JPH04503307A

JPH04503307A - ヒト腫瘍に関連する新規抗原に対する新規モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH04503307A
Application number: JP2503697A
Authority: JP
Inventors: ヘルストロム　カルル　エリック; ヘルストロム　インゲガルド; マルカルト　ハンス; ヨネヤマ　ヨシタカ
Original assignee: オンコーゲン
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1990-01-23
Publication date: 1992-06-18
Also published as: DE69028388D1; ATE142108T1; GR900100121A; NZ232554A; EP0458878B1; AU629617B2; DK0458878T3; WO1990009197A1; AU5150890A; NO913211D0; FI913891A0; IL93156A; EP0458878A1; EP0458878A4; KR910700077A; GR1000454B; IL93156A0; US5134075A; PT93167B; PT93167A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍に関連する新規抗原に対する新規モノクローナル抗体発明の分野本発明は新規モノクローナル抗体及び新規抗原、並びにヒト癌細胞と反応性の前記新規モノクローナル抗体を製造及び使用する方法に関するものである。より詳しくは本発明のモノクローナル抗体は胸部、結腸、卵巣及び肺の癌並びに黒色腫及び肉腫を含む種々のヒト腫瘍に関連する新規細胞表面抗原と反応性である。

本発明のモノクローナル抗体は生体内及び試験管内両方の臨床診断目的例えば悪性癌の検出に適する。さらに、本発明の抗体は治療的使用に、例えば腫瘍細胞との反応に、並びに接合体において化学療法薬、毒素、免疫学的応答修飾因子及び放射性同位体を含み、しかしそれらに限定されない抗腫瘍効果を有する種々の物質の標的選択性担体として適する。本発明の抗原もまた治療及び診断のために有用である。

発明の背景癌は毎年数百万人の死亡の原因である。例えば、肺癌は男性間の癌をもとにする死亡の大部分の原因であり、女性の間の癌死の最もよくある原因としての乳癌を追い越しつ〜ある。多くの場合の癌は疾患の初期段階において根本的に除去されないと化学療法及び放射線療法により治癒されない。従って、胸部、結腸、卵巣及び肺の癌、並びに他の悪性新生物例えば黒色腫及び肉腫に対する診断及び治療の方法に対しより大きい要求が存在する。

癌関連抗原と反応性のモノクローナル抗体が知られている〔例えばパプシデＯ（Ｐａｐｓｉｄｅｒｏ）、Ｓｅｍ１ｎ、　Ｓｕｒｇ、　０ｎｃｏ１．、１　（４）　：１７１〜８１　（１９８５）；シ、ｏム（Ｓｃｈｌｏｍ）ほか、ＩｍｐｏｒｔａｎｔＡｃｌｖ、　０ｎｃｏ１．、１７０〜９２　（１９８５）　；アラム（Ａｌｌｕｍ）ほか、Ｓｕｒｇ、Ａｎｎ、、１８：４１〜６４　（１９８６）；ホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）ほか、Ｓｅｍ１ｎ、　０ｎｃｏ１．、１３　（２）　：　１６５〜７９（１９８６）　；　ｒ癌におけるモノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ）　Ｊ　：　ｒ診断及び治療の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓｆｏｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）Ｊ　、Ｏス（Ｒｏｔｈ）編、フーツラ・パブリッシング（Ｆｕｔｕｒａ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、　Ｍｔ、　Ｋ１５ｃｏ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９８６）、及び「モノクローナル抗体を用いる試験管内癌診断（Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｊｔｒｏ　Ｕｓｉｎｇ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ、クプチク（Ｋｕｐｃｈｉｋ）編、マーセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ。

Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（１９８Ｂ　）参照〕。

既知モノクローナル抗体の大部分は若干の型のヒト癌と反応性であるが、少数の抗体は身体の特定器官例えば膝、胸部、卵巣、結腸、胃又は膵臓に由来する癌と反応する。標的抗原は通常糖タンパク質又は糖脂質である〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４６　：３９１７〜２３　（１９８６）　；及びフィフク（Ｐｉｎｋ）ほか、Ｐｒｏｇ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　９　：　ｌ　２１〜３３（１９８４）参照〕。例えば、特定型の癌腫上の糖タンパク質抗原と反応性のモノクローナル抗体には米国特許第４．７３７．５７９号（非小細胞肺癌に対するモノクローナル抗体）、米国特許第４、７５３．８９４号（ヒト乳癌に対するモノクローナル抗体）、米国特許第４．５７９．８２７号（ヒト胃腸癌に対するモノクローナル抗体）、及び米国特許第４．７１３．３５２号（ヒト腎臓癌に対するモノクローナル抗体）が含まれる。若干のモノクローナル抗体はムチンであると思われる高分子量抗原と反応する。例えばモノクローナル抗体Ｂ７２．３は多くの異なる癌上に選択的に発現される１、０００ｋｄ以上の分子量の腫瘍関連胎児腫瘍性糖タンパク質抗原を認識すると思われる。例えば、８７２．３は乳癌の８４％、結腸癌の９４％、卵巣癌の１００％及び非小細胞肺癌の９６％と反応することが示された〔ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ）　、Ａｃｔａ　Ｃｙｔｏｌ、、　１　（５）　：　５３７〜５６　（１９８７）及びシ、ｏム（Ｓｃｈｌｏｍ）ほかに対し発行された米国特許第４．６１２．２８２号参照〕。同様に、モノクローナル抗体ＫＣ−４は多くの癌例えば結腸、前立腺、肺及び乳癌上に発現された約４００〜５００ｋｄタンパク質抗原を認識する（米国特許第４．７０８．９３０号参照）。

一定の腫瘍細胞に関連すると思われる糖脂質抗原と反応性のモノクローナル抗体もまた開示された。例えば、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ほか、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１５０　：１００８〜１９　（１９７９）はアシアロＧＭ２　、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）マウス肉腫ウィルスにより形質転化されたＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞に対するマーカーとして決定された細胞表面グリコスフィンゴリピド抗原、に特異的な２つのモノクローナル抗体の生成を開示している。また二−プ（Ｋｎｉｅｐ）ほか、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１３１　（３）　：　１５９１〜９４（１９８３）及び米国特許第４．５０７．３９１号（ヒト黒色腫に対するモノクローナル抗体）参照。

さらに、特定型の癌細胞上に認められた糖脂質抗原と反応性のモノクローナル抗体には、ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４４：２０５２〜６１　（１９８４）（ヒト小細胞肺癌に対するモノクローナル抗体）；バルキ（Ｖａｒｋｉ）ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４４　：６８１〜８７　（１９８４）　（肺、胃及び結腸のヒト腺癌並びに黒色腫に対するモノクローナル抗体）、及び米国特許第４．５７９．８２７号（ヒト結腸腺癌に対するモノクローナル抗体）により開示されたものが含まれる。また、ヒト非小細胞肺癌、乳癌及び結腸癌の表面上に発現された炭水化物抗原を認識するＬ６モノクローナル抗体を記載するヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８３　：　７０５９〜６３　（１９８６）参照。

種々の腫瘍細胞上に認められる抗原に対する反応性を示す他のモノクローナル抗体が非常に要求されている。これは診断及び治療において、同じ腫瘍塊に向かう異なるモノクローナル抗体の組合せの使用をしばしば必要にする多くの腫瘍の抗原異質性のためである。さらに、広範囲の腫瘍と高度の反応性を示し、一方、正常組織と反応性がないか又は単に非常に弱い反応性を示すモノクローナル抗体は一般的でない。そのような抗体は明らかに有益であろう。

従って、種々の腫瘍により高レベルで発現される抗原と反応性のモノクローナル抗体が癌の早期診断、癌の広がりの良好な限定、癌患者の免疫学的モニター、並びに癌の治療のための改良法の開発に対し有用になることができることが明らかである。新規細胞表面分子に対するモノクローナル抗体を、癌ワクチンの形態における免疫原の調製に有用であることができ、また例えばホルモン又は成長因子のレセプターとしであるいは細胞内及び細胞間伝播中に含まれる他の分子として重要な細胞機能を有することができる分子をさらに限定するために使用できる。

抗原は独力で酵素又は成長因子活性を有することさえできる。

発明の概要本発明は肺、胸部、卵巣及び結腸癌並びに黒色腫及び肉腫細胞を含む種々のヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面糖タンパク質抗原、Ｌ４５抗原、Ｌの決定基部位に対し特異的であるモノクローナル抗体、Ｌ４５、を提供する。例えば、本発明の抗体は抗体Ｌ４５により確認されるＬ４５抗原を発現する腫瘍の診断及び治療に有用であることができる。本発明のＬ４５抗体はクラスＩｇＧ、１ｇ０２ａサブクラスであり、正常ヒト細胞と有意な反応性を示さない。

本発明の抗体はヒト肺臓組織及び他のヒト組織中の悪性状態の存在を測定する試験管内診断法に使用できる。該方法は抗体Ｌ４５と反応性のｔｏｏ、　ｏｏｏダルトンＬ４５抗原糖タンパク質の特性を有する抗原の存在に対する組織の試験を含む。例えば、Ｌ４５抗原の特性を有する細胞関連抗原の決定基部位を限定する本発明のＬ４５モノクローナル抗体、この抗体の官能性等価物又はフラグメントに組織を接触させ、前記抗体と抗原決定基との相互作用を検出することができる。そのような方法の１つは癌細胞を含む疑いのある試料中のそのような細胞の存在の決定を含む。試料は、そのような細胞を試料中に存在できる他の細胞型から区別できるモノクローナル抗体に接触させる。接触はそのような細胞に抗体が結合する条件のもとで行なわれる。接触後、試料中の細胞に対する抗体の結合の存在又は存在しないことが決定される。この結合は試料中の癌細胞の存在又は存在しないことに関連する。一般に、試料はモノクローナル抗体の標識された特異結合パートナ−に接触させる。この標識は検出可能なシグナルを生ずることができる。

あるいはモノクローナル抗体自体を標識することができる。

発明の精製抗体又は抗体フラグメントを患者に投与することによる腫瘍の生体内位置決定を含む。位置決定は次いで外部シンチグラフィー、発光断層撮影法又は放射性核スキャンを用いて検出される。この方法はまた疾患の程度に関する癌患者の段階化及び治療に応答した変化をモニターする一層良い方法を与えることができる。

本発明はまた、Ｌ４５抗体及び類似の抗体が腫瘍細胞表面に高濃度に発現されるＬ４５抗原と反応できるので、治療用途を有する。本発明のモノクローナル抗体は腫瘍の治療用組成物の製造に使用できる。その組成物は治療的に有効な量の抗体を薬学的に許容できる非経口賦形剤に関連して含む。本発明の抗体はまた、化学療法薬、毒素、免疫学的応答修飾因子及び放射性同位体を含み、しかしそれらに限定されない抗腫瘍効果を有する種々の物質の担体として免疫接合体中に使用できる。

本発明はまた、約１００．０００ダルトンの分子量により確認され、アミノ末端アミノ酸配列：５−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−１−１−［−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｎ− Ｌ−Ｍ−Ｆ（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）を有する新規Ｌ４５抗原、並びに抗体Ｌ４５及びこの抗原に結合するクラスの抗体により確認される等価物を含む。

本発明は精製又はクローン化したＬ４５抗原をワクチンとして一定の腫瘍に対する免疫処置に使用する方法を含む。

発明の詳細な説明記載した発明をより完全に理解できるために、次の詳細な説明が示される。

本発明は、肺、結腸、胸部、卵巣の癌、並びに黒色腫及び肉腫細胞を含むヒト腫瘍細胞上に局在する抗原（Ｌ４５抗原）と特異的に反応性である、Ｌ４５と称される新規モノクローナル抗体、Ｌ４５モノクローナル抗体を製造する方法、並びに該抗体を用いる診断及び治療法に関するものである。Ｌ４５抗体は一連の腫瘍と反応するが、正常ヒト組織又は他の型の腫瘍例えばリンパ腫と実質的に反応性を示さない。

本発明はさらに、肺、胸部、結腸、卵巣のヒト腫瘍、並びに黒色腫及び肉腫に関連するＬ４５抗原と称する新規細胞表面積タンパク質抗原並びにＬ４５抗原を使用する方法に関する。

本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ融合法により又はＥＢＶ−不死化法を用いる方法により製造できる。

ハイブリドーマ融合法は初めにコーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ）により導入された〔コーラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜９７　（１９７５）　；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　ｌ　２７　（３）　：　５３９〜４６（１９８１）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５５：４９８０〜８３　（１９８０）；イー（Ｙｅｈ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、７６　（６）：２９２７〜３１　（１９７６）；及びイー（Ｙｅｈ）ほか、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：　２６９〜７５（１９８２）参照〕。

これらの方法は動物（例えばマウス）中へ免疫原（例えば精製抗原あるいは抗原をもつ細胞又は細胞抽出物）を注入してその動物中の所望免疫応答（すなわち抗体の生成）を誘発させることを含む。例えば膨水からのヒト肺癌細胞、外植ヒト非小細肺癌（ＮＳＣＬＣ）からの培養細胞、又は正常胎児肺臓からの細胞、あるいはそのような細胞からの溶解物を免疫原として使用できる。

例示例において、Ｎ５ＣＬＣ（ヒト肺腺癌）、系統ＣＨ３、からの外植細胞を免疫原として使用した。細胞は例えばマウス中へ注入し、十分な時間後にマウスをと殺し、体性抗体産生リンパ球を得る。抗体産生細胞は感作動物のリンパ節、肺臓及び末梢血から得ることができる。牌細胞が好ましい。マウスリンパ球は後記マウス骨髄腫で高率の安定融合を与える。ラット、ウサギ及びカエル体細胞の使用もまた可能である。所望免疫グロブリンをエンコードする牌細胞染色体は、牌細胞を骨髄腫細胞と、一般に融合剤例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に融合させることにより不死化される。多くの骨髄腫細胞系、例えばＰ３ −ＮＳｌ／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ３．６５３又は５ｐ２１０−Ａｇ１４骨髄腫系、のいずれも標準法による融合パートナ−として使用できる。これらの骨髄腫系はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ　ＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手できる。

得られた所望ハイブリドーマを含む細胞は次いで、非融合親骨髄腫又はリンパ球細胞が実質的に死ぬ選択性培地例えばＨＡＴ培地中で増殖される。ハイブリドーマ細胞のみが生存し、限界希釈条件のもとで増殖されて分離したクローンを得ることができる。

ハイブリドーマの上澄みを所望特異性の抗体の存在について、例えば免疫処置に用いた抗原を用いて免疫検定法によりスクリーニングする。次いで陽性クローンを限定希釈条件のもとてサブクローン化することができ、生じたモノクローナル抗体を分離することができる。種々の普通の方法がモノクローナル抗体の分離及び精製に対して存在し、それから他のタンパク質及び不純物が除かれる。モノクローナル抗体の精製に普通に使用される方法には硫酸アンモニウム沈降法、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれる〔例えばシラ（Ｚｏｌａ）ほか、「モノクローナルハイブリドーマ抗体：方法及び適用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｆｂｉｏｔｉｃｓ　：　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　、ヒュレル（Ｈｕｒｅｌｌ）編、ｐｐ５１〜５２　（ＣＲＣ・プレス、１９８２）参照〕。これらの方法により製造された／）イブリドーマは試験管内又は生体内（腹水中）で、該技術において知られた方法を用いて増殖させることができる〔一般に、フィフク（Ｐｉｎｋ）ほか、前掲、１２３頁、図６−１参照〕。

一般に、個々の細胞系は試験管内で、例えば実験室培養容器中で増殖でき、高濃度の単一特異性モノクローナル抗体を含む培地をデカンテーション、濾過又は遠心分離により収集することができる。あるいは、モノクローナル抗体の収量は、初めの融合に体性及び骨髄腫細胞を与えるために用いた型の組織適合性動物中ヘハイブリドーマの試料を注入することより高めることができる。

融合細胞ハイブリッドにより生成される特異モノクローナル抗体を分泌する腫瘍が注入動物中に生ずる。動物の体液例えば腹水又は血清がモノクローナル抗体を高濃度で与える。コール（Ｃｏｌｅ）ほか、前掲、により論議されたように、ヒトハイブリドーマ又はＥＢＶ−ハイブリドーマを使用するとき、動物例えばマウス中へ注入される異種移植片の拒絶反応を回避することが必要である。

免疫不全又はヌードマウスを使用でき、あるいはハイブリドーマを初めに照射ヌードマウス中へ固形皮下腫瘍として継代し、試験管中で培養し、次いで多量の特異ヒトモノクローナル抗体を分泌する腹水腫瘍を生ずるブリスタン感作、照射ヌードマウス中へ腹腔内注入することができる〔コール（Ｃｏｌｅ）ほか、前掲、参照〕。

一定の治療適用に対し、マウス抗体で治療した患者がヒト抗マウス抗体を生ずるので、キメラ（マウス−ヒト）又はヒトモノクローナル抗体がマウス抗体より好ましいであろう　〔ショーラー（Ｓｈａｗｌｅｒ）ほか、Ｊ、Ｉｍｍｕｎａｌ、、　ｌ　３５　：　ｌ　５３０〜３５　（１９８５）　）。

Ｌ４５抗原と反応性のキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体は、例えばキメラ抗体の製造のために最近開発された方法により製造することができる〔オイ（Ｏｌ）ほか、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　４　（３）：２１４〜２２１　（１９８６）；リウ（Ｌｉｕ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８４　：３４３９〜４３　（１９８７））、従って、マウスＬ４５抗体分子の不変部領域をコードする遺伝子が、適当な生物学的活性（例えばヒト補体の活性化及びＡＤＣＣを仲介する能力）をもつ抗体の不変部領域をコードするヒト遺伝子で置換される。マウス又はヒト超厚の新規抗体はまた適当な生物学的機能をもつＬ４５抗原に対して作ることができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、抗原例えば本発明のＬ４５抗原を用い、ボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）ほか（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）、８５：３９９５〜９９（１９８８））により記載されたように、試験管内でヒトリンパ球を抗原に感作させ、次いでＥＢＶ形質転換又は抗原感作リンパ球とヒトリンパ球とのハイブリドーマ形成することにより作ることができる。

好ましい態様によれば、Ｌ４５と称される本発明の抗体が、実施例中に記載するように、肺腺癌細胞系ＣＨ３を免疫原として用いてハイブリドーマ法により製造された。Ｌ４５抗体を生ずるＬ４５ハイブリドーマはＡ　Ｔ　ＣＣ、Ｒｏｃｋｖｊ　Ｊｌｅ、　Ｍａｒｒｙｌａｎｄに寄託され、そこで次のように確認された：Ｌ４５　受託番号：ＨＢ９８０４Ｌ４５抗体はＩｇＧ２ａサブクラスである。該抗体は種々の型の腫瘍細胞例えば胸部、肺、結腸及び卵巣の癌と、並びに悪性黒色腫及び肉腫と非常に強い反応性を示す。Ｌ４５抗体は細胞リンパ腫細胞系、ＣＥＭ、ＭＯＬＴ−４及びＢ細胞リンパ腫系Ｐ３ＨＲ−１に対し検出可能な結合を示さない。

さらに、本発明の抗体は、主要器官例えば腎臓、肺臓、肝臓、皮膚、肺臓、胸部、結腸、脳、甲状腺、心臓、リンパ節又は卵巣の腺維芽細胞、内皮細胞又は上皮細胞のような正常なヒト組織に対し免疫組織学的に検出可能な結合を示さない。

また該抗体は末梢血白血球と反応しない。従ってこの抗体はその一連の腫瘍細胞に対する特異性及びその正常細胞に比べて腫瘍細胞に対する高度の特異性において多くの既知抗腫瘍抗体より優れている〔例えばヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、「診断及び治療における共有結合的に修飾された抗原及び抗体（ＣｏｖａｌｅｎｔＪｙ　Ｍｏｄｉｆｊｅｄ　ＡｎｔｉｇｅｎｓＡｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　Ａｎｄ　ＴｈｅｒａｐＹ）Ｊ　、クアシュ（Ｑｕａｓｈ）／ロドウエル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）　（編）、ｐｐ２４〜２８、マルセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、）、（１９８９）、及びバグショウ（Ｂａｇｓｈａｗｅ）　、Ｏｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　４８　：１６７〜７５　（１９８３）参照〕。

本発明が前記Ｌ４５抗体及び該抗体の活性結合領域を含むそのフラグメント例えばＦａｂ　、　Ｆ（ａｂ’　）！及びＦ、フラグメントを包含することを理解すべきである。そのようなフラグメントは該技術において十分確立された技術を用いてＬ４５抗体から製造することができる〔例えば、ルソークス（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ）ほか、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、ｌ　２１　：　６６３〜６９、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、（１９８６）参照〕。

さらに、本発明はＬ４５と同じ抗原決定基に結合でき、その部位における結合に対してＬ４５抗体と拮抗できる抗体を包含する。

これにはＬ４５抗体と同様の抗原特異性を有し、しかし種超厚、イソタイプ、結合親和力又は生物学的機能（例えば細胞毒性）において異なる抗体を含む。例えば、本発明の抗体のクラス、イソタイプ及び他の変異体は該技術において知られた組換えクラス−スイッチ及び融合技術を用いて構築することができる〔例えば、サンマナ（Ｔｈａｍｍａｎａ）ほか、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、ｌ　３　：　６１４（１９８３）、スビラ（Ｓｐｉｒａ）ほか、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、、　７４　：３０７〜１５　（１９８４）；ノイバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ほか、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜０８　（１９８４）；及びオイ（Ｏｌ）ほか、前掲、参照〕。従って、Ｌ４５抗体と同じ結合特異性を有するキメラ抗体又は他の組換え抗体（例えば、リンホカインのような第ｉタンパク質に融合した抗体）は本発明の範囲内に属する。

さらに、本発明の抗体が結合するＬ４５抗原が新規汎腫瘍抗原であるので、本発明の抗体は、Ｌ４５抗体が反応するもの以外の決定基を含め、Ｌ４５抗原上の抗原決定基に結合する抗体を包含する。

本発明の範囲内にはまた本発明のＬ４５抗体の抗イデイオタイプ抗体が含まれる。これらの抗イデイオタイプ抗体はＬ４５抗体を免疫原として用いて製造することができ、腫瘍に対する体液性応答の検出において、及び患者内に抗腫瘍応答を誘発させる治療適用において、例えばワクチン中に、有用であることができる〔例えば、ネポム（Ｎｅｐｏｍ）ほか、Ｃａｎｃｅｒ　Ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　。

６：４８７〜５０１　（１９８７）；及びリー（Ｌｅｅ）ほか、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　、８２：　６２８６〜９０　（１９８５）参照〕。

Ｌ４５抗体は、それが結合するＬ４５抗原の分離及び確認に使用できる。例えば、Ｌ４５はプローブとして使用して抗体により認識されるエピトープの同定及び確認並びに癌細胞の表面上のＬ４５抗原をさらに限定することができる〔例えば、ハコモリ（ｔ（ａｋｏｍｏｒｉ）　、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　２　：　１０３〜２６　（１９８４）；ブラウン（１３ｒｏｗｎ）ほか、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　ｌ　２７　：　５３９〜５４６（１９８１）；ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほか、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６　：　１７１〜１７３　（１９８２）；及びローズ（Ｒｏｓｅ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ）、８３：１２６１〜１２６５　（１９８６）参照〕。

本発明のモノクローナル抗体により認識されるＬ４５抗原は胸部、結腸、卵巣及び肺の癌、並びに黒色腫及び肉腫を含む腫瘍細胞の新規細胞表面積タンパク質抗原を含む。Ｌ４５抗原はポリアクリルアミドゲル電気泳動で免疫沈降されると約１００．０００ダルトンの分子量を有する。

新規Ｌ４５糖タンパク質抗原のアミノ末端アミノ酸配列は次のとおりである：Ｗ−Ｙ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｓ−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−１−１−１−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｌ− Ｄ−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｎ−Ｌ−Ｍ−Ｆ（式中、Ｘはまだ確認されなかったアミノ酸を表わし、残余の文字はアミノ酸に対する通常の一文字略号を表わす）。２６残基Ｌ４５アミノ末端配列を現在のタンパク質データベース（ＰＩＲＲｅｌｅａｓｅ　１６．１９８８年３月）中に蓄積されたものと比較すると他の既知配列と有意な配列相同を示さない。

本発明のモノクローナル抗体はまた診断用途に、試験管内及び生体内の両方において、Ｌ４５抗体が特異的に反応性であるＬ４５抗原をもつヒト腫瘍の検出に対して有用である。試験管内診断法は該技術においてよく知られ〔例えば、ロス（Ｒｏｔｈ）　、前掲、及びクプシク（Ｋｕｐｃｈｉｋ）、前掲、参照〕、腫瘍細胞（例えば、ヒト組織、細胞又は切除腫瘍試料上）の免疫組織学的検出、又は腫瘍関連抗原（例えば、血液試料又は他の生物学的流体中）の血清学的検出が含まれる。

免疫組織学的方法は生物学的試料例えば腫瘍組織試料を本発明の抗体に接触させ、次いでその抗原に複合体化した抗体の試料上の存在を検出することを含む。試料によるそのような抗体−抗原複合体の形成は組織中の腫瘍細胞の存在を示す。

試料上の抗体の検出は該技術において知られた方法例えば免疫ペルオキシダーゼ染色法、アビジン−ビオチン（ＡＢＣ）法又は免疫蛍光法を用いて行なうことができる〔例えば、ジオツカ（Ｃｉｏｃｃａ）ほか、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１２１：　５６２〜７９　（１９８６）：ヘルストロム（Ｈｅｌ　Ｉｓｔｒｏｍ）ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、　４６：３９１７〜２３（１９８６）、及びキムボール（Ｋｉｍｂａｌｌ）　（編）、「免疫学入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｏ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　（２版）　、ｐｐｌ　１３〜１１７、マクミラン・パブリッシング（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌ、　Ｃｏ、（１９８６）参照〕。例えば、免疫ペルオキシダーゼ染色法が、実施例■中に記載されるように、肺、胸部、結腸及び卵巣癌並びに黒色腫及び肉腫とのＬ４５抗体の反応性、並びに正常ヒト組織試料との抗体の反応性の欠如を示すために使用された。

血清学的診断法は癌を患っていると思われる患者の血清又は他の生物学的流体中へ分泌又は「流出」された腫瘍関連抗原の検出及び定量を含む。そのような抗原は、「流出」抗原と反応性の抗体を流体試料中の抗原の存在の検出に用いる該技術において知られた方法例えば放射免疫検定（ＲＩ　Ａ）又は抗素結合抗体免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて体液中で検出できる〔例えば、ウオチラ（Ｕｏｔｉｌａ）ほか、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ、　４２　：　１１　（１９８１）及びアルム（Ａｌｌｕｍ）ほか、前掲、ｐ、４８〜５１、参照〕。

従って、こ＼に開示したＬ４５抗体を用いるこれらの検定はＬ４５抗体が反応するＬ４５抗原の生物学的流体中の検出、例えばヒト患者中の種々の癌及び黒色腫の検出に使用できる。従って、前記から本発明のＬ４５抗体を、抗原−抗体反応を含む多くの検定に使用できることが明らかである。これらの検定には標準ＲＩＡ法、液体及び固相の両方、並びにＥＬＩＳＡ検定操作、免疫蛍光法、及び他の免疫細胞化学検定が含まれ、しかしそれらに限定されない〔例えば、シコラ（Ｓｉｋｏｒａ）ほか（編）、「モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）Ｊ　、ｐｐ３２〜５５、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリッシンズ（ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、（１９８４）参照〕。

本発明のＬ４５抗体はまたヒト腫瘍の検出に対する生体内診断適用に有用である。そのような方法の１つは検出可能シグナルを生ずる適当なイメージング試薬で標識した抗体を用いる腫瘍イメージング法による生体内腫瘍の検出を含む。イメージング試薬及びそのような試薬で抗体を標識する操作はよく知られている〔例えば、ベンセルほか（Ｗｅｎｓｅｌ　ａｎｄ　Ｍｅａｒｅｓ）、「放射免疫イメージング及び放射免疫療法（Ｒａｄｉｏ　Ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ　ａｎｄＲａｄｆｏｉｒｎｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）　Ｊ　、エセビール（Ｅｓｅｖｉｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９８３）；コルチャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ）ほか、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

１２１：８０２〜１６（１９８６Ｌ参照〕。標識した抗体は放射性核スキャンのような方法により検出できる〔例えば、プラトウェル（Ｂｒａｄｗｅ　ｉ　ｆ　）ほか、「癌検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｃａｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙ）Ｊ　、ボルドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）ほか（編）　、ｐｐ。６５〜８５、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｒ’ｒｅｓｓ）、（１９８５）参照〕。

本発明の■、４５抗体は多くの生体内治療適用を有する。腫瘍細胞の標的に単独で使用されることに加えて、該抗体を適当な治療物質とともにヒト癌の治療に使用できる。例えば、治療物質を癌の部位に供給するために該抗体を治療薬又は毒素に接合又は連結することができる。そのような治療物質を抗体に接合する方法はよく知られている〔例えば、アーノル（Ａｒｎｏｎ）ほか、「モノクローナル抗体及び癌療法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａｎｄ　ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｌ）Ｙ）Ｊ　、ライズフェルト（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ほか（編）　、ｐｐ、　２４３〜５６、アラン・アール・リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、）　、（１９８５）；へルストロム（Ｈｅｌ　Ｉｓｔｒｏｍ）ほか、［制御薬物供給（ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）Ｊ　（２版）、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）はか（編）、ｐｐ、６２３〜５３、マーセル・デツカ−（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　ｉｎｃ、）、（１９８７）、）ルベ（Ｔｈｏｒｐｅ）、「モノクローナル抗体、′８４：生物学的及び臨床的適用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　’　８４　：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｊ　、ピンチエラ（Ｐｉｎｃｈｅｒａ）ほか（編）、ｐｐ４７５〜５０６　（１９８５）；及びトルベ（Ｔｏｒｐｅ）ほか、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、、　６２　：　１１９〜５８　（１９８２）参照〕。Ｌ４５抗体は細胞を試験管内でそれにさらすときに容易に内在化されないので、例えば組換えＤＮＡ法を用いて抗体を酵素と結合させることにより化学療法薬を腫瘍細胞に標的させることが好ましいであろう。そのような接合体が腫瘍に局在化されると酵素は投与される不活性（非毒性）プロドラッグを接合体が腫瘍細胞に結合した後活性抗癌薬に転化できる〔例えば、センター（Ｓｅｎｔｅｒ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　、８５　：　４８４２〜４６（１９８８）、参照〕。

あるいは、抗体を高エネルギー放射線例えばＩｌｌ　ｌのような放射性同位体に結合させることができ、それは腫瘍部位に局在化されると若干の細胞径のキリング（Ｋｉｌｌｉｎｇ）を生ずる〔例えば、オーダー（Ｏｒｄｅｒ）、「癌検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ボルドウィン（Ｂａｌｄｗｉ口）はか（編）、ｐｐ、３０３〜１６、アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、（１９８５）参照〕。なお他の態様によれば、米国特許第４．６７６、９８０号中にセガル（Ｓｅｇａｌ）により記載されたように、Ｌ４５を第２抗体に接合させて腫瘍細胞の治療のための抗体へテロ接合体を形成させることができる。

本発明のＬ４５抗体に対するなお他の治療適用には補体の存在下あるいは抗体− 薬物又は抗体−毒素接合体の部分として癌患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するためにそれを使用することが含まれる。この方法によれば、自己骨髄を抗体で処理し、骨髄を患者に注入して戻すことにより半ビボで清浄にすることができる〔例えば、ラムゼイ（Ｒａｍｓａｙ）ほか、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　８　（２）　：８１〜８８（１９８８）、参照〕。

さらに、前に記載した本発明のキメラ又は他の組換えＬ４５抗体を治療的に使用できる。例えば、抗腫瘍活性を有する第２タンパク質例えばリンホカイン又はオンコスタチンの少くとも機能的に活性な部分に連結したＬ４５抗体の少くとも抗原結合領域を含む融合タンパク質をヒト腫瘍の生体内治療に使用できる。さらに、Ｌ４５の抗原結合領域がヒトＦＣ領域例えばｆｇＧｌに連結されるキメラＬ４５抗体を抗体依存細胞毒性又は補体仲介細胞毒性の促進に使用できる。さらに、該技術において知られた組換え法を、抗体の結合特異性の１つがＬ４５の結合特異性である二重特異性抗体の構築に使用できる〔例えば、米国特許第４．４７４．８９３号参照〕。

最後に、Ｌ４５抗体の抗イデイオタイプ抗体を活性腫瘍免疫処置及び腫瘍療法において治療的に使用できる〔例えば、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、「診断及び療法における共有結合修飾抗原及び抗体（Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｎｔｊｇｅｎｓ　Ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ＩｎＤｉａｇｎｏｓｉｓ　Ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」、前掲中、ｐｐ３５〜４１の「腫瘍療法モノクロ−六ル抗体、腫瘍ワクチン、及び抗イデイオタイプに対する免疫学的研究」参照）。

従って、本発明がヒト腫瘍の治療のための薬学的組成物、組合わせ、及び方法を包含することが明らかである。例えば、本発明はＬ４５抗体の薬学的に有効な量及び薬学的に許容できる担体を含むヒト腫瘍の治療に用いる薬学的組成物を包含する。組成物はＬ４５抗体を非修飾、治療薬（例えば薬物、毒素、酵素又は第２抗体）に接合して、又は組換え形態（例えばキメラ又は二重特異性Ｌ４５）で含むことができる。組成物はさらに癌の治療のための他の抗体又は接合体を含むことができる（例えば抗体カクテル）。

本発明の抗体組成物は静脈内、腹腔内、経口、リンパ内又は腫瘍中への直接投与を含み、しかしそれらに限定されない普通の投与方法を用いて投与できる。静脈内投与が好ましい。

本発明の抗体組成物は、液体溶液又は懸濁液、錠剤、火剤、粉体、坐剤、ポリマーマイクロカプセル又はマイクロ小胞、リポソーム、及び注射可能又は注入可能溶液を含み、しかしそれらに限定されない種々の剤形であることができる。好ましい形態は投与の方式及び治療適用による。

抗体組成物はまた、好ましくは該技術において知られた普通の薬学的に許容できる担体及びアジュバント例えばヒト血清アルブミン、イオン交換体、アルミナ、レシチン、緩衝物質例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム及び塩又は電解質例えば硫酸プロタミンを含む。

本発明の組成物に対する投与及び用法の最も有効な方法は疾患の重さ及び経過、患者の健康及び治療に対する応答、並びに治療医師の判断による。従って、組成物の投薬量はと個々の患者に対しタイトレートすべきである。しかし、本発明の抗体組成物の有効量は約１〜約５０００ｍｇ／ｍ”の範囲内にあることができる。

抗原Ｌ４５として示される本発明の新規抗原もまた治療適用に使用できる。抗原は腫瘍から精製でき、又は組換えＤＮＡ技術により製造できる（１９８６年２月７日に提出されたブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ほかの同時係属米国特許出願第８２７．３１３号、代理人整理番号Ｎｏ、　５６２４−００８、参照〕。Ｌ４５抗原をコードする遺伝子は初めにＬ４５抗原のｍＲＮＡを高める方法によりクローン化できる。

そのような方法の１つにより、ポリソーム（ｍＲＮＡリポソーム及び新生ポリペプチド鎖からなる）を、新生鏡上のＬ４５抗原決定基を認識する抗体でイムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。ｍＲＮＡは、例えばＬ４５抗体で免疫沈降法により分離され、ｃＤＮＡが適当な発現ベクター中にクローン化される。あるいは、Ｌ４５抗体又はＬ４５抗原に対する抗血清を、発現ベクターを用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用できる。精製又はクローン化したＬ４５抗原は単独で免疫原として、又は適当な免疫学的アジュバントとともに投与できる。

精製又はクローン化したＬ４５抗原は本発明の方法にワクチンとして使用し一定の腫瘍に対する免疫処置に使用できる。そのようなワクチンを製造する方法は該技術において知られている〔例えばニスチン（ε５ｔｉｎ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、８５：１０５２　（１９８８）参照〕。簡単に記載すると、組換えウィルスがクローン化した腫瘍関連抗原例えばＬ４５抗原の発現のために構築される。組換えウィルスで感染された細胞は腫瘍抗原を細胞の表面に、並びに宿主の不適合性抗原及び免疫原ウィルスタンパク質を発現するであろう。これは腫瘍拒絶反応におけるキー役を演する細胞免疫の誘発を容易にする。適当なウィルス例えばワイエス（Ｗｙｅｔｈ）天然痘ワクチンにューヨーク市衛生局株）のプラーク精製したウィルスから得られるワタシニアウイルスがワクシニアウィルスｒ７．５ＫＪプロモーターの制御下のに４５抗原のコーディング配列を含む組換えウィルスの構築に使用される。

組換えウィルスは次いで癌に対する保護のためのワクチンとして静脈内に投与できる。

記載した本発明がより完全に理解されることができるために次の実施例が示される。これらの実施例が単に例示のためであり、決して本発明の範囲を限定すると解すべきでないことを理解すべきである。

実施例１Ｌ４５モノクローナル抗体の調製本発明のＬ４５モノクローナル抗体をイー（Ｙｅｈ）ほか、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、（１９７９）、前掲）により前に記載されたハイブリドーマ融合法を用いて製造した。簡単に記載すると、３列置ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、ＣＨ３と称されるヒト肺癌からの外植培養細胞を免疫原として用いて免疫処置した。マウスは腹腔内（ｉ、ｐ、　）　６注射、各免疫処置に対し約１０’細胞、を受けた。最後の免疫処置の３日後、肺臓を回収し、牌細胞を培地中に懸濁させた。次いでポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）を用いて牌細胞をゲンチシンでトランスフェクションしたＮＳＩマウス骨髄腫細胞と融合させ〔コラ−ほか（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、前掲〕、細胞懸濁物を、イエ（Ｙｅｈ）ほか、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）、前掲、により記載されたように、マイクロタイター次いでこれらのハイブリドーマ培養の上澄みを肺癌細胞系ＣＨ３上の直接結合活性について、及びトイラード（［）Ｈｉｌｌａｒｄ）ほか、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、９２　：　１６８〜７４　（１９８３）により記載されたものに類似するＥＬＩＳＡ検定を用いてヒト繊維芽細胞の短期培養に対してスクリーニングした。この検定によれば、抗原（スクリーニングされる抗体が反応性である）をマイクロタイタープレート上に固定化し、次いでハイブリドーマ上澄みとともにインキュベートする。上澄みが所望の抗体を含むならば、抗体が固定化した抗原に結合し、抗免疫グロブリン抗体−酵素接合体及び光学濃度の測定可能な変化を生ずる酵素に対する基質の添加により検出される。

この実施例のために、肺癌細胞又は対照線維芽細胞あるいは末積面白血球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を９６ウ工ル組織培養プレート〔コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ））中へ分配し、湿り３７℃インキュベーター（５％ＣＯ，）中で一夜インキユベートした。次いで細胞を新調製１．０％グルタルアルデヒド１００μ！で０．５％の最終ウェル濃度に固定し、室温で１５分間インキュベートし、次いで１×ＰＢＳで３回洗浄した。次に細胞をＰＢＳ中の５％ＢＳＡで３０分間ブロックし、再びＰＢＳで３回洗浄した。次いでハイブリドーマ培養の上澄みを１００μｌ／ウエルに加え、ウェルを室温で１時間インキュベートし、細胞を３回ＰＢＳで洗浄した。次に０゜１％ＢＳＡ及びＰＢＳ中に希釈したヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ〔ザイムド（Ｚｙｍｅｄ、　ＣＡ））を１００μＡウエルの濃度に加えた。反応混合物を室温で１時間又は３７℃で３０分間インキュベートし、次に細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで０−フェニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）を１００μｍ／ウェルに加え、プレートを暗所で、室温で５〜４５分間インキュベートした。細胞に対する抗体結合は１０〜２０分内に生じたウェル中の色の変化により検出された。反応を１００μｌ／ウエルＨｚＳ０４の添加により停止させ、ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）マイクロエライザ・オートリーダー中で、４９２ｎｍで吸光度を読みとった。

免疫処置細胞系に対してなお陽性でＰＢＬに陰性のウェルを免疫処置細胞系ペレット並びに正常な腎臓、肝臓及び肺臓組織に対して免疫組織学技術により試験した。

この検定は完全細胞又は精製した溶性抗原あるいは細胞抽出物を固定化抗原として用いて行なうことができることを認めるべきである。溶性抗原又は細胞抽出物を抗原として用いたとき、抗原は初めにＰＢＳ中で５０μｍ／ウェルに塗布し、プレートを検定の開始前に室温で一夜インキユベートした。完全細胞を抗原として用いるとき、それを新鮮で又は固定化後に使用できる。どの場合にも、細胞を初めに培地中で１００μｌ／ウエルで１０４細胞に塗布し、３７℃のインキュベータ（５％ＣＯ，）中で一夜インキユベートした。

肺癌細胞系に結合し、正常組織に結合しない抗体を生じたハイブリドーマをこのように試験管内で選択し、クローン化し、広げ、さらに抗体特異性について試験した。ヒト肺癌と反応性の抗体を生じたハイブリドーマを再びクローン化し、広げ、ブリスタン感作３ガ令Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス中へ注射し、そこでそれらを腹水腫瘍として増殖させた。

この操作後、ハイブリドーマ細胞系Ｌ４５が得られ、クローン化し、マウス中へ注射し、腹水腫瘍として発生させた。前に開示したように、該Ｌ４５ハイブリドーマはＡＴＣＣに寄託された。

腹水中に分泌された抗体はプロティンＡ−セファロース〔例えばエイ（Ｂｙ）ほか、Ｉｎｕ＋＋ｕｎｏｃｈｅｍｆｓｔｒｙ、　１５　：　４２９〜４３６　（１９７Ｂ）参照〕で、又はセファクリルＳ−３００上のゲル濾過により精製した。

精製したＬ４５抗体を以後のキャラクタリゼーションに用いた。

実施例■ Ｌ４５モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションイソタイプ決定Ｌ４５ハイブリドーマにより生成された免疫グロブリンのクラスの決定に、次の方法を用いた。

ａ）オフタロ二−免疫拡散法Ｌ４５ハイブリドーマ細胞の上澄みの分割量を２５％寒天平板の中心ウェル中に置いた。単一特異性ウサギ抗マウスＩｇイソタイプ抗体〔サザン・バイオテクノロジー（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、　ＡＬ））を外側ウェル中に置き、３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。次いで沈殿線を読んだ。

ｂ）ＥＬＩＳＡイソタイピングダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）のイムロン（Ｉｍｍｕｌｏｎ）　９６ウエルプレートをヤギ抗マウスＩｇ抗体で１μｇ／ｍｌ濃度に、ＰＢＳ中５０μｍ／ウェルコートし、４℃で一夜カバーして置いた。プレートをＰＢＳ／ツイーン２０．０．０５％で洗浄し、培地１００μｍ／ウェルで、室温で１時間ブロックした。

プレートを洗浄した後Ｌ４５ハイブリドーマの上澄みを加え、室温で１時間インキュベートした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで洗浄した後プレートをペルオキシダーゼに接合した単一特異性ウサギ抗マウスＩｇイソタイプ抗体〔ザイムド（Ｚｙｍｅｄ）：ｌ　とともに３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，５、中の１ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン及び０．０３％Ｈ７０２とともにインキュベートした。５３０ｎｍにおける光学濃度をダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃ）Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａプレートリーダーで測定した。

これらの操作に基づいてＬ４５モノクローナル抗体がＩｇＧ２ａイソタイプであることが決定された。

Ｌ４５モノクローナル抗体の結合特性抗原の細胞上局在を、非イオン性界面活性剤による透過性化の前後の細胞に対する抗体結合の測定により決定した。完全な培養細胞の細胞表面に対する抗体結合は、ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ、４６：３８１７〜３９２３　（１９８６）により記載されたように、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣ３）ｎを用いる直接蛍光により確認した。簡単に記載すると、ＦＡＣ８細胞分取器を用いる結合分析のために、ｌＸｌ０’培養細胞をＩＭＤＭ培地〔キブコ（Ｇｉｂｃｏ　、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）　：］中の１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で５００μｌ／管の全体積に分取した。

細胞をセファース（Ｓｅｒｏｆｕｇｅ）で１．５分間遠心分離し、上澄みを除去した。ｌＯμｇ／−のＬ４５モノクローナル抗体１００μｌを容管に加え、次いでその内容物を混合し、氷上で３０分間インキュベートした。反応混合物をセロフユージ上で１．５分間の遠心分離により１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭ５００μｌで３回洗浄した（管は第３洗浄後プロツトした）。次いで１５％ＦＢＳ／ＩＭＤＭ中に１＝２５に希釈した最適化ＦＩＴＣ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体〔タボ（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）　）　５０　ａ　１を容管に加え、反応混合物を混合し、３０分間インキュベートした。次いで洗浄段階を繰返し、管のプロッティング夜番ペレットをＦＢＳ　２００〜５００μβ中に再懸濁した。各試料をクールター・エピマウス（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ）ＣＦ　Ａ　ＣＳで試験し平均蛍光強度（ＭＰりを測定した。ＭＦＩから線蛍光当量（Ｌ　Ｆ　Ｅ）を改良した。陰性対照のＬＦＥにより割算した各試験試料のＬＦＥは特異抗体対対照抗体の染色された細胞の明るさ間の比を与えた（１．０＝蛍光に差なし、２．０＝蛍光が明るさとして２倍、など）。結合データは表１中に示される。

表１種々の細胞系に対するＬ４５抗体の結合−龍胞系一一　旦土旦披体稙童且２９８１肺癌　１５．６ＣＨ３肺癌　３．３２７０７肺癌　１．０ＨＣＴ１１６肺癌　７．４３４７７乳癌　１３．５ＲＣＡ結腸癌　２１．０３３４７乳癌　１．６Ｃ結膓癌　２４．３ＣＥＭ　Ｔリンパ球　１．０Ｍ０ＬＴ４Ｔリンパ球　１．３Ｐ３４Ｒ−Ｉ　Ｂリンパ腫　１．０末梢血細胞　１．０表１が示すように、Ｌ４５モノクローナル抗体が肺、胸部及び結腸癌細胞系と反応したが、しかしＴ又はＢリンパ腫系とも、また正常末梢血白血球とも反応しなかった。

免疫組織学Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｐｐ、　１０４〜６９、ジョン・ワイリー・°アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（１９７９）中に記載され、ガリグース（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）ほか、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９　：５１１〜１５（１９８２）により改変されたスターンバーガー（Ｌ、　Ａ、　ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ）のＰＡＰ法を凍結組織切片上の免疫組織学的研究に用いた。これらの試験のための標的組織は外科で得られ、液体窒素中で予冷したイソペンクンを用いて除去４時間内に凍結した。次いで組織を液体窒素中に又は−７０℃で、使用するまで貯蔵した。凍結切片を調製し、風乾し、アセトンで処理し、再び乾燥した〔ガリグース（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）、前掲、参照〕。組織学的評価に用いる切片はヘマトキシリンで染色した。非特異的バックグラウンドを減らすため、切片をＰＢＳ中に１１５に希釈した正常ヒト血清とともにブレインキュベートした〔ガリグース（Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ）ほか、前掲、参照〕。マウス抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ、及びマウスＰＡＰを１０％正常ヒト血清及び３％ウサギ血清の溶液中に希釈した。ウサギ抗マウスＩｇＧ（スターンバーガー・メイヤー・イムノケミカルズ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−ＭｅｙｅｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅａ＋１ｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｊａｒｅｔｔｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ））は１１５０の希釈で用いた。特に精製したＰＡＰ２ｍｇ／鵬ｌを含むマウスペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ複合体［ＰＡＰ、スターンバーガー・メイヤー・イムノケミカルズ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ−ＭｅｙｅｒＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｃ、））はｌ／８０の希釈で用いた。

染色操作は一連の切片を特異抗体、すなわちＬ４５、又は対照抗体で２．５時間処理し、切片を室温で、ｌ１５０に希釈したウサギ抗マウスＩｇＧとともに３０分間インキュベートし、次いで切片をｌ／８０希釈マウスＰＡＰ複合体に室温で３０分間さらすことから構成された。抗体による各処理後にスライドをＰＢＳ中で２回洗浄した。

免疫組織化学的反応は、新たに調製した０、０５Ｍ）リス緩衝液、ｐＨ７，６中の０．５％３，３′−ジアミノベンジジン四塩酸塩〔ジグ？−ケミカル（Ｓｉｇｓａａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ））及び０．０１％Ｈ１０，を加えることにより８分間顕色させた〔ヘルストロム（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ）ほか、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．．１２７　：　５７〜６０　（１９８１）、参照〕。さらに蒸留水中の１％０ｓｅｓ溶液に２０分間さらして染色を強めた。切片を水で洗浄し、アルコール中で脱水し、キシレン中で清浄にし、スライド上に載せた。並行切片はヘマトキシリンで染色した。

スライドはそれぞれコード下に評価し、コードした試料は別の研究者によりチェックした。典型的なスライドは微分干渉コントラスト光学素子〔ファイスーツマルスキイ（Ｚｅｊｓｓ−Ｎｏｍａｒｓｋｉ）　）の使用により撮影した。抗体染色の程度は０（反応性なし）、＋（若干の弱い陽性細胞）、＋十（細胞の少（とも１／３が陽極）、十＋＋（大部分の細胞が陽性）　、＋＋＋＋　（すべての細胞が強く陽性）として評価した。十及び０中色の間の差は十及び千十染色の間より明瞭でないカットであったので、＋十又はそれ以上として類別された染色を「陽性」と考えた。新生物及び基質細胞の両方が腫瘍試料中に認められた。記録された染色は、基質細胞が全く染色されないか又は腫瘍細胞より非常に弱く染色されたので、腫瘍細胞の染色である。

表２は種々の腫瘍及び正常組織試料のＬ４５モノクローナル抗体を用いた免疫組織学的染色を与える。その表が明らかに示すように、Ｌ４５抗体は広範囲のヒト腫瘍試料と反応し、試験した多くの正常ヒト組織と反応性がないことを示す。

表２Ｌ４５モノクローナル抗体による腫瘍及び正常組織試料の免疫ペルオキシダーゼ染色紙−監一里　仄体殖金（陽性腫瘍の数／試験腫瘍全数）結腸癌　１３／ｌ　３肺癌　１０／１３乳癌　１５／ｌ　５卵巣癌　５／６黒色腫　８７８肉腫　４／６正常組織：牌　臓　０／３腎臓　０／４肝臓　０／４心臓　０／１卵巣　０／１副腎　０／１畢丸　０／１胸部　０／８扁桃　０／１皮膚　０１５肺臓　０１５結腸　０／６脳　０／２甲状腺　０／３リンパ節　０／２実施例ｍＬ４５４５℃より認識されたＬ４５抗原精製Ｌ４５４５℃反応性の抗原を確認するために、Ｌ４５抗原をＡ３４９細胞（ＡＴＣＣ，Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）から分離し、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｌ４５抗原は、０、１５　Ｍ−ＮａＣＩ及び１ｍＭフェニルメタンースルホニルフルオリドを含むＩＯｍＭ）リスＨＣｊ７緩衝液、ｐＨ８，５、中ノ０．５％ＮＰ４０でＡ３４９細胞膜から可溶化し、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。カラムはＬ４５４５℃カルボニルジイミダゾール活性化アガロース〔レアクチ−ゲル（Ｒｅａｃｔ　１−Ｇｅ　Ｉ　）（６Ｘ）、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）　）に結合させることにより調製した。結合したＬ４５抗原をアフィニティー支持体がら０．５ＸＮＰ４０及び０．１５　Ｍ−ＮａＣ１を含む０．５Ｍグリシン−ＨＣ１緩衝液、ｐ）１２．３、で溶離させた。溶離したＬ４５抗原はさらに１５％アクリルアミドゲル上の分離用ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により精製した。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（１０％酢酸及び３０％イソプロパツール中０．５重Ｉ％）で染色し、酢酸（５％、ｖ：ｖ）及びメタノール（１７％、ｖ／ｖ）の溶液中で脱色した。染色されたＬ４５抗原バンド（Ｍｒ　１００，０００）をレーザーブレードで切取り、直ちに、バンカピラー（Ｈｕｎ　ｋａｐｉｌｌｅｒ）ほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９１　：　２２７〜２３６（１９８３）！、：より記載されたようｉ：ＦＣＵ−０４０工１ｚクトロエリユーター／コンセントレータ−〔シー・ビー・ニス・サイエンティフィック（Ｃ，Ｂ、　Ｓ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣＡ）　Ｅで電気溶離にかけた。

配列分析自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解をＬ４５抗原の２つの調製物＝１）抗原３６ｐｍｏｌ及び２）抗原１４ｐｍｏｌ、でパルスト液体タンパク質シーケンサ［モデル４７５Ａ、アプライド、バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）］中で行なった。

フェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体はモデル１２０ＡオンラインＨＰＬＣ装置〔アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐ　ｌ　ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｙｅｍｓ、　Ｉｎｃ、　）　）上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）オンラインにより、ＰＴＨＣ１Ｂカラム及び酢酸ナトリウム／テトラヒドロフラン／アセトニトリル勾配を溶離に用いて分析した。

Ｌ４５抗原のアミノ末端アミノ配列は次のとおりである＝Ｗ−Ｙ−Ｔ−Ｖ−Ｎ− ３−Ａ−Ｙ−Ｇ−Ｄ−Ｔ−１１−Ｉ−Ｐ−Ｘ−Ｒ−Ｌ−Ｄ−Ｖ−Ｐ−Ｑ−Ｎ−Ｌ −Ｍ−Ｆ（式中、Ｘは確認されなかったアミノ酸を表わす。）２６残基Ｌ４５アミノ末端配列をＰＩＲデータベース（ＰＩＲＲｅｌｅａｓｅ　１８０、■９８８年９月；りＧｅｎＢａｎｋ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　５７．０．１９８８年９月、ＮＥＷ、１９８８年１１月３０日、　Ｄ　Ｉ　Ｆ。

■９８８年１１月３０日、５ＷＩＳＳ　ＰＲＯＴ、１９８８年１１月３０日；及びＬＯ３ＰＲ０，１９８８年１１月３０日）に比較すると、他の既知配列との有意な配列相同を示さなかった。

Ｌ４５４５℃より確認された抗原は約１００．０００ダルトンの分子ｆｆｉ（Ｍｒ）のタンパク質抗原である。

免疫学的キャラクタリゼーションＡ）　ウェスタンプロット分析イムノアフィニティー精製Ｌ４５抗原をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ。

ｋ、）、Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８０〜６８５　（］　９７０）により記載されたように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（７，５％アクリルアミド、ミニプロチアン（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ）　ＩＩ電気泳動セル、バイオ・ラド（Ｂｉ。

−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）　］にかけ、トウビン（Ｔｏｗｂｉｎ）ほか、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ、、７６　：　４３５０〜４３５４　（１９７９）により記載されたように、しかしメタノールをトランスファー緩衝液から省略してハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎナイロン膜〔アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ））に電気泳動的に移した〔ミニ・トランス−プロット・エレクトリック・トランスファー・セル、バイオ・ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ））。

Ｌ４５抗原は第２抗体としてペルオキシダーゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ〔ハイクローン・ラボ（ＨｙＣｌｏｎｅ　Ｌａｂ、、　Ｌｏｇａｎ、　ＵＴ　）を、及び色原体として４−クロロ−１−ナフトールを用いて免疫検出したしホーケス（Ｈａｗｋｅｓ）　、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１２３　：　１４３〜１４６　（１９８２））、免疫検出はＭ　ｒ　＝　１００．０００における主バンドがＬ４５４５℃特異的に染色されたことを示した。

Ｂ）　放射免疫沈降Ａ３４９細胞を、１０％透析ウシつ児血清（ＦＢＳ）を補足したＲＰＭＩ　１６４０培地（グルコース不含又はロイシン不含ＲＰＭＩ　１６４０セレクト−アミン・キット（Ｓｅｌｅｃｔ−ＡｍｉｎｅＫｉｔ）、ＧＩＢＣ○〕中で３７℃で５時間インキュベートすることにより、それぞれ〔３Ｈ〕−グルコサミン及び〔３Ｈ〕　−ロイシンで標識し、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ培地中で一夜追跡した。

細胞ペレットを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２，１５０ｍＭ−ＮａＣ１，２ｍＭ−ＥＤＴＡ、　０．１％５ＤＳＸ　１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００，１％デオキシコール酸ナトリウム、ＰＭＳＦ（１０μｇ／ｌｆり、アプロチニン（１０μｇ／−）で抽出した。

溶解物をＬ４５４５℃ともに４℃で１時間インキュベートすることによりＬ４５抗原を免疫沈降させた。抗原抗体複合体をヤギ抗マウスＩｇＧ及びパンソルビン［Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎ、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）細胞、カルビオケム（Ｃｏｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓａｎ　Ｄｉａｇｏ、　ＣＡ））で、各４℃で３０分間連続的にインキュベートすることにより沈殿させた。免疫沈降物を５　（１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２，１５０ｍＭ−ＮａＣ１，２ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．１ＸＮＰ４０で４回洗浄し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより還元及び非還元条件下に分析し、ゲルをＥＮ” ＨＡＮＣＥＴＭ　にニュー・イングランド・ニュークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ））で含浸した後フルオログラフィーにより可視化した。

Ｌ４５４５℃〔３Ｈ〕　−ロイシン及び〔３Ｈ〕−グルコサミン標識細胞の両方においてＭ　ｒ　＝　１００．０００を有するＬ４５抗原を特異的に沈降した。

これらのデータはＬ４５モノクローナル抗体により認識された抗原決定基がＭ　ｒ　＝　１００．０００を有する特有−重鎮糖タンパク質上に位置することを示す。Ｌ４５抗原は肺、胸部、結腸及び卵巣癌細胞並びに黒色腫及び肉腫細胞を含む種々の腫瘍細胞に関連する。

上に示した本発明の多くの改変及び変形を、その精神及び範囲から逸脱することなく行なうことができることが明らかである。

記載した特定の態様は単に例として示され、本発明は単に請求の範囲の関係により限定される。

国際調査報告１“０−−１−ａ−―（−−−ｍＨハＴＩＱＱＯ１００ム０）Ｐｃｒ１０５９０１００４０７ λＷ　ｆｆｉ　ＦＯＲ菖Ｗｌ／Ｘｍｋ／２１０．Ｐａｒｔ　ｎ＋１．　Ｃｌａｉｍｓ　ｌ−８，１０−１７ａｎｄ　１９−２９　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ　ａ　ｃａｌｌ　５ｕｒｆａｃｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ・ｉｎ　ａｎｔｉｇ・ｎｏｆ　ｈｕｍｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃ＠ｌｌｓ　ａｎｄ　ａｎ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　ｈｕｍａｊ′Ｉ　ｔｗｏｒｓ、ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓｅｓ　ａ３５．　４３６．　５コＯａｎｄ９３５゜ＸＸ、Ｃ１ａｉｊＩｓ　９　ａｎｄ　１８ａｒ＠ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒｓ、　ｃｌａｓ＠１ｆｉｅ＋１　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　５１４゜ｒＸＸ、　Ｃｌａｉｍ　３０　ｉｓ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｔｈｅｔｈｃｘｌ　ｆｏｒ　ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ　ｈｕｍａｎｔｕ！ＩＩｏｒｓ　ｉｎ！工Ｈ，ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓｅｓ　４２４　ａｎｄ　９コ５゜工Ｖ、　Ｃｌａｉｍ　コｌ　ａｎｄ　３２　ａｒｅ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍ＊ｔｈＯｄ　ｏｆ−ｈｍｍｏｔｈ＊ｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｔｈ・ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｕｍｏｒｓｓ、　ｃｌａｓｓｓｉｆｉｅｄ　１ｎｃｌａｓ＠ｅｓ　４２４　ａｎｄ　９３５゜Ｖ、　Ｃ１ａｈａｓ３３−３フ　ａｒ＠　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｈｙｂｒＷｏｍａ　ｃａｌｌ　１ｉｎｅｓ。

ｃｌａ＠５ｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓｓ−ｓ　４コ５　ａｎｄ　９３５゜ＶＸ、Ｃ１ａｈａｓ　コ９−４１　ａｒｍ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｎｄ　ａ　ａｒｅｔｂｏｄ　ｆｏｒム１ｍｉｚｉｎｇ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｕｍｏｒｓ　ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ　５ａｉｄ　ｖａｃｃｉｎｅ。

ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｃｌａｓｓ　４コ５＋１！＆＆ＩＷｍ　ＦＯＩ　重ＯＬＤｍ　ＷＫ　ＯＦ　ｆｆｉ’ｌ’ｌｌ’　ＯＦ　ＸＷｍｌＴＸＯＭ＊Ｇｒｏｕｐ　Ｘ　ｉｓ　ｄｉｒ＠ｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　ａ　ｔｒｒ＊ｔｂｏｄ　ｆｏｒｕｓｉｎｇ　ｔｈａｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ。

Ｇｒｏｕｐ　ＸＩ　ｉｓ　ｄｉｒ＠ｃｔ＠ｄ　ｔｏ　ａ　５ａｐａｒａｔａ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ。

Ｇｒｏｕｐ　Ｘ工Ｘ　ｉｓ　ｄｉｒａｃｔｍ　ｔｏ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｃａｓｓｆｏｒ　ｕｓｉｘｌ　ｔｈ＠ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ。

Ｇｒｏｕｐ　ｒＶ　ｉｓ　ｄｉｒ＠ｃｔ＠ｄ　ｔｏ　ａ　５ｅｐａｒａｔ＠　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｃ＠５ｓｆｏｒ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅｍ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ、　ｃｒｏｕｐ　Ｖ　ｉｓ　ｄｉｒｅｃｔ− ｔ。

ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ａｎｄ　Ｇｒｏｕｐ　ＶＸ　ｉｓ　ｄｉｒｅｃｔｔｏ　ａ　５ｅｐａｒａｔ＠ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｒｏｄｕｅｔ　ａｎｄ　ａ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　ｕｓｈｑｔｈａｔ　ｐｒｏｄｕｅｌ：。

Ｔａ１ｌ＠　５ａａｒｃｈ　ｂｕｒｃｌａｎ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｆｏｒ　ａａｃｈ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　１ｎｖａｎｔｉｏｎｉｓ　ｕｎｄｕｅ、ｎｏｔ　ｏｎｌｙ　１ｎｓｏｆａｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｐａｒａｎｔｓａａｒｃｈ＠ｓ　ｃｏｖ＠ｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｒａ　ｃｌａｓｓｅｓ　ｎｏｔｍ　ａｂｏｖｅ。

１ｅ１１ｈｈ−一一拳會−−１−１１１１−■−−―ｃ１１１−ｐ噌喰ｈａＰＣ ’ｌ−ノ’０５９０／ＣＸ）４０７ＰＣＴ／ＵＳ９０１００４０７

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖タンパク質抗原上の決定基部位に結合する、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４により生成されたモノクローナル抗体、並びに前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。２．腫瘍細胞が癌細胞である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。３．癌細胞が肺、卵巣、結腸及び胸部癌細胞からなる群から選ばれる、請求項２に記載のモノクローナル抗体。４．腫瘍細胞が黒色腫細胞である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。５．腫瘍細胞が肉腫細胞である、請求項１に記載のモノクローナル抗体。６．検出可能シグナルを生ずることができる標識に接合された請求項１に記載のモノクローナル抗体。７．標識が放射性核種、酵素、蛍光物質及び発色団からなる群から選ばれる、請求項６に記載のモノクローナル抗体。８．ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖タンパク質抗原であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されて約１００，０００ダルトンの分子量により確認され、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原上の細胞決定基部位に結合する、ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４により生成されたモノクローナル抗体、並びに前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。９．請求項８に記載の抗体の治療的に有効な量を薬学的に許容できる非経口賦形剤に関連して含む、腫瘍治療用組成物。１０．骨髄腫細胞と、ヒト腫傷細胞の細胞表面糖タンパク質抗原であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されて約１００，０００ダルトンの分子量を有し、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原上の決定基に結合する抗体を生ずることができる細胞との融合により形成されたハイブリドーマ細胞系により生成されるモノクローナル抗体、並びに前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。１１．クラスＩｇＧである、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。１２．サブクラスＩｇＧ２ａである、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。１３．マウス抗体である、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。１４．ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面糖タンパク質抗原であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されて約１００，０００ダルトンの分子量により確認され、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原上の決定基部位と反応性のモノクローナル抗体、並びに前記抗体の機能的等価物、結合フラグメント及び免疫複合体。１５．パイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４により生成されるモノクローナル抗体からなる、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。１６．ヒト抗体である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。１７．マウスーヒト抗体である、請求項１４に記載のモノクローナル抗体。１８．請求項１４に記載の抗体の治療的に有効な量を薬学的に許容できる非経口賦形剤に関連して含む、腫瘍治療用組成物。１９．ヒト腫瘍の検出のための：ａ）ヒト腫瘍細胞に関連する細胞表面糖タンパク質抗原であって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されて約１００，０００ダルトンの分子量により確認され、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原と反応性の、検出できるように標識されたモノクローナル抗体を腫瘍細胞の試料と組合わせること、及びｂ）前記抗原に関連する腫瘍細胞に結合する前記標識モノクローナル抗体を検定すること、を含む免疫検定法。２０．モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４により生成される抗体である、請求項１９に記載の免疫検定法。２１．抗体が放射性核種、酵素、蛍光物質及び発色団からなる群から選ばれる標識で標識される、請求項１９に記載の免疫検定法。２２．請求項１、８、１０又は１４に記載のモノクローナル抗体をヒト組織又は流体試料に接触させ、前記抗体と前記試料中の抗原的に相当する腫瘍細胞又はその抗原決定基との相互作用を検出することを含む、腫瘍の検出法。２３．腫瘍細胞が肺癌細胞であり、ヒト組織が肺組織である、請求項２２に記載の方法。２４．腫瘍細胞が乳癌細胞であり、ヒト組織が胸部組織である、請求項２２に記載の方法。２５．腫瘍細胞が結腸癌細胞であり、ヒト組織が結腸組織である、請求項２２に記載の方法。２６．腫瘍細胞が卵巣癌細胞であり、ヒト組織が卵巣組織である、請求項２２に記載の方法。２７．腫瘍細胞が黒色腫細胞である、請求項２２に記載の方法。２８．腫瘍細胞が肉腫細胞である、請求項２２に記載の方法。２９．モノクローナル抗体と腫瘍細胞との相互作用が免疫組織学的染色により検出される、請求項２２に記載の方法。３０．生体内ヒト腫瘍を、ａ）請求項１、８、１０又は１４に記載のモノクローナル抗体を精製すること；ｂ）前記抗体を放射能標識すること；ｃ）前記抗体を適当な担体中でヒト患者に投与すること、及びｄ）外部ンシチグラフィー、発光断層撮影法又は放射性核スキャンによりモノクローナル抗体の位置決定すること、を含む位置決定する方法。３１．腫瘍の治療のための、ａ）請求項１、８、１０又は１４に記載のモノクローナル抗体を精製すること；ｂ）前記モノクローナル抗体を細胞毒性物質、毒素又は放射性医薬に接合させること；及びｃ）前記接合したモノクローナル抗体を適当な担体中でヒト腫瘍患者に投与すること、を含む免疫療法の方法。３２．モノクローナル抗体が抗イディオタイプ抗体である、請求項３１に記載の方法。３２．癌細胞又はその免疫原決定基で免疫処置したマウスから得られるリンパ球とマウス骨髄腫細胞とのハイブリドーマを含む、ヒト癌細胞の細胞表面タンパク質抗原上の決定基部位に結合する能力を特徴とするモノクローナル抗体を生成する連続細胞系。３４．癌をもつヒトから得られるリンパ球と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを含む、ヒト癌細胞の細胞表面糖タンパク質抗原上の決定基部位に結合する能力を特徴とするモノクローナル抗体を生成する連続細胞系。３５．ヒト腫瘍細胞の細胞表面糖タンパク質抗原上の決定基に結合できるハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４モノクローナル抗体。３６．ＮＳＩマウス骨髄腫細胞と、肺腺癌ＣＨ３細胞で免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから得られたマウス脾細胞とを融合することにより形成され、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して約１００，０００ダルトンの分子量を有し、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する腫瘍細胞の細胞表面糖タンパク質抗原の決定基に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＨＢ９８０４。３７．腫瘍細胞に関連する細胞表面糖タンパク質抗原であって約１００，０００ダルトンの分子量を有し次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原上の決定基部位に結合する能力を特徴とするモノクローナル抗体を生成する、前記抗原に対する抗体を生成できるリンパ球と骨髄腫細胞とのハイブリドーマを含む連続細胞系。３８．実質的に純粋な形態の糖タンパク質抗原であって、ヒト腫瘍細胞から得られ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定して約１００，０００ダルトンの分子量を有し、次の：【配列があります】（式中、Ｘは未確認アミノ酸を表わす）のようなアミノ末端アミノ酸配列を有する抗原、及びこの抗原の免疫複合体。３９．請求項３５に記載の抗原をコードするＤＮＡを含む組換えウイルスを含む、腫瘍に対する免疫処置に用いるワクチン。４０．ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項３９に記載のワクチン。４１．請求項３９に記載のワクチンの治療的に有効な量を投与することを含む、腫瘍に対する免疫処置法。