TWI481717B

TWI481717B - 免疫原性組合物及其用途

Info

Publication number: TWI481717B
Application number: TW099136764A
Authority: TW
Inventors: Pele Choi-Sing Chong; Chia Chyi Liu; Meng Shin Kuo; Ray Jui Yuan Chang
Original assignee: Nat Health Research Institutes
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2015-04-21
Also published as: TW201209166A; HK1213594A1; CN102399757A; US20120045468A1; US9051361B2; CN104946604A

Description

免疫原性組合物及其用途

本發明係關於製備經純化EV71病毒抗原之方法。本發明亦相關於利用本發明之經純化EV71病毒以製備免疫原性組合物及其免疫方法。

病毒感染引起各種病症。舉例而言，腸病毒71(Enterovirus 71/EV-71)為引起手足口病(hand,foot and mouth disease)之主要病原體之一，且與嚴重神經疾病相關。由於對宿主之EV71感染反應的分子機制瞭解極少，所以尚無對抗EV71感染的有效抗病毒製劑。故仍有需要發展有效對抗EV71感染的疫苗。

本發明係關於對抗EV71感染之免疫原性組合物(例如疫苗)及相關方法。

因此，本發明一方面之特徵在於一種製備經純化EV71病毒抗原之方法，該EV71病毒抗原可用以製備對抗EV71感染之免疫原性組合物(例如疫苗)。該方法包括在培養基中培養產生EV71病毒之細胞、自細胞或培養基中純化EV71病毒(全粒子或次粒子)，及使經純化EV71病毒失活以獲得經純化EV71病毒抗原。培養基較佳為無血清培養基。純化步驟可藉由液相層析純化、蔗糖梯度超速離心純化或兩者來進行。失活步驟可如下進行：在含有甲醛之溶液中在20-45℃下培養EV71病毒2至20天，例如在20-40℃下培養2至10天，或在約37℃下培養2至5天。培養步驟可在旋轉培養瓶或微載體生物反應器中進行。在一實施例中，該方法進一步包括測定經純化EV71病毒抗原量之步驟。此測定步驟可藉由定量ELISA來進行。在以上方法中，EV71病毒抗原可為經分離EV71病毒全粒子、經分離EV71病毒次粒子，或經分離EV71病毒蛋白。此等抗原可用於免疫原性組合物中。因此，在另一方面，本發明之特徵為一種含有經純化EV71病毒抗原之免疫原性組合物。

經分離病毒粒子、蛋白質、多肽或肽係指實質上不含天然結合分子之病毒粒子、蛋白質、多肽或肽，亦即以乾重計為至少75%(亦即包括75%至100%在內的任何數值)純度。純度可藉由任何適當標準方法(例如藉由管柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析)量測。經分離之肽、多肽或蛋白質可純化自天然來源、藉由重組DNA技術或化學方法產生。術語「蛋白質」與「多肽」可互換使用以描述任何胺基酸鏈，而不論長度或轉譯後修飾(例如糖基化或磷酸化)如何。因此，術語「本發明之多肽」包括：本發明之全長、天然產生之蛋白質；對應於本發明之全長天然產生之蛋白質的重組或合成產生之多肽；或天然產生之蛋白質的特定域或部分。該術語亦包涵具有附加之胺基端甲硫胺酸(適用於在原核細胞中表現)的成熟多肽。肽係指足夠短而能自組成胺基酸合成製備之鏈。一般而言，肽為50個胺基酸殘基長或更短(例如50、40、30、20、15、10或5個殘基長)。病毒全粒子或完整病毒粒子係指由核酸(其基因組)經蛋白質保護殼(亦即衣殼)包圍組成之病毒粒子(virion)。次粒子係指含有衣殼，但含有不完整基因組或不含核酸之粒子。例如參看Kinpe DM.及Howley PM.(2001)Fundamental Virology,第4版，第18章。

EV71病毒蛋白之實例包括第一EV71病毒多肽，其包括EV71 VP1蛋白之片段或肽，該EV71 VP1蛋白具有選自下列組成之群的序列或由該等序列組成：SEQ ID NO: 5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46(列於下文)；及第二EV71病毒多肽，其包括EV71 VP2或VP3蛋白之片段或肽。免疫原性組合物可進一步包括醫藥學上可接受之佐劑，諸如磷酸鋁。該第一或第二EV71病毒多肽為至少15個胺基酸殘基長。該第二EV71病毒多肽可包括選自由以下組成之群的序列或由該等序列組成：SEQ ID NO: 1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43(列於下文)。

上述抗原或組合物可用於誘發對腸病毒感染之免疫反應。因此，可投與有效量之抗原或組合物至有需要之個體。「個體」係指人類及非人類之動物。非人類之動物之實例包括所有脊椎動物，例如哺乳類動物，諸如非人類之靈長類動物(尤其為較高等的靈長類動物)、犬、齧齒動物(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓，及非哺乳動物，諸如鳥類。在一較佳實施例中，個體為人類，尤其為幼兒。在另一實施例中，個體為實驗動物或適用作疾病模型之動物。

本發明之一或多個實施將於隨附之圖式及下文之說明中詳述。本發明之其他特徵、目標及優勢可由發明說明、圖式及申請專利範圍而顯而易見。

本發明，至少部分，係基於EV71抗原可引發免疫反應之未預期發現及相關方法。EV71為小核醣核酸病毒科(familyPicornaviridae )腸病毒屬(genusEnterovirus )之不具外套之RNA病毒。此科之特徵包括此等病毒不具外套、具二十面對稱性、直徑30±5 nm、含有單分子正股ssRNA(7.5-8.5 kb)，且其在細胞質中複製。病毒衣殼為對稱之二十面體(T=1)且由60個相同單元構成，各單元由以下四種結構蛋白組成：VP1、VP2、VP3及VP4。EV71病毒在1969年於美國首次分離。已測定EV71原型病毒株BrCr之完整核苷酸序列。

如本文所述，本發明之特徵在於一種製備經純化EV71病毒抗原之方法。該方法包括培養產生EV71病毒之宿主細胞。可使用各種培養方法。實例包括基於旋轉培養瓶、微載體-生物反應器、旋轉器及細胞於微載體珠粒間轉移(Beads-to-Beads transfer)之方法。

可使用各種細胞作為產生上述EV71抗原之宿主。在一實例中，使用Vero細胞。Vero細胞為人類疫苗製備之官方認可細胞株且已用來製備人類小兒麻痺疫苗(polio)及狂犬病疫苗。因為Vero細胞具固著依賴性，所以可使用微載體技術來建立用於疫苗製備之大規模細胞培養方法。為此，可使用微載體技術及無血清培養來克服使用高血清蛋白質含量進行培養之缺點，包括複雜的下游純化過程及普里昂蛋白(prion)污染之風險。在一較佳實施例中，VP-SFM培養基(GIBCO)係為較佳。亦可使用其他培養基，諸如Plus Vero(CESCO)、Excell(SAFC)及HyQ(HYCLONE)。

為產生病毒抗原，一般可以10^-2 至10^-6 (例如約10^-5 )之MOI感染宿主細胞。對於收集，可使用批次、半批次或灌注技術。為純化病毒抗原，可使用液相層析(LC)或蔗糖梯度超速離心純化。可在25℃至37℃下使用例如4000:1 37%福馬林(formalin)進行病毒失活。為評估由此獲得之抗原及含有該抗原之疫苗的效能，可使用VP2抗原中之交叉中和抗原決定基(例如SEQ ID NO: 1-4、8-10、25-29、31-32、34-35及38之一)作為疫苗效能測試之生物標記。

本發明之特徵在於一種對抗病毒感染及/或其他相關病症(包括手足口病，及相關神經疾病)之免疫原性組合物，諸如疫苗。如上所述，該免疫原性組合物含有抗原，例如EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或多肽。

「抗原」係指含有一或多個將刺激宿主之免疫系統產生體液反應及/或細胞抗原特異性反應之抗原決定基的粒子或分子。術語「抗原」可與「免疫原」互換使用。由於與適當細胞進行接觸，因此抗原誘導敏感狀態或免疫反應且在活體內或活體外以可呈現方式與致敏個體之抗體或免疫細胞反應。抗原可被生物體中之抗體特異性識別及結合。與主要組織相容性複合體(MHC)結合之抗原亦可被T淋巴細胞(T-細胞)表面上之受體識別及結合，導致T-細胞活化。如本文中所用，術語「抗原決定基」係指抗原上由特定抗體分子或T-細胞受體所結合之位點。在本文中，該術語可與「抗原決定子」或「抗原決定子位點」互換使用。

術語「免疫反應」或「免疫原性反應」係指個體中免疫系統回應於抗原之任何反應。脊椎動物免疫反應之實例包括(但不限於)抗體產生、誘導細胞介導之免疫性及補體活化。對相同抗原後續刺激之免疫反應(亦稱為二次免疫反應)快於初次免疫所產生之反應。術語「免疫原性」係指在宿主動物中針對抗原產生免疫反應之能力。此免疫反應形成疫苗引發之針對特定感染生物體之保護性免疫力的基礎。

「抗體」係指具有特定胺基酸序列且僅結合於一種抗原或密切相關之一組抗原的免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子之至少一個免疫活性部分。抗體實例包括IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。免疫球蛋白分子之免疫活性部分之實例包括Fab及F(ab)'2片段，其可藉由用諸如胃蛋白酶之酶處理抗體來產生。抗體可為單株抗體或多株抗體。「單株抗體」係指僅含有一個抗原結合位點且能夠與特定抗原決定基發生免疫反應之一群抗體分子。「多株抗體」係指含有一個以上抗原結合位點且能夠與多肽上一個以上抗原決定基發生免疫反應之一群抗體分子。

抗原較佳可自宿主細胞或其培養基表現及分離。其一致性及純度可經由此項技術中已知之方法(例如利用抗體之免疫墨點法或質譜分析)確定。由此製備之抗原可用以製備免疫原性組合物(例如疫苗)以便在易染病毒之個體(例如人類個體)體內產生針對EV71病毒之抗體及免疫反應。例如可用下文所述之方式或藉由此項技術中已知之任何其他等效方法製備此等組合物。

此抗原可與醫藥學上可接受之載劑(諸如磷酸鹽緩衝鹽水、碳酸氫鹽溶液)或佐劑混合以製備醫藥組合物。載劑在其與組合物之活性成分相容且較佳能夠穩定活性成分且對所治療之個體無害的意義上須「可接受」。基於投藥模式及途徑及標準醫藥實施來選擇載劑。適合的醫藥載劑及稀釋劑、以及供其使用之醫藥必需品描述於Remington's Pharmaceutical Sciences中。在一實例中，將抗原與佐劑混合以形成適用於免疫調節之組合物。此組合物可製備成可注射劑、液體溶液或乳液。參看美國專利4,601,903；4,599,231；4,599,230；及4,596,792。

「佐劑」係指添加至免疫原性組合物(諸如疫苗)中之物質，其儘管本身不具有任何特定抗原作用，但可刺激免疫系統且增強對免疫原性組合物之免疫反應。佐劑實例包括(但不限於)礬沈澱物(alum-precipitate)、弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant)、單磷醯基-脂質A/海藻糖二黴菌酸酯佐劑(monophosphoryl-lipid A/trehalose dicorynomycolate adjuvant)、含有短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)及tRNA之油包水乳液，及藉由模擬特定組之進化保守分子完成增強免疫反應任務之其他物質，該等進化保守分子包括脂質體、脂多醣(LPS)、抗原之分子籠(molecular cage)、細菌細胞壁之組分，及胞飲核酸，諸如雙股RNA、單股DNA及含非甲基化CpG二核苷酸之DNA。其他實例包括霍亂毒素(cholera toxin)、大腸桿菌(E. coli )熱不穩定性腸毒素、脂質體、免疫刺激複合物(ISCOM)、免疫刺激序列寡去氧核苷酸及氫氧化鋁。組合物亦可包括有助於活體內傳遞之聚合物。參看Audran等人,Vaccine 21:1250-5,2003；及Denis-Mize等人,Cell Immunol.,225:12-20,2003。或者，本文所述之抗原可在無任何佐劑之情況下用於疫苗中。

有效量之上述組合物可非經腸投與，例如皮下注射或肌肉內注射。或者，可能需要包括栓劑及經口調配物之其他投藥模式。對於栓劑，黏合劑及載劑可包括例如聚伸烷二醇或三酸甘油酯。經口調配物可包括常用賦形劑，諸如醫藥級糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。此等組合物採用溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑之形式。「有效量」意謂研究者、獸醫、醫生或其他臨床醫師所尋求的在個體組織系統中或在個體體內引發生物或醫學反應的組合物之量。

疫苗可經與劑量調配物相容之方式，及在治療上具有有效性、保護性及免疫原性之量投與。所投與之量視所治療之個體而定，包括，例如，個體免疫系統合成抗體及必要時產生細胞介導之免疫反應之能力。需要投與之活性成分之確切量視從業者判斷而定。然而，適合劑量範圍可由熟習此項技術者容易地決定且可為約數微克之本發明多肽。初次投藥及追加劑量之適合方案亦可變化，但可依次包括初次投藥及後續投藥。疫苗劑量亦可視投藥途徑而定且根據宿主體型而變。

易受病毒感染影響之個體(尤其為幼兒)可藉由此項技術中已知之方法鑑別且投與本發明之組合物。組合物劑量視例如特定抗原、是否共投與佐劑及所共投與佐劑之類型、投藥模式及頻率而定，如可由熟習此項技術者決定。如可由熟習此項技術者決定，必要時重複投藥。舉例而言，致敏劑量之後可接著三次的追加劑量，時間間隔為每週一次。可在首次免疫後4至8週提供追加注射(booster shot)，且第二次追加可在8至12週給予相同調配物。可自個體取血清或T-細胞用於測試由組合物引發之對抗病毒的免疫反應。此項技術中熟知檢定對抗蛋白質或感染之抗體或細胞毒性T細胞的方法。需要時可提供額外追加。藉由改變多肽/蛋白質之量、組合物之劑量及投藥頻率，免疫方案可經最佳化以便引發最大免疫反應。在大規模投藥之前，需要進行功效測試。在功效測試中，可經由經口或非經腸途徑投與非人類個體(例如小鼠、大鼠、兔、馬、豬、牛或猴)本發明之組合物。在初次投藥後或在視需要追加投藥後，可用病毒對測試個體與對照個體(接受模擬投藥)進行攻毒以測試組合物之功效。

本發明之特徵亦在於選擇性結合於具有一種上述序列之肽的經分離抗體。特徵亦在於產生抗體之方法，該方法藉由用在動物體內引發免疫反應之上述免疫原性組合物免疫動物以產生抗體；及自動物分離抗體或產生該抗體之細胞來達成。

以下特定實例應視為僅用於說明，而非以任何方式限制本揭示案之其餘部分。在未進一步詳述下，咸信熟習此項技術者可基於本文中之描述最大程度地利用本發明。本文中引用之所有公開案均以全文引用的方式併入本文中。此外，下文提出之任何機制均不以任何方式限制所主張之本發明的範疇。

材料及方法

1.細胞、培養基及病毒

Vero細胞(綠猴腎細胞)自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得。Vero細胞以VP-SFM培養基(GIBCO)培養於組織培養瓶(T-flask)中每週繼代兩次。EV71病毒株EV71-E59自臺灣臺北之疾病控制中心(Center of Disease Control,Taipei,Taiwan)獲得。在感染後第3天(第3 DPI)，自受感染Vero細胞之培養基收集EV71-E59病毒原液原液(EV71-E59 viral stock)。病毒原液儲存於-80℃下。

2.在旋轉培養瓶中產生EV71-E59病毒原液

於旋轉培養瓶中培養，使Vero細胞在含200 mL VP-SFM培養基(37℃下，在滾筒架(roller rack)中以0.33 rpm之速率攪拌)之850 cm² 旋轉培養瓶(CORNING)中繼代。旋轉培養瓶培養之接種細胞密度為約1.5-2×10⁷ 個細胞，且在培養6天後細胞密度達到1.5-2×10⁸ 個細胞。在100%培養基置換之後，EV71-E59病毒以10^-5 之MOI感染Vero細胞。在此研究中，測試兩百或四百毫升工作體積之培養基。在第5 DPI自培養基收集EV71-E59病毒原液。

3.在生物反應器中產生EV71-E59病毒原液

根據Wu等人,2004 Vaccine 22(29-30):3858-64中所述之微載體細胞培養方法進行EV71-E59病毒製備。

在微載體培養方法中使用BIOFLO 310生物反應器(NBS,US)。在60 rpm速率下在pH 7下攪拌生物反應器培養物(1.4 L及5 L工作體積)，且藉由氣體混合裝置將溶解氧(DO)含量控制在50%。首先自上述旋轉培養瓶收集生物反應器中所用之Vero細胞。遵照製造商之說明書製備Cytodex 1微載體(GE)。在設立各實驗前先將Cytodex 1微載體浸於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中三小時以上且高壓滅菌處理15分鐘。以VP-SFM培養基洗滌經高壓滅菌處理之微載體兩次。生物反應器培養物中之接種細胞密度為約2×10⁵ 個細胞/毫升。在第3天，70%培養基經新鮮培養基置換，且在第6天，細胞密度達到2-2.5×10⁶ 個細胞/毫升。在置換70%培養基之後，用EV71-E59病毒以10^-5 之MOI感染Vero細胞。在一實例中，在第6 DPI自微載體培養基收集EV71-E59病毒。在另一實例中，使用半批次培養法藉由在第6、第8、第10及第12 DPI每兩天置換70%培養基來收集病毒。在又一實例中，使用灌注培養法藉由在第6至第13 DPI每天置換50-70%培養基來收集病毒。

4.藉由液相層析純化EV71-E59病毒原液

以上述方式收集EV71-E59病毒原液後，藉由0.65 μm過濾器(SARTORS)移除Vero細胞碎片，且使用100K TFF卡匣(PALL)濃縮及透濾病毒原液。將濃縮病毒原液裝載至Sepharose Fast Flow 6凝膠管柱以便使用FPLC系統、AKTA pilot(GE HEALTHCARE)進行液相層析。Sephacryl S-500凝膠管柱亦用於進行純化方法。對此法所得分離液區段以MAB979抗體(MILLIPORE)進行SDS-PAGE及西方墨點分析(Western blot)來偵測EV71病毒。使用100K TFF卡匣(PALL)濃縮經純化EV71-E59病毒原液且再懸浮於PBS中。使用BCA蛋白質檢定組(PIERCE)測定再懸浮病毒原液之總蛋白質濃度。

5.藉由連續蔗糖梯度超速離心來純化EV71-E59病毒原液

以上述方式收集EV71-E59病毒原液後，藉由0.65 μm過濾器(SARTORS)移除Vero細胞碎片，且使用100K TFF卡匣(PALL)濃縮EV71-E59病毒原液。將濃縮之病毒原液裝載至10-50%連續蔗糖梯度以便在32,000 RPM下超速離心3小時。對此等所得分離液區段使用MAB979抗體(MILLIPORE)進行SDS-PAGE及西方墨點分析以偵測經純化EV71病毒。使用Amicon 100K管(MILLIPORE)藉由在3,000×g下離心來透濾經純化EV71-E59病毒原液。將濃縮原液再懸浮於PBS中。使用BCA蛋白質檢定組(PIERCE)測定再懸浮病毒原液之總蛋白質濃度。

6.測定病毒力價

據組織培養物感染劑量的50%細胞感染力價(TCID₅₀ )測定病毒力價。將連續稀釋之病毒樣品(10^-1 至10^-8 )添加至已長滿Vero細胞之96孔盤中，且各稀釋度以10重複試驗之。在37℃下培育96孔盤六天，且藉由計數受感染Vero細胞之細胞病變效應來獲得TCID₅₀ 值。使用Reed-Muench法計算TCID₅₀ 值。

7.製備失活EV71-E59病毒及動物免疫

將EV71-E59病毒原液與37%甲醛溶液(MERCK)以4000:1比率之體積比混合，且在37℃下培育3天以使EV71-E59病毒失活。在免疫之前，使失活病毒原液在室溫下以磷酸鋁吸附3小時。以0.2 mL經磷酸鋁吸附之失活EV71-E59病毒原液以肌肉內注射法(i.m)免疫一組6隻雌性BALB/c小鼠(18-25 g，出生6-8週)，且將相同劑量於首次免疫後兩週再對小鼠進行強化免疫。另免疫兩隻紐西蘭白兔(New Zealand white rabbit)，且在2至3週後用0.5 mL經磷酸鋁吸附之失活EV71-E59病毒原液進行肌肉內注射強化免疫。同樣地，一恆河猴亦以肌肉免疫，且在1個月後用0.5 mL經磷酸鋁吸附之失活EV71-E59病毒原液進行肌肉內注射強化免疫。在強化免疫一週之後對免疫之動物進行採血，且收集血清以便分析病毒中和能力。

8.藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)偵測EV71-E59病毒粒子

將失活EV71-E59病毒原液滴於塗佈福爾瓦膜(formvar)且經碳蒸(carbon-vaporized)之200網目銅網上。在室溫下將樣品(20 μL)滴在銅網上保持15分鐘，且接著以一片濾紙移除過量樣品。以ddH₂ O洗滌一次後，以2%鎢磷酸溶液對銅網進行染色2分鐘且隨後以一片濾紙移除溶液。染色銅網經乾燥3天以上。在Hitachi H-7650電子顯微鏡下觀察銅網。

9.抗EV71-E59血清之中和試驗

在56℃下使自免疫小鼠收集的血清失活30分鐘。將各血清樣品添加至微管中且使用新鮮VP-SFM培養基以兩倍連續稀釋度稀釋。將400 μL體積含200 TCID₅₀ EV71-E59病毒之懸浮液添加至含有400 μL連續稀釋血清之各管中。在4℃下培育18-24小時後，將100 μL連續稀釋樣品添加至含Vero細胞之96孔盤中。在37℃下培育96孔盤中之培養物七天，且藉由計數受感染Vero細胞之細胞病變效應來獲得TCID₅₀ 值。使用Reed-Muench法獲得50%中和抑制劑量(ID₅₀ )，其為使病毒力價減小50%之血清稀釋度的幾何倒數。

10.　合成肽之設計及合成

EV71病毒株TW/2086/98 VP1、VP2及VP3衣殼蛋白之重疊合成肽在科羅耐國際科技公司(Kelowna International Scientific Inc.，台北縣，台灣)合成，包括涵蓋VP1衣殼蛋白之完整序列的一組57種重疊合成肽、涵蓋VP2衣殼蛋白之完整序列的一組49種重疊合成肽，及涵蓋VP3衣殼蛋白之完整序列的一組47種重疊合成肽。各肽含有15個胺基酸殘基，其中10個殘基與相鄰肽重疊。

11.　藉由ELISA偵測抗體

藉由酵素連結免疫吸附試驗(ELISA)量測抗體對各合成肽之親和力。在4℃下以50 μL在塗佈緩衝液(0.1 MNaHCO₃ ，pH=9.5)中稀釋至10 μg/mL之個別合成肽或經純化病毒塗佈96孔盤(COSTAR)之各孔隔夜。以0.5微克/孔失活EV71-E59病毒原液用作陽性對照組。各合成肽或純化病毒有二重複孔。以1×PBST(含有0.05% Tween 20之磷酸鹽緩衝鹽水)洗滌一次後，以200 μL阻斷緩衝液(5%脫脂奶之PBS溶液)阻斷各孔且在室溫下培育2小時。將以1:200稀釋於1% BSA/PBS中之一級抗體添加至各孔(每孔100 μL)中且培育2小時。在移除一級抗體溶液之後，以1×PBST洗滌各孔六次。向經洗滌之各孔中添加100 μL以1:5000稀釋於1% BSA/PBS中之與辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase)接合之二級抗體，且培育2小時。在移除二級抗體溶液之後，以1×PBST洗滌各孔六次。藉由添加TMB受質溶液(KPL)使反應顯色且在室溫下培育15分鐘。藉由添加H₂ SO₄ (1 N)來停止反應且藉由ELISA讀取器在450 nm下量測吸光度。

12.　序列比對及結構同源性預測

所有相關EV71病毒株均自NCBI PubMed網站(www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)搜尋。使用稱為ClustalW2之電腦軟體(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)對EV71 VP2蛋白之基因組序列進行比對。

結果

1.在旋轉培養瓶中產生EV71-E59病毒原液

Vero細胞在37℃下於含200 mL VP-SFM培養基之850 cm² 旋轉培養瓶中培養。當細胞密度達到1.5-2×10⁸ 個細胞時，置換培養基且用EV71-E59病毒以10^-5 之MOI感染Vero細胞。如圖1中所示，病毒力價在第3 DPI達到2-4.5×10⁶ TCID₅₀ /mL且病毒力價維持穩定產量。當使用200 mL或400 mL培養基時，EV71-E59病毒之生成動力學為類似。

2.在生物反應器中產生EV71-E59病毒原液

使用VP-SFM培養基中之微載體細胞培養來產生EV71-E59病毒原液。在37℃下，在批次、半批次或灌注生物反應器中，使Vero細胞於載體濃度為5 g/L之Cytodex微載體上生長。當細胞密度達到2-2.5×10⁶ 個細胞/毫升時，用新鮮VP-SFM培養基置換70%培養基，且在生物反應器中在32℃下用EV71-E59病毒以10^-5 之MOI感染Vero細胞。發現在1.4 L批次生物反應器培養物中最大病毒力價為在第6 DPI達到2.7×10⁵ TCID₅₀ /mL。病毒力價在1.4 L半批次生物反應器培養物中在第6至第12 DPI在0.8至7×10⁶ TCID₅₀ /mL之範圍內。病毒力價在1.4 L灌注生物反應器培養物中在第6至第12 DPI在0.5至2×10⁶ TCID₅₀ /mL之範圍內(圖2)。在5 L批次生物反應器培養物中最大病毒力價為在第6 DPI達到1×10⁶ TCID₅₀ /mL。病毒力價在5 L半批次生物反應器培養物中在第6至第12 DPI在0.7至13×10⁶ TCID₅₀ /mL之範圍內。病毒力價在5 L灌注生物反應器培養物中在第7至第13 DPI在1至2×10⁷ TCID₅₀ /mL之範圍內(圖3)。與批次培養法相比，半批次及灌注培養法可將收集產率提高3-5倍。

3.藉由液相層析純化EV71-E59病毒原液

將濃縮之EV71-E59病毒原液(20 mL)裝載至Sepharose Fast Flow 6凝膠管柱或Sephacryl S-500，且進行液相層析。基於西方墨點分析，EV71-E59病毒主要收集於分離液區段3及4中(圖4A及4B)。或者，將濃縮之病毒原液(20 mL)裝載至Sephacryl S-500凝膠管柱。EV71-E59病毒之主要分離液區段見於分離液區段7及8中(圖4C)。濃縮彙集之分離液區段。透濾經純化之病毒原液且以PBS再懸浮。

4.藉由連續蔗糖梯度超速離心來純化EV71-E59病毒原液

將濃縮之EV71-E59病毒原液裝載至10-50%連續蔗糖梯度以便在32,000 RPM下超速離心3小時。當自培養基分離EV71-E59病毒時，藉由西方墨點分析偵測到兩種EV71-E59病毒粒子(圖5)。在具有25至28%蔗糖之分離液區段中偵測到EV71-E59次粒子，而在具有35至38%蔗糖之分離液區段中偵測到EV71-E59全粒子。EV71-E59全粒子比EV71-E59次粒子更具感染性。分別透濾此兩種EV71-E59病毒粒子且以PBS再懸浮。

5.EV71病毒粒子之特徵

藉由組合純化與液相層析及蔗糖梯度超速離心來獲得超純EV71-E59病毒原液。將樣品裝載於10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上且用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色。EV71-E59次粒子與全粒子顯示不同蛋白質圖譜(圖6)。EV71-E59病毒抗原之預測分子量及觀測分子量列於表1A-1C中。

如圖6中所示，EV71-E59次粒子具有較多抗原，主要包括VP0(VP2+VP4)、VP1及VP3。EV71-E59全粒子具有基本病毒組成：VP1、VP2、VP3及VP4。

6.製備失活EV71-E59病毒原液

將EV71-E59病毒原液(1×10⁷ PFU/mL)與37%甲醛溶液以4000:1之體積比混合，且在37℃、25℃或4℃下培育以使病毒失活。在37℃下，EV71-E59病毒在24小時內失活，而EV71-E59病毒在25℃下失活需要3天(圖7)。若使病毒在4℃下失活，則EV71-E59病毒力價在3天內仍較高。發現升高溫度顯著提高失活速率。在37℃下，EV71-E59病毒力價耗時2.16天降至10^-12 PFU/mL(表2)。

為確保疫苗接種之安全性，在37℃下進行EV71-E59病毒之失活維持5-6天。

7.藉由TEM偵測EV71-E59病毒粒子

以2%鎢磷酸溶液染色失活EV71-E59原液且在穿透式電子顯微鏡下觀測。發現EV71-E59病毒在失活後仍保持為完整病毒粒子。EV71-E59病毒粒子之尺寸在直徑30±5 nm之範圍內(圖8)。次粒子與全粒子樣品均經偵測具有完整病毒粒子。

8.失活EV71-E59病毒之免疫原性研究

為進一步測定EV71-E59病毒之免疫原性，以甲醛溶液處理來自液相層析及來自連續蔗糖梯度超速離心之經純化病毒原液以使病毒失活。按照兩週免疫時程，以吸附於磷酸鋁上之失活EV71-E59病毒免疫小鼠、兔及猴。在小鼠模型中，結果顯示自液相層析或自連續蔗糖梯度超速離心製備之失活EV71-E59病毒均引發中和抗體並具顯著力價(表3)。

使用相同免疫時程時，EV71-E59全粒子引發高於次粒子之中和抗體力價。在兔及猴模型中，自已用液相層析純化之病毒原液製備之失活EV71-E59病毒亦誘導較高中和力價(表4及表5)。

使用此等抗血清進行交叉中和檢定，且結果展示此等抗血清亦能對抗EV71病毒之C5及B5子基因型(subgenotype)(表6)。

表6.不同血清對抗EV71病毒之遺傳組(genogroup)C5及B5之中和抗體力價。

明顯地，化學失活之EV71-E59病毒亦誘導出對抗其他EV71病毒株之中和抗體(表6)。

9.使用對抗EV71疫苗候選物產生之抗血清來鑑別EV71之線性免疫顯性抗原決定基(linear immunodominant epitope)

使用總共153種重疊合成肽來篩選對抗血清具有高親和力之肽。在此等肽中，57種涵蓋VP1蛋白(VP1-1至VP1-57)；49種涵蓋VP2蛋白(VP2-1至VP2-49)；且47種涵蓋VP3蛋白(VP3-1至VP3-47)。

在一實驗中，以在磷酸鋁中調配之EV71疫苗候選病毒原液免疫六隻小鼠及三隻兔。在兩劑後，收集小鼠抗血清且彙集在一起。小鼠抗血清對於VP1-42及VP1-43肽顯示高OD值。在高OD值下小鼠抗血清未偵測到VP2及VP3肽。兔抗血清對於VP1-01、VP2-27、VP2-28及VP2-29肽顯示高OD值。在高OD值下兔抗血清未偵測到VP3肽。對抗血清具有高親和力之肽列於表7中。

10.　不同次基因型中EV71 VP2抗原決定基序列之比對

將EV71 VP1序列與子基因型樹比對。為瞭解來自不同次基因型(基於VP1)之VP2抗原決定基序列，選擇及比對十種EV71病毒株之VP2胺基酸序列(131-155)。VP2抗原決定基序列比對顯示此序列在EV71病毒株中高度保守(表8)。

*SEQ ID NO: 4為基於SEQ ID NO: 1-3預測之序列，其兩個變異殘基為D及H。

對上述VP1-43肽序列進行位點突變分析。更特定言之，其殘基(除A224外)各自用丙胺酸殘基置換以產生14種突變型肽。此等突變體之序列列於下文，其中丙胺酸殘基加下底線。接著進行ELISA檢定以檢驗此14種突變型肽結合於E1(特異性結合於VP1-43之小鼠抗EV71抗體)之能力。發現215離胺酸、217麩胺酸、218離胺酸，及219天冬胺酸為EV71 VP1抗原性之必需胺基酸。

類似地，對上述VP2-28肽序列進行位點突變分析。基於VP2-28肽序列產生一組14種突變型肽，其中各胺基酸殘基(除136A外)用丙胺酸殘基置換。此等突變體之序列列於下文，其中丙胺酸加下底線。進行ELISA以檢驗突變體結合於MAB979(特異性結合於VP2-28肽之單株抗體)之能力。發現142麩胺酸、145組胺酸、148酪胺酸及149離胺酸為必需的。

A GEHKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO: 11

FA EHKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO: 12

FGA HKQEKDLEYGAC，SEQ ID NO: 13

FGEA KQEKDLEYGAC，SEQ ID NO: 14

FGEHA QEKDLEYGAC，SEQ ID NO: 15

FGEHKA EKDLEYGAC，SEQ ID NO: 16

FGEHKQA KDLEYGAC，SEQ ID NO: 17

FGEHKQEA DLEYGAC，SEQ ID NO: 18

FGEHKQEKA LEYGAC，SEQ ID NO: 19

FGEHKQEKDA EYGAC，SEQ ID NO: 20

FGEHKQEKDLA YGAC，SEQ ID NO: 21

FGEHKQEKDLEA GAC，SEQ ID NO: 22

FGEHKQEKDLEYA AC，SEQ ID NO: 23

FGEHKQEKDLEYGAA ，SEQ ID NO: 24

AA GTGTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO: 25

AGA TGTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO: 26

AGGA GTEDSHPPYKQ，SEQ ID NO: 27

AGGTA TEDSHPPYKQ，SEQ ID NO: 28

AGGTGA EDSHPPYKQ，SEQ ID NO: 29

AGGTGTA DSHPPYKQ，SEQ ID NO: 30

AGGTGTEA SHPPYKQ，SEQ ID NO: 31

AGGTGTEDA HPPYKQ，SEQ ID NO: 32

AGGTGTEDSA PPYKQ，SEQ ID NO: 33

AGGTGTEDSHA PYKQ，SEQ ID NO: 34

AGGTGTEDSHPA YKQ，SEQ ID NO: 35

AGGTGTEDSHPPA KQ，SEQ ID NO: 36

AGGTGTEDSHPPYA Q，SEQ ID NO: 37

AGGTGTEDSHPPYKA ，SEQ ID NO: 38

在另一實驗中，以0.5 mL磷酸鋁吸附之失活EV71-E59病毒原液肌肉內免疫10隻雄性及10隻雌性CD(SD) IGS品系大鼠(分別為第1組及第2組)且在3週後進行強化免疫。結果總括於下表9中。如表中所示，該免疫誘發具有高中和力價之抗血清。

藉由酵素連聯免疫吸附試驗(ELISA)以相同方式量測抗血清對各上述合成肽之親和力。發現VP1-25、VP1-42、VP1-49、VP1-50、VP2-20及VP3-22經偵測具有高OD值，顯示抗血清以高親和力結合於此等肽。下表10中列出此等肽之序列。

進行序列比對以檢驗來自不同次基因型之VP1-25胺基酸序列。結果展示於下表11中。發現此等肽具有高度共同序列：RKVELFTDMRFDAEF(SEQ ID NO:44)。

對來自不同次基因型之VP1-49及VP1-5胺基酸序列進行類似比對分析。結果展示於下表12中。

鑑別出兩個共同序列：SKSKYPLVVRIYMRM(SEQ ID NO:45)及SKSEYSLVIRIYMRM(SEQ ID NO:46)

其他實施例

本說明書中揭示之所有特徵均可以任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可經具有相同、等效或類似目的之替代性特徵替換。因此，除非另外明確規定，否則所揭示之各特徵僅為通用系列之等效或類似特徵之實例。

已描述本發明之許多實施例。然而，應瞭解在不脫離本發明之精神及範疇的情況下可進行各種修改。因此，其他實施例在以下申請專利範圍之範疇內。

<110>　財團法人國家衛生研究院

<120>　免疫原性組合物及其用途

<130>　990021

<150>US 12/858,007

<151>2010-09-08

<160>　46

<213>　腸病毒71

<400>　1

<212>　PRT

<211>　長度：25序列名稱：1

<213>　OrganismName：腸病毒71

<400>　2

<212>　PRT

<211>　長度：25序列名稱：2

<213>　腸病毒71

<400>　3

<212>　PRT

<211>　長度：25序列名稱：3

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：25序列名稱：4

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：5

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：6

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：7

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：8

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：9

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

<400>　14

<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：14

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<211>　長度：15序列名稱：17

<213>　腸病毒71

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<213>　腸病毒　71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒　71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：20

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：21

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：22

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：24

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：25

<213>　腸病毒71

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<211>　長度：15序列名稱：26

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<211>　長度：15序列名稱：31

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：33

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：36

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

<400>　42

<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：44

<213>　腸病毒71

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<212>　PRT

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<213>　腸病毒71

<400>　46

<212>　PRT

<211>　長度：15序列名稱：46

圖1為展示在旋轉培養瓶中產生EV71-E59病毒原液之圖。

圖2為展示在1.4 L生物反應器中產生EV71-E59病毒原液之圖。

圖3為展示在5.0 L生物反應器中產生EV71-E59病毒原液之圖。

圖4A-4C為展示藉由液相層析對EV71-E59病毒原液進行純化之圖及相片。

圖5為一組展示藉由連續蔗糖梯度超速離心對EV71-E59病毒原液進行純化之圖及相片。

圖6為一組展示EV71-E59病毒粒子之特徵的相片。

圖7為展示EV71-E59病毒之失活動力學的圖。

圖8為展示藉由TEM偵測EV71-E59病毒粒子之相片。

(無元件符號說明)

Claims

一種產生經純化及定量EV71病毒抗原之方法，其包含在培養基中培養產生EV71病毒之細胞，自該細胞或該培養基純化EV71病毒，及使該經純化EV71病毒失活以獲得該經純化EV71病毒抗原；其中該純化步驟通過液相層析純化、連續蔗糖梯度超高速離心純化或兩者的組合來進行；及其中該經純化EV71病毒係相當於由位於25-38%蔗糖梯度區間內之EV71病毒全粒子、次粒子與其他高分子量蛋白質的蛋白質組成；且其中該經純化之EV71病毒抗原包含選自由SEQ ID NO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43組成之群的序列。
如請求項1之方法，其中該培養基為無血清培養基。
如請求項1之方法，其中該失活步驟藉由在含有甲醛之溶液中在20-45℃下培育該EV71病毒2至20天來進行。
如請求項3之方法，其中該失活步驟藉由在該含有甲醛之溶液中在約37℃下培育該EV71病毒2至5天來進行。
如請求項1之方法，其中該培養步驟係在旋轉培養瓶或微載體生物反應器中進行。
如請求項1之方法，其中該方法進一步包含測定該經純化EV71病毒抗原之量之步驟。
如請求項6之方法，其中該測定該經純化EV71病毒抗原之量的步驟係藉由定量EV71 VP2抗原之ELISA進行。
如請求項1之方法，其中該EV71病毒抗原為EV71病毒全粒子、EV71病毒次粒子或EV71病毒蛋白。
一種免疫原性組合物，其包含：經分離之EV71病毒多肽，其包括選自由SEQ ID NO：1-4、8-10、25-29、31-32、34-35、38、42及43組成之群的序列。
如請求項9之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。
如請求項9之免疫原性組合物，其中該佐劑含有磷酸鋁。
如請求項9之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫藥學上可接受之佐劑。
如請求項12之免疫原性組合物，其中該佐劑含有磷酸鋁。
如請求項9之免疫原性組合物，其中該組合物另包含EV71病毒多肽，其包括選自由SEQ ID NO：5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46組成之群的序列。
一種如請求項9之免疫原性組合物於製備誘導對腸病毒感染之免疫反應之藥劑的用途。
如請求項15之用途，其中該組合物另包含EV71病毒多肽，其包括選自由SEQ ID NO：5-7、11-14、16、20-24、39-41及44-46組成之群的序列。
如請求項15之用途，其中該組合物包含經分離及抗原定量之EV71病毒全粒子及經分離EV71病毒次粒子，該病毒全粒子及病毒次粒子被去活化。