PT1326617E

PT1326617E - Utilização de 11beta-(4-acetilfenil)-17beta-hidroxi-17alfa-(1,1,2,2-pentafluoroetil)estra-4,9-dien-3-ona para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro da mama, do ovário, do endométrico, mieloma e meningioma

Info

Publication number: PT1326617E
Application number: PT01987669T
Authority: PT
Inventors: Rosemarie Lichtner; Martin Schneider; Jens Hoffmann; Gerd Siemeister; Ulrike Fuhrmann
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2006-12-29
Also published as: UA76729C2; CZ299823B6; CN1469749A; IL154976A; WO2002032432A1; JP2004511523A; KR100668024B1; EP1326617B1; EA010593B1; SK4702003A3; HK1062273A1; BG107744A; CA2423020A1; NO20031741L; CA2423020C; AU2361902A; DE60121980D1; IL154976A0; NO20031741D0; MXPA03002955A

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO DE 11BETA-(4-ACETILFENIL)-17BETA-HIDROXI-17ALFA-(1,1,2,2-PENTAFLUOROETIL)ESTRA-4,9-DIEN-3-ONA PARA A PREPARAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATAMENTO DE CANCRO DA MAMA, DO OVÁRIO, DO ENDOMÉTRIO, MIELOMA E MENINGIOMA

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à utilização da antiprogestina 11β - (4-acetilfenil)-17β-]ηίά^χί-17οί-(1,1,2,2,2-pentafluoroetil)-estra-4,9-dien-3-ona ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cancro, seleccionado do grupo de cancro da mama, cancro do ovário, cancro do endométrio, mieloma e meningioma, no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular.

Antecedentes da Invenção

As antiprogestinas representam uma classe relativamente nova e promissora de agentes terapêuticos que poderiam ter impacto significativo no tratamento de tumores hormonodependentes e outras doenças. Embora as antiprogestinas fossem originalmente criadas para a interrupção medicinal não cirúrgica da gravidez, determinadas antiprogestinas ganharam importância considerável, e. g., na terapia endócrina dos cancros da mama que possuem receptores para progesterona (T. 1

Maudelonde et al., em: J.G.M. Klijn et al., Hormonal

Manipulation of Câncer: Peptides, Growth Factors and New (Anti) Steroidal Agents, Raven Press, New York, 1987, pp. 55-59).

Esta nova estratégia na terapia endócrina baseia-se na actividade antitumoral in vitro de antiprogestinas em linhas celulares de cancro da mama humano positivas para o receptor da progesterona e em vários tumores mamários hormonodependentes in vivo do murganho e do rato. Em particular, o mecanismo antitumoral das antiprogestinas onapristona e mifepristona (RU 486) já tem sido investigado utilizando o modelo de tumor mamário hormonodependente MXT do murganho bem como os modelos tumorais mamários induzidos por NMU e DMBA do rato (M. R. Schneider et al., Eur. J. Câncer Clin. Oncol., Vol. 25, No. 4, pp. 691-701,1989; H. Michna et ai., Breast Câncer Research and Treatment 14: 275-288,1989; H. Michna, J. Steroid. Biochem. Vol. 34, N.° 1-6, pp. 447-453,1989). No entanto, em virtude da baixa actividade e efeitos secundários adversos envolvidos com e. g., mifepristona, este composto não poderia ser recomendado como agente único na gestão do cancro da mama (D. Perrault et al., J. Clin. Oncol. 1996 Out, 14 (10), pp. 2709-2712). Além disso, a mifepristona exibe fortes efeitos secundários antiglucocorticóides (cf. L.M. Kettel et al., Fértil. Steril. 1991 Set, 56 (3), pp. 402-407; X. Bertagna,

Psychoneuroendocrinology 1997; 22 Supl. 1, pp. 51-55). A determinação da percentagem de células tumorais nas respectivas fases do ciclo celular pode ser realizada pelo poderoso método de citometria de fluxo de ADN (cf. G. M. Clark et al., N. Engl. J. Med. 320, 1989, Março, pp. 627-633; L. G. Dresser et al., Câncer 61(3), 1988, pp. 420-427 e literatura aí citada). Foi deste modo demonstrado que as etapas do ciclo 2 celular de um tumor celular, e especificamente, o número de células tumorais em determinadas etapas do ciclo, podem ser um importante prognosticador clinico de progressão da doença e sucesso de terapia. 0 número de células na fase S do ciclo celular é particularmente importante a este respeito. 0 documento EP 0495825 BI divulga a utilização de antiprogestinas (antagonistas competitivos de progesterona) para a produção de medicamentos para o tratamento de carcinomas mamários possuindo um conteúdo aumentado de células tumorais na fase S do ciclo celular, o qual é considerado um factor de risco elevado. Isso baseia-se na observação que antiprogestinas são capazes de bloquear a progressão de células tumorais na fase GoGi do ciclo celular resultando numa diminuição substancial de células tumorais na fase S. Este efeito não foi contudo observado com a terapia padrão do cancro da mama tamoxifeno, terapia estrogénio ou ovariectomia. As antiprogestinas testadas no documento EP 0495825 BI são 11β-[4-N,N-dimetilamino)-fenil]-17a-hidroxi-17p-(3-hidroxipropil)-13a-metil-4,9(10)-gonadien-3-ona e 11β- (4-acetilfenil) -17β-ϊιίύηοχί-17α- (prop-l-inil) -4, 9 (10) -estradien-3-ona.

Os 17cx-f luoroalquilesteróides possuindo forte actividade antiprogestina bem como métodos para os produzir estão descritos no documento WO 98/34947. O documento WO 98/34947 não discute ou investiga o papel que os 17a-fluoroalquilesteróides aqui divulgados possam desempenhar na apoptose celular ou interrupção do ciclo celular.

Dado o valor potencial de agentes que induzem apoptose em células, e. g., no caso de células tumorais, bloqueando a progressão na fase GoGi, é desejável identificar agentes 3 adicionais, e. g., antiprogestinas, possuindo este mecanismo especifico de acção. Tais agentes possuiriam aplicação potencial no tratamento e prevenção de determinados tipos de cancro, tais como cancro da mama, no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular.

Objectivo da Invenção É deste modo um objectivo da presente invenção investigar adicionalmente o modo de acção de antiprogestinas na inibição de doenças hormonodependentes, tal como o cancro da mama e proporcionar um método para a indução direccionada de apoptose em células.

Surpreendentemente, os requerentes descobriram que a antiprogestina 11β - (4-acetilfenil) -17p-hidroxi-17a- (1, 1,2,2,2-pentafluoroetil)-estra-4,9-dien-3-ona (ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável) pode ser utilizada para a indução de apoptose numa célula.

Sumário da Invenção A presente invenção baseia-se na observação inesperada que a antiprogestina 11β- (4-acetilfenil) -17β-1ιίάηοχί-17οί- (1, 1,2,2,2-pentafluoroetil)-estra-4,9-dien-3-ona (referida em seguida como "antiprogestina (I)") induz apoptose e morte celular nas células tumorais, em modelos tumorais padrão de cancro da mama. Descobriu-se que a antiprogestina (I) é capaz de induzir apoptose em células via iniciação de diferenciação terminal. 4

Deste modo, a presente invenção proporciona a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro da mama, cancro do ovário, cancro do endométrio, mieloma e meningioma. De um modo preferido, a indução de apoptose é causada pela iniciação de terminação diferencial. A célula é, de um modo preferido, uma célula de mamifero, de um modo mais preferido, uma célula humana e, de um modo muito preferido, uma célula tumoral, na qual o tumor é, de um modo preferido, cancro da mama.

Um outro aspecto da presente invenção é a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento para o tratamento de tipos de cancro no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular.

Um aspecto adicional da presente invenção é a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a indução de apoptose numa célula in vitro. De um modo preferido, a célula é uma célula de mamifero, de um modo mais preferido, uma célula humana e, de um modo muito preferido, uma célula tumoral, na qual o tumor é, de um modo preferido, cancro da mama.

Um outro aspecto da presente invenção é um método de indução de apoptose numa célula por administração de uma quantidade eficaz de antiprogestina (I) à célula. Este método pode ser aplicado in vitro ou in vivo. De um modo preferido, a célula é uma célula de mamifero, de um modo mais preferido, uma 5 célula humana e, de um modo muito preferido, uma célula tumoral, na qual o tumor é, de um modo preferido, cancro da mama.

Em virtude da capacidade para induzir apoptose celular, a antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável pode ser utilizada para o tratamento de determinados tipos de cancro, tal como o cancro da mama, no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular. Outros tipos de cancro ou doenças hormonodependentes que podem ser afectados e tratados por antiprogestina (I), em virtude da sua capacidade para induzir apoptose celular, podem incluir e. g., cancro da mama, cancro do ovário, cancro do endométrio, mieloma e meningioma, i.e., doenças que têm origem ou são influenciadas pela presença de receptores hormonais e/ou vias hormonodependentes.

Breve Descrição das Figuras A figura 1 mostra o efeito de inibição de crescimento do tumor como resultado da indução de apoptose por antiprogestina (I) num estudo dose-resposta no carcinoma mamário do rato induzido por DMBA, comparado com um controlo, a antiprogestina onapristona bem como ovariectomia. O estudo foi realizado com doses diárias de antiprogestina (I) de 0,5, 2,0, 5,0 e 10,0 mg/Kg s.c. A figura 2 mostra o efeito de inibição de crescimento do tumor como resultado da indução de apoptose por antiprogestina (I) no carcinoma mamário do rato induzido por NMU, comparado com 6 um controlo e ovariectomia. 0 estudo foi realizado com doses diárias de antiprogestina (I) de 0,5, e 1,0 mg/Kg s.c. A figura 3 mostra a indução e apoptose e, deste modo, o efeito de inibição de crescimento do tumor da antiprogestina (I) numa dose de 10 mg/Kg s.c., em tumores T47D humanos xenotransplantados em murganhos scid, comparado com um controlo e ovariectomia. A figura 4 demonstra a indução de apoptose e, portanto, o efeito de inibição de crescimento do tumor de uma dose de 10 mg/Kg s.c. de antiprogestina (I) no modelo de cancro da mama humano MCF-7 em murganhos scid, comparado com um controlo e ovariectomia.

As figuras 5A a 5F mostram dados histológicos relacionados com a indução de apoptose no modelo de cancro da mama em rato induzido por NMU (cf. Exemplo 5) . Em particular, a figura 5A mostra que tumores tratados com antiprogestina (I) exibem formações ductais e acinosas, preenchidas geralmente com material secretório, comparado com o controlo (figura 5B) . A figura 5C mostra tecido de cancro da mama induzido por NMU não tratado com elevada imunorreactividade PCNA (antigénio nuclear de proliferação celular), comparado com tecido de cancro da mama induzido por NMU tratado com antiprogestina (I) (figura 5D) , o qual exibe baixa imunorreactividade PCNA. A figura 5E mostra o aspecto de apoptose em tecido de cancro da mama induzido por NMU tratado com antiprogestina (I), comparado com o controlo (figura 5E) . A figura 6 demonstra o efeito de inibição de crescimento do tumor de antiprogestina (I) na linha celular de cancro da mama 7 T47D (estimulada por estradiol) com uma concentração mínima eficaz de IO”9 a 10”8 mol/L, comparada com a antiprogestina onapristona e com o antiestrogénio puro Ιΐβ-fluoro-7a-{5-[N-metil-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluoropentiltio)-propilamino]-pentil}-estra-1,3, 5(10)-trien-3,17p-diol (documento WO 98/07740).

Descrição Detalhada da Invenção A antiprogestina (I) — 11β-(4-acetilfenil)-17p-hidroxi-17a-(1,1,2,2,2-pentafluoroetil)-estra-4,9-dien-3-ona — é representada abaixo pela fórmula (I):

Quiral (I) A antiprogestina (I) (ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável) é um valioso agente farmacológico possuindo forte actividade antiprogestina. A antiprogestina (I) pode ser utilizada de acordo com a presente invenção para a indução de apoptose em células.

No entanto, deverá igualmente abranger compostos capazes de inibir a biossíntese de progestinas.

Derivados ou análogos farmaceuticamente aceitáveis de antiprogestina (I), no contexto da presente invenção, podem incluir, por exemplo, qualquer um dos compostos inventivos divulgados no documento WO 98/34947.

Os estudos realizados no contexto da presente invenção mostram potentes propriedades de inibição tumoral da antiprogestina (I) numa variedade de modelos tumorais hormonodependentes (ver Exemplos 1 a 6). Demonstra-se adicionalmente que a actividade de inibição tumoral de antiprogestina (I) como resultado da indução de apoptose é mais forte do que os agentes antitumorais convencionais, tal como o antiestrogénio tamoxifeno. O tratamento de cancro da mama utilizando a antiprogestina (I) de acordo com a presente invenção é, até, superior à ovariectomia. A aplicação de antiprogestina (I) nos vários modelos de tumores, como demonstrado abaixo nos Exemplos, revelou uma acumulação de células tumorais na fase GoGi do ciclo celular em conjunto com uma redução significativa e biologicamente relevante no número de células nas fases S e G2M do ciclo celular. Estes resultados indicam uma indução de diferenciação. A interrupção Gi especifica de diferenciação já tem sido proposta anteriormente para outros sistemas de células estaminais (ver J. J. Wille Jr., Câncer Res. 1982, 42 (12) :5139-46; R.E. Scott, J. Ce 11. Biol. 1982, 94(2):400-405).

Os resultados experimentais obtidos nos vários modelos tumorais revelaram que tratamento com antiprogestina (I) parece desencadear diferenciação das células tumorais poligonais mitoticamente activas em estruturas glandulares e ácinos com uma sequestração maciça de produtos secretórios, bem como em 9 subpopulações necrobióticas fusiformes (ver Exemplo 5 e, em particular, figuras 5A e 5B) . Embora o tamanho tumoral, o índice mitótico e o grau de malignidade tenham diminuído distintamente, a fracção de volume de estruturas glandulares nos tumores bem como o aparecimento de apoptose aumentaram 3 vezes comparadas com os controlos (ver Exemplo 5, figuras 5E e 5F).

Sem limitação por qualquer teoria, estes resultados indicam que o mecanismo principal da acção antitumoral da antiprogestina (I) nos modelos testados é um efeito directo antiproliferativo mediado por receptor de progesterona ao nível das células tumorais, por meio da indução de diferenciação terminal associada a morte celular terminal. Deste modo, a antiprogestina (I) afigura-se capaz de eliminar o bloco intrínseco em diferenciação terminal inerente em células tumorais malignas, em tumores positivos ao receptor de progesterona. Este efeito antiproliferativo da antiprogestina (I) parece estar dissociado da actividade anti-hormonal (antiprogestativo) da antiprogestina (I) ·

Agentes tais como antiprogestina (I) que induzem apoptose em células, por exemplo, no caso de células tumorais, bloqueando a progressão na fase GoGi, possuem aplicações potenciais para tratamento e prevenção de numerosos estados. Tais agentes, incluindo a antiprogestina (I), podem ser utilizados para tratar aqueles cancros onde um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular, tal como no cancro da mama.

Deste modo, um aspecto da presente invenção é a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável, para preparação de um medicamento 10 para a indução de apoptose numa célula. Numa forma de realização preferida, a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável refere-se a um medicamento para a indução de apoptose numa célula tumoral, de um modo preferido uma célula tumoral mamária, num humano. Tal medicamento poderia ser benéfico no tratamento de doenças hormonodependentes, tal como cancro da mama, no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular. A preparação dos medicamentos pode ser realizada de acordo com métodos conhecidos na técnica. Adjuvantes geralmente conhecidos e utilizados bem como veículos ou diluentes adicionais adequados podem ser utilizados. Veículos e adjuvantes adequados podem ser tal como recomendado para farmácia, cosmética e campos relacionados em: Ullmann 's Encyclopedia of Technical Chemistry, Vol. 4, (1953), pp. 1-39 ; Journal of Pharmaceutícal Sciences, Vol. 52 (1963), p. 918ff ; H.v. Czetsch-Lindenwald, "Hilfsstoffe fur Pharmazie und angrenzende Gebiete"; Pharm. Ind. 2, 1961, p. 72ff; Dr. H.P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe fur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor KG, Aulendorf in Wurttemberg, 1971.

As antiprogestinas adequadas para os fins da presente invenção, de um modo preferido antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável, podem ser incorporadas em composições farmacêuticas de acordo com métodos conhecidos de preparação galénica para aplicação oral, parentérica, e. g., intraperitoneal, intramuscular, subcutânea ou percutânea. Podem também ser implantadas em tecido. Os implantes podem compreender materiais inertes e. g., polímeros 11 degradáveis biologicamente ou silicones sintéticos, tal como e. g., borracha de silicone.

Podem ser administrados na forma de comprimidos, pilulas, drageias, cápsulas moles, grânulos, supositórios, implantes, soluções aquosas ou oleosas estéreis injectáveis, suspensões ou emulsões, unguentos, cremes, geles ou por sistemas intravaginais (e. g., anéis vaginais) ou intra-uterinos (e. g. diafragmas, dispositivos intra-uterinos).

Para a preparação de um medicamento para administração oral, as antiprogestinas adequadas aos fins da presente invenção como acima definido, podem ser intermisturadas com adjuvantes e veiculos geralmente conhecidos, tais como, por exemplo, goma-arábica, talco, amido, açúcares tais como, e. g., manitose, metilcelulose, lactose, gelatina, agentes surfactantes activos, estearato de magnésio, excipientes aquosos ou não aquosos, derivados de parafina, agentes reticulados, dispersantes, emulsionantes, lubrificantes, agentes conservantes e agentes aromatizantes (e. g., óleos voláteis). Numa composição farmacêutica, a antiprogestina pode ser dispersa numa composição de microparticula, e. g., um nanoparticulado. A fim de melhorar ainda a biodisponibilidade do agente activo, as antiprogestinas adequadas aos fins da presente invenção como acima definido podem também ser formuladas como clatratos de ciclodextrina reagindo-as com α-, β- ou γ-ciclodextrinas ou seus derivados de acordo com o método como divulgado no documento PCT/EP95/02656.

Para administração parentérica as antiprogestinas adequadas aos fins da presente invenção como acima definido podem ser 12 dissolvidas ou suspendidas num diluente farmaceuticamente aceitável, tal como, e. g., óleos com ou sem solubilizantes, agentes surfactantes, dispersantes ou emulsionantes. Como óleos por exemplo e sem limitação, azeite, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de soja, óleo de ricino e óleo de sésamo podem ser utilizados. A quantidade a administrar (i.e., uma "quantidade farmaceuticamente eficaz") varia dentro de uma ampla gama e depende do estado a tratar e do modo de administração. Pode cobrir qualquer quantidade eficiente para o tratamento pretendido. Determinar uma "quantidade farmaceuticamente eficaz" está dentro da competência do especialista na técnica.

Uma unidade de dosagem pode representar cerca de 0,1 a 100 mg de agente(s) activo(s). Para administração a humanos, a dose diária do(s) agente(s) activo(s) é cerca de 0,1 a 400 mg, de um modo preferido 10 a 100 mg, de um modo muito preferido 50 mg.

Os medicamentos podem também administrar-se via uma injecção depot ou uma preparação de implante, opcionalmente para veiculação prolongada do(s) agente (s) activo(s). O modo de administração preferido é administração oral. As antiprogestinas para utilização de acordo com a invenção, e em especial, antiprogestina (I) são particularmente adequadas para administração oral.

De acordo com todos os aspectos da presente invenção é também possivel combinar, pelo menos, uma antiprogestina como acima definido, em particular antiprogestina (I) ou um seu 13 derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável, com, pelo menos, um antiestrogénio, porgue muitas doenças hormonodependentes, em especial cancro do pulmão, exibem não apenas receptores de progesterona, mas também receptores de estrogénio. 0 antiestrogénio pode administrar-se ou simultaneamente com ou sequencialmente à antiprogestina, e em especial com/à antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável. A quantidade de antiprogestina e antiestrogénio pode ser igual ou um componente pode ser mais predominante do que o outro, tal como numa antiprogestina:razão antiestrogénio de 1:50 a 50:1, de um modo preferido 1:30 a 30:1, e de um modo muito preferido 1:15 a 15:1.

Exemplos de antiestrogénios adequados para utilização de acordo com a invenção são antiestrogénios não esteróides, tais como tamoxifeno e nafoxidina bem como raloxifeno, faslodex e EM800. Exemplos de antiestrogénios esteróides incluem aqueles divulgados no documento EP 0348341 A e aqueles divulgados no documento WO 98/07740, em particular, Ιΐβ-flouro-7a-{5-[N-metil-N-3-(4,4,5,5,5-pentaflouropentiltio-propilamino]-pentil}-estra-1,3,5 (10)-trien-3,17β-άϊο1, ou aqueles divulgados no documento WO 99/33855, em particular Ιΐβ-fluoro-7a-{5-[metil- (7,7,8,8,9,9,10,10,10-nonafluoro-decil)-amino]-pentil}-estra-1,3, 5(10)-trien-3,17β-άϊο1 ou derivados ou análogos farmaceuticamente aceitáveis. Inibidores de aromatase possuindo um efeito antiestrogénico, tais como aqueles divulgados nas páginas 7 a 8 do documento EP 0495825 BI podem também ser utilizados como antiestrogénios.

Um outro aspecto da presente invenção é a utilização de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento 14 para o tratamento de um tipo de cancro no qual um indicador de risco elevado é uma quantidade aumentada de células tumorais na fase S do ciclo celular. 0 número de células tumorais na fase S pode determinar-se por citometria de fluxo de ADN como descrito em Dressler et al., "DNA Flow Cytometry and Prognostic Factors in 1331 Frozen Breast Câncer Specimens," Câncer, Vol. 61 (3), 1988, pp. 420-427; ver também McGuire & Dressler, "Emerging

Impact of Flow Cytometry in Predicting Recurrence and Survival in Breast Câncer Patients," JNCI, Vol. 75 (3), 1985, pp. 405- 409. Uma quantidade de elevado risco de células tumorais na fase S indica um candidato particularmente adequado para a utilização de acordo com a invenção. No caso da antiprogestina (I), a vantagem provém não só do potente efeito antitumoral, como evidenciado pelos modelos animais padrão (ver Exemplos 1 a 4), mas também do mecanismo de acção deste agente de indução de apoptose (ver em particular Exemplo 5) e interrupção do ciclo celular.

Num aspecto alternativo, a presente invenção proporciona um método para indução de apoptose numa célula. A célula é de um modo preferido uma célula de mamifero e de um modo muito preferido uma célula humana, e o método pode aplicar-se in vitro ou in vivo. De um modo preferido, apoptose é induzida por meio do mecanismo de iniciação da diferenciação terminal, por exemplo, pela administração de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável. No método, uma quantidade eficaz de antiprogestina (I) ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável pode aplicar-se às células em questão. Por exemplo na linha celular T47D de cancro da mama, cujo crescimento é estimulado pela administração de estradiol, antiprogestina (I) induziu uma inibição completa de crescimento celular com uma concentração minima eficaz de entre 10~9 e 15 10“8 mol (ver Exemplo 6 e figura 6) . Isto é especialmente surpreendente já que a conhecida antiprogestina onapristona não possui efeito de redução no crescimento celular neste modelo de tumor. Deste modo, a antiprogestina (I) é superior com respeito a potência e eficácia a outras antiprogestinas, tais como onapristona e antiestrogénios, tal como tamoxifeno, e até a antiestrogénios puros, tais como Ιΐβ-fluoro-7a-{5-[N-metil-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluoropentiltio)-propilamino]-pentil}-estra-1,3,5(10)-trien-3,17p-diol (documento WO 98/07740). O papel de antiprogestina (I) na indução de apoptose na célula indica que esta antiprogestina (ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável) pode ser útil em inúmeros estados, particularmente estados hormonodependentes, onde indução de apoptose é particularmente desejada. Especificamente, pode utilizar-se no tratamento de tais doenças como cancro da mama, cancro do ovário, cancro do endométrio, mieloma, infertilidade anovulatória, meningioma, í.e., doenças que, substancialmente, têm origem ou são influenciadas pela presença de receptores hormonais e/ou vias hormonodependentes. As antiprogestinas, tais como antiprogestina (I), podem deste modo utilizar-se adicionalmente para a preparação de medicamentos para indução de apoptose ou morte celular para o tratamento de doenças hormonodependentes como já acima descrito. A invenção é adicionalmente ilustrada nos exemplos. Os exemplos seguintes não são para se interpretar como uma limitação. 16

Exemplos

Exemplo 1:

Estudo dose-resposta no modelo do tumor induzido por DMBA

Materiais e Métodos:

Utilizaram-se neste estudo ratos fêmea imaturos Sprague-Dawley (49-51 dias de vida; 10 animais/grupo). Induziram-se tumores mamários por uma única administração oral de 10 mg de 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA, Serva/Heidelberg). Ratos com, pelo menos, um tumor estabelecido com um tamanho de mais de 150 mm2 foram tratados durante 4 semanas por: 1) controlo solvente, 2) ovariectomia em inicio de tratamento, 3) antiprogestina (I) , 0,5 mg/Kg s.c., 4) antiprogestina (I) , 2 mg/Kg s.c., 5) antiprogestina (I), 5 mg/Kg s.c., 6) antiprogestina (I), 10 mg/Kg s.c., e 7) onapristona, 5 mg/Kg, s.c., diariamente. Utilizou-se como um parâmetro para inibição de crescimento a alteração de área de tumor (em % com respeito ao tamanho inicial do tumor) determinada por medições semanais com compasso de espessura. Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis para análise estatística de diferenças de valores médios entre grupos. Para uma descrição adicional e avaliação do modelo de prevenção DMBA, ver R.G. Metha, European Journal of Câncer 36 (2000), pp. 1275-1282. 17

Resultados :

Em animais controlo intactos, observou-se crescimento progressivo de tumor, ao passo que ovariectomia causou uma regressão considerável do tumor em 90% dos animais. O tratamento com antiprogestina (I) em doses de ou acima de 2 mg/Kg resultaram em indução significativa de apoptose resultando em inibição de crescimento de tumor comparado com o controlo (ver fig. 2). Existiu uma clara relação dose-resposta. Ao passo que o tratamento com antiprogestina (I) a 0,5 mg/Kg não impediu o tumor de crescer significativamente, a 2 mg/Kg observou-se indução máxima de apoptose e deste modo inibição de crescimento. Neste grupo viu-se uma regressão completa de tumor em 50% dos ratos. O efeito da dose mais elevada de antiprogestina (I) testada nesta experiência (10 mg/Kg), foi comparável àquela de 2 mg/Kg. A onapristona (5 mg/Kg, s.c.) foi distintamente menos eficaz do que antiprogestina (I) a doses comparáveis.

Conclusão:

No tumor mamário do rato induzido por DMBA, antiprogestina (I) induziu fortemente apoptose nas células tumorais e deste modo suprimiu completamente o crescimento tumoral em animais intactos. Descobriu-se que antiprogestina (I) a 2 mg/Kg possui um efeito máximo apoptótico em células tumorais. A antiprogestina (I) foi distintamente superior a onapristona considerando a inibição de crescimento de tumor. 18

Exemplo 2:

Inibição de crescimento de tumor no modelo de cancro da mama induzido por NMU em rato

Materiais e Métodos:

Induziram-se tumores por uma única injecção intravenosa de NMU (nitrosometilureia, 50 mg/Kg) em ratos fêmea Sprague-Dawley (obtidos de Tierzucht Schõnwalde, idade de 50-55 dias). Começando 10 dias depois, ratos com, pelo menos, um tumor estabelecido foram tratados durante 4 semanas por: 1) controlo solvente, 2) ovariectomia em inicio de tratamento, 3) antiprogestina (I), 1,0 mg/Kg/dia, 4) antiprogestina (I), 0,5 mg/Kg/dia e 5) onapristona, 5 mg/Kg/dia. Utilizou-se como um parâmetro para inibição de crescimento a alteração de área de tumor (em % de tamanho inicial do tumor) determinada por medições semanais com compasso de espessura. Utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis para análise estatística de diferenças de valores médios entre grupos.

Resultados:

Em animais controlo intactos, observou-se crescimento progressivo de tumor, ao passo que ovariectomia causou uma inibição completa de crescimento de tumor. O tratamento com antiprogestina (I) em doses de 0,5 ou 1,0 mg/Kg resultou em inibição significativa de crescimento de tumor em virtude da indução de apoptose comparado com o controlo (ver fig. 2) . A onapristona (5 mg/Kg) foi distintamente menos eficaz do que antiprogestina (I) à dose muito mais baixa de 0,5 mg/Kg. 19

Conclusões :

No modelo de tumor mamário do rato induzido por MNU, em virtude da sua potente capacidade para induzir apoptose em células tumorais, antiprogestina (I) suprimiu completamente o crescimento tumoral em animais intactos. Ambas as doses (1,0 mg/Kg bem como 0,5 mg/Kg) de antiprogestina (I) possuem um significativo efeito apoptótico em células tumorais.

Exemplo 3:

Aloenxerto de cancro da mama T47D humano em murganhos scid

Materiais e Métodos:

Murganhos fêmea scid Fox Chase (M&B) foram suplementados com grânulos de estradiol (Innovative Research of America). Células de cancro da mama T47D, obtidas de cultura de células e suspensas em matrigel, foram implantadas s.c. na região inguinal do murganho. Iniciou-se o tratamento quando os tumores tinham aproximadamente 25 mm2 de tamanho. Continuou-se o tratamento até progressão dos tumores. Grupos experimentais foram: 1) controlo (veiculo), 2) ovariectomia, 3) antiprogestina (I), 10 mg/Kg s.c.

Determinou-se a área tumoral por medições com compasso de espessura. Utilizou-se o teste Kruskal Wallis para análise estatística de diferenças de valores médios entre grupos. 20

Resultados :

No modelo de cancro da mama T47D, ovariectomia resultou numa inibição considerável de crescimento de tumor, comparado com o rápido crescimento no controlo. A Fig. 3 mostra claramente que a aplicação s.c. de antiprogestina (I) a 10 mg/Kg induz apoptose nas células tumorais. O efeito de antiprogestina (I) é quase comparável ao efeito de terapia de privação estrogénica convencional (ovariectomia).

Conclusão: O efeito de antiprogestina (I) na indução de apoptose e, deste modo, sem inibir o crescimento do cancro da mama T47D humano aloenxertado em murganhos scid Fox Chase é comparável ao efeito de terapia de privação estrogénica padrão (ovariectomia) , o qual é considerado o método de eficácia máxima de inibição de crescimento de cancro da mama neste modelo.

Exemplo 4:

Aloenxerto de cancro da mama MCF-7 humano em murganho scid

Materiais e Métodos:

Murganhos fêmea scid Fox Chase (M&B) foram suplementados com pastilhas de estradiol (Innovative Research of America). As células de cancro da mama MCF7, obtidas de cultura de células e suspensas em matrigel, foram implantadas s.c. na região inguinal do murganho. Iniciou-se o tratamento quando os tumores tinham 21 aproximadamente 25 mm2 de tamanho. Continuou-se o tratamento até progressão dos tumores. Grupos experimentais foram: 1) controlo (veiculo), 2) ovariectomia, 3) antiprogestina (I), 10 mg/Kg s.c. Determinou-se a área tumoral por medições com compasso de espessura. Utilizou-se o teste Kruskal Wallis para análise estatística de diferenças de valores médios entre grupos.

Resultados:

No modelo de cancro da mama MCF7, ovariectomia resultou numa inibição considerável de crescimento de tumor, comparado com o rápido crescimento no controlo. A Fig. 4 mostra claramente que a aplicação s.c. de antiprogestina (I) a 10 mg/Kg induziu apoptose nas células tumorais. O efeito de antiprogestina (I) é comparável ao efeito de terapia de privação estrogénica convencional (ovariectomia).

Conclusão: O efeito de antiprogestina (I) na indução de apoptose e deste modo inibição de crescimento do cancro da mama MCF7 humano aloenxertado em murganhos scid Fox Chase é comparável ao efeito de terapia de privação estrogénica padrão (ovariectomia). 22

Exemplo 5:

Cancro da mama induzido por NMU em rato (histologia, índice de proliferação e ensaio TUNEL)

Materiais e Métodos:

Induziram-se tumores por uma única injecção intravenosa de NMU (nitrosometilureia, 50 mg/Kg) em ratos fêmea Sprague-Dawley (obtidos de Tierzucht Schõnwalde, idade de 50-55 dias). Os ratos com, pelo menos, um tumor estabelecido com um tamanho de mais de 150 mm2 foram tratados durante 7 dias por: 1) controlo solvente, 2) ovariectomia em inicio de tratamento, 3) antiprogestina (I) , 3 mg/Kg s.c., diariamente. No fim do tratamento excisaram-se os tumores, fixaram-se em formalina e embeberam-se em parafina. Histologia, indice de proliferação e indução de ensaios de apoptose foram realizados nestes tumores ressectados.

Histologia: Para histologia coraram-se lâminas de tecidos com hematoxilina e analisaram-se por microscopia. índice de Proliferação: Para determinar o índice de proliferação determinou-se a expressão de PCNA. Antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) é uma proteína nuclear de 36 KD associada ao ciclo celular. Imunoreactividade de PCNA nuclear encontra-se no compartimento proliferativo de tecidos normais. Um anticorpo monoclonal, que reconhece um epítopo resistente a fixação e processamento foi utilizado para investigar a sua distribuição tecidular. TUNEL (Teste de Apoptose): O traço bioquímico distintivo de apoptose é a degradação do ADN genómico, um evento irreversível 23 que resulta na morte celular. Esta fragmentação de ADN característica é o resultado da activação de endonucleases nucleares, as quais clivam ADN selectivamente em sitios localizados entre unidades nucleossomais. Estas quebras de cadeias de ADN foram detectadas por marcação enzimática da extremidade 3'-OH com dUTP-fluoresceina utilizando desoxinucleotidiltransferase terminal (TUNEL, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling, cf. Gavrieli et al., J. Cell. Biol. 119, 493, 1992). Detectou-se fluoresceina incorporada utilizando o anticorpo conjugado anti-fluoresceina fosfatase alcalina seguida por reacção de substrato de fosfatase alcalina.

Resultados:

Histologia: Após tratamento com antiprogestina (I), as secções de tecido dos tumores NMU exibiram formações displásicas ductais e acinosas, preenchidas, geralmente, com material secretório (Figura 5A). Além disso, a fracção de volume de estruturas granulares nos tumores aumentou comparado com controlos (Figura 5B) . Adicionalmente, os tumores mamários de animais tratados com antiprogestina (I) exibiram as caracteristicas morfológicas de diferenciação. índice de Proliferação: Imunorreactividade PCNA é elevada em tecido não tratado de cancro da mama induzido por NMU (Figura 5C: Controlo não tratado). 0 número de células com imunorreactividade PCNA é reduzido por indução de diferenciação tecido de cancro da mama induzido por NMU de ratos tratados com antiprogestina (I) (Figura 5D) . Estes dados demonstram que no 24 cancro da mama, o tratamento com antiprogestina reduz o índice de proliferação por indução de diferenciação. TUNEL (Apoptose): Figura 5E demonstra o aspecto de apoptose induzido por antiprogestina (I) em tecido de cancro da mama induzido por NMU em comparação com o controlo não tratado (Figura 5F). É claramente evidente que a antiprogestina (I) por si só era capaz de indução de apoptose em tecido de cancro da mama induzido por NMU e deste modo inibiu o crescimento destes tumores.

Exemplo 6:

Actividade antiproliferativa de antiprogestina in vitro (I) na linha celular T47D

Materiais e Métodos:

Cresceram-se células T47D em soro tratado com carvão vegetal suplementado com E2 (estradiol) a 0,1 nM mais antiprogestina (I) durante 6 dias com uma troca de meio. Após fixação e coloração subsequente com violeta de cristal, registou-se a absorvência e normalizaram-se valores para a absorvência de controlos não tratados como descrito em R.B. Lichtner, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1999, 71; 181-189. O ensaio TUNEL é realizado em analogia com o Exemplo 5 acima com a única diferença que em vez de secções de tecido se utilizam, para o ensaio, células que são cultivadas em lâminas microscópicas. 25

Resultados :

Neste teste de linha celular T47D in vitro, antiprogestina (I) exibiu potente actividade de inibição de crescimento tumoral com uma concentração minima eficaz tão baixa como 10~9 a 10”8 mol/L ao passo que a antiprogestina onapristona não mostrou qualquer efeito de inibição. Até o antiestrogénio puro 11β-fluoro-7a-{5-[N-metil-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluoropentiltio)-propilamino]-pentil}-estra-l,3,5(10)-trien-3,17β-άίο1 (documento WO 98/07740) foi distintamente menos eficaz do que antiprogestina (I) (ver figura 6).

Conclusão:

A antiprogestina (I) de acordo com a presente invenção induz inibição completa de crescimento de células T47D estimuladas por estradiol a concentrações muito baixas e é desta forma superior com respeito a potência e eficácia a outras antiprogestinas, testadas tal como onapristona e ao antiestrogénio puro Ιΐβ-f luoro-7cx-{ 5-[N-metil-N-3-(4, 4,5,5,5- pentafluoropentiltio)-propilamino]-pentil}-estra-l, 3,5(10) -trien-3,17β-άίο1.

Lisboa, 2 de Novembro de 2006 26

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização da antiprogestina 113-(4-acetilfenil)-17p- hidroxi-17a-(1,1,2,2,2-pentafluoroetil)estra-4,9-dien-3-ona ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável para a preparação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cancro seleccionado do grupo de cancro da mama, cancro do ovário, cancro do endométrio, mieloma e meningioma com uma quantidade de risco elevado de células tumorais na fase S, como resultado da indução de apoptose por aplicação da referida antiprogestina ou um seu derivado ou análogo farmaceuticamente aceitável, numa dose diária de 0,1 a 400 mg/Kg.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 na qual o cancro é o cancro da mama. Lisboa, 2 de Novembro de 2006 1