CN111053763B - 双官能团含碘芳香酸在抗ev71病毒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双官能团含碘芳香酸在抗EV71病毒中的应用。通过对双官能团含碘芳香酸L4、L5的EV71病毒抑制活性的研究实验，证实双官能团含碘芳香酸L4、L5能够抑制EV71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，并且抑制EV71病毒在细胞内的复制增殖。本发明提供的双官能团含碘芳香酸L4、L5有潜力制备抗EV71感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。

Description

双官能团含碘芳香酸在抗EV71病毒中的应用

技术领域

本发明属于抗病毒药物技术领域，具体涉及一种双官能团含碘芳香酸在抗EV71病毒中的应用。

背景技术

肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎、脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，EV71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国政府已于2008年将手足口病列为丙类传染病纳入管理，并制定一系列相关法律法规，严控手足口病的流行传播。目前对于由EV71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。因此开发特异有效的抗EV71药物势在必行。

含碘芳香酸是一类具有生物活性的有机化合物。例如对碘苯甲酸是肉桂酸-4-羟化酶(CINNAMATE 4-HYDROXYLASE)的有效抑制剂,肉桂酸-4-羟化酶是类苯基丙烷途径合成木质素构筑单元的关键酶(Dorien Van de Wouwer,et.al.Plant Physiology,2016,172,198-220)；间碘苯甲酸的金属盐对酿酒酵母、异常汉逊氏酵母、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌均表现出较好的抑制活性(P.Koczon,et.al.J.Agric.Food Chem.2001,49,2982-2986)。如2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)是一种优良的植物生长调节剂(颜季琼,et.al.植物生理通讯,1958,3,27-30)。3,5-双(乙酰氨基)-2,4,6-三碘苯甲酸，又称为泛影酸(diatrizoicacid)，是一种重要的照影剂，配制成泛影钠、泛影葡胺注射液,可用于泌尿系、心血管、脑血管及周围血管的造影(I Charles,et.al.1986,US4567034)。然而含碘羧酸的抗病毒活性，包括对于EV71病毒的抑制活性到目前却未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种双官能团含碘芳香酸在抗EV71病毒中的应用，所述双官能团含碘芳香酸包括3-氨基-4-碘苯甲酸(L4)、3，4-二碘苯甲酸(L5)，所述化合物L4、L5对EV71病毒具有抑制作用，有潜力制备抗EV71感染的特异治疗药物，具有大的临床应用前景。

本发明实现目的采用以下技术方案：

一种双官能团含碘芳香酸在抗EV71病毒中的应用，所述双官能团含碘芳香酸包括3-氨基-4-碘苯甲酸(L4)和3，4-二碘苯甲酸(L5)，其中，所述L4、L5的化学结构式如下，

进一步地，所述双官能团含碘芳香酸作为抗EV71病毒药物，在双官能团含碘芳香酸L4、L5浓度均为80μg/mL时，对于EV71病毒的抑制率分别为91.7％和61.5％。

进一步地，所述双官能团含碘芳香酸L4、L5中任一种作为EV71病毒抑制剂，添加药剂学可接受的辅料和载体后，用于制备抗EV71病毒的制剂。

进一步地，所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中任一种。

本发明通过大量的生物学实验，对一系列双官能团含碘芳香酸包括3-氨基-4-碘苯甲酸(L4)，3,4-二碘苯甲酸(L5)对EV71病毒的抑制活性进行了评估，证实双官能团含碘芳香酸L4、L5均具有抗EV71病毒的活性，具体表现为化合物双官能团含碘芳香酸L4、L5强烈抑制EV71在宿主细胞RD产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率，强烈抑制EV71病毒在细胞内的复制增殖，并且L4和L5浓度为40μg/mL时，对于EV71的抑制率分别为91.7％和61.5％，对于EV71的抑制均具有较高的治疗指数，优于阳性对照药物利巴韦林，提示，L4和/或L5有潜力制备抗EV71感染的特异治疗药物，具有大的临床应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)化合物双官能团含碘芳香酸L4、L5合成工艺简单，易于大规模生产推广。

(2)双官能团含碘芳香酸的抗病毒活性未见报道，对其抗EV71病毒活性的开发具有一定的导向作用。

(3)从结构相似的化合物中寻找抗EV71药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步药物开发提供一定的借鉴意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中双官能团含碘芳香酸(L4，L5)对于EV71作用的RD细胞存活率的影响；

图2为本发明实施例1中双官能团含碘芳香酸(L4，L5)对于EV71引起的RD细胞CPE的抑制效应；

图3为本发明实施例2中双官能团含碘芳香酸(L4)对于ADV7子代病毒产量的抑制作用。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。以下实施例中，如果未特别说明，以下实施例中所用材料和操作方法是本领域公知的。

本发明对双官能团含碘芳香酸L4、L5的抗EV71病毒抑制活性进行了研究，L4、L5抑制EV71在宿主细胞RD产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率，抑制EV71病毒在细胞内的复制增殖，有潜力发展成为有效治疗EV71感染的药物。

本发明涉及双官能团含碘芳香酸L4、L5在制备抗EV71病毒药物中的应用。所述应用是指双官能团含碘芳香酸L4、L5添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗EV71病毒的制剂。所述制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

【实施例1】双官能团含碘芳香酸L4、L5抗EV71病毒活性分析

1、试验内容：

结合细胞病变效应分析和MTT测定细胞存活率检测方法，对双官能团含碘芳香酸L4、L5抑制EV71病毒活性进行评估。

2、试验方法：

2.1双官能团含碘芳香酸L4、L5对于宿主RD细胞的毒性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物(L4、L5)的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算药物(L4、L5)对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD₄₉₀值/细胞对照组平均OD₄₉₀值)×100％。

2.2双官能团含碘芳香酸L4、L5对于EV71的抑制活性

将RD细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO₂培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的EV71病毒液感染细胞1h，(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

CPE观察完毕后，利用MTT方法检测药物对EV71的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在490nm处读取所对应的吸光度(OD₄₉₀值)。利用如下公式计算药物对EV71的抑制率。用SPSS11.5软件计算药物的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

2.3双官能团含碘芳香酸(L4、L5)的治疗指数(TI)

TI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

3、试验结果

表1双官能团含碘芳香酸(L4、L5)细胞毒性及抗EV71病毒活性

结果分析：(1)L4、L5细胞毒性及抗EV71活性测试结果如表1所示，浓度依赖的化合物对于EV71作用的RD细胞存活率的影响如图1所示，本发明检测到双官能团含碘芳香酸L4、L5对于EV71有较好的抑制活性，L4和L5浓度为40μg/mL时，对于EV71的抑制率分别为91.7％和61.5％。L4和L5对于EV71的抑制均具有较高的治疗指数，优于阳性对照药物利巴韦林。(2)L4、L5抑制EV71引起的RD细胞CPE效应如图2所示，EV71感染的RD细胞变圆，从细胞板壁脱离，40μg/mL的L4、L5处理对于其病变效应有明显地抑制作用。结果提示，化合物双官能团含碘芳香酸L4、L5强烈抑制EV71在宿主细胞RD产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率，强烈抑制EV71病毒在细胞内的复制增殖，有潜力发展成为有效治疗EV71病毒感染的药物。

【实施例2】双官能团含碘芳香酸L4对EV71子代病毒产量的抑制作用试验

1、试验内容

对双官能团含碘芳香酸L4进行抗EV71活性深入研究，实施其对于EV71子代病毒产量的抑制作用试验，检测在EV71感染RD细胞后，L4对于EV71子代病毒产量的抑制作用。

2、试验方法

对数生长期的RD细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50 EV71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，加入含40μg/mL L4的细胞维持液。36h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定EV71病毒滴度。

3、试验结果

结果分析：如图3所示，双官能团含碘芳香酸L4处理的RD细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了双官能团含碘芳香酸L4对于EV71子代病毒产量具有显著的抑制作用。

综上所述，双官能团含碘芳香酸L4、L5具有较强的抑制EV71活性，其中L4具有最佳的抑制效果，可以强烈抑制EV71病毒引起的RD细胞病变效应，增强细胞存活率，显著降低子代病毒产量，有潜力进一步开发制备一种临床上有效对抗EV71病毒感染的药物。

Claims (4)

1.一种双官能团含碘芳香酸在制备抗EV71病毒药物中的应用，其特征在于：所述双官能团含碘芳香酸包括3-氨基-4-碘苯甲酸(L4)和3，4-二碘苯甲酸(L5)，其中，所述L4、L5的化学结构式如下，

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双官能团含碘芳香酸作为抗EV71病毒药物，在双官能团含碘芳香酸L4、L5浓度均为80μg/mL时，对于EV71病毒的抑制率分别为91.7％和61.5％。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述双官能团含碘芳香酸L4、L5中任一种作为EV71病毒抑制剂，添加药剂学可接受的辅料和载体后，用于制备抗EV71病毒的制剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药物制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂中任一种。

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