CN111320670B - 一种抑制寨卡病毒、登革病毒及黄热病毒感染的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术及生物医药技术领域，涉及病毒抑制剂，具体涉及多肽包括Z155及其在制备ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的多肽抑制剂中的用途。经试验表明，所述多肽Z155能与寨卡病毒颗粒结合，进一步通过与病毒融膜肽结合抑制病毒感染细胞。所述多肽对黄病毒科病毒有广谱抗病毒效果，且多肽细胞毒性极低。本发明的多肽抑制剂可以制备作为治疗ZIKV感染的药物，有利于ZIKV、DENV及YFV单独感染或者共感染的治疗，尤其对于寨卡感染者尤其是孕妇感染的治疗尤为重要。

Description

一种抑制寨卡病毒、登革病毒及黄热病毒感染的多肽及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术及生物医药技术领域，涉及多肽类病毒抑制剂。具体涉及抑制寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)及黄热病毒(yellowfevervirus，YFV)感染的抑制剂，特别是涉及多肽Z155及其在制备ZIKV、DENV及YFV感染的多肽抑制剂中的用途。

背景技术

现有技术公开了寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)为一种新发的虫媒病毒(arboviruses)，属于黄病毒科黄病毒属，寨卡病毒主要通过蚊虫叮咬传播，具有自然疫源性。2013年至2014年，ZIKV在法属波利尼西亚暴发，2015年4月巴西暴发ZIKV感染，病毒在美洲迅速蔓延，随后全球60多个国家出现ZIKV的感染。从2015年到2018年1月，全球有80多万例ZIKV感染及疑似感染的病例报告。随着病毒扩散，寨卡可能在新的区域暴发，寨卡感染可能危害到更多人的健康。

研究报道寨卡病毒感染可引起神经症状，感染孕妇可以引起胎儿小头症及一些其他症状。寨卡感染后约有20％的感染者出现临床症状，症状表现为轻度发热、头痛、皮疹、肌肉和关节疼痛、结膜炎、呕吐、淋巴结肿大和腹泻等不适症状。但孕妇感染寨卡病毒，尤其是在怀孕的前三个月感染，可能引起严重后果。寨卡病毒能穿过胎盘屏障影响胎儿的生长发育,造成胎儿流产以及先天畸形、小头症和其他出生缺陷等严重的临床症状；同时，ZIKV能穿过血脑屏障，其感染还和格林－巴利综合征(Guillain-Barrésyndrome，GBS)相关。

对于寨卡病毒感染，目前没有获得批准的特效治疗药物，也没有可用于预防的寨卡病毒疫苗上市。目前预防和控制寨卡病毒的方法主要是通过消灭蚊虫控制传播媒介。对于寨卡病毒感染的治疗主要是支持疗法，以缓解疾病症状为主。虽然有若干黄病毒的疫苗研发平台可以提供改造。寨卡病毒疫苗的开发研究也面临与登革热、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)等虫媒病毒疫苗相同的问题，即抗体依赖的增强效应(antibody-dependent enhancement effect，ADE)。研究显示，ZIKV感染患时，机体会产生抗体，部分中和效果较差抗体的抗体可能会增强下一次同一类病毒的感染，这种在DENV感染中经常出现，ZIKV抗体也会增强DENV的感染，与ZIKV同属于黄病毒属的登革病毒(DENV)、基孔肯雅病毒和黄热病毒(YFV)等虫媒病毒均可通过埃及伊蚊传播，这几种病毒的流行区域和寨卡有较多重叠，出现共感染的几率很大，寨卡感染症状与所述几种黄病毒属病的的感染通过症状很难区分开，在疫苗接种和运用抗体治疗寨卡感染时需要充分评估潜在的ADE效应，并且，即使开发出可用的疫苗，寨卡和其他虫媒病毒相似，其流行病的出现是零星的和不可预测的，在疾病暴发前为大量人群预先接种疫苗也需要高昂的花费；对于寨卡感染引起的疾病，目前存在巨大的需求，需开发有效的抗病毒药物，特别是特定人群，如孕妇感染，特异性治疗药物能减少婴儿小头症的发病。

研究显示，病毒-细胞融合是包膜病毒进入细胞所必需的过程；寨卡病毒通过受体介导的内吞作用进入细胞，在内吞泡内病毒包膜和内吞泡膜融合将核衣壳释放到细胞质中，该过程主要由寨卡病毒包膜蛋白(E蛋白)介导，在内吞泡内的低pH环境诱导下E蛋白发生重排，构型由二聚变成三聚，融合肽暴露，随后融合肽插入内吞泡膜；E蛋白构像发生二次变化，通过折叠成发卡结构拉近病毒包膜和内吞泡膜，二者发生膜融合，病毒的遗传物质进入细胞质。

研究表明，病毒的融合过程可以通过抑制剂阻断，通过阻断膜融合，可以在早期抑制病毒感染，因此，研究人员认为抑制病毒膜融合是一个重要的药物靶点。多肽类药物作用具有较高的活性和特异性，并且安全性高；目前多肽类病毒融合抑制剂的研发主要是针对I型膜融合病毒，对于寨卡和登革病毒等II型膜融合病毒的融合抑制剂的研究极少将报道，尤其，针对寨卡病毒特效的多肽类融合抑制剂尚未见报道。有研究发现来自寨卡病毒E蛋白stem区的多肽Z2可抑制寨卡病毒的感染，但其作用机制主要是破坏病毒包膜结构，导致基因组丢失，从而丧失感染性，实质其并不是阻断融合过程的融合抑制剂。

基于现有技术的基础与现状，本申请的发明人拟提供新的多肽类病毒抑制剂，具体涉及能特异性抑制黄病毒属病毒感染的多肽类药物，尤其是能特异性抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽类药物。

发明内容

本发明目的在于基于现有技术的基础与现状，提供新的多肽类病毒抑制剂，具体涉及能特异性抑制黄病毒属病毒感染的多肽类药物，尤其是能特异性抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽类药物。

本发明提供了一种特异性抑制抑制寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)、登革病毒(dengue virus，DENV)及黄热病毒(yellow fever virus，YFV)感染的多肽，该多肽可用于制备针对ZIKV感染及其他黄病毒感染的治疗药物，尤其涉及多肽Z155及其在制备ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽抑制剂中的用途。

本发明提供了一段新的多肽序列—Z155，其可靶向寨卡病毒的融膜肽(FP)，通过结合FP，对寨卡病毒的膜融合产生高效的抑制，进一步制备抗病毒融合抑制剂。同时，该多肽对其他黄病毒属病毒如DENV、YFV的感染有良好的抑制效果，具有广谱抗黄病毒属病毒的活性。本发明以ZIKV为主要研究模型，系统地研究了多肽Z155在动物模型上的体内有效性及安全性，结果显示，该多肽具有很好的体内抗病毒效果和安全性，并能穿过血脑屏障和胎盘屏障，对于治疗寨卡头部感染和阻断母婴垂直传播有重要意义。

本发明的多肽抑制剂可用于ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的治疗。

本发明提供了一条可广谱抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽，实验证明其对所述三种病毒具有高效抑制活性。对其体内有效性及毒性进行系统的评估，结果显示该多肽具有很好的抗病毒活性及安全性。

本发明以ZIKV包膜(Envelope，E)蛋白氨基酸序列为基础，设计合成了多肽肽库，经过筛选，获得了一条多肽作为ZIKV、DENV及YFV多肽抑制剂进行研究，结果表明，筛选的多肽Z155(Z155-SEQ1所示)对ZIKV、DENV和YFV均表现出较好的广谱抑制活性；该多肽靶向融膜肽，通过一种全新的方式灭活病毒，属于融合抑制剂：所述多肽先与病毒颗粒结合，抑制病毒内吞后的融合阶段；多肽和病毒颗粒的结合是不可逆的，对病毒具有灭活作用，多肽能在病毒感染早期抑制病毒的感染；经动物实验表明，该多肽能减少ICR孕鼠血清和小鼠胎盘中的病毒载量，具有阻断寨卡垂直传播的潜力，同时，多肽处理能保护A129小鼠免受ZIKV感染导致的死亡，提高小鼠感染后的存活率；细胞毒性检测结果显示，多肽Z155在40μM浓度时对BHK-21、Vero细胞均没有明显细胞毒性；在100μm浓度时不会引起鼠红细胞溶血，没有显示细胞毒性。该多肽较短，仅15个氨基酸序列，其合成花费更少，用于治疗的成本更低，并且能穿过血脑屏障和胎盘屏障，对于治疗头部感染和阻断母婴垂直传播有重要意义。

更具体的，本发明提供了一种多肽Z155，其氨基酸序列如Z155-SEQ1所示；所述序列为:FSQILIGTLLMWLGL。

本发明的Z155-SEQ1所示的氨基酸序列的抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽抑制剂，其氨基酸序列为：FSQILIGTLLMWLGL。

本发明的多肽Z155其序列还可以是下列中的一项，

(1)与Z155-SEQ1所示的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、94％、95％相同的氨基酸序列，或，

(2)以Z155-SEQ1中任一种所示的氨基酸序列中取代、添加、缺失或插入1个或多个，优选2、3、4或5个氨基酸残基的氨基酸序列，所述取代优选是保守氨基酸取代，所述多肽特异性结合ZIKV和/或DENV和/或YFV的融膜肽区域，并通过结合以上病毒的融膜肽造成病毒颗粒失去感染性。

本发明提供了一种用于抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽抑制剂Z155，所述多肽抑制剂其包括所述的多肽Z155，该多肽抑制剂Z155可用于ZIKV、DENV和/或YFV感染的抑制。

本发明还提供了抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的药物，其包括所述的多肽Z155，该药物可用于ZIKV、DENV和/或YFV感染的抑制。

本发明提供上述多肽对应的Z155-SEQ 2所示的病毒基因，其序列为Z155-SEQ2或者Z155-SEQ2经个别位点突变但均可编码所述的多肽，其编码产物为所述的多肽Z155。

本发明提供了一种抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽药物，其包扩所述的可编码Z155多肽的基因序列。

本发明中，所述多肽可以直接合成，也可以通过基因工程手段体外表达获得，由所述的多肽及基因产物均可直接或间接的获得抑制ZIKV、DENV和/或YFV的药物；因此，本发明中所述多肽Z155及其对应基因序列可用于制备抗ZIKV、DENV和/或YFV的药物。

本发明提供了多肽Z155及其在制备ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽抑制剂Z155中的用途，所述抑制ZIKV、DENV和/或YFV感染的多肽抑制剂Z155，经试验表明，该多肽抑制剂Z155可以通过抑制病毒融合的方式较好地抑制ZIKV、DENV和/或YFV的感染，具有广谱抑制黄病毒活性。本发明的多肽抑制剂可用于制备ZIKV、DENV及YFV单独感染或共感染的治疗药物。

附图说明

图1显示本发明中的多肽Z155在BHK-21细胞上抑制ZIKV的感染，IC₅₀＝0.92±0.21μM，而对照的Z155-scr随机多肽则无抑制效果。

图2显示本发明中的多肽Z155对DENV-2及YFV-17D具有抑制活性，IC₅₀值分别约为0.291±0.011μM和0.64±0.022μM，表明所述的多肽Z155对黄病毒的抑制具有广谱性。

图3A显示本发明中的病毒感染不同时间后加入多肽，病毒感染1h后，抑制率明显降低；病毒感染3h后，几乎没有抑制效果；表明Z155在ZIKV感染的早期阶段发挥作用；B显示多肽与细胞在4℃共孵育30分钟后，洗去游离的多肽，多肽几乎无抑制活性，而未洗组的多肽仍保持较高的抗病毒活性，说明多肽的作用位点不在细胞上，而在病毒上。

图4显示本发明中的多肽Z155对VSV及EBOV假病毒没有抑制活性，表明所述的多肽Z155对黄病毒的抑制具有一定的特异性。

图5显示多肽Z155在浓度高达40μM时，其对BHK-21细胞、Vero细胞无明显的毒性，表明多肽Z155对细胞毒性较小，安全性较高。

图6显示多肽Z155在100μM浓度下，其对小鼠红细胞无裂解毒性，表明多肽Z155对红细胞无明显毒性。

图7显示多肽Z155处理组与对照组相比，多肽Z155能够显著降低ZIKV感染的ICR孕鼠血清中的病毒载量(p＝0.0159，Mann-Whitney test)。

图8显示多肽Z155处理组与vehicle对照组相比，多肽Z155能显著降低ZIKV感染的ICR孕鼠中胎盘的病毒载量(p<0.0001，Mann-Whitney test)。

图9显示腹腔注射感染多肽处理ZIKV于A129小鼠，腹腔用药多肽Z155能保护减少A129血清中的病毒载量(p＝0.0022，MannWhitneytest)。

图10显示腹腔注射多肽处理能保护A129小鼠致死剂量ZIKV感染，显著提升存活率(p＝0.0006，Log-ranktest)。

图11显示ZIKV经Z155多肽处理后，分离出寨卡病毒，病毒的感染力并没有恢复，表明多肽对ZIKV有灭活作用，EC₅₀＝0.275±0.126μM。

图12显示Cy-5标记的Z155多肽和Cy-3标记的寨卡病毒颗粒荧光共定位，表明多肽和病毒颗粒结合。

图13显示Z155多肽和包被在ELISA板上的ZIKV融合肽结合，其结合强毒具有浓度依赖。

具体实施方式

以下对本发明的技术方案进行详细的说明。

实施例1多肽药物设计

本实施例以ZIKV包膜蛋白(Envelope，E)的氨基酸序列为基础设计了多条多肽，运用空斑减少实验筛选，经过筛选，获得了一条有良好抗寨卡病毒效果的多肽，该多肽命名为Z155，其氨基酸序列如Z155-SEQ1所示；所述序列为:FSQILIGTLLMWLGL。

实施例2病毒空斑实验检测多肽Z155对ZIKV感染的抑制活性

(1)取生长良好的BHK-21细胞铺24孔板，每孔5×10⁴个细胞，过夜培养16-24小时；

(2)将多肽称量后溶解于DMSO，测OD280吸光度，根据消光系数计算多肽浓度；

(3)使用不含血清的DMEM从起始浓度为10μM开始，在EP管中以2倍比例梯度稀释多肽Z155，每孔含药培养基体积为160μL，一共稀释6个梯度，每个梯度设置3个复孔。设置随机多肽对照；

(4)使用无血清DMEM稀释ZIKV，使得病毒的感染终浓度为0.25×10³PFU每ml，向(2)中每管加入160μL病毒稀释液(确保每孔形成25-35个空斑)，同时设置病毒感染的阳性对照组(只感染病毒不加药物)及阴性对照组(只有细胞)，病毒与药物混匀，放置在37℃条件下孵育1.5h；

(5)将(3)中的病毒和药物混合液300μL加入铺有BHK-21细胞的24孔板(1)中。37℃、5％CO₂条件下感染1h，期间每隔15min分钟摇匀一次。感染完成后，吸走病毒液，每孔加入500μLPBS洗1遍。加入预热的含1％低熔点琼脂、2％FBS的DMEM养基。待琼脂凝固后，放置于37℃、5％CO₂条件下倒置培养；

(6)4-5天后，观察细胞状态病变，待病毒空斑明显时；加入4％多聚甲醛配制的1％浓度的结晶紫，固定细胞和空斑染色8h；

(7)去除上层琼脂，流水冲走多余结晶紫。在看片灯上计数病毒空斑；

(8)计算多肽Z155对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(1-药物孔/病毒孔)×100％；

结果表明，所述的多肽Z155能抑制ZIKV的感染，IC₅₀＝0.92±0.21μM，而Z155的随机序列对照多肽Z155-scr在5μM浓度下没有抑制效果。

实施例3多肽Z155抑制ZIKV感染的作用阶段检测

(1)将BHK-21细胞铺于24孔板中，每孔5×10⁴个，在37℃、5％CO₂条件下培养12-16h；

(2)在不同时间点加入多肽Z155，以及加入多肽后不同处理：

1)Time-of-addition assay:在病毒与细胞孵育不同时间(0h、1h、2h、3h)后，加入300μl多肽Z155，分别记录时间点为0h、1h、2h、3hpost-infection，上述试验孔记为药物孔，同时设置病毒感染的阳性对照组及细胞孔作为阴性对照，每组设置3个重复，多肽终浓度为5μM，病毒量为40～50PFU每孔；

2)Cell wash assay：细胞中加入300μl浓度为5μM的多肽Z155，在4℃共孵育30分钟后，吸走上清，加入1ml PBS洗2次去除游离的多肽(对照组不洗)，每孔加入40～50PFU病毒，上述试验孔记为药物孔，同时设置病毒感染的阳性对照组及细胞孔作为阴性对照。每组设置3个重复；

(3)在37℃、5％CO₂条件下培养12h，吸走上清。加预热的1％低熔点琼脂、2％FBS的DMEM养基；

(4)4-5天后，观察细胞状态，待病毒空斑明显时；加入4％多聚甲醛配制的1％浓度的结晶紫，固定细胞和空斑染色8h；

(5)去除上层琼脂，流水冲走多余结晶紫。在看片灯上对病毒空斑进行计数。

(6)计算不同时间点加入多肽或者病毒后Z155对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(1-药物孔/病毒孔)×100％；

结果表明，多肽Z155作用于ZIKV感染的早期阶段，病毒感染不同时间后加入多肽，发现病毒感染1h后，抑制率明显降低；病毒感染3h后，几乎没有抑制效果；表明Z155在ZIKV感染的早期阶段发挥作用；

所述多肽与细胞在4℃共孵育30分钟后，洗去游离的多肽，多肽几乎无抑制活性，而未洗组的多肽仍保持较高的抗病毒活性，表明所述多肽的作用位点不在细胞上，而在病毒上。

实施例4病毒空斑实验检测多肽Z155对DENV-2及YFV 17D抑制活性

(1)使用无血清DMEM在1.5ml EP管中2倍比梯度稀释多肽Z155，起始浓度为10μM，6个稀释度，管加药体积为180μL，每个浓度设置3个重复；

(2)使用无血清DMEM分别稀释DENV-2和YFV 17D，每孔加入180μL含40-50个PFU病毒DMEM加入(1)中EP管(加药物及病毒对照)，同时设置病毒感染的阳性对照组(病毒孔)及阴性对照组(细胞对照，无病毒，无药物)，病毒与药物37℃条件下孵育1.5h；

(3)将(2)中的混合液300μL加入铺有BHK-21细胞的24孔板中。37℃、5％CO₂条件下吸附2h，期间每隔15min分钟摇匀一次。感染结束后吸走病毒液，每孔加入500μLPBS洗2遍。加含1％低熔点琼脂、2％FBS的DMEM养基；

(4)4-5天后，观察细胞状态，待病毒空斑明显时；加入4％多聚甲醛配制的1％浓度的结晶紫，固定细胞和空斑染色8h；

(5)去除上层琼脂，流水冲走多余结晶紫。在看片灯上计数病毒空斑；

(6)计算多肽Z155对病毒感染的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(1-药物孔/病毒孔)×100％；

结果表明，多肽Z155对DENV-2及YFV 17D具有抑制活性，IC₅₀值分别约为0.22μM和1.35μM，表明多肽Z155对黄病毒的抑制具有广谱性。

实施例5多肽Z155对VSV及EBOV假病毒感染抑制活性的检测

(1)将293T细胞铺于6孔板中，每孔2×10⁵个，37℃、5％CO₂条件下培养12h后备用；

(2)按照PEI转染试剂说明，转染VSV和HIV骨架质粒pNL4.3-Luc-R-E-，进行VSV假病毒的包装；转染pCDNA3.1-EBOV和HIV骨架质粒pNL4.3-Luc-R-E-进行EBOV假病毒的包装；

(3)37℃、5％CO₂条件下培养72h后，收集上清，0.45μm滤膜过滤冻存-80℃，取一部分假病毒测定滴度；

(4)按照每孔1×10⁴密度将Huh7细胞铺于96孔板中，37℃、5％CO₂条件下培养12-16h后使用；

(5)使用无血清DMEM 2倍梯度稀释多肽Z155，起始浓度为20μM，进行5个稀释度，每孔50μL加入96孔板中，每个浓度设置3个重复；

(6)使用无血清DMEM稀释VSV及EBOV假病毒至合适浓度，向(5)中的96孔板分别加入稀释好的VSV及EBOV假病毒，每孔50μL，记为药物孔，同时设置病毒感染阳性对照组(有病毒无药物，即病毒孔)及阴性对照组(无病毒无药物，即无药物孔)，拍打混匀，37℃、5％CO₂条件下孵育1.5h后，将混合液转入(4)中的96孔板中；

(7)37℃、5％CO₂条件下培养12h后，更换为含10％FBS的完全培养基，200μL每孔；

(8)72h后，按照Promega荧光素酶报告基因检测试剂说明书进行荧光素酶活性的测定；

(9)计算多肽Z155对VSV及EBOV的抑制率，计算公式为：多肽抑制率＝(1-药物孔/无药物孔)×100％；

结果表明，5μM浓度多肽Z155对VSV及EBOV假病毒均无明显的抑制活性，表明多肽Z155对病毒的抑制是黄病毒科病毒有特异性。

实施例6多肽Z155对BHK21、Vero细胞的毒性检测

(1)将BHK-21、Vero细胞分别铺于96孔板中，每孔1×10⁴个，37℃培养箱、5％CO₂条件下培养16h后使用；

(2)使用无血清DMEM两倍梯度稀释多肽Z155，使其浓度为40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM，每孔100μL，每个浓度设置3个重复，记为药物孔。同时设置无药物孔和无细胞孔(即单纯DMEM)；

(3)37℃、5％CO₂条件下培养24h后，显微镜下观察细胞状态；

(4)将500μLCCK8溶液(Dojindo Laboratories)加入10mL无血清DMEM中，颠倒混匀；

(5)小心吸弃96孔板中的培养基，将(4)反应液加入96孔中，每孔100μL；

(6)37℃培养箱、5％CO₂条件下培养2h后，在酶标仪测定各孔450nm波长吸光值；

(7)计算细胞的活性，计算公式为：细胞活性＝(药物孔-无细胞孔)×100％/(无药物孔-无细胞孔)；

结果表明，多肽Z155在浓度高达40μM时，其对BHK-21、Vero细胞无明显的毒性。

实施例7多肽Z155对小鼠红细胞的毒性检测

(1)采集SPF级ICR小鼠血液，加入2％柠檬酸钠抗凝。收集后立刻颠倒混匀；

(2)2000rpm离心10min，弃上清；

(3)PBS清洗红细胞一次。2000rpm离心10min，弃上清；

(4)用PBS配制2％鼠红细胞；

(5)使用PBS在96孔板内梯度稀释多肽Z155，多肽终浓度为200μM、100μM、50μM、25μM、13μM、6μM、3μM，每孔50μL。同时取1％tritonx-100作为阳性对照，PBS作为阴性对照，每组设置3个复孔；

(6)向多肽的孔内加入2％的鼠红细胞，每孔50μL；

(7)37℃温箱孵育1h；

(8)4000rpm离心3min，取上清，用酶标仪560nm波长测定各孔的吸光度度；

(9)计算多肽对红细胞活性的影响，计算公式为：红细胞活性＝100％-(多肽组-PBS组)×100％/(triton组-PBS组)；

结果表明，多肽Z155在浓度高达100μM，其对小鼠红细胞无裂解毒性，表明多肽Z155对红细胞无明显毒性。

实施例8多肽Z155减少ZIKV感染后在孕鼠血清及胎鼠胎盘病毒载量

(1)将2×10⁵PFU ZIKV(SZ01)腹腔注射入ICR孕鼠(怀孕12-14天，n＝12)；

(2)1h后，将孕鼠随机分为两组，一组腹腔注射多肽Z155(10mg/kg，n＝6)另一组腹腔注射vehicle(n＝6)；

(3)24h后采集孕鼠血样，分离血清，使用RT-qPCR测定血清中的病毒载量。

(4)使用戊巴比妥处死孕鼠后，每只孕鼠随机取2个胚胎，收集胚胎中的胎盘及胎鼠头部，使用RT-qPCR法测定其中的病毒载量；

(5)使用GraphPad Prism Software进行统计分析；

结果显示，与vehicle对照组相比，多肽Z155处理能够显著降低ZIKV感染的ICR孕鼠血清中的病毒载量(p＝0.0159，Mann-Whitney test)。多肽Z155能显著降低ZIKV感染的ICR孕鼠中胎盘的病毒载量(p<0.0001，Mann-Whitney test)。

实施例9多肽Z155对A129小鼠ZIKV致死性感染具有显著的保护作用

(1)将16只4周龄A129小鼠(I型干扰素缺陷小鼠)随机分成两组；

(2)Z155治疗组腹腔注射1×10⁵PFU的ZIKV(SZ-01)和多肽Z155(10mg/kg，n＝8)；对照组为腹腔注射等量病毒和vehicle(n＝8)；

(3)Z155治疗组每天腹腔注射1次多肽Z155(10mg/kg，n＝8)，对照组腹腔注射等量病毒和vehicle(n＝8)，连续注射6天；

(4)感染后第2天采集小鼠血清，分离血清，测定血清中病毒载量；

(5)对小鼠进行了为期21天的观察，记录其体重及存活情况；

(6)使用GraphPad Prism Software进行统计分析；

结果表明，Z155多肽处理降低感染A129小鼠血清中的病毒载量(p＝0.0022，Mann-Whitney test)，Z155多肽处理保护了的A129小鼠免受ZIKV感染导致的死亡，对照组小鼠完全死于病毒感染(p＝0.0006，Log-rank test)。

实施例10多肽Z155和ZIKV病毒颗粒结合

(1)在Vero细胞培养基中和病毒培养液中添加0.02mg/mLBiotin标记的CapPE，收集病毒培养上清；

(2)病毒培养液在10000g离心10分钟去除大的细胞碎片，超速离心管管底加入20％蔗糖，200000g离心2h纯化病毒。病毒用PBS重悬后储存于-80℃冰箱；

(3)加入Cy3-SA标记biotin标记的病毒后得到Cy3标记的病毒；

(4)(3)中的病毒加入Cy5标记的Z155，涂片，洗去未结合多肽；

(5)共聚焦纤维镜下观察Cy3和Cy5荧光共定位情况；

结果显示，Cy3(绿色)和Cy5(红色)共定位明显，Z155结合于病毒颗粒上。

实施例11多肽Z155和融合肽结合

(1)包被：合成的ZIKV融合肽(序列：RGWGNGCGLFGKGSL)，用DMSO溶解，测定浓度。PBS稀释至终浓度为10μM，50μl每孔；设置包被液对照，每孔加入50μl包被液；每组设置3个复孔，放置于4℃冰箱包被过夜；

(2)封闭：PBS配制0.5％明胶，每孔加入200μl，室温封闭2h。封闭完成后用0.05％PBST洗4次；

(3)多肽孵育：biotin标记的Z155，稀释为不同的浓度梯度5μM起两倍稀释(浓度为5μM-0.3125μM)，每孔加50μl，室温孵育2h让多肽结合。0.05％PBST洗5次；

(4)链霉亲和素孵育：1:10000稀释HRP标记的链霉亲和素，每孔加入50μl，室温孵育1h。0.05％PBST洗5次；

(5)显色：加入TMB底物显色液50μl，显色15-30分钟；

(6)终止：待显色明显时，加入50μl 10％的H₂SO₄终止反应；

(7)用酶标仪测定450nm波长吸光度，设置参考波长620nm；

结果表明，Z155可以和融合肽结合，融合肽和biotin标记的Z155结合成浓度梯度依赖的，其OD比对照高3倍以上。

实施例12多肽Z155灭活ZIKV检测

(1)将梯度稀释的多肽Z155(0.3125、0.6125、1.25、2.5、5、10μM)100μl分别与100μl的ZIKV(5×10³PFU/ml)室温孵育2h。设置相同浓度的随机多肽Z155-scr对照组；

(2)向每个处理中加入50％PEG-8000和5MNaCl处理病毒至终浓度为10％的PEG-8000和0.67M的NaCl；

(3)冰上孵育2h后，放入预冷的离心机14500rpm、4℃离心1h；

(4)弃去上清，使用含有3％PEG-8000和10mg/ml BSA的PBS洗涤病毒沉淀1次，14500rpm、4℃离心1h；

(5)弃去上清，使用含有2％FBS的DMEM重悬离心沉淀中的病毒；

(6)在BHK-21细胞上用空斑法测定沉淀中存留的病毒的感染能力；

结果表明，经多肽Z155处理后的ZIKV其感染活性呈浓度依赖性降低，其半效浓度(concentration for 50％ofmaximal effect，EC₅₀)为0.275±0.126μM，而10μM Z155-scr多肽对ZIKV依然保持感染活性，表明多肽Z155处理最终导致ZIKV丧失感染力，Z155对ZIKV有灭活效应。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种抑制寨卡病毒、登革病毒及黄热病毒感染的多肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Z155

<400> 1

Phe Ser Gln Ile Leu Ile Gly Thr Leu Leu Met Trp Leu Gly Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> Z155

<400> 2

ttctcacaga tcctcatagg cacgctgcta gtgtggttag gtttg 45

Claims (5)

1.一种多肽Z155，其特征在于，其氨基酸序列如Z155-SEQ1所示，序列为:

FSQILIGTLLMWLGL。

2.一种用于抑制ZIKV或DENV或YFV感染的多肽抑制剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的多肽，用于ZIKV或DENV或YFV感染的抑制。

3.一种抑制寨卡病毒感染的药物，其特征在于，其包括权利要求1所述的多肽，用于寨卡病毒感染的抑制。

4.编码权利要求1所述多肽的基因。

5.权利要求1所述的多肽Z155在用于制备抑制ZIKV或DENV或YFV感染的药物中的用途。

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