CN114652748A - 一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用 - Google Patents

一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，所述的医用妇科洗液组分重量百分数为：3～7％干细胞抑菌因子溶液、1～3％儿茶素、0.5～2％小檗碱、0.5～2％大蒜素、1～3％卡波姆、2～6％甘油、1～3％维生素E醋酸酯和纯化水。本发明以干细胞抑菌因子和中药单体为主要活性成分，对皮肤刺激性小，不易引发过敏反应，无毒，无残留，安全有效。干细胞抑菌因子通过与抗菌活性成分协同的作用来抗炎和抗感染。大蒜素、儿茶素、小檗碱具有明确的抗菌活性，可以多组分协同增效，特别是小檗碱作用于细菌代谢的多个途径及细菌产生致病性的多个过程，对多种微生物均有不同程度的抑制效果。本发明主要通过在阴道壁形成一层保护膜，将阴道壁与外界细菌物理隔离，从而阻止病原微生物定植。适用于宫颈炎、阴道炎引起的阴道充血、瘙痒、疼痛、分泌物增多的症状。

Description

一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于妇科用药技术领域，更具体地，涉及一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用。
背景技术
宫颈炎为宫颈受损伤和病原体侵袭而致，包括子宫颈阴道部炎症及子宫颈管黏膜炎症。临床上将宫颈炎分为急性和慢性两种，以慢性炎症为多。宫颈炎可用御外法治疗，主要为抗生素治疗，以全身治疗为主，力求彻底，以免转变为慢性宫颈炎。该治疗方法副作用大，往往在停药后又反弹复发，不能彻底，容易引起人体内分泌紊乱等后果。阴道炎主要是由于细菌、寄生虫的入侵感染，阴道的自然防御功能受到破坏或阴道内菌群失调所致，其主要分为细菌性阴道病(占有症状女性22％～50％)、念珠菌性阴道炎(17％～39％)、滴虫性阴道炎(4％～35％)等。一般阴道炎的药物治疗常采用抗菌为主，比如采用抗生素或其他抗菌药达到杀灭微生物的目的，但长期口服抗生素可能抑制正常菌群，会出现用药有所缓解，但是停药后，阴道炎又卷土重来的现象，这种反复现象一方面使得各种病原体产生了耐药性，另一方面加剧了阴道内菌群的失衡。
市场上常见的妇科洗液种类较多，主要是西药成分为主的西药类洗剂，西药类洗剂通过消除表面或者黏膜上的微生物，以达到杀菌消毒目的；但在制造使用的过程中会因为冲洗而破坏了阴道酸碱度，产生刺激性，导致致病菌含量升高，会影响到使用者的安全健康，有时会引起严重过敏反应。而本发明则以来自天然药物的中药单体和来源于细胞活性组织的干细胞抑菌因子为主要成分，对皮肤刺激性小，不易引发过敏反应，疗效确切，毒性低甚至无毒。
间充质干细胞制备得到的干细胞抑菌因子具有抑菌消炎作用。干细胞抑菌因子可以通过与直接抗菌活性协同作用的间接作用来帮助解决炎症或感染，还表现出间接的生物效应，包括趋化因子和抗内毒素活性，有助于根除感染。干细胞抑菌因子与细胞表面或细胞内的不同分子靶点相互作用。其介导的细胞杀伤通过破坏细胞膜的完整性、抑制蛋白质、DNA或RNA的合成以及与某些细胞内靶点的相互作用而发生。
中药在抗细菌、真菌、病毒、肿瘤等方面都有良好的作用。近年来的研究表明中药中所含有的中药单体及其有效成分可以达到杀菌、消炎的作用。中药单体来源于天然植物，无毒副作用，疗效确切，抗菌作用强，用药浓度低；在体内外均有抗菌及抗细菌毒素的作用；且不易使细菌产生耐药性，同时在阴道炎、宫颈炎的治疗上也有很好的疗效。
发明内容
针对现有的治疗药物和手段中的不足，本发明旨在提供一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，所述的医用妇科洗液组分重量百分数为：3～7％干细胞抑菌因子溶液、1～3％儿茶素、0.5～2％小檗碱、0.5～2％大蒜素、1～3％卡波姆、2～6％甘油、1～3％维生素E醋酸酯和纯化水。
间充质干细胞来源外泌体可以调控固有免疫与适应性免疫应答。通过抑制T淋巴细胞功能、降低B细胞的活化增殖与分泌、影响巨噬细胞分化与树突细胞成熟、抑制自然杀伤细胞的细胞毒活性来发挥其免疫调控作用。间充质干细胞能够分泌细胞因子CCL2从而促进抗菌肽的表达，进而提高角质形成细胞的抗菌活性。抑菌因子具有杀菌止痒、除湿除味、清宫养巢、修复损伤、预防感染的作用，能够促进细胞的增殖分化，有助于修复溃烂面，加速皮肤和黏膜创伤愈合。
儿茶素属于黄烷醇类化合物，占茶叶干重的20％左右，是茶叶中多酚类物质的主要化学成分。大量的研究表明，儿茶素有很好的抑菌效果。其抑菌特点主要有：抗菌谱广，对有细胞壁和无细胞壁的革兰氏阳性、阴性菌均有明显的抑制作用；抗菌作用强，用药浓度低；在体内外均有抗菌及抗细菌毒素的作用；保护和促进有益菌生长，调节菌群平衡；不易使细菌产生耐药性，能与多种抗生素产生协同抑菌作用。
小檗碱，又称黄连素，是从黄连等中草药中分离提取得到的一种异喹啉类生物碱。小檗碱的抗菌作用是最早为人所知且用于临床的。作为广谱抗菌药，小檗碱能够通过减少细菌表面的菌毛数量，抑制革兰阳性菌和阴性菌菌体的附着。传统上认为小檗碱是一个多靶点化合物，可以作用于细菌代谢的多个途径及细菌产生致病性的多个过程，对多种微生物均有不同程度的抑制效果，尤其是对革兰阴性菌中的痢疾杆菌效果明显。与一般抗生素相比，虽然小檗碱的抗菌作用相对较弱，但是由于小檗碱使用安全，相对不易产生耐药。
大蒜素是从大蒜的球形鳞茎中提取的挥发性油状物，具有强烈刺激味和蒜所特有的辛辣味，是大蒜主要生物活性成分。大蒜素现已证实具有较强的抗菌功效，大蒜素可抑菌杀菌，对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有害菌有明显抑制和杀灭作用，对有益菌如乳杆菌则无抑制作用，而且大蒜素无毒副作用，无药物残留，无耐药性，不造成环境污染，价格低廉，是抗生素的替代品，是人类健康的保证。
本发明选用具有抑菌作用，不会破坏自身酸碱性，也不会滋生致病菌，来自于天然中药的多种中药活性成分和来源于细胞活性组织的干细胞抑菌因子为原料，制成妇科洗液，对皮肤、人体外阴和阴道黏膜等刺激性小，安全温和无毒性，与皮肤接触后，能够在皮肤表面形成一层保护薄，将阴道壁与外界细菌物理隔离，阻止病原微生物定植，并将各种药物包裹在保护膜内部，使得药物能够充分与皮肤接触，提高药效。本发明能够有效地预防及治疗宫颈炎、阴道炎引起的阴道充血、瘙痒、疼痛、分泌物增多的症状。
本发明妇科洗液主要由以下步骤制成：
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3～6天进行换液，待细胞融合达到80～85％时，用0.2～0.3％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P2～P5代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向恒温纯化水中依次加入儿茶素、小檗碱、大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、卡波姆、干细胞抑菌因子溶液、甘油、维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH值至4.0～4.5，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
优选的，所述纯化水的温度为60～75℃。
附图说明
图1试验组与对照组对阴道炎的治疗效果对比
图2试验组与对照组对宫颈炎的治疗效果对比
图3医用妇科洗液、普立净阴道冲灌洗液对大肠杆菌的抑菌效果
图4医用妇科洗液、普立净阴道冲灌洗液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果
图5医用妇科洗液、普立净阴道冲灌洗液对白色念珠菌的抑菌效果
图6医用妇科洗液、普立净阴道冲灌洗液对淋病奈瑟氏菌的抑菌效果
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步的详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到85％时，用0.2％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P5代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向60℃恒温纯化水中依次加入3％儿茶素、0.5％小檗碱、2％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、3％卡波姆、3％干细胞抑菌因子溶液、2％甘油、3％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.5，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例2
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每4天进行换液，待细胞融合达到84％时，用0.22％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P4代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向62℃恒温纯化水中依次加入2.8％儿茶素、0.8％小檗碱、1.8％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、2.8％卡波姆、4％干细胞抑菌因子溶液、2.5％甘油、2.8％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.4，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例3
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每5天进行换液，待细胞融合达到83％时，用0.25％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向65℃恒温纯化水中依次加入2.5％儿茶素、1％小檗碱、1.5％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、2.5％卡波姆、5％干细胞抑菌因子溶液、3％甘油、2.5％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.3，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例4
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每6天进行换液，待细胞融合达到82％时，用0.28％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P2代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向68℃恒温纯化水中依次加入2.2％儿茶素、1.2％小檗碱、1.2％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、2.2％卡波姆、5.5％干细胞抑菌因子溶液、4％甘油、2％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.2，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例5
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每5天进行换液，待细胞融合达到81％时，用0.3％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向70℃恒温纯化水中依次加入2％儿茶素、1.5％小檗碱、1％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、2％卡波姆、6％干细胞抑菌因子溶液、5％甘油、1.8％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.1，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例6
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每4天进行换液，待细胞融合达到80％时，用0.28％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P4代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向72℃恒温纯化水中依次加入1.5％儿茶素、1.8％小檗碱、0.8％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、1.5％卡波姆、6.5％干细胞抑菌因子溶液、5.5％甘油、1.5％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例7
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3天进行换液，待细胞融合达到81％时，用0.25％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P3代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向75℃恒温纯化水中依次加入1％儿茶素、2％小檗碱、0.5％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、1.2％卡波姆、6.8％干细胞抑菌因子溶液、5.8％甘油、1.2％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.5，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
实施例8
(1)取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每4天进行换液，待细胞融合达到82％时，用0.22％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P5代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
(2)向75℃恒温纯化水中依次加入1.2％儿茶素、0.5％小檗碱、2％大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(3)将混合液、1％卡波姆、7％干细胞抑菌因子溶液、6％甘油、1％维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH至4.3，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
本发明用实例5所制得的医用妇科洗液，做以下临床试验：
试验一 对阴道炎临床疗效的试验
选取阴道炎患者100例，年龄24～55岁。随机分为试验组(使用实例5所制得的医用妇科洗液)，对照组(使用普立净阴道冲灌洗液)。两组在年龄、病情和病程等方面无显著差异(P>0.05)。
具体的使用方法如下：患者取卧位或者是半卧位，在阴道冲洗器当中倒入20mL洗液，然后插入阴道，推进溶液，保持5min左右，每日2次，2周为1个疗程，连续治疗3个疗程。
疗效判定标准：本文将疗效分4个等级，即治愈、显效、好转和无效。①治愈：主要是指患者的症状消失，白带性状恢复正常，阴部炎症消失，阴道白带镜检为阴性。②显效：主要是指患者临床症状消失，炎症减轻，但是阴道白带镜检依然为阳性。③好转：主要是指患者的各种临床症状有所改善，炎症减轻，阴道镜检为阳性。④无效：患者的各种症状、炎症都没有好转。
疗程结束后，试验组的治疗总有效率(94.0％)高于对照组(56.0％),见表1。试验组与对照组对阴道炎的治疗效果对比见图1。
表1 阴道炎治疗效果对比(n＝50)
Figure BDA0003567882920000071
安全性观察：本试验在治疗过程中及治疗后所用两组药物处于安全范围，在临床观察中均未发现明显不良反应与副作用(皮肤过敏、皮肤瘙痒、皮疹、水泡、头晕、恶心等)，治疗前后患者体温、脉搏、呼吸、血压、血常规、尿常规、肝功能、肾功能均未见明显异常。
试验二 对宫颈炎临床疗效的试验
选取60例宫颈炎患者，随机分为试验组(使用实例5所制得的医用妇科洗液)，对照组(使用普立净阴道冲灌洗液)。两组患者的年龄、病程及病情等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。
具体的使用方法如下：患者取卧位或者是半卧位，在阴道冲洗器当中倒入20mL洗液，然后插入阴道，推进溶液，保持5min左右，每日2次，2周为1个疗程，连续治疗3个疗程。
疗效评价标准：本文将疗效分4个等级，即治愈、显效、好转和无效。①治愈：实验室病原体检查结果呈阴性，且外阴瘙痒、白带异常、腰腹部不适等临床症状和体征完全消失。②显效：实验室病原体检查结果呈阴性，且相关临床症状显著改善，但有一项仍未达标。③好转：实验室病原体检查结果呈阳性，但相关临床症状有所改善。④无效：实验室病原体检查结果呈阳性，且相关临床症状无改善或加重。
疗程结束后，试验组的治疗总有效率(90.00％)高于对照组(60.00％),见表2。试验组与对照组对宫颈炎的治疗效果对比见图2。
表2 宫颈炎治疗效果对比(n＝30)
Figure BDA0003567882920000081
安全性观察：本试验在治疗过程中及治疗后所用两组药物处于安全范围，在临床观察中均未发现明显不良反应与副作用(皮肤过敏、皮肤瘙痒、皮疹、水泡、头晕、恶心等)，治疗前后患者体温、脉搏、呼吸、血压、血常规、尿常规、肝功能、肾功能均未见明显异常。
试验三 抑菌试验
取菌液均匀涂布于营养琼脂培养基上，每个平板内打2个圆孔，向圆孔里分别加入试验组实施例5制得的医用妇科洗液50μL和对照组普立净阴道冲灌洗液50μL。将需氧菌于电热恒温培养箱内37℃培养1d，厌氧菌先放入厌氧罐后置于同一培养箱内37℃培养2d，待培养好后，测量平板上抑菌圈的直径。
抑菌标准：测量抑菌环直径，直径大于7mm者，判为有抑菌作用；小于或等于7mm者判为无抑菌作用。
经检测，该洗液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、淋病奈瑟氏菌均有较好的抑菌效果，见表3、图3～图6。图3至图6中左侧抑菌圈为普立净阴道冲灌洗液的抑菌效果；右侧抑菌圈为洗液的抑菌效果。
表3 抑菌试验结果
Figure BDA0003567882920000082
Figure BDA0003567882920000091
注：“+”表示有抑菌作用；“－”表示无抑菌作用。
试验四 干细胞抑菌因子抑菌实验
采用酶标比浊法检测干细胞抑菌因子的抑菌情况，取6支试管分为抗生素组：肉汤+金黄色葡萄球菌+双抗；干细胞抑菌因子组：肉汤+金黄色葡萄球菌+干细胞抑菌因子，每组3支。
将试管放置在温度37℃摇床中过夜，调整转速为300r/min。24h后，96孔板每孔用移液枪移取100μL植入，取1个空白孔只加肉汤作为系统调零以便去除造成的系统误差，使用酶标仪测吸光度值。根据得到的OD值计算出抗生素组、干细胞抑菌因子组的抑菌率，结果见表4。
表4 各组OD值与抑菌率检测结果比较(n＝3)
Figure BDA0003567882920000092
结果显示，抗生素组、干细胞抑菌因子组抑菌率分别为99.5％、98.7％，都具有较强的抑菌作用。
综上所述表明，一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液能够有效地预防及治疗宫颈炎、阴道炎引起的阴道充血、瘙痒、疼痛、分泌物增多的症状，且优于普立净阴道冲灌洗液的治疗作用，具备临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明范围内的技术方案均属于本发明的保护范围。在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润色，均应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，其特征在于，该医用妇科洗液包含以下质量百分数的组分：3～7％干细胞抑菌因子溶液、1～3％儿茶素、0.5～2％小檗碱、0.5～2％大蒜素、1～3％卡波姆、2～6％甘油、1～3％维生素E醋酸酯和纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，其特征在于，干细胞抑菌因子溶液制备方法如下：取间充质干细胞，注入已添加血清、双抗、谷氨酰胺的DMEM培养基，放入CO2培养箱中培养。每3～6天进行换液，待细胞融合达到80～85％时，用0.2～0.3％胰蛋白酶进行消化，并传代培养到P2～P5代后，更换无血清的培养基培养2d，收集上清液，离心取出细胞及细胞碎片，再用超滤法收集外泌液，得干细胞抑菌因子溶液。
3.根据权利要求2所述的一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，其特征在于，干细胞抑菌因子溶液制备中所使用的间充质干细胞为胎盘间充质干细胞、脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向恒温纯化水中依次加入儿茶素、小檗碱、大蒜素，搅拌溶解后得到混合液；
(2)将混合液、卡波姆、干细胞抑菌因子溶液、甘油、维生素E醋酸酯和剩余的纯化水加入搅拌罐，搅拌均匀，调整pH值至4.0～4.5，灌入推进器中，得一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液。
5.根据权利要求4所述的一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，其特征在于，步骤(1)中纯化水的温度为60～75℃。
6.根据权利要求1所述的一种含有干细胞抑菌因子的医用妇科洗液的制备方法及其应用，在治疗宫颈炎、阴道炎引起的阴道充血、瘙痒、疼痛、分泌物增多等症状中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115737523A (zh) * 2022-11-28 2023-03-07 深圳市合一康生物科技股份有限公司 基于细胞复合因子的女性抑菌修复护理液

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