X-100
  • BALB / c mice were infected once with lxlO 8 Bb and serum was obtained three weeks after infection.
  • Serum antibodies from infected mice were covalently coupled to Sepharose Protein A beads and used for immunoprecipitation of Bb lysates (200 ⁇ l serum + 50 ⁇ l Sepharose Protein A).
  • Antigen-antibody complexes were then separated in a two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) (Amersham IPG strips pH 3-10L; SDS-PAGE 13%) and visualized in the silver color (see FIG. 6). Immunoprecipitated proteins were cut from the 2D-PAGE, treated with trypsin and analyzed in a MALDI-ToF mass spectrometry. Proteins that were nonspecifically bound to the Sepharose Protein A beads were visualized in a control gel and were not taken into account in the selection.
  • 2D-PAGE two-dimensional gel electrophoresis
  • AMIDA Identification of antigens of a permanent human carcinoma cell line with the help of serum antibodies by AMIDA:
  • markers for the detection and diagnosis of diseases Various conditions must be placed on such a "biomarker", such as frequency and specificity. This means that the marker (for example cytokeratin-8-specific antibodies in tumor diseases) should be present in as many tumor patients as possible, but at the same time in as few healthy control persons.
  • the marker for example cytokeratin-8-specific antibodies in tumor diseases
  • a lysate in PBS, 1% Triton X-100 was prepared from 1 ⁇ 10 7 cells of a permanent human carcinoma cell line (FaDu, ATCC No. HTB-43) and the insoluble cell components were pelleted by centrifugation.
  • Serum antibodies of a tumor patient were meanwhile covalently coupled to Sepharose Protein A beads and used for the immunoprecipitation of FaDu-Ly seeds (200 ⁇ l serum + 50 ⁇ l Sepharose Protein A).
  • Antigen-antibody complexes were then separated in a two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) (Amersham IPG strips pH 3-10; SDS-PAGE 13%) and visualized by silver staining (see Fig. 1).
  • Immunoprecipitated proteins were cut from the 2D-PAGE, treated with trypsin and analyzed in a MALDI-ToF mass spectrometry. Proteins that were nonspecifically bound to the Sepharose Protein A beads were visualized in a control gel and were not taken into account in the selection. In this way, antibodies could be detected in the patient's serum, which recognize E ⁇ xDw antigens and which are therefore also suitable for the isolation and identification of allogeneic antigens by AMIDA.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung von Antigenen, die mit Krankheiten assoziiert sind, bei denen es zur Ausbildung einer humoralen Immunantwort und damit zur Bildung spezifischer Antikörper kommt. Das Verfahren basiert auf der durch autologe, allogene oder xenogene Antikörper vermittelten Präzipitation von Antigenen aus Zelllysaten oder Bakterien-, Parasiten- und/oder Virenpräparaten mit autologen, allogenen und/oder xenogenen Seren, Aszites oder Pleuralflüssigkeiten.

Description

Identifizierung von Antigenen durch xenogene, allogene oder autologe Antikörper-vermittelte Präzipitation
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren (hier AMIDA genannt, für antibody- mediated Identification of antigens) zur Identifizierung von Antigenen, die mit Krankheiten assoziiert sind, bei denen es zur Ausbildung einer humoralen Immunantwort und damit zur Bildung spezifischer Antikörper kommt. Dieses Verfahren basiert auf der durch autologe, allogene oder xenogene Antikörper vermittelten Präzipitation von Antigenen aus Zelllysaten oder Bakterien-, Parasiten- und/oder Nirenpräparaten mit autologen, allogenen und/oder xenogenen Seren, Aszites oder Pleuralflüssigkeiten. Die Induktion einer Immunantwort, die einher geht mit der Produktion von Antikörpern, ist somit die einzige Grundvoraussetzung für die Anwendung von AMIDA. Das Verfahren eignet sich somit insbesondere zur Identifizierung von Tumorantigenen, aber auch für solche Antigene, die mit Autoimmunkι-ankheiten oder bakteriellen, viralen und parasitären Infektionen assoziiert sind.
Unter dem Begriff „Antigene", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, sind Strukturen zu verstehen, gegen die ein Organismus Antikörper bildet, da sie seinem Immunsystem fremd sind. Die Kenntnis von möglichst spezifischen Antigenen ist eine wichtige Voraussetzung für die Diagnose und die Immuntherapie von Tumorpatienten und Personen, die z.B. an einer Autoimmunkrankheit oder einer chronischen Infektion leiden Derartige Antigene, die für die jeweilige Krankheit mehr oder minder spezifisch sind, ermöglichen den Nachweis und das Targeting in vivo und in vitro von Tumorzellen, von Zellen, die Ziel einer Autoimmunreaktion sind, sowie auch von infizierten Zellen und infektiösen Organismen. In der vorliegenden Anmeldung wird ein Verfahren zur Isolierung und Identifizierung von Antigenen, die Ziele einer humoralen Immunantwort sind, beschrieben.
Das Targeting von Zellen in vivo und in vitro mit immunologischen Werkzeugen wie T-Zel- len und Antikörpern ist sehr stark von der Kenntnis von möglichst spezifischen Proteinen auf Zielzellen abhängig. Seit einigen Jahren werden folglich umfassende Bemühungen unternommen, um spezifische Antigene — beispielsweise tumorspezifische Antigene - zu identifizieren und zu charakterisieren. Dies geschah und geschieht vorzugsweise über die Analyse des Repertoires an spezifischen T-Zellen (^zelluläre Immunantwort). Die Rolle und die Qualität der humoralen Immunreaktion gegenüber z.B. Tumoren steht dem gegenüber noch am Anfang seiner Erforschung. Diese basiert weitestgehend auf neueren Techniken, die das molekulare Klonieren solcher Tumorantigene ermöglichen, die Targets für eine humorale Antwort sind, also gegen die Antikörper gebildet wurden.
Die Existenz von tumorspezifischen Antikörpern bei Krebspatienten ist für bekannte Antigene wie p53 und HER-2/neu ausführlich beschrieben worden. Die Isolierung neuer Antigene unter Verwendung von autologen oder allogenen Antikörpern hat sich in erster Linie durch Anwendung der SEREX-Technologie (Serological analysis of recombinant cDNA expressi- on libraries; veröffentlicht in: "Human neoplasms elicit mutliple specific immune, responses in the autologous host" Ugur Sahin et al, PNAS Vol 92 pp 11810-11813 Dec. 1995) ergeben. Pfreundschuh und Kollegen demonstrierten damit indirekt, dass Tumore die Aktivierung von CD4+ -T-Zellen auslösen, was wiederum die Aktivierung von Antigen-spezifischen B- Zellen und die Produktion von Antikörpern nach sich zieht. Tumor-spezifische Antikörper sind adäquate Werkzeuge zur Isolierung der von ihnen erkannten Antigene. Bekannte Antigene wie MAGE-1 und Tyrosinase wurden durch SEREX kloniert. Zusätzlich konnten völlig neue Antigene identifiziert werden, wobei das bekannteste NY-ESO-1 ist, dessen Expression in gesundem Gewebe auf Testes und Ovar beschränkt ist, das jedoch bei einer Vielzahl von Krebserkrankungen, wie beispielsweise dem Melanom, aber auch auf Brust-, Blasen-, Prostata- und Leberzeil-Karzinomen, exprirniert wird.
Die SEREX-Technologie umfasst die folgenden Schritte:
1. Erstellen einer cDNA - Bank aus einer Tumorbiopsie und Klonierung in einen λ- ZAP-Vektor;
2. Infektion von geeigneten E.coli - Bakterien und Expression der klonierten cDNAs in diesen Bakterien;
3. Übertragen der rekombinanten E. coli - B akterien auf Nitrozellulos e-Membranen und Screenen der Kolonien mit autologen Seren; 4. Nachweis von gebundenen Antikörpern mit einem anti-IgG-Antikörper;
5. Amplifizierung entsprechender Kolonien, Isolierung der darin enthaltenen Plasmide;
6. Sequenzierung und dadurch Identifizierung der darin enthaltenen cDNA.
Die Hauptnachteile des SEREX- Verfahrens bestehen darin, dass es sehr zeitaufwändig und technisch-methodisch kompliziert ist. Der Bearbeitungszeitraum für eine einzige Tumorbi- opsie kann somit leicht bis zu sechs Monate betragen. Ein weiteres Problem von SEREX stellt die heterologe Expression der aus den Tumorbiopsien gewonnenen cDNAs in E.coli dar: Da posttranslationale Modifikationen wie Glykosilierungen, die für die Erkennung von Antigenen durch Antikörper essentiell sein können, in Bakterien nicht oder unterschiedlich ablaufen, ist die Erkennung von Antigenen durchaus nicht gewährleistet. Daneben stellen natürlich auch die verschiedenen Schritte der reversen Transkription, Klonierung und Transkription potentielle Fehlerquellen dar, so dass SEREX insgesamt eine Technologie darstellt, die ein gewisses Potential besitzt, dabei aber fehleranfällig und zeitaufwändig ist.
Es ist folglich die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und vereinfachtes Verfahren zur Isolierung bzw. Identifizierung von Antigenen bereitzustellen, das direkt, einfach und in vergleichsweise sehr kurzer Zeit durchführbar ist.
Diese Aufgabe wird durch die im Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine effektive Methode zur Isolierung und Identifizierung von Antigenen und arbeitet mit einem speziesspezifischen, xenogenen oder autologen System durch Verwendung von Antikörpern aus Serum, Aszites und/oder Pleuralflüssigkeit. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind vielfältig: Zuerst beruht das System nicht auf der Fremdexpression von cDNAs in bakteriellen oder eukaryotischen Empfängerzellen, sondern ermöglicht vielmehr ein unmittelbares Screening im nativen Kontext, das heißt in Tumorzellen, in erkrankten Geweben oder in Bakterien, Viren oder Parasiten selbst. Dies ist von spezieller Bedeutung, da die ektopische Expression von Antigenen in unverwandten eukaryotischen Empfängerzellen oder Bakterien die tatsächliche Situation in den Spenderzellen (z.B. Zellen eines Primärtumors) nicht adäquat nachahmt. So können sich posttranslationale Modifikationen, wie Glykosilierung, in Abhängigkeit vom Expressions- System unterscheiden und kommen bei Bakterien überhaupt nicht vor. Gfykosilierungen können für die Erkennung von Antigenen aber essentiell sein.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren als high-throughput und semi-automati- sierte Technik etabliert werden, was die Untersuchung von Materialien aus mehreren Patienten parallel ermöglicht. Das Verfahren ist schnell, und es ist realistisch, ein Tumor- assoziiertes Protein innerhalb eines vergleichsweise sehr kurzen Zeitraums von ca. 1-2 Wochen zu isolieren und vollständig zu identifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist bei der Untersuchung einer Vielzahl von Antigenen geeignet: In erster Linie von Tumorantigenen, jedoch weiterhin auch von Antigenen, die mit Autoimmunkrankheiten, sowie bakteriellen, parasitären oder viralen Infektionen assoziiert sind.
Neben der Identifizierung von Tumor-assoziierten Antigenen, eignet sich die Technik auch beispielsweise zur Untersuchung von Antigenen, die an Autoimmunerkrankungeri beteiligt sind. Auch hier sind die Proteine und Strukturen, die Ziel der Autoimmunreaktion sind, oftmals nicht bekannt. In den meisten Fällen konnte zwar die Erkennung bestimmter Autoariti- gene durch spezifische T-Zellen demonstriert werden, die Rolle von B-Zellen und Antikörpern ist bei derartigen Erkrankungen in den meisten Fällen aber nach wie vor unbekannt. Somit kann die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auch bei Autoimmunerkrankungen tiefere Einsichten in einige Krankheitsbilder ermöglichen.
Es ist daher auch möglich, das erfindungs gemäße Verfahren bei chronischen Krankheiten, die durch ein bekanntes pathogenes Agenz verursacht werden, anzuwenden. Dabei kann Gewebe eines erkrankten Patienten, aber auch ein Tiermodell mit unterschiedlichen Mausstämmen angewendet werden. Mausstämme, die gegenüber einer speziellen bakteriellen Infektion resistent bzw. nicht-resistent sind, dienen dabei der Charakterisierung der humoralen Reaktion, die für den Schutz vor dem Pathogen bei dem resistenten Mausstamm verantwortlich ist. Die Anwendung von humanem Gewebe erlaubt die Überprüfung der aus den Tiermodellen gewonnenen Ergebnis se/Antigene und damit die Identifikation von therapeutisch interessanten Antigenen. Auch die Infektion mit verschiedenen Parasiten (z.B. Plasmodien) oder Viren (z.B. die Familie der Herpesviren) führt zu einer Immunreaktion, in deren Ver- lauf es zur Bildung spezifischer Antiköφer kommt. Auch bei solchen Erkrankungen kann somit das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden, um neue Antigene zu identifizieren und somit die Therapie zu verbessern.
Einmal isoliert und charakterisiert, können Tumorantigene, Autoantigene und immunogene bakterielle, parasitäre oder virale Proteine vielfach verwendet werden: (i) Dendritische Zellen oder B-Zellen können damit beladen und so zur Aktivierung spezifischer T-Zellen verwendet werden, (ii) Es lassen sich monoklonale und bispezifische Antiköφer herstellen, die für die Diagnose einer Erkrankung und die Therapie von Patienten von großem Nutzen sind. Das erfindungs gemäße Verfahren stellt somit ein neues und viel versprechendes Werkzeug zur Untersuchung der humoralen Reaktion von Patienten bei einer Vielzahl von Erkrankungen dar und kann zur Entwicklung neuer Therapien dieser Erkrankungen einen entscheidenden Beitrag leisten.
Das erfindungs gemäße Verfahren zum Auffinden von Antigenen umfasst die folgenden Schritte:
Zunächst wird von einem Spender ein Biopsat des Gewebes von Interesse gewonnen und daraus ein Proteinlysat hergestellt; werden Kulturen von Bakterien, Parasiten oder Viren verwendet, so werden diese ebenfalls lysiert. Das Proteinlysat wird dann mit allogenem, xe- nogenem und/oder autologem Serum, Aszites und/oder Pleuralflüssigkeit inkubiert, die jeweils Antiköφer enthalten, die auf eine humorale Immunantwort oder eine Autoimmunantwort auf die Antigene gebildet wurden, um eine spezifische Bindung der Antiköφer an die von ihnen erkannten Antigene im Proteinlysat zu erzielen. Danach erfolgt ein Abtrennen der Antigen-Antiköφer-Komplexe sowie die Identifizierung der spezifisch an die Antiköφer gebundenen Antigene durch geeignete Methoden.
Unter dem Begriff Antigen, wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, wird jede Substanz oder Struktur verstanden, mit der Antiköiper spezifisch reagieren können. Im vorliegenden Zusammenhang wird unter Antigen insbesondere eine Substanz oder Struktur verstanden, nach deren Erkennen der Wirbeltierorganismus mit einer Immunantwort reagiert. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet Antigen insbesondere ein Tumoranti- gen bzw. ein Zielantigen der humoralen Immunantwoit, das mit Autoimmunki-ankheiten und Infektionen - sowohl bakteriellen als auch viralen oder parasitären - assoziiert ist.
Der Begriff „autolog" bedeutet, dass der Spender des zu untersuchenden Zellmaterials und der Spender des Antiköφer-enthaltenden Serums identisch sind.
Der Begriff „allogen" bedeutet, dass der Spender des zu untersuchenden Zellmaterials und der Spender des Antiköφer-enthaltenden Serums nicht identisch, sondern genetisch diffe- rentiell sind, beide jedoch derselben Spezies angehören.
Der Begriff „xenogen" bedeutet, dass der Spender des zu untersuchenden Zellmaterials und der Spender des Antiköφer-enthaltenden Serums nicht identisch sind und nicht derselben Spezies angehören.
Obwohl es sich bei dem autologen System um das in der vorliegenden Erfindung bevorzugte System handelt, können auch allogene oder xenogene Antiköφer enthaltende Seren, Aszites und/oder Pleuralflüssigkeit eingesetzt werden. Viele Antigene, insbesondere Tumormarker, die Spezies-spezifisch auftreten, können auf diese Weise identifiziert werden, ohne unab- dinglich auf autologes Spenderserum angewiesen zu sein. Eine xenogene Anwendung dieses Verfahrens stellt beispielsweise die Inkubation eines Bakterien- oder Virenlysats mit Seren infizierter Wirts Organismen dar.
Unter dem Begriff Serum ist die flüssige Phase von gewonnenem Blut zu verstehen, die lösliche Antiköφer und andere lösliche Serumproteine enthält.
Als Spender wird im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Individuum verstanden, bei dem durch das erfindungsgemäße Verfahren Antigene mittels in xenogenen, allogenen oder autologen Seren, Aszites oder Pleuralflüssigkeit enthaltenen Antiköiper aufgefunden werden sollen. Hierunter sind in erster Linie Säugetiere und Menschen, aber auch infektiöse Organismen, Mikroorganismen oder Zelllinien zu verstehen.
Unter Autoimmunkrankheiten werden Autoaggressionskrankheiten verstanden, bei denen im Laufe einer Immunantwort T-Zellen und Antiköφer gebildet werden, die gegen köφereige- ne Substanzen (Autoantigene) gerichtet sind. Beispiele für Autoimmunkrankheiten sind z.B. Hashimoto-Tyreoiditis, Perniziöse Anämie, chronische Gastritis, Addis on-Krankheit, Systemischer Lupus erythematodes, Multiple Sklerose, und viele andere. Bei diesen, wie auch den vorgenannten bakteriellen, parasitären und viralen Infektionen, wird das erfindungsgemäße Verfahren dann angewendet, wenn die Zielantigene der humoralen Antwort nicht ausreichend bekannt und erforscht sind.
Gemäß einer Ausführungsform werden im Schritt des Inkubierens des Proteinlysats mit Antiköφer enthaltendem autologem, allogenem oder xenogenem Serum, Aszites oder Pleuralflüssigkeit zusätzlich Antiköφer zugegeben, die gegen Immunglobuline des Spenders, beispielsweise der Subklasse IgG, gerichtet sind. Diese zusätzlich zugegebenen Antiköφer sind an ein Trägermaterial gekoppelt und dienen so als Brücke zwischen diesem Trägermate- rial (beispielsweise Sepharose) und den im Serum enthaltenen Antiköipern. Damit kann (falls gewollt) eine gewünschte Antiköφersubklasse spezifisch an das Trägermaterial gebunden werden. Durch diesen Schritt wird eine weitere Spezifität in diese Technologie eingeführt.
Ein Proteinlysat gemäß der vorliegenden Erfindung kann wie folgt hergestellt werden: Zellen werden mittels Detergenzien (beispielsweise Triton-XIOO oder NP40) lysiert, d.h. die Zellmembranen werden vollständig aufgeschlossen. Anschließend werden die unlöslichen Zellbestandteile abzentrifugiert, während sich viele Proteine in Lösung befinden.
Gemäß einer weiteren Ausführungs form wird das Proteinlysat vor dem Inkubationsschritt fraktioniert. Diese Fraktionierung kann beispielsweise eine Auftrennung in Membrananteile und Zytoplasmaanteile umfassen. Für die weitere Durchführung des Verfahrens sind dann beide Fraktionen getrennt einsetzbar. Fraktionierungen ermöglichen eine weitere Spezifizierung der isolierten Antigene und eine vereinfachte technische Durchführung, da weniger Antigene aufzutrennen sind. Zum selben Zweck können Fraktionierungen auch dazu verwendet werden, um einzelne zelluläre Kompartimente anzureichern. Alternativ zur Zentrifu- gation kann eine Fraktionierung nach Proteingröße auch mittels Ausschlußsäulen erfolgen.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Antiköφer sind vorzugsweise an ein Trägermaterial gebunden. Dies gilt sowohl für die im Inkubationsschritt eingesetzten, im autologen/allogenen/ xenogenen Serum, Aszites oder Pleuralflüssigkeit enthaltenen Antiköφer, als auch für die gegebenenfalls zusätzlich eingesetzten Antiköφer, die gegen Immunglobuline des Spenders gerichtet sind. Die Bindung an ein Trägermaterial ermöglicht die spätere Abtrennung der Antigen- Antiköφer-Komplexe über Zentrifiigation, wenn etwa Sepharose-Perlen mit den Antiköipern beschichtet sind und aufgrund ihrer Dichte nach unten sinken. Als Trägermaterialien sind Sepharose, Sepharose Protein A, Sepharose Protein G, Agarose Protein A, oder Agarose Protein G einsetzbar.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Proteinlysat mit dem Trägermaterial vorinkubiert. Dadurch können solche Proteine aus dem Lysat entfernt werden, die unspezifisch an das Trägermaterial binden und im Folgenden die Analyse erschweren würden.
Gemäß eines weiteren Aspektes der vorliegenden Erfindung sind die Antiköiper kovalent an das Trägermaterial gebunden. Eine kovalente Bindung erfolgt im Allgemeinen durch Amid- bindungen zwischen Amino- und Carboxylgruppen der Proteine oder durch die Bildung von Disulfidbrücken aus jeweils zwei SH-Gruppen. Als Reagenzien finden hier beispielsweise Difluordinirrobenzol, Bromcyan, Formaldehyd, Glutaraldehyd, Hydroxysuccinimidester und Imidate Anwendung. Als Imidat wird vorzugsweise Dimethylpimelimidat eingesetzt. Angaben zur kovalenten Bindung von Antiköφern an eine Matrix mittels Dimethylpimelimidat sind zu finden in: A one step purißcation ofmembraneproteins using a high efficiency im- munomatrix. The Journal of Biological Chemistiy, Bd. 257, Nr. 18, Ausgabe vom 25.9.1982, S. 10766-69. Bezüglich weiterer Angaben zur Bindung mit Hilfe von Bromcyan wird auf: Bioanalytik, F.Lottspeich undH. Zorbas. Spektrum Lehrbuch, veiwiesen.
Wie bereits oben angesprochen, kann die Abtrennung der Antigen-Antiköφer-Komplexe im Falle der Bindung der Antiköφer an ein Trägermaterial mittels Zentrifugation erfolgen. Eine Abtrennung der Antiköφer-Antigen-Komplexe, die sich bei der Inkubation von Lysaten mit Serum ausbilden, kann alternativ auch über Protein A- bzw. Protein G-beschichtete Säulen erfolgen. Allgemeine Angaben zur Immunpräzipitation sind in der oben genannten Veröffentlichung (Journal of Biological Chemistry) sowie in Purißcation of anti-thyroglobulin IgGfrom human serum. Clin. Chem. Lab. Med. 2000 Jul. 38 (7), S. 597 - 602, zu finden. Der letzte Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens, der Nachweis der mit den Antiköφem spezifisch gebundenen Antigene, umfasst vorzugsweise das Auftrennen der abgetrennten Komplexe durch elektrophoretische Methoden. Vorzugsweise findet hier eine zweidimensi- onale Elektrophorese Anwendung. Dabei werden die Proteine zunächst nach ihrem isoelektrischen Punkt in einem immobilisierten pH-Gradienten und anschließend nach ihrer Größe in einem konventionellen SDS-PAGE aufgetrennt (Görg A, Obermaier C, Boguth G, Härder A, Scheibe B, Wildgruber R, Weiss W. "The current State of two-dimensional e- lectrophoresis with immobilized pH gradients." Electrophoresis 2000 Apr;21(6): 1037-53).
Unter Elektrophorese wird im vorliegenden Zusammenhang der Transport geladener Teilchen unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes als eine Funktion ihrer Form, Größe und Ladung, sowie von Temperatur, Viskosität und Feldstärke verstanden. Als Träger für die Elektrophorese kommen bevorzugt Gele, wie Polyacrylamid zum Einsatz.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Proteine nach der elektro- phoretischen Auftrennung mit Farbstoffen wie beispielsweise Coomassie-Blau, Silber, Pon- ceau-Rot oder mit fluoreszierenden oder lumineszierenden Reagenzien behandelt.
Weiterhin ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung die interessierenden Proteine, beispielsweise Protein-Spots oder -Banden, ausgeschnitten, einem Protease- Verdau (bspw. Trypsin) unterzogen und mittels Massenspektrometrie analysiert werden. Die interessierenden Proteine können ebenfalls ausgeschnitten werden, einem Protease- Verdau unterzogen und beispielsweise durch klassische Verfahren wie den Edman-Abbau sequenziert werden.
Die Massenspektrometrie erfolgt beispielsweise mittels MALDI-ToF-Spektrometer (Matrix Assisted Laser Disoφtion Ionisation/Time of Flight), wobei aber u.a. auch ESI (Electrospray Ionisation, auch als nanoscale ESI), EI (Elektronenstoß-Ionisation , Quadrupol), CI (chemische Ionisation) und FAB (fast atom bombardment) verwendet werden können.
Alternativ können Proteine radioaktiv markiert werden, wie dies durch die Zugabe von 35S- Methionin oder 32P-γATP bereits vor der Lyse oder durch eine nachträgliche Jodierung von Proteinen geschieht. Dadurch sind diese Proteine markiert und können nach elektrophoreti- scher Auftrennung mit Hilfe eines Röntgenfilmes oder eines anderen geeigneten Verfahrens visualisiert werden.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung werden die Proteine nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulose- oder eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membrane übertragen. Diese Proteine werden dann durch Färbung detektiert und anschließend von der Membran isoliert.
Vorzugsweise werden die durch dieses Verfahren identifizierten spezifischen Antigene mit geeignete Kontrollen verglichen: Solche Kontrollen sind insbesondere Lysate aus gesundem Zellmaterial desselben Spenders und/oder die Analyse des Serums selbst. Diese Probe ist zusätzlich zur Erfassung von Semmproteinen interessant, die spezifisch bei Tumoφatienten im Serum vorhanden sind.
Als Spender des Materials zur Herstellung von Protein-haltigen Lysaten kommen Säugetiere, . insbesondere Mensch, Primat und Nagetiere, aber auch infektiöse Organismen wie Parasiten, Bakterien und Viren in Frage. Als Spender von autologen/allogenen/xenogenen Seren, Aszites oder Pleuralfiüssigkeiten kommen Säugetiere, insbesondere Menschen, Primaten und Nagetiere, wie etwa Maus, Ratte, Hamster oder Kaninchen zum Einsatz.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Zeichnungen sowie die Beispiele näher beschrieben. Es versteht sich, dass diese nur zu Veranschaulichungszwecken vorgesehen sind und der Gegenstand der Erfindung nicht auf die hier dargestellten Aspekte beschränkt ist.
In den Abbildungen zeigen:
Figur 1: Eine durchflußzytometrische Analyse (=FACS-Analyse) der humoralen Reaktion eines Karzinom-Patienten (GHD-1) nach der adjuvanten Immuntherapie mit einem bispezifischen Antiköiper (BiUTl). GHD-1 Lymphozyten (A), Monozyten (B) und Tumorzellen (C) wurden mit den autologen Seren vor oder nach BiUH-Therapie inkubiert. Gebundene Antiköφer wurden unter Verwendung eines menschlichen IgG3-spezifischen sekundären PE- konjugierten Antiköφers nachgewiesen. Die BiUII-Therapie hatte eine starke Induktion von Antiköφern zur Folge, die spezifisch an GHD-1 Tumorzellen, nicht aber an Lymphozyten und Monozyten banden. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment von dreien.
Figur 2: Ein Schema der AMIDA Screening Technologie.
Figur 3: Eine FACS-Analyse der CK8-Expression von Karzinomzelllinien. A.) GHD-1 Tumorzellen wurden entweder unbehandelt (also nicht- permeabilisiert) oder permeabilisiert mit dem CK8 spezifischen Antiköφer 1E8 in Kombination mit einem FITC-markierten sekundären Antiköφer gefärbt. B.) Die angezeigten nicht-peimeabilisierten Zelllinien wurden mit dem CK8 spezifischen Antiköφer 1E8 in Kombination mit einem FITC-konjugierten sekundären Antiköφer gefärbt. Bei allen Experimenten wurden tote Zellen gemäß ihrer Pro- pidiumjodidaufnahme abgegrenzt und von der Analyse ausgeschlossen (außer 3A, permea- bilisierte Zellen). Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment von dreien.
Figur 4: Eine Immunfärbung von CK8 auf Karzinomzelllinien. A.) Zytospins der Karzinomzelllinien FaDu und PCI-1 wurden mit einem CK8 spezifischen Antiköφer in Kombination mit einem Peroxidase-konjugierten Sekundärantiköφer angefärbt. B.) gleich A.), außer dass ein FITC-konjugierter sekundärer Antiköφer veiwendet wurde (grün). Zusätzlich wurde die zelluläre DNA mit Hilfe des interkalierenden Farbstoffes Bis-Benzamidin angefärbt (blau). Ein repräsentatives Experiment von dreien ist dargestellt.
Figur 5: Eine FACS-Analyse der CK8 Expression auf primären Karzinomzellen. A.) Einzelzellsuspensionen von Karzinombiopsien des Kopfes-Hals-Bereiches wurden erzeugt und mit CK8- oder EpCAM-spezifischen Antiköφem in Kombination mit einem sekundären FITC-konjugierten Antiköφer gefärbt. Die Zellen wurden gemäß ihrer Propidiumjodidauf- nahme abgegrenzt (obere Histogramme). Lebende, Pl-negative Zellen waren positiv für Ep- CAM und CK8 (mittlere Histogramme). Tote Zellen (PI positiv) waren EpCAM-negativ, exprimierten aber CK8 in hoher und heterogener Menge (untere Histogramme). Dargestellt sind die repräsentativen Ergebnisse eines von sechs Patienten. B.) Dargestellt sind die durchschnittlichen CK8 -Fluoreszenzen (mean fluorescence intensity) von sechs Zellsuspensionen, die aus Primärtumoren erzeugt wurden, zusammen mit der durchschnittlichen Kontrollfluoreszenz. Figur 6: Zwei-dimensionale Gelelektrophorese von Antigen-Antiköiper-Komplexen von Borrelia burgdorferi (B.b.) -Antigenen und Serumantiköφern von/i.b. infizierten BALB/c Mäusen. Lebende Borrelien wurden in Lysispuffer aufgenommen und unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation pelletiert. Parallel wurden BALB/c Mäuse einmalig mit B.b. infiziert und Serum drei Wochen nach Infektion gewonnen. Serum-Antiköφer von infizierten Mäusen wurden kovalent auf Sepharose Protein A Kügelchen gekoppelt und zur Immunprä- zipitation von B.b. Lysaten verwendet. Antigen-Antiköφer Komplexe wurden anschließend in einer zwei-dimensionalen Gelelektrophorese (2D-PAGE) aufgetrennt (Amersham IPG strips pH 3-10L; SDS-PAGE 13%) und in der Silberfärbung visualisiert.
Beispiele:
I. Anwendung von AMIDA im autologen System
Zelllinien, primäre Tumorzellen, Durchflußzytometrie
Die GHD-1 Zelllinie wurde aus einer Tumorbiopsie eines Hypopharynx-Karzinoms erzeugt und in Standard-Zellkultumiedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Kalbserum) kultiviert. Einzelzell-Suspensionen aus primären Karzinom-Biopsien des Kopf-Hals-Bereiches wurden wie folgt gewonnen: Die Biopsien wurden zerkleinert und für 2 Stunden bei 37°C auf einem Taumelmischer in DMEM inkubiert, das Kollagenase (2mg/ml; Typ 8 Sigma) und DNAse I (0,2mg/ml; Typ TV, Sigma) enthielt. Danach wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen und in mit 3% fötalem Kalbsserum ergänztem PBS für die nachfolgende Immunfärbung und Durchflußzytometrie-Analyse resuspendiert. Nicht-permeabilisierte Zellen (5x105 pro Probe) wurden mit dem menschlichen CK8-spezifϊschen Antiköφer 1E8 (Hiss Diagnostics, Deutschland) zwei Stunden lang auf Eis inkubiert, in PBS, das 3% fötales Kalbsserum enthielt, gewaschen und mit FITC-markiertem sekundärem Antiköφer (1 Stunde, auf Eis) gefärbt. Die Analyse wurde unter Verwendung eines FACScalibur-Gerätes durchgeführt (Becton Dickinson, Deutschland). Alternativ wurden die Zellen fixiert (l%o Paraformalde- hyd, 10 Minuten) und permeabilisiert (Triton 0,2%, 20 Minuten), bevor sie gefärbt wurden. Bei allen Experimenten wurden die Zellen mit Propidiumiodid gefärbt um vitalen/intakte und permeabilisierte Zellen eingegrenzen.
Immunpräzipitation, 2D-Gelelektrophorese und Massen-Spektrometrie.
Biopsien von primären Karzinomen wurden zerkleinert und unter Verwendung eines lOOμm Zeil-Filters (Falcon) homogenisiert. Die Zellen wurden einmal in PBS gewaschen. Primärtumor-Zellen oder GHD-1 Zellen (lxlO7 Zellen) wurden in hypotonem Puffer, der lOmM HEPES (pH7,9), lOmM KC1, l,5mM MgCl2, 0,lmM EGTA und 0,5mM DTT enthielt, für 30 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann mit einer 25G Kanüle mechanisch zerkleinert und die Teilchenfraktion abzentrifugiert (3000g; 4°C). Der die zytoplasmatische Fraktion repräsentierende Überstand wurde mit 1% Triton und Protease-Inhibitoren versetzt und das Pellet (Membranfraktion) in einem dreifachen Volumen PBS resuspendiert, das 1% Triton und Protease-Inhibitoren enthielt. Die Immunpräzipitation wurde mit Sepharose-Perlen, die mit einem anti-humanen IgG3 -Antiköφer (nur im Falle von GHD-1 Lysaten) vorbeschichtet waren und Patientenseren (über Nacht, 4°C, Taumelmischer) durchgeführt. Danach wurden die Perlen umfassend in 50mM Tris-Puffer gewaschen, in 2D-Lysepuffer resuspeήdiert (1 IM Urea, 4% CHAPS, 1% DTT, 2,5mM EDTA und 2,5mM EGTA) und bei 42000g zentrifugiert (1 Stunde, 4°C). Die Proteine im Überstand wurden durch isoelektrische Fokussierang und Verwendung von immobilisierten pH-Gradienten pH 3-10 oder 4-7 (ff G- Streifen, Amersham) getrennt und gemäß ihrem Molekulargewicht in einem 12,5 - 13% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Coomassie- oder Silber- Färbung visualisiert, die Proteine wurden isoliert, mit Trypsin verdaut (2,5ng/μl; Promega) und in einem MALDI-ToF Massenspektrometer (Bruker) analysiert. Die entsprechenden Proteine wurde unter Veiwendung der Mascot Science-Datenbank identifiziert.
Isolierung und Identifizierung von Tumorantigenen in primären Karzinomzellen durch autologes Serum
Die vorliegende Erfindung stellt ein System dar, das zur Isolierung und Identifizierung von Antigenen entwickelt wurde, die beispielsweise in primären Tumorzellen exprimiert werden, und die Ziele für eine humorale Immunreaktion sind. Um diese Identifizierung durchzuführen, wurde zunächst eine Einzelzellsuspension aus einer Biopsie eines primären Hypo- pharynx-Karzinoms erzeugt. Danach wurden die Zellen lysiert und die Proteine gewonnen (s.o.). Die Lysate wurden für 3h mit Sepharose Protein A-Perlen inkubiert, um unspezifisch bindende Proteine aus demLysat zu entfernen. Autologe Serum- Antiköφer wurden auf Sepharose Protein A-Perlen geschichtet und für die Immunpräzipitation (IP) der Tumoφro- tein-Lysate verwendet. Die immunpräzipitierten Proteine wurden in einer zweidimensiona- len Gelelektrophorese (2D-PAGE) gemäß ihrem isoelektrischen Punkt und Molekulargewicht aufgetrennt. Die nachfolgenden Kontroll-IPs wurden parallel analysiert: (i) Perlen, die nur mit Serum beschichtet waren, (ii) Lysate von autologen Normalzellen (hier Leukozyten), die mit den selben Serum- Antiköφern immunpräzipitiert wurden, und (iii) das Proteinlysat wurde mit unbehandelten Sepharose-Perlen inkubiert und immunpräzipitiert, um Proteine zu definieren, die unspezifisch an die Sepharose-Perlen banden. Proteinspots, die ausschließlich in den immunpräzipitierten Tumorlysaten nachzuweisen waren, wurden aus dem Gel ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und durch MALDI-ToF Massenspektrometrie und nachfolgende Recherche in der wissenschaftlichen Datenbank Mascot untersucht und identifiziert. Dabei wurden das Heat Shock Cognate Protein 70 (Hsc70), das Glukose-regulierte Protein 78 (Gφ78, ebenfalls bekannt als BiP) und die Keratine 8 und 9 (CK8, CK9) als Targets für eine humorale Immunität identifiziert.
Die Behandlung von Patienten mit einem Karzinom des Kopf-Halsbereiches mit dem bispezifischen Antikörper BiUII: Charakterisierung der induzierten humoralen Anti- Tumorreaktion durch Anwendung von AMT A
Obwohl sich die chirurgischen Techniken als auch die Strahlen- und Chemotherapie über die letzten Jahrzehnte verbessern ließen, haben Patienten, die an einem Plattenepithelkarzinom des Kopf-Halsbereiches leiden, nach wie vor eine schlechte klinische Prognose. Es wurden und werden daher hauptsächlich adjuvante immunologische Therapien entwickelt mit dem Ziel, die Lebenserwartung dieser Patienten zu erhöhen und ihre Lebensqualität zu verbessern. Ein viel versprechender Ansatz beruht auf der Aktivierung des Immunsystems in vivo über bispezifische Antiköiper, die Tumorzellen mit Immuneffektorzellen vernetzen, was zur Aktivierung dieser Immunzellen und so zum Absterben der Tumorzellen führen kann (Lind- hofer, H., et al., Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas. Implications for a single-step purification of bispecific antibodies. J Immunol, 1995. 155: pp. 219-25.; Zeidler, R., et al., Simultaneous Activation of T Cells and Accessory Cells by aNew Class of Intact Bispecific Antibody Results in Efficient Tumor Cell Killing, Journal of Immunology, 1999. 163: pp. 1246-1252; Zeidler, R., et al., The Fc-region of a new class of intact bispecific antibody mediates activation of accessory cells and NK cells and induces direct phagocytosis of tumour cells. British Journal of Cancer, 2000. 83: pp. 261-266; Zeidler et al., TNFα contributes to the antitumor activity of a bispecific, trifunctio- nal antibody, Anticancer Research, in press). BiUII ist ein solcher bispezifischer Antiköφer, der in einer klinischen Phase I/H-Studie an Patienten mit Hypopharynx-Karzinomen getestet wurde. Von diesen Patienten wurden vor und nach der Therapie Seren gesammelt und Tu- morbiopsien gewonnen, um daraus Tumorzelllinien zu erzeugen. Dabei konnte beim Vergleich vonprä- mit post-Therapieseren des Patienten GHD-1 die Induktion einer tumorspezifischen humoralen Immunreaktion in einer durchflußzyto etrischen Analyse nachgewiesen werden. Die BiUII-Therapie induzierte in diesem Patienten eine starke humorale Immunre- aktion gegen die autologe Tumorzelllinie, wie sich an der Anwesenheit von Autoantiköφem der Subklasse IgG3 im post-Therapieserum nachwiesen ließ, die an die autologen Tumorzellen banden. Im Gegensatz hierzu wurde keine Erhöhung der Antiköφerbindung an autologe Lymphozyten oder Monozyten beobachtet (Figur 1). Somit hatte die BiUII-Behandlung eine gesteigerte tumorspezifische humorale Reaktion zur Folge.
AMIDA wurde bei Patient GHD-1 wie folgt durchgeführt: Prä- und post-Therapieseren wurden getrennt auf Sepharose-A-αIgG3 -Perlen geschichtet und mit lysierten Membranfraktionen autologer GHD-1 Zellen inkubiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden durch 2D- PAGE getrennt, nach tryptischem Verdau durch Massenspektrometrie analysiert und unter Verwendung der Mascot Science Protein-Datenbank identifiziert. Der Zweck dieses Experiments war zweifach: Zuerst, die BiUTI-induzierte humorale Immunreaktion zu charakterisieren, und zweitens, AMIDA unter Bedingungen anzuwenden, bei denen eine humorale Immunantwort nachgewiesen worden war. AMIDA-Screening bei Patient GHD-1 führte zur differentiellen Immunpräzipitierung von Proteinen, die sich im 2D-PAGE als 9 verschiedene Proteinspots darstellten. D.h. im post-Therapieserum des Patienten waren Antiköφer gegen Proteine vorhanden, die im prä-Therapieserum noch nicht vorhanden waren. Diese differen- tiell präzipitierten Proteine sind zusammen mit ihren geschätzten Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten in Tabelle 1 aufgelistet. Die Proteinspots 1 bis 4 eiwiesen sich jeweils als humanes Zytokeratin 8 (CK8; wahrscheinlich unterschiedlich modifizierte Formen davon). CK8 ist ein zytoplasmatisches Protein, das in einschichtigen Epithelien und einigen Arten von Karzinomen exprimiert wird (Southgate, 1999, 13) und das intrazellulär, als Hete- rodimer mit CK18, intermediäre Filamente bildet. CK8 hat ein Molekulargewicht (MW) von ca. 53 kDa und einen berechneten isoelektrischen Punkt (pl) von 5,36, was mit dem MW und pl übereinstimmt, wie sie aus den AMIDA-Ergebnissen geschätzt wurden. Die Proteinspots 5, 6 und 7 wurden als menschliche Immunglobulin (Ig)-Lambda und Ig-Kappa-Ketten identifiziert, ein Ergebnis, das zusätzlich die Induktion einer humoralen Reaktion im Anschluss an die BiUII-Therapie unterstreicht. Bei den beiden verbleibenden Spots 8 und 9 handelt es sich um Proteine, für die kein Eintrag in der Datenbank existiert.
Zelloberfiächenexpression von CK8 in Karzinomlinien und primären Tumorzellen
Zelluläre. Proteine können von Antiköφem auf intakten Zellen eigentlich nur danne erkannt werden, wenn sie sich auf der Zeil Oberfläche befinden. Da es sich bei CK8 eigentlich um ein streng intrazelluläres Protein handelt, weist die Immunpräzipitierung von CK8 aus einem Proteinlysat der autologen Tumorzellen durch Autoantiköφer auf die ektopische, nämlich Oberflächenexpression von CK8 auf diesen Zellen hin. In Folgeexperimenten konzentrierten wir uns daher auf die Charakterisierung dieser aberranten Zelloberfiächenexpression von CK8. Hierzu wurden zuerst unpermeabilisierte GHD-1 Zellen mit einem CK8-spezifischen Antiköφer in Kombination mit einem FITC-konjugierten sekundären Antiköφer gefärbt und die Zelloberfiächenexpression von CK8 anschließend in einem FACScalibur Durchflußzy- tometer bestimmt. Dabei war stets eine schwache, aber beständige Expression von CK8 an der Oberfläche von lebenden und nicht-permeabilisierten GHD-1 Zellen nachweisbar. Die Menge an Membran-ständigem CK8 repräsentierte eine geringere Fraktion im Vergleich zu zytoplasmatischem CK8, wie es in permeabilisierten Zellen detektierbar war (Figur 3a). Ü- berdies konnten wir die Expression von CK8 auf einer Reihe von Kopf-, Hals-, Zervix-, Brust- und Kolonkarzinom-Zelllinien in der Durchflußzytometrie mit spezifischen Antikörpern nachweisen: Neun von elf Karzinomzelllinien exprimierten CK8 auf ihrer Oberfläche (Figur 3b). Die durch die adenoviralen Onkogene E1A und E1B transformierte, humane embryonale Nierenepithelzelllinie HEK293 (Graham et al, Characteristics of a human cell line frans formedby DNA fromhuman adenovirus type 5.J General Virology, 1977, Vol 36, pp. 59-74.) wurde als Kontrolle verwendet, wobei auf der Oberfläche von HEK293-Zellen kein CK8 nachgewiesen werden konnte. Auch in Kontrollexperimenten mit einem Antikörper gegen ein weiteres, streng intrazelluläres Protein (Epidermales Fettsäure- Bindungsprotein, E-FABP) konnte keine unspezifische Färbung an der Zelloberfläche festgestellt werden, obwohl E-FABP intrazellular stark exprimiert wurde (Daten nicht dargestellt). Zusätzlich wurde das CK8 -Färbemuster der Karzinomzelllinien FaDu und PCI-1 durch Immunhistochemie und Immunfluoreszenz bestimmt, indem nicht-permeabilisierte Zellen mit einem CK8-spezifischen Antiköφer angefärbt wurden. Hierbei ergaben sich punktförmige Färbemuster mit hohen lokalen Konzentrationen von CK8 an den Plasmamembranen (Figur 4). In Doppel-Färbungsexperimenten mit einem Antiköφer gegen das membrangebundene pan-Karzinomantigen EpCAM konnte ein überlappendes Färbemuster beobachtet werden, was die Membranlokalisierung von CK8 zusätzlich bestätigt (Daten nicht dargestellt).
Um unsere Ergebnisse auch in vivo zu validieren, wurde die aberrante Expression von CK8 auf der Oberfläche von primären Karzinomzellen untersucht. Hierzu wurden aus sechs frisch isolierten primären Tumorbiopsien des Kopf-Hals-Bereiches Einzelzellsuspensionen hergestellt und mit CK8-spezifischen Antiköipern angefärbt. Da solche Biopsien neben den Tumorzellen selbst zusätzlich normale Zellen, wie Immunzellen, enthalten, wurden die Tumorzellen durch einen Antiköφer gegen das Karzinom-assoziierte Antigen EpCAM nachgewiesen. Parallel hierzu wurde durch die Zugabe von Propidiumiodid (Pl) die Vitalität der Zellen definiert. In diesen Versuchen zeigte sich, dass CK8 ausschließlich auf der Plasmamembran intakter EpCAM positiver Zellen stark (tu-1, tu-2, tu-6), moderat (tu- 5) oder schwach (tu-3, tu-4; Figur 5) exprimiert wurde. Auf EpCAM-negativen Zellen, die in diesen Biopsien vorhanden waren, konnte membranständiges CK8 nicht nachgewiesen werden. Tote Zellen wurden anhand der Aufnahme von Pl definiert und zeigten ein starkes und heterogenes CK8- Färbemuster, was wahrscheinlich eine zytoplasmatische Färbung von CK8 in toten Zellen widerspiegelt, wie sie auch in permeabilisierten Zelllinien beobachtet wurde. Zusammenge- fasst erlauben die dargestellten Ergebnisse den Schluss, dass CK8 in Plattenepithelkarzino- men eine ektopische Expression auf der Zelloberfläche erfährt, während eine solche Expression bei Normalzellen nicht zu beobachten ist.
Zusammenfassung
Hierin wird die Identifizierung von Hsc70, Gιp78, Zytokeratin 8 und 9 und zweier weiterer Proteine unbekannter Funktion als Ziele für eine humorale Reaktion bei Kopf- und Halskarzinompatienten über eine neue Technik, AMIDA, beschrieben. Die humorale Reaktion, die von Tumorzellen in Patienten hervorgerufen wird, wurde benutzt, um mit Hilfe dieser Technologie Tumor-assoziierte Proteine zu isolieren und zu charakterisieren. Die Expression von CK8 auf der Zelloberfläche von Karzinomzellen wurde im vorhergehenden Absatz bereits ausführlich beschrieben. Tatsächlich wurde über die Zelloberfiächenexpression von CK8 für Brustkarzinomzellen berichtet, wo es als ein Membranrezeptor für Plasminogen und dessen Aktivator (tissue type plasminogen activator, tPA) dient (Hembrough, 1996; Cell-surface cytokeratin 8 is the major plasminogen receptor on breast cancer cells and is required for the accelerated activation of cell-associated plasminogen by tissue-type plasminogen activator. J Biol Chem 271 (41), 25684-91 und Hembrough et. al., 1995 A cytokeratin 8-like protein with plasminogen-binding activity is present on the external surfaces of hepatocytes, HepG2 cells and breast carcinoma cell lines. J Cell Sei 108 (3), 1071-82). Es wird angenommen, dass CK8 die Erzeugung eines „Proteasesystems" an der Membran vermittelt, das Tumorzellen dazu benutzen könnten, um in das umgebende Gewebe zu invadieren und dieses umgestalten. Diese Resultate stimmen mit Daten überein, die über die Zelloberfiächenexpression von CK1 und CK8 auf Brustkarzinomen berichten. Von weit größerer Bedeutung war die Validierung der Ergebnisse im Kontext von primären, frisch isolierten Tumorzellen. Sechs Biopsien von Hypophaiynx-Plattenepithelkarzinomen wurden bezüglich der Zelloberfiächenexpression von CK8 untersucht: Alle erwiesen sich als positiv, wenn auch (wie zu erwarten) in unterschiedlicher Stärke (Figur 5). Somit handelt es sich bei der Expression von CK8 auf der Plasmamembran von Karzinomzellen weder um ein Artefakt kultivierter Zelllinien noch um einen Fehler im Nachweissystem. Dieser klare und eindeutige Nachweis bekräftigt vielmehr das Potential des hier vorgestellten Verfahrens. Da Karzinomzelllinien unterschiedlichen Urspmngs (Kolon, Zervix, Brust, Kopf und Hals) CK8 auf ihren Oberflächen exprimieren, liegt es nahe, dass auch CK8-Antiköφer nicht nur (wie nachgewiesen) bei Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf-Halsbereiches, sondern auch bei anderen Karzinompatienten vorhanden sein dürften.
In weiterführenden Experimenten wurden aus einem Zervix-Karzinom und einem Hypopha- rynx-Karzinom mittleiweile 50 differentiell exprimierte Proteinspots isoliert, die Gegenstand derzeitiger Forschungsarbeiten sind.
2 50 5,2 menschliches CK8
3 50 5,1 menschliches CK8
4 50 5,0 menschliches CK8
5 25 5,8 menschliche Ig-Lambda-Kette (Vorstufe)
6 20 6,2 menschliche IgG Kappa-Kette 7 20 6.2 menschliche IgG Kappa-Kette
8 80 4.3 KIAA1273
9 160 6,5 KIAA0373
Tabelle 1: Geschätzte Molekulargewichte und isoelektrische Punkte von Proteinen, die aus zehn Proteinspots isoliert wurden, die reproduzierbar bei AMIDA-Screenings mit Material aus dem Patienten GHD-1 durchgeführt wurden.
II. Anwendung von AMIDA im xenogenen System:
Borrelia burgdorferi und die Lyme Krankheit:
Borrelia burgdorferi (B.b.), das kausale Agenz der Lyme Borreliose, ist ein Gram-negatives Bakterium. B.b.w d durch Zeckenbiß (Ixodes ricinus) übertragen und kann, im Falle einer fehlenden oder mangelhaften Behandlung, eine persistierende und chronisch verlaufende Arthritis verursachen (Lyme Arthritis). Außerdem kann es zu chronischen Infektionen des Herzes und Hims kommen, die eine Karditis bzw. Encephallitis zur Folge haben (Steere, 1997; Steere, 2001).
Mithilfe von Mausmodellen konnte die Pathogenese der Lyme Borreliose studiert werden. Ein Zusammenhang zwischen dem Haplotyp des Haupthistokompatibilitätskomplexes von Mäusen (H2) und deren Suszeptibilität gegenüber einer Borrelien Infektion wurde dabei festgestellt (Schaible et al., 1991). Dieser Zusammenhang besteht auch beim Menschen: bestimmte MHC-Haplotypen sind mit einem chronischen Verlauf der Lyme Borreliose assoziiert.
Die humorale Antwort in Mäusen nach Infektion mit B.b.:
Die Immunantwort gegen B.b. und die molekulare Grundlage für eine Suszeptibilität sind nur unvollständig verstanden. Die Antwort der Helfer- (CD4+) T Zellen ist ein entscheidender Faktor in der Pathogenese der Lyme Arthritis (LA): die Aktiviemng einer Thl Antwort, die gekennzeichnet ist durch die Bildung von piOinflammatorischen Zytokinen wie IFN- gamma, führt zur Induktion der LA. Die Aktiviemng von Typ 2 Helfer T-Zellen, und damit die Bildung von u.a. IL4, hat einen schützenden Effekt bei der Pathogenese der LA (Keane- Myers and Nickell, 1995a; Keane-Myers and Nickeil, 1995b; Matyniak et al., 1995). JJ 4 ist ein essentielles Zytokin bei der Aktivierung und Reifung von B-Zellen, sodass die Induktion einer humoralen Antwort gegen B.b. vermutet und experimentell auch bestätigt werden konnte. Es sind nur wenige der Reaktivitäten gegen B.b. in Mäusen charakterisiert, wie die beiden Membranproteinen Osp C und Ospl7 (Pohl-Koppe et al., 2001), obschon protektive Antiköφer gebildet werden (McKisic and Barthold, 2000).
Identifizierung von Zielantigenen der humoralen Antwort gegen B.b. mittels AMIDA:
Mithilfe der AMIDA Technologie wurde die humorale Antwort in resistenten BALB/c Mäusen vor bzw. nach B.b. Infektion untersucht. Lebende Borrelien (3xl08) wurden in Lysispuf- fer (PBS, 1% Triton X-100) aufgenommen und unlösliche Bestandteile durch Zenüifugation pelletiert. Parallel wurden BALB/c Mäuse einmalig mit lxlO8 B.b. infiziert und Serum drei Wochen nach Infektion gewonnen. Serum- Antiköiper von infizierten Mäusen wurden kova- lent auf Sepharose Protein A Kügelchen gekoppelt und zur Immunpräzipitation von B.b. Lysaten verwendet (200μl Serum + 50μl Sepharose Protein A). Antigen-Antiköφer Komplexe wurden anschließend in einer zwei-dimensionalen Gelelektrophorese (2D-PAGE) aufgetrennt (Amersham IPG Strips pH 3-10L; SDS-PAGE 13%) und in der Silberfärbung visu- alisieit (siehe Fig. 6). Immunpräzipitierte Proteine wurden aus den 2D-PAGE geschnitten, mit Trypsin behandelt und in einer MALDI-ToF Massenspektrometrie analysiert. Proteine, die unspezifisch an die Sepharose Protein A Kügelchen gebunden waren, wurden in einem Kontrollgel visualisiert und bei der Auswahl nicht berücksichtigt. Auf diese Weise konnte eine B.b. -spezifische humorale Antwort gegen Flagellin (accession number: FLLYB3), das konservierte hypothetische integrale Membranprotein BB0616 (accession number: G70220) und das exportierte Protein A (eppA, accession number: G70176) nach Infektion in Mäusen nachgewiesen werden.
in. Anwendung von AMID im allogenen System
Identifizierung von Antigenen einer permanenten humanen Karzinomzelllinie mit Hilfe von Serumantiköipem per AMIDA: Eines der möglichen Anwendungsgebiete von AMIDA ist die Identifizierung von Markern zur Detektion und Diagnostik von Erkrankungen. An einen solchen „Biomarker" sind verschiedene Bedingungen zu stellen, wie Häufigkeit und Spezifität. Das bedeutet, der Marker (etwa Cytokeratin-8 spezifische Antiköφer bei Tumorerkrankungen) soll bei möglichst vielen Tumoφatienten, gleichzeitig aber bei möglichst wenig gesunden Kontrollpersonen vorhanden sein. Um diese Fragestellung anzugehen, haben wir unsere AMIDA Technologie auch im allogenen System angewendet. Dabei war es uns wichtig, ein System zu etablieren, das einfach und reproduzierbar ist. Ein solches sind beispielsweise immortalisierte Zelllinien (etwa Tumorzelllinien), die eine homogene Population darstellen und permanent verfügbar sind.
Hierzu wurden von lxl 07 Zellen einer permanenten humanen Karzinomzelllinie (FaDu, ATCC-Nr. HTB-43) ein Lysat (in PBS, 1% Triton X-100) hergestellt und die unlöslichen Zellbestandteile durch Zentrifugation pelletiert. Serum- Antiköφer eines Tumoφatienten wurden zwischenzeitlich kovalent auf Sepharose Protein A Kügelchen gekoppelt und zur Immunpräzipitation von FaDu-Ly säten verwendet (200μl Serum + 50μl Sepharose Protein A). Antigen-Antiköφer Komplexe wurden anschließend in einer zwei-dimensionalen Gelelektrophorese (2D-PAGE) aufgetrennt (Amersham IPG strips pH 3-10; SDS-PAGE 13%) und durch Silberfärbung visualisiert (siehe Abb. 1). Immunpräzipitierte Proteine wurden aus den 2D-PAGE geschnitten, mit Trypsin behandelt und in einer MALDI-ToF Massenspektrometrie analysiert. Proteine, die unspezifisch an die Sepharose Protein A Kügelchen gebunden waren, wurden in einem Kontrollgel visualisiert und bei der Auswahl nicht berücksichtigt. Auf diese Weise konnten im Serum des Patienten Antiköφer nachgewiesen werden, die E<xDw-Antigene erkennen und die sich somit auch zur Isolierung und Identifizierung allogener Antigene per AMIDA eignen.
Bei dem oben beschriebenen Experiment gelang es uns so, folgende FaDu-Antigene zu isolieren und zu identifizieren:
Literatur:
Keane-Myers, A. and Nickeil, S.P. (1995a) Role of IL-4 and IFN-gamma in modulation of immunity to Borrelia burgdorferi in mice. J Immunol, 155, 2020-2028.
Keane-Myers, A. and Nickell, S.P. (1995b) T cell subset-dependent modulation of immunity to Borrelia burgdorferi in mice. J Immunol, 154, 1770-1776.
Matyniak, J.E., Reiner, S.L., Schaible, U.E., Kramer, M.D., Wallich, R., Tran, T. and Simon, M.M. (1995) T helper phenotype and genetic susceptibility in experimental Lyme di- sease. JExp Med, 181, 1251-1254. occurrence of B. burgdorferi-induced arthritis suggest a critical role of T cells in the development of the disease in mice.
McKisic, M.D. and Barthold, S.W. (2000) T-cell-independent responses to Borrelia burgdorferi are critical for protective immunity and resolution of lyme disease. Infect Immun, 68, 5190-5197.
Pohl-Koppe, A., Kaunicnik, A. and Wilske, B. (2001) Characterization of the cellular and humoral immune response to outer surface protein C and outer surface protein 17 in children with early disseminated Lyme borreliosis. Med Microbiol Immunol (Berl), 189, 193-200.
Schaible, U.E., Kramer, M.D., Wallich, R., Tran, T. and Simon, M.M. (1991) Experimental Borrelia burgdorferi infection in inbred mouse strains: antibody response and associ- ation of H-2 genes with resistance and susceptibility to development of arthritis. Eur J Immunol, 21, 2397-2405.
Steere, A.C. (1997) Diagnosis andtreatment of Lyme arthritis. Med Gin NorthAm, 81, 179- 194.
Steere, A.C. (2001) Lyme disease. NEnglJMed, 345, 115-125.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Auffinden von Antigenen mit den nachfolgenden Schritten:
a) Herstellen eines Proteinlysats aus einem zu untersuchenden Zellmaterial eines Spenders;
b) Inkubieren des Proteinlysats mit allogenem, xenogenem und/oder autologem Serum, Aszites und oder Pleuralflüssigkeit, die jeweils Antiköφer enthalten, die im Laufe einer humoralen Immunantwort oder einer Autoimmunantwort auf die Antigene gebildet wurden, um eine spezifische Bindung der Antiköiper an die Antigene des Proteinlysats zu erhalten;
c) Abtrennen der Antigen- Antiköφer-Komplexe;
d) Nachweisen der mit den Antiköφem spezifisch gebundenen Antigene.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) zusätzlich Antiköφer zugegeben werden, die gegen Immunglobuline des Spenders gerichtet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich bei den Antigenen um Tumorantigene oder Antigene, die mit Autoimmunkrankheiten, bakteriellen, viralen oder parasitären Infektionen assoziiert sind, handelt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Inkubationsschritt das Proteinlysat einer Fraktionierung unterworfen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung eine Trennung in Membrananteile und Zytoplasmaanteile umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktionierung eine Trennung des Zellmaterials in subzelluläre Kompartimente umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Fraktionierung nach Proteingröße mittels Größenausschlußsäulen erfolgt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφer an ein Trägermaterial gebunden vorliegen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass als Trägermaterial Sepharose, Sepharose Protein A, SephaiOse Protein G, Agarose Protein A oder Agarose Protein G eingesetzt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Proteinlysat mit dem jeweils verwendeten Trägermaterial vorinkubiert wird.
11. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprache, dadurch gekennzeichnet, dass die Antiköφer an das Trägermaterial kovalent gebunden vorliegen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die kovalente Bindung durch Bildung von Amidbindungen zwischen Amino- und Car- boxylgruppen der Proteine oder die Bildung von Disulfidbrücken aus zwei SH-Gruppen erfolgt.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche 7-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der Antigen-Antiköφerkomplexe mittels Zentrifiigation oder Sedimentation erfolgt.
14. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtrennung der Antigen-Antiköφerkomplexe mittels Isolierung der Antiköφer durch Protein A bzw. G beschichtete Säulen erfolgt.
15. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Antigene das Auftrennen der abgetrennten Komplexe durch e- lektrophoretische Methoden umfasst.
16. Verfahren nach Ansprach 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine zweidimensionale Elektrophorese eingesetzt wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene nach der Gel-Elektrophorese mit Farbstoffen, z.B. Coomassie-Blau, Silber, Ponceau-Rot, oder mit fluoreszierenden oder lumineszie- renden Reagenzien behandelt werden.
18. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen vor der Lyse mit radioaktiven Reagenzien inkubiert werden.
19. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung die Antigene von Interesse ausgeschnitten, einem Protease-Verdau unterzogen und mittels Massenspektrometrie analysiert werden.
20. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, dass nach erfolgter elektrophoretischer Auftrennung die Antigene von Interesse ausgeschnitten, einem Protease -Verdau unterzogen und sequenziert werden.
21. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene nach der Elektrophorese auf eine Nitrocellulose- oder eine Poly vinyliden- fluorid (PVDF)- Membrane übertragen werden und anschließend erst von der Membran isoliert werden.
22. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Antigene einen Vergleich der gefundenen Antigene mit Kontrollpro- ben, insbesondere aus gesundem Zellmaterial, und/oder mit dem Serum alleine bzw. Lysat alleine umfasst.
23. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass als Spender des Zellmaterials ein Säugetier, insbesondere ein Mensch, ein Primat oder ein Nagetier, bevorzugt Maus, Ratte, Hamster oder Kaninchen, oder ein infektiöser Organismus, bevorzugt ein Virus, ein Bakterium oder ein Parasit, eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass das Serum, Aszites und/oder Pleuralflüssigkeit aus einem Säugetier, insbesondere einem Menschen, einem Primaten oder einem Nagetier, bevorzugt Maus, Ratte, Hamster oder Kaninchen, gewonnen wurde.
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