TWI635869B - 生物型佐劑及含彼之動物疫苗組成物 - Google Patents

Abstract

本發明有關於一種生物型佐劑以及含有此生物型佐劑之疫苗組成物。前述之生物型佐劑包括為豬鏈球菌之溶血素重組蛋白(rSly)，可結合其他動物疾病之抗原製得動物用疫苗組成物，以誘發至少一種受免疫之經濟動物的體內產生抗體，同時刺激細胞性及體液性免疫反應，以保護受免疫之經濟動物免於病原菌感染。

Description

生物型佐劑及含彼之動物疫苗組成物

本發明是有關於一種生物性佐劑，特別是有關於一種利用溶血素重組蛋白誘發長效型免疫保護之生物性佐劑及其於動物疫苗組成物之應用。

佐劑(adjuvant)係指可與疫苗混合使用，並對被免疫生物體具有增強免疫系統反應的物質，都可將其稱為佐劑。疫苗除需有良好的免疫及保護效果，同時亦需安全性，但傳統佐劑常發生對被施打動物的接種部位發生不適反應，如：紅腫熱痛、過敏反應、潰爛等。因此，佐劑應選擇免疫效力佳且副作用低之材料。

佐劑主要可分為五大類：1.免疫調控(Immunomodulation)；2.抗原呈獻(Presentation)；3.引導抗原到目標免疫細胞(Targeting)；4.促進T淋巴細胞免疫反應(Cytotoxin T lymphocyte,CTL)；以及5.抗原堆積作用(Depot generation)。

1.免疫調控(Immunomodulation)

近年研究發現皂素與鋁膠皆能引起良好免疫反應，且亦能刺激被施打動物分泌細胞激素IL-4、5、6、10， 進而誘發Th2路徑，並協助B細胞產生抗體。而細菌內毒素及其衍生物能分泌細胞激素IL-2、12及IFN-γ產生，進而誘發Th1路徑，並誘發CTL毒殺型T細胞增生。

2.抗原呈獻(Presentation)

抗原呈獻即為佐劑協同抗原運送至APC細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞、蘭格漢細胞(Langerhans cells)，而抗原藉由APC細胞表面接受器被吞入細胞內，並由酵素分解成短鏈胺基酸(peptide)，再與第二類組織相容抗原(MHC class II)分子結合，最後呈現至APC細胞表面，而與血液中Th0細胞結合，促使Th0細胞走向Th1或Th2免疫反應。

3.引導抗原到目標免疫細胞(targeting)

該類佐劑能有效的協助抗原輸送至APC細胞，由於某些抗原對動物體內之環境較敏感，常被動物體內之血清蛋白分解脢(protease)或肝臟所破壞清除。通常這類佐劑屬微粒型，能包覆抗原保護其不被破壞，若結構附加醣基，更能增加APC細胞吞噬能力，以達到緩慢釋放且延長保護之效果。

4.促進T淋巴細胞免疫反應(cytotoxin T lymphocyte；CTL)

欲使CTL細胞對抗原產生免疫反應，抗原由APC細胞所吞噬分解，隨後與第二類組織相容抗原(MHC class I)分子結合，最後再與特殊表面接受器CTL細胞辨識，進而誘使CTL細胞分泌細胞毒素(cytotoxin)以及穿 孔素(perforin)，藉此殺死受病毒感染之細胞或受內生性細菌、寄生蟲所感染之細胞。這類佐劑可分為兩大類，一、刺激淋巴球分泌細胞激素IFN-γ，以增強MHC class I與CTL細胞的結合，如脂質A(Lipid A)佐劑；二、促使免疫細胞聚集並協助MHC class I與CTL細胞結合，如油包水(W/O)佐劑。

5.抗原堆積作用(Depot generation)

此類佐劑可分為短時間及長時間堆積兩大類。一、鋁膠與油包水佐劑屬短時間堆積型，混合該類型佐劑之抗原會於被施打部位堆積八至十天，才會被完全清除。二、長時間堆積類型，如合成聚合物聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(poly lactide coglycolide；PLGA)，可使抗原長時間堆積於體內，並持續釋放抗原一至六個月時間，以及克服老人及幼兒免疫力低的問題。該類聚合物常以奈米化處理形成超微粒顆粒，粒徑直徑約為10μm以下。

現今市售疫苗產品之抗原多為不活化菌苗，而佐劑則多為鋁膠與油質佐劑。然而，鋁膠佐劑無法引起長效型的免疫保護，而油質佐劑則因注射困難又不易吸收，其效能亦備受質疑。

有鑑於此，亟需發展一種新穎、有效且適用於動物用之佐劑，以改善習知傳統佐劑僅能誘發短效且及單向的免疫反應。

因此，本發明之一態樣是在提供一種生物型佐劑，其包含豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)溶血素(suilysin)之重組蛋白。

本發明之另一態樣係在提供一種疫苗組成物，其包含抗原以及上述之生物型佐劑，以提供誘發長效型免疫保護之動物用生物型佐劑。

根據本發明之上述態樣，提出一種生物型佐劑，其包含如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。

根據本發明之另一態樣，提出一種疫苗組成物，包含抗原以及上述生物型佐劑。

依據本發明一實施例，上述抗原可例如為豬巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)。

依據本發明一實施例，上述疫苗組成物可包含但不限於每毫升200微克(μg)之生物型佐劑。

依據本發明一實施例，上述疫苗組成物可經由例如口服途徑、非口服途徑或噴霧吸入途徑投予一對象。在一例示中，前述非口服途徑可包含但不限於肌肉注射途徑、皮下注射途徑、皮內注射途徑或腹腔注射途徑。

應用本發明生物型佐劑，其係利用豬鏈球菌之溶血素重組蛋白(rSly)作為生物型佐劑，可結合其他動物疾病之抗原製得動物用疫苗組成物，以誘發至少一種受免疫之經濟動物之體內產生抗體，同時刺激細胞性及體液性免疫反應，以保護受免疫之經濟動物免於病原菌感染。

401/403/405/407/409/411‧‧‧直條

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為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：【圖1】係繪示根據本案一實施例之pET-32a/rSly重組質體DNA經限制酶BamH I及Not I切割後的瓊脂膠體電泳照片。

【圖2a】係繪示根據本案一實施例之轉形株表現rSly重組蛋白的SDS-PAGE膠體電泳照片。

【圖2b】係繪示根據本案一實施例之轉形株表現rSly重組蛋白的西方墨點法分析照片。

【圖3】係繪示根據本案一實施例之轉形株表現rSly重組蛋白與BSA的SDS-PAGE膠體電泳的照片。

【圖4】係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於免疫前(第0週)、基礎免疫後兩週(第2週)、補強接種後兩週(第4週)血清中IgG抗體力價(S/P ratio)的直條圖。

【圖5】係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於補強接種後兩週(第4週)血清中IFN-γ細胞激素表現量的直條圖。

【圖6】係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於補強接種後兩週(第4週)脾臟細胞之刺激指數的直條圖。

承前所述，本發明提供一種生物型佐劑，其包含豬鏈球菌之溶血素的重組蛋白，可應用於疫苗組成物。

豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)為一廣泛分布於全球養豬產業之傳染病，亦為人畜共通傳染疾病，依莢膜表面多醣體之不同，已被證實有33種血清型。於1968年丹麥發現首起人類感染豬鏈球菌案例，在往後幾十年內，豬鏈球菌逐漸蔓延至整個歐洲甚至全世界。而豬鏈球菌含有許多毒力因子，如莢膜多醣(capsule polysaccharide,cps)、溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,mrp)、細胞外因子(extracellular protein factor,ef)、溶血素(suilysin,sly)以及某些細胞外分泌型酵素與細胞膜上相關蛋白。由於豬鏈球菌致病機轉仍不清楚，可能與這些毒力因子互相協助或取代有關；此外，豬鏈球菌常與其他豬隻疾病發生混合感染，甚至受到環境緊迫之影響而造成複雜感染情況。

豬鏈球菌溶血素能增加豬鏈球菌對抗嗜中性球吞噬的能力，或與其他毒力因子進行協同作用，促使嗜中性球壞死以提升豬鏈球菌存活率。其次，溶血素會與細胞膜上膽固醇結合進而穿孔，再與其他毒力因子進行協同作用，穿越內皮細胞以及血腦障壁。過去文獻指出溶血素於調理或無調理作用下無差異，與肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)之pneumolysin致病機制一致，推測可能降低補體在細菌表面沉積有關。由於溶血素會與細胞膜上膽固醇結合並穿孔，而心臟又富含膽固醇，故常造成心內膜炎之臨床症狀；腎小球與關節內膜等處膜富含磷脂質，故常造成關節炎等炎症反應。高濃度的溶血素會破壞血管上皮細 胞，導致巨噬細胞趨化至傷口處，並分泌細胞激素使血腦障壁通透性增加，進而使豬鏈球菌感染腦部造成典型腦膜腦炎；於低濃度溶血素則會刺激細胞激素IL-6及IL-8的分泌，誘使嗜中性球、巨噬細胞、毒殺T細胞以及自然殺手細胞的成熟與活化，亦會引起Th1與Th2免疫反應路徑。

再者，在不同血清型豬鏈球菌發現，溶血素基因序列呈高度保留且變化小，經純化處理後之溶血素重組蛋白的使用量與免疫後所引發之非特異性免疫反應成正相關，可作為生物性佐劑，添加於其他豬隻疾病之抗原中，以製得動物用疫苗組成物。

本發明此處所稱之「生物型佐劑」係指溶血素重組蛋白(rSly)，其序列如SEQ ID NO：1所示，可作為生物型佐劑。在一實施例中，上述rSly重組蛋白具有498個胺基酸，其係由例如豬鏈球菌(Streptococcus suis)血清型第2型的溶血素經修飾而得，而前述之豬鏈球菌是由國立屏東科技大學動物疫苗科技研究所朱純燕教授所提供。

為了便於純化rSly重組蛋白，在一實施例中可於Sly全長基因序列的3’端(例如SEQ ID NO：2第1506個鹼 基)導入點突變，以利於與習知標籤序列例如組胺 酸標籤(His-tag)或其他習知標籤序列連接而進行後續之純化。有關標籤序列的種類誠屬本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，此處不另贅述。

本發明此處所稱之「生物型佐劑」係指rSly重組蛋白，可與豬鏈球菌以外的疫苗混合使用，並對被免疫生 物體具有增強免疫系統反應且兼具生物安全性。在過去的研究中，上述rSly重組蛋白經免疫一對象後，並不會影響受免疫之對象的存活率。

本發明此處所稱之抗原可為任何動物疾病之抗原，本發明並不限制，然以豬隻疾病較佳。在一實施例中，前述抗原可以是由豬巴氏桿菌純化並經福馬林不活化處理，例如豬巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)。

申言之，豬萎縮性鼻炎主要由豬巴氏桿菌毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)所引起。當豬巴氏桿菌毒素作用於豬的成骨細胞以及破骨細胞，可刺激破骨細胞分化及抑制成骨細胞，進而導致鼻頰骨萎縮之臨床症狀。

在一實施例中，上述疫苗組成物可經由例如口服途徑、非口服途徑或噴霧吸入途徑投予一對象，端視實際需求而定。在一例示中，前述非口服途徑可包含但不限於肌肉注射途徑、皮下注射途徑、皮內注射途徑或腹腔注射途徑。在其他例示中，前述受免疫之對象可例如為一經濟動物，其中經濟動物可包括但不限於家畜或家禽，例如豬、牛或羊之家畜，或例如雞、鴨或鵝之家禽。

在應用於動物疫苗組成物時，此疫苗組成物可包含但不限於抗原以及生物型佐劑，其中疫苗組成物可包含例如200μg/mL之生物型佐劑。在一實施例中，上述疫苗組成物可對每頭豬隻(三至四週齡，體重約4公斤至6公斤)施予400微克(μg)之生物型佐劑。在一實施例中，上述疫苗組成物可包含但不限於抗原為豬巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)。有 關豬隻與小鼠之疫苗組成物接種劑量的換算，係根據Hsueh K.-J.等人於2014年在期刊Transboundary and Emerging Diseases第61期第6卷第e35-43頁發表、其標題為「Evaluation on a Streptococcus suis Vaccine Using Recombinant sSao-L Protein Manufactured by Bioreactors as the Antigen in Pigs」一文進行換算，其全文在此一併列為本發明之參考文獻。

本發明以原核表現系統表現溶血素重組蛋白(rSly)作為生物性佐劑，並以小鼠試驗評估生物性佐劑之保護效力以及有效劑量，再與豬巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)搭配試製成重組次單位疫苗，證實rSly重組蛋白具有生物型佐劑之功效。

以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例1：培養豬鏈球菌血清第2型(S.suis 2)

此實施例使用之豬鏈球菌血清第2型(S.suis 2)是由國立屏東科技大學動物疫苗科技研究所朱純燕教授所提供。

首先，將豬鏈球菌血清第2型(S.suis 2)培養於含5%脫纖維羊血之血液瓊脂培養基上，於37℃恆溫培養箱中培養24h後，挑選單一菌落接種於3mL之托-休二 氏培養液(Todd Hewitt Broth，THB，BD,MD,USA；內含3%之雞血清，chicken serum，CS)中，以37℃震盪培養12小時，再於100mL THB培養液內，以37℃震盪培養12小時進行大量培養。

實施例2：製備表現rSly重組蛋白之重組載體

1.分離基因組DNA

此實施例利用市售DNA萃取套組，例如Blood & Tissue Genomic DNA Extraction Miniprep System(Viogene,CA,USA)，萃取上述菌液的基因組DNA。根據製造商的使用手冊操作，即可萃取基因組DNA，並置於-20℃備用。

2.增幅rSly核酸片段

此實施例使用之引子對是針對豬鏈球菌毒力因子Sly基因，並經IEDB(Immune Epitope database)軟體分析序列親/疏水性(http：//tools.immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_in put)者，可例如SEQ ID NO：3所示之正向引子以及如SEQ ID NO：4所示之反向引子，以95℃ 1分鐘、56℃ 2分鐘及72℃ 2分鐘為一個循環進行PCR，共進行35個循環，藉此增幅出PCR產物，其中PCR產物為用於表現溶血素重組蛋白(rSly)的核酸片段。

3.確認rSly核酸片段

上述PCR產物利用0.8~1.2%(W/V)之洋菜膠 體，於TAE緩衝溶液[Tris-acetate-EDTA(TAE)緩衝溶液，含40mM Tris-HCL、20mM glacial acid以及1mM EDTA，pH 8.0)]中，以電壓100伏特進行30至40分鐘電泳，最後利用市售影像系統(例如UVIDOC影像系統；Uvitec,Cambridge,UK)，確認增幅之PCR產物(即rSly核酸片段)，其大小與預期大小(1515bp)相符(圖未繪示)。

4.分離PCR反應產物

使用AxyPrep TM PCR Clean up Kit(Axygen,CA,USA)，根據製造商的使用手冊操作，即可由PCR反應產物之DNA得到純化的rSly核酸片段，經確認DNA序列無誤(如SEQ ID NO：2所示)後，置於-20℃備用。

5.製備pET-32a/rSly重組質體

將純化後之rSly核酸片段與pET-32a質體分別以相同的限制酶進行切割，再以T4 DNA連接酶(400U/μL)(TaKaRa,Shiga,Japan)於16℃進行4小時的接合反應，以獲得pET-32a/rSly重組質體。

實施例3：建立表現溶血素重組蛋白(rSly)之轉形株

1.轉形作用

此實施例係進行轉形作用。首先，將10μL之pET-32a/rSly重組質體，加入100μL之E.coli BL21(DE3)勝任細胞中均勻混合，於4℃冰箱作用30分鐘後，再於42℃水浴中進行90秒之熱休克(heat shock)處理，再迅速置於冰上5分鐘。然後，加入400μL LB培養液，於 37℃培養箱中震盪培養60分鐘，取150μL菌液，利用玻棒均勻塗抹於含有ampicillin(100μg/mL)(MDBio,Taipei,Taiwan)之LB培養基，置於37℃恆溫培養箱中培養14至16小時。

2.分離轉形株的pET-32a/rSly重組質體DNA

將轉形成功之pET-32a/rSly重組蛋白的轉形株，利用Plasmid miniprep purification kit(GeneMark,Taichung,Taiwan)，根據製造商的使用手冊操作，即可萃取得到pET-32a/rSly重組質體DNA，並置於-20℃備用。

上述轉形株所得的pET-32a/rSly重組質體DNA經限制酶BamH I及Not I切割與瓊脂膠體電泳分析後，其產物大小分別為5900bp(即pET-32a)及1515bp(即rSly核酸片段)，如圖1之箭頭所示。另外，上述轉形株所得的pET-32a/rSly重組質體DNA的rSly核酸片段，經DNA定序後確認序列無誤，如SEQ ID NO：2所列。

3.表現rSly重組蛋白

挑選前述轉形成功且選殖表現之溶血素重組蛋白轉形株(E.coli BL 21/rSly)的單一菌落，接種於含濃度為100μg/mL ampicillin之Luria-Bertani(LB)(Difco,MD,USA)3mL培養液中，當吸光值達到OD 600nm 0.6-0.8時，加入isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(aMRESCO,Ohio,USA)使其最終濃度為1mM，置於37℃振盪培養箱誘導4小時至6小時後，即可得到rSly重組蛋 白。之後，上述誘導完成的rSly重組蛋白可利用後續SDS-PAGE分析其大小與表現量。

4. SDS-PAGE分析

此實施例使用SE 250 Mini-Vertical Unit for two slab gels電泳槽(GE Healthcare,WI,USA)進行蛋白質分析。首先取兩片製膠玻璃注入已配製完成之8%之下膠體，隨後加入上膠體後，取10μL已製備完成之rSly重組蛋白至聚丙烯醯胺膠體凹槽內，分別吸取10μL之牛血清蛋白Bovine serum albumin(KPL,MD,USA)稀釋成500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL做為定量標準品，以80伏特進行蛋白質電泳分析。膠體經Coomassie blue染色及分析後，以線性回歸公式算出相對rSly重組蛋白之濃度，其結果如圖2a所示，其中rSly重組蛋白大小約77KDa。

5.西方墨點法(Western blot)分析

上述rSly重組蛋白進行SDS-PAGE後，以TE 22 Mini Tank Transfer Unit濕式轉漬電泳槽(GE Healthcare,WI,USA)，將rSly重組蛋白從SDS-PAGE膠體轉漬至PVDF膜。申言之，首先加入轉漬溶液(Transfer buffer)(25mM Tris,192mM glycine,20% methanol)，以300mA將蛋白質轉印至PVDF膜上(polyvinylidene difluoride membrane,Amersham biosciences,Buckinghamshire,UK)上；一級抗體以3,000倍稀釋之耐過猪鏈球菌血清及anti-His(AbD Serotec,Kidlington,UK)於4℃作用16-18小時，二級抗體以6,000倍稀釋之goat anti-mice IgG-HRP(KPL,WA,USA)於37℃感作1小時，最後加入1：1比例之ECL plus western blotting detection reagents(GE Healthcare,Newcastle,UK)A及B液混合均勻後，加至PVDF膜上進行呈色，最後以G Box冷光螢光系統影像分析系統(Syngene,Frederick,MD)進行影像分析，結果如圖2b所示，於77KDa處有結合條帶產生，證明rSly重組蛋白具有生物活性。

6.純化rSly重組蛋白

將已成功選殖表現之rSly重組蛋白利用實施例3的方式進行生產。首先，將2L之rSly重組蛋白以6,500rpm離心10分鐘(Sorvall RC-6 Plus,Thermo,Massachusetts,USA)，利用20mL lysis buffer(20mM tris base,pH 8.0,8M urea)回溶菌塊，並以超音波震盪器(Misonix Sonicator S-4000,Misonix,New York,USA)進行破菌，最後以全自動純化機(ProfiniaTM Protein Purification System,Bio-red)通過鎳離子純化管柱(Bio-ScaleTM Mini ProfinityTM IMAC Cartridges,1mL)進行純化，收集純化後的rSly重組蛋白。

接下來，利用透析方式去除純化後的rSly重組蛋白中多餘的尿素。首先將透析膜(Dialysis tubingTM)浸漬於EDTA buffer(1% Na2CO3,1mM EDTA)中，以100℃隔水加熱30分鐘。加入純化後之rSly重組蛋白， 平放於0.85%生理食鹽水燒杯內，依序加入5,4,3,2,1M尿素溶液進行透析，每階段作用時間為1.5小時4℃下進行，再置於生理食鹽水透析至隔夜，最後將透析後之rSly重組蛋白進行定量。

將成功誘導完成之rSly重組蛋白進行蛋白質純化及透析。取10μL之純化前、純化後與透析後之三個時間點的rSly重組蛋白，與500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL之牛血清蛋白(Bovine serum albumin；KPL,MD,USA)標準品，進行SDS-PAGE電泳，最後再以線性回歸公式計算出相對蛋白之含量，結果如圖3。

請參閱圖3，其係繪示根據本案一實施例之轉形株表現rSly重組蛋白與BSA的SDS-PAGE膠體電泳的照片。圖3結果顯示，rSly重組蛋白經濃縮10倍後，蛋白質含量為45μg/mL，經透析後之蛋白質含量為65μg/mL，回收率為14.72%。

實施例4：製備含有rSly重組蛋白之豬用疫苗組成物

1.製備PMT與rSly疫苗組成物

有關巴氏桿菌血清型A(P.multocida serotype A)強毒株的培養以及巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)的純化，係根據Suckow M.A.等人於2000年在期刊Laboratory Animals第34期第403-408頁發表、其標題為「Immunization of rabbits against Pasteurella multocida using a commercial swine vaccine」一文進行，其全文在此一併列為本發明之參考文獻。簡言之，將已確診巴氏桿菌感染的豬隻肺部取出並乳化後，培養於blood agar或MacConkey agar上，藉由習知的培養以及檢測方式，分離出巴氏桿菌，再利用例如管柱層析法，純化出巴氏桿菌毒素蛋白(PMT)。然後，利用福馬林對純化之PMT進行不活化處理後，即可獲得巴氏桿菌類毒素蛋白。

將上述純化完成之rSly重組蛋白與已知之巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)以下述配方均勻混合成5組疫苗組成物後，利用小鼠進行免疫評估。

上述5組疫苗組成物分別為第1組：PMT(200μg/mL)+水包油包水(W/O/W)佐劑；第2組：PMT(200μg/mL)+鋁膠(Al-gel)佐劑；第3組：PMT(200μg/mL)+rSly佐劑組(200μg/mL)；第4組：PMT(200μg/mL)抗原組；以及第5組：rSly(200μg/mL)佐劑組。

2.小鼠接種試驗

選擇4週齡體重15g至18g的ICR小鼠共30隻，隨機分為以下6組進行接種。每隻小鼠以肌肉注射0.2mL(每頭小鼠注射40微克(μg)之rSly)，於基礎免疫後2週補強注射一劑量，並於免疫前(第0週)、基礎免疫後兩週(第2週)、補強接種後兩週(第4週)採血，小鼠全血以3,000xg離心10分鐘後，分離血清並保存於-20℃備用。

上述6組小鼠分別注射以下6組疫苗組成物：第1組，PMT(200μg/mL)+水包油包水(W/O/W)佐劑； 第2組，PMT(200μg/mL)+鋁膠(Al-gel)佐劑；第3組，PMT(200μg/mL)+rSly佐劑組(200μg/mL)；第4組，PMT(200μg/mL)抗原組；第5組，rSly(200μg/mL)佐劑組；以及第6組，空白對照組。

3.酵素連結免疫吸附法(ELISA)

利用酵素連結免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)，進一步檢測小鼠血清中IgG抗體力價、細胞激素IFN-γ含量以及T細胞增生的刺激指數，其結果分別如圖4至圖6所示。

ELISA係利用以下方式進行。首先，將P.multocida全菌塗鍍與coating buffer(15mM Na₂CO₃,35mM NaHCO₃,3mM NaN₃,pH 9.6)均勻混合後，平均塗渡於96孔ELISA盤中，置於4℃感作14-16小時，一級抗體以1：250倍稀釋之待測小鼠血清置於37℃作用1.5小時，二級抗體以1：3000倍稀釋之goat anti-mouse Total IgG-HRP(CALTAG,CA,USA)或goat anti-mouse IgG1-HRP(CALTAG,CA,USA)或goat anti-mouse IgG2a-HRP(CALTAG,CA,USA)於37℃作用1小時，每孔分別加入TMB呈色劑(KPL,MD,USA)，於室溫下避光作用10分鐘，再加入等量之TMB終止液(KPL,MD,USA)，利用ELISA reder(Anthos 2020,Cambridge,UK)於OD 450nm測定其吸光值。以S/P ratio公式計算表示，實驗組OD值減陰性對照組OD值/陽性對照組OD值減陰性對照組OD值。所得之數據以Tukey significant test分析並以Mean±SEM呈現。圖4至圖6中不同字母代表各組間具有差異性(p<0.05)。

請參閱圖4，其係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於免疫前(第0週)、基礎免疫後兩週(第2週)、補強接種後兩週(第4週)血清中IgG抗體力價(S/P ratio)的直條圖。直條401代表第1組(PMT+W/O/W)之IgG抗體力價，直條403代表第2組(PMT+Al gel)之IgG抗體力價，直條405代表第3組(PMT+rSly)之IgG抗體力價，直條407代表第4組(PMT)之IgG抗體力價，直條409代表第5組(rSly)之IgG抗體力價，直條411代表第6組(對照組)之IgG抗體力價。

圖4之IgG抗體力價試驗結果顯示，第3組(PMT+rSly)於免疫後第2及4週較其他免疫組及對照組具顯著性差異(p<0.05)，代表第3組(PMT+rSly)可以提供較佳的體液性免疫。

請參閱圖5，其係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於補強接種後兩週(第4週)血清中IFN-γ細胞激素表現量(pg/mL)的直條圖。直條501代表第1組(PMT+W/O/W)之SI值，直條503代表第2組(PMT+Al gel)之SI值，直條505代表第3組(PMT+rSly)之SI值，直條507代表第4組(PMT)之SI值，直條509代表第5組(rSly)之SI值，直條510代表免疫前(第0週)之SI值，直條511代表第6組(對照組)之SI值。

圖5之IFN-γ細胞激素表現量結果顯示，第3組 (PMT+rSly)於補強接種後兩週(第4週)較第1組(PMT+W/O/W)、第2組(PMT+Al gel)、第4組(PMT)及第6組(對照組)具顯著性差異(p<0.05)，但較第5組(rSly)則無顯著差異，代表第3組(PMT+rSly)可以提供較佳的細胞性免疫。

請參閱圖6，其係繪示根據本案一實施例之ICR小鼠於補強接種後兩週(第4週)脾臟細胞(T細胞)之刺激指數(stimulation intex；SI)的直條圖。直條601代表第1組(PMT+W/O/W)之SI值，直條603代表第2組(PMT+Al gel)之SI值，直條605代表第3組(PMT+rSly)之SI值，直條607代表第4組(PMT)之SI值，直條609代表第5組(rSly)之SI值，直條610代表利用刀豆蛋白A(Concanavalin A；ConA)刺激之SI值，直條611代表第6組(對照組)之SI值。

圖6之小鼠脾臟細胞之刺激指數試驗結果顯示，第3組(PMT+rSly)之刺激指數SI值為4.116，較其他免疫組及對照組具顯著性差異(p<0.05)。

4.小鼠攻毒試驗

選擇4週齡15-18g ICR小鼠共60隻，隨機分為6組，每組10隻，組別分類與上述小鼠接種試驗相同。每隻小鼠以肌肉注射0.2mL，於基礎免疫後兩週，以10LD₅₀之巴氏桿菌血清型A(P.multocida serotype A)強毒株進行攻毒，每隻小鼠以腹腔注射0.1mL，於攻毒後持續觀察1週計算小鼠存活率，其結果如表1所示。

表1

請參閱表1，其係繪示根據本案一實施例之ICR 小鼠於攻毒後之存活率。表1之小鼠攻毒後之存活結果顯示，於基礎免疫後2週，以10LD50之P.multocida serotype A強毒株進行攻毒後，第1組(PMT+rSly)的存活率可達70%，第3組(PMT+W/O/W)的存活率為50%，第2組(PMT+Al gel)的存活率為40%，第4組(PMT)的存活率為30%，第5組(rSly)的存活率為10%，而第6組(對照組)的存活率為0%。

綜言之，由上述數個實施例證實，本發明以原核表現系統表現rSly重組蛋白作為生物性佐劑，經小鼠試驗證實具有生物性佐劑之功效。在其他實施例中，當上述疫苗組成物應用於豬隻時，以三至四週齡的豬隻(體重約4公斤至6公斤)為例，每頭可施打400微克(μg)之生物型佐劑，其結果與小鼠攻毒試驗相近，亦證實具有生物性佐劑之功效。

需補充的是，本發明雖以特定組成比例的rSly重組蛋白與PMT抗原、特定的製程、特定的分析方法或特 定儀器作為例示，說明本發明之生物型佐劑及含彼之動物疫苗組成物，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之生物型佐劑亦可使用其他組成比例的抗原、其他的製程、其他分析方法或其他儀器進行。

由上述實施例可知，本發明的生物型佐劑及含彼之動物疫苗組成物，其優點在於使用豬鏈球菌之溶血素重組蛋白(rSly)作為生物型佐劑，可結合其他動物疾病之抗原製得動物用疫苗組成物，以誘發至少一種受免疫動物之體內產生抗體，同時刺激細胞性及體液性免疫反應，以保護受免疫動物免於病原菌感染。

雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立屏東科技大學

<120> 溶血素重組蛋白及含彼之動物疫苗組成物

<130>

<160> 4

<210> 1

<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬鏈球菌(Streptococcus suis)recombinant suilysin第1至498個胺基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 豬鏈球菌recombinant suilysin gene

<400> 2

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 4

Claims (9)

1. 一種生物型佐劑，其係由如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列所組成。
2. 一種疫苗組成物，包含一抗原以及如申請專利範圍第1項所述之生物型佐劑，其中該抗原為豬巴氏桿菌類毒素蛋白(PMT)。
3. 根據申請專利範圍第2項所述之疫苗組成物，其中該疫苗組成物包含每毫升200微克(μg)之該生物型佐劑。
4. 根據申請專利範圍第2項所述之疫苗組成物，其中該疫苗組成物係經由一口服途徑、一非口服途徑或一噴霧吸入途徑投予一對象。
5. 根據申請專利範圍第4項所述之疫苗組成物，其中該非口服途徑包括肌肉注射途徑、皮下注射途徑、皮內注射途徑或腹腔注射途徑。
6. 根據申請專利範圍第4項所述之疫苗組成物，其中該對象為一經濟動物。
7. 根據申請專利範圍第6項所述之疫苗組成物，其中該經濟動物包括一家畜或一家禽。
8. 根據申請專利範圍第7項所述之疫苗組成物，其中該家畜包括豬、牛或羊。
9. 根據申請專利範圍第7項所述之疫苗組成物，其中該家禽包括雞、鴨或鵝。