CN113893260A - 莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用。本发明研究首次提供了莫纳皮拉韦能够通过直接杀伤病毒、阻断病毒的复制以及阻断病毒对正常细胞的吸附作用等多种途径实现抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒活性的效果，在抵御病毒感染的同时对正常细胞的毒性较小。基于上述特性，本发明提供莫纳皮拉韦作为抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒活性成分的应用，可用于抗牛病毒感染的药物或饲料添加剂。本发明提供的应用为莫纳皮拉韦开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗牛感染病毒药物奠定实验基础并提供新的视野。

Description

莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用
技术领域
本发明属于抗牛感染病毒药物技术领域，具体涉及莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用、包含莫纳皮拉韦的药物组合物及用于预防和/或治疗牛感染病毒的药物。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
牛规模化养殖具有可观的经济收益，病毒性感染是威胁牛养殖业的重要因素。其中，如牛流行热、牛肠道病毒感染等具有发病率高、传播速度快的特点。牛流行热(bovineephemeral fever，BEF)又名牛暂时热、牛三日热，是由牛流热病毒(bovine ephemeralfever virus，BEFV)引起的一种牛急性热性传染病。近年来在我国频繁发生。牛肠道病毒(Bovine Enterovirus，BEV)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员，于1959年被Moll和Davis首次报道后，现已在全世界主要养牛国家和地区普遍发现与流行，在我国多个地区的牛场已有发现，可以导致牛发生多种综合征，其主要通过粪口途径传播，传染源主要为病牛和无症状的病毒携带者，感染牛肠道病毒的牛表现为轻度下痢和轻微呼吸道症状，食欲下降，严重者甚至便血，产奶量大幅下降，给养牛业造成了严重的经济损失。
尽管本领域对于上述病毒的生物学特征有深入了解，但病毒的流行病学特征及致病机制仍然知之甚少，目前用于牛病毒感染的治疗药物主要为利巴韦林，种类较为单一。因此，当前迫切需要发展特异有效的预防及治疗药物和手段来遏制牛肠道病毒病毒的危害。
莫纳皮拉韦(Molnupiravir)属于核苷抑制剂，其最初是为治疗流感而开发的一种小分子化合物。是一种高效的可口服的核糖核苷类似物，在病毒复制时取代正常的核糖核苷酸，从而阻止病毒的复制，属于广谱抗冠状病毒药物，包括新型冠状病毒。但迄今尚未有关于莫纳皮拉韦用于预防或治疗牛流行热病毒的报道。
发明内容
本发明研究证实了莫纳皮拉韦能够有效抑制牛流行热病毒或牛肠道病毒，可直接杀灭病毒、阻断病毒复制及降低病毒感染机体细胞的能力，有效实现抑制病毒感染，切断病毒传播，具有良好的兽药开发前景。
基于上述技术背景，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，提供莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用。
所述莫纳皮拉韦具有如下式Ⅰ所示的结构：
Figure BDA0003381696610000021
除了上述结构所对应的小分子化学实体，本发明还提供上述化合物药学上可接受的盐或酯或溶剂化物、互变异构体、内消旋体、外消旋体、立体异构体、代谢产物或前药；除此之外，本发明还提供莫纳皮拉韦的修饰物或晶型结构；例如为了改善药物溶解性或代谢性能所进行的成盐修饰、成酯修饰及晶型化合物等；或为了改善化合物的透膜性能与穿膜活性成分偶联后的物质。
上述第一方面所述“牛感染病毒”表示具有感染牛并导致发病的病毒，包括本领域常见的口蹄疫病毒、恶性卡他热病毒、牛瘟病毒、粘膜病病毒、牛疱疹病毒Ⅰ型、牛流行热病毒、副流感病毒3型、茨城病毒、牛白血病病毒、赤羽病病毒、轮状病毒、朊病毒、牛肠道病毒等。
进一步，本发明效果较好的实施方式中，提供莫纳皮拉韦作为抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒活性成分的应用。
优选的，所述“作为抗病毒活性成分的应用”包括但不限于以下任意一种：
(1)应用于制备抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒相关产品；
(2)施用于有治疗需要的个体，以改善病毒感染症状；
(3)用于牛饲料的添加。
上述第(1)方面所述“相关产品”包括但不限于药物或模型药剂；其中，所述模型药剂用于制备一种牛流行热病毒或牛肠道病毒抑制模型。
经本发明验证，莫纳皮拉韦可以通过直接杀伤病毒、阻断病毒的复制以及阻断病毒对正常细胞的吸附作用等多种途径实现抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒活性的效果。基于上述验证结果，本领域技术人员不难想到将莫纳皮拉韦应用于牛流行热病毒或牛肠道病毒感染机制或抗病毒活性成分筛选、疾病模型的构建等非治疗用途的研究，例如，用于筛选抗牛肠道病毒或牛流行热病毒活性成分，或用于制备一种牛流行热病毒或牛肠道病毒感染抑制模型。
上述第(2)方面所述“施用于有治疗需要的个体”，所述施用方式包括但不限于通过饮食、饮水、口服、注射或介入方式将药物递送至感染部位。
上述第(3)方面所述“用于牛饲料的添加”中，所述莫纳皮拉韦可作为一种饲料添加剂、预混料或药物性添加剂用于饲料的添加。
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中包括莫纳皮拉韦，及药学上所必需的载体。
优选的，所述药物组合物中，还包括其他可能存在的具有抗病毒活性的成分。
优选的，所述药学上所必需的载体包括但不限于药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
优选的，所述药物组合物中，还包括除莫纳皮拉韦之外的至少一种药物活性成分，施用莫纳皮拉韦与其它至少一种药物活性成分的组合时，可以增强这种作用。作为其它药物活性成分的替代或补充，莫纳皮拉韦还可以与其它非药物活性成分组合使用。
另外，上述药物组合物中所述莫纳皮拉韦的药物剂量属于本领域技术人员依据治疗目的可以常规确定的技术内容，当莫纳皮拉韦与其他具有抑制、杀灭或者协助杀灭病毒的活性成分联合使用时，可能适当降低莫纳皮拉韦的使用剂量。
本发明第三方面，提供一种预防和/或治疗牛感染病毒的药物，所述药物中，所述莫纳皮拉韦和/或第二方面所述药物组合物作为活性成分。
根据本发明，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于治疗牛肠道病毒病毒相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。
所述抗牛感染病毒的药物表示用于治疗或预防牛机体中由病毒感染引发的相关疾病。在优选的方案中，所述抗牛感染病毒的药物表示一种物质，其对牛肠道病毒或牛流行热病毒具有明显的抑制杀灭作用，在药物有效浓度范围内，其对吸附阻断作用、复制阻断有作用，对病毒的直接杀灭效果尤为显著。
优选的，所述药物的剂型为本领域兽药常见剂型，包括液体制剂、气体制剂、固体制剂或半固体制剂；所述液体制剂包括注射剂、溶液剂、浇淋剂、喷滴剂或酊剂等；所述固体制剂包括散剂、粉剂、预混剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂等；所述半固体制剂包括软膏剂、浸膏剂、糊剂等。
本发明第三方面，提供一种牛饲料添加剂，所述饲料添加剂中包括莫纳皮拉韦和/或第二方面所述药物组合物。
本发明第四方面，提供一种通过预防牛感染病毒的方法，所述预防方法包括向预防需要的个体施用预防剂量的莫纳皮拉韦和/或第二方面所述药物组合物。
本发明第五方面，提供一种牛感染病毒相关疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向治疗需要的个体施用治疗剂量的莫纳皮拉韦和/或第二方面所述药物组合物。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
本发明首次发现化合物莫纳皮拉韦能够有效抑制牛流行热病毒、牛肠道病毒的增殖，且对正常细胞的毒性相对较小，经实验证明，莫纳皮拉韦对BHK-21细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)大于等于100μM，而对BEFV病毒的半数有效浓度(EC50)为100μM；对BEFV的治疗指数大于等于1，对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)为50μM，而对牛肠道病毒病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM；莫纳皮拉韦对牛肠道病毒病毒的治疗指数为1，该结果表明莫纳皮拉韦具有开发成为抗牛流行热病毒、牛肠道病毒药物的前景，为莫纳皮拉韦开辟了新的药物用途，也为开发高效特异的抗BEFV药物奠定实验基础并提供新的视野。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1所述莫纳皮拉韦抗BEFV损伤细胞的作用图；
其中，图1A为病毒对照组；图1B为BHK-21正常细胞组；图1C为感染细胞药物试验组(使用100μM莫纳皮拉韦)。
图2为实施例1所述莫纳皮拉韦对BHK-21细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图。
图3为实施例1所述莫纳皮拉韦对BEFV的半数有效浓度(EC50)图。
图4为实施例1所述莫纳皮拉韦对BEFV直接杀伤作用效果图。
图5为实施例1所述莫纳皮拉韦对BEFV吸附的阻断作用效果图。
图6为实施例1所述莫纳皮拉韦对BEFV复制的阻断作用效果图。
图7为实施例2所述莫纳皮拉韦抗BEV损伤细胞的作用图；
其中：其中图7A为病毒对照组；图7B为MDBK正常细胞组；图7C为感染细胞药物试验组(施用50μM莫纳皮拉韦)。
图8为实施例2所述莫纳皮拉韦对MDBK细胞的半数细胞毒性浓度(CC50)图。
图9为实施例2所述莫纳皮拉韦对BEV的半数有效浓度(EC50)图。
图10为实施例2所述莫纳皮拉韦对BEV直接杀伤作用效果图。
图11实施例2所述莫纳皮拉韦对BEV吸附的阻断作用效果图。
图12实施例2所述莫纳皮拉韦对BEV复制的阻断作用效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，病毒感染对于牛养殖业具有严重威胁性，为了解决如上的技术问题，本发明提供了莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1莫纳皮拉韦的抗牛流行热病毒活性
1、牛流行热病毒TCID50的测定
将BHK-21细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将BEFV连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设3个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表1 TCID50 of BEFV
Figure BDA0003381696610000061
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数,并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算BEFV的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(2.67-0.5)＝-3.17
TCID50＝10-3.17/0.1mL
即将该病毒稀释103.17接种100μL可使50％的细胞发生病变。
2、莫纳皮拉韦对BHK-21细胞的毒性实验
BHK-21细胞是BEFV的易感细胞。因此，首先检测莫纳皮拉韦对BHK-21细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(BHK-21 1×104个/孔)。
(2)培养至BHK-21单层后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL 2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养1h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算莫纳皮拉韦的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图2所示。
结果：莫纳皮拉韦出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定莫纳皮拉韦半数中毒浓度大于等于100μM。
3、莫纳皮拉韦对BEFV的抑制实验
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个BHK-21细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 100TCID50的BEFV稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照100μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)72h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图3所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对BEFV的有效抑制率。从结果可以看出，莫纳皮拉韦在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对BEFV的半数有效浓度(EC50)为100μM。莫纳皮拉韦对BEFV的治疗指数大于等于1。
4、化合物不同时间加入对BEFV复制的影响
将莫纳皮拉韦分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的100TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用4h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50。
结果：莫纳皮拉韦与BEFV预先作用的给药方式下，通过分析软件，莫纳皮拉韦对BEFV的作用效果如图4所示。从图4中可以看出，在这种作用式下，莫纳皮拉韦在安全浓度范围内对BEFV具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对BEFV吸附的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的100TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，72h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率。
结果：通过分析软件，莫纳皮拉韦对BEFV的作用效果如图5所示，结果显示，在安全浓度范围内莫纳皮拉韦能阻止BEFV对细胞的吸附作用。
(3)药物对BEFV复制的阻断作用
按每孔1×104个的细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的100TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本实施例同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，72h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论。
结果：通过分析软件，莫纳皮拉韦对BEFV的复制阻断作用效果如图6所示，结果显示，在安全浓度范围内，莫纳皮拉韦对BEFV有一定的抑制作用。
本发明应用实施例以BHK-21细胞为载体，在细胞致病模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现莫纳皮拉韦的新型抗病毒作用，对BEFV有一定的抑制作用。
实施例2莫纳皮拉韦的抗牛肠道病毒活性
1、牛肠道病毒TCID50的测定
将MDBK细胞(山东省农业科学院奶牛研究中心保存)消化后以每孔1×105个/mL的细胞密度接种到96孔细胞培养板中，放入37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养成单层细胞后，弃去孔内细胞生长液，将牛肠道病毒连续10倍稀释的病毒稀释液(稀释度分别为10-1～10-10)接种于长满单层细胞的96孔板，每孔100μL，放入37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，并逐日观察细胞的CPE情况，以及详细记录细胞病变孔数。同时设置正常细胞对照组和空白对照组，每组设8个重复，待不再继续发生细胞病变时判定结果。细胞病变孔是以上的细胞发生病变对应的细胞孔，并按Karber法计算病毒TCID50。
表2 TCID50 of BEV
Figure BDA0003381696610000091
Figure BDA0003381696610000101
注：TCID50，Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量，又称50％组织细胞感染量；即指能在培养板孔或试管内引起半数细胞病变或死亡(cytopathiceffect,CPE)所需的病毒量。
结果：在显微镜下的形态学观察发现48h时不同浓度的病毒稀释液均造成了细胞病变，细胞的折光性发生改变，单层结构被破坏，细胞出现圆缩坏死，逐渐呈拉网状并形成空泡，有的细胞裂解脱落成碎片状，72h后各孔的细胞病变不再继续，统计出不同浓度的CPE孔数，并计算出不同浓度的CPE比率，并按Karber法计算牛肠道病毒的TCID50值：
LgTCID50＝L-D(S-0.5)
(L:最高稀释度的对数；D:稀释度对数之间的差；S阳性孔比率总和)
LgTCID50＝L-D(S-0.5)＝-1-1×(7-0.5)＝-7.5
TCID50＝10-7.5/0.1mL
即将该病毒稀释10-7.5接种100μL可使50％的细胞发生病变。
2、莫纳皮拉韦对MDBK细胞的毒性实验
MDBK细胞是牛肠道病毒的易感细胞。因此，首先检测莫纳皮拉韦对MDBK细胞的细胞毒性，具体实验步骤如下：
(1)在96孔板内接种100μL细胞(MDBK 1×104个/孔)。
(2)培养约12h后，进行下一步加药分析。弃去培养基，每孔加100μL含不同药物浓度的2％FBS DMEM，每个浓度做3个平行。同时对照孔：加100μL 2％FBS DMEM培养基。调零孔：不铺细胞。
(3)在37℃，5％CO2条件下培养48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)37℃，5％CO2条件下继续培养4h后，在450nm测定吸光值。将正常生长细胞的A450nm设为100％细胞对照。
(5)分析数据，利用GraphPad Prism5计算莫纳皮拉韦的半数细胞毒性浓度(CC50)值。其结果如图8所示。
结果：莫纳皮拉韦出现剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，则表现出细胞病变较为明显。经统计学分析，确定莫纳皮拉韦半数中毒浓度为50μM。
3、莫纳皮拉韦对牛肠道病毒的抑制实验
(1)在96孔板的每个孔中接种1×104个MDBK细胞，37℃，5％CO2培养箱中过夜培养；
(2)弃去培养基，每孔加入100μL 1000TCID50的牛肠道病毒稀释液(用2％FBS DMEM细胞长满后加入病毒稀释液，按照100μM初始浓度，两倍浓度梯度稀释加药，5％CO2培养箱中培养；
(3)48h后，按CCK-8试剂盒说明书操作，用酶标仪测定450nm处的OD值。
(4)分析数据，病毒抑制率(％)＝(药物处理组D450nm值-病毒对照组D450nm值)/(正常细胞对照组D450nm值-病毒对照组D450nm值)×100％，用GraphPad Prism5软件得化合物的半数有效浓度(EC50)值。其结果如图9所示。然后按公式TI＝CC50/EC50，计算相应的治疗指数TI值。
结果：通过CCK-8试剂盒检测细胞活力，可以计算出药物对牛肠道病毒的有效抑制率。从结果可以看出，莫纳皮拉韦在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。通过分析软件，对牛肠道病毒的半数有效浓度(EC50)为50μM。莫纳皮拉韦对牛肠道病毒的治疗指数为1。
4、化合物不同时间加入对牛肠道病毒复制的影响
将莫纳皮拉韦进行进一步的作用机制研究。分别采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、药物和病毒预先作用的3种不同作用方式进行体外抗病毒抑制试验。
(1)药物对病毒的直接杀伤作用
将等量的1000TCID50病毒液与不同浓度的药物稀释液混合均匀置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用2h后，加入长成单层的96孔细胞培养板中，每个药液梯度100μL/孔，培养箱中作用2h，弃去上清液，加细胞维持液继续培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h进行细胞活力检测，用GraphPad Prism5软件得化合物的EC50,其结果如图10所示。
结果：从图中可以看出，在这种作用式下，莫纳皮拉韦对牛肠道病毒表现出一定的抑制作用，并且药物在安全浓度范围内，其有效抑制率随着药物浓度的增加而增大，呈一定的量效关系。表明莫纳皮拉韦对牛肠道病毒具有一定的直接灭活的作用。
(2)药物对牛肠道病毒吸附的阻断作用
按每孔1×104个细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将不同浓度的药物稀释液每个药液梯度100μL/孔，加入长成单层的96孔细胞培养板中，培养箱中预先作用4h后，弃去上清液，用PBS洗两遍，加入等量的1000TCID50病毒液置于37℃、5％CO2培养箱中培养。本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，48h后进行细胞活力检测，并计算该作用方式下不同浓度药物的抗病毒有效率，其结果如图11所示。
结果：CPE观察结果显示，药物预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度有明显的变化。表明莫纳皮拉韦能有效阻止牛肠道病毒对细胞的吸附作用。(3)药物对牛肠道病毒复制的阻断作用
按每个孔1×104个细胞密度将消化好的细胞接种到孔板中，待长成单层细胞后弃去上清液，将等量的1000TCID50病毒液加入长成单层的96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2培养箱中预先作用1h后，然后弃去上清液，PBS将细胞洗2遍，然后加入不同浓度的药物稀释液，每个药液梯度100μL/孔，本试验同时设置正常细胞对照组、病毒对照组和空白对照组，每个浓度设3个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后进行细胞活力检测，分析数据，得出结论，其结果如图12所示。
结果：CPE观察结果显示，病毒预先处理组与病毒对照组相比，细胞病变的程度均有明显的变化。检测结果显示，莫纳皮拉韦能有效阻断BEV在细胞中的复制作用。
本实施例以牛肾细胞(MDBK)为载体，在细胞模型上，采用先加药后加病毒、先加病毒后加药、病毒预先作用再加药物的3种不同作用方式进行了体外抗病毒抑制研究。发现莫纳皮拉韦的新型抗病毒作用，对牛肠道病毒有一定的抑制作用，对病毒的吸附阻断、复制阻断有较好的效果，对病毒的直接杀灭作用尤为显著。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用。
2.如权利要求1所述莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用，其特征在于，所述莫纳皮拉韦具有如下式Ⅰ所示的结构：
Figure FDA0003381696600000011
除了上述结构所对应的小分子化学实体，本发明还提供上述化合物药学上可接受的盐或酯或溶剂化物、互变异构体、内消旋体、外消旋体、立体异构体、代谢产物、前药、莫纳皮拉韦的修饰物或晶型化合物；
优选的，所述莫纳皮拉韦的修饰物包括为了改善药物溶解性或代谢性能所进行的成盐修饰、成酯修饰或为了改善化合物的透膜性能与穿膜活性成分偶联后的物质。
3.如权利要求1所述莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用，其特征在于，所述牛感染病毒表示具有感染牛并导致发病的病毒，包括但不限于口蹄疫病毒、恶性卡他热病毒、牛瘟病毒、粘膜病病毒、牛疱疹病毒Ⅰ型、牛流行热病毒、副流感病毒3型、茨城病毒、牛白血病病毒、赤羽病病毒、轮状病毒、朊病毒或牛肠道病毒。
4.如权利要求3所述莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用，其特征在于，莫纳皮拉韦为抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒的活性成分。
5.如权利要求4所述莫纳皮拉韦作为抗牛感染病毒活性成分的应用，其特征在于，所述作为抗病毒活性成分的应用包括但不限于以下任意一种：
(1)应用于制备抗牛流行热病毒或抗牛肠道病毒相关产品；
(2)施用于有治疗需要的个体，以改善病毒感染症状；
(3)用于牛饲料的添加；
优选的，第(1)方面所述相关产品包括但不限于药物或模型药剂；其中，所述模型药剂用于制备一种牛流行热病毒或牛肠道病毒抑制模型；
优选的，第(2)方面所述施用于有治疗需要的个体，所述施用方式包括但不限于通过饮食、饮水、口服、注射或介入方式将药物递送至感染部位；
优选的，第(3)方面中，所述莫纳皮拉韦作为一种饲料添加剂、预混料或药物性添加剂用于饲料的添加。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包括莫纳皮拉韦，及药学上所必需的载体；
优选的，所述药物组合物中，还包括其他可能存在的具有抗病毒活性的成分；
优选的，所述药学上所必需的载体包括但不限于药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂；
优选的，所述药物组合物中，还包括除莫纳皮拉韦之外的至少一种药物活性成分。
7.一种预防和/或治疗牛感染病毒的药物，其特征在于，所述药物中，所述莫纳皮拉韦和/或权利要求6所述药物组合物作为活性成分；
优选的，所述药物的剂型为本领域兽药常见剂型，包括液体制剂、气体制剂、固体制剂或半固体制剂；所述液体制剂包括注射剂、溶液剂、浇淋剂、喷滴剂或酊剂；所述固体制剂包括散剂、粉剂、预混剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂或丸剂；所述半固体制剂包括软膏剂、浸膏剂或糊剂。
8.一种牛饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中包括莫纳皮拉韦和/或权利要求6所述药物组合物。
9.一种通过预防牛感染病毒的方法，其特征在于，所述预防方法包括向预防需要的个体施用预防剂量的莫纳皮拉韦和/或权利要求6所述药物组合物。
10.一种牛感染病毒相关疾病的治疗方法，其特征在于，所述治疗方法包括向治疗需要的个体施用治疗剂量的的莫纳皮拉韦和/或权利要求6所述药物组合物。
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