ES2258278T3 - Marcadores de proteina para el cancer esofagico. - Google Patents
Marcadores de proteina para el cancer esofagico.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN ANALISIS MEDIANTE ORDENADOR DE GELES 2 - G DE LAS PROTEINAS DE TEJIDOS DE TUMORES DE ESOFAGO, BASADA EN EL AMFOLITO VECTOR (CA) Y EN EL GRADIENTE DE PH INMOVILIZADO (IPG); ESTE ANALISIS REVELA QUE HAY UNAS PROTEINAS QUE SON DIFERENTES EN CUANTO AL TEJIDO TUMORAL Y AL TEJIDO DE CONTROL.
Description
Marcadores de proteína para el cáncer
esofágico.
La presente invención se refiere a proteínas que
son marcadores para el cáncer esofágico.
El cáncer esofágico es una enfermedad mortal, y
es uno de los diez cánceres más comunes en todo el mundo. Por
razones que no están claras, ha habido un rápido aumento en la
incidencia del adenocarcinoma esofágico. La aparición de un cambio
en el esófago, denominado como mucosa de Barrett, en el que un
epitelio metaplásico precanceroso sustituye al epitelio escamoso
normal, seguida del reflujo gastroesofágico, es el principal factor
de riesgo para este cáncer mortal. La reducción de la alta
mortalidad asociada con este cáncer requerirá medios simplificados
para el diagnóstico de la mucosa de Barrett y la identificación, en
un estadio precoz, de cambios en la mucosa de Barrett que indiquen
la evolución hacia el cáncer.
En el momento actual, el cáncer esofágico se
diagnostica principalmente mediante biopsia. Desafortunadamente, con
frecuencia para cuando se diagnostica el cáncer éste está muy
avanzado. La supervivencia tras el diagnóstico es escasa.
Por tanto, existe una necesidad de diagnóstico de
cáncer esofágico en un estadio precoz, o incluso en un estadio
precanceroso. Pueden utilizarse marcadores que se correspondan con
el avance de la enfermedad para monitorizar los regímenes
terapéuticos.
Mediante la comparación de geles
2-D que muestran proteínas de un esófago normal,
mucosa gástrica normal, mucosa de Barrett y cáncer esofágico, se ha
identificado un conjunto de proteínas en los tejidos de distinto
origen. Estas proteínas proporcionan información sobre la patogenia
del cáncer esofágico, y pueden tener utilidad como marcadores para
monitorizar regímenes terapéuticos.
También pueden purificarse las proteínas y
utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos que puedan
utilizarse como reactivos de diagnóstico. Los anticuerpos que se
unen específicamente a las proteínas pueden utilizarse en un
inmunoensayo de líquidos corporales para detectar las proteínas,
proporcionando así información diagnóstica y/o información para
monitorizar regímenes terapéuticos. Los líquidos corporales
utilizados en el método de inmunoensayo pueden ser muestras de
sangre o suero, orina, saliva, lágrimas u otros líquidos
corporales.
Además, las proteínas y productos derivados de
las mismas tienen aplicaciones terapéuticas.
La invención se define mediante las
reivindicaciones adjuntas.
La figura 1 muestra un gel de anfolito portador
(CA, "carrier ampholyte") completo con muchas manchas
importantes rotulados.
La figura 2 muestra la región alrededor de la
mancha 102 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 3 muestra la región alrededor de las
manchas 109-111 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 4 muestra la región alrededor de la
mancha 61 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 5 muestra la región alrededor de la
mancha 112 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 6 muestra la región alrededor de las
manchas 115 y 117 de 12 muestras.
La figura 7 muestra la región alrededor de la
mancha 118 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 8 muestra la región alrededor de las
manchas 42, 44 y 120 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 9 muestra la región alrededor de la
mancha 121 para geles de CA de 4 muestras.
La figura 10 muestra la región alrededor de las
manchas 122, 123 y 124 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 11 muestra un cuadrante de un gel.
La figura 12 muestra un cuadrante de un gel.
La figura 13 muestra la región alrededor de la
mancha PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular,
"proliferating cell nuclear antigen") para geles de CA de 12
muestras.
La figura 14 muestra la región alrededor de la
mancha 29 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 15 muestra la región alrededor de la
mancha 31 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 16 muestra la región alrededor de la
mancha 42 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 17 muestra la región alrededor de la
mancha 44 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 18 muestra la región alrededor de la
mancha 5 para geles de CA de 12 muestras.
La figura 19 muestra un cuadrante de un gel de
gradiente de pH inmovilizado (IPG, "immobilized pH
gradient").
La figura 20 muestra un cuadrante de un gel de
IPG.
La figura 21 muestra la región alrededor de la
mancha 29 para geles de IPG de 10 muestras.
La figura 22 muestra la región alrededor de las
manchas 15, 51 y 53 para geles de IPG de 10 muestras.
La figura 23 muestra la región alrededor de la
mancha 56 para geles de IPG de 10 muestras.
La figura 24 muestra la región alrededor de la
mancha 57 para geles de IPG de 10 muestras.
La figura 25 muestra un cuadrante de un gel de
IPG.
Ejemplo
1
Se obtuvo tejido de 27 pacientes para un análisis
2-D a partir de tejido tumoral y esófago normal.
Para pacientes en los que apareció el tumor en el contexto de la
mucosa de Barrett, también se obtuvo tejido de Barrett. (Una
característica anatomopatológica interesante de la mucosa de Barrett
es que se asemeja a un tipo de tejido gastrointestinal en vez de al
tejido esofágico, en el que se halla. El extremo inferior del
esófago se asemeja a la mucosa gástrica en vez de al verdadero
tejido esofágico, así pues los tumores que surgen en esta
localización necesitan compararse con el esófago normal así como con
tejido gástrico como control). Para tumores que aparecieron en el
extremo inferior del esófago, también se obtuvo mucosa gástrica
normal. Todas las muestras se obtuvieron en el momento de una
cirugía inicial. Por tanto, para cada paciente se obtuvieron dos
tejidos de control, además del cáncer: esófago normal y mucosa de
Barrett para la mitad de los pacientes, y esófago normal y estómago
para la otra mitad.
Para todas las muestras, se prepararon geles
2-D basados en anfolito portador que cubrieran el
intervalo de pH de aproximadamente 3,5-10,0.
El tejido se solubilizó mediante la adición de
tampón de lisis que consistía (por litro) en urea 8 M, 20 ml de
tensioactivo Nonidet P-40, 20 ml de anfolitos (pH
3,5-10), 20 ml de 2-mercaptoetanol,
y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM en agua desionizada
destilada. Se cargaron aproximadamente alícuotas de 30 \mul que
contenían 70 \mug de proteína en geles individuales.
Debido a que el enfoque isoeléctrico es sensible
a la modificación de carga, es importante minimizar las alteraciones
proteicas (por ejemplo, proteolisis, desamidación de glutamina y
asparagina, oxidación de cistina a ácido cístico, carbamilación) que
puedan dar como resultado una preparación inapropiada de la muestra.
Una vez solubilizadas, las muestras pueden almacenarse congeladas a
-80ºC durante periodos cortos (< 1 mes) sin una modificación
proteica significativa).
Se realizó PAGE 2-D tal como se
describió anteriormente (Strahler et al, Journal of Clinical
Investigation, 85:200-207, 1990). En la mayoría de
los casos las alícuotas se aplicaron inmediatamente sobre geles de
isoenfoque. Los geles de la primera dimensión contenían 50 ml de
anfolitos por litro (pH 3,5-10). El isoenfoque se
llevó a cabo a 1.200 V durante 16 h y 1.500 V durante las últimas 2
h. Se dejaron correr simultáneamente 20 geles. Para la separación en
la segunda dimensión, se utilizó un gradiente de acrilamida de
11,4-14,0 g/dl. Las manchas de proteína se
visualizaron mediante la técnica de tinción con plata de Merril
et al. (Merril et al, Science,
211:1437-1438, 1981).
Ejemplo
2
Además de generar patrones 2-D
que se basaban en anfolito portador, se generó un segundo conjunto
de patrones utilizando gradientes de pH inmovilizado como un
conjunto complementario.
Se prepararon muestras como para los geles de CA
tratados en el ejemplo 1. Para la separación en la primera dimensión
un gradiente de pH inmovilizado que cubre el intervalo de separación
de pH 4-10. La segunda dimensión es la misma que
para los geles de CA del ejemplo 1.
Se prepararon geles de IPG utilizando derivados
de acrilamida que tienen grupos carboxilo o amino terciarios con
valores de pK específicos. Se preparó un gradiente de pH lineal a
partir de una disolución ácida densa y una disolución básica ligera
utilizando un molde de microgradiente de dos cámaras. El gradiente
de pH se estabilizó durante la polimerización de la matriz de
Immobiline-acrilamida-bisacrilamida
mediante un gradiente colineal de glicerol. Se han publicado
formulaciones de mezclas de tamponamiento de Immobiline con
Immobiline de valoración para las disoluciones de pH límite para
gradientes de pH estrechos (1 unidad de pH) o gradientes de pH
amplios (> 1 unidad de pH, hasta 6 unidades de pH) (Gianazza
et al, Electrophoresis 6:113 (1985) y Nota de aplicación de
LKB ("LKB Application Note") 324 (1984)).
La segunda dimensión separa las proteínas
basándose en el peso molecular en un gel de SDS. Un gradiente de
acrilamida del 11,5 hasta el 14% de T (reticulación del 2,6%)
proporciona una separación eficaz de proteínas de masa de desde
15.000 hasta 100.000. Las proteínas fuera de este intervalo no están
tan bien resueltas. Proteínas con un peso molecular inferior a
10.000 Da experimentan electroforesis próxima al frente de colorante
y no se resuelven.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Cada gel se exploró en un formato de 1024 x 1024
píxeles, en el que cada pixel puede tener uno de los 256 valores
posibles representando diferentes grados de intensidad. Las listas
de manchas para las imágenes de estudio se hacen corresponder con
listas de manchas de imágenes modelo de manera que el resultado es
una jerarquía de manchas de proteína que se han hecho corresponder.
El fin de esta correspondencia es vincular la misma mancha de
polipéptido a través de la jerarquía para permitir la evaluación de
su variación cuantitativa actual y su especificidad, tal como se
describe en Strahler et al, 1990 (J. Clin. Invest. Vol. 85,
págs. 200-207). Para la comparación, entre geles, de
la cantidad de proteínas individuales, se utiliza un proceso de
ajuste. La intensidad integrada de los polipéptidos detectados,
medida en unidades de densidad óptica por milímetro cuadrado, se
ajusta en relación a la intensidad de los polipéptidos de referencia
que se expresan de manera ubicua. El ajuste se hace para compensar
cualquier variación entre geles debido a la carga o la tinción de la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El número de diferencias de manchas entre la
mucosa de Barrett y el esófago normal fue enorme. Quedó claro que
las muestras de Barrett eran mucho más similares a las muestras de
mucosa gástrica, de manera que se identificaron las manchas que eran
más grandes en la mucosa de Barrett en comparación con la
gástrica.
Algunas de las manchas presentes en la mucosa de
Barrett y no en el tejido gástrico estaban presentes en el esófago
normal, y probablemente éstas son menos interesantes. Aparecen en la
parte de abajo empezando por la mancha 6. Debe observarse que las
manchas que son mayores en la mucosa de Barrett también son grandes
en el adenocarcinoma esofágico, ya que los dos tipos de muestra
representan esencialmente el mismo tejido pero difieren con respecto
al estado de malignidad.
La mancha 102 es mayor en la mucosa de Barrett
que en los tejidos normales analizados.
Las manchas 109, 110, 111 grandes casi siempre
están presentes en mayores cantidades en la mucosa de Barrett que en
la mucosa gástrica o en el esófago normal. También son grandes en el
adenocarcinoma esofágico.
La mancha 33 siempre es bastante grande en la
mucosa de Barrett, y, ocasionalmente, es aproximadamente igual en la
mucosa gástrica, pero con frecuencia es más pequeña. No merecería
mencionarse, excepto porque parece ser mayor en el adenocarcinoma
esofágico.
La mancha 61 casi siempre es más grande en la
mucosa de Barrett. Normalmente, una mancha justo a la derecha es
mayor en la mucosa gástrica.
La mancha 112 es mayor en la mayoría de las
mucosas de Barrett.
La mancha 113 es mayor en la mucosa de Barrett,
pero también está presente como una mancha obvia en la mucosa
gástrica. (la mancha justo a la derecha del 113 es grande en la
mucosa gástrica).
La mancha 117 es potencialmente interesante. Es
difícil de encontrar en muchas mucosas gástricas porque está en un
área de muchas manchas pequeñas.
La mancha 115 parece bastante buena y está cerca
de la 117.
Normalmente, la mancha 118 es más grande en la
mucosa de Barrett. Es bastante básica y por tanto difícil de
comparar en todos los geles.
La mancha 44 parece buena, pero ya se ha hallado
como mancha interesante ya que parece más grande en el
adenocarcinoma esofágico.
La mancha 120 es particularmente grande en la
mucosa de Barrett y el adenocarcinoma esofágico.
La mancha 121 es una mancha de 18 kd enorme,
gris, muy básico en la mucosa de Barrett y el adenocarcinoma
esofágico. Está tan hacia la derecha del gel que a veces es difícil
de distinguir si está ahí o fuera del gel.
La mancha 122 es más grande en la mucosa de
Barrett.
La mancha 123, muy baja y ácida, es parte de una
familia de manchas más grandes en la mucosa de Barrett.
La mancha 124 parece buena. Es posible que sea
una P18 fosforilada ("c").
Las manchas 6, 7 y 8 son más grandes en la mucosa
de Barrett, pero éstas son manchas INMENSAS en el esófago
normal.
Normalmente, la mancha 116 es más grande en la
mucosa de Barrett pero parece grande en el esófago.
Normalmente, las manchas de HSP27 son más grandes
en la mucosa de Barrett, pero son incluso mayores en el esófago
normal.
La mancha 119 pareció apasionante, pero es una
mancha enorme del esófago.
Resumen de manchas a lo largo de la mucosa
gástrica (MG), cáncer de cardias (CC), mucosa de Barrett (B), y
adenocarcinoma esofágico (AE).
Leyenda:
U = interesante y arriba
i= algo interesante (arriba) pero no tan
convincente como otras manchas.
n= no tan interesante. Normalmente, para AE
frente a B significa que las manchas siguen siendo del mismo tamaño
(más grande que la de MG).
D = significaría abajo, pero no se necesita para
estas manchas.
Las primeras 5 manchas se observaron por primera
vez al comparar AE frente a B, el resto al comparar B frente a MG.
(Tal vez también puede observarse la 115 en el AE frente a B).
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de mancha | B frente a MG | AE frente a B | CC frente a MG | pH | PM |
| 5 | n | U | n | 4,4 | 57 |
| 29 | i | U | i | 6,1 | 42 |
| 31 | n | U | n | 5,7 | 33 |
| 42 | n | U | n | 6,2 | 25 |
| 44 | U | U | U | 5,9 | 27 |
(Continuación)
| Nº de mancha | B frente a MG | AE frente a B | CC frente a MG | pH | PM |
| 33 | U | n | n | ||
| el patrón típico: más grande en B, AE que en MG, CC | |||||
| 61 | U | n | i | 4,4 | 58 |
| 113 | U | n | n | 4,4 | 41 |
| 102 | U | n | n | 5,7 | 51 |
| 109 | U | n | i | 6,0 | 48 |
| 110 | U | n | i | 6,1 | 49 |
| 111 | U | n | i | 6,2 | 50 |
| 112 | U | n | n | 6,3 | 53 |
| 117 | U | n | i | 6,1 | 41 |
| 115 | U | i | U | 6,1 | 39 |
| (aún más grande en AE que en B, pero no excepcional) | |||||
| 113 | U | n | n | 4,4 | 41 |
| 120 | U | n | n | 5,8 | 25 |
| 122 | U | n | n | 5,2 | 17 |
| 123 | U | n | i | 5,0 | 14 |
| 124 | U | n | n | 5,6 | 19 |
| 121 | U | 6,8 | 17 |
La comparación de la mucosa de Barrett con la
gástrica y el esófago normal para los mismos pacientes descritos
anteriormente, identificó unas 15 manchas que se creyeron aumentadas
en la mucosa de Barrett, utilizando geles preparados con enfoque
isoeléctrico (IEF) en la primera dimensión. Todos éstos excepto uno
estuvieron presentes en igual o mayor cantidad en las muestras de
adenocarcinoma esofágico. Se han hecho esfuerzos para identificar
estas mismas manchas de proteína en geles de gradiente de pH
inmovilizado (IPG) utilizando como guías la localización de la
mancha en los de IEF, el color de la mancha utilizando el mismo
protocolo de tinción con plata y si se observó en los IPG una
diferencia similar entre la mucosa de Barrett y el material de
control (esófago normal, mucosa gástrica).
Se identificaron con seguridad nueve de las
manchas. Tenían los números de mancha 113, 109-111
(un grupo de manchas contadas como una única proteína), 117, 118,
120, 122, 123, 124, y 44 (que está entre las manchas notificadas
como que eran mayores en el adenocarcinoma esofágico).
También se identificaron con seguridad las
manchas 61 y 121. Las cuatro manchas (38, 102, 112, 115) de proteína
restantes se identificaron provisionalmente en los IPG.
Este componente del estudio se inició analizando
los patrones de cinco pacientes que parecieron ser los más
excepcionales. Esta es una comparación de la mucosa de Barrett
frente a adenocarcinoma. La comparación llevó a los siguientes
hallazgos:
- Mancha 5
- parece aumentada en AE,
- Mancha 13
- está aumentada en AE, I
- Mancha 25
- está arriba en la mayoría de AE para el que existe un buen patrón de lado básico.
- Mancha 29
- está arriba en AE en la mayoría de pacientes, pero es pequeña y difícil.
- Mancha 30
- está arriba en AE para la mayoría de las muestras.
- Mancha 31
- está justo a la izquierda de la 30, arriba en AE en todos los pacientes excepto uno en el que está abajo.
- Mancha 32
- está arriba en AE en la mayoría de pacientes
- Mancha 33
- está arriba en AE en la mayoría de pacientes
- Mancha 35
- está arriba en AE, pero es difícil. Arriba más claramente en un par de pacientes.
- Mancha 38
- está arriba en AE en todas las muestras. Puede ser PCNA.
- Mancha 40
- está arriba en AE en dos pacientes.
- Mancha 41
- está muy arriba en AE en algunos pacientes. Aunque también aparece en esófago.
- Mancha 42
- está arriba en AE. Un paciente no la muestra.
- Mancha 44
- está arriba en AE en la mayoría de pacientes.
- Mancha 47
- Parece bastante buena.
- Mancha 50
- Está arriba en AE, muy ácida, y difícil.
- Mancha 52
- está arriba en AE en todos excepto en un paciente.
Posteriormente, se revisaron otros geles para las
diferencias de manchas anteriores. Se analizaron todos los geles
pero sólo se tabularon los datos para un subconjunto de los geles
más claros.
La tabla de a continuación sólo muestra un
subconjunto de las manchas anteriores, porque sólo incluye las
mejores diferencias de manchas. Aparecen asteriscos junto a las que,
entre éstas, se consideraron como las más interesantes.
Los símbolos en la tabla significan:
| +,++ | = | aumenta |
| -,- - | = | disminuye, |
| 0 | = | no hay mancha, |
| ? | = | área difícil/difícil de juzgar, |
| "s" | = | pequeña, si es que hay alguna diferencia en el tamaño de la mancha. |
Los pacientes se identifican mediante tres
letras.
| Mancha | Wil | Ray | Har | Sta | Sco | Bal | Ing | Pal | Ben | Rea | Ril |
| P18 | ++ | s | + | + | s | + | s | - | + | + | + |
| NDPK | ++ | s | + | s | s | s | + | - | + | + | + |
| 38= | |||||||||||
| PCNA | ++ | s | s | s | + | s | ++ | + | + | + | + |
| 5* | + | + | s | + | s | s | + | + | + | ? | ++ |
| pequeña pero con frecuencia, diferencia casi cualitativa | |||||||||||
| 13 | - - - | s | + | s | - - | + | + | s | s | + | |
| Parecido a actina. No siempre arriba. | |||||||||||
| 29* | 0 | 0 | s | + | + | 0 | + | 0 | + | ++ | ++ |
| pequeña pero con frecuencia casi cualitativa | |||||||||||
| 31* | ++ | 0 | s | + | + | + | + | ++ | ++ | + | |
| Una mancha buena aunque nunca muy grande | |||||||||||
| 35 | + | 0 | 0 | + | 0 | 0 | ? | ? | ? | + | + |
| Podría ser buena, pero pequeña y difícil | |||||||||||
| 42* | ++ | + | + | ++ | s | ? | + | ++ | ++ | ++ | |
| Buena, a veces grande. Justo encima y a la derecha de la forma "L2" de hsp27 | |||||||||||
| 44* | + | + | s | + | + | s/+ | - | s | + | + | + |
| Buena, a veces grande aunque siempre presente en la mucosa de Barrett. | |||||||||||
| 47 | + | ? | s | + | + | ? | - | + | + | + | ++ |
| Interesante. Una mancha bastante veteada, bastante básico. Difícil, no tan convincente. | |||||||||||
| 50 | ? | 0 | + | + | s | + | s | s | + | + | + |
| PM muy bajo, proteína muy ácida. Borrosa. Quizá en parte en función de una mejor calidad de muestra para | |||||||||||
| las muestras tumorales. | |||||||||||
| 57 | ++ | s | ? | + | + | - | - | + | + + | + | |
| Una mancha de PM muy bajo, a veces grande, pero abajo en algunos. |
Inicialmente se corrieron IPG cargados con ácido
(geles de gradiente de pH inmovilizado) para tres pacientes
(cOO71-80) e IPG cargados con base para tres
pacientes diferentes (cIO25-34) y se analizaron por
separado. Como en experimentos previos, existen muchas diferencias
únicas para cada par de muestras de un individuo, algunas debidas a
cantidades variables de distintas impurezas de la muestra, otras
quizá a alteraciones idiosincrásicas que son verdaderas diferencias
pero que no se comparten entre la mayoría de tumores. Por tanto, la
dificultad está en hallar diferencias compartidas entre la mayoría
de tumores.
La figura 19 muestra 12 manchas que fueron
mayores en los tumores en comparación con mucosas de Barrett en los
geles cargados con ácido, para los que no se conocen las identidades
proteicas. (Las manchas conocidas P18 y NDPKA también aparecieron
mayores en los tumores de estos pacientes). Algunos de estos geles
eran bastante ligeros, de manera que la seguridad en este conjunto
no fue tanta en lo que respecta a los geles cargados con base, ni es
tan grande la Est (etiqueta de secuencia expresada, "expressed
sequence tag") de las manchas candidatas.
La figura 20 muestra un conjunto de manchas
candidatas que se creen mayores en los IPG cargados con base. De
hecho, hubo tantas diferencias que produjo alguna preocupación el
que se hubiera seleccionado un subconjunto especial de pacientes. El
sistema de numeración concuerda con la numeración de manchas en los
geles cargados con ácido de manera que las manchas 15, 18 y 19 son
las mismas manchas tal como se indicaron en la primera figura, sin
embargo no siempre es fácil relacionar las manchas entre los dos
conjuntos de geles cargados en extremos opuestos de la banda de
IPG.
Se realizaron dos nuevos conjuntos de IPG
cargados con base de los que se seleccionaron los tres pares de
patrones mejores (tumor, mucosa de Barrett) con el fin de determinar
qué manchas candidatas mostraron los cambios de mancha más
reproducibles. De esta revisión parecieron haber seis manchas con
las que merecía más la pena continuar con la secuenciación. El que
estas manchas merezcan más la pena que algunas de las otras está
influido en parte por su intensidad en los tumores, ya que ésta se
relaciona con lo fácilmente que podrían purificarse y secuenciarse.
Además, en el caso de las manchas 15 y 51 el hecho de que estas
manchas se identificaran previamente como diferencias interesantes
en los geles de IEF las mantuvo en la lista.
Hay figuras que contienen secciones de geles en
primer plano para tres pacientes de una serie, y dos más de una
segunda serie (condiciones ligeramente diferentes), con la muestra
de Barrett en la izquierda y la muestra de tumor en la derecha.
La mancha 29 (aproximadamente 35 kD) tiene color
rojizo.
La mancha 51 (28 kD) ha sido más grande en
tumores de manera sistemática. En algunas series los tumores han
dado manchas grandes mientras que algunas veces no tan grandes,
sugiriendo que la proteína puede ser difícil de solubilizar.
La mancha 15 (26 kD) ha sido una diferencia muy
sistemática, pero puede ser un reto secuenciarla ya que con
frecuencia la mancha no es muy grande.
La mancha 53 (24 kD) tiene un cierto solapamiento
con otro mancha que puede o no estar relacionada.
La mancha 56 (2OkD) en realidad aparece como un
par de manchas que sí parecen estar relacionadas, ya que sus tamaños
parecen estar correlacionados.
La mancha 57 (1OkD?) es un mancha rojiza, de peso
molecular muy bajo. No se pone de manifiesto muy bien en las dos
parejas de geles de la parte inferior en la figura porque está en el
"frente de colorante", pero la diferencia es evidente en los
mismos geles.
Se sigue que se llevaron a cabo estudios
utilizando dos métodos distintos de separación en la primera
dimensión, concretamente geles de enfoque isoeléctrico (IEF) y geles
de gradiente de pH inmovilizado (IPG). En primer lugar se señalaron
5 manchas (IEF5, IEF15, IEF29, IEF31, IEF51) como las diferencias
más sistemáticas en las muestras de IEF, en las que se buscaron
manchas que estaban ausentes o casi ausentes en tejidos distintos al
adenocarcinoma esofágico (mucosa de Barrett, mucosa gástrica,
esófago normal). Posteriormente, en estudios de IPG, se
identificaron 6 manchas muy interesantes que fueron mayores en las
muestras de adenocarcinoma esofágico (IPG29, IPG56, IPG57, IPG53,
IPG51, IPG15, siendo las dos últimas idénticas a las manchas IEF42 e
IEF 44, respectivamente). Las manchas IEF5, IEF29 e IEF31 se
identificaron provisionalmente en los geles de IPG.
La tabla de a continuación resume qué manchas
aumentaron (en ambos tipos de geles) en el adenocarcinoma esofágico
en comparación con la mucosa de Barrett. "+" indica un aumento
claro, "-" indica sin diferencia, y "?" implica dificultad
en la puntuación de la mancha, normalmente por estar oculta por otro
mancha grande, o en el caso de la mancha IPG57 porque la mancha no
se separó bien del frente de colorante (parte inferior) del gel de
la segunda dimensión.
\newpage
| Paciente | Gel | IPG29 | IPG56 | IPG57 | IPG53 | IPG51 | IPG15 | IEF5 | IEF29 | IEF31 |
| tipo | =IEF42=IEF44 | |||||||||
| 1 Bal | IPG | + | + | + | + | + | - | |||
| IEF | + | + | + | + | - | + | - | - | + | |
| 2 Ben | IPG | + | + | + | - | - | + | |||
| IEF | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 3 Sta | IPG | + | + | + | + | + | + | |||
| IEF | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 4 Rea | IPG | + | + | + | + | + | - | |||
| IEF | + | + | + | + | + | + | ? | + | + | |
| 5 Sco | IPG | + | + | ? | - | + | - | |||
| IEF | - | + | + | - | - | + | - | + | + | |
| 6 Wil | IPG | + | + | + | + | + | + | |||
| IEF | + | + | + | + | + | + | + | - | + | |
| 7 Pal | IPG | - | + | + | - | - | - | |||
| IEF | - | + | + | + | + | - | + | - | + | |
| 8 Har | IPG | + | + | ? | - | + | + | |||
| IEF | + | + | + | - | + | - | - | - | - | |
| 9 Bit | IPG | + | + | + | + | - | + | |||
| IEF | + | + | + | + | - | + | ? | ? | ? | |
| 10 Lab | IPG | + | - | + | + | + | - | |||
| IEF | + | - | + | + | + | - | ? | ? | ? | |
| 11 Duc | IPG | + | + | ? | - | + | + | |||
| IEF | ? | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 12 Ray | IEF | - | - | ? | - | + | + | + | - | - |
| 13 Ril | IEF | + | + | ? | + | + | + | + | + | + |
| Peso | ||||||||||
| molecular | 37 | 19 | 10 | 26 | 25 | 27 | 57 | 42 | 33 | |
| kD | ||||||||||
| pH | 4,7 | 4,3 | 4,6 | 6,4 | 6,2 | 5,9 | 4,4 | 6,1 | 5,7 |
\vskip1.000000\baselineskip
En realidad, la mancha 56 parece como un par de
manchas que sí parecen relacionadas, ya que sus tamaños parecen
estar correlacionados.
Ejemplo
5
Se prepararon geles de proteínas secretadas a
partir de trozos de tejido fresco de dos pacientes nuevos para
esófago normal, mucosa gástrica, y mucosa de Barrett, así como geles
control que separan proteínas en los medios utilizados para cultivar
las células. Estos patrones de "proteínas secretadas" mezcladas
con proteínas del medio (suero) son prometedores. Sin embargo, la
limitación aquí es que el estudio requiere muestras frescas y por
tanto el número de muestras está obligado a ser pequeño. Los
resultados hasta la fecha son que un grupo de manchas numeradas como
109-111, en las que se observó un aumento en la
mucosa de Barrett en relación al esófago normal y la mucosa
gástrica, son bastante grandes en las muestras de "proteínas
secretadas" de Barrett en comparación con las muestras de
control.
Ejemplo
6
Hay un total de al menos unas veinte manchas que
son de interés para la secuenciación y la identificación. Se eluyen
las manchas de los geles y se someten a análisis de secuencia.
Varios de los marcadores potenciales descritos
anteriormente basándose en su un punto isoeléctrico (pI) y peso
molecular estimados, se han caracterizado adicionalmente con
respecto a su secuencia en el extremo N-terminal.
Esta información ha conducido a la identificación de algunas de las
proteínas basándose en su correspondencia con bases de datos de
proteínas o en secuencias novedosas para otras. Los datos se
muestran a continuación.
| 101, | PM 52 kD, pH 5,8 | citoqueratina 8, escindida |
| basándose en la secuencia T?GPRAF??R | ||
| 111 | PM 50 kD, pH 6,2 | albúmina, escindida |
| 109-111 son una serie de manchas relacionadas. 11 identificada como una albúmina escindida basándose en la secuencia | ||
| 120 | PM 25 kD, pH 5,8 | albúmina, escindida |
| también parece ser una albúmina sérica escindida basándose en la secuencia DAHKSEV | ||
| 124, | PM 19 kD, pH 5,6 | posiblemente relacionada con colágeno |
| secuencia XXAPLTATAP. No hay correspondencia en la base de datos pero APLTAT se corresponde con parte de colágeno | ||
| 29(IPG), | PM 37 kD, pH 4,7 | \begin{minipage}[t]{110mm} HS72 o HS7C humana, secuencia escindida de GSTRIPKIQKLLQD, que es HS72 o HS7C humana escindidas\end{minipage} |
| 42, | PM 25 kD, pH 6,2, | proteína de unión a actina ("actin capping protein"), escindida |
| dio la secuencia de QVKGKKNIRATE, que es proteína de unión a actina escindida | ||
| 53(IPG), | PM 26 kD, pH 6,4, | triosa fosfato isomerasa, escindida |
| parece ser triosa fosfato isomerasa basándose en la secuencia GNWKMNQR (y una secuencia menor VGGNWKMN) | ||
| 56(IPG), | PM 19 kD, pH 4,3, | no hay correspondencia para la secuencia |
| dio la secuencia (ASQ)VFV(FG)RM?MK pero nada corresponde con la base de datos y puede ser novedosa | ||
| 14, | PM 50 kD, pH 5,8, | moesina o ezrina |
| secuencia interna de moesina o ezrina basándose en la secuencia de (LHD)-MGNHELYM | ||
| 139, | PM 20 kD, pH 4,4 | precursor 2 del homólogo de beta amiloide (A4) |
| puede ser precursor 2 del homólogo de beta amiloide (A4) escindido basándose en la secuencia MYPELQV(?)D | ||
| 157, | PM 52 kD, pH 4,2, | no hay correspondencia para la secuencia |
| \begin{minipage}[t]{168mm} dio la secuencia K(?)HKGE(?)N(?)LLRAQP(pequeño)EL. No hay correspondencias de la base de datos para esta secuencia\end{minipage} |
| 164-166, | PM 46 kD, pH 4,4, | vimetina, escindida |
| una serie de manchas relacionadas. Parece ser vimetina escindida basándose en la secuencia SSVPGVRLLQ | ||
| 92, | PM 5 kD, pH 5,1 | posiblemente citoqueratina 17 |
| \begin{minipage}[t]{168mm} basándose en el análisis de aminoácidos se pensó que esta era la citoqueratina 17. El análisis de secuencia dio una señal débil de XTXILKFTL y la ck17 tiene una secuencia en el extremo N-terminal TTSIRQFTSS, parte de la cual se alinea\end{minipage} | ||
| 143, | PM 56 kD, pH 5,6, | posiblemente glutatión sintasa |
| \begin{minipage}[t]{168mm} posible glutatión sintasa pero los datos del análisis de aminoácidos no son lo suficientemente sólidos para estar seguros.\end{minipage} |
Ejemplo
7
Las proteínas eluidas a partir de los geles tal
como en el ejemplo 6, o fragmentos peptídicos de las mismas, pueden
utilizarse como inmunógenos para la producción de anticuerpos. Los
anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o pueden ser
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos se producen mediante
métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los fragmentos de
unión a antígeno de los anticuerpos se preparan mediante métodos
conocidos por los expertos en la técnica. Pueden utilizarse
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con afinidad y especificidad
muy altas para pruebas inmunológicas para detectar marcadores de
cáncer esofágico.
Se utilizan anticuerpos o fragmentos de
anticuerpos con afinidad y especificidad muy altas para probar
líquidos corporales para determinar la presencia de las proteínas
anteriormente identificadas. Los líquidos corporales probados pueden
ser sangre o suero, orina, saliva, lágrimas u otros líquidos
corporales. El inmunoensayo puede ser de cualquier tipo conocido por
los expertos en la técnica. El ensayo puede ser homogéneo o
heterogéneo. El ensayo puede utilizarse con máquinas automatizadas,
o puede ser funcional en entornos de menor tecnología.
Una prueba tal proporciona una prueba simple y
rápida que ayuda en el diagnóstico de estas graves enfermedades.
Ejemplo
8
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
producidos en el ejemplo 7 pueden conjugarse con una etiqueta
radiactiva e inyectarse en un paciente. Con técnicas de obtención de
imágenes apropiadas puede localizarse el tumor utilizando el
anticuerpo conjugado radiactivamente. Si aumenta considerablemente
la cantidad de radiactividad unida al anticuerpo, o si el anticuerpo
o fragmento de anticuerpo se conjuga a una toxina, el conjugado
puede utilizarse para destruir células tumorales in vivo. El
anticuerpo o fragmento proporciona la función de selección de
diana, y la toxina o la radiactividad destruye las células
seleccionadas por el anticuerpo como diana.
Ejemplo
9
El gen que corresponde con proteínas específicas
de tumor identificadas mediante el método de la presente invención
puede aislarse e identificarse mediante técnicas conocidas por los
expertos en la técnica. Entonces puede inactivarse el gen mediante
técnicas biológicas moleculares y sustituirse en el cuerpo mediante
terapia génica. Alternativamente, pueden producirse moléculas
antisentido para los genes de los marcadores específicos de tumor, y
pueden utilizarse las moléculas antisentido como agentes
terapéuticos. Mediante cualquiera de los métodos anteriores
conocidos por los expertos en la materia, se reduce la expresión
génica específica de tumor.
Claims (4)
1. Método de diagnóstico o monitorización in
vitro de la evolución de la enfermedad de cáncer esofágico en un
paciente humano que padece un tumor esofágico que comprende un
adenocarcinoma, comprendiendo el método:
a) determinar la cantidad de al menos una
proteína humana que se sobreexpresa en los tumores esofágicos que
comprenden adenocarcinomas, en comparación con tejidos esofágicos
normales, en una muestra del paciente, dando la proteína en
electroforesis en gel 2-D de tejido tumoral
esofágico una secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal
(1) Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys Ile Gln Lys Leu
Leu Gln Asp y un peso molecular en el gel de 37 kD (IPG 29, figura
20);
una secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal:
(2) Gln Val Lys Gly Lys Lys Asn Ile Arg Ala Thr
Glu y un peso molecular en el gel de 25 kD
(IEF 42 = IPG 51, figura 20);
Secuencias de aminoácidos del extremo
N-terminal:
(3a) Gly Asn Trp Lys Met Asn Gln Arg y (3b) Val
Gly Gly Asn Trp Lys Met Asn y un peso molecular en el gel de 26 kD
(IPG 53, figura 20);
o una secuencia de aminoácidos del extremo
N-terminal:
(4) Xaa Val Phe Val Xaa Arg Xaa Met Lys,
en la que Xaa es un aminoácido desconocido o
determinado de manera incompleta, siendo el primer Xaa Ala, Ser o
Gln, siendo el segundo Xaa Phe o Gly y siendo el tercero desconocido
y un peso molecular en el gel de 19 kD (IPG 56, figura 20); y
b) correlacionar la cantidad de proteína con la
presencia o el estadio de la enfermedad.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la
determinación comprende un ensayo inmunológico.
3. Método según la reivindicación 1, en el que la
determinación comprende electroforesis en gel
2-D.
4. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo conjugado
a una proteína definida en la reivindicación 1 con (a) una etiqueta
radiactiva, para su uso en una técnica de obtención de imágenes
in vivo para localizar un tumor en un paciente humano o (b)
una toxina, para su uso en la destrucción de células tumorales en un
paciente.
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