CZ299823B6

CZ299823B6 - Lécivo obsahující antiprogestin pro ošetrování rakoviny

Info

Publication number: CZ299823B6
Application number: CZ20031073A
Authority: CZ
Inventors: Hoffmann@Jens; Lichtner@Rosemarie; Siemeister@Gerd; Schneider@Martin; Fuhrmann@Ulrike
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2008-12-03
Also published as: CN1209111C; AU2361902A; UA76729C2; CA2423020C; HUP0301433A3; SI1326617T1; PT1326617E; AU2002223619B2; DE60121980D1; EP1326617B1; NO20031741D0; HRP20030388A2; IL154976A; KR100668024B1; EP1326617A1; CA2423020A1; PL360157A1; ES2269492T3; NZ538347A; HUP0301433A2

Abstract

Použití antiprogestinu 11.beta.-(4-acetylfenyl)-17.beta.-hydroxy-17.alfa.-(1,1,2,2,2-pentafluorethyl)estra-4,9-dien-3-onu nebo jeho farmaceuticky prijatelného derivátu nebo analogu pro prípravu léciva pro ošetrování typu rakoviny vybraného ze souboru, který tvorí karcinom prsu, karcinom vajecníku, endometriální karcinom, myelom a meningiom s vysoce rizikovým množstvím nádorových bunek v S fázi prostrednictvím vyvolání apoptózy aplikací uvedenéhoantiprogestinu nebo jeho farmaceuticky prijatelného derivátu nebo analogu v denní dávce cinící 0,1 až 400 mg/kg.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití antiprogestinu llp-(4-acetylfenyl)-17[3-hydroxy-T7a(l,l,2,2,2-pentafluorethyl)estra-^4,9-dien-3-onu nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu nebo analogu pro přípravu léčiva pro ošetřování typu rakoviny vybraného ze souboru, který tvoří karcinom prsu, karcinom vaječníku, endometriální karcinom, myelom a meningiom, u něhož ío němž je indikátorem vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu.

Dosavadní stav techniky 15

Antiprogestiny představují relativně novou a perspektivní třídu terapeutických činidel, které by mohli mít významný vliv na ošetřování hormonálně závislých nádorů a jiných onemocnění. Ačkoliv byly antiprogestiny původně tvořeny s ohledem na lékařské nechirurgické ukončení těhotenství, nabyly určité antiprogestiny značného významu, například při endokrinní terapii těch karcinomů prsu, které vykazují receptory pro progesteron (T. Maudelonde a kok, v: J. G. M.

Klijn a kol., Hormonal Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors and New (Anti) Steroidal Agents, Raven Press, New York, 1987, str. 55 až 59).

Tato nová strategie endokrinní terapie je založena na protinádorovém účinku antiprogestinu 25 u buněčných linií karcinomu prsu pozitivních na progesteronové receptory in vitro a některých hormonálně závislých nádorů prsu u myši a krysy in vivo. Zejména již byl zkoumán protinádorový mechanismus antiprogestinu onapristonu a miťepristonu (RU 486), a to pomocí modelu hormonálně závislého MXT nádoru prsu u myši, a rovněž tak modelu DMBA- a NMU-indukovaného nádoru prsu u krysy (M. R. Schneider a kol., Eur. J. Cancer Clin. OncoL, sv. 25, č. 4,

31) str. 691 až 701, 1989; 11. Michna a kol., Breast Cancer Research and Treatment 14: 275 až 288,

1989; H. Michna, J. Steroid. Biochem., sv. 34, č. 1 až 6, str. 447 až 453, 1989). Kvůli nízké aktivitě a nežádoucím vedlejším účinkům spojeným s např. mifepristonem však tato sloučenina nemohla být doporučena jako jediné činidlo při ošetřování karcinomu prsu (D. Perrault a kok, J. Clin. OncoL 1996 říjen, 14(10), str. 2 709 až 2 712). Dále mefipriston vykazuje silné antigluko35 kortikoidní vedlejší účinky (vizL. M. Kettel a kol., Fertil. Steril. 1991 září, 56(3), str. 402 až 407;

X. Bertanga, Psychoneuroendocrinology 1997; 22 Suppl. 1, str. 51 až 55).

Stanovení procenta nádorových buněk v příslušných fázích buněčného cyklu lze provádět pomocí

DNA průtokové cytometrie s vysokou rozlišovací schopností (viz G. M. Clark a kol., N. Engl. •ίο I Med. 320, 1989, březen, str. 627 až 633; L. G. Dressler a kol., Cancer 61(3), 1988, str. 420 až

427, a zde uvedená literatura). Nyní se ukázalo, že stádium buněčného cyklu nádorových buněk, a konkrétně počet nádorových buněk v určitých stadiích cyklu, může být důležitým klinickým prediktorem progrese onemocnění a úspěchu léčby. V tomto ohledu je obzvláště důležitý počet buněk v S fázi buněčného cyklu.

EP 0 495 825 Bl popisuje použití antiprogestinu (kompetitivních progesteronových antagonistů) pro přípravu léčiv k léčení karcinomů prsu sc zvýšeným obsahem nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu, který je považován za vysoce rizikový faktor, Toto jc založeno na zjištění, že jsou antiprogestiny schopné blokovat progresi nádorových buněk v G₀Gj fázi buněčného cyklu, což vede k podstatnému snížení nádorových buněk v S fázi. Tento účinek však nebyl pozorován u standardní terapie karcinomu prsu tamoxifenem, estrogenovc terapie či ovarektomie. Antiprogestiny testovanými v rámci EP 0 495 825 Bl jsou 1 l[3-[4-(N,N-dimethylamino)fenyl]-17ahydroxy--17β- (3h\droxy propyl)- 1 Samethyl-4,9( 10)-gonadien3 on a 1 lp(4acetyTfenyl>17β-hydroxy-1 7ct-(prop-l-ynyl)-4,9( 10} estradicn-3-on.

la-fluoralky IsTcroidv se silnou antiprogestinovou aktivitou, a rovněž tak způsoby jejich přípravy jsou popsány ve WO 98734 947. WO 98/34 947 nepopisuje, ani nezkoumá, roli, kterou by zde popisované 17a-fluoralkylsteroidy mohli hrát při buněčné apoptóze či zástavě buněčného cyklu.

Potenciální hodnotou činidel, která vyvolávají apoptózu buněk, např. v případě nádorových buněk, blokováním progrese v GqGi fázi, je dáno, že je žádoucí nalézt další činidla, např. antiprogestiny, vykazující tento specifický mechanismus účinku. Tato činidla by došla potenciálního použití při léčení a prevenci určitých typů karcinomů, jako je karcinom prsu, u nichž je známkou vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu.

Podstata vynálezu

Proto je úkolem předkládaného vynálezu dále prozkoumat způsob účinku antiprogestinů při inhi15 biči hormonálně závislých onemocnění, jako je karcinom prsu, a poskytnout způsob cíleného vyvolání apoptózy buněk,

Překvapivě bylo zjištěno, že antiprogestin 11 p-(4-acetylfenyl)-l 7β-hydroxy-l 7a-( 1,1,2,2,2)pentafluorethyl)estra-4,9-dien-3-on, nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog, lze použít k vyvolání apoptózy buněk.

Předkládaný vynález je založen na neočekávaném zjištění, že antiprogestin 1 lp{4 -acelyllcnyl)17(3-hydroxy-l 7<x-( 1,1,2,2,2)-pentafluorethyl)estra“4,9-dien-3-on (dále označovaný jako „antiprogestin (1)“) vyvolává apoptózu a buněčnou smrt u nádorových buněk standardních nádo25 rových modelů karcinomu prsu. Zjistilo se, že antiprogestin (I) je schopný vyvolat apoptózu buněk prostřednictvím iniciace terminální diferenciace.

Proto předkládaný vynález poskytuje použití antiprogestinů (I) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu pro přípravu léčiva pro ošetřování typu rakoviny vybraného ze souboru, který tvoří karcinom prsu, karcinom vaječníků, endometriální karcinom, myelom a meningiom s vysoce rizikovým množstvím nádorových buněk v S fázi prostřednictvím vyvolání apoptózy aplikací uvedeného antiprogestinů nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu nebo analogu v denní dávce činící 0,1 až 400 mg/kg. Výhodně je vyvolání apoptózy způsobeno iniciací terminální diferenciace. Rakovinou je výhodně karcinom prsu.

Předmětem předkládaného vynálezu je použití antiprogestinů (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu k přípravě léčiva pro léčení uvedených typů rakoviny, při nichž je známkou vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu,

Antiprogestin (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog lze rovněž použít pro vyvolání apoptózy buňky in vitro. Buňkou může být savčí buňka, výhodně lidská buňka, a nejvýhodneji nádorová buňka, přičemž nádorem může být výhodně karcinom prsu.

Díky schopnosti vyvolat buněčnou apoptózu lze antiprogestin (1) nebo jeho farmaceuticky prija45 telný derivát či analog použít při ošetřování určitých typů karcinomů, jako je karcinom prsu, při nichž je známkou vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu. K dalším typům rakoviny ěi hormonálně závislých onemocnění, které lze, díky jeho schopnosti vyvolat buněčnou apoptózu, ovlivňovat a ošetřovat antiprogestinern (l), mohou například patřit karcinom prsu, karcinom vaječníků, endometriální karcinom, myelom, meningom, tj.

onemocnění, která v podstatě vznikají či jsou ovlivněna přítomností hormonálních receptorů nebo/a hormonálně závislých metaboliekých cest.

Přehled obrázků na výkresech

SEM směrodatná odchylka

Obr. I ukazuje inhibiění účinek na růst nádoru jako výsledek vyvolání apoptózy antiprogestinem (I) v rámci studie dávkové odezvy na DMBA vyvolaném karcinomu prsu u krysy, v porovnání s kontrolou, antiprogestinem onapristonem, a rovněž tak ovarektomií. Studie byla prováděna s denními dávkami antiprogestinu (I) ve výši 0,5, 2,0, 5,0 a 10,0 mg/kg s.c.

Obr. 2 ukazuje inhibiění účinek na růst nádoru jako výsledek vyvolání apoptózy antiprogestinem (I) u NMU vyvolaného karcinomu prsu u krysy, v porovnání s kontrolou a ovarektomií. Studie byla prováděna s denními dávkami antiprogestinu (I) ve výši 0,5 a 1,0 mg/kg s.c.

Obr. 3 ukazuje vyvolání apoptózy, a tak inhibiění účinek na růst nádoru antiprogestinu (I) v dávce 10 mg/kg s.c. u xenotransplantovaných lidských T47D nádorů u SC1D myší, v porovnání s kontrolou a ovarektomií.

Obr. 4 ukazuje vyvolání apoptózy, a tak inhibiění účinek na růst nádoru antiprogestinu (1) v dáv20 ce 10 mg/kg s.c. u modelu MCE-7 lidského karcinomu prsu u SCID myši, v porovnání s kontrolou a ovarektomií.

Obr. 5A až 5F ukazují histologická data vztahující se k vyvolání apoptózy u modelu NMU vyvolané rakoviny prsu u krysy (viz příklad 5). Zejména obr. 5A ukazuje, že nádory ošetřené antipro25 gestinem(l) vykazují duktální a acinózní formace, obvykle vyplněné sekrečním materiálem, v porovnání s kontrolou (obr. 5B). Obr. 5C ukazuje neošetřenou tkáň NMU vyvolaného karcinomu prsu s vysokou PCN A (prolíferační buněčný nukleární antigen) imunoreaktivitou v porovnání se tkání NMU vyvolaného karcinomu prsu ošetřeného antiprogestinem (1) (obr. 5D), která vykazuje nízkou PCN A imunoreaktivitu. Obr. 5E ukazuje příznaky apoptózy u antiprogestinem (1) ošetřené tkáně NMU vyvolaného karcinomu prsu, v porovnání s kontrolou (obr. 5F).

Obr. 6 ukazuje inhibiční účinek antiprogestinu (I) u buněčné linie T47D karcinomu prsu {stimulované estradiolem) s efektivní prahovou koncentrací ve výši 10”⁹ až 10 ⁸ mol/1, v porovnání s antiprogestinem onapristonem a čistým antiestrogenem 11 [3-fluor-7a-{5-[N-methyl-N-335 (4,4,5.5,5-pentaBuorpentylthio)propylamino]pentyl }estra-l ,3,5( 10)-trien-3,17p-diolem (WO 98/07 740).

Detailní popis vynálezu

Antiprogestin (I), tj. 11p-(4-acetylfenyl)-17p-hydroxy-17a-(l,l,2.2,2)-pentafluorethyl)estra4,9~dien-3-on, představuje níže uvedený vzorec (I).

Antiprogestin (I), nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog, je cenné farmaceutické činidlo vykazující silnou antiprogestinovou aktivitu. Antiprogestin (I) lze použít, v souladu s předkládaným vynálezem, k vyvolání apoptózy buněk.

Termín „antiprogestin“ má v rámci předkládaného vynálezu v prvé řadě zahrnovat všechny sloučeniny schopné kompetitivně inhibovat progesteronové receptory. Měl by však také zahrnovat sloučeniny schopné inhibovat biosyntézu progestinů.

K farmaceutickým derivátům či analogům ant i progestinů (I) může v rámci předkládaného vyňalo lezu patřit například libovolná sloučenina popsaná ve WO 98/34 947.

Studie provedené v rámci předkládaného vynálezu ukazují silné nádory inhibující vlastnosti antiprogestinu (1) v různých modelech hormonálně závislých nádorů (viz příklady 1 až 6). Dále ukazují, že nádor inhibující účinnost antiprogestinu (I), jako výsledek vyvolání apoptózy, je silnější než u běžných protinádorových činidel, jako je antiestrogen tamoxifen. Ošetřování karcinomu prsu pomocí antiprogestinu (1) podle předkládaného vynálezu je do konce lepší než ovarektomie.

Použití antiprogestinu u různých nádorových modelů, jak je popsáno níže, v příkladech provedení vynálezu, ukazuje akumulaci nádorových buněk v G₀G i fázi buněčného cyklu společně s významným a biologicky relevantním snížením počtu buněk v S a ČEM fázi buněčného cyklu. Tyto výsledky ukazují na vyvolání diferenciace. Difcrenciačně specifická G] zástava již byla navržena drive pro jiné systémy kmenových buněk (viz J. J. Wille Jr., Cancer Res. 1982, 42 (12): 5 139 až 46; R. E. Scott, J. Cello Biol. 1982,94(2): 400 až 405).

Z experimentálních výsledků získaných u různých nádorových modelů se zdá, že ošetřování antiprogestinem (I) spouští diferenciaci mitoticky aktivních polygonálních nádorových buněk směrem ke glandulárním strukturám a acinům s masivní sekvestrací sekrečních produktů, a rovněž ke vřetenovitým nekrobiotickým populacím (viz příklad 5 a zejména obr. 5Λ a 5B), Zatímco se velikost nádoru, mitotický index a stupeň malignity výrazně snižuje, objemová frakce glandulámích struktur v nádorech, a rovněž tak příznaky apoptózy, se v porovnání s kontrolami trojnásobně zvyšují (viz příklad 5, obr. 5E a 5F).

Bez omezení na libovolnou teorii tyto výsledky naznačují, že hlavním mechanismem protinádorového působení antiprogestinu (I) je u testovaných modelů přímý antíproliferativní účinek zpro35 středkovaný progesteronovými receptory na úrovni nádorových buněk, prostřednictvím vyvolání terminální diferenciace spojené sterminální buněčnou smrtí. Zdá se, že tímto způsobem je antiprogestin (I) schopen odstranit vnitrní blok terminální diferenciace vlastní maligním nádorovým buňkám u nádorů pozitivních na progesteronové receptory. Zdá se, že tento antíproliferativní účinek antiprogestinu (1) nesouvisí s antihormonální (antiprogestinovou) aktivitou antiprogestinu (I).

Činidla jako antiprogestin (I), která vyvolávají apoptózu buněk, například v případě nádorových buněk, blokováním progrese v G₀G[ fázi, lze potenciálně použít při ošetřování a prevenci mnoha stavů. Tato činidla, včetně antiprogestinu (1), lze použít při ošetřování karcinomů, při nichž je známkou vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu, jako je karcinom prsu.

Proto je jedním z předmětů předkládaného vynálezu použití antiprogestinu (í) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu ěi analogu pro přípravu léčiva pro ošetřování typu rakoviny vybra50 ného ze souboru, který tvoří karcinom prsu, karcinom vaječníku, endometriální karcinom, myelom a meningiom s vysoce rizikovým množstvím nádorových buněk v S fázi prostřednictvím vyvolání apoptózy aplikací uvedeného antiprogestinu nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu nebo analogu v denní dávce činící 0,1 až 400 mg/kg. Podle výhodného provedení se výše uvedené použití antiprogestinu (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu týká léčiva pro ošetřování karcinomu prsu.

CZ 299823 Bó

Přípravu léčiv lze provádět v souladu se způsoby v oboru známými. Lze použít běžně známé a používané pomocné látky, a rovněž tak další vhodné nosiče ěi ředidla. Vhodnými nosiči a pomocnými látkami mohou být nosiče a pomocné látky doporučované pro farmacii, kosmetiku ? a příbuzné obory v: Ullmann' s Encyclopedia of Technical Chemistry, sv. 4, (1953), str. 1 až 39; Journal of Pharmaceutical Sciences, sv. 52 (1963), str. 918 a další; H. v. Czetsch-Lindenwald, „Hilťsstoffe fiir Pharmazie und angrenzende Gebiete; Pharm. Ind. 2, 1961, str. 72 a další; Dr. Η. P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe tur Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor KG, Aulendorf in Wurttemberg, 1971.

io

Antiprogestíny vhodné pro účely předkládaného vynálezu, výhodně antiprogestin (I) nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog, lze do farmaceutických kompozic zabudovat v souladu se známými způsoby přípravy galenik pro perorální či parenterální, např. intraperitoneální, intramuskulámí, subkutánní či perkutánní, aplikaci. Lze je také implantovat do tkáně. Implantáty is mohou jako inertní materiály obsahovat např. biologicky odbouratelné polymery či syntetické silikony, jako je např. silikonová pryž.

Lze je podávat v podobě tablet, pilulek, dražé, gelových kapslí, granulí, čípků, implantátů, injikovatelných sterilních vodných či olejových roztoků, suspenzí či emulzí, mastí, krémů, gelů nebo intravaginálních (např. vaginálních kruhů) nebo intrauterinních systémů (např. diafragma (pesar), smyčky).

Při přípravě léčiva pro perorální podávání lze antiprogestíny vhodné pro účely předkládaného vynálezu, jak jsou definovány výše, smíchat s běžně známými a používanými pomocnými látka25 mi a nosiči, jako jsou například, arabská guma, talek, škrob, cukry, jako jsou např. mannitóza, methylcelulóza, laktóza, želatina, povrchově aktivní činidla, stearát hořečnatý, vodné a nevodné pomocné látky, deriváty parafinu, zesíťující činidla, dispergační činidla, emulgační činidla, lubrikanty, konzervační činidla a aromatická činidla (např. éterické oleje). Antiprogestin může být ve farmaceutické kompozici dispergován v mikročásticové, například nanočásticové, kompozici.

Za účelem dalšího zvýšení biologické dostupnosti účinného činidla lze antiprogestíny vhodné pro účely předkládaného vynálezu, jak jsou definovány výše, také upravit do podoby cyklodextrinclathrátů reakcí $α-, [3- nebo γ-cyklodextriny nebo jejich deriváty, způsobem popsaným v LP 771 217 (PCT/EP95/02656).

Pro parenterální podávání mohou být antiprogestíny vhodné pro účely předkládaného vynálezu, jak jsou definovány výše, rozpuštěny nebo suspendovány ve fyziologicky přijatelném ředidle, jako jsou např. oleje sči bez solubilizačních činidel, povrchově aktivních činidel, dispergačních činidel nebo emulgačních činidel. Jako oleje lze použít, bez omezení, olivový olej, podzemnicový κι olej, bavlníkový olej, sójový olej, ricinový olej a sezamový olej.

Podávané množství, tj. „farmaceuticky účinné množství“, se pohybuje v rámci širokého rozmezí a závisí na ošetřovaném stavu a způsobu podávání. Může zahrnovat libovolné množství účinné při zamýšleném ošetřování. Stanovení „farmaceuticky účinného množství“ je ve schopnostech odborníka v oboru.

Jedna jednotková dávka může představovat přibližně 0,1 až 100 mg úěinného(ých) činidla (činidel). Pro podávání člověku činí denní dávka účinného(ých) činidla (činidel) přibližně 0,1 až 400 mg, výhodně 10 až 100 mg, nejvýhodnějí 50 mg.

S{)

Léčiva lze také podávat prostřednictvím depotní injekce nebo implantačniho přípravku, popřípadě s ustáleným uvolňováním ůěinného(ých) činidla (činidel).

Výhodným způsobem podávání je perorální podávání. Antiprogestíny pro použití podle vynálezu, >5 a zejména antiprogestin (I), jsou obzvláště vhodné pro perorální podávání.

Antiprogestin (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog lze při použití podle před' kládaného vynálezu také kombinovat s alespoň jedním antiestrogenem, protože mnohé hormonálně závislé onemocnění, zejména karcinom prsu, vykazují nejen progesteronové receptory, ale i estrogenové receptory. Antiestrogen lze podávat souběžně s antiprogestinem nebo postupně, vzhledem k antiprogestinu, a zejména antiprogestinu (I) nebo jeho farmaceuticky přijatelnému derivátu či analogu. Množství antiprogestinu a antiestrogenů může být stejné nebo může jedna složka převládat nad druhou, takže poměr antiprogestimantiestrogen může činit 1:50 až 50:1, výhodně 1:30 až 30:1, a nej výhodněji 1:15 až 15:1.

ío

Příklady vhodných antiestrogenů pro použití podle předkládaného vynálezu jsou nesteroidní antiestrogeny, jako je tamoxifen a nafoxidin, a rovněž tak raloxifen, faslodex a EM800. Mezi příklady steroidních antiestrogenů patří antiestrogeny popsané v EP 0 348 341 A a antiestrogeny popsané ve WO 98/07 740, zejména 11JM1uor-7a-{5-[N-methyl-N-3-(4,4,5,5,5-pentafluori s pentylthio-propylaminojpentyl jestra l ,3,5( 10)—trien—3,17β—dio 1, nebo antiestrogeny popsané ve

WO 99/33 855, zejména 11 (3-fluor-7a-{ 5-[methyl-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-nonafluordecyl)amino]pentyl}estra-l,3,5(10Hrien*-3,l7p-diol nebo jejich farmaceuticky přijatelné deriváty či analogy. Jako antiestrogeny lze také použít inhibitory aromatázy s antiestrogenním účinkem, jako jsou inhibitory aromatázy popsané na stranách 7 až 8 dokumentu EP 0 495 825 Bl.

?o

Jak bylo uvedeno výše, je předmětem použití antiprogestinu (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu k přípravě léčiva k ošetřování určitých typů rakoviny, u nichž je známkou vysokého rizika zvýšené množství nádorových buněk v S fázi buněčného cyklu. Počet nádorových buněk v S fázi lze stanovit pomocí DNA průtokové cytometrie, jak je popsáno v Dressler a kol., „DNA Flow Cytometry and Prognostic Factors in 1331 Frozen Breast Cancer Specimens,

Cancer, sv. 61 (3), 1988, str. 420 až 427; viz též McGuire & Dressler, „Emerging Impact of Flow

Cytometry in Predicting Recurrence and Survival in Breast Cancer Patients^tL, JNCI, sv. 75(3),

1985, str. 405 až 409. Vysoce rizikové množství nádorových buněk v S fázi ukazuje obzvláště vhodné kandidáty pro použití podle vynálezu. V případě antiprogestinu (I) vyplývá výhoda jak ze silného prot i nádorového účinku, jak bylo prokázáno pomocí standardních živočišných modelů (viz příklady 1 až 4), tak z mechanismu účinku vyvolání apoptózy tohoto činidla (viz zejména příklad 5) a zástavy buněčného cyklu.

Antiprogestin podle vynálezu působí prostřednictvím vyvolání apoptózy buňky, například savčí 35 buňky, tj. i lidské buňky, a to in vitro či in vivo. Výhodně je apoptóza vyvolána prostřednictvím mechanismu vyvolání terminální diferenciace, například, podáváním antiprogestinu (I) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu. Při tomto lze u dané buňky aplikovat účinné množství antiprogestinu (1) nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu či analogu. Například u buněčné linie karcinomu prsu T47D. jejíž růst se stimuluje podáváním estradiolu, vyvolává antiprogestin (1) úplnou inhibicí buněčného růstu s účinnou prahovou koncentrací mezi 10 ⁹a 10⁸mol (viz příklad 6 a obr. 6). Toto je obzvláště překvapivé, neboť známý antiprogestin onapriston v tomto nádorovém modelu nevykazuje redukční účinek na buněčný růst. Proto je antiprogestin (I), s ohledem na potenci a účinnost, lepší než další antiprogestiny, jako je onapriston, a antiestrogeny, jako je tamoxifen, a dokonce i než čisté antiestrogeny, jako je 11 β-fluor45 7a-{5--[N-methyl-N-3-(4,4,5,5,5--pentafluorpentylthio)propylamino]pentyl }estra-l ,3,5( 10)trien-3,17J3-diol (WO 98/07 740),

Úloha antiprogestinu (1) při vyvolání apoptózy buňky ukazuje, že lze tento antiprogestin (nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát či analog) použít při mnoha stavech, zejména při hormonál50 ně závislých stavech, při nichž je vyvolání apoptózy obzvláště žádoucí. Konkrétně ho lze použít při ošetřování takových onemocnění, jako je karcinom prsu, karcinom vaječníků, endometriální karcinom, myelom, meningom, tj. onemocnění, jejichž podstatnou příčinou je, nebo/a je ovlivňuje, přítomnost hormonálních receptorů nebo/a hormonálně závislých pochodů. Antiprogestiny,

CZ 299823 Bó jako je antiprogestin (I), tak lze dále použít k přípravě léčiv pro vyvolání apoptózy nebo buněčné smrti k ošetřování hormonálně závislých onemocnění, jako jsou ta již popsaná výše.

Předkládaný vynález je dále ilustrován příklady provedení vynálezu. Následující příklady prove? dění vynálezu však nemohou být chápány jako jakékoliv omezení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Studie dávkové odezvy u DM BA vyvolaného nádorového modelu i s Materiály a metody:

Při této studii byly použity nezralé samičí krysy Sprague-Dawíey (staré 49 až 51 dní; 10 zvířat/skupina). Nádory prsu byly vyvolány jediným orálním podáním 10 mg 7.12 dimethylbenz[a]anthraccnu (DMBA, Serva/Heidelberg). Krysy alespoň s jedním potvrzeným nádorem o velikosti převyšující 150 mm² byly ošetřovány po dobu 4 týdnů pomocí: 1) rozpouštědla-kontrola, 2) ovarektomie na počátku ošetřování, 3) antiprogestinu (l), 0,5 mg/kg s.c, 4) antiprogestinu (I), 2 mg/kg s.c, 5) antiprogestinu (I), 5 mg/kg s.c, 6) antiprogestinu (I), 10 mg/kg s.c. a 7) onapristonu, 5 mg/kg s.c, denně. Jako parametr inhibice růstu byla použita změna plochy nádoru (v % vzhledem k počáteční velikosti nádoru) stanovovaná pomocí týdenních kal i peřových meření.

Ke statistické analýze meziskupinových diferencí středních hodnot byl použit Kruskal-Wallisův test. Pro další popis a hodnocení DM BA prevenčního modelu viz R. G. Metha, European Journal of Cancer 36 (2000), str. 1275 až 1282.

Výsledky:

U intaktních kontrolních zvířat byl pozorován progresivní nádorový růst, zatímco ovarektomie vedla k významné regresi nádoru u 90 % zvířat. Výsledkem ošetřování antíprogestínem (I) v dávce rovné či vyšší než 2 mg/kg byla významná indukce apoptózy vedoucí, v porovnáni s kontrolou, k inhibici nádorového růstu (viz obr. 2). Byl pozorován vztah mezi dávkou a odezvou.

Zatímco ošetřování pomoct 0,5 mg/kg antiprogestinu (I) významně nezamezovalo nádoru v růstu, u 2 mg/kg byla pozorována maximální indukce apoptózy, a tak inhibice růstu. V této skupině byla pozorována úplná regrese nádoru u 50 % krys. Účinek nejvyšší dávky antiprogestinu (1) testované v rámci tohoto experimentu (10 mg/kg) byl srovnatelný s účinkem 2 mg/kg, Onapriston (5 mg/kg s.c.) byl ve srovnatelných dávkách zřetelně méně účinný než antiprogestin (í).

Závěr:

V modelu DMBA vyvolaného nádoru prsu u krysy antiprogestin (1) silně vyvolává apoptózu nádorových buněk, a tak zcela suprimuje nádorový růst u intaktních zvířat. Bylo zjištěno, že

4? maximální apoptotický účinek na nádorové buňky vykazuje dávka 2 mg/kg antiprogestinu (I). Antiprogestin (l) byl, pokud jde o inhibici nádorového růstu, lepší než onapriston.

Příklad 2

Inhibice nádorového růstu v modelu NMU vyvolaného karcinomu prsu u krysy

Materiály a metody:

Nádory byly u samičích krys Sprague-Dawley (získaných od Tierzucht Schónwalde, stáří 50 až dní) vyvolány jedinou intravenózní injekcí NMU (nitrosomethylmočoviny, 50 mg/kg). Zapoío čalo se o 10 dní později, krysy alespoň s jedním potvrzeným nádorem byly ošetřovány po dobu týdnů pomocí: 1) rozpouštědla - kontrola, 2) ovarektomie na počátku ošetřování, 3) antiprogestinu (I), 1,0 mg/kg/den, 4) antiprogestinu (I), 0,5 mg/kg/den a 5) onapristonu, 5 mg/kg/den, Jako parametr inhibice růstu byla použita změna plochy nádoru (v % počáteční velikosti nádoru) stanovovaná pomocí týdenních kaliperových měření. Ke statistické analýze meziskupinových is diferencí středních hodnot byl použit Kruskal-Wallisův test.

Výsledky:

U intaktních kontrolních zvířat byl pozorován progresivní nádorový růst, zatímco ovarektomie 20 vedla k úplné inhibici nádorového růstu. Výsledkem ošetřování antiprogestinem (I) v dávce 0,5 či

1,0 mg/kg byla, v porovnání s kontrolou, významná inhibice nádorového růstu, způsobená vyvoláním apoptózy (viz obr. 2). Onapriston (5 mg/kg s.c.) byl zřetelně méně účinný než antiprogestin (I) v podstatně nižší dávce činící 0,5 mg/kg.

Závěr:

V modelu NMU vyvolaného nádoru prsu u krysy antiprogestin (I), díky své silné schopnosti vyvolávat apoptózu nádorových buněk, zcela suprimuje nádorový růst u intaktních zvířat. Obě dávky (1,0 mg/kg, a rovněž tak 0,5 mg/kg) antiprogestinu (I) vykazují významný apoptotický účinek na nádorové buňky.

Příklad 3

Ϊ5 Xenoštěp lidského karcinomu prsu T47D u SCID myší

Materiály a metody:

Samičím SCID myším Fox Chase (M&B) byly jako doplněk podávány estradiolové pelety (Inno40 vativc Research of America). Do inguinální oblasti myší byly s.c. implantovány buňky karcinomu prsu T47D získané z buněčné kultury a suspendované v matrigelu. V ošetřování se započalo, když velikost nádorů činila přibližně 25 mm². V ošetřování bylo pokračováno až do progrese nádorů. Experimentálními skupinami byly: 1) kontrola (vehikulum), 2) ovarektomie, 3)antiprogestin (I), 10 mg/kg s.c. Byla stanovována plocha nádoru pomocí kaliperových měření. Ke statis45 tické analýze meziskupinových diferencí středních hodnot byl použit Kruskal-Wallisův test.

Výsledky:

U modelu karcinomu prsu T47D vedla ovarektomie, v porovnaní s rychlým růstem u kontroly, k významné inhibici nádorového růstu. Obr. 3 zřetelně ukazuje, že s.c, aplikace 10 mg/kg antiprogestinu (I) vyvolává apoptózu nádorových buněk. Účinek antiprogestinu (1) je téměř srovnatelný s účinkem běžné estrogen-deprivační terapie (ovarektomie).

Závěr:

Účinek antiprogestinu (I) ve smyslu vyvolání apoptózy, a tak inhibice růstu lidského karcinomu prsu T47D xenotransplantovaného SCID myši Fox Chase, je srovnatelný s účinkem standardní estrogen-deprivační terapie (ovarektomie), která je považována za maximálně účinný způsob inhibice karcinomu prsu u tohoto modelu.

Příklad 4

Xcnoštěp lidského karcinomu prsu MCF-7 u SCID myši

Materiály a metody:

Samičím SCID myším Fox Chase (M&B) byly jako doplněk podávány estradiolové pelety (ínnovative Research of America). Do inguinální oblasti myší byly s.c. implantovány buňky karcinomu prsu MCF7 získané z buněčné kultury a suspendované v matrigelu. V ošetřování se započalo, když velikost nádorů činila přibližně 25 mm“. V ošetřování bylo pokračováno až do progrese nádorů. Experimentálními skupinami byly: I) kontrola (vehikulum), 2) ovarektomie, 3)antiprogeslin (1), 10 mg/kg s.c. Byla stanovována plocha nádoru pomocí kaliperových měření. Ke statistické analýze meziskupinových diferencí středních hodnot byl použit Kruskal-Wallisův test.

Výsledky:

U modelu karcinomu prsu MCF7 vedla ovarektomie, v porovnaní s rychlým růstem u kontroly, k významné inhibici nádorového růstu. Obr. 4 zřetelně ukazuje, že s.c. aplikace 10 mg/kg antiprogestinu (I) vyvolává apoptózu nádorových buněk. Účinek antiprogestinu (I) je srovnatelný s účinkem běžné estrogen-deprivační terapie (ovarektomie).

Závěr:

Účinek antiprogestinu (I) ve smyslu vyvolání apoptózy, a tak inhibice růstu lidského karcinomu prsu MCF7 xenotransplantovaného SCID myši Fox Chase, je srovnatelný s účinkem standardní estrogen-deprivační terapie (ovarektomie).

Příklad 5

NMU vyvolaný karcinom prsu u krysy (histologie, proliferační index a TUNEL analýzy) Materiály a metody:

Nádory byly u samičích krys Sprague-Dawley (získaných od Tierzucht Schónwalde, stáří 50 až

55 dní) vyvolány jedinou intravenózní injekcí NMU (nitrosomethylmočoviny, 50 mg/kg). Krysy alespoň s jedním potvrzeným nádorem o velikosti převyšující 150 mm² byly ošetřovány po dobu 7 dní pomocí: I) rozpouštědla - kontrola, 2) ovarektomie na počátku ošetřování, 3) antiprogestinu (1), 3 mg/kg, denně. Na konci ošetřování, byly nádory excidovány, fixovány ve formalinu a uloženy v parafinu. Na těchto resekovaných nádorech byly provedeny histologická analýzy, analýza proliferačního indexu a analýza indukce apoptózy.

Histologie: Za účelem histologického vyšetření byly tkáňové řezy obarveny hematoxilinem a mikroskopicky analyzovány, /λ

Proliferační index: Ke stanovení proliferačního indexu byla stanovována exprese PCNA. Nukleární antigen proliferuj ících buněk (PCNA, prolifcrating cell nuclear antigen) je 3ókD nukleární protein související s buněčným cyklem. Nukleární PCNA imunoreaktivita se pozoruje u proliferativních částí normálních tkání. Ke stanovení jeho distribuce ve tkáni byla použita monoklonální protilátka, která rozpoznává epitop odolný vůči fixaci a zpracování,

TUNEL (test apoptózy): Biochemickou známkou apoptózy je degradace genomické DNA, tj. ireverzibilní proces, který vede k buněčné smrti. Tato charakteristická fragmentace DNA je výsledkem aktivace nukleárních endonukleáz, které selektivně štěpí DNA v místech umístěných ío mezi nukleosomálními jednotkami. Tyto úlomky řetězce DNA byly detekovány za enzymatického značení 3'-OH konců pomocí fluorescein-dUTP terminální deoxynukleotidyltransferázou (TUNEL, Terminál Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling, viz Gavrieli a kol., J. Cello Biol. 119, 493, 1992). Zabudovaný fluorescein byl detekován pomocí konjugátu anti-fluoresceinové protilátky a alkalické fosfatázy následovaného reakcí substrátu s alkalickou fosfatázou.

Výsledky:

Histologie: Po ošetřování antiprogestinem (I) vykazovaly tkáňové řezy z NMU nádorů dysplas20 tické duktální a acinózní formace, obvykle vyplněné sekrečním materiálem (obr. 5A). Dále se u nádorů, v porovnání s kontrolou, zvýšila objemová frakce žlázových struktur (obr. 5B). Dále vykazovaly nádory prsu antiprogestinem ošetřovaných zvířat (I) morfologické znaky diferenciace.

Proliferační index: PCNA imunoreaktivita byla vysoká u neošetřované tkáně NMU vyvolaného karcinomu prsu (obr. 5C: Neošetřovaná kontrola). Počet buněk s PCNA imunoreaktivitou byl snížen vyvoláním diferenciace u tkáně NMU vyvolaného karcinomu prsu krys ošetřovaných antiprogestinem (I) (obr. 5D). Tato data ukazují, že ošetřování antiprogestinem (I) snižuje, u karcinomu prsu, proliferační index pomocí vyvolání diferenciace.

TUNEL (apoptóza): Obr. 5E ukazuje příznaky apoptózy vyvolané antiprogestinem (I) u tkáně NMU vyvolaného karcinomu prsu, v porovnání s neošetřovanou kontrolou (obr. 5F). Je zřejmé, že samotný antiprogestin (I) je schopný vyvolat apoptózu u tkáně NMU vyvolaného karcinomu prsu, a tak inhibovat růst těchto nádorů.

Příklad 6

Antiproliferativní aktivita antiprogestinu (1) in vitro u buněčné linie T47D

Materiály a metody:

Buňky T47D byly kultivovány v séru ošetřeném pomocí uhlí a doplněném 0,1 nM E2 (estradiolu) plus antiprogestinu (I) po dobu 6 dní sjednou změnou média. Po provedení fixace a následném barvení krystalovou violetí, byla zaznamenávána absorbance a hodnoty byly normalizovány k absorbanci neošetřovaných kontrol způsobem popsaným v R. B. Lichtner, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1999, 71; 181 až 198. Analýzy TUNEL byla provedena analogicky k výše uvedenému příkladu 5, s jedinou odlišností, a to, že namísto tkáňových řezů byly pro analýzu použity buňky, které byly kultivovány na mikroskopických sklíčkách.

Výsledky:

V tomto in vitro testu s buněčnou linií T47D vykazoval antiprogestin (I) silnou inhibiční aktivitu na růst nádoru selektivní prahovou koncentrací tak nízkou jako 10 ⁹ až 10 ^s mol/l, zatímco anti55 progestin onapriston nevykazoval žádný inhibiční účinek. Dokonce i čistý antiestrogen 11β— fluor-7<x-> 5-[N--methyl--N-3-(4,4,5,5,5--pentafluorpentylthio)propylamino]pentyl}estra! .3,5( 10)- tri en-3,17(3—diol byl zřetelně méně účinný než antiprogestin (I) (viz obr. 6).

Závěr:

?

Antiprogestin (1) podle předkládaného vynálezu vyvolává úplnou inhibicí růstu buněk T47D stimulovaného estradiolem ve velmi nízkých koncentracích, a je tak, pokud jde o potenci a účinnost, lepší než jiné testované antiprogestiny, jako je onapriston, a než čistý antiestrogen lip— fluor-7a-15-[N-methy 1—N—3—(4,4,5,5,5-pentafluorpentylthio)propy lam ino]pentyl}estrai a 1,3,5( 10)- trien-3,17 β-d io I.

Claims

ts PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití antiprogestinu 11 [3-(4-ac etyl feny I) 17 (3-hydroxy-17 ot-( 1,1,2,2,2-pentaflu o rethyl)estra-4,9--dien--3-onu nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu nebo analogu pro přípravu

20 léčiva pro ošetřování typu rakoviny vybraného ze souboru, který tvoří karcinom prsu, karcinom vaječníku, endometriální karcinom, myelom a meningiom s vysoce rizikovým množstvím nádorových buněk v S fázi prostřednictvím vyvolání apoptózy aplikací uvedeného antiprogestinu nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu nebo analogu v denní dávce činící 0,1 až 400 mg/kg.
2. Použití podle nároku 1, při němž je rakovinou karcinom prsu.

11 výkresů plocha nádoru [% počáteční plochy]