CN112057453B - Enc002及其类似物在治疗或预防肠道病毒感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小分子化合物在病毒治疗中的应用，具体涉及ENC002及其类似物在治疗或预防肠道病毒感染中的应用。提供式(a)化合物在制备抑制肠道病毒复制的药物方面的用途。式(a)任意芳环上的一个或多个氢原子被R1取代，R1为C1‑6烷基、3‑7元环、硝基、卤素、烷氧基、氨基、磺酸基、芳基、杂环基、羟基、羧基、三氟甲基、腈基、‑C(O)‑O‑C1‑6烷基或N‑C1‑6烷基；A是O、N、S或C；R2为氢、C1‑6烷基、3‑7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基；R3为氢、C1‑6烷基、3‑7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基。该化合物能很好地抑制肠道病毒，在抗肠道病毒药物开发中具有较大应用前景。

Description

ENC002及其类似物在治疗或预防肠道病毒感染中的应用
技术领域
本发明涉及小分子化合物在病毒治疗中的应用，具体涉及ENC002及其类似物或衍生物在治疗或预防肠道病毒感染中的应用。
背景技术
肠道病毒属于小RNA病毒科，其包含多种人类及动物病毒，其中肠道病毒A-J共9组，鼻病毒三组，肠道病毒A-D型为人类肠道病毒。肠道病毒属中的肠道病毒A71型(Enterovirus-A71，EV-A71)、柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3)、柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16，CVA16)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)等病毒都是人类的重要病原病毒[1]。不同肠道病毒感染人所引起的症状及并发症区别很大。这其中主要的症状为非典型性发热、中枢神经系统疾病(如无菌性脑膜炎、脑炎、非脊髓灰质炎麻痹)、心肌炎、心包炎、呼吸道疾病、手足口病等，严重危害人类的健康[2-5]。肠道病毒属的EV-A71及CVA16是手足口病的主要病原体[6]。其中的EV-A71病毒通常会引起严重的神经系统并发症。近30年来，手足口病在亚太地区广泛流行，发病率与死亡率不断提高，流行毒株也在不断变迁[7]。肠道病毒感染在东南亚国家以及中国大陆和中国台湾都有较大规模暴发和流行，特别是中国大陆从2008年起，每年都会有人手足口病的爆发。
肠道病毒通常在夏秋季节爆发流行，其感染分布广泛，临床表现复杂多样。目前，对肠道病毒的感染缺乏有效的治疗性药物。在肠道病毒中，除个别病毒如脊髓灰质炎病毒，EV-A7有有效的预防性疫苗外，仍有超过110种肠道病毒对人类健康造成巨大威胁。我国每年的丙型传染病病例中，有将近200万人手足口病病毒感染者。目前手足口疫情的控制仍以常规卫生及消毒等预防为主，临床尚未有特异性治疗药物。2015年，中国在世界上率先研发成功EV-A71全病毒灭活疫苗，为防控严重手足口病提供了有效手段。目前已有中国医学科学院医学生物学研究所、北京科兴生物技术有限公司和中国生物技术集团武汉生物制品研究所有限责任公司等3家公司的EV-A71疫苗获批上市[8]。然而，该疫苗尚未列入国家免疫规划，且保护效率和安全性仍有待长期广泛验证[9]。2017年，中国手足口病疫情整体流行强度低于2016年同期，但严重程度略高于2016年同期。同时，中国手足口疫情还出现了新的流行趋势，如2012至2016年流行病调查显示，山东省CV-A16和其他肠道病毒替代EV71成为该地区手足口病的主要病原体；中国多个省市报告CV-A6近年流行增多，成为手足口病的主要流行病原，手足口病呈现多种肠道病毒交替或共同流行，增加了控制手足口病的复杂性和艰巨性。
因此，目前急需寻找一种有效的肠道病毒抑制剂。
发明内容
针对上述领域存在的问题，我们以全新的靶点进行了基于结构生物学的靶向肠道病毒的小分子药物筛选，通过大量的筛选工作及细胞实验，鉴定出了新的抗肠道病毒活性的小分子化合物。
一方面，本发明提供式(a)所示的化合物在制备抑制肠道病毒复制的药物方面的用途，其特征在于：
Figure BDA0002643302030000021
其中，任意芳环结构上的一个或多个氢原子被R1取代，R1为C1-6烷基、3-7元环、硝基、卤素、烷氧基、氨基、磺酸基、芳基、杂环基、羟基、羧基、三氟甲基、腈基、-C(O)-O-C1-6烷基或N-C1-6烷基；
A是O、N、S或C；
R2为氢、C1-6烷基、3-7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基；
R3为氢、C1-6烷基、3-7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基。
在本发明的优选实施例中，式(a)所示的化合物的分子式为C23H18ON4，其结构式如下：
Figure BDA0002643302030000031
在本发明的一些实施例中，所述肠道病毒为人肠道病毒A型，人肠道病毒B型，人肠道病毒C型，和/或人肠道病毒D型。
在本发明的一些实施例中，所述肠道病毒为人手足口病病毒EV-A71。
在本发明的一些实施例中，所述药物还包含药学上可接受的载体；或者所述药物是口服制剂、注射制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂或丸剂。
在本发明的一些实施例中，所述药物用于预防或治疗肠道病毒感染或者由肠道病毒感染引起的并发症；所述并发症包括手足口病、脑膜炎、无菌性脑膜炎、脊髓灰质炎、急性心肌炎、急性呼吸道疾病，和/或急性迟性麻痹。
另一方面，本发明提供一种预防或治疗肠道病毒感染的药物，其特征在于：包含式(a)所示的化合物：
Figure BDA0002643302030000032
其中，任意芳环结构上的一个或多个氢原子被R1取代，R1为C1-6烷基、3-7元环、硝基、卤素、烷氧基、氨基、磺酸基、芳基、杂环基、羟基、羧基、三氟甲基、腈基、-C(O)-O-C1-6烷基或N-C1-6烷基；
A是O、N、S或C；
R2为氢、C1-6烷基、3-7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基；
R3为氢、C1-6烷基、3-7元环、芳基、杂环基、三氟甲基或氨基。
在本发明的优选实施例中，式(a)所示的化合物的分子式为C23H18ON4，其结构式如下：
Figure BDA0002643302030000041
在本发明的一些实施例中，所述肠道病毒为人手足口病病毒EV-A71。
在本发明的一些实施例中，所述药物还包含药学上可接受的载体；或者所述药物是口服制剂、注射制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂或丸剂。
我们依据结构生物学并结合超级计算机分析，选用全新的靶点3A蛋白筛选出了分值较高的小分子化合物，并利用体外结合实验验证了化合物与病毒蛋白间的结合。基于此，本发明一方面提供用于抑制肠道病毒复制的小分子化合物，其结构式如式(a)所示。式(a)化合物通过靶向肠道病毒3A蛋白从而抑制病毒RNA的合成，进而抑制病毒的复制。
在一些实施例中，式(a)化合物为编号ENC002(本实验室设置的编号)的化合物，其CAS号为849018-64-0，分子式为C23H18ON4，结构式如图1所示。ENC002与肠道病毒3A蛋白的结合效果较好。在细胞水平对病毒复制影响程度的检测中，ENC002可显著抑制肠道病毒的复制，抑制效率为70％以上。间接免疫荧光检测结果显示，该化合物能够有效降低RD细胞中EV-A71病毒蛋白的荧光信号(图4)。免疫印记结果表明，该化合物能够有效降低RD细胞中的EV-A71水平(图2)。病毒滴度测定结果显示，该化合物能够有效降低细胞上清中EV-A71成熟病毒粒子的水平，有效抑制病毒的复制(图6)。
在另一些实施例中，式(a)化合物为化合物ENC002的类似物或衍生物。
另一方面，本发明还提供式(a)化合物和/或其在药学上可接受的盐类在制备抑制肠道病毒复制的药物方面的用途。所述药物能够抑制肠道病毒RNA的合成、病毒的复制和繁殖，可用于预防和治疗病毒感染，还可用于治疗肠道病毒感染引起的并发症，包含但不限于：手足口病，脑膜炎，无菌性脑膜炎，脊髓灰质炎，急性心肌炎，急性呼吸道疾病，急性迟性麻痹。
所述肠道病毒可以是人肠道病毒A型，人肠道病毒B型，人肠道病毒C型，和/或人肠道病毒D型。在一些实施例中，所述肠道病毒为人手足口病病毒EV-A71。
本发明还提供一种预防或治疗肠道病毒感染的药物，包含式(a)所示的化合物。在一些实施例中，所述药物包含化合物ENC002，ENC002的类似物，和/或ENC002的衍生物。ENC002具有非常好的抑制肠道病毒的活性，且在浓度为40μM时，不引起显著的细胞毒性，在抗肠道病毒药物的开发中具有较大的应用前景。在一些实施例中，所述药物还包含其他抗病毒成分。
本发明还提供一种预防或治疗肠道病毒感染的方法，对患者按疗程和有效剂量施予任一所述药物。
附图说明
图1.化合物ENC002的结构式。
图2.Western blot检测ENC002对人手足口病病毒EV-A71在RD细胞中复制的影响；其中，Mock为未感染病毒且未进行药物处理的RD细胞(对照组)；ENC002为ENC002处理组(ENC002终浓度为10μM)；为评价ENC002对病毒的抑制效果，设置DMSO处理组(DMSO终浓度为10μM)；EV-A71 VP1代表病毒VP1蛋白量；为衡量蛋白上样量一致性，以GAPDH(即glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参照；RD细胞以10μM ENC002处理，可见ENC002对EV-A71病毒有显著抑制作用。
图3.Western blot检测ENC002对EV-A71病毒在RD细胞中复制的影响的量化评价；应用Image J软件分析图2中的Western blot检测结果的蛋白条带。以GAPDH为内参照，作相对定量图。以DMSO组为100％，表示抑制效率。
图4.间接免疫荧光检测ENC002对人手足口病病毒EV-A71在RD细胞中复制的影响。其中，Mock为未感染病毒且未进行药物处理的RD细胞(对照组)；ENC002(5μM)，ENC002(10μM)，ENC002(20μM)，ENC002(40μM)为不同浓度的ENC002处理组；DMSO为二甲基亚砜处理组(DMSO终浓度为40μM)。可见随ENC002浓度的增加，代表EV-A71病毒蛋白的荧光信号减弱，显示ENC002能够有效抑制EV-A71病毒在RD细胞内的复制。
图5.间接免疫荧光检测ENC002对EV-A71病毒在RD细胞中复制的影响的定量评价。RD细胞感染EV-A71病毒后，加入10μM ENC002处理。培养0，12，24及48小时后，免疫荧光检测EV-A71病毒蛋白的荧光信号，数据经Image J软件处理后读取阳性细胞数。结果显示，ENC002处理组的阳性细胞数比DMSO处理组有大幅度的下降，说明ENC002对EV-A71病毒有很好的抑制效果。
图6.病毒滴度检测确定细胞上清中EV-A71病毒粒子的滴度。其中，Mock为未感染病毒且未进行药物处理的RD细胞(对照组)；ENC002为ENC002处理组(ENC002终浓度为20μM)；DMSO为二甲基亚砜处理组(DMSO终浓度为20μM)。可见ENC002处理组的成熟病毒粒子数维持较低水平，其48小时病毒滴度Log值仅为2.5左右，DMSO处理组为4.9。可见ENC002能够显著地抑制病毒复制并有效降低成熟病毒粒子的数目。
图7.以间接免疫荧光分析病毒感染细胞数，测定ENC002发挥抗EV-A71病毒作用的半数抑制浓度。其中，横坐标表示ENC002的浓度，纵坐标表示ENC002对EV-A71的抑制率。病毒与细胞孵育后，加入不同浓度的ENC002，感染24小时后，免疫荧光分析病毒感染细胞数目。结果显示，ENC002对EV-A71病毒的半数抑制浓度为8μM左右。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不用于限制本发明的保护范围。
细胞与病毒
RD细胞：人恶性胚胎横纹肌瘤细胞，由中国科学院微生物研究所提供。
人手足口病病毒EV-A71：已知病毒，记载在公知文献Wong,K.T.,L.C.S.Lum,andS.K.Lam,Enterovirus 71infection and neurologic complications.New EnglandJournal of Medicine,2000.342(5):p.356-357.中。本实验所用的EVA71-BrCr型毒株由中国科学院微生物研究所提供。
上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明，自申请日起二十年内，可以提供给公众用于研究目的的实验。
实验试剂
DMEM：dulbecco's modified eagle medium，购自life technology，货号C11995500BT。
FBS：fetal calf serum，胎牛血清，购自life technology公司，货号10437-028。10％FBS是指胎牛血清在培养基中的体积分数为10％。
5×PEG8000 NaCl溶液：配制方法为：称取NaCl 8.766g，PEG8000 50g，溶解在200ml纯水中。
胰酶：购自life technology，货号25200-072；以下实验中所使用的2.5％胰酶是指浓度为2500mg/L的胰酶。
化合物ENC002：CAS号为849018-64-0，购自Sigma。使用时用DMSO溶剂配制为100mM浓度。
DMSO：购自Sigma，货号D2650，分子式：C2H6SO，BR级。
EV-A71鼠单克隆抗体：购自密理博，货号：MAB979。
FITC标记山羊抗小鼠二抗：购自中衫金桥，货号：ZF-0312。
细胞裂解液：购自Sigma，货号：R0278。
辣根过氧化酶标记的二抗：购自中衫金桥，货号：ZDR-5307。
抗GAPDH鼠单抗：购自中衫金桥，货号：TA-08。
DAPI：4',6-diamidino-2-phenylindole(4,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐)，购自Thermo Scientific，货号：D3571。
Triton-X100：购自Sigma，货号：X100。
BSA：购自Sigma，货号：A4161。
PBS：137mM NaCl，2.7mMKCl，4.3mM Na2HPO4，1.4mM KH2PO4。
TBST：Tris-HCI缓冲液(0.5M，pH7.6)100ml，NaCl 8.5～9g(0.15mol/L)，1ml/L的Triton-20。
下述实施例中的试剂，如无特殊说明，均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法，可参考相关实验手册，例如《分子克隆实验指南第四版》，2017年，J.萨姆布鲁克，E.F弗里奇，科学出版社。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
实施例1.抗肠道病毒活性的小分子化合物筛选
依据结构生物学并结合超级计算机分析，选用全新的靶点3A蛋白在上市药物库(Aprroved)、天然产物库、InterBioScreen库中筛选小分子化合物。虚拟筛选策略参照文献“Computational protein–ligand docking and virtual drug screening with theAutoDock suite.Nature Protocols,2016”中记载的筛选方法。所述3A蛋白的氨基酸序列如下：GPPKFRPIRISLEEKPAPDAISDLLASVDSEEVRQYCREQGWIIPETPTNVERHLNRAVLVMQSIATVVAVVSLVYVIYKLFAGFQ。筛选到化合物ENC002(本实验室的化合物编号)，其CAS号为849018-64-0，分子式为C23H18ON4，结构式如图1所示。
实施例2.化合物ENC002对人肠道病毒的药效学检测
1、细胞培养、EV-A71病毒的扩增及纯化
用含10％FBS的DMEM培养基培养RD细胞。待细胞数目足够，将其分至10cm培养皿，密度70％。放入37℃二氧化碳培养箱中培养。24小时后，用DMEM培养基稀释EV-A71病毒，弃掉细胞培养皿中的培养基后，向每皿细胞中加入4ml病毒稀释液，按MOI＝1接种EV-A71病毒。37℃吸附1小时后，弃上清，加入含5％FBS的DMEM培养基10ml。37℃培养48小时，观察细胞是否达到50％脱落。收集上清，2000转/min离心10分钟。取上清。配制5×PEG8000 NaCl溶液，并于121℃高压蒸汽灭菌30分钟，室温冷却后与病毒上清液均匀混合，然后置于4℃过夜。12000g离心1小时，去上清。沥干液体，将沉淀用1×PBS(pH＝7.4)重悬，得到的病毒液分装后置于-70℃保存。
2、EV-A71病毒滴度测定
为计算药物处理后细胞培养上清的TCID50值(半数组织培养感染剂量)，需要将待测病毒上清进行倍比稀释，加入到敏感细胞中，观察细胞病变。具体步骤如下：用2.5％胰酶消化RD细胞，计数，以每孔3000个细胞将细胞置于96孔培养板的每个小孔中。在含10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。吸取病毒液或病毒培养上清100μl，用DMEM培养基对病毒培养上清进行10倍稀释度倍比稀释。取出96孔培养板，去除每孔培养基，按每孔100微升加入稀释的病毒液，37℃吸附1小时，补加100微升含10％FBS的DMEM培养基。37℃培养48-72小时，观察每个稀释度病变孔，以Reed-Muench法计算病毒滴度。
3、化合物ENC002对EV-A71病毒抑制效果的间接免疫荧光检测
首先，用2.5％胰酶消化RD细胞，计数，按照每孔70％汇合度铺细胞至12孔板。在含有10％FBS的DMEM培养基中培养24小时。弃上清，用冰DMEM培养基洗三次，以MOI＝1用DMEM培养基稀释EV-A71病毒，然后加入12孔板中，每孔500微升。设置未感染对照孔，以DMEM培养基替代病毒液。4℃孵育1小时后，弃上清，以冰DMEM培养基漂洗三次，加入含10％FBS的DMEM培养基。分别进行如下处理：
处理1：设置4个ENC002处理组，使4组的ENC002的终浓度分别为5μM，10μM，20μM和40μM；同时设置DMSO处理组，使DMSO的终浓度为40μM；同时设置对照组(未加入病毒液和药物的RD细胞)。将所有处理组和对照组置于37℃培养24小时。
处理2：设置4个ENC002处理组，使4组的ENC002的终浓度均为10μM，将4个ENC002处理组置于37℃分别培养0，12，24及48小时；同时设置4个DMSO处理组，使DMSO的终浓度均为10μM，将4个DMSO处理组置于37℃分别培养0，12，24及48小时；同时设置4个对照组(未加入病毒液和药物的RD细胞)，将4个对照组置于37℃分别培养0，12，24及48小时。
处理3：以终浓度40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM、0.5μM和0.25μM加入化合物ENC002，置于37℃培养24小时。
处理完成后，立刻用4％多聚甲醛(福晨化学试剂有限公司)固定细胞10分钟，然后进行免疫荧光分析，步骤如下：用0.2％(v/v)Triton-X100(Sigma，X100)在冰上破膜10分钟，加入3％(g/ml)BSA(Sigma，A4161)，室温封闭1小时。加入1μg/ml的EV-A71鼠单克隆抗体(密理博，MAB979)，室温孵育1小时，1×PBS(pH＝7.4)洗三次，每次10分钟。加入0.5μg/ml的FITC标记山羊抗小鼠二抗(中衫金桥，ZF-0312)，室温孵育45分钟，1×PBS(pH＝7.4)洗三次，每次10分钟。用1μg/ml DAPI(Thermo Scientific，D3571)染色，避光于室温反应10min。弃染色液，用1×PBS(pH＝7.4)洗3次，10min/次。以488nm波长，在荧光显微镜下观察并拍照。用Image J图像处理软件计算绿色信号细胞数(病毒感染细胞数量)，通过DAPI荧光信号计算细胞总数。计算感染效率或半数抑制浓度。
实验结果：
处理1：如图4所示，随ENC002浓度的增加，EV-A71病毒蛋白的绿色荧光信号减弱，表明ENC002能够有效抑制EV-A71病毒在RD细胞内的复制。
处理2：如图5所示，在每个时间点，ENC002处理组的阳性细胞数都比DMSO处理组有大幅度的下降，说明ENC002对EV-A71病毒有很好的抑制效果。
处理3：如图7所示，横坐标表示ENC002的浓度，纵坐标表示ENC002对EV-A71的抑制率。结果显示，ENC002对EV-A71病毒的半数抑制浓度为8μM左右。
4、化合物ENC002对EV-A71抑制效果的WB检测
首先，用2.5％胰酶消化RD细胞，以70％汇合度铺细胞至12孔培养板。在含有10％FBS的DMEM中培养24小时。弃上清，冰DMEM洗三次，以MOI＝1用DMEM培养基稀释EV-A71病毒，加入12孔板中，每孔500微升。设置未感染病毒的对照孔。4℃孵育1小时，弃上清，用冰DMEM漂洗三次，加入含10％FBS的DMEM培养基，并加入药物进行处理，设置：
ENC002处理组：向含有细胞和病毒的孔中加入ENC002至终浓度为10μM；
DMSO处理组：向含有细胞和病毒的孔中加入DMSO至终浓度10μM；
对照组：未加入病毒液和药物的RD细胞。
将处理组和对照组置于37℃培养24小时。24小时后，吸掉上清，冰浴，用1×PBS(PH＝7.4)轻轻洗涤3次，加入100微升细胞裂解液(Sigma，R0278)，待至细胞裂解完全后，吸入1.5ml离心管中，12000转/分，4℃离心10分钟。将上清转移到离心管中，用Nanodrop测量蛋白浓度，以等量总蛋白上样，12％SDS-PAGE，80V电泳2小时，将所述蛋白通过湿转的方法转移至PVDF膜(GE Health)上(200mA、90min)，考马斯亮蓝染色确定转膜效率，脱色后用TBST(0.5M Tris-HCI(pH7.6)缓冲液100ml，NaCl 8.5～9g(0.15mol/L)，1ml/L的Triton-20)洗涤3次，每次10分钟；5％(g/ml)脱脂奶粉封闭过夜，TBST洗涤3次后，加入EV-A71鼠单克隆抗体(密理博，MAB979，用1％(g/ml)脱脂奶粉稀释抗体，1/1000稀释)，37℃孵育1小时，TBST洗涤3次(每次10分钟)后，加入辣根过氧化酶标记的二抗(中衫金桥，ZDR-5307，用1％(g/ml)脱脂奶粉稀释抗体，1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次后(每次10分钟)，再用超敏发光液(密理博，WBKLSO100)显色，拍照。用Image J软件分析WB条带灰度值。显色完成后，TBST洗膜，加入TBST稀释的抗GAPDH鼠单抗(中衫金桥，TA-08，用1％(g/ml)脱脂奶粉稀释抗体，1:3000稀释)，室温孵育1小时，TBST洗三次(每次10分钟)，加入辣根过氧化酶标记的二抗(中衫金桥，ZDR-5307，用1％(g/ml)脱脂奶粉稀释抗体，1/3000稀释)，37℃孵育45分钟，TBST洗涤3次(每次10分钟)后，再用超敏发光液(密理博，WBKLSO100)显色，拍照。用Image J软件分析WB条带灰度值。
结果如图2所示，EV-A71 VP1代表病毒VP1蛋白量。为衡量蛋白上样量一致性，以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参照。结果表明，化合物ENC002对EV-A71病毒有显著抑制作用。
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Claims (4)

1.式(a)所示的化合物在制备抑制肠道病毒复制的药物方面的用途，其特征在于：
Figure FDA0003531444050000011
分子式为C23H18ON4，所述肠道病毒为人手足口病病毒EV-A71。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物还包含药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是口服制剂或注射制剂；所述口服制剂是指片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂或丸剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是用于预防或治疗所述肠道病毒感染或者由所述肠道病毒感染引起的手足口病。
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