JP7252575B2 - 広域エンテロウイルス抵抗性ポリペプチド及びその応用 - Google Patents
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Description
ヘルパンギーナは、主に、コクサッキーウイルスA群2型(CVA2)、CVA4、CVA6、CVA9、CVA16、CVA22型、及びB群1型(CVB1)、CVB2、CVB3、CVB4、CVB5型によって引き起こされる。ヘルパンギーナは、急激な発熱になり、ほとんどの場合に軽度または中程度の発熱であり、時々40℃以上になり、ひいては、けいれんを引き起こすことが多い。発熱の病程は、約2~4日である。年長の子供は喉の痛みを訴え、嚥下に影響を与える可能性がある。乳幼児は唾液分泌、食事の拒否、落ち着きのなさを示す。頭痛、腹痛、筋肉痛を伴うこともある。5歳以下の子供の約25%は、嘔吐を伴うことがある。典型的な症状は咽頭に現れる。咽頭の充血を特徴とし、発症後2日内に口腔粘膜に小さな(直径1~2mm)灰白色のヘルペスが数個(少なくとも1~2個であり、10個以上に多くなり)現れ、その周囲に紅暈で囲まれる。2~3日後に紅暈は激しく拡大し、ヘルペスは破裂して黄色の潰瘍を形成する。このような粘膜疹は、扁桃腺の前柱に現れることが多く、軟口蓋、口蓋垂、及び扁桃腺上にも見られるが、歯肉及び頬粘膜に繋がらない。病程は、一般的に、4~6日であり、時々2週間遅れるものがある。
手足口病は、主に、エンテロウイルス71型(EV71)、CVA6、CVA8、CVA10、CVA16、CVB3及びCVB5によって引き起こされる。手足口病の一般的な臨床症状は、突然の発熱、口の痛み、食欲不振であり、口腔粘膜に散在するヘルペス又は潰瘍が現れ、舌、頬粘膜及び硬口蓋などにあることが多く、軟口蓋、歯肉、扁桃腺及び咽頭に繋がられてもよい。紅斑性丘疹は、手、足、臀部、腕部、下肢部に現れ、その後、ヘルペスに変換し、ヘルペスの周囲に炎症性紅暈があり、水疱内の水分が少ない。手及び足部には多くあり、手掌の裏面にもある。丘疹数は、少なくとも数個であり、数十個に多くなる。消退後に、痕跡や色素沈着が残らない。手足口病の一部の患児は、ヘルパンギーナを最初の症状とし、次いで、手掌、足裏、臀部などの部位に赤色丘疹が現れる。病程が急速に進行すると、少数の患児は、手足口病から重篤な無菌性髄膜炎、脳炎などを発症する可能性がある。発熱、頭痛、吐き気、嘔吐、嘔吐後に伴う髄膜刺激症状を示し、体温は大きく変動し、ほとんどの場合には、低熱であり、40℃以上に高くなることもあり、二峰性発熱はしばしば病程で存在する。他の症状は、例えば、喉の痛み、筋肉の痛み、丘疹、光恐怖症、下痢、リンパ節腫脹などがあり、少数の患者は、軽度の麻痺が発生する可能性がある。
エンテロウイルスは、一本鎖プラス鎖RNAウイルスであり、ゲノムサイズが約7.5kbであり、ポリタンパク質をコードできる大きなORFを含む。ポリタンパク質は、さらに4つの構造タンパク質(VP1-VP4)及び7つの非構造タンパク質(2A-2C及び3A-3D)に加水分解される。3Aタンパク質は、エンテロウイルス(EV71、CVA及びCVBなどを含み)で非常に保存されている非構造タンパク質であり、ホモ二量体として細胞内膜に存在し、ウイルスの複製及び宿主の自然免疫の調節に重要な役割を果たす。
ウイルス感染後に、宿主細胞は、一連の自然免疫機構を活性化して防御し、その防御は、RNA干渉(RNA interference、 RNAi)によって誘導される抗ウイルス防御を含む。ウイルスが宿主細胞に感染した後に、ウイルスゲノム自体の構造又は複製中間体により、ウイルスに由来する長鎖二本鎖RNA(double-stranded RNA、 dsRNA)が生成される。これらのdsRNAは、宿主細胞のDicerタンパク質によって認識され、ウイルス由来の低分子干渉RNA(viral small interfering RNA、 vsiRNA)に切断され、その後、vsiRNAがArgonaute (AGO)タンパク質と結合されて組み立てられ、RNA誘発サイレンシング複合体(RNA-induced silencing complex、 RISC)を形成し、最終的に、ウイルスの標的遺伝子RNAの分解を誘導するため、ウイルスの複製を抑制してウイルスを排除する目的を達成する。
上記本発明の目的を達成するために、本発明は、以下の技術態様を提供する。即ち、
本発明は、ウイルス性疾患を予防及び/又は治療するための薬物の調製における、標的としての抗エンテロウイルスタンパク質(Enterovirus RNA suppressing protein、ERSP)の応用を提供する。
本発明は、さらに、ERSPを標的とする阻害剤の調製におけるポリペプチドの応用を提供し、前記ERSPの機能は、前記ポリペプチドによって阻害され、ウイルスの核酸は、Dicerにより切断されてvsiRNAを生成する。
本発明は、さらに、ウイルス性疾患を予防及び治療するための薬物の調製におけるポリペプチドの応用を提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ERSPは、エンテロウイルスの非構造タンパク質3Aである。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記疾病は、前記ウイルスによって引き起こされる手足口病、心筋炎、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎、脳炎、ウイルス性感冒などである。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、CR、CK及び/又はDLLを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドは、以下の配列を有する。
I:(X1) (X2)DLL、(X2)DLL(X3)、DLL(X3) (X4)
、(X5)YC(X6)、C(X6)。
(ここで、
X1は、イソロイシン(I)であり、
X2は、セリン(S)又はアラニン(A)から選ばれ、
X3は、アラニン(A)又はリシン(K)又はグルタミン(Q)又はアルギニン(R)又はセリン(S)又はシステイン(C)から選ばれ、
X4は、セリン(S)又はアラニン(A)から選ばれ、
X5は、グルタミン酸(E)又はグルタミン(Q)から選ばれ、
X6は、アルギニン(R)又はリシン(K)から選ばれる。)
或いは、II:Iに記載のアミノ酸配列において少なくとも1つのアミノ酸が欠失、挿入
又は置換されている配列、
或いは、III:I又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも50%の同一性を有し、そしてERSP活性を阻害する配列、
或いは、IV:I又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、Iに記載の配列は、SEQ ID No
.1~14のいずれか1つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
本発明は、さらに、ERSPの活性を阻害できるポリペプチドを提供する。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、CR、CK及び/又はDLLを含む。
本発明の幾つかの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、YCR及び/又はYCKを含む。
I:(X1) (X2)DLL、(X2)DLL(X3)、DLL(X3) (X4)
、(X5)YC(X6)、C(X6);
(ここで、
X1は、イソロイシン(I)であり、
X2は、セリン(S)又はアラニン(A)から選ばれ、
X3は、アラニン(A)又はリシン(K)又はグルタミン(Q)又はアルギニン(R)又はセリン(S)又はシステイン(C)から選ばれ、
X4は、セリン(S)又はアラニン(A)から選ばれ、
X5は、グルタミン酸(E)又はグルタミン(Q)から選ばれ、
X6は、アルギニン(R)又はリシン(K)から選ばれる。)
或いは、II:Iに記載の配列において少なくとも1つのアミノ酸が欠失、挿入又は置換
されている配列、
或いは、III:I又はIIに記載のアミノ酸配列において少なくとも50%の同一性を有し、そしてERSP活性を阻害する配列、
或いは、IV:I又はII又はIIIに記載の配列に相補的な配列。
EQ ID No.1~14のいずれか1つに示されるが、膜透過ペプチドの配列及びリンカーペプチドの配列が含まれない。
上記の研究に基づいて、本発明は、さらに、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である核酸を提供する。
本発明は、さらに、前記核酸を含む組換えベクターを提供する。
それに基づいて、本発明は、さらに、前記組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含む薬物を提供する。
本発明は、さらに、前記ポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含むワクチンを提供する。
本発明は、さらに、前記薬物を服用及び/又は注射する、エンテロウイルス感染症の治療方法を提供する。前記注射は、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈内注射である。
本発明は、さらに、前記ワクチンを接種する、エンテロウイルス感染症の予防方法を提供する。
本発明では、「治療」という用語は、疾患の発症又は進展を阻止又は低減するように、病程の進展又は悪化を抑制、阻止、低減、改善、軽減、停止、遅延、または逆転することを意味し、記載された維持及び/又は投与中の疾患の、障害または病理学的状態のさまざまな指標は、症状又は合併症の軽減又は緩和、或いは、治愈又は消除疾患、障害又は病状の治癒又は消失を指す。
本発明では、「薬物」という用語は、ある疾患の予防又は治療に適用できる単一化合物、複数の化合物からなる組成物を意味し、或いは、単一化合物を主要な活性成分とする組成物又は製剤(formulation)、さらに、複数の化合物を活性成分とする組成物又は製剤である。「薬物」とは、各国の法律や規制に準拠し設立された行政機関によって承認されて生産された製品だけでなく、承認及び生産許可を取得するための過程で形成された単一化合物を活性成分として含有する様々な物質形態であることを理解すべきである。「形成」とは、化学合成、生物学的変換、または購入を通じて取得することを理解すべきである。
本発明は、さらに、前記阻害剤により調製された改造体を提供し、前記改造体は、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI又は3A-EP-PEG4-PAであり、前記3A-TAT-EPのアミノ酸配列はSEQ ID NO.3に示され、3A-EP-DRIの非天然アミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示され、3A-EP-PEG4-PAのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.5に示される。
さらに、本発明は、さらに、エンテロウイルス阻害剤の調製における前記阻害剤又は前記改造体の応用を提供する。
RNA干渉は、ウイルスに対する自然免疫機構である。RNA干渉によるウイルス抵抗過程では、ウイルスRNA複製によって生成された二本鎖RNAは、宿主Dicerタンパク質によって認識され、低分子干渉RNA(siRNA)に切断される。これらのウイルス由来低分子干渉RNA(vsiRNA)は、転送され、RNA誘導サイレンシング複合体に組み立てられ、相同性のあるウイルスRNAの分解を誘導するため、ウイルスに抵抗する目的を達成する。例えば、EV71の非構造タンパク質3Aは、ウイルス二本鎖RNAに結合することによりDicerの切断を防止し、vsiRNAウイルス由来低分子干渉RNAの生成を阻害することができるため、RNA干渉による抗ウイルス自然免疫を回避する目的を達成する。
本発明で提供されるポリペプチドは、効率良く、広域の抗ウイルス活性を有する。これは、EV71ウイルス、CVA16ウイルス、CVA6ウイルス、CVB3ウイルス、CVB5ウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルス71型、CVA16ウイルス、CVB3ウイルス、CVB5ウイルスに抵抗するポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。
EV71 3Aタンパク質は、86個のアミノ酸残基を含む。3Aは、二量体化する能力があり、その二量体化は、3Aの正確な機能に重要な役割を果たす。出願人は、3A二量体化ドメインの2つの螺旋構造の構成及び配列特徴に基づいて、EPポリペプチド配列(SEQ ID NO.1に示される)を設計し、その配列は、EV71非構造タンパク質3Aに結合し、3Aタンパク質二量体の形成を妨げることができるため、ウイルスの複製及び感染を阻害する。
上記の考え方に基づいて、出願人は、該阻害剤が細胞膜を通過して細胞内に入ることによりウイルスへの阻害作用を果たすために、EPポリペプチドをコア配列とし、ポリペプチドP2(SEQ ID NO.2に示される)を設計し、そのポリペプチドP2は、α1と競争的に相互作用することができるため、3Aの二量体化を阻止し、3Aタンパクの抗自然免疫を阻害する役割を果たし、最終的に抗ウイルスの目的を達成する。
前記改造体は、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI及び3A-EP-PEG4-PAであり、前記3A-TAT-EPのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.3に示され、3A-EP-DRIのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.4に示され、3A-EP-PEG4-PAのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.5に示される。
エンテロウイルス71型の阻害剤の応用においては、本発明で提供されるP2及びP2改造体によりエンテロウイルス71型の阻害剤を調製すること、又は本発明で提供されるP2及びP2改造体を他の有効成分とともにエンテロウイルス71型の阻害剤を調製することを含む。
エンテロウイルス3Aタンパクは、ウイルスdsRNAに結合してDicerによる切断を阻止し、ウイルス由来vsiRNAの産生を阻害し、宿主のRNAiによる抗ウイルス免疫に抵抗することができる効率的なERSPである。
本発明に係るポリペプチド及びその誘導体は、エンテロウイルス3Aの抗ウイルス免疫力を阻害することができ、新たなEV71治療薬であり、新しい標的については、抗ウイルス薬の薬剤耐性などに非常に重要である。
従来技術と比較して、本発明は以下の利点を有する。
P2系ポリペプチドは、効率よい抗ウイルス活性を持つ。これは、エンテロウイルスの予防及び制御のために新しい戦略を提供するとともに、抗ヒトエンテロウイルスポリペプチド低分子薬物の研究及び開発を加速するために新しい理論的基盤も提供する。また、P2系ポリペプチドの明確な抗ウイルスメカニズムは、その応用の安全性及び最適化方法の明確さを保証し、将来のさらなる開発に便利である。
本発明で提供されるポリペプチド及びその応用に使用される原料及び試薬は、いずれも市販品を購入できる。
以下、実施例と組み合わせて本発明をさらに説明する。
1.材料:
MEM培地(Thermo)、血清(Gibco)は、Invitrogen社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ(NEST)は、プロモーター公司から購入され、PBS、DAPI、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドP2は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列がSEQ ID NO.2に示された。
2.実験手順
実験は、2つの群に分けられ、EV71ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、1つの実験群ではEV71ウイルスを添加した後、ポリペプチドP2を加え、別の実験群ではウイルスを添加ずにポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光の手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞1mlを免疫蛍光用ディッシュに敷き、30%コンフルエントに達したら、試料を収集した。
(2)培地を吸引し、0.01mol/L、pH7.4のPBS 1mlで残った培地を3回、各回5分間洗い流した。
(3)4%パラホルムアルデヒド溶液を調製し、PBS 100mlにパラホルムアルデヒド4gを溶解させた。調製された4%パラホルムアルデヒド 1mlを各ディッシュに加え、細胞を固定するために、5min反応させた。
(4)4%パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、0.01mol/L、pH7.4のPBS 1mlで残ったパラホルムアルデヒドを3回、各回5分間洗い流した。
(5)1mg/mlのDAPI溶液をPBSで100ng/mlに希釈し、ディッシュに加え、15min反応させた。
(6)反応液を吸引し、1ml 0.01mol/L、pH7.4のPBSを再度追加し、残った反応液を3回、各回5分間洗い流した。
(7)ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識(FITC)付きポリペプチドを使用し、RD細胞のその細胞膜透過効率を検出した。2群の実験を個別に設定し、第1群は、未処理対照群であり、それぞれR8及びP2を加え、第2群は、EV71感染群であり、EV71感染後に、さらに、それぞれR8、P2を加えた。2群の実験は同時に実行され、ウイルスMOI(Multiplicity of Infection,感染多重度)=0.1であり、濃度1μMであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから12時間後、試料を収集し、細胞を固定して免疫蛍光染色を行い、細胞核をDAPI溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図1に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドP2は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチドP2は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり100μl播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェルのP2の最終濃度がそれぞれ0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μMになるように一定の濃度勾配でポリペプチドP2を加えた。
(3)ポリペプチドを添加してから24h後に試料を収集し、生細胞検出試薬CCK-8を1ウェルあたり10μl加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
結果は、図2、表2に示され、未処理細胞の細胞生存率を100%とし、ポリペプチド100μMを加えた後に細胞生存率は、対照群(未処理細胞)と有意差がなく、本研究で使用されるポリペプチドP2は、100μM以内でいずれも細胞毒性がないことが証明されている。
1.材料
トータルRNA抽出キット(Omega)、24ウェルプレート、100mmディッシュ、50ml注射器は、迪躍創新公司から購入され、孔径0.22μmのメンブレンフィルター(Millipore)は、飛げい公司から購入され、ワンステップqRT-PCRキット(Takara)は、友名公司から購入され、RNA抽出及びqRT-PCRプロセスで使用される水はDEPC水であり、実験は全体としてRNaseフリーの環境で実行された。
2.ウイルスの増幅
(1)RD細胞を5つの100mmディッシュに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、1μlの107PFU/mlのEV71ウイルス、CVA16ウイルス、CVB3ウイルス、CVB5ウイルスを加えた。
(3)2日間後に、細胞にCPE(細胞変性効果)現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになると試料を収集した。
(4)100mm ディッシュ中の上清を15ml 遠心チューブに吸引し、500g、5min遠心した。
(5)次いで、上清を別の15ml 遠心チューブに採取し、50ml 注射器及び0.22μmのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
(6)ウイルス抽出RNA 100μlを採取して前に抽出された既知力価のウイルスRNAとともにワンステップqRT-PCRを実行し、ウイルスの力価を測定した。
(1)それぞれ異なる細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し(1ウェルあたりの2%血清含有MEM培地の添加量は、0.5mlである)、各ウェルに106PFU/mL EV71ウイルス 5μlを加えた。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、50μMである異なるポリペプチドを加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)次に、ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル 2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
R8膜透過ペプチド(配列:RRRRRRRR)が挿入されたRD細胞を陰性対照とした。
1.材料
HEK293T、Vero、Huh7.5細胞
2.複数種の細胞のポリペプチドP2の抗ウイルス効果の測定
(1)293T細胞、Vero細胞及びHuh7.5細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し(1ウェルあたりの2%血清含有MEM培地の添加量は0.5mlである)、各ウェルに106 PFU/ml EV71ウイルス 5μlを加えた。
(3)1時間後、それぞれ異なる細胞に最終濃度が0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、50μMであるポリペプチドP2を加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)次いで、ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
図4より、RD細胞、293T細胞、Vero細胞又はhuh7.5細胞のいずれにも、ポリペプチドP2はいずれも有意な抗ウイルス效果を奏することことがわかった。
293T細胞、Vero細胞、Hμh7.5細胞で測定されたIC50値は、それぞれ9.677μM、1.958μM、1.842μMである。
1.材料
ポリペプチドは3A-TAT-EP(SEQ ID NO.3に示す)、3A-EP-DRI(SEQ ID NO.4に示す)及び3A-EP-PEG4-PA (SEQ ID NO.5に示す)を採用した。かかるポリペプチドは、いずれも商業的に合成されたものである。
2.抗ウイルス效果に対するポリペプチドP2の改造体の影響
(1)293T細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し(1ウェルあたりの2%血清含有MEM培地の添加量は0.5mlである)、各ウェルに106 PFU/ml EV71ウイルス 5μlを加えた。
(3)1時間後、ポリペプチドP2、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI及び3A-EP-PEG-PAをそれぞれ最終濃度0.01μM、0.1μM、1μM、10μMで加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)次いで、ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
(1)まず、増殖状態が良いRD細胞を96ウェルプレートに播種し、各ウェルに1×104個、37℃、5% CO2の条件下で24時間培養した。
(2)2%FBS含有MEMを使用してポリペプチド薬物(3A-TAT-EP及び3A-EP-DRI)を2倍段階希釈し、希釈濃度は40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.313μMであり、1ウェルあたり100μl、別の96ウェルプレートに加え、各濃度は3点測定(Triplicate)を行った。
(3)希釈されたウイルスを上記ウェルに1ウェルあたり100μL加え、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェルをそれぞれ対照とし、ウイルスの最終濃度は、0.1 MOIである。
(4)混合物を細胞が播種された96ウェルプレートに移し、37℃、5%CO2の条件下で24時間培養した後、CCK8キットによりウイルスに対するポリペプチドの阻害活性を測定した。
(5)ウイルス感染に対するさまざまな濃度のポリペプチドの阻害率は、次の式を使用して計算されました。
阻害率=(処理されたODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)×100%/(未処理ODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)。ここで、ODはOD450-OD630の値を指す。
結果は、図5に示され、ポリペプチドP2から改造されたポリペプチド3A-TAT-EP(SEQ ID NO.3に示す)、3A-EP-DRI(SEQ ID NO.4に示す)及び3A-EP-PEG4-PA (SEQ ID NO.5に示す)は、いずれもEV71阻害剤として作用を発揮し、またウイルスへの阻害を向上させる効果を奏することもできる。qRT-PCRにより測定された3A-EP-PEG4-PAのIC50は3.25μMである。
図6では、CCK8キットによるポリペプチドのウイルス阻害活性の測定は、3A-TAT-EPのIC50は4.36μMであり、3A-EP-DRIのIC50は3.56μMであることを示した。
1.材料:
MEM培地(Thermo)、血清(Gibco)は、Invitrogen社から購入され、免疫蛍光用ディッシュ(NEST)は、プロモーター公司から購入され、PBS、DAPI、パラホルムアルデヒドは、迪躍創新公司から購入された。
ポリペプチドP1は、南京金斯瑞公司により合成され、その配列はSEQ ID NO.6に示された。
2.実験手順
実験は、2つの群に分けられ、EV71ウイルスの添加によるペプチドの細胞内移行に与える影響を回避するために、1つの実験群ではEV71ウイルスを添加してからポリペプチドP1を加え、別の実験群ではウイルスを添加せずポリペプチドのみを加え、また、各群では、陰性対照を用意した。
免疫蛍光染色の手順は、以下の通りである。:
(1)RD細胞1mlを免疫蛍光用ディッシュに敷き、30%コンフルエントに達したら試料を収集した。
(2)培地を吸引し、0.01mol/L、pH7.4のPBS 1mlで残った培地を3回、各回5分間洗い流した。
(3)4%パラホルムアルデヒド溶液を調製し、パラホルムアルデヒド4gをPBS 100mlに溶解させた。調製された4%パラホルムアルデヒド1mlを各ディッシュに加え、5min反応させ、細胞を固定化した。
(4)4%パラホルムアルデヒドを吸引し、さらに、0.01mol/L、pH7.4のPBS 1mlで残ったパラホルムアルデヒドを3回、各回5分間洗い流した。
(5)1mg/mlのDAPI溶液をPBSで100ng/mlに希釈し、ディッシュに加え、15min反応させた。
(6)反応液を吸引し、0.01mol/L、pH7.4のPBS 1mlを再度追加し、残った反応液を3回、各回5分間洗い流した。
(7)ディッシュを蛍光顕微鏡下で観察した。
蛍光標識(FITC)付きポリペプチドを使用し、RD細胞のその細胞膜透過効率を検出した。2群の実験を個別に設定し、第1群は、未処理対照群であり、それぞれR8、P1及びP2を加え、第2群は、EV71感染群であり、EV71感染後に、さらに、それぞれR8、P1及びP2を加えた。2群の実験は同時に実行され、ウイルスMOI(Multiplicity of Infection,感染多重度)=0.1であり、濃度1μMであるポリペプチドを加えた。ポリペプチドを添加してから12時間後に試料を収集し、細胞を固定化して免疫蛍光染色を行い、細胞核をDAPI溶液で染色した。結果は、ポリペプチドは、感染又は非感染の条件下で、いずれも細胞に入ることができ、優れた細胞膜透過能を持つことを示した。
図14に示すように、ウイルス添加又は無添加の細胞では、いずれもポリペプチドの細胞内移行が観察され、ポリペプチドP1は優れた細胞膜透過能を持つことを証明した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチドP1は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μLである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中のP1最終濃度がそれぞれ0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μMになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドP1を加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチド3A-TAT-EPは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μLである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中のEP最終濃度がそれぞれ0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μMになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドEPを加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチド3A-EP-DRI及び3A-EP-PEG4-PAは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μLである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中の3A-EP-DRI及び3A-EP-PEG4-PA最終濃度がそれぞれ0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μMになるように、一定の濃度勾配でポリペプチド3A-EP-DRI及び3A-EP-PEG4-PAを加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.材料
トータルRNA抽出キット(Omega)、24ウェルプレート 、100mmディッシュ、50ml注射器は、迪躍創新公司から購入され、0.22μmのメンブレンフィルター(Millipore)は飛げい公司から購入され、ワンステップqRT-PCRキット(Takara)は友名公司から購入され、RNA抽出及びqRT-PCRプロセスで使用される水はDEPC水であり、実験は全体として在RNaseフリーの環境で実行された。
2.ウイルスの増幅:
(1)RD細胞を5つの100mmディッシュに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、107 PFU/mlのEV71ウイルス 1μlを加えた。
(3)2日間後、細胞にCPE(細胞変性効果)現象が発生するか否かを観察し、病変現象が明らかになる時に試料を収集した。
(4)100mmディッシュ中の上清を15ml 遠心チューブに吸引し、500g、5minで遠心した。
(5)次いで、上清を採取して別の新しい15ml 遠心チューブに入れ、50ml 注射器及び0.22μmのメンブレンフィルターでろ過して滅菌した。
(6)ウイルス抽出RNA100μlを採取して前に抽出された既知力価のウイルスRNAとともにワンステップqRT-PCRを実行し、ウイルス力価を測定した。
(1)それぞれ異なる細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し(1ウェルあたりの2%血清含有MEM培地の添加量は0.5mlである)、各ウェルに106 PFU/mL EV71ウイルス 5μlを加えた。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が0.01μM、0.1μM、1μM、10μMである異なるポリペプチドを加えた。ポリペプチド無添加群を対照とした。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)さらに、ウェル中に70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
ポリペプチドP2、ER、ER-DRIの抗CVA16ウイルス効果の検出結果は、図22、表11~15に示した。
1.材料
P1:RRRRRRRRAISDLLASは、商業的に合成されたものである。2日齢のICR系新生児マウスを採用した。
2.マウス体内のポリペプチドP1の抗ウイルス活性
(1)2日齢のICR系新生児マウス8匹をランダムに2つの群に分けられ、各群あたり4匹である。これらの新生児マウス8匹は、腹腔内注射にて用量が108PFU/mlのEV71でチャレンジされた。
(2)チャレンジされるとともに、1つの群は、P1ポリペプチドを10mg/kgで腹腔内注射されて治療群とし、別の群は、同量のPBSを注射されて対照群とした。
(3)ポリペプチド及びPBSを12時間おきに1回注射し、チャレンジ後5日目まで注射し続けた。
(4)5日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Trizolで研磨した後、組織から全RNAを抽出した。
(5)ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
結果は、図7及び表16に示され、P1は、マウス体内のEV71ウイルス量を有意に低減した。
3. マウス体内のCVA16に対するP1の抗ウイルス活性の検出は、以上と同じである。
(1)増殖状態が良いRD細胞を96ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル(DMEM)を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はMOI=0.1である。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μMであるCRポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設置した。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に、ウイルスのみを添加する対照群では病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(5)37℃で2h静置した。
(6)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率=(処理されたODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)×100%/(未処理ODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)であり、ここで、ODはOD450-OD630の値を指す。
結果は、図9及び表18に示され、EV71に対するCRのIC50は、1.7μMである。
1.材料
ポリペプチドCR:YGRKKRRQRRRGSGCRは、商業的に合成されたものである。2日齢のICR系新生児マウスを採用した。
2.マウス体内のポリペプチドCRの抗ウイルス活性
(1)2日齢のICR系新生児マウス8匹をランダムに2つの群に分け、各群あたり4匹である。これらの新生児マウスの8匹に腹腔内注射にて108PFU/ml EV71用量でチャレンジした。
(2)チャレンジすると同時に、1つの群は、CRを10mg/kgで腹腔内注射し、別の群は、同量のPBSを対照として注射した。
(3)ポリペプチド及びPBSを12時間おきに1回注射し、チャレンジ後5日目まで注射し続けた。
(4)5日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Trizolにより研磨した後、組織から全RNAを抽出した。
(5)ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
結果は、図10及表19に示され、CRがマウス体内のEV71ウイルス量を有意に低減させることを示した。
結果は、図11及表20に示され、CRがマウス体内のCVA16のウイルス量を有意に低減させることを示した。
1.材料
ポリペプチドER-DRIは、商業的に合成されたものであり、10日齢の新生児マウス12匹を採用した。
2.マウス体内のER-DRIの毒性評価
(1)10日齢の新生児マウス12匹をランダムに2つの群に分け、各群あたり6匹であり、1つの群は、ER-DRIを20mg/kgで1日1回腹腔内注射し、3日間の注射を連続した。別の群は、同量のPBSを対照として注射した。
(2)マウスの体重を毎日記録し、合計15日である。
(3)マウスに4週間投与した後、マウスを安楽死させ、解剖し、その脳、肝臓、肺、腎臓を分離させ、HE染色を行った。
結果は、図12に示され、20mg/kgのポリペプチド注射群とPBS群は体重が有意差がない。図13のHE染色像より、20mg/kgのポリペプチド注射群とPBS群は脳、肝臓、肺、腎臓に明らかな病理学的変化はなく、有意差がないことを示した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチドER及びER-DRIは、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μLである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ0.46μM、2.34μM、4.68μM、9.37μM、18.75μM、37.5μM、75μM、150μM、300μMになるように、ER及びER-DRIを加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.材料
トータルRNA抽出キット (Omega)、24ウェルプレート 、100mmディッシュ、50ml注射器は、迪躍創新公司から購入され、0.22μmのメンブレンフィルター(Millipore)は、飛げい公司から購入され、ワンステップq-pcrキット(Takara)は、友名公司から購入され、RNA抽出及びqRT-PCRプロセスで使用される水はDEPC水であり、実験は全体として在RNaseフリーの環境で実行された。
2.細胞中のポリペプチドの抗ウイルス効果の測定
(1)増殖状態が良いRD細胞を96ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、薬物無添加・ウイルス無添加ウェル及び薬物無添加・ウイルス添加ウェル(DMEM)を対照として設置し、ウイルスの最終濃度はMOI=0.1である。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μMであるER-DRI及びERポリペプチドを加え、また、ポリペプチドを添加せずにウイルスのみを添加する、並びにウイルス及びポリペプチドを添加しない対照群を設定した。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に、ウイルスのみを添加する対照群で病変が明らかになる場合には、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(5)37℃で2h静置した。
(6)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。計算式は、ポリペプチド阻害率=(処理されたODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)×100%/(未処理ODウェル-ウイルスのみ添加ODウェル)であり、ここで、ODはOD450-OD630の値を指す。
1. 実験材料
ポリペプチドER-DRIは、商業的に合成されたものであり、2日齢の新生児マウス10匹を採用した。
2.実験手順
(1)2日齢のICR系新生児マウス10匹をランダムに2つの群に分け、各群あたり5匹である。これらの新生児マウス10匹は、腹腔内注射にて用量108PFU EV71でチャレンジされた。
(2)チャレンジすると同時に、1つの群は、ER-DRIポリペプチドを10mg/kgで腹腔内注射して薬物治療群とし、別の群は、同量のPBSを注射して対照群とした。
(3)ポリペプチド及びPBSを12時間おきに1回注射し、チャレンジ後5日目まで注射し続けた。
(4)5日目後、新生児マウスを安楽死させ、肺を取り、Trizolにより研磨した後、組織から全RNAを抽出した。
(5)ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチドBP8、BP10及びBP15は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)RD細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μlである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ3.0625μM、6.125μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μMになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドBP8、BP10及びBP15を加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃放置4h。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.実験材料
CCK-8試薬(MCE)は、プロモーター公司から購入された。
2.実験手順
ポリペプチドBP8、BP10及びBP15は、ウイルスに抵抗する過程でウイルスを阻害できるだけでなく、細胞毒性がないことを確認する必要がある。従って、その指標を細胞毒性試験により検出し、未処理の細胞を対照群として使用した。
具体的な手順は、以下の通りである。
(1)Vero細胞を96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100μLである。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地を2%血清含有MEM培地に交換し、ウェル中の最終濃度がそれぞれ3.0625μM、6.125μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μMになるように、一定の濃度勾配でポリペプチドBP8、BP10及びBP15を加えた。
(3)ポリペプチドを加えてから24時間後に試料を収集し、各ウェルに生細胞検出試薬CCK-8 10μlを加え、均一に混合した。
(4)37℃で2h静置した。
(5)マイクロプレートリーダーでOD450における吸光度を検出した。
1.材料
ポリペプチドBP8(SEQ ID NO.12に示され)、BP10(SEQ ID NO.13に示され)及びBP15(SEQ ID NO.14に示され)を採用した。それらのポリペプチドは、商業的に合成されたものである。
2.ポリペプチドBP8、BP10及びBP15の抗ウイルス効果への影響
(1)RD細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地をCVB5ウイルスの2%血清を含むMEM培地に交換し、1ウェルにあたり0.5mlであり、MOI=0.01で、対照群にCVB5ウイルスが含まれない。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が0.78μM、1.56μM、3.13μM、6.25μMであるポリペプチドBP8、BP10及びBP15を加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
1.材料
ポリペプチドBP8(SEQ ID NO.12に示され)は、商業的に合成されたものである。
2.ポリペプチドBP8の抗CVB3ウイルス効果への影響
(1)Vero細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地をCVB3ウイルスの2%血清を含むMEM培地に交換し、1ウェルあたり0.5mlであり、対照群にCVB3ウイルスが含まれなく、ウイルスのMOI=0.01である。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が2.5μM、5μM、10μMであるポリペプチドBP8を加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
1.材料:ポリペプチドBP8(SEQ ID NO.12に示す)は、商業的に合成されたものである。2日齢のICR系新生児マウスを採用した。
2.マウス体内のポリペプチドBP8の抗ウイルス活性
(1)2日齢のICR系新生児マウス10匹をランダムに2つの群に分け、各群あたり5匹である。これらの新生児マウスの10匹は、腹腔内注射にて用量108PFU CVB5でチャレンジされた。
(2)チャレンジすると同時に、1つの群は、10mg/kgのBP8で腹腔内注射され、別の群は、同量のPBSを対照として注射された。
(3)ポリペプチド及びPBSを12時間おきに1回注射し、チャレンジ後5日目まで注射し続けた。
(4)5日目後、新生児マウスを安楽死させ、後肢の筋肉を取り、Trizolにより研磨した後、組織から全RNAを抽出した。
(5)ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
1.材料
ポリペプチドER-DEI(SEQ ID No.11に示す)は、商業的に合成されたものである。
2.ポリペプチドER-DEIの抗CVA6ウイルス効果への影響
(1)Vero細胞を24ウェルプレートに播種した。
(2)70%~80%コンフルエントに達したら、10%血清含有MEM培地をCVB3ウイルスの2%血清を含むMEM培地、1ウェルあたり0.5mlであり、対照群にCVA6ウイルスが含まれなく、ウイルスのMOI=0.01である。
(3)1時間後、それぞれ最終濃度が2.5μM、5μM、10μMであるポリペプチドBP8を加えた。
(4)ウイルスに感染してから24時間後に試料を収集し、トータルRNA抽出キットでRNAを抽出した。
(5)上清を捨て、ウェルにTRK細胞溶解液350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(6)さらに、ウェルに70%エタノール(DEPC)350μlを加え、シェーカーで5min振盪した。
(7)ウェルから溶液を取り出し、RNA抽出用カラムに移し、12000gで1min遠心した。
(8)回収チューブ中の溶液をカラムに再度ロードし、12000gで1min遠心した。
(9)RNA洗浄バッファー1を加え、12000gで30s遠心した。
(10)RNA洗浄バッファー2を加え、 12000gで1min遠心した。
(11)ステップ(10)を繰り返した。
(12)洗浄バッファーを加えずカラムを12000gで2min遠心し、残留RNA洗浄バッファーを完全に除去した。
(13)DEPC水 50μlを加え、12000gで2min遠心した。
(14)RNAサンプル2μlを採取し、ワンステップqRT-PCRキットによりリアルタイム定量PCRを行った。
Claims (9)
- SEQ ID No.1~14のいずれか1つの配列で示されるポリペプチド。
- SEQ ID No.2~14からなる群より選択される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である、ことを特徴とする核酸。
- 請求項3に記載の核酸を含む、ことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターを含む、ことを特徴とする宿主細胞。
- 請求項1に記載のポリペプチド及び薬学的に許容される添加物を含む、EV71、CVA16、CVB3、CVB5又はCVA6のエンテロウイルスによって引き起こされる疾患の予防又は治療のための薬物。
- 前記エンテロウイルスによって引き起こされる疾患は、手足口病である、請求項6に記載の薬物。
- エンテロウイルス71型の阻害剤であって、アミノ酸配列がSEQ ID No.2に示されるポリペプチドP2である阻害剤である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドの改造体であって、前記改造体は、3A-TAT-EP、3A-EP-DRI又は3A-EP-PEG4-PAであり、前記3A-TAT-EPのアミノ酸配列がSEQ ID No.3に示され、3A-EP-DRIのアミノ酸配列がSEQ ID No.4に示され、3A-EP-PEG4-PAのアミノ酸配列がSEQ ID No.5に示される改造体。
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