CN109694401A - 败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用 - Google Patents

败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其具有三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。所述三个抗原决定位分别具有如SEQ ID NOs:2、3以及4所示的序列。本发明还提供一种含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒、编码所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白或编码所述含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的核酸序列，以及含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白及/或所述含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物。

Description

败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用
技术领域
本发明关于败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，特别是关于含有败血性巴氏杆菌毒素抗原决定位的重组蛋白，以及含有所述重组蛋白的类病毒颗粒。
背景技术
猪萎缩性鼻炎(Atrophic Rhinitis,AR)为猪只呼吸系统的三大主要传染病之一。猪萎缩性鼻炎会造成受感染的猪只的颜面骨畸形及慢性化脓性鼻炎，而引起鼻甲介骨的萎缩。在严重感染时，鼻腔、颔骨、上颔骨亦会发生病变。下鼻甲骨的下游窝状部位最常受感染。上鼻甲、下鼻甲骨、鼻中膈或筛骨等部位均会被感染。
猪萎缩性鼻炎(AR)是由支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,B.b) 以及败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)A型菌(PmA)及D型菌(PmD)所引起，尤其是败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)所产生的毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)。取PMT毒素分别以肌肉、腹腔及鼻腔接种等方式接种于四周龄小猪，均可以引致鼻甲介骨萎缩的病变产生，此外也会波及全身性骨骼发育而使生长迟缓，甚至高剂量接种时，会导致肝脏受损而造成猪只黄疸及死亡。
猪萎缩性鼻炎(AR)遍及世界各养猪地区，患猪生长缓慢，饲料利用效率降低。单独感染时虽然死亡率不高，但污染率却很大，而且容易诱发其他合并症或病原的感染，造成高死亡率，增加生产成本。在猪萎缩性鼻炎(AR)严重感染的养猪场，其经济损失约为 15-38％，且在重度感染的养猪场有较明显的生长障碍情形，平均日增重约较正常猪只少 5-8％。因此开发有效的猪萎缩性鼻炎疫苗，以预防猪只罹患猪萎缩性鼻炎(AR)可以说是刻不容缓且极为重要的事。
发明内容
本发明在第一部分提供一种败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)毒素重组蛋白，包含：一具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位(epitopes)、一具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位，以及一具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。
本发明在第二部分提供一种含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(virus like particle,VLP)，包含：一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及一乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein,HBc)；其中所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白插入所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域(Major immunodominant region,MIR)。
本发明在第三部分提供一种编码如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核酸序列。
本发明在第四部分提供一种编码如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的核酸序列。
本发明在第五部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物，包含如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒至少其中一种，以及一药学上可接受的载体。
本发明在第六部分提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物用于制备动物对抗猪萎缩性鼻炎的药物的应用。
本发明在第七部分提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素的抗体，是通过如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白或如前述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备而得。
本发明在第八部分提供一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，包含一侦测单元，所述侦测单元选自于下列群组所组成中至少一者：一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、一如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒、一如前所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备的抗体，以及一如前所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备的抗体。
本发明以下面的实施例及所附图式予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1所示为在一实施例中，含有本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(VLP)的电子显微镜照片。箭头所指为本发明的一个类病毒颗粒。比例尺：50μm。
图2所示为在一实施例中，以酵素连结免疫分析(ELISA)测定抗败血性巴氏杆菌毒素 (PMT)抗体效价的结果；第1组为负对照组；第2组为含有实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌(B.b)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的免疫组合物(B.b+PmA+PmD组)；第3组为实施例一所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP组)；第4组为实施例三所得的具有含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)；第5组为市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)。符号*与**代表与第1组(负对照组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号#与##代表与第2组(B.b+PmA+PmD 组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号++代表与第5组(市售疫苗组) 相比具有显著差异(表示p<0.01)。
图3A至图3C所示为在一实施例中，中和抗体试验分析结果。图3A所示为以含有胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养Vero细胞的细胞形态(负对照组)；图3B所示为以含4 倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)处理Vero细胞的细胞形态(正对照组)，可见到细胞呈现典型的结节样(如箭头所示)；图3C所示为以具有含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)免疫的小鼠血清稀释160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素 (PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态；图3D所示为以市售猪萎缩性鼻炎疫苗 (市售疫苗组)免疫的小鼠血清稀释160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态，依然可以见到细胞呈现典型的结节样(如箭头所示)。
具体实施方式
本发明提供一种败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)，包含三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗原决定位(epitopes)，以诱导动物产生抗败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗体。所述三个抗原决定位分别是：
抗原决定位A:SVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI(SEQ ID NO:2)；
抗原决定位B:SISPDDPPREITD(SEQ ID NO:3)；以及
抗原决定位C:LNSTPGTGRPMP(SEQ ID NO:4)。
在某些优选的实施例中，各个所述的抗原决定位的氨基酸序列之间可以进一步由连接子(linker)连接，所述连接子至少含有一个以上的甘氨酸(Glycine,Gly)，所述连接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser，或如SEQ ID NOs:11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21所示的序列。在一实施例中，所述连接子具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。然而，各个所述抗原决定位氨基酸序列之间，不必然由连接子所连接。
本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)，可以由下式表示：
(抗原决定位1)-(连接子1)m-(抗原决定位2)-(连接子2)n-(抗原决定位3) 式(I)所述抗原决定位1、抗原决定位2、抗原决定位3其中一个具有如SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其他二个抗原决定位分别具有如SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4的氨基酸序列；所述连接子1以及连接子2各自独立选自于Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:11、12、 13、14、15、16、17、18、19；
其中m是代表从0至约10的整数；
其中n是代表从0至约10的整数。
在某些实施例中，本发明提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)具有如SEQ ID NOs:5、22、23、24、25以及26所示的氨基酸序列至少一种。
在部分实施态样中，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)与上述式(I)所表示的氨基酸序列具有至少大约80％序列同源性，优选的，具有大约85％序列同源性，更佳者，具有大约90％序列同源性，甚至是大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％序列同源性。
本发明并且提供一种含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP)，是将三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗原决定位(epitopes)插入或取代到一个乙型肝炎病毒核心蛋白(Hepatitis B virus core protein,HBc)的主要免疫显性区域(Major immunodominant region,MIR)，以形成含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒 (re-PmT VLP)。所述三个败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)的抗原决定位分别为：
抗原决定位A:SVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI(SEQ ID NO:2)；
抗原决定位B:SISPDDPPREITD(SEQ ID NO:3)；以及
抗原决定位C:LNSTPGTGRPMP(SEQ ID NO:4)。
在某些优选的实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第73～94个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc) 的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第73～82个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第75～81个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域 (MIR)位在所述蛋白的第78～79个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第78～81个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第78～82个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第78～86个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第78～89个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域 (MIR)位在所述蛋白的第78～94个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第81～82个氨基酸位置上。在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)位在所述蛋白的第82～83个氨基酸位置上。
在某些优选的实施例中，各所述抗原决定位的氨基酸序列之间以及抗原决定位的氨基酸序列与乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)序列之间可进一步由连接子(linker)连接，所述连接子至少含有一个以上的甘氨酸(Glycine,Gly)，所述连接子包含但不限于：Gly-Gly、Gly-Ser、SEQ ID NOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21。在一实施例中，所述连接子具有如SEQ ID NOs:11及/或12所示的氨基酸序列。然而，各个所述抗原决定位氨基酸序列之间，不必然由连接子所连接。
本发明所提供的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)，可以由下式所表示：
(HBc-N端段)-(连接子3)p-(抗原决定位1)-(连接子1)m-(抗原决定位2)- (连接子2)n-(抗原决定位3)-(连接子4)q-(HBc-C端段) 式(II)
所述抗原决定位1、抗原决定位2、抗原决定位3其中一个具有如SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其他二个抗原决定位分别具有如SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4的氨基酸序列；所述连接子1、连接子2、连接子3以及连接子4为各自独立选自于Gly-Gly、Gly-Ser、 SEQ IDNOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21；
其中m是代表从0至约10的整数；
其中n是代表从0至约10的整数；
其中p是代表从0至约10的整数；
其中q是代表从0至约10的整数。
在某些实施例中，所述乙型肝炎病毒核心蛋白N端段(HBc-N端段)具有HBc蛋白第1～ 73个氨基酸的序列，而乙型肝炎病毒核心蛋白C端段(HBc-C端段)具有HBc蛋白第83～144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～75个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第82～144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第79～ 144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第82～144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第83～ 144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第87～144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第90～ 144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～78个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第95～144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～81个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第82～ 144个氨基酸的序列。在某些实施例中，所述HBc-N端段具有HBc蛋白第1～82个氨基酸的序列，而HBc-C端段具有HBc蛋白第83～144个氨基酸的序列。
在某些实施例中，本发明所提供的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒 (re-PmT VLP)具有如SEQ ID NOs:9、10、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36 所示的氨基酸序列的至少一种。
在部分实施态样中，本发明所提供的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)与上述式(II)所表示的氨基酸序列具有至少大约80％序列同源性，优选的，具有大约85％序列同源性，更为优选的，具有大约90％序列同源性，甚至是大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％、大约99％序列同源性。
本发明并提供一种编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的核酸序列以及一种编码本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP)的核酸序列。所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)包含如SEQ ID NOs:2、3以及4 所示的抗原决定位。而所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP) 包含如SEQ ID NOs:2、3以及4所示的抗原决定位以及一如SEQ ID NO:6所示的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)，其中所述抗原定位插入或取代所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)。
所述编码本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的核苷酸序列以及所述编码本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的核酸序列，是分别由本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的氨基酸序列以及本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列衍生而来。将本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)氨基酸序列以及本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列上的各个氨基酸置换为遗传密码表(genetic code table)所列的编码所述氨基酸的核苷酸序列(包含各种简并密码子(degenerate codons，或称同义密码子，synonymous codons))，即可得到本发明所提供的所述核苷酸序列。例如，本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)以及本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列上的丝氨酸(serine)可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGC等核苷酸序列所编码。本发明的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)以及本发明的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列上的各个氨基酸，可由以下各核苷酸序列所编码：
此外，本发明也提供一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物。所述猪萎缩性鼻炎免疫组合物含有一败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及/或一含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)。所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)包含如SEQ IDNOs:2、3以及4所示的抗原决定位。而所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)包含如SEQ ID NOs:2、3以及4所示的抗原决定位以及一如SEQ ID NO: 6所示的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)，其中所述抗原定位插入或取代所述乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的主要免疫显性区域(MIR)。
在某些实施例中，所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)具有如SEQ IDNOs:5、 22、23、24、25或26所示的氨基酸序列。在一具体实施例中，所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在另一具体实施例中，所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP) 具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在又一实施例中，所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)具有如SEQ ID NOs:27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36所示的氨基酸序列之一。
本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)以及含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)包含但不限于由基因选殖方式或以胜肽合成仪 (peptide synthesizer)合成而得；以基因选殖方式获得所述重组蛋白的方式可为，但不限于：将编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的核酸序列或编码含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的核酸序列选殖到表现载体中，各形成含有编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的核酸序列的质粒或含有编码含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的核酸序列的核酸序列的质粒，再将所述质粒转殖到生物表现宿主中，经蛋白质表现后而得到的抗原蛋白。
所述表现载体系统包含，但不限于，pET载体系统以及pGEX载体系统等；所述生物表现系统(宿主)包含，但不限于：原核表现系统(如：大肠杆菌(E.coli))、真核表现系统(如：动物细胞(昆虫细胞或哺乳类动物细胞)、植物细胞)。
在一实施例中，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物进一步含有支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)以及败血性巴氏杆菌D 型菌(PmD)。所述支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)的来源可为例如，但不限于，美国标准生物品收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)编号 ATCC31437，所述败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)的来源可为例如，但不限于，英国国家标准生物品收藏中心(National Collection of Type Cultures,NCTC)编号NCTC 12177，以及所述败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)的来源可为例如，但不限于，英国国家标准生物品收藏中心(NCTC)编号NCTC 12178等菌株，或源自野外分离所得的菌株。
本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含其他病原抗原，所述病原抗原包含，但不限于：猪环状病毒第二型(PCV2)抗原、猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)抗原、猪支原体(Mycoplasma)、猪小病毒(Parvovirus,PPV)、猪丹毒(Erysipelas)、伪狂犬病(Aujeszky's disease)，及/或猪胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumonia，APP)。
另外，本发明所提供的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可进一步包含一种或多种选自于下列药学上可接受的载体，包括：溶剂、乳化剂、悬浮剂、分解剂、黏结剂、赋形剂、安定剂、螯合剂、稀释剂、胶凝剂、防腐剂、润滑剂、界面活性剂、佐剂、生物型载体等。
所述药学上可接受的载体包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂 (emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、界面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)，及其他类似或适用本发明的载体。
所述药学上可接受的赋形剂可为适合在肠外、肠内或滴鼻施用的药学上可接受的有机或无机载体物质，且所述赋形剂不会与活性组合物产生有害的反应。适合的赋形剂包含，但不限于，水、盐类溶液、蔬菜油、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、脂肪酸单甘酯和甘油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
所述药学上可接受的佐剂包含，但不限于，水性氢氧化铝胶、明矾、Freund氏不完全佐剂、油质佐剂、水溶性佐剂、或水包油包水双相佐剂(water-in-oil-in-water, W/O/W)；在一实施例中，所述佐剂为水性氢氧化铝胶。
进一步地，本发明提供一种动物对抗猪萎缩性鼻炎的方法，包含将有效量的上述免疫组合物施予动物，以增强所述动物对抗猪萎缩性鼻炎的免疫力，进而提升、改善其临床症状、存活率、及增重趋势。
本发明并提供一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PmT)的抗体，所述抗体是通过本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及/或含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)所制备或衍生而得；所述抗体包括，但不限于：单克隆抗体、多克隆抗体，以及经基因重组的抗体。在一实施例中，所述抗体为经由将本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(rPMT)施打在一动物体内而得到的多克隆抗体。
本发明并提供一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，所述检测试剂盒是用来侦测检验样本是否含有败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PmT)或侦测检验样本内是否含有抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素(PmT)的抗体。所述检测试剂盒包含，但不限于：(1)一抗原，所述抗原为本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及/或含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)，在一实施例中，所述抗原置于一抗原盘上；及/或 (2)一抗体，所述抗体是由本发明所提供的所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及 /或含有所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)所衍生、制备而得的单克隆抗体或多克隆抗体。
所述检测试剂盒的形式包含但不限于：酵素连结免疫分析(enzyme-linkedimmuNOsorbent assay,ELISA)试剂盒、微芯片检验试剂盒(Microchip kit)、免疫荧光分析法(immuNO fluorescent assay,IFA)检测试剂盒、或其他通过所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及/或含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)所制得的检测试剂盒。在一实施例中，所述检测试剂盒至少包含一含有本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)及/或含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的抗原盘，可用来检验样本中是否含有抗败血性巴氏杆菌毒素 (PmT)的抗体。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本文及所附的申请专利范围所使用的「约」、「大约」或「近乎」一词实质上代表所述的数值或范围位在20％以内，优选的为在10％以内，以及更佳者为在5％以内。在本文所提供的数字化的量为近似值，意旨若术语「约」、「大约」或「近乎」没有被使用时亦可被推得。
除非上下文另有明确说明，本文及所附的权利要求所使用的「一」、「一个」，以及「所述」的含义包括复数。此外，为了方便读者阅读，在本说明书中可能使用标题或副标题，这些对于本发明的范围没有影响。
以下实施例将更为具体地描述本发明，这些实施例仅为说明性的，因为对本领域技术人员而言，许多修改及变化将会变得显而易见。本发明的各种具体实施例将在下文中被详细地描述。
实施例一 败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)的构筑
1.败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)氨基酸序列的设计
自败血性巴氏杆菌毒素蛋白(PmT)全长氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示)选出三段抗原决定位(epitopes)，分别为：
抗原决定位A:SVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQI(SEQ ID NO:2)；
抗原决定位B:SISPDDPPREITD(SEQ ID NO:3)；
抗原决定位C:LNSTPGTGRPMP(SEQ ID NO:4)。
分别在抗原决定位A(SEQ ID NO:2)、抗原决定位B(SEQ ID NO:3)，以及抗原决定位C(SEQ ID NO:4)之间各以一段连接子连接，所述连接子具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。依照抗原决定位A、B、C自重组蛋白N端自C端排列顺序组合的不同，得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)氨基酸序列分别如SEQ ID NOs:5、22、23、 24、25，以及26所示，并以合成仪合成所述氨基酸序列或以基因选殖表现方式获得。
2.含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列的设计
将上述构筑的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)(SEQ ID NO:5)插入乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)(SEQ ID NO:6)的第78个与第79个氨基酸之间，并且分别在乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)N端段(第1～78个氨基酸；SEQ ID NO:7)与败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)(SEQ ID NO:5)之间，以及败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)(SEQ ID NO:5)与乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)C端段(第79～144个氨基酸；SEQ ID NO:8)之间，各以一段连接子连接，所述连接子具有如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。得到含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的氨基酸序列如SEQ ID NO:9 所示。所述氨基酸序列可以合成仪合成，或者先合成编码所述氨基酸序列的核酸序列，并将所述核酸序列选殖至表现载体中，在生物表现宿主中表现所述氨基酸序列并纯化。
上述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)也可以使用基因选殖表现方式获得。以基因选殖方式构筑编码含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的核酸序列时，可以使用限制酶切位连接各个片段。例如，但不限于，将编码乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)N端段(第1～78个氨基酸；SEQ ID NO:7)的核酸序列、编码连接子(SEQ ID NO:12)的核酸序列、编码败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白 (re-PmT)(SEQ ID NO:5)的核酸序列、编码连接子(SEQ ID NO:12)的核酸序列，以及编码乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)C端段(第79～144个氨基酸；SEQ ID NO:8)的核酸序列依序插入载体pET24的多种限制酶酵素切位(Multiple cloning site,MCS)内，并分别以SacI、NcoI、HindIII及KpnI等限制酶切位连接上述各核酸序列，以构筑形成编码含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的核酸序列，再将含有这段核酸序列的载体转殖到生物表现宿主中，经蛋白质表现后得到含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的观察
将上述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)纯化后，调整蛋白浓度至1mg/ml，再以0.22mm滤膜过滤后，以JEM-1400电子显微镜(JEOL公司，日本)进行负染色观察。首先制备300网目的镀碳铜网(carbon-coated copper grid)，接着将样品在每个铜网上滴8ml，静置3-5分钟后，以滤纸吸掉多余液体，接着以1％醋酸铀溶液(pH4.5)进行染色30秒，再以滤纸吸掉多余液体后进行显微镜观察。观察时电压设定为80kV。显微镜观察的结果如图1所示，本发明含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)呈现出类病毒颗粒状(如图1箭头所指)。
实施例二 支气管败血性博德氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)及败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的培养
1.支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)的培养
先将支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)接种在TSB固体培养基上[含5％ (v/v)酵母抽出液(yeast extract)、10％(v/v)血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基(tryptic soy broth,TSB，BD公司，美国)]，在37℃下培养隔夜后，挑选单一菌落接种在脑心浸出液(brain heart infusion,BHI)液体培养基内(BD公司，美国)，在37℃下震荡培养隔夜；接着取菌液再接种在BHI液体培养基内，在37℃下震荡培养隔夜，并计算菌落形成单位(colony forming unit,CFU)值；最后加入甲醛(formaldehyde)，在室温下震荡24至36小时，对菌液进行灭活处理。
2.败血性巴氏杆菌(P.multocida)的培养
先将败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)及具有产生毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD) 分别接种在TSB固体培养基上[含5％(v/v)酵母抽出液、10％(v/v)血清、大豆分解蛋白质干酪素培养基(TSB，BD公司，美国)]，在37℃下培养隔夜后，挑选单一菌落接种在脑心浸出液(BHI)液体培养基内(BD公司，美国)，在37℃下震荡培养隔夜；接着取0.1％ (v/v)菌液再接种在BHI液体培养基内，在37℃下震荡培养隔夜，并计算菌落形成单位 (CFU)值；最后加入甲醛对菌液进行灭活作用。
实施例三 猪萎缩性鼻炎免疫组合物的配制
将实施例一所得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白(re-PmT)(SEQ ID NO:5)(最终浓度为250μg/ml)或含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)(SEQID NO:10)(最终浓度为250μg/ml)与实施例二所得到的灭活的支气管败血性博德氏杆菌(B. bronchiseptica)(最终浓度为1x109CFU/ml)、灭活的败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(最终浓度为1x109CFU/ml)及灭活的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(最终浓度为1x109CFU/ml) 以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)混和均匀，并加入铝胶[最终浓度为30％(v/v)]作为佐剂，以配制成为猪萎缩性鼻炎免疫组合物。
实施例四 猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及中和抗体分析
1.小鼠免疫试验
将败血性巴氏杆菌抗体阴性3周龄健康的BALB/c小鼠(实验动物中心，台湾)随机分为5组；第1组为对照组，第2-5组为免疫试验组；各组每只小鼠分别以腹腔注射(intraperitoneal injection,ip.)注射0.2ml的以下物质：
第1组：含30％(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(负对照组)；
第2组：实施例二所得到的支气管败血性博德氏杆菌(B.bronchiseptica)(1x109CFU/ml)、败血性巴氏杆菌A型菌(PmA)(1x109CFU/ml)以及败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)(1x109 CFU/ml)的免疫组合物(含30％(v/v)铝胶佐剂)(B.b+PmA+PmD组)；
第3组：实施例一所得到的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQ IDNO: 10)(浓度为250μg/ml)(re-PmT VLP组)；
第4组：实施例三所得到的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQID NO: 10)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)；以及
第5组：市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)。
每只小鼠分别在初次免疫前24小时(第0天)采血保存，初次免疫(第1天)后，在第13天再进行采血，在第14天以相同免疫剂量再进行二次免疫，并在第24天再次采血。分离血液样本中的血清，以进行毒素抗体的酵素连结免疫分析(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)与中和抗体试验。
2.毒素抗体的酵素连结免疫分析(ELISA)
以商品化的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)(Abcam公司，美国)作为抗原，并将抗原涂布 (coating)在ELISA用96孔盘(Thermo公司，美国)，在4℃下静置16小时。去除多余抗原后加入清洗缓冲液(wash buffer；0.9％NaCl；0.1％Tween20)，清洗3次后倒干。接着加入阻隔缓冲液(blocking buffer；含有1％BSA的wash buffer)，在室温下静置1小时后，以清洗缓冲液清洗，接着将上述各组小鼠采集到的血清样品以PBS缓冲溶液稀释后，每孔加入稀释的小鼠血清，在室温下静置1小时后，去除血清样品，并以清洗缓冲液清洗，然后加入辣根过氧化酵素(Horseradish peroxidase,HRP)标定的山羊抗小鼠的二级抗体(goat anti-mouseconjugated HRP，Gene Tex公司，美国)，所述二级抗体先以阻隔缓冲液稀释5,000倍后再加入96孔盘(100μl/孔)，在室温下静置1小时后，去除二级抗体，并以清洗缓冲液清洗后，每孔加入100μl 3,3’,5,5’-四甲基联苯氨二盐酸(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB，KPL公司，美国)溶液避光呈色 10分钟，并以酵素连结免疫分析测读仪(M2/M2ELISA Reader，Molecular Devices公司，美国)读取波长650nm的吸光值。
酵素连结免疫分析结果如图2所示。二次免疫后，免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第4组，即B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP 组)的小鼠血清中含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体效价最高，其次为免疫实施例一所得的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(第3组，即re-PmT VLP组)的小鼠血清；而免疫市售猪萎缩性鼻炎疫苗(第5组，即市售疫苗组)的小鼠血清中所含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体效价，与免疫实施例二所得的支气管败血性博德氏杆菌、败血性巴氏杆菌A型菌及败血性巴氏杆菌D型菌(第2组，即B.b+PmA+PmD组)的小鼠血清中的抗体效价则无显著差异。而各免疫试验组(第2-5组)的小鼠血清中含有的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体效价皆比第1组(负对照组)的小鼠血清中的抗体效价高，并且具有显著差异(p<0.05或p<0.01)。由此可知，本发明所提供的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP)可以在动物体内有效地诱导出抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，具免疫原性，而且免疫效果比市售猪萎缩性鼻炎疫苗好。
3.中和抗体效价试验
以绿猴肾脏细胞(Vero cell)作为试验材料，测试免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第4组，即B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)的小鼠血清中所含的抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)抗体，是否为可中和PMT毒性的中和抗体。进行中和抗体效价测试之前，先进行Vero细胞的最小毒性剂量(minimum toxindose，MTD)测定。
(a)Vero细胞的最小毒性剂量(MTD)测定
将Vero细胞接种在96孔培养盘中，待细胞长成单层后，去除培养液，并加入使用不含血清的DMEM培养液(GIBCO公司，美国)稀释的败血性巴氏杆菌毒素(PMT，Abcam公司) (0、20、50、100ng)进行处理。以含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液作为负对照组，培养后并观察细胞的型态变化，以能诱导Vero细胞产生细胞病变(cytopathic effect，CPE) 的最低败血性巴氏杆菌毒素(PMT)浓度为最小毒性剂量(MTD)。试验结果显示，Vero细胞的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)的最小毒性剂量为50ng。
(b)中和抗体效价试验
首先，分别将免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第4组，即B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)的小鼠血清，以及免疫市售猪萎缩性鼻炎疫苗(第5组，即市售疫苗组)的小鼠血清稀释10倍后，再进行连续稀释(40、80、120、160、200、240倍)。在96孔培养盘中，分别加入上述稀释的小鼠血清，并在各孔中加入含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)，然后置于37℃中反应1小时。接着将上述反应液加入培养在96孔盘的Vero细胞中，在37℃、5％CO2培养箱中培养后，观察所述血清是否能够抑制Vero细胞产生细胞病变(CPE)。
结果如图3所示。以含4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)处理Vero 细胞作为正对照组，其细胞形态如图3B所示，可以看到细胞呈现典型的结节样(如图3B 箭头所示)。相较之下，以含胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养Vero细胞作为负对照组，其细胞形态如图3A所示；而以免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第4组，即B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)的小鼠血清稀释 160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态如图3C所示。而以免疫市售猪萎缩性鼻炎疫苗(第5组，即市售疫苗组)的小鼠血清稀释160倍后与4倍最小毒性剂量(MTD)的败血性巴氏杆菌毒素(PMT)中和后，加入Vero细胞共培养的细胞形态如图3D所示。图3A与图3C所示的细胞皆未出现如图3B所示的典型的结节样，图3D尚有少许结节样的细胞形态，显示免疫含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第4组，即B.b+PmA+ PmD+re-PmT VLP组)的小鼠血清，以及免疫市售猪萎缩性鼻炎疫苗(第5组，即市售疫苗组)的小鼠血清中皆含有抗败血性巴氏杆菌毒素(PMT)的中和抗体，而且前者的中和抗体含量高于后者。这些结果表示，相较于市售猪萎缩性鼻炎疫苗，本发明提供的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物可以引起受试动物体产生较多的中和抗体。
4.统计方法
所有实验数据利用SigmaState软件与单因子变异数分析(One-Way ANOVA)进行统计分析，实验结果以平均值±标准偏差(mean±SEM)表示。并使用学生氏-纽曼-柯尔斯检验(Student Newman-keuls test)统计方法进行各组间的比较；符号*与**代表与第1组(负对照组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号#与##代表与第2组(B.b+ PmA+PmD组)相比具有显著差异(分别表示p<0.05与p<0.01)。符号++代表与第5组(市售疫苗组)相比具有显著差异(表示p<0.01)。
实施例五 含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析1–台湾猪萎缩性鼻炎菌苗检验标准(巴氏杆菌效力试验)
根据台湾猪萎缩性鼻炎菌苗检验标准，将败血性巴氏杆菌抗体阴性3周龄BALB/c小鼠(实验动物中心，台湾)随机分为3组，第1组为对照组，第2组为B.b+PmA+PmD+ re-PmTVLP免疫试验组，第3组为市售疫苗免疫试验组；每只小鼠分别以腹腔注射(ip.) 注射0.5ml的10倍稀释待测物，各组分别为：
第1组：含30％(v/v)铝胶的PBS缓冲溶液(对照组)；
第2组：实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQ IDNO:10) 的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)；以及
第3组：市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)。
免疫试验组(第2组及第3组)在免疫后第14日各分为3小组，依组序分别以具有生产毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株(同实施例二)1x106CFU/ml、1x107 CFU/ml、1x108CFU/ml三种浓度活菌液0.1ml腹腔注射。同时对照组(第1组)小鼠也分为三小组，依组序分别以巴氏杆菌强毒菌株1x105CFU/ml、1x106CFU/ml、1x107CFU/ml 三种浓度活菌液0.1ml腹腔注射。观察10天后，各免疫试验组与对照组分别以贝卡二氏法(Beherens-Karber)计算其LD50，且各免疫试验组的防御指数须高于对照组1x100.5以上。贝卡二氏法防御指数计算法如下：
LD50＝攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x 1
防御指数＝【对照组攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x1】 -【免疫组攻毒剂量的最低稀释倍数-[(各组死亡率的总和/100)-0.5]x 1】。
结果如表1所示，含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第2组，即B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)确实能诱发小鼠产生保护效力，并耐过败血性巴氏杆菌D型菌(PmD)强毒菌株的攻毒，且其防御指数大于1x102.8，高于台湾检验标准(1x100.5)以及市售猪萎缩性鼻炎疫苗(市售疫苗组)的防御指数(1x102.5)。
表1含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析1结果
实施例六 含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析2
将败血性巴氏杆菌抗体阴性、体重15～20g的BALB/c小鼠(实验动物中心，台湾)随机分为3组，第1组为对照组，第2、3组为免疫试验组。分别将各免疫试验再细分为 3小组；各组小鼠分别以腹腔注射方式注射以下物质：
第1组：每只小鼠注射0.2ml PBS缓冲溶液(对照组)；
第2-1组：每只小鼠注射0.2ml实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQ ID NO:10)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物原液(B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)；
第2-2组：每只小鼠注射0.2ml稀释5倍的实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQ ID NO:10)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(1/5B.b+PmA+PmD +re-PmT VLP组)；
第2-3组：每只小鼠注射0.2ml稀释25倍的实施例三所得的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(SEQ ID NO:10)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(1/25B.b+PmA+PmD+re-PmT VLP组)；
第3-1组：每只小鼠注射0.2ml市售猪萎缩性鼻炎疫苗原液(市售疫苗组)；
第3-2组：每只小鼠注射0.2ml稀释5倍的市售猪萎缩性鼻炎疫苗(1/5市售疫苗组)；
第3-3组：每只小鼠注射0.2ml稀释25倍的市售猪萎缩性鼻炎疫苗(1/25市售疫苗组)。
免疫试验组(第2、3组)在初次免疫后第14日进行二次免疫，剂量同初次免疫；对照组(第1组)小鼠则再次注射0.2ml PBS缓冲溶液；二次免疫后第10天进行攻毒试验，每只小鼠以腹腔注射方式注射0.2ml具有生产毒素能力的败血性巴氏杆菌D型菌(PmD) 强毒菌株[同实施例二]100LD50活菌液，观察10天记录存活率。原液免疫组(第2-1组、第3-1组)存活率须高于80％、5倍稀释免疫组(第2-2组、第3-2组)存活率须高于50％、 25倍稀释免疫组(第2-3组、第3-3组)存活率须高于20％，对照组则须全部死亡。
结果如表2所示，含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物(第2-1组、第2-2组、第2-3组)确实能诱发小鼠产生足够的保护效力，免疫原液疫苗的小鼠、免疫稀释5倍疫苗的小鼠，以及免疫稀释25倍疫苗的小鼠的存活率皆为100％，全部符合上述存活率的标准。
表2含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmT VLP)的猪萎缩性鼻炎免疫组合物的免疫原性及保护效力分析2结果
实施例七 抗败血性巴氏杆菌毒素(PmT)抗体的制备
1.抗败血性巴氏杆菌毒素(PmT)的多克隆抗体
将实施例一所得到的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP) 与适用的佐剂(如：铝胶)混合后施与动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)以进行初级免疫，经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要可进二次免疫。经适当时间间隔后(如： 2～3周)，采集免疫动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)的血清，即制得抗败血性巴氏杆菌毒素(PmT)的多克隆抗体。
其中所述抗败血性巴氏杆菌毒素(PmT)的多克隆抗体，可视需要与显色剂或荧光结合。
其中所述动物经施予初级免疫及二次免疫后，可视需要增加免疫次数，以提高抗体效价。
其中施与的动物包含，但不限于：小鼠、大鼠、兔、禽(蛋)、猪、山羊、牛、水产动物。
2.抗败血性巴氏杆菌毒(PmT)的单克隆抗体
将实施例一所得到的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒(re-PmTVLP) 与适用的佐剂(如：铝胶)混合后施与动物(如：小鼠、大鼠、猪、山羊、兔)以进行初级免疫，经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要可进二次免疫。经适当时间间隔后(如： 2～3周)，采集免疫动物(如：小鼠)的血清，用以评估适合用以采集脾脏细胞的小鼠。从所述适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞(如：FO细胞株、NS细胞株)以PEG(PolyethyleneGlycol，如PEG1500)进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的融合瘤并单株化后，可得一适合用以产制抗败血性巴氏杆菌毒素(PmT)的单克隆抗体的融合细胞株。
经上述制备所得的抗体，可用在免疫检测试剂、治疗剂、或加入食品、饲料中使食用者具有免疫力等。
上列详细说明系针对本发明之一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。
序列表
<110> 金协国际实业有限公司
<120> 败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、其类病毒颗粒及其应用
<130> P17-0222
<140> 201710985876X
<141> 2017-10-20
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1281
<212> PRT
<213> 败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<300>
<308> GenBank: ABR23002
<309> 2007-08-13
<313> (2)..(1282)
<400> 1
Lys Thr Lys His Phe Phe Asn Ser Asp Phe Thr Val Lys Gly Lys Ser
1 5 10 15
Ala Asp Glu Ile Phe Arg Arg Leu Cys Thr Asp His Pro Asp Lys Gln
20 25 30
Leu Asn Asn Val Lys Trp Lys Glu Val Phe Ile Asn Arg Phe Gly Gln
35 40 45
Met Met Leu Asp Thr Pro Asn Pro Arg Lys Ile Val Glu Lys Ile Ile
50 55 60
Asn Glu Gly Leu Glu Lys Gln Gly Leu Lys Asn Ile Asp Pro Glu Thr
65 70 75 80
Thr Tyr Phe Asn Ile Phe Ser Ser Ser Asp Ser Ser Asp Gly Asn Val
85 90 95
Phe His Tyr Asn Ser Leu Ser Glu Ser Tyr Arg Val Thr Asp Ala Cys
100 105 110
Leu Met Asn Ile Phe Val Glu Arg Tyr Phe Asp Asp Trp Asp Leu Leu
115 120 125
Asn Ser Leu Ala Ser Asn Gly Ile Tyr Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala
130 135 140
Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly
145 150 155 160
Pro Asn Glu Gln Ile Tyr His Ser Arg Val Ile Ala Asp Ile Leu Tyr
165 170 175
Ala Arg Ser Val Trp Asp Glu Phe Lys Lys Tyr Phe Met Glu Tyr Trp
180 185 190
Gln Lys Tyr Ala Gln Leu Tyr Thr Glu Met Leu Ser Asp Thr Phe Leu
195 200 205
Ala Met Ala Ile Gln Gln Tyr Thr Arg Gln Thr Leu Thr Asp Glu Gly
210 215 220
Phe Leu Met Val Cys Asn Thr Tyr Tyr Gly Asn Lys Glu Glu Val Gln
225 230 235 240
Ile Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Gly Tyr Pro Ser Thr Asp Ile Ile Cys
245 250 255
Ile Glu Gln Lys Gly Leu Pro Thr Pro Lys Val Ile Leu Tyr Ile Pro
260 265 270
Gly Gly Thr Gln Pro Phe Val Glu Phe Leu Asn Thr Asp Asp Leu Lys
275 280 285
Gln Trp Ile Ala Trp His Leu Lys Asp Asn Lys His Met Val Ala Phe
290 295 300
Arg Lys His Phe Ser Leu Lys Gln Arg Gln Glu Gly Glu Thr Phe Thr
305 310 315 320
Gly Ile Asp Lys Ala Leu Gln Tyr Ile Ala Glu Glu Ser Pro Glu Trp
325 330 335
Pro Ala Asn Lys Tyr Ile Leu Tyr Asn Pro Thr His Leu Glu Thr Glu
340 345 350
Asn Leu Phe Asn Ile Met Met Lys Arg Thr Glu Gln Arg Met Leu Glu
355 360 365
Asp Ser Asp Val Gln Ile Arg Ser Asn Ser Glu Ala Thr Arg Asp Tyr
370 375 380
Ala Leu Ser Leu Leu Glu Thr Phe Ile Ser Gln Leu Ser Ala Ile Asp
385 390 395 400
Met Leu Val Pro Ala Val Gly Ile Pro Ile Asn Phe Ala Leu Ser Ala
405 410 415
Thr Ala Leu Gly Leu Ser Ser Asp Ile Val Val Asn Gly Asp Ser Tyr
420 425 430
Glu Lys Arg Lys Tyr Gly Ile Gly Ser Leu Val Gln Ser Ala Leu Phe
435 440 445
Thr Gly Ile Asn Leu Ile Pro Val Ile Ser Glu Thr Ala Glu Ile Leu
450 455 460
Ser Ser Phe Ser Arg Thr Glu Glu Asp Ile Pro Ala Phe Phe Thr Glu
465 470 475 480
Glu Gln Ala Leu Ala Gln Arg Phe Glu Ile Val Glu Glu Glu Leu His
485 490 495
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Glu Asn Leu
500 505 510
His Lys Ile Arg Leu Val Arg Leu Asn Asn Glu Asn Gln Pro Leu Val
515 520 525
Val Leu Arg Arg Leu Gly Gly Asn Lys Phe Ile Arg Ile Glu Pro Ile
530 535 540
Thr Phe Gln Glu Ile Lys Gly Ser Leu Val Ser Glu Val Ile Asn Pro
545 550 555 560
Val Thr Asn Lys Thr Tyr Tyr Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly Gly
565 570 575
Ser Pro Tyr Ser Pro Phe Arg Ile Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr Pro
580 585 590
Glu Val Leu Lys Ala Arg Ala Ser Val Ile Gly Lys Pro Ile Gly Glu
595 600 605
Ser Tyr Lys Arg Ile Leu Ala Lys Leu Gln Arg Ile His Asn Ser Asn
610 615 620
Ile Leu Asp Glu Arg Gln Gly Leu Met His Glu Leu Met Glu Leu Ile
625 630 635 640
Asp Leu Tyr Glu Glu Ser Gln Pro Ser Ser Glu Arg Leu Asn Ala Phe
645 650 655
Arg Glu Leu Arg Thr Gln Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Leu Pro Glu Met
660 665 670
Glu Ala Leu Lys Lys Gln Ile Leu Gln Ile Pro Asn Lys Gly Ser Gly
675 680 685
Ala Ala Arg Phe Leu Leu Arg Thr Ala Met Asn Glu Met Ala Gly Glu
690 695 700
Thr Ser Glu Ser Thr Ala Asp Leu Ile Arg Phe Ala Leu Gln Asp Thr
705 710 715 720
Val Ile Ser Ala Pro Phe Arg Gly Tyr Ala Gly Ala Ile Pro Glu Ala
725 730 735
Ile Asp Phe Pro Val Lys Tyr Val Ile Glu Asp Ile Ser Val Phe Asp
740 745 750
Lys Ile Gln Thr Asn Tyr Trp Glu Leu Pro Ala Tyr Glu Ser Trp Asn
755 760 765
Glu Gly Ser Asn Ser Ala Leu Leu Pro Gly Leu Leu Arg Glu Ser Gln
770 775 780
Ser Lys Gly Met Leu Ser Lys Cys Arg Ile Ile Glu Asn Ser Leu Tyr
785 790 795 800
Ile Gly His Ser Tyr Glu Glu Met Phe Tyr Ser Ile Ser Pro Tyr Ser
805 810 815
Asn Gln Val Gly Gly Pro Tyr Glu Leu Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Ser
820 825 830
Met Leu Gln Glu Val Gln Gly Asp Leu Gly Phe Glu Gln Ala Phe Ala
835 840 845
Thr Arg Asn Phe Phe Asn Thr Leu Val Ser Asp Arg Leu Ser Leu Met
850 855 860
Glu Asn Thr Met Leu Leu Thr Glu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Trp Asp
865 870 875 880
Ala Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Tyr Asp Glu Gln Phe Ala Ala Met Ser
885 890 895
Ile Asn Glu Arg Ile Glu Lys Cys Met Asn Thr Tyr Arg Gly Val Ala
900 905 910
Phe Gln Asn Ser Ser Lys Ser Ile Asp Phe Phe Leu Asn Asn Leu Thr
915 920 925
Thr Phe Ile Asp Asn Gly Leu Thr Glu Ile Ala Ile Ser Asp Leu Pro
930 935 940
Tyr Asp Ile Val Gln Gln Glu Ile Ser Gln Phe Leu Gln Gly Ser Asn
945 950 955 960
Glu Trp Lys Thr Leu Asp Ala Met Leu Phe Asn Leu Asp Lys Gly Asp
965 970 975
Ile Asn Gly Ala Phe Arg Lys Leu Leu Gln Ser Ala Lys Asp Asn Asn
980 985 990
Ile Lys Phe Arg Ala Ile Gly His Ser Asp Asn Ser Val Pro Pro Phe
995 1000 1005
Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Leu Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Ala Glu
1010 1015 1020
Ala Ile Glu Lys Leu Asp Arg Glu Gly Gln Lys Phe Val Val Phe Ala
1025 1030 1035 1040
Asp Ser Ser Leu Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro
1045 1050 1055
Gly Leu Val Gln Tyr Leu Lys Ile Pro Ala Thr Val Val Asp Ser Asp
1060 1065 1070
Gly Ala Trp Gln Phe Leu Pro Asp Val Ala Ser Ser Arg Val Pro Ile
1075 1080 1085
Glu Val Thr Glu Leu Glu Asn Trp Gln Val Leu Thr Pro Pro Gln Gly
1090 1095 1100
Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gln Phe Lys Leu Thr Ala Gly Phe Pro Thr
1105 1110 1115 1120
Glu Gln Ser Arg Leu Pro Leu Leu Glu Asn Ser Val Ser Glu Asp Leu
1125 1130 1135
Arg Glu Glu Leu Met Gln Lys Ile Asp Ala Ile Lys Asn Asp Val Lys
1140 1145 1150
Met Asn Ser Leu Val Cys Met Glu Ala Gly Ser Cys Asp Ser Val Ser
1155 1160 1165
Pro Lys Val Ala Ala Arg Leu Lys Asp Met Gly Leu Glu Ala Gly Met
1170 1175 1180
Gly Ala Ser Ile Thr Trp Trp Arg Arg Glu Gly Gly Met Glu Phe Ser
1185 1190 1195 1200
His Gln Met His Thr Thr Ala Ser Phe Lys Phe Ala Gly Lys Glu Phe
1205 1210 1215
Ala Val Asp Ala Ser His Leu Gln Phe Val His Asp Gln Leu Asp Thr
1220 1225 1230
Thr Ile Leu Ile Leu Pro Val Asp Asp Trp Ala Leu Glu Ile Ala Gln
1235 1240 1245
Arg Asn Arg Ala Ile Asn Pro Phe Val Glu Tyr Val Ser Lys Thr Gly
1250 1255 1260
Asn Met Leu Ala Leu Phe Met Pro Pro Leu Phe Thr Lys Pro Arg Leu
1265 1270 1275 1280
Thr
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400> 2
Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile
20 25
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400> 3
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 败血性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)
<400> 4
Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala
20 25 30
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr
35 40 45
Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro
50 55 60
<210> 6
<211> 144
<212> PRT
<213> 乙型肝炎(Hepatitis A virus)
<400> 6
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
<210> 7
<211> 78
<212> PRT
<213> 乙型肝炎(Hepatitis A virus)
<400> 7
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp
65 70 75
<210> 8
<211> 66
<212> PRT
<213> 乙型肝炎(Hepatitis B virus)
<400> 8
Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly
1 5 10 15
Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
20 25 30
Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile
35 40 45
Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr
50 55 60
Leu Pro
65
<210> 9
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr
85 90 95
Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn
100 105 110
Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
115 120 125
Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly
130 135 140
Arg Pro Met Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
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Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
<210> 10
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Ser Val Gly Lys Glu
85 90 95
Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val
100 105 110
Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp
115 120 125
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr
130 135 140
Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Ser Thr Ala
1
<210> 12
<211> 9
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Gly Ser Gly
1
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 20
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser
1 5 10 15
Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gly Ser Gly Ser Gly
20 25 30
Thr Gly Ser Gly
35
<210> 21
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Gly Gly Ser
35
<210> 22
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro
1 5 10 15
Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala
20 25 30
Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala
35 40 45
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp
50 55 60
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<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly
20 25 30
Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr
35 40 45
Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro
50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly
35 40 45
Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile
50 55 60
<210> 25
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro
20 25 30
Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala
35 40 45
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp
50 55 60
<210> 26
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr
20 25 30
Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly
35 40 45
Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile
50 55 60
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr
85 90 95
Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn
100 105 110
Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg
115 120 125
Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
130 135 140
Glu Ile Thr Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
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<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Ser Val Gly Lys Glu
85 90 95
Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val
100 105 110
Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr Pro
115 120 125
Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp
130 135 140
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230
<210> 29
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
85 90 95
Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr
100 105 110
Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro
115 120 125
Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly
130 135 140
Arg Pro Met Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
<210> 30
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Ser Ile Ser Pro Asp
85 90 95
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys
100 105 110
Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro
115 120 125
Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr
130 135 140
Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230
<210> 31
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
85 90 95
Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly
100 105 110
Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr
115 120 125
Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro
130 135 140
Asn Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
<210> 32
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Ser Ile Ser Pro Asp
85 90 95
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Leu Asn Ser Thr
100 105 110
Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys
115 120 125
Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro
130 135 140
Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230
<210> 33
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg
85 90 95
Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr Tyr
100 105 110
Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro Asn
115 120 125
Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
130 135 140
Glu Ile Thr Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
<210> 34
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Leu Asn Ser Thr Pro
85 90 95
Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys Glu
100 105 110
Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val
115 120 125
Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp
130 135 140
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230
<210> 35
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Leu Asn Ser Thr Pro Gly Thr Gly Arg
85 90 95
Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp Asp Pro Pro Arg
100 105 110
Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys Glu Gly Ala Tyr
115 120 125
Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro Val Trp Gly Pro
130 135 140
Asn Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Ala Ser
145 150 155 160
Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile
165 170 175
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
180 185 190
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
195 200 205
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
210 215 220
<210> 36
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro Trp Leu Asn Ser Thr Pro
85 90 95
Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Ser Thr Ala Ser Ile Ser Pro Asp
100 105 110
Asp Pro Pro Arg Glu Ile Thr Asp Gly Ser Thr Ala Ser Val Gly Lys
115 120 125
Glu Gly Ala Tyr Tyr Pro Asp His Asp Tyr Gly Pro Glu Tyr Asn Pro
130 135 140
Val Trp Gly Pro Asn Glu Gln Ile Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val
165 170 175
Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
180 185 190
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser
195 200 205
Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala
210 215 220
Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
225 230

Claims (21)

1.一种败血性巴氏杆菌Pasteurella multocida毒素重组蛋白，其特征在于，包含：
一具有如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；
一具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位；
以及
一具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的败血性巴氏杆菌毒素蛋白的抗原决定位。
2.如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述各抗原决定位之间由连接子连接。
3.如权利要求2所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述连接子为各自独立选自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21所组成的群组。
4.如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白，其特征在于，所述败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白具有如SEQ ID NOs:5、22、23、24、25以及26所示序列之一。
5.一种含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，包含：
一如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白；以及
一乙型肝炎病毒核心蛋白；
其中如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白插入所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域。
6.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心蛋白具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，以及所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域为选自于由所述乙型肝炎病毒核心蛋白的第73～94个氨基酸、第73～82个氨基酸、第75～81个氨基酸、第78～79个氨基酸、第78～81个氨基酸、第78～82个氨基酸、第78～86个氨基酸、第78～89个氨基酸、第78～94个氨基酸、第81～82个氨基酸，以及第82～83个氨基酸所组成的群组。
7.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白取代所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域。
8.如权利要求7所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心蛋白具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，以及所述乙型肝炎病毒核心蛋白的主要免疫显性区域为选自于由所述乙型肝炎病毒核心蛋白的第73～94个氨基酸、第73～82个氨基酸、第75～81个氨基酸、第78～79个氨基酸、第78～81个氨基酸、第78～82个氨基酸、第78～86个氨基酸、第78～89个氨基酸、第78～94个氨基酸、第81～82个氨基酸，以及第82～83个氨基酸所组成的群组。
9.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白与所述乙型肝炎病毒核心蛋白之间由连接子连接。
10.如权利要求9所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述连接子为各自独立选自于由Gly-Gly、Gly-Ser及SEQ ID NOs:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21所组成的群组。
11.如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒，其特征在于，所述含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒具有如SEQ ID NOs:9、10、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36所示的氨基酸序列之一。
12.一种编码如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的核酸序列。
13.一种编码如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒的核酸序列。
14.一种猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白以及如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒至少其中一种，以及一药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，进一步包含一支气管败血性博德氏杆菌Bordetella bronchiseptica、一败血性巴氏杆菌A型菌Pasteurellamultocida Type A以及一败血性巴氏杆菌D型菌Pasteurella multocida Type D。
16.如权利要求14所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物，其特征在于，进一步包含其他病原抗原，所述病原抗原为选自由下列群组所组成者：猪环状病毒第二型抗原、猪流感病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗原、猪支原体、猪小病毒、猪丹毒、猪胸膜肺炎放线杆菌，以及伪狂犬病。
17.一种如权利要求14所述的猪萎缩性鼻炎免疫组合物在制备动物对抗猪萎缩性鼻炎的药物的应用。
18.一种抗败血性巴氏杆菌D型菌毒素的抗体，其特征在于，通过如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白或如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备而得。
19.如权利要求18所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含至少下列其中一种：一单克隆抗体、一多克隆抗体，以及一经基因重组的抗体。
20.一种猪萎缩性鼻炎的检测试剂盒，其特征在于，包含一侦测单元，所述侦测单元为选自于下列群组所组成中至少一者：一如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白、一如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒、一如权利要求1所述的败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白所制备的抗体，以及一如权利要求5所述的含有败血性巴氏杆菌毒素重组蛋白的类病毒颗粒所制备的抗体。
21.如权利要求20所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体包含至少下列其中一种：一单克隆抗体、一多克隆抗体，以及一经基因重组的抗体。
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