BG107744A

BG107744A - Използване на антипрогестини за предизвикване на апоптоза в клетка

Info

Publication number: BG107744A
Application number: BG107744A
Authority: BG
Inventors: Jens Hoffmann; Rosemarie Lichtner; Gerhard Siemeister; Martin Schneider; Ulrike Fuhrmann
Original assignee: Schering Aktiengesellschaft
Priority date: 2000-10-18
Filing date: 2003-04-18
Publication date: 2004-02-27
Also published as: UA76729C2; CZ299823B6; CN1469749A; IL154976A; WO2002032432A1; JP2004511523A; KR100668024B1; EP1326617B1; EA010593B1; SK4702003A3; HK1062273A1; CA2423020A1; NO20031741L; CA2423020C; AU2361902A; DE60121980D1; IL154976A0; NO20031741D0; MXPA03002955A; AU2002223619B2

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до използването на антипрогестини за

Ь предизвикване на апоптоза в клетка. По-специално, изобретението се отнася до използването на антипрогестин 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси-17а(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9-диен-3-он или негови фармацевтично приемливи производни или аналози за предизвикване на апоптоза в клетка. Освен това изобретението осигурява използването на антипрогестини за получаването на лекарство за лечение на тип рак, като рак на гърдата, при който индикатор за висок риск е увеличено количеството на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

Предшестващо състояние на техниката

Антипрогестините представляват относително нов и обещаващ клас терапевтични средства, които биха имали съществено влияние върху лечението на хормонално-зависими тумори и други заболявания. При все че антипрогестините първоначално са създадени с оглед на медицинско нехирургическо прекратяване на бременост, някои антипрогестини са придобили съществено значение в примерно ендокринната терапия на такива ракови заболявания на гърдата, в които участват рецептори за прог^стерон (Т. Maudelonde et al., в: J. G. M. Klijn et al., Hormonal

Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors and New (Anti) Steroidal Agents, Raven Press, New York, 1987, pp 55 - 59),

Тази нова стратегия в ендокринната терапия се базира на антитуморната активност на антипрогестини в прогестерон рецепторпозитивни човешки клетъчни линии на рак на гърдата in vitro и в няколко хормонално зависими тумори на гърдата на мишка и плъх in vivo. Поспециално, антитуморният механизъм на антипрогестините онапристон и мифепристон (RU 486) е изследван като е използван хормон-зависещ МХТ гръден туморен модел на мишка, както и DMBA- и NMU-предизвикани гръдни туморни модели при плъх (М. R. Schneider et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., Vol. 25, No. 4, pp. 691 - 701, 1989; H. Michna et al., Breast Cancer Research and Treatment 14: 275 - 288, 1989; H. Michna, J. Steroid. Biochem. Vol. 34, Nos 1- 6, pp. 447 - 453, 1989). Поради малка активност обаче и вредни странични ефекти, свързани например с мифепристон, това съединение не можа да бъде препоръчано като самостоятелно средство при рак на гърдата (D. Perrault et al., J. Clin. Oncol. 1996 Oct, 14(10), pp. 2709 2712). Нещо повече, мифепристон проявява силни антиглюкокортикоидни странични ефекти (виж. L. М. Kettel et al., Fertil. Steril. 1991 Sep, 56(3), pp. 402 -407; X. Bertagna, Psychoneuroendocrinology 1997; 22 Suppl. 1, pp. 51 Определянето на процента тхзюрни клетки в съответните фази на клетъчния цикъл може да се осъществи чрез мощен ДНК поточен цитометричен метод (виж. G. М. Clark et al., N. Engl. J. Med. 320, 1989, March, pp. 627 - 633; L. G. Dressier et al., Cancer 61(3 ), 1988, pp. 420 - 427 и цитираната там литература). Показано бе, че етапите на клетъчния цикъл на туморната клетка и по-специално броя на туморните клетки в някои етапи на цикъла, могат да бъдат важен клиничен предсказател за прогресирането на болестта и успеха на лечението. Броя на клетките в S-фазата на клетъчния цикъл са особно важни в това отношение.

ЕР Ο 495 825 Bl описва използването на антипрогестини (конкурентен прогестеронов антагонист) за получаването на лекарствени средства за лечение на рак на гърдата, при който има увеличено съдържаноие на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл, което се смята за висок рисков фактор. Това се основава на наблюдението, че антипрогестини са способни да блокират прогресирането на туморни клетки в GoGi- фазата на клетъчния цикъл, водещо до съществено намаляване на туморните клетки в S-фазата. Този ефект обаче не се наблюдава при стандартното лечение на рак на гърдата с тамоксифен, естрогенна терапия или при овариектомия. Антипрогестините, изпитани в ЕР 0 495 825 В1, са 11р-[4-Ь[,К-диметиламино)-фенил]-17а-хидрокси-17р-(3-хидроксипропил)13а-метил-4,9(10)-гонадиен-3-он и 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси-17а(проп-1 -инил)-4,9(10)-естрадиен-3-он.

17а-флуороалкилстероиди, притежаващи силна антипрогестинова активност, както и методи за получаването им са описани в WO 98/34947. WO 98/34947 не обсъжда или не изследва ролята, която описаните там 17афлуороалкилстероиди могат да играят в клетъчната апоптоза или в задържане на клетъчния цикъл.

Оценявайки стойността на средства, които предизвикват апоптозиз в клетки, например в случая на туморни клетки, чрез блокиране прогресирането в G₍Gi- фазата, желателно е да се идентифицират други средства, например антипрогестини, притежаващи този механизъм на действие. Такива средства биха имали голяма приложение при лечението и предпазването на някои типове рак като рак на гърдата, при който индикатор за висок риск е увеличеното количество на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

Техническа същност на изобретението

Предмет на изобретението е по-нататъшно изследване начина на действие на антипрогестини в инхибиране хормонално-зависими заболявания като рак на гърдата и осигуряване на метод за постигане предизвикването на апоптоза в клетки.

Изненадващо изследователите са открили, че антипрогестина 11β-(4ацетилфенил)-17р-хидрокси-17ос-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9диен-3-он (или негови фармацевтично приемливи производно или аналог) могат да се използват за предизвикване на апоптоза в клетка.

Изобретението се базира на неочакваното наблюдение, че 11β-(4ацетилфенил)-17 β-хидрокси-17α-( 1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9диен-3-он (по-нататък ще се означава като “антипрогестин (I)”) предизвиква апоптоза и клетъчна смърт в туморни клетки в стандартни туморни модели на рак на гърдата. Намерено бе, че антипрогестин (I) е способен да предизвика апоптоза в клетки чрез иницииране на терминална диференциация.

Така настоящето изобретение осигурява използването на антипрогестин (I) или негово фармацевтично приемливо производно или аналог за получаването на лекарство за предизвикване на апоптоза в клетка. С предпочитание, предизвикването на апоптоза се причинява чрез иницииране на терминална диференциация. Клетката е с предпочитание бозайникова клетка, по-предпочитано човешка клетка и най-добре туморна клетка, при което тумора е с предпочитание рак на гърдата.

Друг аспект на настоящето изобретение е използването на антипрогестин (I) или негово фармацевтично приемливо производно или аналог за получаването на лекарство за лечението на типове рак, при които индикатор за висок риск е увеличено количество от туморни клетки в Sфазата на клетъчния цикъл.

~Друг аспект на настоящето изобретение е използването на антипрогестин (I) или негово фармацевтично приемливо производно или аналог за предизвикване на апоптоза в клетка in vitro. Клетката е с предпочитание бозайникова клетка, по-предпочитано човешка клетка и найдобре туморна клетка, при което тумора е с предпочитание рак на гърдата.

Друг аспект на настоящето изобретение е метод за за предизвикване на апоптоза в клетка чрез прилагане на ефективно количество антипрогестин (I) към клетката. Този метод може да се прилага in vitro и in vivo. Клетката е с предпочитание бозайникова клетка, по-предпочитано човешка клетка и най-добре туморна клетка, при което тумора е с предпочитание рак на гърдата.

Благодарение на способноста на предизвиква клетъчна апоптоза, антипрогестин (I) или негово фармацевтично приемливо производно или аналог може да се използва за лечение на някои типова рак като рак на гърдата, при който индикатор за висок риск е увеличеното количество от туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл. Други типове рак или хормонално-зависими заболявания, които могат да се повлияят и лекуват с антипрогестин (I), благодарение на способността му да предизвиква клетъчна апоптоза, могат да бъдат например рак на гърдата, ендометриален рак, миелома, ановуларна безплодност, менингома, т.е. заболявания, които по същество произхождат или се повлияват от присъствието на хормонални рецептори и/или по хормонално-зависими пътища.

Кратко описание на фигурите:

Фигура 1 показва инхибиращия ефект върху туморния растеж като резултат на предизвикване на апоптоза от антипрогестин (I) в изследване на доза - реакция в DMBA-предизвикан карцином на гърдата при плъх в сравнение с контрола, антипрогестина онапристон както и с овариектомия. Изследването се провежда с 0.5, 2.0, 5.0 и 10.0 мг/кг подкожно дневна доза от антипрогестин (I).

^Фигура 2 показва инхибиращия ефект върху туморния растеж като резултат на предизвикване на апоптоза от антипрогестин (I) в NMU предизвикан карцином на гърдата при плъх в сравнение с контрола и с овариектомия. Изследването се провежда с 0.5 и 1.0 мг/кг подкожно дневна доза от антипрогестин (I).

Фигура 3 показва предизвикване на апоптоза и с това инхибиращ ефект върху растежа на тумора от антипрогестин (I) при доза 10 мг/кг подкожно, при ксенотрансплантирани човешки T47D тумори в scid мишки, в сравнение с контрола и овариектомия.

Фигура 4 показва предизвикване на апоптоза и с това инхибиращ ефект върху растежа на тумора от антипрогестин (I) при доза 10 мг/кг подкожно, при MCF-7 човешки рак на гърдата модел в scid мишки, в сравнение с контрола и овариектомия.

Фигури 5А до 5F показват хистологични данни, свързани с предизвикване на апоптоза при модел с NMU-предизвикан карцином на гърдата при плъх (виж пример 5). По-специално, фигура 5А показва тумори третирани с антипрогестин (I) показват каналовидни и гроздовидни образувания, обикновено напълнени със секреторен материал, сравнени с контрола (фигура 5В). Фигура 5С показва нетретирана NMU-предизвикана карциномна тъкан от гръден рак с висока PCNA (пролиферативен клетъчен нуклеарен антиген) имунореактивност в сравнение с NMU-предизвикани карциномна тъкан от гръден рак, третирани с антипрогестин (I) (фигура 5D), която проявява ниска PCNA имунореактивност. Фигура Е показва вида на апоптозата при третирана с антипрогестин (I) NMU-предизвикани карциномна тъкан от гръден рак, в сравнение с контрола (фигура 5F).

Фигура 6 показва инхибиращия ефект върху туморния растеж на антипрогестин (I) в T47D клетъчна линия от рак на гърдата (стимулирано с естрадиол) с ефективна прагова концентрация от 10’' до 10' мола/л, сравнен с антипрогестина онапристон и чистия антиестроген 11р-флуоро-7а-{5-|>1метшр Н-3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}-естра1,3,5( 10)-триен-3,17р-диол (WO 98/07740).

Антипрогестин (I) - 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси-17а(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9-диен-3-он е представен по-долу с формула (I):

(I)

Антипрогестин (I) (или негово фармацевтично приемливо производно или аналг) е ценно фармацевтично средство, притежаващо силна антипрогестинова активност. Антипрогестин (I) може да се използва съгласно изобретението за предизвикване на апоптоза в клетки.

Терминът “антипрогестини“ в контекста на настоящето изобретение включва на първо място всички съединения, които са способни на конкурентно инхибиране на прогестероновн рецептори. Но той също обхваща съединения, които са способни да инхибират биосинтезата на прогестини.

Фармацевтично приемливо производно или аналог на антипрогестин (I) в контекста на настоящето изобретение може да включва всяко от съединенията от изобретението, описани в WO 98/34947.

Изследванията проведени в контекстна на настоящето изобретение показват силните тумор инхибиращи свойства на антипрогестин (I) при множество хормонално-зависими туморни модели (виж примери 1 до 6). Освен това е показано, че туморинхибиращата активност на антипрогестин (I) като резултат от предизвикване на апоптоза е по-силна от тази на обичайните противотуморни средства като антиестрогена тамоксифен. Лечението на рак на гърдата при използване на антипрогестин (I) съгласно изобретението е дори по-добро от овариектомия.

Прилагането на антипрогестин (I) при различни туморни модели се демострира по-долу в примерите при което се вижда, че натрупването на туморни клетки в GoGp фазата на клетъчния цикъл заедно със знаително и биологично релевантно намаляване на броя на клетките в S- и G₂M фазата на клетъчния цикъл. Резултатите показват едно предизвикване на диференциация. Диференциацията - специфично Gi-задържане вече е предложено по-рано за други стволови клетъчни системи (виж. J.J. Wille Jr., Cancer Res. 1982, 42(12):5139 - 46; R. E. Scott, J. Cell. Biol. 1982, 94(2): 400 405).

Експерименталните резлтати, получени при различните туморни модели, откриват, че третирането с антипрогестин (I) изглежда че предизвиква диференциация на митотичноактивни полигоналните туморни клетки към жлезисти структури и гроздовидност с масивно секвестиране на секреторни продукти, както и към вретеновидно-оформени некробиотични субпопулации (виж пример 5 и по-специално фигури 5А и 5В). Докато размера на тумора, митотичният индекс и степента на злокачественност съществено намаляват, обемната фракция на жлежести структури в туморите, както и появяването на апоптоза се увеличава трикратно в сравнение с контролите (виж пример 5, фигури 5Е и 5F).

Без да се ограничаваме с каквато и да е теория, тези резултати показват, че главният механизъм на антитуморна активност на антипрогестин (I) в изпитаните модели е директен прогестерон-рецептор медииран антипролиферативен ефект на нивото на туморните клетки, чрез предизвикване на терминална диференциация свързана с терминална клетъчна смърт. По този начин, антипрогестин (I) изглежда да е способен да елиминира интринзния блок в терминална диференциация, присъща на злокачествени туморни клетки в прогестерон рецептор-позитивни тумори. Този антипролиферативен ефект на антипрогестин (I) изглежда да е дисоцииран от антихормоналната (антипрогестионална) активност на антипрогестин (I).

Средства като антипрогестин (I), които предизвикват апоптоза в клетки, например в случая на туморни клетки, чрез блокиране прогресирането в GoGr фазата, имат голямо приложение за лечение и предпазване от множество заболявания. Такива средства, включително антипрогестин (I), могат да се изполват за лечение на такъв вид рак, при който индикатор за висок риск е увеличеното количество туморни клетки в

S-фазата на клетъчния цикъл, като рак на гърдата.

Така, един аспект на настоящето изобретение е използването на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог за получаването на лекарство за предизвикване на апоптоза в клетката. Съгласно предпочитано изпълнение, използването на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог е свързано с лекарство за предизвикване на апоптоза в туморна клетка, за предпочитане в туморна клетка на рак на гърдата в човек. Такова лекарство би било успешно при лечението на хормонално-зависими заболявания като рак на гърдата, при което индикатор за висок риск е увеличеното количество туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

Производството на лекарствени средства може да се осъществи по известни методи. Могат да се използват обичайни известни добавки, както и други подходящи носители или разредители. Подходящи носители и добавки могат да бъдат препоръчаните за фармацията, козметиката и сродни области в Ullmann’s Encyclopedia of Technical Chemistry, Vol. 4, (1953), pp. 1-39; Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 52 (1963), p. 918ff; Η. V. CzetschLindenwald, “Hilfsstoffe flier Pharmazie und angrenzende Gebiete”; Pharm. Ind. 2, 1961, p. 72ff; Dr. Η. P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor KG, Aulendorf in Wuerttemberg, 1971.

Подходящите за настоящето изобретение антипрогерстини, с предпочитание антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог, могат да се включат във фармацевтични състави съгласно известни методи за получаване на галенични форми за орално или парентерално, например интраперитонеално, мускулно, подкожно или през кожата приложение. Те могат също да се имплантират в тъкан. Имплатите могат да включват като инертни вещества например биологично разграждащи се полимери или синтетични силикони като примерно силиконов каучук.

Те могат да се прилагат под формата на таблетки, пилюли, дражета, гелни капсули, гранули, супозитории, импланти, инжектируеми стерилни водни или маслени разтвори, суспензии или емулсии, мазила, кремове, гелови или чрез интравагинални (например вагинални пръстени) или интраутеринни системи (например диафрагми, спирали).

За получаването на лекарствено средство за орално приложение подходящите антипрогестини, съгласно определението от по-горе, могат да се смесят с обичайно известни и използвани добавки и носители като например гума арабика, талк, нишесте, захари като например манитоза, метилцелулоза, лактоза, желатин, повърхностноактивни средства, магнезиев стеарат, водни или неводни пълнители, парафинови производни, напречносвързани средства, диспергатори, емулгатори, смазващи вещества, консервиращи средства и ароматизатори (например етерични масла). Във фармацевтичния състав антипрогестинът може да е диспергиран на микрочастички, например наночастички.

За по-нататъшно подобряване на биодостъпността на активното средство, антипрогестините, подходящи за целите на настоящето изобретение съгласно определението по-горе, могат също да се формулират като цйклодекстринови клатрати чрез взаимодействие с α-, β- или γ11 циклодекстрини или тяхни производни съгласно описания в PCI7EP95/02656 метод.

За парентерално приложение подходящите за настоящето изобретение антипрогестини, съгласно определението от по-горе, могат да бъдат разтворени или суспендирани във физиологично приемливи разредители като например масла с или без солюбилизатори, повърхностонактивни средства, дисперганти или емулгатори. Като масла, без това да е ограничаващо, могат примерно да се използват маслинено, фъстъчено, памучно, соево, рициново и сусамено.

Количеството на приложение (т.е. “фармацевтично ефективното количество”) варира в широки граници и зависи от състоянието, което ще се лекува и начина на приложение. То може да покрива всяко ефективно количество за предвиденото лечение. Определянето на “фармацевтично ефективното количество” е в компетентността на специалиста от областта.

Една единична доза може да представлява около 0.1 до 100 мг активно средство(а). При хора, дневната доза от активно средство(а), която ще се прилага е около 0.1 до 400 мг, за предпочитане 10 до 100 мг, най-добре 50 мг.

Лекаствените средства съгласно изобретението могат да се прилагат чрез депо инжектиране, чрез имплантен препарат или като IUD (вътрешно утеринно устройство), евентуално за забавено отдаване на активното средство(а).

Предпочитаният начин на приложение е оралния. Използваните съгласно изобретението антипрогестини и по-специално антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливи производни или аналози, са особено подходящи за орално приложение.

Съгласно всички аспекти на настоящето изобретение е също възможно да се комбинира най-малко един антипрогестин, съгласно определнието от по-горе, по-специално антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог, с най-малко един антиестроген, тъй като много хормонално-зависещи заболявания, поспециално рак на гърдата, показват не само прогестеронови рецептори, но също така и естрогенни рецептори. Антиестрогените могат да се прилагат или едновременно или последователно с антипрогестина и по-специално с/заедно с антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог. Количеството антипрогестин и антиестроген може да е еднакво или едната съставка да е повече от другата, като примерно в съотношение на антипрогестин : антиестроген от 1 : 50 до 50 : 1, за предпочитане 1 : 30 до 30 : 1 и най-добре 1 : 15 до 15 : 1.

Примери на подходящи за използване съгласно изобретението антиестрогени са нестероидните антиестрогени, като тамоксифен и нафоксидин, както и ралоксифен и ЕВ800 и стероидния антиестроген фазлодекс. Примери на стероидни антиестрогени включват описаните в ЕР 0 348 341 А и описаните във WO 98/07740, по-специално 11р-флуоро-7а-{5[N-метил- М-3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол или описаните във WO 99/33855, поспециално 11 р-флуоро-7а- {5-[метил-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-нонафлуородецил)-амино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол или негови фармацевтично приемливи производни или аналози. Като антиестрогени могат да се използват също ароматазни инхибитори, притежаващи антиестрогенен ефект като описания на страници 7 до 8 на ЕР 0 495 825 В1.

Друг аспект на изобртнието е използването на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог за получаването на лекарствено средство за лечението на тип рак, при който индикатор за висок риск е увеличено количество тхморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл. Броят на туморни клетки в S-фазата може да се определи чрез ДНК поточна цитометрия, както е описано от Dressier et al., “DNA Flow Cytometry and Prognostic Factors in 1331 Frozen Breast Cancer Specimens”, Cancer, Vol. 61(3),

1988, pp. 420 - 427; виж също McGuire & Dressier, “Emerging Impact of Flow Cytometry in Predicting Recurrence and Survival in Breast Cancer Patients,” JNCI, Vol. 75(3), 1985, pp.405 - 409. Високо рисково количество туморни клетки в S-фазата показва особено подходящ кандидат за използване на лекарството съгласно изобретението. В случай на антипрогестин (I), предимството възниква както от силния антитуморен ефект, както се вижда от стандартните животински модели (виж примери 1 до 4), така и от механизмът на действие на това средство предизвикващо апоптоза (виж поспециално пример 5) и спиране на клетъчния цикъл.

В алтернативен аспект настоящето изобретение осигурява метод за предизвикване на апоптоза в клетка. Клетката е с предпочитание такава на бозайник и най-добре на човек и методът може да се приложи in vitro и in vivo. С предпочитание апоптоза се предизвиква чрез механизъм на иницииране на терминална диференциация, например, чрез прилагане на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог. При метода антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог може да се приложи към въпросните клетки. Например в T47D клетъчна линия на рак на гърдата, този растеж се стимулира чрез прилагане на естрадиол, антипрогестин (I) предизвиква напълно инхибиране на растежа на клетките при ефективна прагова концентрация между 10' и 10' мола (виж пример 8 и фигура 6). Това е особено изненадващо, тъй като известния антипрогестин онапристон няма намаляващ ефект върху клетъчния растеж при този туморен модел. Така, антипрогестин (I) е по-добър по отношение на сила на активността и ефикасността спрямо други антипрогестини като онапристон и по отношение на антиестрогени като тамоксифен и дори по отношение чисти антиестрогени като 11р-флуоро-7а-{5-[Т1-метил-Ь1-3-(4,4,5,5,5пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17рдиол (WO 98/07740).

Ролята на антипрогестин (I) при предизвикване на апоптоза в клетката показва,. че този антипрогестин (или негови фармацевтично приемливо производно или аналог) може да бъде полезен в приемник със състояния, по-специално хормонално-замисими състояния, при които предизвикване на апоптоза е особено желателно. По-специално, той може да се използва при лечението на такива заболявания като рак на гърдата, рак на яйчниците, ендометриален рак, миелома, ановулаторна безплодност, менингома, т.е. заболявания, които по същество произхождат или се повлияват от присъствието на хормонални рецептори и/или по хормоналнозависещи пътища. Антипрогестини като антипрогестин (I) могат освен това да се използват за получаването на лекарствени средства за предизвикване на апоптоза или клетъчна смърт за лечение на хормонално-зависими заболявания, както по-горе бе описано.

Изобретението се илюстрира по-нататък с примерите. Следващите примери не трябва да се приемат за ограничаващи.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1

Изследване на доза-реакция в DMBA-предизвикан туморен модел Материали и методи:

При изследването се използват недоразвити женски Sprague-Dawley плъхове (49-51 дни на възраст; 10 животни в група). Туморите в гърдите се предизвикват от единична доза 10 мг орално приложен 7,12диметилбенз[а]антрацен (DMBA, Serva/Heidelberg). Плъхове, при които е установен най-малко един тумор с размер по-голям от 150 мм се третират в продължение на 4 седмици с: 1) контрола от разтворител, 2) овариектомия при започване на третирането, 3) антипрогестин (I) 0.5 мг/кг подкожно, 4) антийрогестин (I) 2 мг/кг подкожно, 5) антипрогестин (I) 5 мг/кг подкожно,

6) антипрогестин (I) 10 мг/кг подкожно и 7) онапристон 5 мг/кг подкожно дневно. Като параметър на инхибирането на растежа се проверяват седмично промените в площта на тумора (в % по отношение на първоначалния размер на тумора) чрез измервания с дебеломер (шублер). За статистически анализ за разликите между групите се използват средните стойности съгласно теста на Kruskal - Wallis. За по-нататъшно описание и оценяване в DMBA предпазен модел виж R. G. Metha, European Journal of Cancer 36 (2000), pp. 1275- 1282.

Резултати

В интактните контролни животни се наблюдава прогресивно нарастване на тумора, докато при овариектомизираните животни има значително намаляване на тумора в 90 % от животните. Въздействието с антипрогестин (I) в дози от 2 мг/кг и повече води да значително инхибиране на туморния растеж в сравнение с контролата (виж фигура 2). Има ясна връзка между дозата и получената реакция. При въздействие с 0.5 мг/кг антипрогестин (I) не се предпазва съществено тумора от растеж, докато при 2 мг/кг се наблюдава максимално инхибиране на растежа. В тази група се наблюдава напълно регресиране на тумора при 50 % от плъховете. Ефектът при най-високата доза антипрогестин (I), изпитано в този експеримент (10 мг/кг), е сравним с този от 2 мг/кг. Онапристон (5 мг/кг, подкожно) е значително по-малко ефективен от антипрогестин (I) при сравними дози.

Заключение

При модел на DMBA-предизвикан тумор на гърдата при плъх антипрогестин (I) напълно потиска растежа на тумора при интактни животни. Намерено бе, че 2 мг/кг антипрогестин (I) има максимален апоптичен ефект върху растежа на тумора. Антипрогестин (I) е значително по-добър от онапристон по отношение инхибиране на т\-морния растеж.

Пример 2

Инхибиране на туморния растеж в NMU-предизвикан рак на гърдата в модел на плъх

Материали и методи:

Туморите се предизвикват от единична интравенозна инжекция NMU (нитрометилуреа, 50 мг/кг) при женски Sprague-Dawley плъхове (получени от Tierzucht Schoenwalde, 50 - 55 дни на възраст). Третирането започва 10 дни по-късно, плъхове с най-малко един установен тумор се третират 4 седмици както следва: 1) контрола- разтворител, 2) овариектомизирани при започване на третирането, 3) антипрогестин (I), 1.0 мг/кг/дневно, 4) антипрогестин (I), 0.5 мг/кг/дневно, 5) онапристон, 5 мг/кг/дневно. Като параметър за инхибиране на растежа се проверяват ежеседмично промените в площта на тумора (в % по отношение на първоначалния размер на тумора) чрез измервания с дебеломер (шублер). За статистически анализ за разликите между групите се използват средните стойности съгласно теста на Kruskal Wallis.

Резултати

В интактните контролни животни се наблюдава прогресивно нарастване на тумора, докато при овариектомизираните животни има напълно инхибиране растежа на тумора. Въздействието с антипрогестин (I) в дози от 0.5 или 1.0 мг/кг води да значително инхибиране на туморния растеж в сравнение с контролата (виж фигура 2). Онапристон (5 мг/к е значително по-малко ефективен от антипрогестин (I) при много по-малки дози от 0.5 мг/кг.

Заключение

При модел на NMU- предизвикан тумор на гърдата при плъх, благодарение на силната си способност да предизвиква апоптоза в туморни клетки, антипрогестин (I) напълно потиска растежа на тумора при интактни животни. II двете дози (1.0 мг/кг, както и 0.5 мг/кг) антипрогестин (I) имат значим апоптичен ефект върху туморни клетки.

-Пример 3

Човешки T47D рак на гърдата ксенографт в scid мишки

Материали и методи:

Женски Fox Chase scid мишки (М&В) се допълват с естрадиолни пелети (Innovative Research of America). T47D човешки гръдни ракови клетки, получени от клетъчна култура и суспендирани в матригел, се имплантират подкожно в ингвиналната област на мишките. Третирането започва когато туморите са приблизително с размери 25 мм². Третирането продължава до прогресирането на туморите. Експерименталните групи са: 1) контролна (носител), 2) овариектомизирани, 3) антипрогестин (I), 10 мг/кг подкожно. Туморните площи се определят чрез дебеломер (шублер). Теста на Kruskal - Wallis се използва за статистически анализ на разликите между средните стойности за групите.

Резултати

При T47D модел на рак на гърдата, овариетомията дава значително инхибиране на растежа на тумора в сравнение с бързия растеж при контролата. Фигура 3 показва ясно, че подкожно прилагане на 10 мг/кг антипрогестин (I) също предизвиква апоптоза в туморните клетки. Ефектът на антипрогестин (I) е почти сравним с ефекта от обичайната естроген отстраняваща терапия (овариектомия).

Заключение

Ефектът на антипрогестин (I) в предизвикване на апоптоза и с това инхибиране растежа на човешки T47D рак на гърдата ксенографиран в Fox Chase scid мишки е сравним с ефекта на стандартната естроген отстраняваща терапия (овариектомия), която се счита за максимално ефективен метод за инхибиране растежа на рака на гърдата в този модел.

Пример 4

Човешки MCF-7 рак на гърдата ксенографт в scid мишки

Материали и методи:

•’Женски Fox Chase scid мишки (М&В) се допълват с естрадиолни пелети (Innovative Research of America). MCF7 човешки гръдни ракови клетки, получени от клетъчна култура и суспендирани в матригел, се имплантират подкожно в ингвиналната област на мишките; Третирането започва когато туморите са приблизително с размери 25 мм². Третирането продължавало прогресирането на туморите. Експерименталните групи са: 1) контролна (носител), 2) овариектомизирани, 3) антипрогестин (I), 10 мг/кг подкожно. Туморните площи се определят чрез измервания с дебеломер (шублер). Теста на Kruskal - Wallis се използва за статистически анализ на разликите между средните стойности за групите.

Резултати

При MCF7 модела на рак на гърдата, овариетомията дава значително инхибиране на растежа на тумора в сравнение с бързия растеж при контролата. Фигура 4 ясно показва, че подкожно прилагане на 10 мг/кг антипрогестин (I) предизвиква апоптоза в туморните клетки. Ефектът на антипрогестин (I) е почти сравним с ефекта от обичайната естроген отстраняваща терапия (овариектомия).

Заключение

Ефектът на антипрогестин (I) в предизвикване на апоптоза и с това инхибиране растежа на човешки MCF7 рак на гърдата ксенографиран в Fox Chase scid мишки е сравним с ефекта на стандартната естроген отстраняваща терапия (овариектомия).

Пример 5

NMU-предизвикан рак на гърдата в плъх (хистология, пролиферационен индекс и TUNEL изпитание) Материали и методи

Туморите се предизвикват от единична интравенозна инжекция NMU (нитрометилуреа, 50 мг/кг) при женски Sprague-Dawley плъхове (получени от Tierzucht Schoenwalde, 50 - 55 дни на възраст). Третирането започва 10 дни по-късно, плъхове с най-малко един установен тумор с размер по-голям от 150 мм се третират 7 дни както следва: 1) контрола- разтворител, 2) овариектомизирани при започване на третирането, 3) антипрогестин (I), 3.0 мг/кг/дневно. В края на третирането туморите се изрязват, фиксират във формалин и се поставят в парафин. Хистология, пролиферативен индекс и апоптозно предизвикване се проверява на тези ресектирани тумори.

Хистология: За хистологично изследване отделните пластовете се оцветяват с хематоксилин и се анализират микроскопски.

Пролиферативен индекс: За определяне на пролиферативния индекс се определя експресирането на PCNA. Пролиферативният клетъчен нуклеарен антиген (PCNA) е 36 kD нуклеарен протеин, свързан с клетъчния цикъл. Нуклеарната PCNA имунореактивност се намира в пролиферативния отдел на нормалните тъкани. Моноклонално антитело, което разпознава фиксация и устойчив на обработка епитоп, се използва за изследване неговото разпределение в тъканите.

TUNEL (апоптозен тест): Биохимичата храктеристика на апоптозата е разграждането на геномната ДНК, един необратим процес, който води до клетъчна смърт. Това характерно ДНК фрагментиране е в резултат на активирането на нуклеарната ендонуклеаза, която селективно разцепва ДНК на места разположени между нуклеосомални единици. Тези ДНК верижни разкъсвания се проследяват чрез ензи.матично бележене на 3’-ОН терминалите чрез използване на флуоресцеин-dUTP терминална деооксинуклеотидна трансфераза (TUNEL, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling, cf. Gavrieli et al., J. Cell. Biol. 119, 493, 1992). Включен флуоресцеин се проследява като се използва антифлуоресцеин антитело алкалинов фосфатазен конюгат, последвано от алкалинова фосфатазна субстратна реакция.

Резлтати:

Хистология: След третиране с антипрогестин (I), тъканните отрязъци от NMU-туморите показват диспластични каналовидни и гроздовидни образувания, обикновено запълнени със секреторен материал (фигура 5А).

Нещо повече, обемната фракция на жлезистите структури в туморите се увеличават в сравнение с контролите (фигура 5В). В допълнение, туморите на гърдата на третираните с антипрогестин (I) животни показват диференциирани морфологични характеристики.

Пролиферативен индекс: PCNA имунореактивността е висока в нетретираните с NMU-предизвикан рак на гърдата тъкани (фигура 5С: нетретирана контрола). Броя клетки с PCNA имунореактивност се намалява при въвеждане на диференциация в тъкани от NMU-предизвикан рак на гърдата при плъхове, третирани с антипрогестин (I) (фигура 5D). Тези данни показват, че при рак на гърдата, въздействието с антипрогестин намалява пролиферационният индекс чрез предизвикване на диференциация.

TUNEL (апоптоза): Фигура 5Е показва появата на апоптоза предизвикана от антипрогестин (I) тъкани от NMU-предизвикан рак на гърдата в сравнение с нетретирана контрола (фигура 5 F). Ясно се вижда, че антипрогестин (I) самостоятелно е способен да предизвика апоптоза в тъкани на NMU-предизвикан рак и така да инхибира растежа на тези тумори.

Пример 6

Антипролиферативна активност на антипрогестин (I) in vitro в T47D клетъчна линия

T47D клетки се отглеждат в третиран с въглен серум допълнен с 0.1 нМ Е2 (естрадиол) плюс антипрогестин (I) в продължение на 6 дни с една промяна на средата. След фиксиране и последващо оцветяване с кристалвиолет, отчита се абсорбирането и стойностите се нормализират към абсорбирането на нетретираните с въглен, както е описано от R. В. Lichtner, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, 71; 181 - 189. TUNEL изпитанието се провежда аналогично на горния пример 5 с единствената разлика, че за изпитанието вместо тъканни слоеве се използват клетки, които се култивират на микроскопски стъкла.

Резултати

При този in vitro тест с T47D клетъчна линия, антипрогестин (I) проявява силна инхибираща туморния растеж активност при ефективна прагова концентрация от толкова нисък порядък като 10'⁹ до 10'⁸ мола/л, докато антипрогестина онапристон не показва никакъв инхибиращ ефект. Дори чист антиестроген 11р-флуоро-7а-{5-[Ъ1-метил-Ь1-3-(4,4,5,5,5пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил} -естра-1,3,5(10)-триен-3,17βдиол (WO 98/07740) е значително по-малко ефективен от антипрогестин (I) (виж фигура 6).

Заключение

Антипрогестин (I) съгласно настоящето изобретение предизвиква цялостно инхибиране на естрадиол-стимулиран T47D клетъчен растеж при много ниска концентрация и с това е по-добър от наблюдаваната активност и ефективност на антипрогестини като онапрогестин и на чист антиестроген 11р-флуоро-7а-{5-|~М-метил-М-3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)пропиламино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол.

22/03

ИЗПОЛЗВАНЕ НА АНТИПРОГЕСТИНИ ЗА ПРЕДИЗВИКВАНЕ НА АПОПТОЗА В КЛЕТКА

Област на техниката

Изобретението се отнася до използването на антипрогестини за предизвикване на апоптоза в клетка. По-специално, изобретението се отнася до използването на антипрогестин 11р-(4-ацетилфенил)-υβ-хидрокси-17а(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9-диен-3-он или негови фармацевтично приемливи производни или аналози за предизвикване на апоптоза в клетка. Освен това изобретението осигурява използването на антипрогестини за получаването на лекарство за лечение на тип рак, като рак на гърдата, при който индикатор за висок риск е увеличено количеството на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

Предшестващо състояние на техниката

Антипрогестините представляват относително нов и обещаващ клас терапевтични средства, които биха имали съществено влияние върху лечението на хормонално-зависими тумори и други заболявания. При все че антипрогестините първоначално са създадени с оглед на медицинско нехирургическо прекратяване на бременост, някои антипрогестини са придобили съществено значение в примерно ендокринната терапия на такива ракови заболявания на гърдата, в които участват рецептори за прогбстерон (Т. Maudelonde et al., в: J. G. M. Klijn et al., Hormonal

Manipulation of Cancer: Peptides, Growth Factors and New (Anti) Steroidal Agents, Raven Press, New York, 1987, pp 55 - 59).

Тази нова стратегия в ендокринната терапия се базира на антитуморната активност на антипрогестини в прогестерон рецепторпозитивни човешки клетъчни линии на рак на гърдата in vitro и в няколко хормонално зависими тумори на гърдата на мишка и плъх in vivo. Поспециално, антитуморният механизъм на антипрогестините онапристон и мифепристон (RU 486) е изследван като е използван хормон-зависещ МХТ гръден туморен модел на мишка, както и DMBA- и NMU-предизвикани гръдни туморни модели при плъх (М. R. Schneider et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol., Vol. 25, No. 4, pp. 691 - 701, 1989; H. Michna et al., Breast Cancer Research and Treatment 14: 275 - 288, 1989; H. Michna, J. Steroid. Biochem. Vol. 34, Nos 1- 6, pp. 447 - 453, 1989). Поради малка активност обаче и вредни странични ефекти, свързани например с мифепристон, това съединение не можа да бъде препоръчано като самостоятелно средство при рак на гърдата (D. Perrault et al., J. Clin. Oncol. 1996 Oct, 14(10), pp. 2709 2712). Нещо повече, мифепристон проявява силни антиглюкокортикоидни странични ефекти (виж. L. М. Kettel et al., Fertil. Steril. 1991 Sep, 56(3), pp. 402 -407; X. Bertagna, Psychoneuroendocrinologv 1997; 22 Suppl. 1, pp. 51 55).

Определянето на процента тхморни клетки в съответните фази на клетъчния цикъл може да се осъществи чрез мощен ДНК поточен цитометричен метод (виж. G. М. Clark et al., N. Engl. J. Med. 320, 1989, March, pp. 627 - 633; L. G. Dressier et al., Cancer 61(3), 1988, pp. 420 - 427 и цитираната там литература). Показано бе, че етапите на клетъчния цикъл на туморната клетка и по-специално броя на ту морните клетки в някои етапи на цикъла, могат да бъдат важен клиничен предсказател за прогресирането на болестта и успеха на лечението Броя на клетките в S-фазата на клетъчния цикъл са особно важни в това отношение.

EP Ο 495 825 Bl описва използването на антипрогестини (конкурентен прогестеронов антагонист) за получаването на лекарствени средства за лечение на рак на гърдата, при който има увеличено съдържаноие на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл, което се смята за висок рисков фактор. Това се основава на наблюдението, че антипрогестини са способни да блокират прогресирането на туморни клетки в GoGi- фазата на клетъчния цикъл, водещо до съществено намаляване на туморните клетки в S-фазата. Този ефект обаче не се наблюдава при стандартното лечение на рак на гърдата с тамоксифен, естрогенна терапия или при овариектомия. Антипрогестините, изпитани в ЕР 0 495 825 В1, са 11р-[4-М,М-диметиламино)-фенил]-17а-хидрокси-17р-(3-хидроксипропил)13а-метил-4,9(10)-гонадиен-3-он и 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси-17а(проп-1-инил)-4,9(10)-естрадиен-3-он.

17а-флуороалкилстероиди, притежаващи силна антипрогестинова активност, както и методи за получаването им са описани в WO 98/34947. WO 98/34947 не обсъжда или не изследва ролята, която описаните там 17афлуороал кил стероиди могат да играят в клетъчната апоптоза или в задържане на клетъчния цикъл.

Оценявайки стойността на средства, които предизвикват апоптозиз в клетки, например в случая на туморни клетки, чрез блокиране прогресирането в G(Gi- фазата, желателно е да се идентифицират други средства, например антипрогестини, притежаващи този механизъм на действие. Такива средства биха имали голяма приложение при лечението и предпазването на някои типове рак като рак на гърдата, при който индикатор за висок риск е увел!гченото количество на туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

Техническа същност на изобретението

Изненадващо изследователите са открили, че антипрогестина 11 β-(4ацетилфенил)-17р-хидрокси-17ос-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9диен-3-он (или негови фармацевтично приемливи производно или аналог) могат да се използват за предизвикване на апоптоза в клетка.

Изобретението се базира на неочакваното наблюдение, че 11β-(4ацетилфенил)-17Р-хидрокси-17а-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9диен-3-он (по-нататък ще се означава като “антипрогестин (I)”) предизвиква апоптоза и клетъчна смърт в туморни клетки в стандартни туморни модели на рак на гърдата. Намерено бе, че антипрогестин (I) е способен да предизвика апоптоза в клетки чрез иницииране на терминална диференциация.

'Друг аспект на настоящето изобретение е използването на антипрогестин (I) или негово фармацевтично приемливо производно или аналог за предизвикване на апоптоза в клетка in vitro. Клетката е с предпочитание бозайникова клетка, по-предпочитано човешка клетка и найдобре туморна клетка, при което тумора е с предпочитание рак на гърдата.

Кратко описание на фигурите:

.^Фигура 2 показва инхибиращия ефект върху туморния растеж като резултат на предизвикване на апоптоза от антипрогестин (I) в NMU предизвикан карцином на гърдата при плъх в сравнение с контрола и с овариектомия. Изследването се провежда с 0.5 и 1.0 мг/кг подкожно дневна доза от антипрогестин (I).

Фигура 6 показва инхибиращия ефект върху туморния растеж на антипрогестин (I) в T47D клетъчна линия от рак на гърдата (стимулирано с естрадиол) с ефективна прагова концентрация от 10’ до 10’ мола/л, сравнен с антипрогестина онапристон и чистия антиестроген 11р-флуоро-7а-{5-|Кметшг- №3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}-естра1,3,5(10)-триен-3,17р-диол (WO 98/07740).

Терминът “антипрогестини в контекста на настоящето изобретение включва на първо място всички съединения, които са способни на конкурентно инхибиране на прогестеронови рецептори. Но той също обхваща съединения, които са способни да инхибират биосинтезата на прогестини.

Прилагането на антипрогестин (I) при различни туморни модели се демострира по-долу в примерите при което се вижда, че натрупването на туморни клетки в GoGr фазата на клетъчния цикъл заедно със знаително и биологично релевантно намаляване на броя на клетките в S- и G₂M фазата на клетъчния цикъл. Резултатите показват едно предизвикване на диференциация. Диференциацията - специфично Gi-задържане вече е предложено по-рано за други стволови клетъчни системи (виж. J.J. Wille Jr., Cancer Res. 1982, 42(12):5139 - 46; R. E. Scott, J. Cell. Biol. 1982, 94(2): 400 405).

Средства като антипрогестин (I), които предизвикват апоптоза в клетки, например в случая на туморни клетки, чрез блокиране прогресирането в GoGj- фазата, имат голямо приложение за лечение и предпазване от множество заболявания. Такива средства, включително антипрогестин (I), могат да се изполват за лечение на такъв вид рак, при който индикатор за висок риск е увеличеното количество туморни клетки в

Производството на лекарствени средства може да се осъществи по известни методи. Могат да се използват обичайни известни добавки, както и други подходящи носители или разредители. Подходящи носители и добавки могат да бъдат препоръчаните за фармацията, козметиката и сродни области в Ullmann’s Encyclopedia of Technical Chemistry, Vol. 4, (1953), pp. 1-39; Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 52 (1963), p. 918ff; Η. V. CzetschLindenwald, “Hilfsstoffe fuer Pharmazie und angrenzende Gebiete”; Pharm. Ind. 2, 1961, p. 72ff; Dr. Η. P. Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe fuer Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, Cantor KG, Aulendorf in Wuerttemberg, 1971.

За по-нататъшно подобряване на биодостъпността на активното средство, антипрогестините, подходящи за целите на настоящето изобретение съгласно определението по-горе, могат също да се формулират като цйклодекстринови кпатрати чрез взаимодействие с α-, β- или γ11 циклодекстрини или тяхни производни съгласно описания в РСТ/ЕР95/02656 метод.

Примери на подходящи за използване съгласно изобретението антиестрогени са нестероидните антиестрогени, като тамоксифен и нафоксидин, както и ралоксифен и ЕВ800 и стероидния антиестроген фазлодекс. Примери на стероидни антиестрогени включват описаните в ЕР 0 348 341 А и описаните във WO 98/07740, по-специално 113-флуоро-7а-{5[N-метил- N-3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол или описаните във WO 99/33855, поспециално Пр-флуоро-7а-{5-[метил-(7,7,8,8,9,9,10,10,10-нонафлуородецил)-амино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол или негови фармацевтично приемливи производни или аналози. Като антиестрогени могат да се използват също ароматазни инхибитори, притежаващи антиестрогенен ефект като описания на страници 7 до 8 на ЕР 0 495 825 В1.

Друг аспект на изобртнието е използването на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог за получаването на лекарствено средство за лечението на тип рак, при който индикатор за висок риск е увеличено количество туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл. Броят на туморни клетки в S-фазата може да се определи чрез ДНК поточна цитометрия, както е описано от Dressier et al., “DNA Flow Cytometry and Prognostic Factors in 1331 Frozen Breast Cancer Specimens”, Cancer, Vol. 61(3),

В алтернативен аспект настоящето изобретение осигурява метод за предизвикване на апоптоза в клетка. Клетката е с предпочитание такава на бозайник и най-добре на човек и методът може да се приложи in vitro и in vivo. С предпочитание апоптоза се предизвиква чрез механизъм на иницииране на терминална диференциация, например, чрез прилагане на антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог. При метода антипрогестин (I) или негови фармацевтично приемливо производно или аналог може да се приложи към въпросните клетки. Например в T47D клетъчна линия на рак на гърдата, този растеж се стимулира чрез прилагане на естрадиол, антипрогестин (I) предизвиква напълно инхибиране на растежа на клетките при ефективна прагова концентрация между 10' и 10’ мола (виж пример 8 и фигура 6). Това е особено изненадващо, тъй като известния антипрогестин онапристон няма намаляващ ефект върху клетъчния растеж при този туморен модел. Така, антипрогестин (I) е по-добър по отношение на сила на активността и ефикасността спрямо други антипрогестини като онапристон и по отношение на антиестрогени като тамоксифен и дори по отношение чисти антиестрогени като 11р-флуоро-7а-{5-[Ъ1-метил-Ь1-3-(4,4,5,5,5пентафлу оропентилтио)-пропиламино] -пентил} -естра-1,3,5(10)-триен-3,17 βдиол (WO 98/07740).

Ролята на антипрогестин (I) при предизвикване на апоптоза в клетката показва, че този антипрогестин (или негови фармацевтично приемливо производно или аналог) може да бъде полезен в приемник със състояния, по-специално хормонално-замисими състояния, при които предизвикване на апоптоза е особено желателно. По-специално, той може да се използва при лечението на такива заболявания като рак на гърдата, рак на яйчниците, ендометриален рак, миелома, ановулаторна безплодност, менингома, т.е. заболявания, които по същество произхождат или се повлияват от присъствието на хормонални рецептори и/или по хормоналнозависещи пътища. Антипрогестини като антипрогестин (I) могат освен това да се използват за получаването на лекарствени средства за предизвикване на апоптоза или клетъчна смърт за лечение на хормонално-зависими заболявания, както по-горе бе описано.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1

Изследване на доза-реакция в DMBA-предизвикан туморен модел Материали и методи;

При изследването се използват недоразвити женски Sprague-Dawley плъхове (49 - 51 дни на възраст; 10 животни в група). Туморите в гърдите се предизвикват от единична доза 10 мг орално приложен 7,12диметилбенз[а]антрацен (DMBA, Serva/Heidelberg). Плъхове, при които е установен най-малко един тумор с размер по-голям от 150 мм² се третират в продължение на 4 седмици с: 1) контрола от разтворител, 2) овариектомия при започване на третирането, 3) антипрогестин (I) 0.5 мг/кг подкожно, 4) антшТрогестин (I) 2 мг/кг подкожно, 5) антипрогестин (I) 5 мг/кг подкожно, 6) антипрогестин (I) 10 мг/кг подкожно и 7) онапристон 5 мг/кг подкожно дневно. Като параметър на инхибирането на растежа се проверяват седмично промените в площта на тумора (в % по отношение на първоначалния размер на тумора) чрез измервания с дебеломер (шублер). За статистически анализ за разликите между групите се използват средните стойности съгласно теста на Kruskal - Wallis. За по-нататъшно описание и оценяване в DMBA предпазен модел виж R. G. Metha, European Journal of Cancer 36 (2000), pp. 1275- 1282.

Резултати

Заключение

При модел на DMBA-предизвикан тумор на гърдата при плъх антипрогестин (I) напълно потиска растежа на тумора при интактни животни. Намерено бе, че 2 мг/кг антипрогестин (I) има максимален апоптичен ефект върху растежа на тумора. Антипрогестин (I) е значително по-добър от онапристон по отношение инхибиране на туморния растеж.

Пример 2

Материали и методи:

Резултати

Заключение

При модел на NMU- предизвикан тумор на гърдата при плъх, благодарение на силната си способност да предизвиква апоптоза в туморни клетки, антипрогестин (I) напълно потиска растежа на тумора при интактни животни. И двете дози (1.0 мг/кг, както и 0.5 мг/кг) антипрогестин (I) имат значим апоптичен ефект върху туморни клетки.

-Пример 3

Материали и методи:

Женски Fox Chase scid мишки (М&В) се допълЬат с естрадиолни пелети (Innovative Research of America). T47D човешки гръдни ракови клетки, получени от клетъчна култура и суспендирани в матригел, се имплантират подкожно в ингвиналната област на мишките. Третирането започва когато туморите са приблизително с размери 25 мм². Третирането продължава до прогресирането на туморите. Експерименталните групи са: 1) контролна (носител), 2) овариектомизирани, 3) антипрогестин (I), 10 мг/кг подкожно. Туморните площи се определят чрез дебеломер (шублер). Теста на Kruskal - Wallis се използва за статистически анализ на разликите между средните стойности за групите.

Резултати

Заключение

Пример 4

Материали и методи:

Женски Fox Chase scid мишки (М&В) се допълват с естрадиолни пелети (Innovative Research of America). MCF7 човешки гръдни ракови клетки, получени от клетъчна култура и суспендирани в матригел, се имплантират подкожно в ингвиналната област на мишките. Третирането започва когато туморите са приблизително с размери 25 мм². Третирането продължава до прогресирането на туморите. Експерименталните групи са: 1) контролна (носител), 2) овариектомизирани, 3) антипрогестин (I), 10 мг/кг подкожно. Туморните площи се определят чрез измервания с дебеломер (шублер). Теста на Kruskal - Wallis се използва за статистически анализ на разликите между средните стойности за групите.

Резултати

Заключение

Пример 5

NMU-предизвикан рак на гърдата в плъх (хисто.тогия, пролиферационен индекс и TUNEL изпитание) Материали и методи

Туморите се предизвикват от единична интравенозна инжекция NMU (нитрометилуреа, 50 мг/кг) при женски Sprague-Dawley плъхове (получени от Tierzucht Schoenwalde, 50 - 55 дни на възраст). Третирането започва 10 дни по-късно, плъхове с най-малко един установен тумор с размер по-голям от 150 мм² се третират 7 дни както следва: 1) контрола- разтворител, 2) овариектомизирани при започване на третирането, 3) антипрогестин (I), 3.0 мг/кг/дневно. В края на третирането туморите се изрязват, фиксират във формалин и се поставят в парафин. Хистология, пролиферативен индекс и апоптозно предизвикване се проверява на тези ресектирани тумори.

Хистология: За хистологично изследване отделните пластовете се оцветяват с хематоксилин и се анализират микроскопски,

TUNEL (апоптозен тест): Биохимичата храктеристика на апоптозата е разграждането на геномната ДНК, един необратим процес, който води до клетъчна смърт. Това характерно ДНК фрагментиране е в резултат на активирането на нуклеарната ендонуклеаза, която селективно разцепва ДНК на места разположени между нуклеосомални единици. Тези ДНК верижни разкъсвания се проследяват чрез ензиматично бележене на 3’-ОН терминалите чрез използване на флуоресцеин-dUTP терминална деооксинуклеотидна трансфераза (TUNEL, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling, cf. Gavrieli et al., J. Cell. Biol. 119, 493, 1992). Включен флуоресцеин се проследява като се използва антифлуоресцеин антитело алкалинов фосфатазен конюгат, последвано от алкалинова фосфатазна субстратна реакция.

Резлтати:

Нещо повече, обемната фракция на жлезистите структури в туморите се увеличават ^ сравнение с контролите (фигура 5В). В допълнение, туморите <· на гърдата на третираните с антипрогестин (I) животни показват диференциирани морфологични характеристики.

Пример 6

Резултати

При този in vitro тест с T47D клетъчна линия, антипрогестин (I) проявява силна инхибираща тум орния растеж активност при ефективна прагова концентрация от толкова нисък порядък като 10’⁹ до 10'⁸ мола/л, докато антипрогестина онапристон не показва никакъв инхибиращ ефект. Дори чист антиестроген 11р-флуоро-7ос-{5-[К-метил-Ь1-3-(4,4,5,5,5пентафлуоропентилтио)-пропиламино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17рдиол (WO 98/07740) е значително по-малко ефективен от антипрогестин (I) (виж фигура 6).

Заключение

Антипрогестин (I) съгласно настоящето изобретение предизвиква цялостно инхибиране на естрадиол-стимулиран T47D клетъчен растеж при много ниска концентрация и с това е по-добър от наблюдаваната активност и ефективност на антипрогестини като онапрогестин и на чист антиестроген 11р-флуоро-7ос-{5-[П-метил-М-3-(4,4,5,5,5-пентафлуоропентилтио)пропиламино]-пентил}-естра-1,3,5(10)-триен-3,17р-диол.

Claims

1. Използване на антипрогестина 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси17а-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9-диен-3-он или негови фармацевтично приемливо производно или аналог за предизвикване на апоптоза в клетка.

2. Използване съгласно претенция 1, при което предизвикването на апоптоза се причинява чрез иницииране на терминална диференциация.

3. Използване съгласно предходната претенция, при което клетката е на бозайник.

4. Използване съгласно претенция 3, където бозайниковата клетка е човешка.

5. Използване съгласно предходната претенция, при което клетката е туморна клетка.

6. Използване съгласно претенция 5, където туморът е рак на гърдата.

7. Използване съгласно предходните претенции, при което лекарственото средство съдържа още и антиестроген.

8. Използване на антипрогестина 11р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси17а-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-4,9-диен-3-он или негови фармацевтично приемливо производно или аналог за получаване на лекарствено средство за лечение на тип рак, при който индикатор за висок риск е увеличеното количество туморни клетки в S-фазата на клетъчния цикъл.

9. Използване съгласно претенция 8, при което заболяването е рак на гърдата.

10. Метод за предизвикване на апоптоза в клетки, характеризиращ се с това, че включва прилагане на ефективно количество от на антипрогестина 11 р-(4-ацетилфенил)-17р-хидрокси-17а-(1,1,2,2,2-пентафлуороетил)-естра-

4,9-диен-З-он или негови фармацевтично приемливо производно или аналог към клетка in vitro.

11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че клетката е туморна клетка на бозайник.

12. Метод съгласно претенции 10 или 11, характеризиращ се с това, че клетката е от рак на гърдата.

Патентни претенции