JPH03155799A - ヒト子宮頸部腺癌由来培養細胞株ｏｍｃ―４に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト子宮頚部腺癌由来培養細胞株ＯＭＣ−４
に対するモノクローナル抗体に関する。

し従来の技術およびその課題］ 現在、細胞診断学は剥離細胞診からアスピレションなど
積極的に細胞を採取する方法へと変っており、それによ
り得られた新鮮細胞を対象とする機会が多くなってきた
。これらの細胞は、機能、分化、環境など種々の因子が
有機的に関与した最終像であり、細胞診断は細胞形態に
反映されたわずかな所見をもって行われている。ざらに
細胞診断は細胞検査上あるいは細胞診断固のみが行うこ
とになっており、その判定には長年の経験と熟練を要す
る。癌細胞を検出するためには、その活発な増殖能力を
反映する細胞核の肥大、濃染等が指標となるが、またこ
れは炎症や化生の細胞増殖による細胞核変化と非常に類
似している。その中でも特に腺癌細胞は他の癌細胞にく
らべ判別しにくいのが特徴である。

組織診断に用いられている酵素抗体法が長期にわたり、
細胞診断に応用されなかったのは、細胞片のほうが組織
切片に比べて非特異的反応を発現しやすく、結果の判定
に問題があったためと思われる。この非特異的反応を防
止するために固定法を改良したり（Ｊ、　Ｊａｐ、　Ｓ
ｏｃ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｙｔｏｌ、、　２２、８０１−
８１２（１９８３））　、正常血清（非免疫血清）によ
る前処理（Ｊ、　Ｊａｐ、　Ｓｏｃ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃ
ｙｔｏｌ、、　２２２１Ｂ−２２７（１９８３））が必
要とされている。

一方、これに使われる抗体には、ＣＥＡ　（癌胎児性抗
原）　、Ａ　Ｆ　Ｐ　（ａ−ｆｅｔｐｒｏｔｅｉｎ）な
トニ対するポリクローナル抗体、ざらにＥＭＡ　（上皮
性膜抗原）等に対するモノクローナル抗体などがある。

しかし抗ＣＥＡ抗体中には好中球や組織法と反応すルＮ
　ＧＡ　（Ｎｏｎ５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｒｏｓｓｒｅａ
ｃｔｉｎｇａｎｔｉｇｅｎ）が含まれているために、非
癌ヒト牌アセトンパウダー等で吸収操作が必要である。

またＥＭＡ以下多くの腫瘍マーカーに対する抗体は、体
腔液細胞診において腺癌細胞と鑑別困難な反応性中皮細
胞に反応してしまうという欠点がある本発明は以上述ぺ
たような従来の事情に鑑みてなされたもので、癌の中で
も判別しにくい腺癌細胞に特異的に反応するようなモノ
クローナル抗体を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明によれば、ヒト子吉頚部腺癌由来培養細胞株　Ｏ
ＭＣ−４に対して特異性を有するモノクローナル抗体が
提供される。

本発明の抗０ＭＣ−４モノクローナル抗体は、腺癌に特
異的であり、他の扁平上皮癌等の腫瘍細胞とは交叉反応
が少ない点において特徴づけられる。

従って細胞診断における免疫染色に使用することができ
、ざらに組織診断での免疫染色にも用いることができる
。さらに本モノクローナル抗体に螢光物質を結合させる
ことにより、フローサイトメーターでの細胞診断の自動
化が可能となる。

以下、本発明によるモノクローナル抗体の製造方法につ
き詳述する。

本発明のモノクローナル抗体は、ヒト子宮頚部腺癌由来
培養細胞株　ＯＭＣ−４の培養細胞そのものを免疫原と
して用いて常法により製造できる。

例えば、上記免疫原で免疫された哺乳動物の形質細胞（
免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細
胞）とのハイブリドーマを作製し、これにより所望抗体
を産生するクローンを選択、培養する方法により得られ
る。

上記本発明のモノクローナル抗体の製造に当たって、免
疫原として用いられるＯＭＣ−４細胞はホモジエネート
にしたすせず、できるだけそのままの状態で哺乳動物に
投与することが望ましい。したがって、アジュバントを
用いたエマルジョンも作製しない。それは細胞診断に用
いる抗体はできるだけ細胞の表面抗原を認識しているほ
うが良いからである。具体的にはトリプシン処理にてペ
トリ冊より剥離したＯＭＣ−４を洗浄液であるＰＢＳ（
−）にて数回洗い、血清成分などの免疫原になるような
余分な成分は極力除くようにする。かくして１ｑられる
免疫原を利用した本発明の抗０ＭＣ−４モノクローナル
抗体の製造は、上記免疫原を用いることを除いて、常法
に従い実施でき、かくして本モノクローナル抗体を大小
にしかも安定して収得することができる。

上記モノクローナル抗体の製造方法は、より具体的には
上記免疫原で免疫された哺乳動物の形質細胞（免疫細胞
）と哺乳動物の形質細胞腫細胞とのハイブリドーマを作
製し、これより所望抗体（モノクローナル抗体）を産生
するクローンを選択、培養することにより実施される。

上記の方法において、抗体の製造に供される哺乳動物と
しては、特に制限はないが、本発明のモノクローナル抗
体をハイブリドーマを利用して製造する場合には、細胞
融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選
択されるのが望ましく、一般にはマウス、ラット等が有
利に用いられる。

上記モノクローナル抗体の製造法において、免疫は一般
的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、陵内
、皮下、腹腔内注射等により投与することにより実施で
きる。より具体的には、免疫原を、供試動物に２〜１４
日毎に数回投与し、投与量は、例えばマウスでは’１Ｘ
１０６〜１Ｘ１０７ｃｅｌｌｓになるようにすることに
より行い得る。また上記モノクローナル抗体の製造にお
いて用いられる免疫細胞としては、上記Ｒ終投与の約３
日後に摘出した肺臓細胞を使用するのが望ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、
例えば、 ｐ３　（ｐ３／Ｘ６３−Ａ（１８）（Ｎａｔｕｒｅ、２
５６，４９５−４９７（１９７５）ｐ３−　Ｕ　１　（
Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　）ｌｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８１．
１−７（１９７Ｂ））ＮＳ　−１（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、６，５１１−５１９（１９７Ｂ））
Ｍ　Ｐ　Ｃ−１１（Ｃｅ１１．８，４０５−４１５（１
９７Ｂ））Ｓ　Ｐ　２　／　Ｏ（Ｎａｔｕｒｅ、　２７
６、２６９−２７０（１９７Ｂ））ＦＯ（Ｊ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、Ｈｅｔｈ、３５．１−２１（１９８０））
Ｘ６３．　５．　３．　　（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
１２３，１５４８−１５５０（１９７９）） Ｓ　１９４　（Ｊ、　Ｅｇｐ、　Ｈｅｄ、１４８，３１
３−３２３（１９７Ｂ））等や、ラットにおける Ｒ　２１０　（ＮａｔＬｌｒｅ、２７７、１３１−１３
３（１９７９））等の骨髄腫細胞等を使用できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばミルスティーン（ＨｉｌＳｔｅｉｎ）らの
方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖ
ｏｌ、７３．ｐｐ３（１９８１））等に準じて行うこと
ができる。より具体的には、上記融合反応は、通常の融
合促進剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　
、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の存在下に、通常の培
地中で実施され、培地にはざらに融合効率を高めるため
にジメチルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加
することもできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用
比は、通常の方法と変わりはなく、例えば形質細胞腫細
胞に対して免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通
である。融合反応時の培地としては、上記形質細胞腫細
胞の増殖に通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭ１
１６４０培地、ＭＥＭ培地その他この種の細胞培地に一
般に利用されるものを例示でき、通常これらの培地は牛
脂仔血清（ＦＢＳ）等の血清補液を俵いておくのがよい
。

融合は、上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を、
上記培地内でよく混合し、予め３７°Ｃ程度に加温した
ＰＥＧ溶液、例えば平均分子量が１ｏｏｏ〜６０００程
度のＰＥＧ溶液を、通常培地に約３０〜６０　ｗ／ｖ％
の濃度で加えて混ビ合わＵることにより行われる。以後
、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操
作を繰り返すことにより、所望のハイブリドーマが形成
される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡ　Ｔ培地（ヒポキリンチン、アミノプ
テリンおよびチミジンを含む培地）で培養することによ
り行われる。該ＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイ
ブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに
十分な時間、通常数日〜数週間行えばよい。かくしてｊ
ｑられるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目
的とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇ
ｖａｌｌ　Ｅ、、　Ｈｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、７０
，４１９−４３９（１９８０））、プラーク法、スポッ
ト法、凝集反応法、オクタロニ−（０ｕｃｈｔｅｒｌｏ
ｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等の一般
に抗体の検出に用いられている種々の方法（「ハイブリ
ドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）Ｒ＆Ｄプラニ
ング発行、３０−５３頁、昭和５７年３月５日）に従い
実施することができ、この検索には前記免疫原が利用で
きる。

かくして得られる本発明のモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマは、通常の培地で継代培養することが
でき、また液体窒素中で長期間保存することができる。

上記ハイブリドーマからの本発明のモノクローナル抗体
の採取は、該ハイブリドーマを、常法に従って培養して
その培養上清として得る方法や、ハイブリドーマをこれ
と適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水
として得る方法等が採用される。前者の方法は、高純度
のモノクロナル抗体を１がるのに適しており、後者の方
法はモノクローナル抗体の大量生産に適している。

また上記のごとくして１ｑられるモノクローナル抗体は
、更に塩析、ゲル濾過法、アフィニティクロマトグラフ
ィ等の通常の手段により精製することができる。

なお、本発明によるモノクローナル抗体とは、上記のよ
うにして精製したもののほか、培養液−上清や血清、腹
水の状態で得られる標品も含まれる。

［実施例］ 以下、本発明のモノクローナル抗体の具体的な実施例を
挙げ、本発明をざらに詳しく説明する。

■抗原の作製 １９８５年１０月３日、４７オのステージＩｂ　　子宮
頚部腺癌患者の患部より摘出した腫瘍組織をＢＡＬＢ／
Ｃヌードマウスに移植した。２か月後、直径的０．６ｃ
ｍになった腫瘍を取り出し、切片とした後、０．２５％
トリプシン溶液中にて攪拌、単細胞化した後、培養液に
移した。培養液はＨａｍ’ｓ　Ｆ　−１２培地に２０％
ＦＢＳ　（牛脂仔血清）を加えたものを使用した。混在
する線維芽細胞は抗生物質（ペニシリン　２０００　ｕ
ｎｉｔｓ／ｍｌ　、ストレプトマイシン２０００μ９　
／ｍｌ　＞にて培養初期に除去した。その後２週問おき
に継代を繰り返し、安定な細胞株０ＭＣ−４を１９だ（
八ｃｔａ、　０ｂｓｔ、　Ｇｙｎａｅｃ、　Ｊｐｎ、３
９，８５９−８６０（１９８７））。こうして１ワられ
たヒト子宮頚部腺癌由来培養細胞株　ＯＭＣ−４の細胞
そのものを抗原として用いた。

■モノクローナル抗体の作製法 免役 ＢＡＬＢ／Ｃマウスに、ＰＢＳ　（−）に懸濁したＯＭ
Ｃ−４細胞を２週問おきに３回、−匹当たり１　Ｘ１０
７〜Ｉ　Ｘｌｏａ個／ｍｌの８度で０．５ｍｌ腹腔内投
与して、免疫した。ざらに２週間俊、同様の条件で最終
免疫をかけた。

星凰皿合 最終免疫後３日目に、これらマウスより抗体を産生ずる
感作リンパ球を含む肺臓を摘出した。摘出した肺臓をハ
サミで切片としたのちメツシュに通し、感作リンパ球を
単細胞として分離した。この感作リンパ球を遠心管に集
め、０．１７Ｍ塩化アンモニウム溶液にて７〜１０分間
処理し溶血させた後、赤血球を除去し、ＲＰＭ　Ｉ　−
１６４０培地にて３回洗った。細胞をカウントし、’１
Ｘ１０Ｂ個／　１０ｍ１となるように調製した。

一方、マウスＢＡＬＢ／ｃ由来ミエローマ細胞（ＳＰ２
１０＞をピペッティングにてペトリ皿より剥がし、ＲＰ
ＭＩ−１６４０培地にて３回洗った。

細胞をカウントし、’１Ｘ１０Ｂ個／　４０　ｍｌとな
るように調製した。

これら２種の細胞を混合したのち遠心した。上清を捨て
た債、５０　ｗ／ｖ％のポリエチレングリコル４０００
（ＭＥＲＣＫ社製）溶液’ｌ　ｍｌをゆっくりと加えな
がら懸濁した。その後、ＤＭＥＭ培地９ｍ１を徐々に加
えながら懸濁した。１０分間放置後遠心した。上清を捨
てた後、ＨＡＴ培地５０　ｍｌを徐々に加えながら懸濁
した。ＢＡＬＢ／ｃマクロファージをフィダーセルとし
て敷いたマイクロプレートに１ウエル当たり１００μβ
ずつ分注し、３７℃、５％ＣＯ２インキ１ベーター中に
て培養した。その後、２〜３日毎に５０μβずつ３回、
ＨＡＴ培地を加えていった。

スクリーニングおよびクローニング 細胞融合後、１０〜１２日後にコロニーが形成されてい
るウェルより上清を採取し、ＯＭＣ−４をコートしたマ
イクロプレートにてＥＬＩＳＡ法を実施した。ＥＬＩＳ
Ａの結果、その培養上清がＯＭＣ−４に対し強く反応覆
るコロニーを選択した。そのように選択されたコロニー
に対して、次にこのコロニー上清を用いて子宮頚部腺癌
組織パラフィン包埋切片に対し、免疫組織染色を行った
。そしてこの免疫染色が陽性にでるコロニーをさらに絞
り込んだ。このように絞り込んだコロニーを限界希釈法
によりクローニングを行った。その結果、ＯＭＣ−４お
よびヒト子宮頚部腺癌に対して強い反応性を有するモノ
クローナル抗体を産生ずる単一のハイブリドーマを得た
。このハイブリドーマをｒａｎｔｉ−ＯＭＣ−４１１７
−１３Ｊと称し、産生ずるモノクローナル抗体をｒＡＤ
　１１７ｍ　ｌと称することとする。

■モノクローナル抗体の特性 上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特異性
を検討するため、ＯＭＣ−１＜ヒト子宮頚部扁平上皮癌
由来細胞株）　、ＯＭＣ−４（ヒト子宮頚部腺癌由来細
胞株）　、ＯＭＣ−６（ヒト子宮内膜間質肉腫由来細胞
株）、ＥＤｉＰａｃｋ（ヒト由来表皮細胞）を抗原とし
てＥＬＩＳＡを行ったところ、ＯＭＣ−４のみと強く反
応し、他の細胞とはほとんど反応しなかった。

第１図は、本実施例によるモノクローナル抗体（ＡＤ　
１１７ｍ　）の抗０ＭＣ−４活性に対１６１１５希釈分
析を行った結果を他の抗原に対するものと比較して示し
たもので、縦軸は波長４０５　ｎｍにおける吸光度、横
軸はＡＤ　１１７ｍ原液（培養上清）ｍ度（Ｘ＝Ｏ）の
１７５希釈度（１１５ｅｘｐＸ　）　’Ｆｒ目盛ったも
のである。また、◇はＯＭＣ−４、＋はＯＭＣ−１、Δ
はＯＭＣ−６、口はＥｐｉＰａｃｋをそれぞれ抗原とし
た場合を示す。また免疫組織染色の結果は、ヒト子宮頚
部腺癌およびヒト子宮内膜腺癌に対してよく染まること
が分かつている。

ざらに抗原の性質を調べるために、マイクロプレートに
コートしたＯＭＣ−４を酵素処理等を行った後、ＥＬＩ
ＳＡをしたところ、プロナー＋ｉｉ理では反応性の低下
が見られず（第２図参照）、過ヨウ素酸処理では反応性
が低下した（第３図参照）。またシアリダーゼ処理でも
反応性の低下は見られなかった（第４図参照）。

ここで第２図は、波長４０５　ｎｍにおける吸光度、即
ち抗体活性（縦軸）に対するプロナーゼの希釈度依存性
を示したもので、プロナーヒ２５μ９／威を原液濃度（
Ｘ＝Ｏ）として１／２　ｅｘｐＸを横軸にプロットした
ものである。第３図は吸光度に対する過ヨウ素酸の希釈
度依存性を示したもので、過ヨウ素酸２０　ｍＭを原液
濃度（Ｘ＝Ｏ）として１／２　ｅＸＥ）Ｘを横軸にプロ
ットしたものである。第４図は吸光度に対するシアリダ
ーゼの希釈度依存性を示したもので、シアリダーゼ２５
０　ｍｕ／ｒｎｉを原液濃度（Ｘ＝Ｏ）として１１５８
ＸＩ）Ｘを横軸にプロットしたもので、口はＡＤ　１１
７ｍの場合、＋は抗ＣＡ　１９−９抗体の場合を示す。

以上のことから、このモノクローナル抗体はエピトープ
として糖鎖を認識する可能性が高い。

更に、このモノクローナル抗体と糖鎖を認識する抗ＣＡ
　１９−９抗体との交叉実験を行ったところ、この２つ
の抗体は交叉しないことが分かった。第５図はこのこと
を示したもので、図中、口はＡＤ１１７ｍのｍ度を一定
にした状態での抗ＣＡ　１９−９抗体の希釈度（１／３
　ｅＸＤＸ　）に対する吸光度変化、＋は抗ＣＡ　１９
−９抗体の濃度を一定にした状態でのＡＤ　１１７ｍの
希釈＆　（１／３　ｅｘｐＸ　）に対する吸光度変化を
示したものである。

ざらにこのモノクローナル抗体のクラス、サブクラスを
調べたところ、ＩＳＦＭであることが分かった。

以上のような特性を示すモノクローナル抗体ｒＡＤ　１
１７ｍ　Ｊを産生するバイブリド−’？「ａｎｔｉ−Ｏ
ＭＣ−４１１７−１３Ｊは、通産省工業技術院微生物工
業技術研究所（微工研）に微工研菌奇第１１０３２号（
ＦＥＲＮ　Ｐ−１１０３２）として寄託されている。

この抗体を他の市販の腫瘍マーカーと共に用いて体腔液
細胞診における免疫染色を行ったところ、第１表のよう
な結果になった。この表において、抗体の染色強度、抗
体の陽性ＶＡ度は、癌細胞に対する各抗体の染色状態を
示すもので、中皮細胞の染色強度は、正常細胞に対する
各抗体の染色状態を示すものである。また、染色強度は
染色された色の濃淡の度合をＯ〜３の数値で表した時の
平均値を示し、陽性頻度は癌細胞のうち染色されたもの
の＃Ａ度をＯ〜３の数値で表した時の平均値を示す。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明による抗０ＭＣ−４モノク
ローナル抗体は、ＯＭＣ−４に対して高い特異性を有す
るので、このモノクローナル抗体を用いて免疫染色する
ことにより、非特異的反応を抑えることができ、細胞診
断および組織診断における有用な診断薬となることが期
待でき、また癌に対する有効な治療薬に応用することが
可能である。

ざらにこのモノクローナル抗体は、ロット間での抗体力
価の差がなく、かつ吸収操作の必要もないので、常に一
定品質の抗体を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるモノクロナール抗体の抗体活性に
対する希釈度依存性を伯の抗原に対するものと比較して
示す特性図、第２〜４図はそれぞれ本発明によるモノク
ロナール抗体の抗体活性に対するプロナーゼ、過ヨウ素
酸およびシアリダーゼの希釈度依存性を示す特性図、第
５図は本発明によるモノクロナール抗体とａｎｔｉ−Ｃ
Ａ　１９−９との交叉実験結果を示す特性図である。 第３図 希 釈度（１１５ｅｘｐＸ） 第４図 希釈度（１１５ｅｘｐＸ） 第１図 第２図 第５図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト子宮頚部腺癌由来培養細胞株ＯＭＣ−４に対
   して特異性を有することを特徴とする抗ＯＭＣ−４モノ
   クローナル抗体