PT93167B - Novo anticorpo monoclonal contra novo antigenio associado a tumores humanos - Google Patents

Description

C13161-

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo O presente invento diz respeito a um novo anticorpo monoclonal, que se liga fortemente um antigénio proteico associado a tumores humanos, incluindo carcinomas do cólon, mama, ovário e pulmão, assim como a me-lanomas e sarcomas. 0 anticorpo liga-se a células humanes normais em muito menor grau do que às células tumorais. 0

ONCOGEN LIMITED PARTNERSHIP "NOVO ANTICORPO MONOCLONAL CONTRA NOVO ANTIGÉNIO ASSOCIADO A TUMORES HUMANOS" -2-

anticorpo tem utilização em métodos de diagnóstico, tais como detecção de células malignas associadas a tumores, e em métodos terapêuticos para o tratamento de humanos com tumores. Também é divulgado uma glicoproteína de 100.000 daltons encontrada na superfície celular de células de tu-motes humanos. A sequência de aminoácidos amino-terminal deste antigénio é: 15 10 15 20 25

W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácido não identificado. \ -3-

Λ Ο presente invento está relacionado com um novo anticorpo monoclonal e um novo antigénio e com métodos para a produção e utilização de tal novo anticorpo monoclonal reactivo com células de carcinoma humano. Mais especificamente, o anticorpo monoclonal deste invento é reactivo com o novo antigénio de superfície celular, o qual está associado a uma variedade de tumores humanos incluindo carcinomas da mama, colon, ovário e pulmão, assim como melanomas e sarcomas. 0 anticorpo monoclonal deste invento é adequado para fins de diagnóstico clínico in vitro e invivo, como seja a detecção de carcinomas malignos. Adicionalmente o anticorpo do presente invento é adequado para utilização terapêutica, por exemplo para reagir com células tumorais e em conjugados como veículo selectivo de alvos para vários agentes que possuam efeitos anti-tumorais, sem que esteja limitado a: drogas quimioterapêuticas, toxinas, modificadores de resposta imunológica e radioisótopos. 0 antigénio do invento é também útil para fins terapêuticos e de diagnóstico.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os carcinomas causam usualmente milhões de mortes. Por exemplo, os carcinomas do pulmão são responsáveis pela maneiiradas mortes provocadas por cancro no homem e estão a alcançar os carcinomas da mama como a causa mais frequente por cancro entre es mulheres. A maior parte dos casos de carcinoma são incuráveis por quimioterapia e terapia de radiação a menos que seja radioal-mente removido nas fases iniciais da doença. Existe grande necessidade de métodos de diagnóstico e terapia de carcino- -4-

mas da mama, cólon, ovário, pulmão, assim como para outros neoplasmas malignos tais como melanonas e sarcomas. São conhecidos anti-corpos mono-clonais reactivos com antigénios associados e carcinomas (ver, e.g. Papsidero, Semin. Surg. Oncol., 1 (4): 171-81 (1985): Schlom et al., Important. Adv. Oncol., 170-92 (1985); Allum et al., Surg. Ann. , 18-41-46 (1986); Houghton et al; Semin. Oncol, 13(2): 165-79 f 19 86) ; Monoclonal Antibédies in Câncer: Advanees for Diagnosis and Treatment, Roth (ei), Futura Publishing, Mt. Kisco, New York (1986); and Câncer Dia-gnosti in vitro Monoclonal Antibodies, Kupchik, (ed.) Mareei Dekker, Inc., New York, (1988)). A maior parte dos anticorpos mono-clonais conhecidos são reactivos com vários tipos de carcinomas humanos, enquanto apenas alguns anticorpos reagem com carcinomas derivados de orgãos específicos do corpo, e.g. pulmão, mama, ovário, cólon, estômago ou pâncreas. Os anyi-génios alvos são normalmente glicoproteicos ou glicolipi-dos (ver, e.tj. Hellstrom et al., Câncer Research 46:3917-23 (1986); e Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33 (1984)). Por exemplo, anticorpos monoclonais reactivos com antigénios g1icoproteícos em tipos específicos de carcinomas incluem os descritos na Patente dos Estados Unidos 4.737.579 (anticorpos monoclonais contra carcinomas do pulmão que não sejam das células pequenas), Patentes dos Estados Unidos 4.753.894 (anticorpos monoclonais contra cancro da mama humano), Patente dos Estados Unidos 4.579.827 (anticorpos monoclonais contra cancro gastrointestinal humano) e Patente dos Estados Unidos 4.713.352 (anticorpos monoclonais contra carcinoma renal humano). Alguns anticorpos monoclonais reagem com antigénio de alto peso molecular para parecerem nucivos. Por exemplo, p anticorpo monoclonal B72.3 parece restabelece rum antigénio gl icoproteico oncofetal associado a tumores com mais de 1000 kd de peso molecular que é selecti- -5-

vamente expresso numa série de carcinomas diferentes. Assim, B 72.3 reage com 84% dos carcinomas da mama, 94% dos carcinomas do cólon, 100% dos carcinomas do ovário e 96% dos carcinomas pulmão que não sejam das células pequenas (ver Johns-ton, Acta Cytol., 1(5): 537-56 (1987) e Patente dos Estados Unidos 4.612.782 atribuída a Schlon et al.,). De modo semelhante o anticorpo monoclonal KC-4 reconhece um antigénio proteína de aproximadamente 400-500 kd expresso numa série de carcinomas, tais como cólon, próstata, pulmão e mama (ver Patente dos Estados Unidos 4.708.930).

Também têm sido divulgados anticorpos monoclonais reactivos com antigénio glicoiipidos que se possa estarem associados a certas células tumorais.

Por exemplo, Young et al., J. Exp. Med., 150:1008-19 (1979) descrevem a produção de dois anticorpos monoclonais específicos de asialo GM2, um antigénio glicofingolipido de superfície celular que fica estalbelecido como marca para células 3T3 de BALB/c transformadas pelo vírus do sarcoma mu-rino de Kirsten. Ver, também, Kniep et al., J. Immunol. 131 (3): 1591-94 (1983) e Patente dos Estados Unidos 4.507.391 (anticorpo monoclonal contra melanoma humano).

Em adição anticorpos monoclonais reactivos com antigénios glicolipidos encontrados em tipos específicos de células de carcinoma incluem os descritos por Rosen et a±. , Câncer Research, 44:2052-61 ( 1984) (anticorpos monoclonais contra cancro de células pequenas do pulmão humano); Varki et al., Câncer Research, 44:681-87 (1984) (anticorpos monoclonais contra adenocarcinomas humanos do pulmão, estômago e cólon e melanoma) e Patente dos Estados Unidos 4.579.827 (anticorpos monoclonais contra adenocarci-noma do cólon humano). Ver também, Hellstrom et aK, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:7059-63 (1986) que descreve o anticorpo monoclonal, L6 o qual reconhece um antigénio açúcar expresso na superfície de carcinoma do pulmão humano que não -6-

sejam de células pequenas, carcinomas da mama e carcinomas do pulmão. São bastante necessários anticorpos monoclonais adicionais que apresentam reactividade com antigénios encontrados numa variedade de células tumorais. isto deve-se essêncialmente à heterogeneidade antigénica da maior parte dos tumores que muitas vezes necessitam, no çjiagnéstico ou terapia, da utilização de uma combinação de diferentes anticorpos monoclonais atingidos contra a mesma massa tumoral. Ainda, as anticorpos monoclonais que apresentem um elevado grau de reactividade com uma larga gama de tumores, ao mesmo tempo mostrando ausência ou apenas uma reactividade muito fraca com tecidos normais não são vulgares. Tais anti-corpos seriam claramente vantajosos. E assim óbvio que um anticorpo mo-noclonal reactivo com um antigénio expresso em níveis elevados por uma variedade de tumores pode tornar-se útil no diagnóstico precoce de cencros, numa melhor definição do alastramento do cancro, no controle imunológico de pacientes com cancro, assim como para oadesenvolvimento de métodos melhorados para terapia de cancros. E também aparente que os anticorpos monoclonais contra novas moléculas de superfície celular podem ser usados para melhor caracterização de tais moléculas as quais podem ser importantes para a preparação de imunogénios na forma de eacinas contra o cancro e que podem também ter importantes funções celulares, por exemplo como receptores de hormonas ou de factores de crescimento ou como moléculas envolvidas na comunicação in-tra e interce1u1 ar. Os antigénios podem ter também eles próprios actividade enzimática ou de factor de crescimento. \ -7- V *ν

SUMARIO DO INVENTO O presente invento proporciona um anticorpo monoclona, L45, o qual é específico para um sítio determinante num antigénio glicoproteico de superfície celular, o antigénio L45, associado a uma variedade de células tumorais humanas, incluindo células de carcinoma do pulmão, mama, ovário e cólon, e melanoma e sarcoma. Assim, o anticorpo do invento pode ser útil no diagnóstico e terapia de tumores, que expressam o antigénio L45 identificado pelo anticorpo L45. 0 anticorpo L45 do invento é da classe IgG e da subclasse IgG2a e nãoapresenta reactivida-de significativa com células humanas normais. 0 anticorpo do invento pode ser usado em métodos de diagnóstico j_n vitro para determinação da presença de uma condição maligna em tecido de pulmão humano e noutros tecidos humanos. Os métodos envolvem o exame do tecido quanto à presença de um antigénio tendo as caracteristicas da glicoproteina antigénica L45 de 100 000 daltons reactiva com oanticorpo L45. Por exemplo o tecido pode ser posto em ccntacto com o anticorpo monoclonal L45 do invento o qual define um sitio determinante num antigénio associado a células tendo as caracteristicas do antigénio L45 um equivalente funcional ou um fragmento deste anticorpo e são detectadas quaisquer interacção do referido anticorpo e determinantes antigénios. Tal método envolve a determinação da presença de células de carcinoma numa amostra suspeita de ter tais células. A espécie é posta em contacto com o anticorpo monoclonal que é capaz de distinguir tais células de outros tipos celulares que possam estar presentes na amostra. 0 contacto é efectuado em condições de ligação do anticorpo a tais células. Após o contacto, é determinada a presença ou ausência de ligação do anti-' -corpo às células da amostra. Esta ligação está relacionada -8-

com a presença ou ausência de células de carcinoma na amostra. Geralmente a amostra é posta em contacto com um membro de um par de ligação específica marcado do anticorpo monoclonal. Esta marca é capaz de produzir um sinal detec-tâvel. Como alternativa, o próprio anticorpo monoclonal -pode ser marcado.

Um outro método de diagnóstico envolve a localização ni vivo de um tumor através da administração a um paciente de um anticorpo purificado ou fragmento de anticorpo do presente invento marcado com um agente que dá um sinal detectável. A localização é então detec-tada usando cintigrafia externa, tomografia de emissão ou varrimento radionuclear. Este método pode também proporcionar melhores vias de enquadramento de pacientes com cancro no que respeita ao grau de doença a para controlar alterações da respesta à terapia. 0 invento também tem aplicação terapêutica, uma vez que o anticorpo L45 e anticorpos semelhantes podem reagir com o antigénio L45 que é expresso em elevadas concentrações na superfície de células tumoraís. 0 anticorpo monoclonal do invento pode ser usado pera preparar uma composição para o tratamento de tumores. A composição compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo em associação com um veículo parenteral farma-ceuticamente aceitável. 0 anticorpo do invento pode também ser usado em imunoconjugados como um veículo de vários agentes que tenham um efeito anti-tumoral' incluindo mas não estando restringido a drogas quimioterapeuticas , toxinas modificadoras de resposta imunológica e radioisótopos.

MF 0 invento também compreende o novo antigénio L45 caracterizado por um peso molecular de aproxi-madamente 100 000 daltons e tendo uma sequência de aminoá-cidos amino-terminal :S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-1- -9- -9-

\ em que X representa um aminoécido não identificado e equivalente, iden tificada pelo anticorpo L45 e a classe de anticorpos que se liga a este antigénio. 0 invento inclui métodos para usar o antigénio L45 purificado ou clonado como uma vacina para imunizar contra certos tumores. -10-

DESCRIÇAO DETALHADA DO INVENTO

Para que o invento aqui descrito possa ser melhor compreendido faz-se a descrição detalhada que se segue. 0 presente invento diz respeito a um novo anticorpo monoclonal designado L45, o qual é especi-ficamente reactivo com um antigénio (antigénio L45) localizado em células de tumor humano incluindo carcinomas do pulmão, cólon, mama, ovário e células de melanoma e de sarcoma, métodos para a produção do anticorpo monoclonal L45 e métodos de diagnóstico e terapêuticos empregando o anticorpo, o anticorpo L45 reaje com uma gama de tumores e não apresenta quase nenhuma reactividade com tecidos humanos normais ou com outros tipos de tumores tais como linfomas. 0 invento diz ainda respeito a um novo antigénio glicoprotelna de superfície celular, designado antigénio L45, associaco a tumores humanos do pulmão, mama, cólon, ovário e melanoma e sarcoma, e métodos para a utilização do antigénio L45. 0 anticorpo monoclonal do invento pode ser preparado por técnicas de fusão de hibridomas ou por técnicas que utilizam tecnologias de imorta1ização com EBV.

As técnicas de fusão de hibridomas foram primeiro introduzidas por Kohler e Milstein (ver, Kohler e Milstein (ver, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Brown et a 1. , J. Immunol . , 124(2): 539-46 ( 1981 ); Brown et al., J. B iol. Chem. 255:4980-83 ( 1980 ); Yeh et al; Proc. Nat'l. -11-

Acad. Sei. (USA) 76(6): 2927-31 ( 1976); e Yeh et aj_. , Int. J. Câncer 29:269-75 (1982)).

Estas técnicas envolvem a injecção de um imunogénio (e.g., antigénio purificado ou células ou extractos celulares tendo o antigénio) num animal (e.g. um murganho) de modo a induzir uma resposta imune prentendida (i.e., produção de anticorpos) naquele animal. Por exemplo pode ser usado como imunogénio células de carcinoma do pulmão humano derivadas de efusões pleurais, células em cultura derivadas de carcinomas do pulmão que não sejam de células péquenas (NSCLC) ou de células de um pulmão fetal normal ou lisadas derivadas de tais células. Neste exemplo ilustrativo, as células de tecido removido de um NSCLC (adenocarci noma de pulmão humano), linha CH3, foram usadas como imunogénio. As células foram injectadas, por exemplo, num ratinho e, apôs um tempo suficiente, o ratinho foi morto e obtidos os linfócitos somáticos produtores de anticorpos. As células produtoras de anticorpos podem derivar de nódulos linfáticos, baços e sangue periférico de animais sensibilizados. São preferidos as células do baço. Os linfócitos de ratinho dão uaa percentagem mais elevada de fusões estáveis com as mielomas de ratinho descritos abaixo. E também possível a utilização de células somáticas de rato, ovelha e rã. Os cromossomas de células do baço codificadores de imunoglobu-linas pretendidas são imortalizados através da fusão de células do baço dom células de mieloma, geralmente na presença de um agente de fusão tal como polietilenoglicol (PEG). Pode ser usada qualquer uma de uma série de linhas celulares de mieloma como pardde fusão de acordo com técnicas convencionais; por exemplo, as linhas de mieloma P3-NS1/1-Agu-1, P3-X63-Ag8.653 ou Sp2/0-Ag14. Estas linhas de mieloma podem ser adquiridas à American Type Culture Collection (ATCC), Rockvílle, Maryland. -12-

As células resultantes, que incluem os hibridomas pretendidos, são então cultivadas num meio selectivo, como seja meio HAT, em que as células parentais não fundidas de mieloma ou de linfocito eventualmente morrem. Apenas as células de hibridomas sobrevivem e podem crescer em condições de diluição limite para se obter clo-nes isolados. Os sobrenadantes dos hibridomas são despistados quanto à presença de anticorpo da especificidade pretendida, e.g., por técnicas de imunoensaio usando o antigé-nio que foi usado na imunização. Os clones positivos podem então ser eubclonados em condições de diluição limite e o anticorpo monoclonal produzido pode ser isolado. Existem vários métodos convencionais para o isolamento e purificação dos anticorpos monoclonais de modo a libertaflos de outras proteínas e de outros contaminantes. Métodos normalmente usados para a purificação de anticorpos monoclonais in-clisn percipitações com sulfato de amónio, cromatografia de permuta iónica e cromatografia de afinidade (ver, e.g. Zola et a 1., em Monoclonal Hybridoma Antibodies; Techniques and Applications, Hurell (ed.) pág. 51-52 (CRC Press 1982)). Os hibridomas produzidos de acordo com estes métodos podem ser propagados _i_n vitro ou ^_n vivo (em fluido de ascites) usando técnicas conhecidas (ver, de um modo geral, Fink et a 1. , supra, na página 123, Big. 6-1).

Geralmente, a linha celular individual pode ser propagada _ini vitro por exemplo em frascos de cultura e o meio de cultura contendo concentrações elevadas de um único anticorpo monoclonal especifico pode ser colhido por decantação, filtração, ou centrifugação. Como alternativa, a produção de anticorpo monoclonal pode ser aumentada injectando uma amostra do hibridoma num animal hito-compativel do tipo usado para proporcionar células somãtiias e de mieloma para a fusão original. Tumores secretando o anticorpo monoclonal especifico produzido pelo hibrido de células fundidas desenvolvem-se no animal injectado. Os fluidos do corpo do animal, tais como fluido de axites ou -13-

soro, proporcionam anticorpos monoclonais em concentrações elevadas. Conforme discutido por Cole et a 1., supra, quando se usa hibridomas humanos ou hibridomas EBV, é necessário evitar a rejeição do enxerto injectado em animais como sejam ratinhos. Podem ser usados ratinhos imunodeficientes ou labro ou o hibridoma pode ser passado primeiro em ratinhos labro irradiados como um tumor subcutâneo sólido, cultivado in vitro e depois injectados intraperitonealmente em ratinhos Labro irradiados previamente injectados com prista-no, os quais desenvolvem tumores ascitos secretando grandes quantidades de anticorpo monoclonaís-especificos humanos (ver Cole et al., supra).

Para certas aplicações terapêuticas os anticorpos monoclonais humanos ou quiméricos (ratinho--humano) podem ser preferidos aos anticorpos murinos, devido aos pacientes tratados com anticorpos de ratinho produzirem anticorpos humanos anti-ratinho. (Shawler et al., J. Immunol. 135:1530-35. Anticorpos monoclonais quiméricos ratinho-humano reactivos com o antigénio L45 podem ser produzidos, por exemplo, por técnicas recentemente desenvolvidas para a produção de anticorpos quiméricos (Or et al., Biotechnologies 4( 3):314-221 (1986); Liu et al., Proc. Nat1 1 Acad. Sei (USA) 84:3439-43 (1987)). Assim, genes codificadores de regiões constantes da molécula de anticorpo murino L45 são substituídos com o genes humanos, codificadores das regiões constantes de um anticorpo com actividade biológica adequada (como seja a capacidade de activar complemento humano e mediar ADCC). Novos anticorpos de origem murina du humana, podem também ser feitos contra o antigénio L45 tendo as funções biológicas adequadas. Por exemplo podem ser feitos anticorpos monoclonais humanos usando o antigénio, e.g. o antigénio L45 do invento, para imobilizar linfócitos humanos contra o antigénio _i_Q. vitro seguido de transformação com EBV ou hibridação dos linfócitos sensibilizados com antigénio com linfócitos de ratinho ou humanos, como descrito por Borrebaeck et al. (proc. Nat'l Acad. Sci(USA) 85:3995-999(1988'

Oe acordo com uma realização preferida, o anticorpo deste invento, designado L45, foi produzido via técnicas de hibridoma usando uma linha celular de adenocarcinoma do pulmão CH3 como imunogénio conforme descrito bo Exemplo infra. 0 hibridoma L45, produzindo o anticor po L45, foi depositado qa ATCC, Rockville, Maryland e foi identificado como se segue: L45 No. de Acesso: HB 4804 0 anticorpo L45 é da subclasse IgG2a. 0 anticorpo apresenta uma reactividade muito forte com células tumorais de uma variável de tipos, por exemplo, carcinomas da mama, pulmão, cólon e ovário, assim como um melanomas e sarcomas malignos. 0 anticorpo L45 não apresenta ligação detectável às linhas celulares de linfoma, CEM, MOLT-4 e a linha de linfoma de células B p3Hr-1.

Em adição, o anticorpo deste invento não apresenta qualquer ligação imuno-histológicamente detectável a tecidos humanos normais, tais como fibroblastos células endoteliais ou células epiteliais dos principieis orgãos, e.g. rim, baço, fígado, pele, pulmão, mama, cólon, cérebro, tiróide coração, nódulos linfáticos ou ovários. 0 anticorpo também não reage com leucócitos do sangue periféricos. Assim este anticorpo é superior à maior parte dos anticorpos anti-tumorais conhecidos na sua especificidade para uma gama de células tumorais e no seu elevado grau de especificidade para células tumorais comparado com células normais (ver, e.g., Hellstrom et al., Covalentey Modified Antigenes and Antibodies In Diagnosis And Therapy, Quash/ /Rodwell (eds.), pág. 24-28 (Mareei Dekker, Inc. (1989); e Bugshawe, Br. J. Câncer, 48: 167-75 (1983)).

Deverá ser compreendido que o presente invento engloba o anticorpo L45 descrito atrás e quais- -15- quer fragmentos dele contendo a região de ligação activa do anticorpo, como seja Fab, F(ab1)2 e fragmentos FV. Tais fragmentos podem ser produzidos a partir do anticorpo L45 usando técnicas bem estabelecidas (ver, e.g. Roussevau et a 1., em Methods Enzymol, 121:663-69 Academic Press, (1986)).

Em adição, 0 presente invento engloba anticorpos que são capazes de se ligarem ao mesmo determinante antigénico que 0 anticorpo L45 e competindo com 0 anticorpo L40 para ligação naquele sítio. Estes incluem anticorpos tendo a mesma especificidade antigénica do anticorpo L45 mas diferindo na origem, isotipo, aflinidade de ligação ou função biológicas (e.g. citotoxicidade). Por exemplo, classe, isotipo e outras variantes do anticorpo do invento podem ser construídas usando técnicas de recombinantes de alteração de classe e fusão beom conhecidas na área (ver, e.g., Thammana et al., Eur J. Immunol. 13:614 (1983); Spura et al., J.Immunol Meth., 74:307-15 (1984); neuberger et al., Nature, 312: 604-08 (1984); e Oi et al., supra). Assim anticorpos quiméricos ou outros anticorpos recombinantes (e.g., anticorpo fundido com uma segunda, proteína como seja um linfoquina) tendo a mesma especificidade de ligação do anticorpo L45 estão dantro do âmbito deste invento. Ainda, uma vez que o antigénio L45 a que se liga 0 anticorpo do invento se liga a um novo antigénio tumoral, 0 anticorpo do invento inclui anticorpos que se ligam a qualquer determinante antigénico naquele antigénio L45; incluindo outros determinantes além daqueles com que 0 anticorpo L45 reage.

Também estão incluídos no âmbito do invento anticorpos anti-idiotipicos do anticorpo L45 do invento. Estes anticorpos anti-iiotipicos podem ser produzidos usando 0 anticorpo L45 como imunogénio e são úteis para fins de diagnóstico na detecção de resposta humana a tumores e em aplicações terapêuticas, e.g. numa vacina, para induzir uma resposta anti-tumoral em pacientes (ver, e.g., Neptn -16-

et al., Câncer And Metastasis Reviews, 6:487-501 (1987); e Ler et al; Proc. Nat'I♦ Acad. Sei (USA), 82:6286-40 (1985)). 0 anticorpo L45 pode ser usado para isolar e caracterizar o antigénio L45 a que se liga. Assim L45 pode ser usado como sonda para identificar e caracterizar o epítopo reconhecido pelo anticorpo e para ainda definir o antigénio L45 na superfície das células de carcinoma (ver, e.g. Hakomori, Ann. Rev. Immunol., 2:103-26 (1984); Brown et al., J.Immuno1. 127-534-546 (1981); Brown et al., Nature. , 296:1 71 -173 ( 1982); e Rose et al; Proc. Nat1 21 Acad. Sei. (USA), 83:1261-1265 (1986)).

15 20 25 -P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F 1 0 antigénio L45 reconhecido pelos anticorpos monoclonais do presente invento compreende um novo antigénio g1icoproteína de superfície celular caracte-rístico de células tumorais carcinomas da mama, cólon, ovário e pulmão assim como melanomas e sarcomas. 0 antigénio L45 tem um peso molecular de aproximadamente 100 000 daltons quando sujeito a imunoprecipitação em electroforese em gel de poliacrilamida. A sequência de aminoácidos amino-terminal do novo antigénio glicoproteína L45 é a seguinte: 2 5 10

W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I onde X representa um aminoácido que não foi ainda identificado e o resto das letras representa as abreviaturas convencionais de uma única letra para os aminoácidos. Uma comparação da sequência amino-terminal de 26 resíduos de L45 com a guardada nas bases de dados normais sobre proteínas (PIR Release 16, Março 1988) não revelou homologiasignificativa -17-

de sequências com quaisquer outras sequências conhecidas. 0 anticorpo monoclonal do invento é também útil em aplicações de diagnóstico, tanto in vitro como j_n vivo, para a detecção de tumores humanos portadores do antigénio L45 com o qual o anticorpo L45 é especificamen-te reactivo. Os métodos de diagnóstico ni vitro são bem conhecidos (ver, e.g. Roth, supra e Kupchik, supra) e incluem detecção imuno-histológica de células tumorais (e.g. em tecido humano, células ou amostras de tumores removidas) ou detecção serológica de antigénios associados a tumores (e.g. em amostras de sangue ou noutros fluidos biológicos).

As técnicas imuno-histológicas envolvem o contacto €e uma amostra biológica como seja uma amostra de tecido tumoral com o anticorpo do invento e depois detecção da presença na amostra do anticorpo complexa-do com o seu antigénio. A formação de tais complexos anti-génio-anticorpo com a amostra indica a presença de células tumorais no tecido. A detecção do anticorpo na amostra pode ser conseguida usando técnicas conhecidas tais como técnica de coiração com imunoperoxidase, a técnica de avidi-na (ABS ou técnicas de imunofluorescência (ver, e.g. Ciocca et a 1., Meth Enzymol. 121:562-79 ( 1986); Hellstrom et al., Câncer Research, 46:3917-23 (1986); e Kimball (ed.) Intro-duction to Imunology (2a ed.), pãg. 113-117, Macmillan Publ. Co. (1986)). Por exemplo, a coloração com imunoperoxidase foi usada como descrito no Exemplo III, infra, para demonstrar a reactividade do anticorpo L45 com carcinomas do pulmão, marna, cólon e melanomas e sarcomas e a ausência de reactividade do anticorpo com amostras de tecido humano norma 1.

As técnicas de diagnóstico seroló-gico envolvem a detecção e quantificação de antigénios associados a tumores que foram secretados ou ."arrastados"

para o soro ou outros fluidos biológicos de pacientes que se pense sofrer de carcinoma. Tais antigénios podem ser detectados nos fluidos do corpo usando também técnicas conhecidas tais como radioimunoensaios (RIA) ou ensaios imu-no-sorventes ligados a enzimas (ELISA) em que um anticorpo reactivo como antigénio "arrastado" é usado para detec-tar a presença do antigénio numa amostra de fluido (ver, e.g., Uotila et al., J. Immunol Methods 42:11 (1981) e Allum et al., supra, na pág 48-51). Estes ensaios, usando o anticorpo L45 aqui descrito podem portanto ser usados na detecção em fluidos biológicos do antigénio L45 com o qual o anticorpo L45 reage e portanto na detecção de vários carcinomas e melanomas em pacientes humanos. Assim, é aparente do que foi dito que o anticorpo L45 do invento pode ser usado na maior parte dos ensaios envolvendo reacções antigénio anticorpo. Estes ensaios incluem, mas não estão limitados a técnicas convencionais de RIA, em fase sólida e em fase liquida, assim como processos de ensaios ELISA, técnicas de imuncfluorescência e outros ensaios imunocitoquímicos (ver, e.g. Sikora et al (eds.), Monoclonal Astibodies pág. 32-52, Blackwell Scientific Pub1ications , ( 1984). 0 anticorpo L45 do invento é também útil para aplicações de diagnóstico in vivo passa a detecção de tumores humanos. Tal abordagem envolve a detecção de tumores in vivo por técnicas visualização de tumores usando o anticorpo marcado com um reagente de visualização adequado que produz um sinal detectável. Os reagentes de visualização e processos para a marcação de anticorpos com tais reagentes são bem conhecidos (ver, e.g., Wensel and Meares, Radio Immunoimaging and Radioimunotherapys, Eh-sevies, New York (1983); Colcher et al., Method Enzymol. 121:802-16 (1986)). 0 anticorpo marcado por ser detectado por uma técnica como seja varrimento radionuclear (ver, eg. Bradwell et al., em Monoclonal Antibodies for Câncer Detec-tion and Therapi, Baldwing et al., (eds.) pâg. 65-85, Aca- -19- demic Press (1985)). 0 anticorpo L45 do invento tem uma série de aplicações terapêuticas _i_n vivo. Além de ser usado sózinho no direccionamento para células de tumor, o anticorpo pode ser usadoconjuntamente com um agente terapêutico adequado para tratar cancro humano. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado ou ligado a uma droga terapêutica ou toxina para libertação do agente terapêutico no sítio do cancro. São bem conhecidas técnicas para conjugação de tais agentes terapêuticos a anticorpos (ver, e.g. Mono-clonal Antibodies and Câncer Therapy, Reísfeld et al (eds.), pág. 243-55, Alan R. Liss, Inc., (1989); Hellstron et al., em Controlled Drug Dellvery (2ne ed.), Robínson et al (eds.) pág. 623-53, Mareei Dekker, Inc., (1987); Thorpe, Monoclonal Antibodies 84: Bloloqical and Ciinical Applications Pinchura et al (eds.) pág. 475-506 (1985); e Thorpe et al., ímmunol. Rev. 62:119-58 (1982)). Uma vez que o anticorpo L45 eão é fácilmente interna1ízado quando as células são expostas a ele in vitro, é preferível direccionar as drogas quimíote-rapêuticas para células tumorais através do acoplamento do anticorpo a uma enzima, usando técnicas de UNA recombí-nante. Quando tais conjugados estão localizados no tumor a enzima pode converter uma prodroga ínactiva (não tóxica) que é administrada apôs os conjugados se terem ligado â$ células tumorais. em droga anti-cancro activa (Ver, e.g. Senter et al., Proc. Nat'l Acad. Scl (USA), 85:4842-46 ( 1988).

Como alternativa, o anticorpo pode ser acoplado a radiação de alta energia, e.g., um radíoisõ-131 topo tal como I, o qual quando localizado no sítio do tumor, resulta na morte de vários diâmetros de células (ver, e.g. Order, em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy , Baldwin et al. (eds.), pág. 303-16 Academic

Press, (1985)). -20-

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Ainda de acordo com uma outra realização, o L45 pode ser conjugado com um segmento anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado para o tratamento de células tumorais como descrito por Segai na Patente dos Estados Unidos 4.676.980.

Ainda outras aplicações terapêti-cas para o anti-corpo L45 do invento incluem a sua utilização, quer na presença de complemento quer como parte de um conjugado anticorpo-droga ou anticorpo-toxina e para remover células tumorais de medula óssea de pacientes com cancro. Oe acordo com esta abordagem medula óssea autologa pode ser purgada exvivo por tratamento com o anticorpo e a medula novamente introduzida no paciente (ver, e.g. Ramsay, et al., J. Clin. Immunol, 8(2): 81-88 (1988)).

Ainda, anticorpos quiméricos ou outros anticorpos recombinantes. Por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antigénio L45 ligado a pelo menos uma fracção funcionalmente activa de uma segunda proteína tendo actividade anti-tumoral, e.g. uma linfoquina ou oncostatina, pode ser usada para tratar tumores humanos j_n vivo. Em adição, um anticorpo quimérico L45 em que a região de ligação ao antigénio de L45 é ligado a uma região F: humana, e.g. IgG1, pode ser usado para promover citotoxiciJade celular dependente de anticorpo ou citotoxicidade mediada pelo complemento. Ainda, técnicas recombinantes conhecidas podem ser usadas para construir anticorpos bi-específicos em que uma das especificidades de ligação do anticorpo é a de L45 (ver, e.g. Patente dos Estados Unidos 4.474.893).

Finalmente, anticorpos anti-idio-tipicos do anticorpo L45 podem ser usados terapêuticamente na imunização activa contra tumores e terapia de tumores -21- \

(ver, e.g. Hellstrom et al., Immunologica 1 Approaches To Tumor Therapy Monoclonal Antibodies, Tumor Vaccines And Anti-Idiotypes", em Bovalently Modified Antigens And Antibodies In Diagnosis and Therapy, supra, na pág. 35-41). E portanto aparente que o presente invento inclui composições farmacêuticas, combinações e métodos para o tratamento de tumores humanos. Por exemplo, o invento inclui composições farmacêuticas para usar no tratamento de tumores humanos compreendendo uma quantidade farmacêuticamente eficae de um anticorpo L45 e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições podem conte r o anticorpo L45, madificado conjugado com um agente terapêutico (e.g., droga, toxina, enzima ou segundo anticorpo) ou ruma forma recombinante (e.g. L45 quimérico ou bi-es-pecifico). As composições podem ainda incluir anticorpos ou conjugados para o tratamento de carcinomas (e.g. mistura de anti-corpos ) .

As composições de anticorpo do invento podem ser administradas usando métodos convencionais de administração incluindo mas não estando limitado a administração intravenosa, intraperitonea1 , oral, intra1infáti-ca ou administração directa no tumor. E preferido a administração intravenosa.

As composições de anticorpo do invento podem ser numa variante de formar de dosagem as quais incluem, mas não estão limitadas a, solúções líquidas ou suspensões, conprimidos, pílulas pós, supositórios, micro cápsulas poliméricas ou microvesícuias, lipcssomas e soluções injectáveis ou para infusão. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica.

As composições de anticorpo também incluem preferêncialmente veículos farmacêuticamente -22-

aceitáveis convencionais e adjuvantes conhecidos, tais como albumina sérica bovina, permutadores de iões, alumina, lecitina, substâncias tamponantes tais como fosfato de glici-na, ácido sórbico, sorbato de potássio e sais ou electroli-tos tais como sulfato de protessina. 0 modo mais efeicaz de administração e o regime de dosagem para as composições deste invento dependem da gravidade e do curso da doença da saúde, do paciente, e da resposta ao tratamento e do critério do médico assistente. Assim, as dosagens das composições deverão ser tituladas para o paciente individual. No entanto, uma dose eficaz das composições de anticorpo deste invento pode estar na gama de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 2 mg/m . 0 novo antigénio do presente invento referido como antigénio L45 pode também ser usado para fins terapêuticos. 0 antigénio pode ser purificado a partir dos tumores ou produzido por tecnologia de DNA recom-binante (Brown et a 1., Pedido de Patente U.S. copendente No. de Série 827.313, Attorney Dodeet No. 5624-008, entregue em 7 de Fevereiro úú, 1 985, aqui incluído como referência). 0 gene codificador do antigénio L45 pode ser clonado por métodos que primeiro fazem o anriquecimento em mRNA do antigénio L45. Através de um destes métodos, polissomas (Cons-ti ndo em ribassomas com um mRNA e cadeias polipeptidicas nascentes) podem ser purificados por cromatografia de imu-ncafinidade com anticorpo que reconhece o determinante antigénio L45 na cadeia nascente, 0 mRNA é isolado por imuno-precipitação com e.g., anticorpo L45 e o DNA é clonado num vector de expressão adequado. Como alternativa o antigénio L45 ou anti-soro contra antigénio L45 deve ser usado no despiste de uma biblioteca de cDNA um vector de expressão. 0 antigénio L45 purificado ou clonado pode ser administrado sôzinho ou como imunogénio ou juntamente com um adjuvante -23-

imunolôgico adequado. 0 antigénio L45 purificado ou clo-nado pode ser usado nos métodos do invento como uma vacina para imunizar contra certos tumores. São conhecidos processos para a preparação de tais vacinas (ver, e.g. Estin et a 1., Proc. Nat'1 Acad. Sei (USA), 85:1052 ( 1988)). Resumidamente, são construídos vírus recombinantes para a expressão do antigénio clonado associado a tumores, por exemplo o antigénio L45. As células infectadas com os vírus recom-binantes expressarão o antigénio de tumor na superfície das células juntamente com os antigénios de histocompatibi1 idade do hospedeiro e proteínas imunogénicas virais. Isto favorece a indução de imunidade celular que desenpenha um papel chave na rejeição de tumores. Um vírus é por exemplo o vírus da eacina derivado de um vírus purificado em placa de vacina da varicela Wyeth (espécie de ^ew York City Board of Health), é usado para construir um vírus recombinante contendo a sequência codificadora do antigénio L45 sob o controle do promotor do vírus da vacina "7,5 K" (Hu et al., J.Virol 62:176-180 (1980). 0 vírus recombinante pode ser então administrado intravenosamente como uma vacina para proteger contra o cancro.

Para que o invento aqui descrito possa ser melhor compreendido, são descritos os exemplos que se segue. Oeverá ser entendido que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser passados como limitantes deste invento de qualquer modo. -24- -24-

EXEMPLO I

Preparação do anticorpo monoclonal L45 0 antigénio monoclonal L45 do invento foi produzido usando técnicas de fusão de hibridomas descritos anteriormente por Yeh et al., Proc. Nat1!. Acad.

Sei (USA). (1979), supra). Resumidamente, um ratinho NALB/c de três meses de idade foi imunizado usando culturas de células de um adenocarcinoma humano do pulmão, designado CH3, como imunogénio. 0 ratinho recebeu seis (6) injecções in-traperitoniais (i.p.) e aproximadamente 10^ células para cada imunização. Três dias apôs a última imunização ò base foi removido a células do baço foram suspensas em meio de cultura. As células do baço foram então fundidas com células de mieloma de ratinho transfectadas NS1 com genitici-na (Kohler e Milstein, supra), usando polietilenoglicol (PE6) e a suspensão celular cultivada em poços de microtitulação em meio HAT selectivo como descrito por Yeh et al., Proc.

Nat1 1 . Acad. Sei (USA) , supra. A mistura foi semeada para formar culturas de baixas densidade a partir de células fundidas isoladas ou clones.

Os sobrenadantes destas culturas de hibridoma foram então despistados quanto à ligação à linha celular do pulmão CH3, e novamente co meulturas de curto prazo de fibroblastos humanos usando um ensaio de ELISA semelhante ao descrito por Donillard et al., Meth. Enzymol. 92: :168-74 (1983). De acordo com este ensaio, o antigénio (com o qual é reactivo o anticorpo a ser testado) é imobilizado em placas de microtitulação e depois incubado com sobrenadantes de hibridoma. Se um sobrenadante possuir o anticorpo pretendido, o anticorpo ligar-se-à ao antigénio imobilizado e é detectado pela adição de um conjugado de anticorpo anti-imunoglobulina-enzima e um substrato para a enzima que leva a uma alteração mensurável na densidade ôptica.

-25-

Para este exemplo, células de cancro do pulmão ou células fibroblasticas testemunha ou leucócitos do sangue periférico (PBLs) foram distribuídos por uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (Costar, Cam-bdrige, MA) e incubados durante a noite numa incubadora húmida a 37°C (5% (O2) - As células foram então fixadas com 100 ul de glutaraldeido a 1,0¾ preparado de fresco para uma concentração final no poço de 0,5% e incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem três vezes com PBS 1x ..

As células foram em seguida bloqueadas durante 30 min. com BSA a 5% em PBS e lavadas novamente três vezes com PBS. Os sobrenadantes das culturas de hibridomas foram então adicionados a 100 ul/poço, os poços foram incubados durante 1 h è temperatura ambiente e as células lavadas três vezes com PBS. Em seguida adicionou--se 0 conjugado de puroxidase de rábano silvestre e anticorpos de cabra anti-ratinho (Zymed, CA), diluido em 0,1% de BSA e adicionou-se PBS para uma ccrcentração de 100 ul/poço. A mistura de reacção foi incubada durante 1 h à tem-pe-ratura ambiente ou 30 min a 37°C e as células foram então três vezes coM PBS. Adicionou-se então 0 fenilenodiamina (0PD) a 100 ul/poço e as placas foram incubadas no escuro à temperatura ambiente durante 5-45 min. A ligação dos anticorpos ãs células foi detectada por mudança de côr aos poços que ocorreu dentro de 10-20 minutos. A reacção foi parada pela adição de 100 ul/poço de H2S04 e a absorvância lida com auto-leitor de Microelisa Dynatech (Alexandria, VA) a 492 nm.

Os poços ainda positivos em linhas celulares imunizantes e negativos em PBLs foram testados por técnicas de imuno-histo1ogia em sedimentos de linhas celulares imunizantes e tecidos normais de rim, fígado e baço.

Deve-se notar que este ensaio pode ser efectuado usando células intactas ou antigénio solúvel purificado ou extractos celulares como antigénio imobilizado. Quando se usou antigénio solúvel ou extractos celulares como antigénio, o antigénio foi inicialmente semeado a 50 ul/poço em PBS e as placas foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente antes do começo do ensaio. Quando se usa células intactas como antigénio elas podem ser usadas frescas ou após fixação. Em ambos os casos as células foram inicialmente semeadas a 10 células a 100 μ\! /poço em meio de cultura de incitados durante a noite numa estufa a 37°C (5%(02).

Os hibridomas que produziram anticorpos que se ligara? â linha

EXEMELO II

Caracterização do anticorpo monoclonal L4I>

Determinação do isotipo

Para determinar a classe de imu-noglobulina produzida pelo hibridoma L45, utilizaram-se as seguintes técnicas. a) Imunodifusão Ouchterlony

Uma pequena quantidade de sobrena-dante das células de hibridoma L45 foi colocada no poço do centro de uma placa de agar a 25%. Anticorpos monoespecifi-cos de coelho anti-isotipos de Ig de ratinho (Southern Bio-technology, Birmingham, AL) foram colocados nos poços exte- -27-

riores e a placa foi incubada durante 24-48h a 37°C. leu--se então as linhas de precipitação.

b) Isotipagem por ELISA

Placas de 96 poços dynatech Immu-lon doram revestidos com anticorpos de cabra anti-Ig de ratinho a uma concentração de 1 ug/ml. 50 ul/poço em PBS e deixada coberta durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas com PBS/Tween 20, 0,05¾ e bloqueadas com meio 100 u1/ /poço durante 1 h â temperatura ambiente. Apôs lavagem das placas os sobrenadantes do hibridoma L45 foram adicionados e incubados à temperatura ambiente durante 1 h. Após kvagem com PBS contendo albumina do scro bovina (BSA) as placas foram incubadas a 37°C durante 2 h com anticorpos monoespe-cificos de coelho anti-isotipo de Ig de ratinho acoplados a peroxidase (Zymed). Após lavagem, as placas foram incubadas com 1 mg/ml de o-fenilenodiamino e 0,03% de H202 em tampão citrato 0,1M pH 4,5. A densidade óptica foi determinada a 630 nm num leitor de placas de ELISA Dynatec.

Com base nestes processos, determinou-se que o anticorpo monoclonal L45 é do isotipo IgG2a.

Carasteristicas de ligação do anticorpo monoclonal L45 A localização subcelular do anti-génio foi determinada através da mediação da ligação do anticorpo às células antes ou depois da permeabi1ização com detergente não íónico. A ligação de anticorpos à superfície celular de células em cultura intactas foi identificada por fluorescência directa usando um conteúdo de células ac-tivas por fluorescência (FACS)II como descrito por Hellstrom et al., Câncer Research 46:3817-3923 (1986). Resumidamente, para as análises de ligação usando um contador de células FACSII, 1χ106 células em culturas foram colocadas em úreio IMDM (GitxD, Grand Island, NY) suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS) para um volume total de 500 ul/tubo. As células foram centrifugadas durante 1,5 min. num Serofuge e removido o sobrenadante 100 ul do anticorpo monoclonal L45 e 10 ug/ml foi adicionado a cada tubo, o conteúdo dos quais foi então misturado a incubado em gelo furante 30 min. A mistura de reacção foi lavada três vezes com 500 ul de 15% FBS/IMDM por centrifugação durante 1,5 min na Serofuge (os tubos secos após a terceira lavagem). Em seguida 50 ul de anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com FITC optimizado (Tago, Burglingame, CA) diluido a 1:25 em 15% FBS/IMDM foi adicionado a cada tubo e a mistura de reacção foi misturada e incubada durante 30 min. 0 passo de lavagem foi então repetido e após secagem dos tubos, cada sedimento foi ressuspenso em 200-500 ul de PBS. Cada uma das amostras foi avaliada num Coulter Epics C FACS e determinada a intensidade média de fluorescência (MFI). A partir da MFI determinou-se o equivalente linear de fluorescência (LFE). 0 LFE de cada amostra a testar dividido pelo LFE de uma testemunha negativa deu uma razão entre a fluorescência de células coradas por anticorpos específicos vs tes temunha (1,0 = nenhuma diferença na fluorescência, 2,0 = = fluorescência duas vezes mais intensa , etc.). Os dados de ligação estão apresentados na Tabela 1 abaixo. TABELA 1

Ligação do anticorpo L45 a várias linhas celulares

Linhas celulares 2981 carc i noma (_ca_) do pulmão CH3 ca. do pulmão 2707 ca. do pulmão HCT116 ca. do pulmão 3477 ca. da mama RCA ca. do cólon 3347 ca. da mama C ca. do cólon

linfócito I CEM

linfócitos T MOLT linfoma B P34R-1 Células do sangue periféricos

Taxa de ligação do anticotpo L45 _ 15,6 3.3 1 ,0 7.4 13,5 21 ,0 1,6 24,3 1 ,0 1 ,3 1 ,0 1 ,0

Tal como a Tabela 1 demonstra, o anticorpo monoclonal L45 reage com linhas celulares de carcinoma do pulmão, mama e cólon, mas não reage com linhas celulares de linfoma T ou B nem com leucócitos normais de sangue periférico. -30-

Imuno-histologia A técnica PAP de L.A. Sternberger como descrito em Immunochemistry pág. 104-69, John Wiley & Sons, New York (1979), conforme modificado por Carrigneset a 1. , Int. J. Câncer, 29:511-15 ( 1982), foi usada nos estudos imuno-histológicos em secções de tecido congelado. Os tecidos alvo para estes testes foram obtidos por cirOrgia e congelados dentro de 4h apôs remoção usando isopentano pré-ar-refecido em azoto líquido. Os tecidos foram então guardados em azoto líquido ou a -70°C até serem usadas. Preparam--se então secções congeladas, secaram-se ao ar, trataram--se com acetona e secaram-se novamente (ver Garrigues et a 1., supra). As secções a serem usadas na avaliação histológica foram coradas com hematoxi1ina. Para diminuir os fundos inespecíficos, as secções foram pré-incubadas com soro humano normal diluodo a 1/5 em P3S (ver Garrigues et a 1. , Supra) . Os anticorpos de ratinho, anticorpos de coelho anti-ígG de ratinho e PAP de ratinho foram diluídos numa solução de soro humano normal a 10¾ e soro de coelho a 3%. 0 soro de coelho anti IgG de ratinho (Sternberger-Meyer Immu-nochemicals, Inc., Jarettsvi1 le, MD) foi usado a uma diluição de 1/50. Os complexos de peroxidase-antiperoxidase de ratinho (PAP, Sternberger-Meyer Immunochemica 1s , Inc.) contendo 2mg/ml de PAP especificamente purificado foram usados numa diluição de 1/80. 0 processo de coloração consistiu no testamento de acções seriadas com anticorpo específico, i.e., L45 ou um anticorpo testemunha durante 2,5h, incubando as secções durante 30 minutos à temperatura ambiente com soro de coelho anti-ígG de ratinho diluído a 1/50 e depois expondo as secções a complexos PAP de ratinho diluídas a 1/80 durante 30 mín. à temperatura ambiente. Após cada tratamento com anticorpo, os cortes foram lavados duas vezes em PBS. -31-

A reacçãc inr.uno-histoquimica foi revelada adicionando tetra-hidrocloreto de 3,3 '-diaminoben-zidina a 0,5¾ (Sigma Chemical & Co., St. Louis, MO) e 0,01% de H202 em tampão Tris 0,05M, pH 7,6, durante 8 min (ver Hellstrom et a 1., J. Immunol. 127:57-60 (1981). Exposição a uma solução de 1% de OsO^ em água destilada durante 20 min intensificou a côr. As secções foram lavadas com água e montadas em lâminas. Secções paralelas foram coradas com hematoxi1ina.

Os cortes foram avaliados individualmente sob código e as amostras codificadas foram observadas por um investigador independente. Os cortes típicos foram fotografados usando óptica de contraste de fase diferencial (Zeiss-Nomarski). 0 grau de coloração de anticorpo foi avaliado como o (nenhuma reactividade), + (células muito fracamente positivas), ++ (pelo menos um terço das células positivas), +++ (a maior parte das células positivas), ++++ (todas as células fortemente positivas). Devido às diferenças entre coloração+e o eram menos claras do que entre coloração + e ++, uma coloração classificada como ++ ou mais foi considerada “positiva. Ambas as células neoplási-cas e de estroma foram observadas em amostras de tumores. A coloração registada é a de células tumorais devido !às células de estroma não terem corado de todo cu terem corado muito mais fracamente do que as células tumorais. A Tabela 2 abaixo apresenta a coloração imuno-histolôgica de várias amostras de tumor e de tecido normal usando o anticorpo monoclonal L45. Tal como a tabela claramente mostra, o anticorpo L45 reage em uma larga gama de amostras de tumor humano e não apresenta reac-tividade com qualquer um de uma série de tecidos humanos normais testados. -32-

TABELA Z

Coloração com imunoperoxidase de amostras de tecido tumorais e normais com o anticorpo monoclonal L45

Tipo de tecido Ligação do anticorpo (Número de tumores positivos/ Número total de tumores testados ca. do cólon 13/13 ca. do pulmão 10/13 ca. da mama 15/15 ca. do ovário 5/6 melanoma 8/8 sarcoma 4/6

Tecidos normais: baço 0/3 rim 0/4 fígado 0/4 coração 0/1 ovário 071 adrenais 0/1 test i cu 1 os 0/1 mama 0/8 amígdala 0/1 pele 0/5 pulmão 0/5 cólon 0/5 cérebro 0/2 t i rõi de 0/3 nódulos linfáticos 0/2 -33-

EXEMPLO III

Antigénio L45 reconhecido pelo anticorpo L45

Purificação

Para caracterizar o antigénio reativo com o anticorpo L45, o antigénio L45 foi isolado a partir de células A549 (ATCC, Rockville, MD) e purificado por cromatografia de imunoafinidade. 0 antigénio L45 foi solu- bilizado a partir de membranas das células A549 com 0,5% NP40 em tampão 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, contendo Q,15M NaCl e 1 mM feni Imetano-su1fonilfluoreto e purificado por croma-tografia de imuniafinidade. A coluna foi preparada acoplando a anticorpo L45 a agarose activada com carbonildiimida-zolo (Reacti-Gel (Ex.), Pierce, Rockford, 1L). O antigénio L45 ligado foi eluido do suporte de afinidade com tampão 0,5M glicina-HCl, pH 2,3, contendo 0,5% NP40 e 0,15 M NaCl. 0 antigénio L45 eluido foi ainda purificado por electrofo-rese preparativa em gel do dodeci lsulfato de sódio-poliacri-lamida (SDS-PAGE) num gel de 15% de acrilamida. Após elec-troforese, o gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue, 2,5% por peso em ácidos acético a 10% e 30% isopropanol) e descorado numa solução de ácido acético (5%, v:v) e metanol (17%, v:v). A banda de antigénio L45 corada (mr 100.000) foi removida com uma lâmina de barbear e imediatamente submetida a electroeluiçãc com um ECU-040 E 1 ectroe1utor/Concen-trator (C.B.S. Scientific Co., San Diego, CA) como descrito por Hunkapiller, et al., Methods in Enzymology 91-227-236 ( 1983).

Análisedas sequências

Fez-se degradação automática de Edenan com duas preparações de antigénic L45:1 ) 36 pmoles de antigénio e 2) 14 pmoles de antigénio num sequênciador de proteína pulsálii em fase liquida (Modelo 475A, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Os derivados de amifto-ácidos com feniltio-hidantoína foram analisados por croma-tografia líquida de alta resolução em fase reversa (HPLC) em linha com um unidades de HPLC Modelo 120A (Applied Biosystems, INC.) usando uma coluna PTH C18 e um gradiente de acetato de sõdio/tetra-hidrofurano/acetonitrilo para elui-ção. A sequência de amincácidos amino-terminal do antigénio L45 é a seguinte: 15 10 15 20 25

W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácidc que não foi identificado.

Uma comparação da sequência amino--terminal de 26 resíduos de L45 com a base de dados PIR (PIR Release 180, Setembro, 1588; GenBenk Release 57.0, Setembro, 1988; NEW, 30 de Novembro, 1588; DIF 30 de Novembro, 1988; SWíSS PROT, 30 de Novembro, 1988; e L0SPR0, 30 de Novembro, 1983) não revelou homologia de sequências significativa com qualquer outra sequência conhecida. 0 antigénio reconhecido pelo anticorpo L45 é um antigénio proteico com aproximadamente 100.000 daltons de peso molecular (Mr). -35- Λ

Caracterização imunolôgica A) Análise de transferências Western 0 antigénio L45 purificado por imunoafinidade foi sujeito a SDS-PAGE (7,5% de acrilamida, Mini-Protean II E1 ectropflioresis Cell, Bio-Rad, Richmond, CA), como descrito por Laemmli, U.K., Nature 227:680-585 (1970) e transferido e1ectroforeticamente (Mini Trans-Blot Electric Transfer Cell, Bio-Rad, Richmond, CA) a membrana de "nylon" Hybond-N (Amarsham Corp. Arlington Heigts, IL), como descrito por Tanbin, et a 1. , Proc. Nat1 1 Acad. Sei. USA 76:4350-4354 (1979), excepto ter-se omitido metanol no tampão de transferência. 0 antigénio L45 foi imunodetectado usando como segundo anticorpo soro de cabra anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase (Hyclone Lab., Logan, VT), e 4-c 1 oro-1-naftol como cromogénio (Hawkes, Anal. Biochem. 123:143-146 (1932). A imunodetecção revelou que a banda principal a Mr-100 000 foi especificamente corado como anticorpo L45. B) Radioimunoprecipitação Células A549 foram marcadas por q biosslntese coin /"3H7-glucosamina e /" H_7-leucina, respec-tivamente, por incubação em meio RPMI 1640 (sem glucose ou sem leucina, RPMI 1640 Select-Amine Kit, GIBC0), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) dializado durante 5 h a 37°C e incubadas durante a noite em meio DMEM, suplementado com 10% F3S. Os sedimentes celulares foram extraídos com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2, 150 mM NaCl, 2mM EDTA, 0,1% SOS, 1% Triton X-100, 1% desoxicolato de sódio, PMSF (10 ug/ml), aprotinina (10 ug/ml). 0 antigénio L45 foi imunoprecipitado por incubação dos lisados com anticorpo L45 durante 1 h a 4°C. Ocomplexo antigénico-antigénpo foi precipitado com soro de cabra anti-IgG de ratinho e Pan- -36- -36-

sorbin (células de Staphy1ococcus aureus, Calbiochem, San Diego, CA) incubando cada um sequênciaimente durante 30 min. a 4°C. 0 imunoprecipitado foi lavado 4 vezes com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2, 150 mM NaCi, 2mM EDTA, 0,1¾ NP40 e analisado por SDS-PAGE em condições redu-tore e não redutoras e vizualizado por fluorografia após 3 impregnação do gel com EN HANCETM (New England Nuclear, Boston, MA). 0 anticorpo L45 precipitou específicamente o antigénio L45 com uma Mr=100 000 ou células marcadas tanto com / H7-leucina como com / H 7-glucosa-mina. Estes dados demonstram que o determinante entigéneo reconhecido pelo anticorpo monoclonal L45 está situado numa única glicoproteína de cadeia simples com Mr=100 000. 0 antigénio L45 está associado a uma variedade de células tumorais incluindo células de carcinomas do pulmão, mama, cólon e ovário e células de melanoma e de sarcoma. E aparente que muitas modificações e variações deste invento, conforme estabelecido atrás, podem ser feitas sem se afastarem do espírito do invento.

As realizações especificas descritas são dadas como exemplo apenas e o invento está limitado apenas pelos termos das reivindicações apensas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES 11-. - Anticorpo monoclonal produzido por uma linha celular de hibriaoma ATCC No. HB9804, caracterizado por se ligar a um sítio determinante num an-tigénio glicoproteína da superfície celular de células de tumores humanos e equivalentes funcionais, fragmentos e imunocomplexos de ligação do referido anticorpo. 2a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas células tumorais serem células de carcinoma. 3a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as referidas células de carcinoma são selecccionadas do grupo constituído por células de carcinoma do pulmão, ovário, cólon e mama. 4a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as referidas células de tumor serem células de melanoma. 5a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por nas referidas células de tumor serem células de sarcoma. 6a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser conju-g gado com uma marca capaz de produzir um sinal detectável. -38-

   7*. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 6, caracterizadc por a marca ser se-leccionada do grupo constituído por um radionucleico, uma enzima, um agente fluorescente e um cromóforo. 8â. - Anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma ATCC No. HB9804, ca-racterizado por se ligar a um sítio determinante celular num antigénio glicorpotelco da superfície celular de células de tumores humanos, ser o referido antigénio caracte-rizado por um peso molecular de aproximadamente 100 000 dal tons como determinado por electrofcrese em gel de poliacri-lamida e tendo uma sequência de aminoácidos amino-terminais como se segue: 15 10 15 20 25 W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-i-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácido não identificado e equivalente funcionais, fragmentos e imunocomplexos de ligação do referido anticorpo. 9S. - Processo para a preparação de uma composição para tratamento de tumores, caracteriza-do por se incluir na referida quantidade terapêuticamente eficaz do anticorpo da reivindicação 8 em associação com um veículo parentéricc farmacêuticamente aceitável. 10*. - Anticorpo monoclonal carac-terizado por ser produzido por uma linha celular de hibridoma formada por fusão de uma célula de mieloma e uma célula capaz de produzir anticorpo que se liga a um determinante num antigénio glicoproteíco da superfície celular de células de tumores, tendo o referido antigénio um peso molecular -39-

   de aproximadamente 100 000 daltons conforme determinado por eiectroforese em gel de poliacrilamida e tendo uma sequência de aminoácidos amino-terminal como se segue: 15 10 15 20 25 W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-í-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácido não identificado e equivalente funcionais , fragmentos e imunocomp1exos de ligação do referido anticorpo. 11*. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser da classe IgG. 12* . - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser da subclasse IgG2a. 13*. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser um anticorpo murino. 14*. - Anticorpo monoclonal caracterizado por ser reactivo com um sitio determinante num antigénio g1icoproteíco da superfície celular associado a células de tumores humanos, sendo o referido antigénio caracterizado por um peso molecular de aproximadamente 100 000 daltons conforme determinado por eIectroforese em gel de poliacri lamida e tendo uma sequência de aminoácido amino--terminal como se sague: -40-

   15 10 15 20 25 W-Y-T-V-N-S-A — Y-G-D-T-I- I-í-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M—F onde X representa um aminoácidc não identificado e equivalentes funcionais, fragmentos e imunocomplexos de ligação do referido anticorpo. 15*. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por coaâstir no anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma ATCC No. HB 9804. 16*. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ser anticorpo humano. 17a. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por ser um anticorpo de ratinho-humano. 18*. - Processo para a preparação de uma composição para o tratamento de tumores, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da reivindicação 14 em associação com um veículo parenterai farmaceuticamente aceitável. 19*. - ímunoensaio para a detecção de tumores humanos, caracterizado por compreender -41-

   a) combinação de um anticorpo monoclonal reactivo com um antigénio glicoprcteína da superfície celular associado a células de tumores humanos, o referido antigénio caracte-rizado por um peso molecular de aproximaaamente 100 000 dal-tons conforme determinado por e1ectroforese em gel de poli-acrilamida e tendo uma sequência de aminoácidos amino-ter-minal como se segue: 15 10 15 20 25 W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácido não identificado com uma amostra de células tumorais o referido anticorpo marcado de modo a poder haver detecção; e b) ensaio para a ligação do referido anticorpo monoclonal marcado a células tumorais associadas ao referido antigénio. 20a. - imunoensaio de acordo com a reivindciação 19, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser o anticorpo produzido pela linha celular de hibridoma ATCC No. HB 9804. 21a. - Imunoensaio de acordo com a reivindicação 19 , caracterizado por o referido anticorpo estar marcado com uma marca seleccicnada do grupo constituído por um radionuc1ido, uma enzima, um agente fluorescente e um cromôforo. 22a. - Método para a detecção de tumores caracterizado por compreender o contacto do anticorpo monoclonal da reivindicação 1, 8, 10 ou 14 com uma amostra de tecido ou fluido humano e detecção da interacção do referido anticorpo com quaisquer células tumorais ou -42-

   Λ seus determinantes antigénicos correspondendo antigenica-mente presentes na referida amostra, em que a presença ou ausência de tumor está relacionada com a presença ou a ausência de ligação do anticorpo às células de tumor da amostra em teste e em que essa ligação é detectada através de uma marca que emita um sinal detectável. 23a. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células de tumor serem células de carcinomas do pulmão e o tecido humano ser tecido do pulmão. 24i. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células tumo-rais serem células de carcinoma da mama e o tecido humano é tecido da mama. 25¾. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células tu-morais serem células de carcinoma do cólon e o tecido humano ser tecido do cólon. 26â. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células de tumor serem células carcinoma do ovário e o tecido humano ser tecido de ovário. 2 7â. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células de tumor serem células de melanoma. 28a. - Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por as referidas células de tumor serem células de sarcoma. -43-

   29J_. - Método de acordo com a reivindciação 22, caracterizado por a interacção do referido anticorpo monoclonal com as referidas células tumores ser detectada por coloração imuno-histolôgica. 30s. - Método para localização de tumores humanos j_n v i vo caracterizado por compreender: a) purificação do anticorpo monoclonal da reivindicação 1, 8, 10 ou 14; b) marcação radioactiva do referido anticorpo; c) administração do referido anticorpo a um paciente humano num veículo adequado; e d) localização do anticorpo monoclonal por cintigrafia externa, tomografia de emissão ou varrimento radionuclear. 31â. - Método de imunoterapia para o tratamento de tumores, caracterizado por compreender: a) purificação do anticorpo monoclonal da reivindicação 1, 8, 10, ou 14; b) conjugação do referido anticorpo monoclonal com agente num veículo adequado a um paciente humano ccm tumor. 32£. - Método de acordo com a reivindciação 31, caracterizado por o referido anticorpo monoclonal ser um anticorpo anti-idiotipo. -44-

   33a. - Linha celular contínua que produz um anticorpo monoclonal, o referido anticorpo mono-clonal caracterizado pela capacidade de ligação a um sítio determinante num antigénio g1icoproteína da superfléie celular de células de carcinoma humano, caracterizado por compreender um hibridoma de um linfócito derivado de um ratinho imunizado com céluias de carcinoma ou com um seu determinante imunogénico e uma linha de mielcma de ratinho. 34a. - Linha celular continua que produz um anticorpo monoclcnal, c referido anticorpo mono-clonal caracterizado pela sua capacidade de ligação a um sítio determinante num antigénio fllicoprotelna de ligação a um sítio determinante num antigénio glicoprotelna da superfície celular de células de carcinoma humana, caracte-rizada por compreender um hibridoma de um linfócito derivado de um ser humano com carcinoma e uma célula de mieloma. 35a. - Linha celular de hibridoma ATCC No. H8 9804 caracterizado por ser produtora do anticorpo monoclonal capaz de se ligar um determinante num antigénio g1icoproteIna da superfície celular de células de tumor humano. 36a. - Linha celular de hibridoma ATCC No. HB 9804 caracterizado por ser formada pela fusão de uma célula de mieloma de ratinho NS1 com um esplenócito de ratinho obtido a partir de um ratinho BAL8/ e imunizado com células CH3 de adenocarcinoma do pulmão, o qual produz um anticorpo monoclonal que se liga a um determinante do antigénio g1icoproteína da superfície celular de células de tumor humano tendo um peso molecular de aproximadamente 100 000 daltons com uma sequência de aminoácidos amino-ter-minal como se segue.

   15 10 15 20 25 W-Y-TV-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F onde X representa um aminoácido não identificado conforme determinado por electroforese em gel de poliacrilamida. 37â. - Linha celular contínua que produz um anticorpo monoclonal sendo caracterizado pela ca pacidade de ligação a um sítio determinante um antigénio glicoproteína da superficie celular associado a células tumorais, o referido antigénio tendo um peso molecular de aproximadamente 100 000 daltons tendo uma sequência amino-terminal como se segue: 15 10 15 20 25 W-Υ-ΐ1-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F- onde X apresenta um aminoácido não identificado, caracteri zado por compreender um hibridoma de um linfócito capaz de produzir anticorpo contra o referido antigénio e uma célula de mieloma. 38ã. - Processo para a preparação de um antigénio glicoproteína numa forma substânciaJnente pura, e de imunocomplexos deste antigénio, caracterizado por se proceder à sua obtenção a partir de células de tumor humano, de modo a obter-se um antigénio glicoproteína com um peso molecular de cerca de 100 000 daltons como determinado por electroforese em gel de poliacrilairida e tendo uma sequência de aminoácidos amino-terminal como se segue : 15 10 15 20 25 W-Y-T-V-N-S-A-Y-G-D-T-I-I-I-P-X-R-L-D-V-P-Q-N-L-M-F-onde X representa um aminoácido não identificado. -46- 39§. - Processo para a preparação de uma vacina para usar na imunização contra tumores, caracte-rizado por se incluir um vírus recombinante incluindo o DNA codificador do antigénio da reivindicação 35. 40ã. - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado por o referido virus ser de vaccinia. 41ã. - Método para a imunização contra tumores, caracterizado por compreender a administração numa quantidade terapeuticamente eficaz da vacina da reivindicação 39, em que a gama de dosagem eficaz se situa entre cerca de 1 e cerca de 5000 mg/m2 . b. Relativamente ao termo "ratinho-humano" vem informar que se trata do termo técnico pelo qual é conhecido um anticorpo monoclonal quimérico que é obtido quando genes codificadores de regiões constantes da molécula de anticorpo L45 de murino são substituídos por genes humanos codificadores das regiões constantes de um anticorpo com ac-tividade biológica adequada. Nesse sentido, o anticorpo obtido não é nem humano nem de ratinho, mas sim uma entidade híbrida denominada "anticorpo de ratinho-humano". Lisboa, 15 de Fevereiro de 1990

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