JPH02109993A - ヒト細胞膜上の蛋白抗原に対するモノクローナル抗体を効率的に作成する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合技術を用
いて、ヒト細胞膜、特にヒト腫ｆＩｉ！ＩＩ胞膜上の蛋
白に特異的に反応するモノクローナル抗体を製造する方
法に関する。更に詳しくは、免疫動物に、糖鎖抗原に対
する免疫不全マウス、特に雄のＣＢＡ／Ｎマウスを用い
ることにより、ヒト腫瘍の病理的・血清学的診断のみな
らず、ヒト踵壇の細胞膜上に限局する蛋白を標的にした
ミサイル療法、腫瘍の位置を決定する体内診断用として
有用な、ヒト腫瘍の細胞膜上の蛋白に特異的に反応する
モノクローナル抗体を製造する方法に関する。

［従来技術］ 近年、Ｋｏｈｌｅｒらが考案した細胞融合技術［Ｎａｔ
ｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）コを利用したモノ
クローナル抗体の作成が盛んに行われるようになった。

腫瘍細胞を免疫原としたモノクローナル抗体の作成もＫ
ｏｐｒｏｗｓｋｒらによる大腸癌を免疫原として作成し
たＮ−１９−９抗体［Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅ
ｎｅｔ、、５：９５７（１９７９）、５ｃｉｅｎｃｅ、
２１２：５３（１９８１）］をはじめとし、Ｌｉｎｄｈ
ｏ１ｗらによる大腸癌でのＣ−５０抗体［１ｎｔ。

＾ｒｃｈｓ　　＾Ｉｌｅｒｇｙ　　Ａｐｐｌ、１ｍｇ＋
ｕｎ、、７１：１７８（１９８３）］　　。

ｅａｓｔらによる卵巣癌でのＱＣ−＋２５抗体［Ｎ、Ｅ
ｎｇ、Ｊ。

Ｍｅｄ、、３０９：８８３（１９８３）］　、　Ｍｅｔ
ｚｇｅｒらによる膵癌でのＤＵ−ＰＡＮ−２抗体ＣＣａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４２：５ｏｌ（１９８２）］　＋
（ｈｕｎｇらによる膵癌での５Ｐａｎ−１抗体ＣＤｉｇ
、Ｄｉｓ、Ｓｃｉ、。

３０：９６？（＋９８５）］等が次々に樹立された。こ
れらのモノクローナル抗体を用いて、担癌患者の血中に
当該モノクローナル抗体が認識する癌抗原の存在を証明
し、いくつかの抗体は既に癌の血清学的診断に利用され
ている。

Ｋｏｐｒｏｗｓｋ　ｉらをはじめとした研究者の腫瘍特
異的モノクローナル抗体の作成方法は、癌細胞ないしは
癌細胞膜をＢＡＬＢ／Ｃマウスに免疫し、抗体産生細胞
と骨髄ｍ＊胞を融合し、抗体産生クローンの中で、癌細
胞とよく反応し且つ正常細胞と反応しない性質のクロー
ンを選び出す方法である。

ところが彼等の方法には、癌細胞抗原のうち、糖鎖抗原
、脂質抗原、蛋白抗原等を分別する操作が含まれておら
ず、結果として彼等が作成した方法でのモノクローナル
抗体はすべて、糖鎖に対するものであった。　本発明者
らのａ験でも、子宮内膜癌細胞株であるＩｓｈｉｋａｗ
ａ！１胞もしくはｌ０Ｃ−２１細胞を用いてＢ　Ａ　Ｌ
　Ｂ　、／　Ｃマウスに免疫する方法で、得られたモノ
クローナル抗体が認識する抗原は、Ｌｅ”、Ｌｅ’やＨ
抗原のフコースを含む血液型抗原が多く、蛋白を認識す
るものはほとんど得られなかった。これは腺癌より分泌
される血液型糖鎖抗原活性を有するムチンの免疫原性が
強いために、生成したモノクローナル抗体のほとんどが
ムチン上の糖鎖を認識するものとなり、ムチンに比べ細
胞膜上で免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得られに
くいためで、これまでにヒト腺癌の細胞膜上の蛋白を認
識するモノクローナル抗体は得ろたという報告は殆どな
い。

［発明が解決しようとする課題］ 腫瘍細胞を免疫原としたＮ−１９−９抗体、　Ｃ−５０
抗体。

ＱＣ−＋２５抗体、　ＤＵ−ＰＡＮ−２抗体、　５Ｐａ
ｎ−１抗体等の抗体が認識する抗原決定基は全て血液型
物質類似の癌関連糖鎖であり、通常のＢＡＬＢ／Ｃマウ
スを用いたヒト腫瘍細胞、特に腺癌細胞の免疫方法では
、腺癌より分泌される血液型ｖｉａ抗原活性を有するム
チンの免疫原性が強いため、生成したモノクローナル抗
体のほとんどがムチン上の糖鎖を認識するものとなり、
ムチンに比べ免疫原性の弱い蛋白を認識する抗体が得ら
れなかった。

血液型物質類似の癌関連糖鎖を認識する抗体の開発は進
み、癌の診断に臨床上有用であるとの評価は定着した。

ところがヒト腺癌の細胞膜上の蛋白と特異的に反応する
抗体はいまだ得られず、当該抗体を製造する方法の開発
が望まれていた。

［課屈を解決するための手段］ 本発明は、糖鎖抗原に対する抗体産生が免疫不全となっ
ていると言われている雄のＣＢＡ／ＩＩＪマウス［Ａｓ
ｓｂａｕｇｈ＋Ｄ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、＋３６：９３１、（＋９７２）、　５ｃｈｅ
ｒ、１．＋ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４
１ニアＢＢ（＋９７５）、　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ａ、、ｅ
ｔ　ａｌ、、Ｊ、ｌｍ５ｕｎｏ１．．１１５：８９８（
＋９７５）］にヒト腫腫細胞を免疫することにより、ヒ
ト腫瘍細胞、特にムチンの免疫原性が極めて強いとされ
るヒト腺癌においても、腫瘍細胞収上の蛋白を認識する
モノクローナル抗体が得られることを見出して本発明を
完成した。

即ち本発明は、 ａ）糖鎖抗原に対して免疫不全を有する先天的免疫不全
マウスをヒト細胞またはヒト細胞膜で免疫する工程； ｂ）該被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスの抗体産生細胞
と骨髄腫細胞とを融合させる工程；Ｃ）該ヒト細胞膜蛋
白に特異的に反応する抗体を産生ずる融合細胞株を選択
する工程； ｄ）該選択融合細胞株をクローン化する工程；及びｅ）
該クローン化融合細胞株を培養し、培養液中より抗体を
分取する工程； よりなることを特徴とするヒト細胞膜上の蛋白に特異的
に反応する抗体を作成する方法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

モノクローナル抗体は、抗体を産生ずる能力と細胞培ｉ
液中で永久的に増殖できる能力を有している抗体産生細
胞が産生ずる予め曝露、規定された抗原にス（して特異
的なモノクローンな免疫グロブリンであり、その製造法
としては、哺乳動物に抗原を免疫した後、１）Ｋｏｈｌ
ｅｒらにより考案された瑚胞融合技術、即ち抗体産生細
胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコール、センダイ
ウィルス等の存在下で融合する方法、２）Ｓｔｅｉｎｉ
ｔｚらによるＥＢＶ等のウィルスに抗体産生細胞を感染
させ形質転換する方法［Ｎａｔｕｒｅ、２６９：４２０
（＋９７７）］がある。

後者はウィルスの管理、形質転換細胞作成の困難性によ
り、前者の細胞融合法によるモノクローナル抗体作成方
法が一般的である０本発明は細胞融合法によるモノクロ
ーナル抗体を製造するものであるが、糖鎖抗原に対して
免疫不全を有する先天的免疫不全マウス、特に雄のＣＢ
Ａ／Ｎマウスを免疫動物とする上記方法により、腫瘍細
胞膜上の蛋白を認識するモノクローナル抗体を効率よく
作成するものである。

本発明方法において、免疫するヒト細胞としては、子宮
内膜癌、卵巣癌、大腸癌、肝癌、膵癌、胆管癌、胃癌、
乳癌および肺癌等のヒトＢ瘍纏胞が例示される。

（１）抗体産生細胞の製造 ３〜１０週齢、好ましくは８週齢の雄のＣＢＡ／Ｎマウ
スの皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、標準懸濁液
または繍織培養培地中のＩＩＪＩ細胞をそのまま或いは
ホモジナイズして、適当なアジュバントと共にｌＸｌ０
’〜Ｉ　Ｘ　１０７個を注射し、必要に応じて追加免疫
する。−最終免疫後３〜７日に、これらマウスより抗体
を産生ずるリンパ球を含む牌臓またはリンパ節等末梢す
ンパ系＆ｌ織を摘出する。得られた組織からリンパ球を
単細胞として分離する方法としては、例えば免疫実験操
作法Ｂ［１９７４年、日本免疫学会発行１２５３ページ
］に記載されている方法による。

（２）融合細胞の製造 融合細胞の作成方法としては、例えばＧａ　ｌ　ｆ　ｒ
ｅらの方法ＣＮａｔｕｒｅ、２６６：５５０（＋９７７
）］に準じて行われる。マウス骨髄ｌ！細胞１〜２０Ｘ
１０７個に対して１０倍量の上記抗体産生リンパ球細胞
とを混合して、ポリエチレングリコールの存在下、３０
〜４０℃の温度で約１〜３分閏程度反応させ融合する。

融合の後、２４１．／ｅｌｆの培養プレートあるいは９
６Ｗｅｌ＋の培養プレートに融合細胞（牌臓纏胞が１〜
２　Ｘ　１０’／Ｗｅｌｌとなる量）を分注し、ＨＡＴ
培地（ヒボキサンチン・アミノプテリン・チミジン添加
培地）を添加し３０〜４０℃の温度で、１０〜１４日培
養する。ＨＡＴ培地で培養後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地か
らアミノプテリンを除いた培地）で培養し、完全ｔａ　
ｔｔＩ！に交換する。

ＨＡＴ培地での融合細胞の選択培養は、例えばＬｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄら［５ｃｉｅｎｃｅ、＋４５ニア０９（
＋９６４）コの方法に準じて行える。

（３）特異抗体産生性融合細胞株の選択およびクローニ
ング Ｗｅｌｌ中でコロニー状に成した融合細胞の培Ｉｔα中
の抗体を蛍光、酵素あるいはラジオアイソトープで標識
した第二抗体と反応させ、標識物の活性を測定すること
により、特異抗体産生性融合細胞株を選択する。この方
法としては、例えばＰｏｐｅらの方法ＣＪ、Ｅｘｐ、Ｍ
ｅｄ、、＋２０：１２１（１９６４）］に準じて行うこ
とができる。マイクロタイタープレートに免疫に用いた
腫瘍細胞をアセトン固定し、培養上清中の抗体と反応、
蛍光ｔＩＡｖａ抗マウスＴｇＧ抗体を反応させ、蛍光を
測定して蛍光を発する細胞株を選択する。活性を認めた
融合細胞株は、限界希釈法等により複数回のクローニン
グを行いクローンを確立する。　限界希釈法としては、
例えば免疫実験操作法ＩＸ［１９８０年、日本免疫学会
発行２９６３ページ］に記載されている方法による。す
なわち、融合細胞が３個／麿１くらいになるように通常
培地で希釈し、９６シｅｌｆの培養プレートに０．２ｍ
ｌ／Ｗａｌｌとなるように分注する。その際に、フィー
ダーレイヤー（ｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ）として同系
マウスの胸腺細胞を２Ｘ１０’個／Ｗｅｌｌとなるよう
に加えておく、ときどき培地交換を行いながら、クロー
ンを増殖させる。

（１）抗体の製造 クローンのつくるモノクローナル抗体は一般に抗体価が
高く、クローン化した融合細胞を培養し、細胞培養液の
上清を分ｍ＃１ａｔ、て使用できる抗体が得られるが、
マウス好ましくはブリスタン処理（２，６，ＩＯ，１４
−テトラメチルペンタデカン）を投与し、２週間程度飼
育）マウスの腹腔にクローンを注入して生じる腹水、又
は血清中に存在する抗体を使用する方法が、得られる抗
体量も多く有用である。ｒＡえば、Ｃｅｄｕｒａｌらの
方法（Ｊ、１ｓｓｕｎｏ１．。

１１８：１９５１（＋９７７）］に準じて実施できる。

これらの抗体はざらに塩析、イオン交換ゲル濾過、アフ
イニティ力ラムクロマト等で精製して製する。

（５）モノクローナル抗体が認識する抗原の解析方法 本発明による製造方法によって製造したモノクローナル
抗体が抗原（腫瘍細胞）の認識部位を決定する方法とし
て、抗原をシアリダーゼ、過沃素酸、トリプシン等の試
薬で処理した後、モノクローナル抗体と反応させ、これ
らの処理をしない場合と比較して、抗体の認識部位を解
析する。

シアリダーゼ処理により抗原性が消失すればシアル酸が
、過沃素酸処理により抗原性が消失すれば糖鎖が、トリ
プシン処理により抗原性が消失すれば蛋白を認識する抗
体と決定できる。

［実施ｒ１４］ 以下の実施例は本発明を更に詳細に説明する目的で示す
ものであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１゜ 子宮内膜癌腺癌細胞株であるｌｓｈｉｋａｗａ細胞［百
円ら１日本産科婦人科学会雑誌、　３７：＋１０３（１
９８５）］を５Ｘ１０’個をＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩ
ＢＣＯ社製）培ＩＩ液で洗浄後、０．２ｍｌの同液に浮
遊させ、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ａｄｊ
ｕｖａｎｔと共に、適齢８週の雄のＣＢＡ／Ｎマウス（
静岡実験動物共同組合より購入）皮下に投与、更に２週
間隔で腹腔内に２回の免疫を行った。３回目の免疫終了
後、３日目にこのマウスより無菌的に牌臓を摘出し、摘
出した膵臓は裁断しさらにメツシュを通してリンパ球懸
濁液を得た。マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳ　１−
Ａｇ４／　１株）は、融合の２日前より１０％牛脂児血
清（ＦＣＳ’）を含むＲＰＭＩ−１６４ＯｔＳ　ａ液中
５％Ｃｏ２．３７℃の条件で増殖させた。

上記膵臓細胞Ｉ　Ｘ　１０８個とマウスミエローマ細胞
２Ｘ　１０７個を含む培ｌＩ液を混合し、１５００ｒｐ
ｍで３０分遠心後、上清を捨て、５０％ポリエチレング
リコール１０００（和光純薬社ｉｔ）１ｍを１滴づつ滴
下しながらゆっくりと細胞をほぐした。１分後、ＦＣ５
含有ＲＰＭＩ−１６４０培養１１ｍ１ゆっくりと滴下し
ながら細胞を混合させ、同様の操作を繰返した。さらに
ＦＣ９を含むＲＰＭｌ−１６４０培ｉ液７１を３分閏か
けてゆつくりと遠心管を回転させながら加えた。この時
点で培養液をさらに加え１０”個の細胞が１０■！の培
養液に含むように調製し、この細胞懸濁液０．２■１づ
つを９６１Ｊｅｌｌのマイクロプレートに分注し、５％
ＣＯ２，３７℃で培１１シた。培ＩＩｒｆ！Ｉ始２日後
。

３日後、５８１．７日後、１１日後に培養上清０゜１ｍ
ｌを廃棄し、ヒボキサンチン、アミノプテリン。

チミジンおよびＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４００，１
■１を加えた。増殖限界になったところで、Ｉｓｈｉｋ
ａｗａｌｌ胞に対する培養上清中の抗体活性を閉接蛍光
抗体法で検討した。コロニーを通常の培養器に移し替え
増殖させる。増殖限界に達した融合細胞は、予めｆｖｅ
ｌｌあたり５Ｘ１０’個のマウス胸腺細胞を播種してお
いた９６Ｗａｌｌのマイクロプレートに移し、更に培養
した。増殖限界にたした融合細胞は３個／ｍｌ＜らいに
なるように通常培地で希釈し、２４Ｗｅｌｌの培養プレ
ートに０．２ｍｌ／Ｗｅｌｌとなるように分注し、クロ
ーンをｌＸ１０７個になるまで増殖させた。モノクロー
ナル抗体産生クローン細胞を０．２１１リスタン処理し
たＣＢＡ／ＮマウスとＢＡＬＢ／Ｃマウスとの雑種第１
代のマウス腹腔内に注射し、２週問後に腹水を採取した
。採取した腹水を１５００　ｒｐ−で３０分間遠心分離
し上清を得た。上清に生理食塩水を加えて２倍量とし、
この希釈腹水に飽和硫安を徐々に加えて硫安４０％飽和
とし、室温で３０分静かに攪拌後５０００　ｒｐ■で３
０分間遠心分離して沈渣を得た。この沈渣をざらに３回
４０％飽和硫安溶液で洗浄しγ−グロブリン分画を得た
。このγ−グロブリン分画をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィー法にて精製抗体を回収した。

上記操作により、ハイブリドーマｌｌ−１を樹立し、そ
の抗体をＴｌ−１と命名した。この抗体はＩｇＧ２ｍの
サブクラスに属していた。

実施例２゜ 実施例１．と同様な操作をｌ０Ｃ−２１，＊胞。

０ＶＡ−１細胞で実施し、得られた抗体が認識する抗原
を解析するためにｌｓｈｉｋａｗａｍ胞、ＨＯＣ−２１
纏胞、０ＶＡ−１細胞の成分をシアリダーゼ、過沃素酸
、トリプシンおよびミックストグリコシダーゼで処理し
た後、抗体の反応性を調べた。

（試薬） シアリダーゼ　（シグマ社ＩＩ） １０　　Ｕ／ｓｌ、　５０■阿酢酸緩衝液中過沃素酸　
（和光純薬社ＩＩ） １０ｇ＋Ｍ、２５膳阿酢酸ナトリウム液中トリプシン　
（シグマ社！り ５０μ８／■１，５０■門トリス塩酸ｍ衝液中ミックス
トグリコシダーゼ　（生化学工業）５０μ８７■１．５
０ｍＭクエン酸緩！酸液中１０６個／１のｌｓｈｉｋａ
ｗａ細胞またはＩ　ＯＣ−２１纏胞（または○ＶＡ−１
纏胞）の成分を１０μｍ／Ｗｅｌｌづつ、マイクロプレ
ートに入れ０．５％グルタルアルデヒド１００μｍを；
ｎ加し室温で７分間静置する。ＰＢＳで３回洗浄後０．
３％過酸化水素メタノール溶液１００μｍを加え３０分
閘室温で静置する。ＰＢＳで３回洗浄後、上記試薬を５
０μＩ／讐ｅｌｆづつ分注し−、３７℃で１時間反応さ
せた０反発後Ｔ　Ｂ　Ｓ　（Ｔ　ｗ　ｅ　ｅ　ｎ　２０
　、　Ｂ　ＳＡ、ＰＢＳ）で３回洗；↑後、パーオキシ
ダーゼ標識抗−マウスＩｇＣを５０μｍ／讐ｅ１１加え
室温で１時間反応させた。ＴＢＳで３回洗浄後オルトフ
ェニレンジアミン基質１００μｍを加え３０分間反応後
、ＩＮ硫酸ｌＯＯμｍを加え反応を停止し、４９２ｎ−
における吸光度を測定した。

Ｉｓｈｉｋａｗａ纏胞、ＨＯＣ−２１細胞および０ＶＡ
−１細胞とも過沃素酸、ミックストグリコシダーゼで反
応性の増強が起こり、シアリダーゼでは変化なし、トリ
プシンでは反応性が消失したので、得られた３槌類の抗
体が認識する抗原の認識部位は蛋白抗原であることが確
認された。

実施例３゜ 実施例で得た抗体の各種組織、癌細胞株との反応性より
特異性を調べた。

方法はアビジン−ビオチン免疫ｍｍ染色法を用いたくフ
ナコシ薬品社製試薬）。

表１は正常各組織２表２は各種癌に対するｌｌ−１抗体
の反応性を示す。

！！−１抗体は正常腺上皮に特異的に反応し、それ以外
の正常＆ｌＩ織成分成分反応しながフた（表１）。

癌細胞に対する反応性は腺癌細胞株においてのみ反応し
、扁平上皮癌細胞株で反応するものはなかった（表２）
。

表１．正常各組織に対するＩ　Ｉ−１抗体の反応性（免
疫組織染色法）表２．各種癌組織に対するｌｌ−１抗体
の反応性（免疫組織染色法）実施例４゜ 当該実施例で得たＴｌ−１抗体が認識する抗原蛋白の解
析を二次元０’Ｆａｒｒｅｌ法によるイムノブロッティ
ング法および５ＯＳ−ＰＡＧＥによる一次元イムノブロ
ツティング法によって行った（図１゜２）、方法はいず
れも免疫実験法【右田浚介ら監訳、西村書店、ｐ１９〜
６４］に準じて実施した。

１１−１抗体が認識する抗原蛋白は、分子量６万２００
０に中心をもつ、１０本程度のバンドを形成する等電点
６〜６．２の蛋白であり、これは従来の糖鎖に対する抗
体が高分子分画に均等に広く広がる分子を認識するとの
報告［Ｔｓｕｊｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４７：３５４３（＋９８７）
］と明らかに異なるものであった。

【図面の簡単な説明】 図１ａは、ｌ０Ｃ−２１の膜抽出物の二次元電気泳動蛋
白銀染色の結果を示し、 図１ｂは、ＨＯＣ−２１の膜抽出物の二次元電気泳動を
ニトロセルロースメンブランにトランスプロットし、！
■−１抗体で免疫染色した結果を示し、 図２は、各種処理による抗原の変化、−次元電気泳動イ
ムノブロッティング法の結果を示す。 図１ｂにおいて、（１）〜（６）はそれぞれ、１３０に
　ホスホリラーゼ　Ｂ。 ７５Ｋ　牛血清アルブミン。 ５０Ｋ　　卵アルブミン。 ３９Ｋ　　炭酸脱水素酵素。 ２７Ｋ　　大豆トリプシンインヒビター１７Ｋ　リゾチ
ームを示し、 図２において、 ａｎｅ　１は、Ｉｓｈｉｋａｗａ！ｌ胞膜抽出物。 Ｉａｎｅ２は、ＨＯＣ−２１１胞膜抽出物を。 １ａｎｅ３〜Ｉａｎｅ９はそれぞれｌ０Ｃ−２１！ｌ胞
膜抽出物の ミックストグリコシダーゼ処理物。 シアリダーゼ処理物。 トリプシン処理物（１時間）。 トリプシン処理物（１６時間） プロナーゼ処理物（１時間） プロナーゼ処理物（ １６６時間 過沃素酸処理物 く ６時間） を示す。 ↓・ 榮Ｎ 勧 む 煩 払 外。 ヘ ベ 鎚 回１ 戊 圀 手 続 補 正 書 （方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６３年特許願第２６０６１９号 ２発明の名称 ３補正をする者 事件との関係

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）糖鎖抗原に対して免疫不全を有する先天的免
   疫不全マウスをヒト細胞またはヒト細胞膜で免疫する工
   程； ｂ）該被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスの抗体産生細胞
   と骨髄腫細胞とを融合させる工程；ｃ）該ヒト細胞膜蛋
   白に特異的に反応する抗体を産生する融合細胞株を選択
   する工程； ｄ）該選択融合細胞株をクローン化する工程；ｅ）該ク
   ローン化融合細胞株を培養し、培養液中より抗体を分取
   する工程； よりなることを特徴とするヒト細胞膜上の蛋白に特異的
   に反応する抗体を作成する方法。
2. （２）被免疫、糖鎖抗原免疫不全マウスが雄のＣＢＡ／
   Ｎマウスであることを特徴とする請求項１に記載の方法
   。
3. （３）該ヒト細胞膜蛋白に特異的に反応する抗体を産生
   するクローンを、培地中に培養するかマウスに投与して
   該マウスで腹水化し、該培養物または腹水より分取する
   ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. （４）免疫するヒト細胞が腫瘍細胞である請求項１に記
   載の方法。
5. （５）免疫するヒト腫瘍細胞が子宮内膜癌、卵巣癌、大
   腸癌、肝癌、膵癌、胆管癌、胃癌、乳癌および肺癌から
   なる群から選択される請求項４に記載の方法。