CN115637292B

CN115637292B - 预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法

Info

Publication number: CN115637292B
Application number: CN202211419631.8A
Authority: CN
Inventors: 邢镨元; 谢同济; 李研; 应建明; 李峻岭; 王守正; 杨琳
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-11-14
Filing date: 2022-11-14
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2042-11-14
Also published as: CN115637292A; ZA202305665B

Abstract

本发明公开了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法，所述预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型包括检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量。所述模型的建立方法，包括mRNA的提取和数据处理、连续变量的二分类化、二分类化变量的变量筛选和模型构建。本发明提供的模型对患者小细胞癌转化风险诊断的准确性优于参与模型构建的单个mRNA，且本发明构建的模型有助于对患者进行个性化管理，对于高打分患者即转化风险较大的患者，应当增加耐药监测频次，必要时进行二次活检确认是否发生小细胞转化，从而有效地对临床应用进行指导。

Description

预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法。

背景技术

与传统的化疗相比，以酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）为代表的小分子靶向治疗在驱动基因阳性非小细胞肺癌尤其是肺腺癌（lungadenocarcinoma，LUAD）的治疗中取得了更好的疗效。然而患者在TKI治疗约1年后将不可避免地出现耐药现象。常见的耐药机制包括：驱动基因的二次突变，如表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）基因发生T790M耐药突变；非驱动基因的改变，如MET基因扩增；上皮间质转化；病理类型转化等。其中EGFR突变型LUAD患者向小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）的病理类型转化代表了一种罕见的耐药机制，在EGFR突变型LUAD中发生率约为3-14%。

近年来，已有研究从基因组、表观遗传组及转录组等多个层面对小细胞转化的机制进行探索，但由于这些研究对患者的临床诊断和预后信息探索甚少，故尚无法对临床应用提供指导。因此，建立一个针对小细胞转化风险的预测模型，具有重要意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

根据本发明实施例的第一方面，提供了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型，包括检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量。

根据本发明实施例的第二方面，提供了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险模型的建立方法，包括：

S1、mRNA的提取和数据处理从肺腺癌患者肿瘤样本中提取mRNA，对提取mRNA进行定量和质量检测，并测定提取mRNA的表达量，将获得数据与参考mRNA进行归一处理，备用；

S2、连续变量的二分类化以结合病史和组织学定义的标本类型为金标准，之后以连续的提取mRNA表达量为待测变量，通过ROC法（受试者工作特性曲线）确定待测变量的最佳界值，并根据最佳界值将患者分为低表达组和高表达组，实现连续变量的二分类化；

S3、二分类化变量的变量筛选和模型构建以二分类化的连续变量为自变量，以结合病史和组织学定义的标本类型为因变量进行单因素逻辑回归，筛选提取mRNA中同时满足ROC法和单因素逻辑回归分析具有统计学意义，且在最佳界值分组下两组人数均衡的情况下进行模型构建。

进一步的，所述的提取mRNA为肺腺癌患者肿瘤样本中730个mRNA的表达量。

进一步的，小于或等于最佳界值的为低表达组，大于最佳界值的为高表达组。

进一步的，所述模型构建采用LASSO-Logistic回归以最大限度地降低过拟合。

进一步的，模型构建时，定义高表达为1，低表达为0，所述标本类型中发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为1，未发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为0，采用十折交叉验证确定最小交叉验证误差和最终模型。

进一步的，所述最终模型的得分为二分类mRNA表达与各自系数乘积的总和与截距项之和。

进一步的，所述的建立方法还包括检验独立预测价值，所述检验独立预测价值包括通过构建的模型对每个患者打分，并根据中位值进行风险高低的划分。

进一步的，大于分数中位值的为高风险，小于或等于分数中位值的为低风险。

进一步的，所述检验独立预测价值还包括对患者的年龄、性别和EGFR突变类型进行单因素逻辑回归分析以筛选混杂因素。

进一步的，在进行单因素逻辑回归分析时，将p值小于0.25的变量作为亚组分析因素进行控制变量。

根据本发明实施例的第三方面，提供了一种检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量的试剂在制备预测肺腺癌患者小细胞转化风险的试剂盒中的应用。

进一步的，所述肺腺癌患者小细胞转化风险为EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞癌转化风险。

进一步的，所述试剂盒中包括进行如下计算模型分的说明和/或工具：模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2。

根据本发明实施例的第四方面，提供了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的方法，所述方法不用于诊断用途，所述方法包括检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量；

根据以下公式计算模型分数，模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2；通过模型分数的高低判断风险高低，模型分数大于0.407的为高风险，模型分数小于或等于0.407的为低风险。

与现有技术相比，本发明的优点包括：

本发明设计合成了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型及其建立方法，本发明提供的预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型采用mRNA数据构建了预测EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞转化风险的模型，该模型对患者转化风险诊断的准确性优于参与模型构建的单个mRNA，且经过分层分析显示，模型打分是一个独立的预测因素。本发明构建的模型有助于对患者进行个性化管理，对于高打分患者即转化风险较大的患者，应当增加耐药监测频次，必要时进行二次活检确认是否发生了小细胞转化，从而有效地对临床应用进行指导。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：

图1：示出了实施例1中发生小细胞转化患者的中位转化所需时间；

图2：示出了实施例1中初步筛选的22个mRNA的单因素Logistic分析结果的森林图；

图3a：示出了实施例1中模型构建所用COL6A6的ROC；

图3b：示出了实施例1中模型构建所用CASP12的ROC；

图3c：示出了实施例1中模型构建所用HHIP的ROC；

图3d：示出了实施例1中模型构建所用ZBTB16的ROC；

图3e：示出了实施例1中模型构建所用BIRC3的ROC；

图3f：示出了实施例1中模型构建所用GATA2的ROC；

图4：示出了实施例1中模型打分的ROC；

图5：示出了实施例1中年龄、性别和EGFR突变类型单因素Logistic分析结果的森林图；

图6a：示出了实施例1中年龄≤55岁组分析下模型打分诊断能力的柱状图；

图6b：示出了实施例1中年龄＞55岁组分析下模型打分诊断能力的柱状图；

图6c：示出了实施例1中EGFR基因19外显子缺失突变类型分析下模型打分诊断能力的柱状图；

图6d：示出了实施例1中EGFR基因21外显子L858R突变类型分析下模型打分诊断能力的柱状图。

具体实施方式

鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例的一个方面提供了一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型，包括检测肺腺癌患者肿瘤样本的COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量。

S1、mRNA的提取和数据处理使用RNeasy FFPE Kit（Qiagen, CA, USA）提取FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）标本的mRNA，由Qubit 3.0 Fluorometer （Thermo FisherScientific, Carlsbad, CA, USA）进行定量，采用2100 Bioanalyzer（Agilent, CA, USA）检测mRNA片段和质量。由nCounter FLEX分析系统（NanoString, Seattle, WA, USA）共计测定“Nanostring nCounter Pancancer Pathway”中730个mRNA的表达量。通过NanoString的nSolver 4.0将分析产生的原始计数与参考mRNA进行归一。

S2、连续变量的二分类化以结合病史和组织学定义的标本类型为金标准，之后以连续的提取mRNA表达量为待测变量，通过ROC法确定待测变量的最佳界值，并根据最佳界值将患者分为低表达组和高表达组，其中，小于或等于最佳界值的为低表达组，大于最佳界值的为高表达组；在本发明实施例中，所述以结合病史和组织学定义的标本类型为发生小细胞转化患者的腺癌标本、未发生小细胞转化患者的腺癌标本。所述最佳界值为约登指数最大处。

S3、二分类化变量的变量筛选和模型构建

以730个二分类化的mRNA为自变量，以标本类型为因变量进行单因素逻辑回归，筛选730个mRNA中同时满足ROC法和单因素逻辑回归分析具有统计学意义，且在最佳界值分组下两组人数均衡的二分类化mRNA进行模型构建。

优选的，所述模型构建采用LASSO-Logistic回归以最大限度地降低过拟合。

优选的，模型构建时，定义高表达为1，低表达为0，发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为1，未发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为0，采用十折交叉验证确定最小交叉验证误差和最终模型。

优选的，所述最终模型的得分为二分类mRNA表达与各自系数乘积的总和与截距项之和。

优选的，所述的建立方法还包括检验独立预测价值，所述检验独立预测价值包括通过构建的模型对每个患者打分，并根据中位值进行风险高低的划分；其中，大于分数中位值的为高风险，小于或等于分数中位值的低风险。

优选的，所述检验独立预测价值还包括对患者的年龄、性别和EGFR突变类型进行单因素逻辑回归分析以筛选混杂因素。

优选的，在进行单因素逻辑回归分析时，将p值小于0.25的变量作为亚组分析因素进行控制变量。

根据本发明实施例的第三方面，提供了一种检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量的试剂在制备预测肺腺癌患者小细胞转化风险的试剂盒中的应用。所述肺腺癌患者小细胞转化风险为EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞癌转化风险。

优选的，所述试剂盒中包括进行如下计算模型分的说明和/或工具：模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2。

以下集合若干典型实施例及附图对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：

步骤1：标本采集和临床信息收集回顾性收集2011年1月1日至2022年5月31日在中国医学科学院肿瘤医院就诊并接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞转化EGFR基因敏感突变阳性晚期肺腺癌患者31例，其中具有肺腺癌时期的FFPE标本18例。纳入收集标准为：1）通过聚合酶链反应（PCR）或二代测序（NGS）诊断组织学或细胞学证实的伴有敏感EGFR突变的晚期肺腺癌患者；2）接受EGFR-TKIs作为一线或后线治疗；3）基于高质量的肿瘤活检或保存良好的细胞学标本诊断为小细胞转化；4）具有肺腺癌时期的FFPE标本（此标准不适用于中位小细胞转化时间的计算）。排除标准为：1）既往诊断为神经内分泌肿瘤；2）无法获取临床资料；3）FFPE样本提取得到的mRNA质量低。

同时，本实施例纳入接受EGFR-TKI治疗后未发生小细胞转化EGFR基因敏感突变阳性晚期肺腺癌患者12例，用以建立模型。纳入标准为：1）通过PCR或NGS诊断组织学或细胞学证实的伴有敏感EGFR突变的晚期肺腺癌患者；2）接受EGFR-TKIs作为一线或后线治疗；3）晚期一线治疗开始至死亡或末次随访日期的时间间隔超过EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞转化所需时间中位值（以下简称：中位小细胞转化所需时间）；4）晚期接受EGFR-TKI治疗后至少进行1次组织学或细胞学检测，且未发现小细胞转化；5）具有肺腺癌的FFPE标本。排除标准为:1）既往诊断为神经内分泌肿瘤；2）无法获取临床资料；3）FFPE样本提取得到的mRNA质量低。

本实施例经中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准(批准号:21/243-2914)。

本实施例定义年龄为从出生到首次接受一线治疗的时间，并将患者按照55岁的年龄分为年轻和年长。本实施例定义小细胞转化所需时间为自EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者接受晚期一线治疗开始至发生小细胞转化的时间间隔，中位小细胞转化所需时间由Kaplan-Meier（KM）法确定。图1显示了发生小细胞转化患者的中位转化所需时间为27.5个月。本实施例的末次随访日期为2022年6月27日。

步骤2：mRNA的提取和数据处理使用RNeasy FFPE Kit（Qiagen, CA, USA）提取FFPE标本的mRNA，由Qubit 3.0 Fluorometer （Thermo Fisher Scientific, Carlsbad,CA, USA）进行定量，采用2100 Bioanalyzer（Agilent, CA, USA）检测mRNA片段和质量。由nCounter FLEX分析系统（NanoString, Seattle, WA, USA）共计测定“NanostringnCounter Pancancer Pathway”中730个mRNA的表达量。通过NanoString的nSolver 4.0将分析产生的原始计数与参考mRNA进行归一。

步骤3：连续变量的二分类化、变量筛选和模型构建

以结合病史和组织学定义的标本类型为金标准，本实施例中的标本类型为发生小细胞转化患者的腺癌标本、未发生小细胞转化患者的腺癌标本，以连续的mRNA表达为待测变量，使用ROC法确定730个mRNA各自的最佳界值，其中，约登指数最大处为界值点，根据最佳界值将患者分为低表达组（小于或等于最佳界值）和高表达组（大于最佳界值）。以730个二分类化的mRNA为自变量，以标本类型（发生小细胞转化患者的腺癌标本/未发生小细胞转化患者的腺癌标本）为因变量进行单因素Logistic回归。筛选730个mRNA中同时满足ROC法和单因素Logistic分析具有统计学意义（p值小于0.05），且在最佳界值分组下两组人数较为均衡的进行模型构建。图2显示了初步筛选的22个有统计学意义（p值小于0.05）mRNA的单因素Logistic分析结果的森林图，可见包括COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3、GATA2在内的17个mRNA是转化标本判断的负向因素（即低表达判定为转化标本，比值比小于1）；而包括CHEK2在内的5个mRNA是转化标本判断的正向因素（即高表达判定为转化标本，比值比大于1）。模型构建采用LASSO-Logistic回归以最大限度地降低过拟合。模型构建时，以筛选mRNA二分类表达为自变量（高表达定义为1，低表达定义为0），以标本类型（发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为1，未发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为0）为因变量。采用十折交叉验证确定最小交叉验证误差和最终模型。模型得分（即风险分数）为二分类mRNA表达与各自系数乘积的总和与截距项之和。模型表达式为：模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2。

步骤4：模型分数预后判断作用的有效性图3a-图3f显示了模型构建所用mRNA的ROC。根据上述构模型构建型对每个患者进行打分，并根据ROC法进行风险高低的划分，模型分数大于0.407的为高风险，模型分数小于或等于0.407的为低风险。图4显示了模型打分的ROC，曲线下面积为0.984，在最佳界值下仅有一例误判（假阳性率=100%-91.67%=8.33%），而不存在漏判（假阴性率=100%-100%=0）。对比图3中模型构建所用mRNA与模型打分的ROC曲线下面积，可以发现，模型打分的诊断准确性（0.984，见图4）大于各mRNA（0.741、0.769、0.796、0.810、0.861、0.866）。此外，本实施例还对模型打分预测价值的独立性进行判断，由于模型打分的假阴性率为0，预测准确性高，因此缺乏模型打分漏判的个案会造成Logistic回归系数不收敛，即不适合把模型打分纳入Logistic回归进行独立性分析，故本例首先对模型打分以外的变量进行单因素分析，之后使用分层分析的方法验证模型打分的独立预测价值。图5显示了年龄、性别和EGFR突变类型单因素Logistic分析结果的森林图，可见年龄（p=0.106）和EGFR突变类型（p=0.221）为潜在混杂因素（p值小于0.25）。分别以年龄（≤55岁和＞55岁）和EGFR突变类型作为分层因素，所述EGFR突变类型包括19外显子缺失突变【19del】和21外显子L858R突变【21L858R】。计算模型打分对标本类型的区分能力，结果如图6所示：模型打分在不同年龄组对标本类型的区分均具有统计学意义（≤55岁组p=0.003；＞55岁组p<0.001），在不同EGFR突变类型组对标本类型的区分亦均具有统计学意义（19del组p=0.001；21L858R组p=0.002）。可见模型打分可以在年龄分层或EGFR突变类型分层下仍具有预测EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞转化的风险的价值。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1. 一种预测肺腺癌患者小细胞转化风险模型的建立方法，其特征在于，包括：

S1、mRNA的提取和数据处理

从肺腺癌患者肿瘤样本中提取mRNA，对提取mRNA进行定量和质量检测，并测定提取mRNA的表达量，将获得数据与参考mRNA进行归一处理，备用；

S2、连续变量的二分类化

以结合病史和组织学定义的标本类型为金标准，之后以连续的提取mRNA表达量为待测变量，通过ROC法确定待测变量的最佳界值，并根据最佳界值将患者分为低表达组和高表达组，实现连续变量的二分类化；

S3、二分类化变量的变量筛选和模型构建

以二分类化的连续变量为自变量，以结合病史和组织学定义的标本类型为因变量进行单因素逻辑回归，筛选提取mRNA中同时满足ROC法和单因素逻辑回归分析具有统计学意义，且在最佳界值分组下两组人数均衡的二分类化的连续变量进行模型构建；所述模型用于检测腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量；所述预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型表达式为：模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2。

2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：所述的提取mRNA为肺腺癌患者肿瘤样本中730个mRNA的表达量。

3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：模型构建时，定义高表达为1，低表达为0，所述标本类型中发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为1，未发生小细胞转化患者的腺癌标本定义为0，采用十折交叉验证确定最小交叉验证误差和最终模型。

4.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于：所述最终模型的得分为二分类mRNA表达与各自系数乘积的总和与截距项之和。

5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于：还包括检验独立预测价值，所述检验独立预测价值包括通过构建的模型对每个患者打分，并根据中位值进行风险高低的划分。

6.根据权利要求5所述的建立方法，其特征在于：所述检验独立预测价值还包括对患者的年龄、性别和EGFR突变类型进行单因素逻辑回归分析以筛选混杂因素。

7.一种检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量的试剂在制备预测肺腺癌患者小细胞转化风险的试剂盒中的应用，所述预测肺腺癌患者小细胞转化风险基于权利要求1-6任一项所述的预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型的建立方法实现，其特征在于：所述预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型表达式为：模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述肺腺癌患者小细胞转化风险为EGFR基因敏感突变阳性肺腺癌患者在接受EGFR-TKI治疗后发生小细胞癌转化风险。

9.预测肺腺癌患者小细胞转化风险的方法，所述方法不用于诊断用途，其特征在于：所述方法包括检测肺腺癌患者肿瘤样本中COL6A6、CASP12、HHIP、ZBTB16、BIRC3和GATA2的mRNA表达量；

根据以下公式计算模型分数，模型分数=2.793-0.047×COL6A6-0.057×CASP12-0.368×HHIP-0.636×ZBTB16-1.453×BIRC3-1.886×GATA2；通过模型分数的高低判断风险高低，模型分数大于0.407的为高风险，模型分数小于或等于0.407的为低风险，所述模型基于权利要求1-6任一项所述的预测肺腺癌患者小细胞转化风险的模型的建立方法实现。