CN116675746A - 多肽及其在预防或治疗黄病毒属病毒感染中的用途 - Google Patents

多肽及其在预防或治疗黄病毒属病毒感染中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及能特异性抑制寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)及黄热病毒(YFV)等黄病毒属感染的多肽以及药物组合物。本发明提供的该多肽包括寨卡病毒的衣壳蛋白或其片段，所述片段与寨卡病毒的衣壳蛋白二聚体结合。这对于黄病毒属感染的治疗，尤其是孕妇ZIKV感染的治疗显得尤为重要，可以作为预防或治疗ZIKV、DENV和/或YFV等黄病毒属感染的潜在药物。

Description

多肽及其在预防或治疗黄病毒属病毒感染中的用途
技术领域
本发明属于生物技术及生物医药技术领域，涉及病毒抑制剂，具体涉及抑制寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)及黄热病毒(yellow fevervirus，YFV)感染的多肽。
背景技术
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)与登革病毒(dengue virus，DENV)及黄热病毒(yellow fever virus，YFV)一样，同属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为一条正向单链RNA，大小约10.8Kb，编码3个结构蛋白(PrM、Envelope、Capside)和七个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
ZIKV是虫媒病毒中的一种，虽然ZIKV主要由白天活动的伊蚊叮咬传播，但研究显示，其传播方式还有母婴垂直传播、性传播及输血传播。报道公开了ZIKV感染导致发烧、疹子、关节疼痛、肌肉疼痛、头痛和结膜炎等症状，但症状多较温和，为自限性疾病，一般2～7天后自行好转。但是已证实ZIKV感染孕妇后，病毒可穿透胎盘屏障，可导致婴儿出现小头症或其他比较严重的脑损伤，尤其是在怀孕的前3个月；同时，ZIKV感染可能还与Guillain-Barre综合征有关。
然而，目前相关领域尚没有有效预防及治疗ZIKV感染的疫苗或药物，本领域研究人员认为，预防ZIKV感染的主要的措施是防止蚊虫的叮咬，而ZIKV感染的治疗是对症治疗，缓解其疾病症状；基于现状，目前亟需研究ZIKV的特效药物，寄希望于能够为感染ZIKV的孕妇提供特异性治疗，以减少小头症婴儿的出生。
由于多种黄病毒具有相同的传播媒介，即埃及伊蚊，目前已有DENV、ZIKV及其他黄病毒，如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)共感染的病例报道。然而，患者体内已有的DENV抗体会通过抗依赖的增强效应(antibody-dependent enhancement effect，ADE，体内已有病毒抗体能够增强异源病毒感染的效应)增强ZIKV的感染。同样，一些ZIKV抗体也会增强DENV的感染。通过修饰抗体降低其与FcγR的结合可降低其ADE效应，然而此举会增加抗体的生产成本。若药物具广谱抗黄病毒活性，或可用于治疗ZIKV和DENV或其他黄病毒共感染的病例，而无需考虑ADE效应。目前尚无针对ZIKV感染及其与其他黄病毒感染导致的后续疾病没有有效预防及治疗病毒感染的疫苗或药物。
基于多肽类药物具有较高的特异性和安全性，在人体内半衰期相对较短，目前亟需针对寨卡病毒感染及其他黄病毒如DENV、YFV的感染的多肽类药物。
发明内容
针对寨卡病毒(ZIKV)感染及其他黄病毒属如登革病毒(DENV)及黄热病毒(YFV)的感染，本发明提供了能特异性抑制黄病毒属感染的多肽类药物，尤其是能特异性抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽类药物，这对于黄病毒感染的治疗，尤其是孕妇ZIKV感染的治疗显得尤为重要，可以作为治疗ZIKV、DENV和/或YFV感染的潜在药物。
本发明的上述目的通过以下具体方案实现。
在第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包括寨卡病毒的衣壳蛋白或其片段，所述片段与寨卡病毒的衣壳蛋白二聚体结合。
在一些实施方式中，所述片段与寨卡病毒的衣壳蛋白的RNA结合区域和/或包膜蛋白-膜蛋白结合区域(E-M结合区域)结合。
在一些实施方式中，所述结合为非共价键结合。
在一些实施方式中，该多肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
本发明的另一方面提供了一种融合多肽，所述融合多肽包括第一方面所述的多肽和穿膜肽。
在一些实施方式中，所述穿膜肽包括SEQ ID NOs:3～8中至少一项所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述穿膜肽包括SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
本发明的多肽或融合多肽能够用于预防、抑制和/或治疗ZIKV、DENV和/或YFV等黄病毒的感染。
本发明的又一方面提供了一种核酸分子，包括编码本发明所述的多肽或融合多肽的核苷酸序列。
本发明的又一方面提供了一种表达载体，包括本发明所述的核酸分子。
本发明的又一方面提供了一种宿主细胞，包括本发明所述的核酸分子或所述的表达载体。
本发明的又一方面提供了一种药物组合物，包括所述的多肽、或所述的融合多肽、或所述的核酸分子、或所述的表达载体、或所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
在一些实施方式中，所述药物组合物为片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、混悬液、粉剂、乳剂、气雾剂、凝胶剂、滴眼剂、缓释剂或缓释植入体的形式。在一些实施方式中，所述药物组合物可以配制成可注射的配制品。在一些实施方式中，所述配制品适合于玻璃体内注射、皮下、皮内、肌内、静脉、鞘内或椎管内给药。
本发明的药物组合物有利于ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的预防、治疗或抑制，尤其对于疫区孕妇ZIKV感染的治疗尤为重要。
本发明的又一方面提供了一种药盒，包括本发明所述的药物组合物，所述药物组合物被封装在容器中，所述容器优选是玻璃安瓿、玻璃瓶、塑料安瓿、塑料瓶、塑料袋或预装式注射器。在一些实施方式中，本发明涉及适合于向人类肠胃外给药的药物单位剂型，该药物单位剂型包含在适合容器中的如本文所述的药物组合物。在一些实施方式中，所述适合容器是预填充的注射器。在一些实施方式中，该预填充的注射器包括注射针。
本发明的又一方面提供了本发明所述的多肽、所述的融合多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体、所述的宿主细胞、所述的药物组合物或所述的药盒在制备用于预防、抑制或治疗黄病毒属感染的药物中的应用。
在一些实施方式中，所述黄病毒属感染包括寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)和/或黄热病毒(YFV)感染等。
本发明中，所述多肽可以通过人工直接合成，也可通过基因工程手段体外表达获得，由所述的多肽及编码其的核酸分子均可直接或间接的获得抑制ZIKV和/或DENV、YFV感染的药物；因此，本发明中所述多肽及编码其的核酸分子可用于制备抗ZIKV的药物。
本发明的多肽可以通过干扰病毒组装的方式较好地抑制ZIKV和/或DENV、YFV感染，具有抑制黄病毒广谱性且细胞毒性小的特点，本发明的多肽抑制剂有利于ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的预防、治疗或抑制，尤其对于疫区孕妇ZIKV的治疗显得尤为重要，可以作为治疗ZIKV和/或DENV、YFV感染的潜在药物。
附图说明
图1显示多肽C3在ZIKV C蛋白中的位置，ZIKV C蛋白由E-M结合区域、二聚化区域、RNA结合区域组成，其中C3位于C蛋白RNA结合区域，此区域参与了病毒核衣壳蛋白和病毒基因组的组装。
图2显示多肽C3可以抑制ZIKV感染导致的细胞病变，在细胞系Vero E6和BHK21中的显著抑制细胞病变，而无关对照多肽NR则无抑制效果。
图3显示多肽C3可以抑制ZIKV的增殖，在细胞系Vero E6和BHK21中的IC50值分别约为0.593μM，0.2443μM，而无关对照多肽NR则无抑制效果。
图4显示多肽C3对DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV和JEV均无有抑制活性，表明多肽C3对ZIKV的抑制具有特异性。
图5显示多肽C3对CHIKV无明显的抑制活性，表明多肽C3具有一定种属特异性。
图6显示多肽C3在浓度高达20μM时，其对BHK21、SF268、Vero E6细胞仍无明显的毒性，表明多肽C3对细胞毒性较小，安全性较高。
图7显示多肽C3在高达120mg/kg的给药剂量时，其对孕鼠组织均没有明显毒性，表明多肽C3对孕鼠无明显毒性。
图8显示多肽C3在高达120mg/kg的给药剂量时，其对子鼠组织均没有明显毒性，表明多肽C3对子鼠无明显毒性。
图9显示腹腔注射ZIKV于A129小鼠1h后，腹腔用药多肽C3能保护40％的A129小鼠免受ZIKV感染导致的死亡(p＝0.0328，Log-rank test)。
图10显示经C3与ZIKV C蛋白二聚体相互作用，且其作用位点集中于ZIKV C蛋白RNA结合区域组成和E-M结合区域。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
定义
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文针对氨基酸所使用的术语“取代”是指一氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基被另一个不同的“置换”氨基酸残基置换。本文针对氨基酸所使用的术语“插入”是指将至少一个额外氨基酸掺入一氨基酸序列中。虽然插入物通常由插入1或2个氨基酸残基组成，但也可以制备较大的“肽插入物”，例如插入约3至5个或甚至最多约10、15或20个氨基酸残基。如以上所公开，插入的残基可以是天然存在或非天然存在的。本文针对氨基酸所使用的术语“缺失”是指从一氨基酸序列去除至少一个氨基酸残基。
本文的多肽可在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本文中，多肽中的必需或非必需氨基酸残基优选地用来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基置换。在某些实施方式中，氨基酸链段可以用结构类似且侧链家族成员的次序和/或组成不同的链段置换。或者，在某些实施方式中，可沿编码序列的全部或一部分随机引入突变，如通过饱和诱变引入，并且由此得到的突变体可掺入本发明的多肽中，并针对这些多肽结合至所希望的靶标的能力进行筛选。
本文所用的术语“穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)”是一类由不多于30个氨基酸组成的小分子多肽，根据其氨基酸组成，可分为阳离子细胞穿膜肽和两亲性细胞穿膜肽。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”指药物制剂中除了活性成分之外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括，但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
本文所使用的术语“治疗”指减轻和/或改善障碍和/或与其相关的疾病或症状，以及预防障碍症状的恶化。期望的治疗效果包括，但不限于防止疾病发生或复发，症状的缓解，疾病的任何直接或间接的病理结果的减少、防止转移、减缓疾病发展速度、改善或缓解症状、缓解或改善预后。但应当理解，治疗疾病或症状并不要求完全地消除该疾病或与其相关的症状。
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)与登革病毒(dengue virus，DENV)及黄热病毒(yellow fever virus，YFV)一样，同属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为一条正向单链RNA，大小约10.8Kb，编码3个结构蛋白(PrM、Envelope、Capside)和七个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。
登革病毒(dengue virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型亚群，存在四种不同但密切相关的病毒血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒RNA约含有11000个核苷酸，MW为4.2×106，编码3个结构蛋白(C、PrM和E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。
黄热病病毒(yellow fever virus，YFV)是黄热病科黄热病毒属的单股正链RNA病毒。病毒颗粒呈球形，直径40-60nm，外有脂质包膜，表面有棘突，基因组长度约为11kb。黄热病毒只有一个血清型，根据病毒基因组序列特征可分为多个基因型。该病毒可与同为黄病毒属的登革病毒、寨卡病毒、西尼罗病毒等产生血清学交叉反应。
本发明提供了一条可抑制ZIKV感染的多肽，实验证明其对ZIKV病毒具有高效抑制活性；同时，以ZIKV为主要模型，系统地研究了其体内有效性及毒性，结果显示该多肽具有很好的活性及安全性。
本发明以ZIKV核衣壳(capsid protein，C)蛋白的晶体结构(PDB:5Z0R，5Z0V)为基础，依据ZIKV C蛋白功能结构域截短C蛋白，并以此执行ZIKV多肽抑制剂研究实验，结果表明，选取的多肽(SEQ ID NO:1所示)对ZIKV表现出较好的抑制活性，且在病毒感染早期抑制病毒的感染；经动物实验表明，多肽能抑制ZIKV在C57BL/6孕鼠中的垂直传播，还能保护A129小鼠免受ZIKV感染导致的死亡。对其作用机制进行分析，发现其可与C蛋白相互作用，抑制病毒组装，最终抑制病毒增殖；经细胞毒性检测，所述多肽C3对BHK21、SF268、Vero细胞均无毒性。
本发明中，所述多肽可以通过人工直接合成，也可通过基因工程手段体外表达获得，由所述的多肽及基因均可直接或间接的获得抑制ZIKV和/或DENV、YFV感染的药物；因此，本发明中所述多肽及编码其的核酸分子可用于制备抗ZIKV的药物。
本发明提供了多肽及编码其的核酸分子在制备ZIKV和/或DENV、YFV感染的多肽抑制剂中的用途；所述抑制ZIKV和/或DENV、YFV感染的多肽抑制剂，经试验表明，该多肽抑制剂可以通过干扰病毒组装的方式较好地抑制ZIKV和/或DENV、YFV感染，具有抑制黄病毒广谱性且细胞毒性小的特点，本发明的多肽抑制剂有利于ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的治疗。
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
以下实施例中，通过如下的方法确定核酸拷贝的方法：
(1)应用ZIKV通用探针引物(通用探针引物及质粒模板的具体信息请参见：参考文献Liu Y,al.et.Nature.2017May)，进行ZIKV病毒QRT-PCR核酸检测；
(2)应用QRT-PCR进行DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV核酸检测，使用的DENV，YFV检测引物均为通用性探针引物(其中，DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4的探针引物的具体信息请参见：Santiago GA,al.et.PLoS Negl Trop Dis.2013Jul.YFV的探针引物的具体信息请参见：Domingo C,al.et.J Clin Microbiol.2012Dec)；
(3)应用QRT-PCR进行CHIKV核酸检测，使用的引物为CHIKV通用性探针引物(CHIKV探针引物的具体信息请参见：Pabbaraju K,al.et.J Clin Virol.2016Oct)。
实施例1多肽药物C3设计
本实施例以ZIKV核衣壳(capsid protein，C)蛋白(Genebank号：KX266255.1，SEQID NO:1)的晶体结构(PDB:5Z0R，5Z0V)为基础，依据ZIKV C蛋白功能结构域截短C蛋白，并对多肽C3(SEQ ID NO:2，EAMEIIKKFKKDLAAMLRIINARKE)进行病毒抑制研究，推测其可以抑制病毒的组装阶段；如图1所示，结果表明，本发明的多肽C3位于C蛋白RNA结合区域，靠近病毒的膜间隙区域。多肽C3委托金斯瑞生物科技有限公司合成。
实施例2多肽C3对ZIKV感染导致细胞病变的抑制活性检测
(1)分别合成含有多肽C3和穿膜肽的融合蛋白(SEQ ID NO:9)以及含有对照多肽NR和穿膜肽的融合蛋白(SEQ ID NO:11)；
(2)使用无血清DMEM在96孔板中2倍比梯度稀释上述融合蛋白，起始浓度为20μM，共稀释7个浓度，每孔加药体积为50μL，每个梯度设置3个重复；
(3)使用无血清DMEM稀释ZIKV，使得病毒的终浓度为0.01MOI，每孔50μL加入(1)中的96孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)、阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，以及对照多肽组(加对照多肽及病毒，其中对照多肽NR的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)，病毒与药物37℃条件下孵育1.5h；
(4)将(2)中的混合液100μL加入铺有BHK21细胞或Vero E6细胞的96孔板中。37℃、5％CO2条件下培养24h，更换培养基为含有2％FBS的DMEM培养基；
(5)5-8天后，显微镜下观察细胞状态，并使用CCK8检测多肽C3对ZIKV的抑制活性。将500μL CCK8溶液加入10mL无血清DMEM中(一块96孔板的用量)，颠倒混匀；
(6)小心吸弃96孔板中的培养基，将(4)反应液加入96孔中，每孔100μL；
(7)37℃条件下培养2h后，使用酶标仪测定OD 450值；
(8)计算多肽C3对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(药物孔OD 450值-病毒孔OD 450平均值)×100％/(无药物孔OD 450平均值-病毒孔OD 450平均值)。
结果如图2所示。结果表明，本发明中的多肽C3可以抑制ZIKV感染导致的细胞病变，在细胞系Vero E6和BHK21中的显著抑制细胞病变，而无关对照多肽NR则无抑制效果。
实施例3多肽C3抑制ZIKV增殖的抑制活性检测
(1)将BHK21细胞和Vero E6铺于96孔板中，每孔2×104个，37℃、5％CO2条件下培养12h后待用；
(2)使用无血清DMEM在24孔板中10倍比梯度稀释实施例2中融合蛋白，起始浓度为20μM，共稀释7个浓度，每孔加药体积为250μL，每个梯度设置3个重复；
(3)使用无血清DMEM稀释ZIKV，使得病毒的终浓度为0.01MOI，每孔250μL加入(1)中的24孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)、阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，以及对照多肽组(加对照多肽及病毒)病毒与药物37℃条件下孵育1.5h；
(4)将(2)中的混合液500μL加入铺有BHK21细胞或Vero E6细胞的96孔板中；
(5)37℃、5％ CO2条件下培养24h，更换培养基为含有2％FBS的DMEM的新鲜培养基；
(6)2-3天后，取200μL使用自动核酸提取仪，提取ZIKV基因组核酸；
(7)应用ZIKV通用探针引物，进行ZIKV病毒QRT-PCR核酸检测；
(8)计算多肽C3对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(病毒孔ZIKV核酸拷贝-药物孔ZIKV核酸拷贝)×100％/(病毒孔ZIKV核酸拷贝)。
结果如图3所示。结果表明，本发明中的多肽C3可以抑制ZIKV的增殖，在细胞系Vero E6和BHK21中的IC50值分别约为0.593μM和0.2443μM，而无关对照多肽NR则无抑制效果。
实施例4多肽C3对DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV，JEV感染抑制活性的检测
(1)将BHK21细胞和Vero E6铺于24孔板中，每孔1×105个，37℃、5％CO2条件下培养12h后待用；
(2)使用无血清DMEM在24孔板中10倍比梯度稀释实施例2中融合蛋白，起始浓度为20μM，7个稀释度，每孔加药体积为250μL，每个浓度设置3个重复；
(3)使用无血清DMEM分别稀释DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV，JEV，使得病毒的终浓度为0.01MOI，每孔250μL加入(1)中的24孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)及阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，病毒与药物37℃条件下孵育1.5h；
(4)将(2)中的混合液500μL加入铺有Vero E6细胞的24孔板中。
(5)37℃、5％ CO2条件下培养24h，更换培养基为含有2％FBS的DMEM的新鲜培养基；
(6)2-3天后，取200μL使用预分装核酸提取试剂盒(深圳华因生物科技有限公司，规格16T/板，运行程序HY-216)，进行全自动核酸提取DENV-1,DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV17D，JEV基因组核酸；
(7)应用QRT-PCR进行DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV，JEV核酸检测，使用的DENV，YFV，JEV，检测引物均为通用性探针引物；
(8)计算多肽C3对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(病毒孔核酸拷贝-药物孔核酸拷贝)×100％/(病毒孔核酸拷贝)；
结果如图4所示。结果表明，多肽C3对DENV-1，DENV-2，DENV-3，DENV-4，YFV和JEV均没有抑制活性，表明本发明中的多肽C3对ZIKV的抑制具有特异性。
实施例5多肽C3对甲病毒科病毒CHIKV感染抑制活性的检测
(1)将BHK21细胞和Vero E6铺于24孔板中，每孔1×105个，37℃、5％CO2条件下培养12h后待用；
(2)使用无血清DMEM在24孔板中10倍比梯度稀释实施例2中融合蛋白，起始浓度为20μM，7个稀释度，每孔加药体积为250μL，每个浓度设置3个重复；
(3)使用无血清DMEM稀释CHIKV，使得病毒的终浓度为0.01MOI，每孔250μL加入(1)中的24孔板(加药物及病毒孔记为药物孔)，同时设置病毒感染的阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)及阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，病毒与药物37℃条件下孵育1.5h；
(4)将(2)中的混合液500μL加入铺有Vero E6细胞的24孔板中；
(5)37℃、5％ CO2条件下培养24h，更换培养基为含有2％FBS的DMEM的新鲜培养基；
(6)2-3天后，取200μL使用自动核酸提取仪，提取CHIKV基因组核酸；
(7)应用QRT-PCR进行CHIKV核酸检测，使用的引物为CHIKV通用性探针引物；
(8)计算多肽C3对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(病毒孔核酸拷贝-药物孔核酸拷贝)×100％/(病毒孔核酸拷贝)；
结果如图5所示。结果表明，多肽C3对CHIKV无明显的抑制活性，表明多肽C3对黄病毒的抑制具有一定的种属特异性。
实施例6多肽C3对BHK21、Sf268、Vero E6细胞的毒性检测
(1)将BHK21、Sf268、Vero E6细胞分别铺于96孔板中，每孔1×104个，37℃、5％ CO2条件培养6h后使用；
(2)使用无血清DMEM稀释实施例2中融合蛋白，使其浓度为20μM、10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0.0001μM，每孔100μL，每个浓度设置3个重复，记为药物孔。同时设置无药物孔和无细胞孔(即单纯DMEM)；
(3)37℃、5％ CO2条件下培养24h后，显微镜下观察细胞状态；
(4)将500μL CCK8溶液加入10mL无血清DMEM中，颠倒混匀；
(5)小心吸弃96孔板中的培养基，将(4)反应液加入96孔中，每孔100μL；
(6)37℃、5％ CO2条件下培养2h后，在酶标仪OD 450下测定各孔的吸光度值；
(7)计算细胞的活性，计算公式为：细胞活性＝(药物孔OD 450值-无细胞孔OD 450平均值)×100％/(无药物孔OD 450平均值-无细胞孔OD 450平均值)；
结果如图6所示。结果表明，多肽C3在浓度高达20μM时，其对BHK21、Sf268、Vero E6无明显的毒性，表明多肽C3对细胞毒性较小，安全性较高。
实施例7多肽C3对孕鼠安全性检测
(1)将C57BL/6孕鼠(怀孕12-14天，n＝20)随机分为4组，通过眼眶采血，收集孕鼠血样，检测ALT(Alanine aminotransferase),Creatinine含量；
(2)分别给4组注射不同剂量实施例2中融合蛋白(10mg/kg，n＝5；35mg/kg，n＝5；120mg/kg，n＝5)，对照组尾静脉注射PBS(n＝5)；
(3)分别在孕鼠接受药物处理1d，3d，5d后，通过眼眶采血，收集孕鼠血样，检测ALT(Alanine aminotransferase),Creatinine含量；
(4)随后对小鼠进行了为期21天的观察，并记录观察结果；
(5)随机选取两只子鼠和对应母鼠进行解剖，执行HE染色验证；
(6)使用GraphPad Prism Software进行统计分析。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
结果如图7(孕鼠)和图8(子鼠)所示。结果表明，多肽C3处理组和PBS对照组相比母鼠和子鼠组织均无病变，即在最高剂量C3蛋白(120mg/kg)给药时，对小鼠也有较好的安全性。
实施例8多肽C3抑制ZIKV对A129小鼠的致死性感染实验
(1)将1×105PFU ZIKV(SMGC)腹腔注射于A129小鼠(I型干扰素缺陷，4周龄，n＝20)体内；
(2)1h后，将上述小鼠随机分为两组，一组腹腔注射实施例2中含有多肽C3的融合蛋白(10mg/kg，n＝10)，另一组为腹腔注射等量的实施例2中含有NR多肽的融合蛋白(vehicle)(10mg/kg，n＝10)；
(3)每天注射1次，连续注射6天；
(4)在A129小鼠攻毒2d后，通过眼眶采血，收集孕鼠血样，使用RT-qPCR法测定血清中的病毒载量；
(5)对小鼠进行了为期21天的观察，并记录观察结果；
(6)使用GraphPad Prism Software进行统计分析。**，p<0.01；
结果如图9所示。结果表明，腹腔注射ZIKV于A129小鼠1h后，腹腔用药多肽C3能保护40％的A129小鼠免受ZIKV感染导致的死亡(p＝0.0328，Log-rank test)。
实施例9多肽C3与ZIKV C蛋白互作位点分析
本实施例中使用ZDOCK 3.0.2分别预测多肽C3和衣壳蛋白-C蛋白的结合方式；对接开始之前，采用Alphafold2模型预测capsid-protein-C以及多肽C3的三维结构。对接时以ZDOCK 3.0.2的默认配置进行对接研究，进行全局刚性堆积并打分，随后，对对接结果打分最好的构象通过AMBER软件进一步精细处理，即能量最小化优化去除局部结构冲突，最后采用PyMOL 2.5.2进行可视化分析。结果如图10所示。基于对接预测的多肽C3和蛋白结合模式，图中黄色虚线表示氢键作用。酒红色虚线表示盐桥作用，酒红色的实心短线条表示短肽和蛋白发生相互接触作用的氨基酸，结果表明多肽C3与ZIKV C蛋白二聚体通过非共价结合的方式相互作用，且其作用位点集中于ZIKV C蛋白RNA结合区域和E-M结合区域。
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多肽，包括寨卡病毒的衣壳蛋白或其片段，所述片段与寨卡病毒的衣壳蛋白二聚体结合，优选地，所述片段与寨卡病毒的衣壳蛋白的RNA结合区域和/或包膜蛋白-膜蛋白结合区域(E-M结合区域)结合。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
3.一种融合多肽，包括权利要求1所述的多肽和穿膜肽。
4.根据权利要求3所述的融合多肽，其特征在于，所述穿膜肽包括SEQ ID NOs:3～8中至少一项所示的氨基酸序列；
优选地，所述穿膜肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述融合蛋白包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。
5.一种核酸分子，包括编码权利要求1或2所述的多肽或权利要求3或4所述的融合多肽的核苷酸序列。
6.一种表达载体，包括权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，包括权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体。
8.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述的多肽、或权利要求3或4所述的融合多肽、或权利要求5所述的核酸分子、或权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、散剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、混悬液、粉剂、乳剂、气雾剂、凝胶剂、滴眼剂、缓释剂或缓释植入体的形式。
10.权利要求1或2所述的多肽、权利要求3或4所述的融合多肽、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8或9所述的药物组合物在制备用于预防、抑制或治疗黄病毒属感染例如寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)和/或黄热病毒(YFV)感染的药物中的应用。
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