JPH0789909B2 - ハイブリドーマセルラインの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はハイブリドーマ細胞系
(セルライン)の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ハイブリドーマは、雑種を形成するため
に、「不死化」細胞(特に骨髄腫細胞)を、特定物質を産生
する能力により通常選択した「正常」非形質転換細胞
(例、抗体を産生するリンパ球細胞)と融合させることに
よって形成される細胞に適用する用語である。これらの
雑種は、単一の構造および／または性質を有する物質を
産生する細胞系を得るために選択し、クローン化するこ
とができる。特に、リンパ球で形成されるかかるハイブ
リドーマは、モノクローン抗体を製造するのに使用する
ことができる。近年のハイブリドーマ技術の開発は、安
定で、取得希望の特定物質を高収率かつ特異的に産生す
る細胞系を得ることに向けられてきた。この問題につい
て各種のアプローチがなされたが、歴史的理由により、
免疫グロブリン／抗体の分野に大きく集中していた。こ
の分野での従前の活動を研究すると、直面した問題の類
別の大要と、今までに試みられた各種の解決法を概観で
きる。モノクローン性生産物を製造する雑種セルライン
の研究の最初の衝動は、生産物がモノクローン抗体であ
る免疫生物学の分野から発生した。通常の抗血清は、抗
原結合部位において構造的には異なるがそれぞれ大また
は小なる持続性および／または特異性でもって同じ抗原
に結合する非常に多数の抗体を一般に含有している。加
えてまた、通常の抗血清は、他の抗原に対するもので、
抗血清が得られる宿主個体の以前の防御反応を反映する
多数の抗体を含有している。ほとんどの目的には、かか
る広範な抗血清で充分であるが、よりすぐれた特異性や
再現性を与えることが特に診断と療法の分野において重
大な前進をもたらし、すばらしい能力をもつ科学的手段
を付与することになるであろうと考えられた。最初であ
り且つ現在では古典的な解決法は、ＫohlerとＭilstein
がＮature,２５６,４９５〜４９７(１９７５)に報告し
たが、彼らは免疫化マウス脾臓細胞を薬物感受性マウス
骨髄腫細胞に融合させることに成功した。こうして不死
化した融合細胞はインビトロで生育しそして単一細胞レ
ベルからクローン化して、均質な抗体集団(モノクロー
ン抗体)を産出する均質な細胞集団を製造することがで
きた。多くのユニークな細胞から選択し、且つ選択的な
再クローニングによって、所望の抗原特異性をもつ抗体
を産生する細胞を取得し、生育することが可能となっ
た。このような方法で製造されたマウス抗体は、研究や
診断の目的には有用であることが証明されており、また
あるものはヒトの治療にさえ用いられていた。しかし、
同様な特異性と再現性のヒト抗体がこの方法で得ること
ができるのであれば、ヒトの免疫グロブリン療法におい
て大きな前進となるであろう。またこのことは感作の危
険性を減少するであろう。

【０００３】インビトロでかかるヒト抗体を製造する問
題へのアプローチがいくつか試みられたが、それらは現
在のところ大きく成功していない。これらには以下のこ
とが挙げられる。 (i)Ｅpstein−Ｂarrウイルス(ＥＢＶ)による正常なヒト
リンパ球の形質転換。このタイプの細胞は樹立するに長
くて冗長な工程を必要とし、またクローンおよび選択す
ることが非常に困難であるので、この方法はほとんど成
功しなかった。 (ii)ヒト骨髄腫細胞との正常な(ヒト)リンパ球の融合。
この方法はマウス−マウスハイブリドーマの法に明らか
に類似性を表わしているが、ヒト系ではただ一つの骨髄
腫細胞系のみしか容易に入手できないという問題に直面
し、またこの系は融合の成功を妨害するマイコプラスマ
でもって汚染されていることが判明した。 (iii)ＥＢＶ−形質転換ヒトリンパ芽球様のＢ細胞系へ
の正常なヒトリンパ球の融合。おそらくこれはすでに報
告されたものでは最も確実で再現性ある方法であるが、
リンパ芽球様細胞が出会う基本的なインビトロの欠点を
もつ。上記細胞はクローン化することが非常に困難であ
る。またＢ細胞分化系統の早期段階に該当するので、そ
れらの抗体を産生し分泌する能力が真性骨髄腫のそれよ
り約１０倍低い。 (iv)マウス骨髄腫へのヒトリンパ球の融合。この方法は
マウス−マウスハイブリドーマと同様に優れたインビト
ロ特性を有する細胞を製造し得るが、それは雑種が固有
の遺伝学的不安定性を有するという大きな欠点を備えて
いる。これから生ずる厄介な結果の１つは、免疫グロブ
リンの軽カッパー鎖を形成するためのゲノムが位置する
ヒト染色体を上記細胞が追放するということである。 従って、要約すれば、方法(i)は実施するにはあまりに
も冗長で非能率的である。方法(ii)は未だ実用的意義を
有していない。方法(iii)は現在利用可能なものでは最
良である。方法(iv)は実行可能であるが、細心の注意を
払うクローニング手段でもってしても生産性を維持でき
ない。以上の検討も現在までのほとんどの研究も抗体製
造に集中しているが、生産性ある細胞パートナーを、取
得希望の特定物質の分泌に関して選択し、また不死化セ
ルラインに融合できるということが明らかである。

【０００４】

【発明の記載】今回、他の細胞に更に融合させるために
親として異種間ハイブリドーマ細胞を使用することによ
り、安定性を大きく改良されたハイブリドーマを得るこ
とができるということが判明した。従って、本発明は、
不死化細胞が異種間ハイブリドーマ細胞であり、予定さ
れた物質を産生する細胞が異種間ハイブリドーマの非形
質変換パートナーと遺伝学的に適合できることを特徴と
する、上記予定物質産生細胞に融合された不死化細胞を
含むハイブリドーマセルラインの提供を可能とする。か
かる細胞の安定性は、正しく培養される場合に抗体の如
き予定された物質の産生を維持する能力をもたらす。あ
る具体例においては、不死化細胞として選択された異種
間ハイブリドーマは、免疫グロブリンを産生するそれ自
体の能力を失った骨髄腫雑種である。かかる異種間ハイ
ブリドーマの具体例は、骨髄腫細胞とリンパ球細胞の間
のものであると思われる。適切な骨髄腫細胞の具体例
は、マウスとラットから得られたものであり、免疫グロ
ブリンは産生しないものが好ましい。これらの骨髄腫は
それ自体、実際上骨髄腫の性質をもつ雑種(例、マウス
骨髄腫／マウスリンパ球)であり得る。かかる細胞は例
えばマウスＳＰ−２骨髄種セルラインである。次いでこ
れを例えば、他の種から得られるリンパ球(例、ヒトリ
ンパ球細胞)に融合させる。好ましい実施態様では、免
疫グロブリンをもはや産生しないかかる融合で生ずる異
種間ハイブリドーマを、物質産生細胞に更に融合させる
ために選択する。これらの異種間ハイブリドーマは、染
色体喪失の点ですぐれた安定性を得るため、より一層好
適な環境を与える。不死化に使用する異種間ハイブリド
ーマは、通常の方法で更に融合する以前に薬剤耐性にす
る。方法の例は８−アザグアニン耐性に関する選択であ
る。このようにして得られるハイブリドーマは、更に融
合するための安定な親を与える。他の融合パートナー
は、予定物質を産生する能力で選択したもので(例えば
抗体の産生の場合リンパ球の選択である)、異種間ハイ
ブリドーマの非形質変換パートナーと遺伝学的に適合す
るものである。必要度の特異性を得るには、選択細胞を
あらかじめ感作して所望物質産生性にすることが望まし
い。このことは例えば抗体の場合には、特定抗原でもっ
て宿主を免疫化し次いで対応する抗体を産生する免疫細
胞(即ち、免疫適格細胞)を採集することによって達成で
きる。これらは例えば脾臓、リンパ節または血球であり
得る。

【０００５】異種間ハイブリドーマ細胞である親の物質
産生細胞への融合は、通常の方法で行なう。これには通
常、融合を促進する物質(例、ＰＥＧ１５００)と共に適
当な培地で同等量の各細胞をインキュベートすることが
含まれる。所望の雑種の選択も、通常の方法でよく、選
択培地(例、不死化細胞がヒポキサンチンホスホリボシ
ル転移酵素を含有しない場合にはＨＡＴ(ヒポキサンチ
ン／アミノプテリン／チミジン))で実施することができ
る。得られるセルラインは安定で、抗体を高収率で産生
する。これらはクローン化することもでき、また要すれ
ば再選択することもできる。従って、本発明は安定なハ
イブリドーマセルラインの製造法に関し、該方法は異種
間ハイブリドーマ細胞である親を好ましくは薬剤耐性に
し、これを異種間ハイブリドーマの非形質変換パートナ
ーと遺伝学的に適合する物質産生細胞に融合させ、そし
て所望の雑種を選択することから成る。これら細胞を使
用する抗体製造は、適当な培地(例、希釈牛胎児血清を
含むもの)でインビトロでまたは宿主(例、ヌードまたは
無胸線のマウスまたはラット)への注入および腹水液の
収穫によってインビボで、通常の方法によって実施する
ことができる。方法の選択により、一つまたはそれ以上
の精製工程が必要となり得る。本発明はまた、かかる細
胞系を使用する抗体の製造を可能にする。所望の性質を
有する単純ハイブリドーマセルラインが経済的理由によ
り好ましいことは明らかであるが、所望または必要であ
れば、かかるセルラインを更に融合することも可能であ
る。本発明による典型的な抗体産生ハイブリドーマは、
親としてのヒトリンパ球と融合したマウス骨髄種を抗体
産生者としての前感作ヒトリンパ球と融合させて形成さ
れるものである。適当な場合には、骨髄種細胞自体が
(例えばマウス／マウス雑種自体であるＳＰ−２マウス
細胞系のように)雑種であり得る。

【０００６】通常の技術と従前の研究を述べている文献
の例は以下の通りである。 (１) Ｋohler,Ｇ.およびＭilstein,Ｃ.Ｎature,２５
６,４９５−４９７(１９７５) (２) Ｎadler,Ｌ.Ｍ.等Ｃancer Ｒesearch,４０,３１
４７−３１５４(１９８０) (３) Ｃosimi,Ａ.Ｂ.等Ｎ,Ｅng１.Ｊ.Ｍed.,３０５,３
０５−３１４(１９８１) (４) Ｚurawski,Ｖ.Ｒ.等Ｓcience,１９９,１４３９−
１４４１(１９７８) (５) Ｋoskimies,Ｓ.,Ｓcand.Ｊ.Ｉmmunol.,１１,７３
−７７(１９８０) (６) Ｓteinitz,Ｍ.等Ｎature,２８７,４４３−４４５
(１９８０) (７) Ｏlsson,Ｌ.およびＫaplan,Ｈ.Ｓ.,Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.Ｕ,Ｓ.Ａ.,７７,５４２９−５４３１(１９
８０) (８) Ｃroce,Ｃ.Ｍ.等Ｎature,２８８,４８８−４８９
(１９８０) (９) Ｎowinski,Ｒ.等Ｓcience.２１０,５３７−５３
９(１９８０) (10) Ｃroce,Ｃ.Ｍ.等Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.
Ａ.,７６,３４１６−３４１９(１９７９) (11) Ｇalf
re,Ｇ.等Ｎature２６６,５５０(１９７７) (12) Ｍiller,Ｒ.Ａ.等Ｎ.Ｅngl.Ｊ.Ｍed.３０６,５１
７(１９８２) (13) Ｓikora Ｋ.,等Ｌancet,i １１(１９８２)およ
び例えば米国特許第４１７２１２４号、ＥＰ出願公開第
００４３７１８号と００４４７２２号。 また、Ｍclntyreによってモノクローン抗体に関する書
籍が最近発行されている。異種間融合の親(これは予定
物質産生能力を喪失している)を使用することによっ
て、本発明は、安定、急速な成長、クローン容易であ
り、所望物質(例、ヒト抗体)の高産生率を有するハイブ
リドーマの取得を可能にする。本発明に従って製造され
るヒト抗体は、通常の如く抗体に使用できる。かかる使
用分野の例は以下の通りである。 感染症: ウイルス(サイトロメガロウイルス、帯状痘疹
ウイルス、単純ヘルプスウイルス、肝炎ＡおよびＢウイ
ルス、風疹ウイルス等)、バクテリア(抗毒素、抗細胞
壁)、 真菌(カンジダ)悪性疾患: 毒素の抱合ありおよびなしに
かかわらずあらゆる種類の悪性腫瘍に対する抗体 中毒: 抗毒物抗体(解毒薬、ジギタリス、オピエート
剤、三環性抗うつ剤、バルビツレート剤等) 抗イデイオタイプ: 抗・抗膵臓β細胞、抗・抗アセチル
コリンレセプター、抗リウマチ様因子 血液型抗原: 抗Ｒh 移植: 拒絶を抑制する抗Ｔ細胞、移植片の刺激能力を減
少する強化抗体 アレルギー: アレルゲンに対するＩgＧ抗体、感受性減
退化の代換物 ホルモン: 避妊薬として使用する絨毛性性腺刺激ホルモ
ン抗体 ハイブリドーマ細胞自体は、免疫グロブリン遺伝子のク
ローニングを試みる場合にはmＲＮＡ源としても使用で
きる。

【０００７】本発明の特定の実施態様においては、元来
Ｐ３−Ｘ６３−Ａg８系と羊の赤血球細胞に対する抗体
を産生するマウス脾臓細胞のハイブリドーマ自体であっ
たＳＰ−２細胞系であって抗体産生能力を喪失したもの
が使用される(Ｃ.Ｆ.Ｍ.Ｓhulmann等,Ｎature,２７６,
２６９(１９７８))。これは例えばＮＩＧＭＳ Ｈuman
Ｇenetic Ｍutant Ｃell Ｒepository Ｒef.ＧＭ３５６
６９Ａから入手できる(ＵＳ ＤＨＨＳ １９８２ Ｃatal
og of ＣellＬines 参照)。このセルラインは、通常の
技術によって薬剤耐性にされ次いで正常なヒト抹消リン
パ球と融合される(Ｃ.Ｆ.Ｇ.Ｇalfre等,Ｎature,２６
６,５５０(１９７７)およびＲ.Ｎowinski等Ｓcience,２
１０,５３７(１９８０))。多数の雑種を得、約５週間後
に急速な成長を示し且つ抗体を産生しない５クローンを
選択する。これらの細胞を８−アザグアニン耐性に関し
て選択し、かかる系の３つでもって、２０μg／mｌの８
−アザグアニンに耐性の変異体を得ることが可能であ
る。これらの細胞は同時にヒポキサンチン−アミノプテ
リン−チミジン(ＨＡＴ)培地に感受性であり、これらが
ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素を産生する能力
を喪失していることを示す。これらのセルライン(ＳＰ
ＡＺ−４)の一つを、次いで２×１０⁷ＳＰＡＺ−４細胞
と１０⁸扁桃腺細胞を使用して、ヒト扁桃腺リンパ球と
インビトロで融合させる。融合は標準法に従って実施す
る。比較のために、ＳＰ／２セルラインも融合させる。
得られる細胞集団を、必要な雑種を回収するためにＨＡ
Ｔ培地で選択する。非融合対照培養物の全細胞が死滅す
ると直ちに、ＨＡＴ培地を正常な非選択性生育培地と置
きかえる。生育２週間後に抗体産生について最初の試験
を行い、各融合からの４７培養体の全部がヒト抗体を産
生したことが判明する。更に４週間後に再試験すると、
ＳＰ／２ハイブリドーマの５５％に対してＳＰＡＺ−４
ハイブリドーマの８３％が未だに抗体を産生しているこ
とが認められる。ＳＰ／２ラインのわずか３％に対して
ＳＰＡＺ−４の２８％において、高い産生率が認められ
る。抗体産生喪失の主たるファクターがＬ鎖ゲノムの喪
失であるという事実にかんがみ、軽鎖産生の特異的試験
を行う。ＳＰＡＺ−４ラインの６７％がカッパー鎖、そ
の８８％がラムダー鎖を生産することが認められる。Ｓ
Ｐ／２の対応する値はそれぞれ３９％と６１％である
(勿論、これらのパーセント値は特定の試験と使用免疫
グロブリン(１g)についてのみ比較可能である)。結果は
第１表に示す。すべての場合において、ＳＰＡＺ−４が
ＳＰ／２より優れており、特に実用的見地からして最も
重要である強力な生産性に関して優れている。これらの
すべての実験を、安定なクローンに対する圧力を最大に
するために、非クローン細胞について行う(安定なクロ
ーンは多くの遺伝物質を有し、彼らに不必要な染色体の
追放に成功した細胞よりも常に成長が悪い)。しかし、
細胞をクローンするために実験を行った。現在までに得
られた結果では、安定で生産性のＳＰ／２雑種はただ１
つも得られなかったことを示す(即ち、すべての生育細
胞が抗体を産生するセルラインはない)が得られること
を示す。他方、ＳＰＡＺ−４雑種ではかかるクローンを
誘導することが可能である。本発明は、不安定性問題の
解決により、従来の公知方法よりも実質的に良好な結果
を得ることを可能にする。古典的なマウス−マウスハイ
ブリドーマが不安定であり、そしてわずらわしいサブク
ローニングが常に必要であるとしても、それが実用に供
し得ることは一言の価値がある。ＳＰＡＺ−４ハイブリ
ドーマの示す不安定度はマウス−マウスハイブリドーマ
のそれよりも低いので、後者はより一層実用的でさえあ
る。

【０００８】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。 実施例１: ＳＰＡＺ−４系の製造 Ｆicoll−Ｉsopaque遠心分離によって、健康な提供者の
ヘパリン化血液から末梢血液リンパ球(ＰＢＬs)を単離
する。洗浄後、pＨ８.０に調節したＤulbeccosＨ２１培
地５０mｌ中の５×１０⁷ＳＰ／２細胞と１０⁸ＰＢＬsを
混合する。細胞を６００×gで５分間ペレット化し、そ
の後上澄液を注意深く除去する。細胞を３７℃に保ちな
がら、５０％ＰＥＧ４０００／Ｈ２１の１mｌを１分で
徐々に加える。更に１０mｌのＨ２１を２分で加える。
細胞を遠心分離によって集め(ペレット化)、５５mｌの
ＨＡＴ培地に懸濁し(ＨＡＴ培地: ２０％胎児牛血清１
０％ＮＣＴＣ１０９、１％非必須アミノ酸、０.５％ピ
ルビン酸塩、０.２Ｕ／mｌインスリン、１mＭオキサル
酢酸、１０^-4ヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテ
リンおよび１.６×１０^-3Ｍチミジンを含むＤulbeccos
Ｈ２１)、平底組織培養マイクロプレート中の０.１mｌ
培養物５２８個に播種する。２週間毎３〜５日で新しい
ＨＡＴ培地を培養物に与え、その後培地をＨＴ培地(１
０％ＦＣＳ、１０^-4ヒポキサンチンおよび１.６×１０
^-3チミジンを含むＤulbeccos Ｈ２１)に変える。１５日
後ヒト抗体試験のために試料を取る。良好な成長を示し
抗体産生を示さない５個の培養物を選択する。次いでこ
れらを８−アザグアニン耐性サブラインの製造に選択す
る。１０％ＦＣＳおよび２０μg／mｌ８−アザグアニン
を含むＤulbeccos Ｈ２１に５個のセルラインを２×１
０⁵細胞／mｌで播種する。これらの培養物の３個から、
二、三週間後に生育成長する細胞を回収することができ
る。これらの１個はＨＡＴに感性のＳＰＡＺ−４であ
り、更に試験するのに使用する。

【０００９】実施例２: 扁桃腺リンパ球との融合 小児から扁桃腺を結合組織部で切り取り、微細金属網を
通過させて、単一細胞プレパラートを得る。赤血球の数
を減ずるために、全細胞をＦicoll−Ｉsopaqueで分画す
る。得られる細胞集団の１０⁸の細胞を、実施例１で述
べたのと同じ方法でもって２×１０⁷のＳＰＡＺ−４ま
たはＳＰ／２細胞に融合させる。その後細胞をＨＡＴ培
地の培養物０.５mｌの４７個に播種し、この時にシクロ
スポリンＡ０.５μg／mｌを補給する。１日後にシクロ
スポリンＡを含まないＨＡＴ培地０.５mｌを加える。３
日目にすでに培地の５０％がＨＴ培地に変化する。この
後毎３〜５日の経過でもって細胞をＨＴ培地に維持す
る。 免疫グロブリン製造試験 従来のＥＬＩＳＡ(固相酵素免疫検定)システムを使用す
る。pＨ９.６の重炭酸塩緩衝剤中１:４００の希釈でウ
サギ抗ヒト免疫グロブリンをＮunc ＥＩＡプレートに捕
捉させる。該プレートを洗浄後、培養上清を３７℃で３
０分インキュベートする。再度洗浄後、１:４００の希
釈でペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヒトＩgＧ、ＩgＭ、
ＩgＡ試剤(Ｍiles−Ｙeda)でインキュベーション物を処
理する。洗浄後酵素反応物を１,２−フェニレンジアミ
ン二塩酸塩とＨ₂Ｏ₂で発色させる。ヤギ抗ヒトラムダー
またはヤギ抗ヒトカッパー試剤(Ｔago)を１:３０００の
希釈でウサギ抗ヒトＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＡの代わりに使
用する以外は同じ方法で、軽鎖産生試験を行う。結果を
Ｔitertek Ｍultiscan Ｅlisa 光度計で評価し、第１表
の「４」と「７」の値をこの光度計からの低い読みと高い読
みとしてそれぞれ表示する。

【００１０】実施例３: インフルエンザＡおよびＢ型に
対するモノクローン抗体の製造(インビボ免疫後) 使用したインフルエンザワクチンは、Ａ／バンコック、
Ａ／ブラジルおよびＢ／シンガポールからの赤血球凝集
素とノイラミニダーゼを含む商品名ＳＡＮＤＯＶＡＣで
ある。３人の健康な志願者を免疫化し、３、７、１０、
１４および１７日に採血する。各回５０〜６０mｌの血
液をひじ静脈からヘパリン含有注射器へ抜く。リンパ球
をＦicoll−Ｐaque(Ｐharmacia)上の遠心分離によって
単離し、使用前に塩水で２回洗う。融合の親は a) ＳＰＡＺ−４(実施例１参照) b) ＳＰ／２(上記参照) c) ＷＩＳＴＡＲ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥで８−アザグア
ニン耐性にしたＧＭ１５００ヒトリンパ芽球様細胞(ヒ
トＩgＧ２カッパーを産生する) である。ＳＰＡＺ−４とＳＰ／２は全く同じに融合す
る。骨髄腫(１０⁷細胞)とヒトリンパ球(約３×１０⁷細
胞)を、pＨ８.０でＤＭＥＭ無血清培地の存在下試験管
で混合する。細胞を６００×gで５分遠心分離にかけ
る。得られるペレットを５０％ＰＥＧ４０００で１分処
理し、その後ＰＥＧを培地で徐々に希釈する。１回洗浄
後、２０％胎児牛血清を含むＤＭＥＭ−ＨＡＴ培地の１
００μｌ培養物１７６個に細胞を播種する。細胞を湿気
のある１０％ＣＯ₂−大気で３７℃で培養する。ＧＭ
１５００細胞(１０⁷細胞)をpＨ８.０の無血清ＤＭＥＭ
中でヒトリンパ球(約３×１０⁷細胞)と混合し、６００
×gで５分遠心分離する。ペレットを５０％ＰＥＧ６０
００で５分処理し、その間に細胞を６００×gで遠心分
離する。この後ＰＥＧを培地で徐々に希釈する。１回洗
浄後、２０％胎児牛血清を含むＲＰＭＩ １６４０−Ｈ
ＡＴ培地の１００μｌ培養物１７６個に細胞を播種す
る。細胞を湿気のある５％ＣＯ₂−大気で３７℃で培養
する。６１６０個の培養物(ＧＭ１５００により２６４
０体、ＳＰＡＺ−４により２４６４体、ＳＰ／２により
１０５６体)を行ない全体で３５個の融合(ＧＭ１５００
に１５体、ＳＰＡＺ−４に１４体、ＳＰ／２に６体)を
得る。一般に毎３〜５日間で、細胞増殖が必要とすると
きはいつでも、培地を培養物に変える。上澄液に抗イン
フルエンザ抗体が存在することをＥＬＩＳＡ法で検定す
る。関連インフルエンザ抗原をマイクロプレートウエル
(Ｎunc)に捕捉し、上澄液を加え、抗原と相互作用させ
る。洗浄後ぺルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヒトＩgＧ、
ＩgＡ、ＩgＭ(Ｍiles)をウエルに加える。インキュベー
ション後非結合ペルオキシダーゼ抱合体を洗浄除去し、
酵素発色物質をウエルに加える。反応を視覚で評価し、
Ｔitertekマイクロプレート光度計で証明する。陽性結
果を示す培養物を、マウス胸線細胞供給細胞と共に１０
０μｌのＤＭＥＭ＋２０％胎児牛血清中に(ＳＰＡＺ−
４およびＳＰ／２由来細胞)、またはＭＲＣ−５供給細
胞のＲＰＭＩ １６４０＋２０％胎児牛血清中にＧＭ
１５００由来細胞)、１細胞／培養物で細胞を播種する
８８個の新しいウエルに限界希釈条件でクローン化す
る。生産性細胞は大スケールで生育させ、液体Ｎ₂中に
凍結する。合計８６個の培養物をクローン化した(ＧＭ
１５００から５８体、ＳＰＡＺ−４から２６体、ＳＰ
／２から２体)。細胞をクローン化すべきであるか否か
については、その決定に全く自由な基準を適用するがこ
れはクローン化後に真に陽性の細胞の収率が低い結果を
招き得る。。例えばＧＭ １５００は高産生細胞を製造
しないのでこの決定が必要となる。ＳＰＡＺ−４細胞か
らは４個の陽性クローンが確認され、ＳＰ／２からは１
個が確認されるが、しかし後者は雑種ではなく、自然に
生起したＥＢウイルス形質変換細胞であった。産生細胞
はＧＭ １５００からは誘導されない。融合の結果を下
記表に要約して示す。

【００１１】

【表１】

【００１２】５個の陽性セルラインを数回再クローン
し、大スケールで成長させる。これはＥＢＶ系の消滅を
もたらす(かかる細胞コロニーが低密度クローニングを
生存させないことはよく知られている)。４個の陽性Ｓ
ＰＡＺ−４ハイブリドーマセルラインをＣ１５、Ｃ２
８、Ｃ２９およびＣ７５として確認した。

【００１３】実施例４: 抗インフルエンザハイブリドー
マの製造(インビトロ免疫後) ヒト脾臓細胞をＦalcon２０５１チューブ中の２mｌに１
０⁶／mｌで播種し、全体で３４℃１０⁶の細胞を使用す
る。最適量の庶糖濃度勾配精製Ａ／バンコックウイルス
を加え、培養物を５％ヒト熱不活化血漿を含むＲＰＭＩ
１６４０培地で空気中５％ＣＯ₂の雰囲気下３７℃で１
０１時間維持する。回収した９×１０⁶細胞を実施例３
に述べたのと同様にして同数のＳＰＡＺ−４細胞に融合
する。細胞を１７６個の培養物に播種し、２０％胎児牛
血清、ＨＡＴおよび１μg／mｌシクロスポリンＡを含む
ＤulbeccosのＭＥＭで成長させる。２日後ＨＡＴ培地を
ＨＴ培地で次第に置換し、その後４〜５日の間隔で変え
る。融合後１２日と１９日目に培養物を抗インフルエン
ザ抗体についてスクリーニングし、陽性培養物をクロー
ン化する。陽性クローン(Ｂ₂として確認)を得、これは
大スケールで成長させることができ、また薬剤用の純粋
抗体をインビトロで製造するのに使用することができ
る。

【００１４】実施例５: ヒト抗インフルエンザモノクロ
ーン抗体の特性確認 a) 抗体／Ｃ１５ この抗体はＩgＧ１クラスのものであり、カッパー軽鎖
を有する。抗体は試験したすべてのインフルエンザＡ型
ウイルス(Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２)に反応し、そ
れは恐らくウイルスの核タンパクに向けられている。抗
体はインビトロで中和活性を有せず、またインビボで保
護効果を有していない。 b) 抗体／Ｃ２８ この抗体はＩgＧ１クラスのものであり、ラムダー軽鎖
を有している。抗体はＨ３Ｎ２型のインフルエンザウイ
ルスに反応するのみであり、それは恐らくウイルスの赤
血球凝集素に向けられている。抗体はインビトロで強い
中和効果を有し、またインビボで劇的な保護活性を有し
ている。それは試験したすべてのＨ３Ｎ２ウイスル(即
ち、１９６８、１９６９、１９７３、１９７４、１９７
５、１９７７、１９７９および１９８０からのウイル
ス)を中和することができる。ＭＤＣＫ細胞上の１９７
３Ａ／ポートチャーマーズで試験すると、純粋抗体１.
５ｍｇ／mｌを含む抗体製品は、中和価１２８００を有
することが認められる。同一実験において、標準ヒト免
疫グロブリン製剤(Ｓandoglobulin)は濃度６０ｍｇ／m
ｌで中和価５０を有することが認められる。このこと
は、モノクローン抗体Ｃ２８がタンパク質当量レベルで
正常な免疫グロブリンよりも１０２４０倍高い能力を有
していることを意味している。これに関連して、抗イン
フルエンザ抗体が正常な免疫グロブリン製剤の越的成分
一つであるということを指摘したい。このことは、Ｃ２
８と同じ中和能力を有し、例えばサイトメガロウウイル
スまたは帯状痘疹ウイルス(この場合正常な免疫グロブ
リン製剤の抗体レベルはかなり低い)に対する抗体は、
相対的能力がより一層高い値に達することを意味する。 c) 抗体／Ｃ２９ この抗体はＩgＧ１クラスのものであり、ラムダー軽鎖
を有している。抗体はＢ／シンガポール型インフルエン
ザに反応する。他のＢ型ウイルスに対する試験は行わな
かった。Ａ型ウイルスに対しては活性を有していない。 d) 抗体／Ｃ７５ この抗体はＩgＧ３クラスのものであり、カッパー軽鎖
を有している。これはＨ３Ｎ２型ウイルスに反応するの
みであり、恐らくはウイルスの赤血球凝集素に向けられ
ている。これはインビトロで中和活性を有せず、インビ
ボで保護効果を有しない。 e) 抗体／Ｂ２ この抗体はＩgＧ１クラスのものであり、カッパー軽鎖
を有している。これはＨ３Ｎ２型ウイルスに反応するの
みであり、恐らくはウイルスの赤血球凝集素に向けられ
ている。抗体はインビトロで中和効果を有せず、インビ
ボ保護試験は行わなかった。

【００１５】

【表２】

【００１６】本発明により実施可能となるものを列挙す
ると次の通りである。 １．不死化細胞が異種間ハイブリドーマ細胞であり、予
定物質産生細胞が異種間ハイブリドーマの非形質転換パ
ートナーと遺伝学的に適合することを特徴とする、上記
予定物質産生細胞に融合した不死化細胞を含むハイブリ
ドーマセルライン。 ２．物質産生細胞が異種間ハイブリドーマ細胞母体の非
形質転換パートナーと同一種のものである上記第１項記
載のハイブリドーマセルライン。 ３．物質産生細胞パートナーと、異種間ハイブリドーマ
細胞母体の非形質転換パートナーがヒト起源のである上
記第２項記載のハイブリドーマセルライン。 ４．産生物質が抗体である上記第１〜３項のいずれか１
項記載のハイブリドーマセルライン。 ５．物質産生細胞が予定物質を産生するようにインビト
ロまたはインビボで前感作されている上記第４項記載の
ハイブリドーマセルライン。 ６．物質産生細胞がリンパ球である上記第１〜５項のい
ずれか１項記載のハイブリドーマセルライン。 ７．リンパ球がヒト起源のものである上記第６項記載の
ハイブリドーマセルライン。 ８．リンパ球が抗体を産生するようにインビボまたはイ
ンビトロであらかじめ感作されている上記第６または第
７項記載のハイブリドーマセルライン。 ９．異種間ハイブリドーマ細胞の骨髄腫パートナーが免
疫グロブリンを産生しないネズミ骨髄腫である上記第１
〜８項のいずれか１項記載のハイブリドーマセルライ
ン。 10．ネズミ骨髄腫がマウス骨髄腫である上記第９項記載
のハイブリドーマセルライン。 11．マウス骨髄腫がＳＰ−２細胞系によってもたらされ
る上記第１０項記載のハイブリドーマセルライン。 12．異種間ハイブリドーマ細胞母体が予定物質を産生す
る能力を失っているかまたは他の理由で産生することが
できない上記第１〜１１項のいずれか１項記載のハイブ
リドーマセルライン。 13．マウス骨髄腫細胞と親細胞としてのヒトリンパ球の
融合による異種間ハイブリドーマ細胞および物質産生細
胞としてのあらかじめ感作された抗体産生ヒトリンパ球
を含む上記第１〜１２項のいずれかのハイブリドーマセ
ルライン。 14．異種間ハイブリドーマ細胞を薬剤耐性にし、これを
異種間ハイブリドーマの非形質転換パートナーと遺伝学
的に適合する物質産生細胞に融合させ、そして所望の雑
種を選択することを特徴とする安定なハイブリドーマセ
ルラインの製造法。 15．使用する融合パートナーを上記第１〜１３項のいず
れかに述べたものから選択する上記第１４項記載の方
法。 16．薬剤耐性を８−アザグアニンに耐性の細胞から選択
することによって達成する上記第１４または１５項記載
の方法。 17．融合をこれを促進する物質の存在下に行う上記第１
４〜１６項のいずれか１項記載の方法。 18．促進物質がポリエチレングリコールである上記第１
７項記載の方法。 19．所望雑種の選択を、ＨＡＴ感受性の欠如と予定物質
産生能力の検定を基礎として行う上記第１４〜１８項の
いずれか１項記載の方法。 20．異種間ハイブリドーマ細胞である親と物質産生細胞
を、これら細胞の融合促進剤と共に栄養培養培地に含む
ことから成る細胞融合システム。 21．細胞パートナーが上記第１〜１３項のいずれかに述
べられているものである上記第２０項記載の細胞融合シ
ステム。 22．融合促進剤がポリエチレングリコールである上記第
２０または２１項記載の細胞融合システム。 23．上記第１〜１３項のいずれかのまたは上記第１４〜
１９項のいずれかに従って製造されたハイブリドーマセ
ルラインをそのためのインビトロまたはインビボ培養培
地で培養し、その後該培地から予定物質を単離すること
を特徴とする該物質の製造法。 24．得られる物質が抗体である上記第２３項記載の方
法。 25．インビボ培養を無胸線(ヌード)マウスまたはラット
中で行う上記第２３または２４項記載の方法。 26．ハイブリドーマセルラインを製造するために細胞融
合においてパートナーとして使用するものである上記第
９〜１３項のいずれか１項記載の異種発生性ハイブリド
ーマセルライン。 27．マウス／ヒト／ヒトハイブリドーマセルライン。 28．予定の特異性を有するヒト抗体を産生可能な安定な
マウス／ヒト／ヒトハイブリドーマセルライン。 29．マウス細胞がマウス／マウスハイブリドーマ自体で
ある上記第２７または２８項のハイブリドーマセルライ
ン。 30．抗体産生能力を喪失している薬剤耐性のマウス／ヒ
トハイブリドーマを製造し、別のヒト染色体に好都合な
環境を与え且つ抗体産生維持に高安定性を示すヒト化マ
ウス骨髄腫細胞を構築することを特徴とする、長期間に
わたってヒト抗体を産生するセルラインの製造法。 31．通常の方法でＳＰ−２セルラインを正常なヒトリン
パ球と融合させ、抗体産生なしに急速成長を示す取得雑
種からクローンを選択し、これを更に８−アザグアニン
耐性に関して選択し、これを再びヒトリンパ球と融合さ
せ、そしてＨＡＴ培地中で得られた細胞集団を選択する
ことを特徴とする上記第３０項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マウス骨髄腫細胞と親細胞としてのヒト
   リンパ球の融合による異種間ハイブリドーマを不死化細
   胞とし使用し、これを異種間ハイブリドーマの元になっ
   た形質転換されてないパートナー細胞と遺伝学的に融合
   する目的抗体産生ヒトリンパ球に融合させ、そして目的
   とする雑種を選択することを特徴とする、安定なハイブ
   リドーマセルラインの製造法。
2. 【請求項２】 異種間ハイブリドーマをリンパ球と融合
   させる前に薬剤耐性にする、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。
3. 【請求項３】 融合が異種間ハイブリドーマとリンパ球
   を細胞融合促進剤含有栄養培養培地中で培養することに
   よって行われる、特許請求の範囲第１項記載の方法。