KR102009007B1 - 항-프로게스틴 민감성 종양을 확인하고 치료하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

항-프로게스틴 민감성 종양을 확인하고 치료하기 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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Abstract

항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 갖는 것으로 의심되는 환자를 확인하고 치료하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도가 항-프로게스틴 요법을 이용한 치료에 민감한 종양을 확인하기 위해 이용될 수 있다.

Description

항-프로게스틴 민감성 종양을 확인하고 치료하기 위한 방법 및 시스템{METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFYING AND TREATING ANTI-PROGESTIN SENSITIVE TUMORS}
배경
본 출원은 전체 개시내용이 참조로서 본원에 포함되는, 2011년 10월 4일에 출원된 미국 가특허 번호 61/542,931호를 우선권으로 주장한다.
프로게스테론 수용체(PR)는 2개의 주요 아이소형(isoform) PR-A 및 PR-B로 세포에 존재한다. 결합된 프로게스틴 리간드, 예를 들어, 프로게스테론의 존재하에서, PR은 특정 부위에서 인산화되고, 이합체화되고, 다수의 다양한 세포 요소(예를 들어, p300 및 스테로이드 수용체 보조활성제)와 복합체를 형성하고, 프로게스테론 반응 요소(PRE)로 공지된 특정 DNA 서열에 결합하여, RNA로의 DNA 전사를 개시시킨다. PR-리간드 복합체는 또한 차례로 특정 유전자를 전사시키는 세포 요소를 형성하는 다수의 다른 보조활성제 및 보조억제물질을 끌어당긴다. 이들 PR 복합체(집중점(foci)으로도 언급됨)는 면역조직형광(immunohistofluorescence) 기술을 이용하여 형광 응집물로서, 및 본 특허에 기재된 면역조직화학 기술을 이용하여 밀집되고 어둡게 염색된 핵 응집물로서 프로게스테론 수용체를 함유하는 세포의 핵 내에서 시각화될 수 있다.
폐경전 여성에서, 에스트로겐이 우세한 호르몬이고, 프로게스테론이 최소로 분비되는 증식 단계(월경 주기의 첫번째 부분) 동안, PR-A 및 PR-B에 대한 정상 자궁내막 세포의 염색(예를 들어, 면역형광 기술 및 공초점 현미경검사법을 이용함)은 확산성 프로게스테론 수용체 핵 염색 패턴을 나타낸다. 프로게스테론이 우세한 호르몬인 분비 단계(월경 주기의 두번째 부분)에서, 동일한 면역형광 기술 및 공초점 현미경검사법을 이용하여, PR-A 및 PR-B에 대한 염색은 용이하게 검출가능한 형광 핵 집중점으로 나타난다.
RNA 전사 억제제는 PR 집중점의 형성을 방지하는 것으로 밝혀졌고, 26S 프로테아솜 억제제는 PR 핵 집중점을 붕괴시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 세포 내의 PR 집중점의 존재는 활성 전사 복합체에 해당하고, PR 및 이후의 유전자 발현의 활성화를 나타내는 것으로 생각된다. 역으로, 확산성 핵 염색 또는 PR 집중점의 부재는 전사적으로 비활성인 PR의 존재를 나타낸다. 프로게스틴 리간드에 대한 정상 유방 및 자궁내막 조직(프로게스테론에 대해 생리학적으로 반응성임)의 노출 시, 확산성 핵 염색 패턴으로부터 집중점 아핵 구조로의 변화가 관찰될 수 있고, 이는 프로게스테론 수용체의 활성화를 나타낸다.
정상 유방 상피 및 자궁내막 세포에 대해 에스트로겐은 분열촉진성(예를 들어, 세포 증식을 야기시킴)인 반면, 프로게스틴의 효과는 더욱 복잡하다. 자궁내막에서, 프로게스틴은 G1 단계에서 초기에 에스트로겐-유도된 세포 주기 진행을 억제하는 반면, 유방에서, 프로게스틴은 증식을 자극하고 억제할 수 있다. 정상 유방 조직 생검에서, 증식 활성이 프로게스테론에 의해 자극되는 것으로 밝혀졌다(Am J Obstet Gynecol, 1997). 이러한 복잡성은 유방암에서 실험 관찰의 교란을 초래하였다. 예를 들어, 프로게스토겐은 페놀 레드(phenol red) 비함유 매질이 사용되는 경우 시험관내에서 유방암 세포에 대해 직접적인 증식 효과를 갖는 것으로 보인다(H. J. Kloosterboer, J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 49, No. 4-6, pp. 311-318, 1994). 그러나, 유방암 세포주에서 증식이 유도된 동일한 피임제 프로게스토겐이 에스트로겐-의존성 DMBA 래트 유방암 모델에서 연구된 경우, 이들 프로게스토겐은 종양 진행을 억제하였다. 동일하게, 많은 상기 시험관내 실험 모델이 부적당한 것으로 최근에 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌[Lange C. et al. Progesterone Receptor Action: Translating Studies in Breast Cancer Models to Clinical Insights. Chapter 7 in Innovative Endocrinology of Cancer; 94-111(2010)]을 참조하라. 프로게스테론-유도된 증식이 상기 실험 모델에서 밝혀진 반면, 대다수의 증식 세포는 PR을 발현하지 않았다. 따라서, 이들 모델이 항프로게스틴을 이용한 치료의 효능을 반드시 예측하는 것은 아니다.
악성 세포가 또한 핵 PR 집중점을 나타내지만, 이들은 크기 및 조성에 있어서 정상 세포의 집중점과 상이하다. 암에서 관찰된 PR 집중점은 세포의 악성 특성에 타당한 PR에 대한 특정 역할을 나타낸다. 예를 들어, 악성(암) 유방 세포에서 PR에 의해 활성화된 유전자는 정상 유방 세포에서 PR에 의해 활성화된 유전자와 상이하며; 자궁내막암에서, PR 집중점은 악성 특징과 관련되나, PR 수준은 그렇지 않으며; 암세포에서 집중점은 더 크고, 이는 암에서 일반적인 염색질 리모델링에서의 변화로 인한 것일 수 있으며; 유방암에서 PR 집중점은 호르몬 상태(예를 들어, 폐경전 및 폐경후 여성 각각에서 순환 프로게스테론의 존재 및 부재에서의 호르몬 상태)와 관계 없이 관찰된다. PR 집중점은 PR-수용체 양성 인간 유방암 생검의 약 50%의 종양 세포에서 관찰되었다(예를 들어, 면역형광 기술 및 공초점 현미경검사법을 이용함). 다른 환자의 종양 샘플은 면역형광 기술 및 공초점 현미경검사법을 이용하여 종양 세포에서 확산성 PR 핵 염색 패턴을 나타내었고, 이는 PR의 비-활성화되거나 비-기능적인 형태를 나타낸다.
대부분의 유방암은 현재 유방암 요법에서 사용되는 가장 효과적인 약물 중 일부인 호르몬 치료(즉, 항-에스트로겐 또는 아로마타제 억제제)로 치료될 수 있다. 호르몬 치료는 보통 암세포 내에서의 호르몬 수용체의 확인을 기초로 하여 지정된다. 오나프리스톤(onapristone, ONA)은 본래 피임 용도를 위해 개발된 항-프로게스틴 약물이다. 그러나, 진행된 유방암에서 실질적 활성이 입증되었고, 이전에 호르몬 요법이 실패한 유방암(예를 들어, 환자가 항에스트로겐 타목시펜을 처방받음에도 불구하고 유방암이 진행됨)을 갖는 101명의 불량한 예후의 환자의 연구에서 10%의 반응률을 가졌다. 제 1선 호르몬 치료로서 ONA를 이용한 작은 유방암 연구에서, ONA는 상기 질병에서 최적으로 이용가능한 치료의 보다 높은 범위의 효능인 56%의 객관적 반응률을 생성시켰다. ONA는 PR에 결합하고, PR 인산화를 유도하지 않고, PR이 이합체화되는 것을 허용치 않는다. PR-ONA 복합체는 이의 표적 DNA 세그먼트에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않고, 따라서, DNA 전사에 필요한 과정인 염색질 리모델링을 활성화시키지 않는다. 시험관내 시스템에서, ONA는 PR에 대한 인공 리간드의 결합에 의해 생성된 PR 핵 응집물을 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 유전자 활성화 연구는 프로게스틴 및 다른 항-프로게스틴이 프로게스테론 반응성 유전자를 활성화시키는 반면, ONA는 최소 활성화(즉, 3 유전자)를 갖는 것을 시종일관 나타내었다.
또한, ONA는 생리학적으로 달성될 수 있는 농도에서 순수한 PR 길항제이다. ONA는 다른 스테로이드 수용체를 간섭하지 않으며, 미페프리스톤(mifepristone)과 같은 다른 항-프로게스틴에 의해 나타나는 유방암 요법에 대한 요망되지 않은 부작용인 인간 피검체에서의 에스트로겐 분비를 증가시키지 않는다.
오나프리스톤은 유방암에 대한 잠재적 치료제로서 이전에 연구되었으나, 독성 우려로 인해 이의 개발은 중지되었다. 문헌[Robertson et al., Onapristone , a Progesterone Receptor Antagonist , as First - line Therapy in Primary Breast Cancer European J. of Cancer 35(2) 214-218 (1999)]. ONA 및 다른 항-프로게스틴을 이용한 치료에 가장 크게 반응할 것 같은 종양을 갖는 환자의 서브셋을 확인하는 것이 중요하며, ONA 및 다른 항-프로게스틴을 이용한 치료를 이용한 치료에 가장 적게 반응할 것 같은 종양을 갖는 환자의 서브셋을 확인하는 것도 동등하게 중요하다. 상기 환자의 서브셋을 확인하는 것은 APF를 갖는 상기 환자가 잠재적으로 효과적인 암 치료에 접근하는 것을 가능케 할 것이며, ONA 또는 다른 항-프로게스틴이 이점을 제공할 수 없는 암을 갖는 환자를 불필요한 독성에 노출시키는 것을 피하게 할 것이다.
현재, 특정 암(예를 들어, 유방암)에서 내분비 치료를 이용하는 것에 대한 치료 결정을 내리는 경우에 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체의 존재 또는 부재만이 고려된다. 따라서, PR에 대한 통상적인 검정은 암을 갖는 환자로부터의 종양을 PR-양성 또는 PR-음성의 2개의 카테고리로 분류한다. 검정의 한 유형은 세포의 전체 단백질 당 PR의 양을 정량한다. 이들 방법은 자동화될 수 있으며 정량적이지만, 세포 아핵 수용체 구조의 정확도, 민감성 및 분석과 관련하여 만족스럽지는 않다. 두번째 유형의 검정은 포르말린 고정 조직 표본 및 수용체를 표적으로 하는 형광 또는 발색단 표지된 모노클로날 항체(PR-A 및 PR-B의 각각에 대한 항체, 또는 PR-A 및 PR-B 둘 모두를 인지하는 단일 항체)를 이용한 면역조직화학 방법을 포함한다. 면역조직화학 방법을 이용하여, 세포의 특정 백분율 이상(통상적으로, ≥ 1%)에서의 임의의 현미경적으로 검출가능한 핵 염색 반응은 전문 학회 지침에 의해 PR 양성인 것으로 보고된다. 통상적으로, ≥ 10% ER 또는 PR 양성 세포의 임상 컷 오프가 항-호르몬 치료의 사용과 관련된 치료적 결정을 내리는데 이용된다. 세포 또는 핵 염색의 패턴은 고려되지 않는다. 상대적 염색 강도(즉, 낮음, 중간, 또는 높음)가 또한 호르몬 수용체 양성의 정성적 척도로 사용된다. 이러한 두번째 유형의 검정은 더 노동 집약적이며, 표준화되어 있지 않다. 통상적으로, 호르몬 수용체(에스트로겐 수용체(ER) 또는 PR)의 존재를 확인하기 위한 IHC 분석에 대해 저 배율 현미경 검사가 이용된다. 통상적인 방법을 이용하여, 확인된 호르몬 수용체를 발현하는 종양 세포의 백분율의 평가 이외에 세포 분포의 분석은 수행되지 않는다. PR의 아핵 분포 패턴의 분석은 고배율의 현미경검사를 필요로 한다. 대조적으로, 고배율의 현미경검사는 종양 조직에서의 호르몬 수용체의 표준 IHC 결정에 요구되지 않는다. 이들 호르몬 수용체 결정의 통상적인 방법은 따라서 아핵 PR 분포와 관련된 정보를 제공할 수 없다.
프로게스틴은 별개의 세포를 표적화하고, PR을 발현하지 않는 세포에 대한 간접적인 효과를 가짐으로써 유방 및 다른 호르몬 민감성 조직에서 복잡한 작용을 한다. PR 집중점 복합체는 정상 조직 및 암성 조직에서 정성적으로 동일하지 않으며, 이들은 동일한 프로게스테론 수용체 관련 유전자를 반드시 활성화시키지는 않는다. 이용가능한 임상 데이터는 호르몬 수용체 양성 세포를 확인하기 위한 통상적인 기술이 항-에스트로겐이거나 항-프로게스틴 표적화 치료이건 간에 항-호르몬 효능을 예측한다는 입장을 충분히 뒷받침하지 않는다. 현재, 유방암 및 다른 호르몬 민감성 종양을 갖는 환자에 대해 호르몬 치료(예를 들어, 항에스트로겐 또는 아로마타제 억제제)를 이용하는 것에 대한 결정은 단순히 종양 샘플 내의 호르몬-수용체의 존재를 기초로 한다. 호르몬 수용체(ER 또는 PR)의 존재는, 호르몬-수용체 양성 종양 병증의 50-60% 만이 치료로부터 이로울 것으로 예측됨에 따라, 호르몬 치료에 대한 반응을 충분히 예측하지 못한다.
불균일한 "자연 발생" 종양과 관련하여 ONA 및 다른 항-프로게스틴의 효능을 예측하기 위한 안정된 방법이 필요하다. 추가로, 개별 환자에서 암에 대한 ONA 및 다른 항-프로게스틴의 치료 효능을 예측하는 검정이 필요하다.
개요
항-프로게스틴 치료에 관한 중요한 문제는 관련된 임상 치료 표적인 활성화된 PR을 확인하는 방법이다. 본 발명의 예시적 방법은 임상 환경에서 일상적으로 수득가능한 인간 종양 조직에서의 기능적(활성화된) 상태로 존재하는 PR을 특성규명하는 것을 목표로 한다. 특정 항-프로게스틴을 이용하여 비-활성 PR을 길항시키는 것이 치료적으로 효과가 없음에 따라, 본 발명의 방법은 항-프로게스틴을 이용한 환자의 치료를 안내하기 위한 신규하고 중요한 정보를 제공한다. 상기 예측 진단 시험은, (1) ONA 및 다른 항-프로게스틴과 관련하여 치료 결정을 내리는 것을 뒷받침하기 위한 안정된 방법을 제공하고, (2) 치료에 반응할 것 같은 개별적 환자 및 환자 집단의 선택을 안내하고, (3) 항-프로게스틴 치료로부터 가장 적게 반응하거나 이익을 얻을 것 같은 개별적 환자를 배제시킬 것이다.
한 양태에서, 오나프리스톤(ONA)과 같은 항-프로게스틴을 이용한 치료에 가장 민감한 프로게스테론 수용체(PR) 양성 종양의 서브셋의 확인 및 치료를 위한 방법이 제공된다. 본원에 기재된 바와 같이 밀집한 집중점 PR 핵 분포 패턴을 나타내는 프로게스테론 수용체 양성 종양이 오나프리스톤과 같은 항-프로게스틴을 이용한 치료에 더 민감하다. 시험관내 균일한 실험 모델로부터의 결과는 자연-발생의 불균일한 종양의 특성을 반드시 예측하지는 않는다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양의 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 종양형성성 또는 암성인 것으로 의심되는 조직 샘플은 환자로부터 수득될 수 있다. 조직 샘플에서의 프로게스테론 수용체 양성 세포가 확인될 수 있다. 조직 샘플로부터의 프로게스테론 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체 집중점의 분포의 정도가 이후 결정될 수 있고, 조직 샘플 내의 집중점 분포의 정도가 프로게스테론 수용체 양성 세포의 약 5%를 초과하는 경우 항-프로게스틴이 환자에 투여될 수 있다.
이들 환자는 활성화된 프로게스테론 집중점(APF)를 비활성화시키는 항-프로게스틴(예를 들어, ONA)을 이용한 치료로부터 이득을 보고, 종양이 활성화된 PR을 발현하지 않는 환자보다 APF의 추가 형성을 방지할 가능성이 더 높다. PR의 비-활성화된 형태는 통상적으로 확산성 핵 PR 염색으로 관찰된다. 항-프로게스틴에 의한 APF의 비활성화는 집중점의 분리 및 집중점의 구조를 실질적으로 변경시킴이 없는 집중점의 활성화의 억제를 포함하는 다양한 메커니즘 중 임의의 메커니즘에 의해 발생할 수 있다. 한 양태에서, APF 형성은 여러 메커니즘을 통해 항-프로게스틴에 의해 억제되거나 방지될 수 있다. 예를 들어, 오나프리스톤은 개별적 프로게스테론 수용체가 이합체화되는 것을 허용치 않을 수 있고, 리간드 인산화 부위에서 PR이 인산화되는 것을 방지할 수 있다. PR-ONA 복합체는 이의 표적 DNA 세그먼트(PRE)에 약하게 결합할 수 있거나 전혀 결합하지 않을 수 있고, DNA 전사에 필요한 과정인 염색질 리모델링을 유도하는데 실패할 수 있다. 또 다른 예에서, 다른 항-프로게스틴은 PR이 이합체화되는 것을 가능케 할 수 있고, DNA 전사를 유도하지 않는 보조활성제 또는 보조억제제와 복합체를 형성할 수 있다.
이러한 예에서, DNA 결합은 PRE에서 발생할 수 있으나, 전사는 발생하지 않는다. APF의 확인은 작용제가 PR 경로를 간섭하는 한 임의의 항-프로게스틴 치료의 결정에 정보를 제공할 수 있다. 한 양태에서, APF의 확인은 활성화되거나 그렇지 않은 PR 경로의 상태를 결정한다. 예를 들어, 미페프리스톤, 또는 PR과 복합체를 형성하고 DNA에 결합하는 임의의 프로게스틴의 사용은 APF의 확인에 의해 정보가 제공될 수 있다. PR 인산화를 억제하고, 이에 따라 PR 활성화를 간섭하는 것을 포함하는 다른 작용제의 활성은 다양한 암에서 APF의 존재에 의해 예측될 것이다. 따라서, APF의 확인은 PR의 기능을 억제함으로써 작용하는 화합물의 다양한 부류에 대한 치료 권장에 정보를 제공하기 위해 이용될 수 있다.
활성화된 PR 집중점(APF)을 발현하지 않는 환자 종양은 통상적인 검정에 의해 PR-음성인 종양, 또는 통상적인 검정에 의해 PR-양성인 종양을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 유방암, 뇌암, 수막종, 전립선암, 난소암, 자궁내막암, 자궁근종, 폐암, 및 자궁암을 포함하는 APF를 나타내는 임의의 종양/암이 상기 항-프로게스틴을 이용한 치료를 위한 후보이다. 암성 질환으로 정식으로 아직 분류되지 않은 폐 평활근종증이 또한, 비정상적 조직에서 APF가 발현되는 경우 이로울 가능성이 있다. 또 다른 양태에서, 표준 치료를 이용하여 다루기 어렵지만, APF를 제시하는 양성 종양은, APF의 존재가 상기 종양이 PR의 이상 활성화, 즉, 프로게스틴 경로에 의해 유도되는 것을 나타냄에 따라 항프로게스틴에 의해 치료될 수 있다.
또 다른 양태는 환자로부터 종양형성성 또는 암성인 것으로 의심되는 조직 샘플을 수득하고, 상기 조직을 항-프로게스테론 수용체 항체에 노출시킴으로서 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 조직 샘플에서 프로게스테론 수용체 양성 세포가 확인될 수 있다. 조직으로부터의 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 결합 분포의 정도가 결정될 수 있다. 집중점 결합 분포가 조직 샘플에서 프로게스테론 수용체 양성 세포의 약 5% 초과인 경우, 항-프로게스틴은 항프로게스틴의 역가, 생체이용률, 및 안전성 프로파일에 따라 하루 당 약 10 내지 약 200 mg의 투여량 범위로 환자에 투여된다.
또 다른 양태에서, 조직은 유방, 뇌, 수막종, 전립선, 난소, 자궁내막, 자궁근종, 폐, 및 자궁 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 종양 조직의 표본이다.
또 다른 양태에서, 집중점 분포의 존재 또는 부재는 형광, 비색 반응(예를 들어, 효소 반응)에 의해 검출되고, 대조염색 항체(예를 들어, 발색단), 방사능, 및 웨스턴 블롯(예를 들어, PR의 차별적 인산화)으로 영상화된다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스틴은 오나프리스톤, 로나프리산(lonaprisan), 미페프리스톤, PF-02413873, 텔라프리스톤(telapristone), 릴로프리스톤(lilopristone), ORG2058, 아소프리스닐(asoprisnil), 및 울리프리스탈(ulipristal)로 구성된 군으로부터 선택된다.
활성 프로게스테론 수용체 집중점 분포의 존재는 프로게스테론 수용체 양성 세포의 약 5% 초과의 핵 집중점 분포의 정도에 의해 나타난다. 또 다른 양태에서, 종양은 집중점 분포와 관련하여 불균일할 수 있고, 종양의 다양한 영역에서 별개의 프로게스테론 수용체 집중점을 갖는 활성 결합 패턴(A), 별개의 프로게스테론 수용체 집중점을 갖지 않는 확산성 결합 패턴(D), 또는 A 패턴 및 D 패턴의 혼합(AD)을 나타낼 수 있다.
상기 양태 중 임의의 양태에서, 집중점 분포(A 또는 AD 패턴)가 존재하는 경우, 상기 집중점 분포의 강도 또는 밀도가 정량될 수 있다. 예를 들어, 프로게스테론 수용체 항체가 방사성 표지될 수 있거나, 형광 표지될 수 있거나, 대조 염색 항체(발색단)으로 영상화될 수 있거나, 비색 반응(예를 들어, 효소 반응)으로 영상화될 수 있거나, 표지의 강도가 측정되고 정량될 수 있는 또 다른 방식으로 표지될 수 있다.
도면
도 1a 및 1b는 프로게스테론 수용체에 특이적인 항체를 이용하여 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 생검으로부터 유래된 인간 유방암 샘플에서의 예시적인 갈색의 면역조직화학 핵 염색 패턴을 도시한다;
도 2a 및 2b는 프로게스테론 수용체에 특이적인 항체를 이용하여 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 생검으로부터 유래된 인간 유방암 샘플에서의 예시적인 녹색 핵 염색 패턴을 도시한다;
도 3a 및 3b는 프로게스테론 수용체에 특이적인 항체를 이용하여 포르말린 고정되고 파라핀 포매된 생검으로부터 유래된 인간 유방암 샘플에서의 HES 백그라운드 대조염색을 이용한 예시적인 갈색의 면역조직화학 핵 염색 패턴을 도시한다;
도 4는 3개의 결합 패턴 A, AD, 및 D에 대한 PR-A 및 PR-B에 대해 양성인 유방암 샘플의 퍼센트를 도시한다.
상세한 설명
본원에 기재된 여러 예시적 양태를 기재하기 전, 본 발명은 하기 설명에 기재된 구성 또는 과정 단계의 세부사항에 제한되지 않음이 이해되어야 한다. 본원에 기재된 양태는 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.
본원에서 사용되는 구 "종양을 치료하는" 및 "종양의 치료"는 종양 세포의 복제를 억제하거나, 종양의 확산을 억제하거나, 종양 크기를 감소시키거나, 신체 내의 종양 세포의 수를 줄이거나 감소시키거나, 종양에 의해 야기되는 질병의 증상을 개선시키거나 완화시키거나, 종양의 성장을 감소(종양이 진행되는데 걸리는 시간을 증가)시키거나, 사망이 암 또는 암의 이차 결과로 인한 것인 경우 환자의 생존을 개선시키는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 암의 치료를 포함한다. 종양은 암 및 비-암성 종양 둘 모두를 포함한다. 사망률 및/또는 이환률에서의 감소, 종양-관련 증상의 개선이 존재하거나, 신체 내의 종양 세포의 감소된 수, 감소된 종양 크기 또는 진행에 걸리는 시간에서의 개선, 진행이 없는 생존의 개선 또는 질병이 없는 생존의 개선으로 나타날 수 있는 질병 부담의 감소가 존재하는 경우에 치료는 치료적인 것으로 간주된다.
본원에서 사용되는 용어 "APF-활성 항-프로게스틴" 및 이의 등가물은 세포의 핵 내의 활성화된 PR 집중점(APF)을 용해시키거나 분리시키는 능력을 나타내거나, 세포의 핵 내의 APF의 형성을 억제하는 능력을 나타내는 항-프로게스틴 약물을 나타내며, 이는 이의 작용 메커니즘이 세포의 PR 활성화 경로를 통하는 것을 나타낸다.
용어 "APF-양성", "PR 집중점 양성", "활성화된 PR", "기능 상태의 PR" 등은 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체 응집물의 존재를 나타낸다.
용어 "집중점 분포"는 프로게스테론 양성 세포의 핵 내의 "집중점"(즉, 프로게스테론 수용체의 응집)의 분포를 나타낸다. 반점 존재(speckled) 또는 과반점 존재(hyperspeckled) 패턴은 생물학에서 스테로이드 핵 수용체 집중점 패턴을 언급하는데 사용될 수 있는 용어이다.
용어 "집중점 분포의 정도"는 프로게스테론 양성 세포의 핵에 존재하는 PR 집중점의 상대량을 나타낸다. 집중점 분포의 정도는 정량적 또는 정성적으로 결정될 수 있다.
예를 들어, 비색, 효소, 또는 방사성 표지된 리간드, 예를 들어, 프로게스테론 수용체 항체의 사용은 세포 핵 내의 프로게스테론 수용체에 결합시키는데 이용될 수 있다. 집중점 분포의 정도는, 예를 들어, 색 강도, 형광을 측정하거나, 표지된 항체에 의해 방출된 방사능의 수준을 정량함으로써 정량적으로 결정될 수 있다. 집중점 분포의 정도는 적절한 배율의 광학현미경 또는 DNA 마이크로어레이, 단백질 프로파일링, 방사성 표지, 또는 APF를 측정하기 위한 다른 대용물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 기술을 이용하여 대조군 샘플과 표지된 샘플 사이의 결합의 강도를 비교함으로써 정성적으로 결정할 수 있다.
용어 "확산성 패턴"은 집중점 분포의 부재를 나타내는 미세한 과립 패턴을 나타낸다.
용어 "프로게스틴"은 프로게스테론 수용체 조정자(PRM) 또는 선택적 프로게스테론 수용체 조정자(SPRM)으로도 언급되는 프로게스테론의 작용의 일부 또는 전부를 모방하는 자연 또는 합성 황체기 물질을 나타낸다.
용어 "항-프로게스틴"은 오나프리스톤, 로나프리산, 미페프리스톤, PF-02413873, 텔라프리스톤, 릴로프리스톤, ORG2058, 아소프리스닐, 및 울리프리스탈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 황체기 작용제의 형성, 수송, 또는 작용을 억제하거나, 이를 비활성화시키는 물질을 나타낸다. PRM 또는 SPRM은 일부 항-프로게스틴 특성을 가질 수 있고, 사용 환경에 따라 항-프로게스틴 또는 프로게스틴으로 간주될 수 있다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 나타내고, 다른 물질을 배제하는 항원에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 임의의 물질, 또는 물질들의 그룹을 포함한다. 일반적으로, 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간 또는 동물로부터 유래된 항체, 인간화된 항체(예를 들어, 인간으로부터 유래된 비-결합 부분, 동물로부터 유래된 결합 부분) 및 이들의 단편을 포함한다.
용어 "항-PR-A" 및 "항-PR-B" 항체는 프로게스테론 수용체의 아이소형 - PR-A 및 PR-B 각각에 특이적인 항체를 나타낸다. "항-PR-AB"는 PR-A 및 PR-B 둘 모두에 결합할 수 있는 항체를 나타낸다. 본원의 양태에 따라 사용하기에 적합한 특이적 항체는 PgR636 및 PgR1294(M. Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813)), Novacastra 클론 16, 클론 SAN27, 클론 1A6, Dako 클론 PgR636, Ventana, 클론 1 E2, Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser162] 항체 클론 1064-E2; Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser190] 항체 클론 EP1516Y, Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser294] 항체 클론 608, Abcam 프로게스테론 수용체 [p Ser400] 항체 Ref ab60954, 및 Genetex 프로게스테론 수용체 [p Ser554] 항체 Ref. GTX118987을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "투여하다"는 약물 또는 약물들을 제공하거나, 하나 이상의 약물들을 처방하거나, 처방집에 하나 이상의 약물들을 싣는 것을 나타낸다. 용어 "제공하는"은 임의의 적합한 투여 경로(예를 들어, 경구, 주사, 정맥내, 근내, 및 경피 등)를 통해 환자에 직접적으로 약물을 투약하거나, 이를 수행하기 위한 지시를 환자에게 제공하는 것을 나타낸다.
한 양태는 환자로부터의 종양형성성인 것으로 의심되는 조직을 수득하고, 조직으로부터의 세포의 핵 내의 항-프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정함으로써 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 집중점 분포의 정도가 약 5%를 초과하는 경우, 항-프로게스틴(예를 들어, 오나프리스톤, 로나프리산, 미페프리스톤, PF-02413873, 텔라프리스톤, 릴로프리스톤, ORG2058, 아소프리스닐, 및 울리프리스탈)이 환자에 투여될 수 있다.
유방 및 다른 암에서의 PR, 프로게스틴 및 항-프로게스틴의 역할이 이전에 연구되었으나, 결과는 결론에 이르지 못하였고, 이는 환자를 진단하고 치료하는데 난점을 초래하였다. 다수의 모델은 다른 요인 중에서 종, 계통, 암 유형, 발암물질, 및 종양 환경의 다수의 복잡한 상호작용을 나타내었다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, PR은 세포 성장 및 증식의 비정상적이거나 조절되지 않는 자극을 발생시키는 리간드의 활성화 잠재성에 영향을 미치는 변경된 생리학적 특성과 함께 병리학적으로 활성화될 수 있다. 그러나, 가장 일반적으로 연구된 모델은 본래의 종양의 적은 수로부터 유래되고, 이에 따라 종양 유형들 또는 다양한 환자의 종양들 사이에서 생리학적 변동성을 정확하게 나타내지는 않는다. 즉, 암 모델의 제한된 수는 인간 집단에서 불균일한 암의 복잡성을 포함하기에는 불충분하다.
PR 집중점의 형성의 연구는 유전학적으로 조작된 세포주에서 세포질로부터 핵으로의 PR 전위를 유도하는 능력에 대해 화합물을 시험하는데 이용되었다. 이들 검정, 예를 들어, Thermo Scientific PR(프로게스테론 수용체) Redistribution® 검정은 시험 화합물의 존재하에서 PR의 핵 축적을 정량하기 위한 이미지 분석 및 형광 현미경검사법을 이용한다. 대조적으로, 본원에 제공된 양태는 PR 리간드 또는 약물의 존재와 상관 없이 원발성 종양 조직 내의 PR 집중점의 분석을 위해 설계된다. 한 양태에서, 본원에 기재된 예시적 방법은 PR 길항제 특성을 갖는 항-프로게스틴의 환자에서의 효능을 예측하는데 이용될 수 있는 이상을 나타내는 자연-발생 종양에서의 세포의 핵 내의 PR 집중점의 존재에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 진료소에서의 항시적으로 활성화된 PR의 특성규명은 종양 및 암이 오나프리스톤을 포함하는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 것을 나타내는 것으로 이제 밝혀졌다.
오나프리스톤, (예를 들어, (8S,11R,13R,14S,17S)-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-하이드록시-17-(3-하이드록시프로필)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온)은 하기 화학 구조를 갖는다:
Figure 112014036772712-pct00001
다른 항-프로게스틴은 황체기 3-(6,6-에틸렌-17B-하이드록시-3-옥소-17A-프레그나-4-엔-17A-일)프로피온산 G-락톤, 3-(6,6-에틸렌-17.베타.-하이드록시-3-옥소-17.알파.-프레그나-4-엔-17.알파.-일)프로피온산.감마.-락톤 및 하기를 포함한다:
미페프리스톤
(10S,11S,14S,15S,17R)-17-[4-(디메틸아미노)페닐]-14-하이드록시-15-메틸-14-(프로프-1-인-1-일)테트라사이클로[8.7.0.0^{2,7}.0^{11,15}]헵타데카-1,6-디엔-5-온
Figure 112014036772712-pct00002
릴로프리스톤
(11-베타,17-베타,17(z))-로페닐);에스트라-4,9-디엔-3-온,11-(4-(디메틸아미노)페닐)-17-하이드록시-17-(3-하이드록시-1-p;11β-[4-(디메틸아미노)페닐]-17β-하이드록시-17-[(Z)-3-하이드록시-1-프로페닐]에스트라-4,9-디엔-3-온
Figure 112014036772712-pct00003
ORG2058
(8R,9S,10R,13S,14S,16R,17S)-16-에틸-17-(2-하이드록시아세틸)-13-메틸-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-도데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-온
Figure 112014036772712-pct00004
로나프리산
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-(4-아세틸페닐)-17-하이드록시-13-메틸-17-(1,1,2,2,2-펜타플루오로에틸)-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온
Figure 112014036772712-pct00005
아소프리스닐
(8S,11R,13S,14S,17S)-11-[4-[(E)-하이드록시이미노메틸]페닐]-17-메톡시-17-(메톡시메틸)-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온
Figure 112014036772712-pct00006
울리프리스탈
(8S,11R,13S,14S,17R)-17-아세틸-11-[4-(디메틸아미노)페닐]-17-하이드록시-13-메틸-1,2,6,7,8,11,12,14,15,16-데카하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온
Figure 112014036772712-pct00007
PF-2413873
4-[3-사이클로프로필-1-(메실메틸)-5-메틸-1H-피라졸-4-일]옥시,-2,6-디메틸벤조니트릴
Figure 112014036772712-pct00008
또 다른 양태에서, 집중점 PR 결합은 현재 사용되는 통상적인 PR 검정보다 더 민감하고 예측적인 시험을 제공한다. 통상적으로 PR-양성인 환자 뿐만 아니라 PR-음성으로 통상적인 PR 검정에서 분류된 환자도 집중점 PR 핵 결합에 대한 양성여부를 시험해 볼 수 있고, 따라서 오나프리스톤과 같은 항-프로게스틴을 이용한 치료를 위한 후보자일 수 있다. 이렇게, 이전 방법을 이용하여 PR 음성으로 이전에 확인된 환자는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스틴을 이용한 치료를 위한 후보자로 간주되지 않았다. PR-음성으로 통상적으로 시험된 환자에서 PR 집중점의 존재는 상기 환자 중 일부에서 오나프리스톤이 활성인 명백하게 이례적인 결과를 설명할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 양태는 호르몬 치료를 "삼중 음성"(즉, 에스트로겐 수용체(ER), PR 및 Her2에 대해 음성)으로 분류되는 유방암을 갖는 환자를 잠재적으로 포함하는 더 많은 수의 암환자에게 잠재적으로 이용가능하게 만들 것이다.
본원에 기재된 양태에서 사용하기 위한 예시적인 적합한 면역조직화학 방법은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[M. Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813) and M. Nadji (Anatomic Pathol. (2005) 123:21-27)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 분석을 위한 원발성 암 조직 표본은 통상적인 PR 검정에 대해 당 분야에 공지된 바와 같은 암 조직의 파라핀 섹션 또는 미세 바늘 흡인 도말표본으로 제조될 수 있다. 파라핀 섹션이 사용되는 경우, 파라핀은 먼저 슬라이드를 가열함으로써 용해되고, 크실렌으로 탈왁스된다. 이후, 슬라이드는 감소하는 등급의 에탄올에서 재수화되고, 항체, 바람직하게는 PR-A, PR-B, 또는 둘 모두에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 노출된다. 이후, 항체의 결합은 항체 결합의 검출을 위한 당 분야에 공지된 방법 중 어느 하나를 이용하여 검출되고, 이의 예는 하기에 기재된다.
항체의 이의 표적에 대한 결합의 검출을 위한 하나의 예시적인 적합한 방법은 비색 검정, 통상적으로 효소적 비색 검정이다. 하나의 상기 방법은 광학현미경 하에서 가시적인 착색된 염색을 발생시키기 위해 퍼옥시다제를 이용한다. 조직 표본 내의 내인성 퍼옥시다제는 과산화수소를 이용하여 블로킹되고, 내인성 비오틴은 항체 또는 항체들과의 인큐베이션 전에 비오틴-블로킹 시약을 이용하여 블로킹된다. 일차 항체가 마우스 항체인 경우, 이는 비오티닐화된 항마우스 면역글로불린에 이후에 결합된다. 스트렙타비딘-퍼옥시다제 컨쥬게이트는 효소를 항체-표적 복합체에 결합시키기 위해 첨가된다. 색은 디아미노벤지딘 및 큐프릭 설페이트의 첨가에 의해 발색된다. 조직 표본은 퍼옥시다제 염색의 시감도(visibility)를 증가시키기 위해 패스트 그린(fast green)으로 대조염색될 수 있다.
대안적으로, 형광 방법은 PR-A, PR-B 또는 둘 모두에 대한 항체 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우, 형광-표지된 일차 항체는 PR 표적에 결합될 수 있고, 형광 현미경 하에서 직접 검출될 수 있다. 그러나, PR에 대한 표지되지 않은 일차 항체의 결합을 이용한 후, 일차 항체에 대한 형광-표지된 이차(예를 들어, 항마우스 면역글로불린) 항체의 결합을 이용하는 방법은 비-특이적 형광을 감소시킬 수 있다. 면역조직화학 검정에서 사용하기 위해 공지된 임의의 형광 표지, 예를 들어, FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트); 플루오레세인 FITC 520 nm 녹색 Alexa 488 515 nm 녹색 피코에리트린 PE 565 nm 황색; 피코에리트린-Texas Red ECD 620 nm 적색; 피코에리트린-시아닌5 PC5 665 nm 진한 적색; 페리디닌 클로로필 PerCP 670 nm 진한 적색; 피코에리트린-시아닌 5.5 PC5.5 703 nm 원적색; 피코에리트린-시아닌 7 PC7 755 원적색; E 알로피코시아닌 APC 660 nm 진한 적색; 알로피코시아닌-시아닌 7 APC-CY7이 본원에 기재된 양태에서 사용될 수 있다.
모노클로날 및 폴리클로날 항체 둘 모두가 본원에 기재된 양태에서 유용할 수 있다. 포르말린 고정 및 파라핀 포매에 대해 내성인 2개의 항체(PgR636 및 PgR1294)를 포함하는 적합한 모노클로날 항체의 총망라되지 않은 목록이 문헌[M. Press, et al. 상기]에 기재되어 있다. 본원의 양태에 따라 사용하기에 적합한 특이적 항체는 PgR636 및 PgR1294(M. Press, et al. (Steroids (2002) 67:799-813)), Novacastra 클론 16, 클론 SAN27, 클론 1A6, Dako 클론 PgR636, Ventana, 클론 1E2, Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser162] 항체 클론 1064-E2; Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser190] 항체 클론 EP1516Y, Novus Biologicals 프로게스테론 수용체 [p Ser294] 항체 클론 608, Abcam 프로게스테론 수용체 [p Ser400] 항체 Ref ab60954, 및 Genetex 프로게스테론 수용체 [p Ser554] 항체 Ref. GTX118987을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 양태에서, PR에 대한 항체의 결합은 적절한 경우 광학 현미경 또는 형광 현미경 하에서 염색된 슬라이드의 관찰에 의해 검출된다. 배율은 통상적으로, 예를 들어, 항체에 대한 결합에 대해 양성인 세포의 백분율을 평가하기 위해 약 200X 또는 400X이다. 그러나, APF의 검출에 대한 민감성을 개선시키기 위해, 아핵 구조의 연구를 촉진시키기 위해 800X-1000X에서 슬라이드를 평가하는 것이 요망될 수 있다.
현미경검사에 의해 명백히 PR 음성인 샘플은 광학 또는 형광 현미경검사의 역치 아래의 양성 샘플을 검출하기 위해 흐름세포측정법에 의해 평가될 수 있다. 흐름세포측정법이 드문 양성 세포를 나타내는 경우, 고배율 X800-X1000 현미경검사가 아핵 구조를 연구하고, 활성화된 프로게스테론 수용체 집중점(APF)을 확인하기 위해 이용될 수 있다. 그러나, 흐름세포측정법에 의해 검출된 양성 세포가 APF의 분석을 위한 현미경검사에 의해 확실하게 검출되기에 너무 드문 경우, 형광-활성화된 세포 분류기(FACS)(예를 들어, Sony Cell Sorter SH800, Siemens Immulite 2000)가 세포의 형광을 기초로 하여 현탁 상태의 세포로부터 양성 세포를 분리시키기 위해 이용될 수 있다. 양성 세포가 농축되나 상기 과정에 의해 손상되지 않음에 따라, 이후의 현미경에 의한 평가에서 성공적으로 시각화된 APF의 확실성 및 가능성이 실질적으로 증가된다.
개별적 종양 세포 핵에서의 APF의 존재 또는 부재는 광학 또는 형광 현미경 하에서, 또는 임의의 다른 적절한 수단, 예를 들어, 형광 또는 비색 측정에 의해 시각적으로 검출될 수 있다. 한 양태에서, 검출을 위한 시각적 수단이 이용될 것이다. 염색의 결과는 APF의 존재 또는 부재를 확인하거나, 양성 세포의 수 또는 백분율을 계수함으로써 정량될 수 있다. 대안적으로, 염색의 특정 특징은 정량될 수 있다. 예를 들어, 검출은 APF의 형태의 집중점 결합이 확산성 핵 염색, 수 또는 백분율에 의한 양성 세포의 정량, 및/또는 APF의 강도 또는 수/밀도의 정량을 수반하는지 아닌지의 여부의 표기를 포함할 수 있다. APF 밀도의 정량은 집중점/세포의 평균 수로서, 또는 임의의 척도(예를 들어, "약간", "중간" 또는 "많은")를 이용하여 결정될 수 있다. 강도는 임의의 척도, 예를 들어, 낮음/중간/높음 또는 수적 척도, 예를 들어, 1-5를 이용하여 유사하게 결정될 수 있다. 또 다른 양태에서, 환자의 종양 조직의 분석의 결과는 양성 및/또는 음성 대조군과 비교될 것이다.
한 양태에서, 종양 조직 표본은 표본 내의 프로게스테론 양성 세포의 핵의 1-100%, 5-100%, 25-100% 또는 50-100%가 APF를 나타내는 경우 APF-양성으로 판단된다. 또 다른 양태에서, APF-활성 항-프로게스틴의 치료 효능은 또한 APF 염색의 강도 또는 APF의 수 또는 밀도와 관련될 수 있고, 이들 파라미터는 또한 APF-활성 항-프로게스틴을 이용한 치료에 대한 종양의 민감성을 결정하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, APF-활성 항-프로게스틴을 이용한 치료에 대한 종양의 민감성은 양성 세포의 수 또는 백분율이 증가하고/하거나, APF의 강도가 증가하고/하거나, 종양 조직 표본의 세포에서 APF의 수가 증가함에 따라 증가할 것이다.
추가 양태에서, APF-활성 항-프로게스틴에 대한 종양의 민감성을 결정하기 위한 방법은 수작업(예를 들어, 형광 현미경을 이용한 시각적 검출)일 수 있거나, 이들은 비색- 또는 형광-표지된 조직 표본의 신속한 스캐닝, 검출 및 정량을 위한 방법을 이용하여 자동화되거나 반-자동화될 수 있다. 예를 들어, 완전히 자동화된 스캐닝 및 분석 시스템이 특정 양태에서 개발되고 이용될 수 있다. 분석되는 종양의 특정 영역의 수작업 선택이 한 양태에서 사용될 수 있으나(예를 들어, InScape® 면역조직화학 시스템(예를 들어, InScape® 면역조직화학 시스템(Quest Diagnostics 3 Giralda Farms Madison, NJ 07940))), 세포 핵 내의 APF의 스캐닝 및 분석을 위한 자동화된 시스템이 항원-특이적 면역조직화학 염색된 표본의 자동화된 전체-표본 스캐닝 및 분석을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 이미지 인지는 전체 염색된 조직 섹션의 디지털 이미지를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 항원-특이적 컴퓨터 알고리즘이 전체 표본을 나타내는 디지털 이미지의 결과를 분석하기 위해 이용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵 내의 확산성 백그라운드 염색으로부터 집중점을 구별하고, 세포와 세포(cell-by-cell) 또는 클러스터와 클러스터(cluster-by-cluster)를 기초로 한 집중점의 형광 강도 및 크기를 측정하기 위한 소프트웨어를 구성할 수 있으며, 전체 표본 상에서 각각의 세포 또는 클러스터에 대해 상기 과정이 반복될 수 있다. 이들 자동화된 방법은, 특정 양태에서, 비용 감소와 함께 수작업으로는 가능하지 않은 작용을 수행함으로써 정확성을 개선시킬 수 있다. 완전한 자동화는 또한 시험이 비-전문적인 의학 센터에서 이용가능하게 만들 수 있다.
한 양태에서, 진단 검정의 결과를 기초로 하여 환자를 치료할지의 여부의 결정은 APF가 존재하는 경우 APF의 수/백분율, 강도 및/또는 밀도를 기초로 한다. 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, APF-활성 항-프로게스틴을 이용한 치료의 효능은 양성 세포의 수 또는 백분율이 증가하고/하거나, APF의 강도가 증가하고/하거나, 종양 조직 표본의 세포 내의 APF의 수가 증가함에 따라 증가할 것이 예견된다. 이들 파라미터를 기초로 하여, 의학적 숙련자는 또한 치료의 용량, 타이밍 및 길이를 결정할 수 있다. 따라서, 또 다른 양태는 APF-양성 종양을 치료하기 위한 APF-활성 항-프로게스틴의 사용에 관한 것이다.
상기 방법에 따라 확인되거나 치료되는 종양은 APF가 발생하고, APF의 존재가 결정될 수 있는 임의의 암성 또는 비-암성 종양을 포함할 수 있다. 이러한 암 또는 종양은 유방암, 폐암, 자궁암, 자궁근종, 난소암, 전립선암, 뇌암, 및 혈관종을 포함한다. 특정 양태에 따라 확인되거나 치료될 수 있는 양성 종양은 수막종을 포함하며, 이의 70%는 통상적인 분석에 의해 PR을 발현한다.
전술한 방법의 APF-활성 항-프로게스틴은 APF를 비활성화(예를 들어, 응집물을 용해시키거나 분리시키거나, APF의 형성을 방지하거나, 비활성 APF를 형성시킴에 의함)시키는 능력을 갖는 임의의 항-프로게스틴 약물일 수 있다. 이러한 약물은 오나프리스톤(ONA)을 포함하나, 유사한 작용 메커니즘을 갖는 다른 약물이 또한 본원에 기재된 양태에서 사용하기에 적합하다.
또 다른 양태는 환자로부터 종양형성성 또는 암성으로 의심되는 조직을 수득하고, 상기 조직을 항-프로게스테론 수용체 항체에 노출시킴으로써 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 확인하는 방법을 제공한다. 조직 샘플 내의 프로게스테론 양성 세포가 확인될 수 있다. 조직 샘플로부터의 프로게스테론 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도가 결정될 수 있고, 조직 샘플 내의 집중점 분포의 정도가 프로게스테론 수용체 양성 세포의 약 5%를 초과하는 경우 항프로게스틴이 환자에 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 환자로부터 종양형성성인 것으로 의심되는 조직 샘플을 수득하고, 항-프로게스테론 수용체 항체에 조직을 노출시키는 것을 포함한다. 조직 샘플 내의 프로게스테론 수용체 양성 세포가 확인될 수 있고, 조직으로부터의 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 결합 분포가 결정될 수 있다. 집중점 결합 분포가 조직 샘플 내의 프로게스테론 수용체 양성 세포의 A 또는 AD 결합 패턴의 5%를 초과하는 경우, 항-프로게스틴은 항-프로게스틴의 역가, 생체이용률, 및 안전성 프로파일에 따라 하루 당 약 10 내지 약 200 mg의 투여량 범위로 환자에게 투여된다.
또 다른 양태에서, 집중점 분포의 정도는 면역화학, 면역형광, DNA 마이크로어레이, 단백질 프로파일링, 방사성 표지, 또는 APF를 측정하기 위한 다른 대용물을 포함하는 본원에 논의된 바와 같은 적합한 방법에 의해 결정될 수 있다.
또 다른 양태에서, 종양 조직은 유방, 수막종, 전립선, 난소, 자궁내막, 자궁근종, 폐, 및 자궁 조직으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스틴은 오나프리스톤, 로나프리산, 미페프리스톤, PF-02413873, 텔라프리스톤, 릴로프리스톤, ORG2058, 아소프리스닐, 및 울리프리스탈로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 집중점 분포의 정도는 프로게스테론 양성 조직 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 결합 패턴을 확인함으로써 결정된다. 불균일한 종양은 활성 프로게스테론 수용체 집중점 또는 비활성 프로게스테론 수용체 집중점을 가질 수 있는 세포를 포함한다. 따라서, 세포 핵 내의 명백한 클럼프(clump)로 나타나는 바와 같은 활성 집중점을 함유하는 세포 영역, 및 더욱 확산성인 패턴을 나타내는 세포 영역이 존재할 수 있다.
예를 들어, 도 1은 유방암 환자의 생검으로부터 수득된 인간 유방암 샘플의 포르말린 고정 및 파라핀 포매된 조직 샘플 내에서 항-프로게스테론 항체로 수득된 갈색의 핵 염색으로부터의 2개의 예시적 결합 패턴을 도시한다. 도 1a는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감할 것 같지 않은 세포를 나타내는 확산성, 과립 패턴(D)을 도시한다. 대조적으로, 도 1b는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감할 것 같은 세포를 나타내는 반상(mottled) 결합 패턴(A)을 도시한다. 혼합된 패턴은 A 및 D 패턴 둘 모두를 나타내고, AD로 언급된다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스테론 항체는 항-PR-A 항체, 항-PR-B 항체, 및 항-PR-A 및 항-PR-B 항체의 혼합물, 및 이특이적 항-PR AB 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 항-프로게스틴은 항-프로게스틴의 역가, 생체이용률, 및 안전성 프로파일에 따라 하루 당 10 내지 약 200 mg의 양으로 투여된다. 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 종양을 갖는 환자를 확인함으로써, 더 적은 용량의 항-프로게스틴이 사용되어 독성 부작용의 더 적은 위험을 발생시킬 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 프로게스테론 수용체의 5%를 초과하는 집중점 분포를 나타내는 환자에 대해 더 적은 투여량 범위가 이용될 수 있다. 한 양태에서, A 또는 AD 분류는 다양한 용량을 발생시킬 수 있는 반면, D 패턴은 항-프로게스틴 치료를 이용한 치료가 보장되지 않는 것을 나타낸다.
또 다른 양태에서, APF를 비활성화시키는 능력에 대해 항종양 약물을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 이들 방법은, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 따라 APF-양성 종양을 치료하는데 사용하기 위한 후보자일 수 있는 추가 항-프로게스틴을 확인하는데 유용하다. 한 양태에서, 상기 방법은 종양에서 프로게스테론 수용체 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포를 감소시키는 능력에 대한 약물 후보자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 동일 종양으로부터의 적어도 2개의 종양 조직 표본이 수득될 수 있다. 한 종양 조직 표본이 약물 후보자에 노출될 수 있다. 이후, 종양 조직 표본은 항-프로게스테론 수용체 항체에 노출될 수 있고, 종양 조직 표본으로부터의 프로게스테론 수용체 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도가 결정될 수 있다. 약물 후보자에 노출된 종양 조직 표본 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포가 약물 후보자에 노출되지 않은 종양 조직 표본에 비해 감소되는 경우, 약물 후보자는 종양의 프로게스테론 수용체 양성 세포 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포를 감소시킬 수 있다.
또 다른 양태는 조직 샘플 및 프로게스테론 수용체를 검출할 수 있는 적어도 하나의 항체 또는 항체 결합 단편을 포함하는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 종양을 분류하는 시스템을 제공한다. 항체 또는 항체 결합 단편은 종양 조직 표본으로부터의 세포의 프로게스테론 수용체 양성 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 프로게스테론 양성 세포의 세포 핵 내의 집중점 분포의 정도가 약 5%보다 큰 경우 종양은 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감하다.
또 다른 양태에서, APF의 검출가능한 염색에서의 감소를 검출하는 것은 항종양 약물의 APF 비활성화 활성의 지표이다. APF의 검출가능한 염색에서 실질적 감소를 검출하지 못하는 것은 항종양 약물의 APF 비활성화의 결핍의 지표이다.
또 다른 양태에서, APF-활성 항-프로게스틴은 어느 하나의 작용제 단독에 비해 개선된 치료 효능을 달성하기 위해 APF 비활성화 메커니즘(예를 들어, 항에스트로겐)에 의해 작용하지 않는 추가 호르몬 치료제와 조합하여 사용될 수 있다. 대안적으로, APF-활성 항-프로게스틴은 어느 하나의 작용제 단독에 비해 개선된 치료 효능을 달성하기 위해 스크리닝 검정에서 APF 활성에 대해 음성인 하나 이상의 통상적인 화학요법제(예를 들어, 에버롤리무스(everolimus), 트라스투주맙(trastuzumab), TM1-D, 항-HER2 약물, 베바시주맙(bevacizumab), 또는 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 탁산(taxane), 독소루비신(doxorubicin), 리포솜 독소루비신, 페길화된 리포솜 독소루비신, 안트라사이클린(anthracycline), 안트라센디온(anthracenedione), 카르보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 5-FU, 젬시타빈(gemcitabine) 및 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)와 같은 작용제를 이용한 화학요법)와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 에버롤리무스는 아로마타제 억제제와 조합하여 지정되고, 이후에 항-프로게스틴과 조합하여 지정될 수 있는 mTor 억제제이다.
또 다른 양태에서, 핵 내의 프로게스테론 수용체에 대한 항체의 집중점 분포의 존재를 검출하는 것은 상기 약물에 내성이 되는 항종양 약물로 이전에 치료된 환자의 종양이 여전히 오나프리스톤과 같은 APF-활성 항-프로게스틴에 민감한 지에 대한 지표로 사용될 수 있다. 한 양태에서, 상기 방법은 이전의 화학요법으로부터 발생하는 종양의 화학내성이 APF-활성 항-프로게스틴을 이용한 치료에 의해 역전될 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 적합화될 수 있다. 상기 화학내성의 역전은 이전의 화학요법 및 APF-활성 항-프로게스틴의 작용의 상이한 메커니즘을 기초로 할 수 있다.
또 다른 양태는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 종양을 분류하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 조직 샘플 및 프로게스테론 수용체를 검출할 수 있는 적어도 하나의 항체 또는 항체 결합 단편을 포함하며, 상기 항체 또는 항체 결합 단편은 종양 조직 표본으로부터의 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정하는데 사용되며, 상기 종양은 집중점 분포의 정도가 약 5%를 초과하는 경우 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감하다.
실시예 1
유방암(침습성 유관암) 및 자궁내막암을 갖는 환자로부터의 종양 표본을 Oscar Lambret Cancer Center (Lille, France)의 해부병리학 부서의 기록으로부터 선택하였다. 환자에게서 연구 목적을 위해 이들의 조직의 사용에 대해 이전에 동의를 얻었다. 4% 포르말린 고정액에 고정되고, 파라핀에 포매된 유방 또는 자궁내막 종양 조직의 샘플을 수득하였다.
면역조직화학(IHC)을 기록상의 유방 또는 자궁내막 종양 조직의 3-4 μm 섹션에 대해 수행하였다. 섹션을 탈파라핀화시키고, 수화시키고, 작업 완충액(0.05 mol/L Tris/HCl, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.6, Dako, Denmark, code S3006) 중에서 세척하였다. 항원 회수를 20분 동안 98℃에서 수조에서 Dako Target Retrieval Solution(변형된 시트레이트 완충액, pH 6.1, Dako, Denmark, code S1699)로 수행하였다. 이후, 섹션을 Dako Peroxydase Block 용액으로 덮어 5분 동안 실온(RT)에서 내인성 과산화물을 블로킹하고(Dako EnVision® +/HRP Mouse (DAB+) Kit, Dako, Denmark, code K4007), 세척하고, 습윤화된 챔버에서 60분 동안 RT에서 적절한 최적 희석의 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다(표 1). 작업 완충액을 이용한 5분의 세척 후, 30분 동안 RT에서 일차 항체 결합의 검출을 위해 Dako Labelled Polymer(Dako EnVision® +/HRP Mouse (DAB+) Kit, Dako, Denmark, code K4007)를 사용하였다. 이후, 색소원(DAB)을 5-10분 동안 실온에서 Substrate-Batch와 함께 사용하였고, 섹션을 Gill 헤마톡실린으로 가볍게 대조염색시켰다.
면역조직화학 염색 절차에서 일차 항체를 아이소형 대조군 마우스 IgG1(표 1) 또는 항체 희석액 단독(세척 완충액 음성 대조군)으로 대체하여 음성 대조군을 수득하였다.
표 1. 면역조직화학에 대해 사용된 항체
Figure 112014036772712-pct00009
Imaging Model ROHS 디지털 카메라가 장비된 Zeiss Axioscope 현미경을 이용하여 면역조직화학 분석을 수행하였다. 면역반응성 신호를 종양 세포 핵의 명백한 갈색 표지로 분류하였다. 표지의 강도를 음성에 대해 0, 약함에 대해 +, 중간에 대해 ++, 및 강함에 대해 +++로 규정하였다.
실시예 2
12개의 유방암 샘플을 IHC에서 3개의 상이한 항체 및 4개의 방법으로 분석하였다. 6개의 샘플은 추가의 면역조직형광(IHF) 분석을 위해 가공될 수 있었다.
면역조직형광을 CCD 카메라 및 형광 이미지의 포착에 특이적인 Smart Capture 소프트웨어가 장비된 Zeiss 형광 현미경을 이용하여 수행하였다. IHF를 기록상의 유방 종양 조직의 3-4 μm 섹션에 대해 수행하였다. 섹션을 탈파라핀화시키고, 수화시키고, 작업 완충액(0.05 mol/L Tris/HCl, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.6, Dako, Denmark, code S3006)에서 세척하였다. 항원 회수를 20분 동안 98℃에서 수조에서 Dako Target Retrieval Solution(변형된 시트레이트 완충액, pH 6.1, Dako, Denmark, code S1699)으로 수행하였다. 이후, 섹션을 흑색 습윤화된 챔버에서 60분 동안 RT에서 적절한 최적 희석의 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다(표 2). 작업 완충액을 이용한 5분의 세척 후, Alexa Fluor 488에 컨쥬게이션된 적절한 이차 항체를 30분 동안 RT에서 일차 항체 결합의 검출을 위해 사용하였다(항-마우스 IgG (H+L), F(ab')2, Cell Signaling, USA, code 4408S, 1:1000 희석; 항-토끼 IgG (H+L), F(ab')2, Cell Signaling, USA, code 4412S, 1:1000 희석). 이후, 모든 슬라이드를 세척하고, Vectashield® HardSet Mounting Medium(Vector Labs, USA, code H-1400)를 이용하여 커버슬립을 덮고, 형광을 보존시키기 위해 분석때까지 어두운 곳에서 냉장고에 저장하였다. 면역조직형광 염색 절차에서 일차 항체의 아이소형 대조군 마우스 IgG1 또는 토끼 혈청(IHC 표 참조) 또는 항체 희석액 단독(세척 완충액 음성 대조군)의 대체에 의해 음성 대조군을 수득하였다.
모든 종양 샘플은 3개의 상이한 항체에 대해 PR 양성이었다. 그러나, 핵 패턴의 분석은 이특이적 A 및 B 항체를 갖는 11개의 PR 양성 병증 중 6개에서 결론에 이르지 못하였다(1개의 병증은 상기 항체 단독을 이용하여 PR 음성이었다). 6개의 병증을 항체 모두를 이용한 IHF 분석에 적용시켰다. 2개의 병증에서, IHF 절차는 모든 항체를 이용하여 수행될 수 없었는데, 이는 이용가능한 충분한 종양 조직이 남아있지 않아서이다. 4개의 병증은 PR B 항체로 분석될 수 있었다. 다른 항체(PRA 및 PRA + B)를 이용한 IHF 분석은 핵 패턴을 특성규명하기 위한 한 예에서 결론에 이르지 못했다. 관찰된 IHF PR 핵 분포 및 결합 패턴은 IHC와 일치하였다.
이후, 더 큰 샘플을 항-PR A 항체, 항-PR B 항체, 또는 둘 모두의 혼합물(이하, A+B로 언급됨)을 이용한 IHC로 분석하였다.
75개의 유방암 및 25개의 자궁내막암 샘플을 처리하였다. 각각의 표지된 종양 샘플에 대해, 양성 집중점 분포를 괴사 영역을 배제한 전체 종양 조직 내의 표지된 종양 세포의 백분율로 규정하였다.
발견된 2개의 기본 패턴이 도 1에 제시된다. 이들 이미지는 (IHC)를 이용하여 항-PR 항체를 이용한 조직 샘플의 염색을 도시한다. 도 1a는 갈색의 미세한 과립의 확산성 D 패턴을 도시한다. 도 1b는 양성 집중점 결합 A 패턴을 나타내는 반상의 클럼프화된 패턴을 도시한다. 도 2는 IHF를 이용하여 처리된 동일 샘플을 도시한다. 도 2a는 도 2a에서의 IHC 결과와 유사한 확산성 D 패턴을 도시한다. 도 2b는 도 2b에서와 유사한 반상의 클럼프화된 집중점 결합 패턴을 도시한다. 도 1a 및 2a의 확산성 D 패턴은 프로게스테론 또는 프로게스테론-효능제가 존재하지 않는 경우 형광 수용체를 발현하는 유전자-조작된 세포(Arnett-Manfield et Al, 2004, 1C 대조군, 1D, 및 IE) 및 정상 인간 자궁내막 조직 및 자궁내막암(Arnett-Manfield et Al, 2004, 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F)에서 수득된 결과와 유사하다.
포르말린 고정, 파라핀 포매된 종양 조직에서 관찰된 활성 A 패턴은 신선한 세포에서 수득된 이미지와 상이할 수 있다. 상기는 포르말린-고정 및 파라핀 포매된 조직이 세포 내용물을 변화시킴으로써, PR의 상이한 패턴을 발생시키기 때문인 것으로 예상된다. IHF를 사용한 연구 간행물에 비해 또 다른 차이가 상기 방법과 관련된다. 연구 환경에서, 공초점 현미경(즉, 2개의 레이저 빔을 이용함)은 고해상도 및 3D 이미지를 제공하며; 조직 샘플의 얇은 슬라이스(예를 들어, 2 마이크론)가 이용된다. IHC 패턴은 세포 내용물을 변형시키는 화학적 반응으로부터 발생한다. IHC와 대조적으로, 전통적인 광-시야(wide-field) 현미경이 표준의 더 두꺼운 종양 슬라이스(예를 들어, 4 마이크론)를 판독하는데 사용된다. 기재된 IHC 기술은 해상도의 일부 손실을 발생시킨다.
IHF 기술은 현미경적 세포 구조를 변경시키지 않는다는 점에서 종양 조직에 대해 화학적으로 덜 공격적이다. IHF는 전문화된 장비 및 기술적으로 경험이 있는 병리학자를 필요로 하며, 이는 훨씬 더 시간-소모적이다. IHF는 다른 병리학 분석, 예를 들어, 포르말린-고정되고 파라핀 포매된 조직을 필요로 하는 표준 조직학과 용이하게 커플링될 수 없다. 따라서, 한 양태에서, IHC는 통상적인 병리학적 실험 절차로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 개발된 IHC 기술에서, 4 마이크로미터의 조직 섹션(통상적인 임상 분석에 대해 흔히 사용되는 두께)을 모든 분석에 사용하였다.
도 3a 및 3b는 백그라운드 염색을 이용한 도 1a 및 1b와 동등하다. 5A, 또는 면역형광에서 관찰된 확산성 패턴은 대조염색에 의해 어두워진다. 마찬가지로, 5B는 육안의 핵 이상을 나타낸다. 그러나, 심지어 5A의 확산성 패턴은 여전히 균일한 핵을 갖는 5A와 같은 특징을 갖는 반면, 1B는 5B에서 이상형성 핵으로 해석되었다.
따라서, 2개의 기본 패턴이 발견되며; 활성화된 PR의 부재를 나타내는 확산성 PR 핵 염색, 및/또는 PR 집중점으로 언급되는 응집하는 불균일한 염색이 세포의 핵 내에서 인지될 수 있다. PR 집중점은 실질적으로 더 작은 확산성 패턴의 성분보다 더 크다(도면 참조).
실시예 3
3개의 카테고리 또는 표현형이 본원에 기재된 양태와 함께 사용하기 위해 확인되었고, 이는 더 높은 배율(800X)에서 관찰된다. 대조적으로, 통상적인 IHC PR 상태 결정을 위해서는 표준 배율(400X)이 사용된다.
카테고리(고배율에서 관찰됨)
D: 확산성 염색, PR 집중점 없음(예를 들어, 도 1a)
AD: A 및 D 세포와 관련된 영역, 또는 A 보다 작은 크기를 갖는 PR 집중점의 불균일한 분포.
A: 불균일한 방식으로 분포된 큰 집중점(예를 들어, 도 1b)
이러한 분류(D, AD, 및 A)를 100명의 추가 병증(75개의 유방암 및 25개의 자궁내막암 조직 샘플)에 대해 평가하였다. 일부 경우에, 샘플은 하나의 PR 아이소형에 대해서는 양성이었고, 나머지는 그렇지 않았다(예를 들어, PR-A에 대해서는 양성이나, PR-B에 대해서는 그렇지 않음).
유방암 샘플(61개의 병증은 표준 PR 발현에 대해 분석되고, 12개의 병증은 모든 항체에 대해 PR 음성이었고, 2개의 병증은 데이터가 손실되었다).
표 2
Figure 112014036772712-pct00010
표 3
Figure 112014036772712-pct00011
C. 집중점 분포
하기 섹션은 A, AD, D 패턴 및 N(음성, PR 염색 없음)의 빈도를 기재한다. 모든 병증은 고배율(800X)에서 분석하였다. 2개의 유방암 병증은 평가가능하지 않았다. 표 4의 데이터는 분류가 사용된 항체(PRA 또는 PRB)에 따라 다양하고, AD 패턴에 대한 항체 사이에서 더욱 변동성이 존재하는 것을 나타낸다. 이는 암 조직에서 2개의 PR 수용체(A 및 B)의 고유한 탈규제(deregulation)를 반영할 가능성이 가장 높다. 특정 양태에서, PR 아이소형의 각각에서 표적화된 항체는 분석의 결과를 해석하기 위한 추가 정보를 제공하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 병증은 항-PR A 항체를 이용한 "D" 및 제 2의 항-PR B 항체를 이용한 "AD"일 수 있다. "AD"의 이후의 분류를 기초로 하여, 항-프로게스틴을 이용한 치료가 잠재적으로 적절할 것이다. 유사하게, 병증은 PR A에 대한 항체를 이용한 "A" 및 PR B에 대한 항체를 이용한 "AD"일 수 있고, 이는 이상 PR 활성에 의해 나타나는 더 큰 정도의 악성 세포 성장으로 인해 항-프로게스틴의 상이한(더 높은) 용량을 잠재적으로 필요로 할 수 있다. PR을 결정하기 위한 통상적인 IHC 방법은 이들이 호르몬 수용체(즉, ER 및 PR)의 존재 또는 부재만을 나타내므로 상기 정보를 제공할 수 없다. 한 양태에서, 1개 이상의 별개의 항체를 이용한 분석을 기초로 한 활성화된 PR 집중점 패턴은 활성화된 PR 집중점 패턴을 분석하기 위한 추가 정보를 제공할 것이다.
Figure 112014036772712-pct00012
실시예 4
하기 표에 개설된 데이터 세트에서, 제공된 종양 샘플은 하나의 항체에 대해 APF 음성일 수 있고, 또 다른 항체에 대해 APF 양성일 수 있으며, 다른 항체에 비해 한 항체에 대해 상이한 APF 패턴을 나타낸다. 그러나, 결과는 일반적으로 PR-A와 PR-B 항체 사이에서 일치하였다. 이러한 일치는 하기에 후속되는 교차표(cross-tabulation)의 대각선에서 제시된다. 2개의 세트의 조건 사이의 일치는 표의 음영이 진 텍스트 박스 내에서 강조되어 있다. 이러한 결과는 특정 양태에서 하나 이상의 항체가 APF 핵 분포 패턴을 확인하기 위한 추가 정보를 제공함을 예시한다.
하기 표 5는 유방암 샘플에서 PR A+B 항체 혼합물에 대한 관계에서 PR A 항체를 이용한 APF 패턴을 비교한다. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합, 또는 불균일한 중간-중간 크기 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR-A 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR-A + PR-B 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 5: PR A 대 PR A+B를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00013
표 6: 유방암 샘플: 항-PR B 항체(PR B) 대 항-PR A 및 항-PR B의 혼합물(PR A+B)을 이용하여 수득된 결과의 교차표. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합, 또는 불균일한 중간-중간 크기의 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR-B 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR-A + PR-B 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 6: PR B 대 PR A+B를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00014
표 7: 유방암 샘플: 항-PR B 항체(PR B) 대 항체 항-PR A(PR A)를 이용하여 수득된 결과의 교차표. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합, 또는 불균일한 중간-중간 크기의 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR B 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR A 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 7: PR A 대 PR B를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00015
자궁내막암
PR 핵 분포의 유사한 패턴이 자궁내막암 샘플에서 관찰된다. 중요하게는, 정상 섬유모세포가 생검 샘플에서 발견되었고, PR 양성인 것으로 인지되었다. 이들 정상 섬유모세포는 D PR 핵 분포 표현형을 가졌고, 이는 이들 정상 세포에서의 PR이 활성화되지 않았고, 환자가 폐경후임에 따라 생리학적 수준의 프로게스테론을 생성하지 않을 가능성이 가장 큰 것을 나타낸다. 따라서, 섬유모세포는 내인성 프로게스테론에 노출되지 않는다. 대조적으로, 암 조직은 섬유모세포 패턴에 의해 나타나는 바와 같은 생리학적 프로게스테론의 부재하에서도 PR의 활성화된 형태(APF)를 제시하였다.
표 8: 자궁내막암 샘플: 항-PR A 항체(PR A) 대 항-PR A 및 항체 항-PR B의 혼합물(PR A+B)을 이용하여 수득된 결과의 교차표. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합, 또는 불균일한 중간-중간 크기의 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR-A 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR A 및 PR B 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 8: PR A 대 PR A+B를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00016
표 9: 자궁내막암 샘플: 항-PR B 항체(PR B) 대 항-PR A 및 항체 항-PR B의 혼합물(PR A+B)을 이용하여 수득된 결과의 교차표. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합, 또는 불균일한 중간-중간 크기의 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR B 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR A 및 PR B 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 9: PR B 대 PR A+B를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00017
표 10: 자궁내막암 샘플: 항-PR B 항체(PR B) 대 항체 항-PR A(PR A)를 이용하여 수득된 결과의 교차표. A: 큰 집중점을 갖는 응집된 패턴, AD: A 세포 및 D 세포의 혼합물, 또는 불균일한 중간-중간 크기의 집중점. D: 확산성 패턴 또는 활성화된 PR의 부재. 열은 PR B 항체만을 이용하여 표시된 결합 패턴에 따라 병증을 분류하는 한편, 행은 PR A 항체를 이용하여 병증을 분류한다. 대각선의 강조된 행은 일치하는 병증, 즉, 둘 모두의 방법을 이용하여 동일한 결합 패턴을 갖는 병증의 수를 나타낸다. 다른 세포는 일치하지 않는 결과, 즉, 각각의 방법에 대해 상이한 결합 패턴을 갖는 병증을 나타낸다.
표 10: PR B 대 PR A를 이용한 APF 패턴의 비교
Figure 112014036772712-pct00018
한 양태에서, PR-A 및 PR-B에 특이적인 항체 또는 PR-A 및 PR-B에 특이적인 이특이적 항체의 사용은 AD 패턴 PR 핵 분포 패턴을 확인하기 위해 함께 사용될 수 있고, 여기서 단일 항체(예를 들어, PR-A 또는 PR-B)의 사용은 특정 병증에서 AD 패턴을 확인할 수 없다.
또 다른 양태에서, 본원에 개시된 방법은, 예를 들어, IHC를 이용하여 밝혀지고, 신선한 조직 및 IHF를 이용하여 확인된 암 생검에서의 PR 핵 패턴을 기재한다. 확산성 패턴은 실험 및 생리학적 조건 하에서 프로게스틴에 노출되지 않은 정상 세포/조직에서 발견된다. 확산성 핵 분포 패턴은 종양 세포의 PR이 활성화되지 않고, 따라서 항프로게스틴을 이용한 종양의 치료가 효과적일 가능성이 없는 것을 나타낸다. 대조적으로, AD 또는 A 패턴의 존재는 실험 모델 또는 정상 세포가 프로게스틴에 노출되는 경우에 관찰되는 것과 유사하다. 이들 패턴은 PR이 활성화되고, 일부 세포에서 전사적으로 활성화되며, 항프로게스틴을 이용한 치료가 상기 병증에서 효과적일 수 있음을 알려준다.
이들 패턴(예를 들어, A 및 AD)의 발현은 종양 및 다양한 샘플에 걸쳐 불균일하며, 이는 암의 특징이다. 대조적으로, D 표현형은 균일하며, 이는 PR의 생물학적 기능의 결핍과 일치하는 패턴이다. PR의 발현 및 본 발명자가 기재한 표현형은 발현된 PR 아이소형(A 또는 B) 및 사용된 항체(예를 들어, 이특이적 AB, A 단독, B 단독 및 A + B의 혼합물)에 따라 다양하다. PR 핵 분포 패턴의 상기 변동성은 본질적으로 불균일한 자연 발생 인간 암에서 예기치 않은 것이 아니다.
실시예 5
도 4의 플롯은 3개의 결합 패턴 A, AD, 및 D에 대한 PR-A 및 PR-B에 대해 양성인 유방암 샘플의 퍼센트를 도시한다. 상기 결과는 통상적인 방법에 의해 결정된 양성 프로게스테론 수용체 상태가 본원에 기재된 바와 같은 PRF 분포의 존재와 서로 관련되지 않는다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 6
표 11
표 11은 "A" 및 "D" 둘 모두의 결합 패턴 세포를 나타내는 조직 샘플에 대한 "A" 결합 패턴 세포의 백분율을 제시한다. "APR"로 표지된 열은 조직 샘플에 대해 관찰된 전체 패턴을 나타내는 반면, "A%" 열은 "A" 결합 패턴을 나타내는 샘플에서 세포의 백분율을 나타낸다. 각각의 행은 항-PR-A 및 항-PR-B 항체 둘 모두 또는 각각의 항체 단독을 이용한 하나의 병증에 대한 결과를 제시한다.
표 11: 다양한 항체를 이용한 APF 패턴을 나타내는 세포의 백분율
Figure 112014036772712-pct00019
본원의 본 발명은 특정 구체예를 참조로 하여 기재되었으나, 이들 구체예는 단지 본 발명의 원리 및 적용의 예시임이 이해되어야 한다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이 본원에 기재된 방법 및 시스템에 대해 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항 및 이들의 등가물의 범위 내인 변형 및 변화를 포함하는 것으로 의도된다.

Claims (20)

  1. 하기를 포함하는, 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 스크리닝하는 방법:
    a) 종양형성성(tumorigenic) 또는 암성(cancerous)인 것으로 의심되는 조직 샘플 내에서 프로게스테론 수용체 양성 세포를 확인하는 단계;
    b) 조직 샘플로부터의 프로게스테론 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정하는 단계; 및
    c) 조직 샘플 내의 집중점 분포의 정도가 프로게스테론 수용체 양성 세포의 5%를 초과하는 경우 종양이 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 것으로 결정하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 항-프로게스테론 수용체 항체에 조직을 노출시킴으로써 조직으로부터의 세포의 핵 내의 집중점 분포의 정도를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 종양이 유방, 뇌, 수막종, 전립선, 난소, 자궁내막, 자궁 근종, 폐, 및 자궁 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 항-프로게스틴이 오나프리스톤(onapristone), 로나프리산(lonaprisan), 미페프리스톤(mifepristone), PF-02413873, 텔라프리스톤(telapristone), 릴로프리스톤(lilopristone), ORG2058, 아포프리스닐(apoprisnil), 및 울리프리스탈(ulipristal)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 집중점 분포의 정도가 조직의 프로게스테론 양성 세포 내의 프로게스테론 수용체의 결합 패턴을 확인함으로써 결정되는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 결합 패턴이 확산성(D), 활성(A), 및 활성/확산성(AD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제 2항에 있어서, 적어도 2개의 항체가 집중점 분포의 정도를 결정하기 위해 사용되는 방법.
  8. 제 2항에 있어서, 항체가 항-PR-A 항체, 항-PR-B 항체, 및 항-PR-A 및 항-PR-B 항체의 혼합물, 및 PR-A 및 PR-B에 특이적인 이-특이적 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  9. 제 2항에 있어서, 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도가 면역조직화학, 면역형광, 및 웨스턴 블롯으로 구성된 군으로부터 선택된 검출 방법에 의해 결정되는 방법.
  10. 삭제
  11. 하기를 포함하는, 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 스크리닝하는 방법:
    a) 항-프로게스테론 수용체 항체에 종양형성성인 것으로 의심되는 조직 샘플을 노출시키는 단계;
    b) 조직 샘플에서 프로게스테론 수용체 양성 세포를 확인하는 단계; 및
    c) 조직으로부터의 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 결합 분포를 결정하고, 집중점 결합 분포가 A 또는 AD 결합 패턴을 갖는 조직 샘플 내에서 프로게스테론 수용체 양성 세포의 5% 초과인 경우 종양이 항-프로게스틴에 의한 성장 억제에 민감한 것으로 결정하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 종양이 유방, 뇌, 수막종, 전립선, 난소, 자궁내막, 자궁근종, 폐, 및 자궁 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 항-프로게스틴이 오나프리스톤, 로나프리산, 미페프리스톤, PF-02413873, 텔라프리스톤, 릴로프리스톤, ORG2058, 아포프리스닐, 및 울리프리스탈로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  14. 제 11항에 있어서, 집중점 분포의 정도가 조직의 세포 내의 프로게스테론 수용체의 결합 패턴을 확인함으로써 결정되는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 결합 패턴이 확산성(D), 활성(A), 및 활성/확산성(AD)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  16. 제 11항에 있어서, 항체가 항-PR-A 항체, 항-PR-B 항체, PR-A 및 PR-B에 특이적인 이-특이적 항체, 및 항-PR-A 및 항-PR-B 항체의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 종양 조직 생검에서 프로게스테론 수용체 양성 세포의 세포 핵 내의 프로게스테론 수용체의 5%를 초과하는 집중점 분포를 나타내는 조직 샘플을 확인하는 단계를 포함하는, 오나프리스톤에 의한 성장 억제에 민감한 종양을 스크리닝하는 방법.
  18. 삭제
  19. 하기를 포함하는, 종양 내의 프로게스테론 수용체 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포를 감소시키는 능력에 대해 약물 후보자를 스크리닝하는 방법:
    하나의 종양 조직 표본을 약물 후보자에 노출시키는 단계, 종양 조직 표본을 항-프로게스테론 수용체 항체에 노출시키는 단계, 종양 조직 표본으로부터의 프로게스테론 수용체 양성 세포의 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정하는 단계, 및 약물 후보자에 노출된 종양 조직 표본 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포가 약물 후보자에 노출되지 않은 종양 조직 표본에 비해 감소되는지의 여부를 결정하는 단계, 여기서, 약물 후보자가 약물 후보자에 노출된 조직 표본의 프로게스테론 수용체 양성 세포 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포를 감소시키는 경우, 상기 약물 후보자가 종양의 프로게스테론 수용체 양성 세포 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포를 감소시킬 수 있음.
  20. 프로게스테론 수용체를 검출할 수 있는 적어도 하나의 항체 또는 항체 결합 단편 및 조직 샘플을 포함하는 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 종양을 분류하기 위한 키트로서, 상기 항체 또는 항체 결합 단편이 종양 조직 표본으로부터의 세포의 프로게스테론 수용체 양성 핵 내의 프로게스테론 수용체의 집중점 분포의 정도를 결정하기 위해 사용되고, 프로게스테론 양성 세포의 세포 핵 내의 집중점 분포의 정도가 5%를 초과하는 경우 상기 종양이 항-프로게스틴을 이용한 치료에 민감한 것인, 키트.
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