CN117924515A - 一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原及其重组抗体 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原及其重组抗体；所述双靶点重组抗原包括牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，以及牛链球菌的杆状决定蛋白，所述顶膜抗原1与所述杆状决定蛋白之间串联，或，所述免疫定位蛋白1与所述杆状决定蛋白之间串联；通过引入牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，再引入牛链球菌的杆状决定蛋白，并使得二者串联在一起，因此可以得到包含牛球虫和牛链球菌双靶点的重组融合蛋白抗原，该重组融合蛋白抗原可以避免只能采用单一病原体的疫苗和抗体来预防和治疗这两类病原体感染的情况，因此更具有实用性。

Description

一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原及其重组抗体

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原及其重组抗体。

背景技术

牛链球菌和牛球虫分属细菌和原虫，两者均寄生于牛的消化道中，在牦牛中的感染率呈现上升趋势，且均能在受感染动物的粪便中检出病原体，两种病原在易感动物间的流行不仅对畜牧业造成损失，还对牧区居民和牧区工作人员的健康造成了严重威胁，同时将会带来较大的经济损失，目前有效控制球虫病和牛链球菌的感染严重依赖于管理措施以及抗球虫和抗菌药物，但是药物的长期使用也使耐药性成为球虫病治疗和牛链球菌感染治疗的潜在威胁，而妥善的管理需要耗费较大的人力物力；疫苗是通过其自身的抗原性诱导机体产生相应的特异性抗体对具有相同抗原性的外来病原体相互作用发生抗菌或者是杀菌作用。重组抗原疫苗在畜牧业中可应用于畜禽疫病的预防和控制，且这些重组疫苗能够提供免疫保护，减少畜禽中相应疾病的发生和传播，从而降低养殖业的损失。

IgY抗体是一种特殊类型的抗体，它是由鸟类(特别是鸡)产生的免疫球蛋白Y(IgY)；相比于哺乳动物产生的IgG抗体，IgY抗体产量丰富，鸟类能够产生大量的IgY抗体，因此可以通过鸡蛋收集大量的抗体；特异性高，IgY抗体可以高度特异地识别和结合抗原，这使其在生物医学研究和诊断中具有很高的准确性；相对于其他动物(如小鼠、兔子)产生的抗体，IgY抗体的制备成本相对较低，这使其在大规模应用中具备优势，此外该抗体具有较小的交叉反应。但是目前重组疫苗大多数只针对某一种特定的病原体，或者针对某一病原体的多种亚型，很少同时针对两种或者两种以上病原体，同时目前也没有针对牛球虫病和牛链球菌病的疫苗和治疗性抗体，并且只针对单一病原体的疫苗和治疗性抗体对养殖动物的保护力度有限。

因此设计牛链球菌和牛球虫双基因融合蛋白的重组疫苗及其特异性抗体有利于从细菌和原虫两个方面减少易感动物所受到的威胁，进而减少易感动物受到的威胁，在利于牧业发展的同时也保障了人类的健康。

发明内容

本申请提供了一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原及其重组抗体，以解决现有技术中目前重组疫苗暂时没有针对牛球虫病和牛链球菌病的疫苗和治疗性抗体的技术问题。

第一方面，本申请提供了一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原，所述双靶点重组抗原包括牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，以及牛链球菌的杆状决定蛋白，所述顶膜抗原1与所述杆状决定蛋白之间串联，或，所述免疫定位蛋白1与所述杆状决定蛋白之间串联。

可选的，所述双靶点重组抗原还包括霍乱毒素B亚基，所述霍乱毒素B亚基设于所述顶膜抗原1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述免疫定位蛋白1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述杆状决定蛋白的N端或C端。

可选的，所述霍乱毒素B亚基具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

可选的，所述双靶点重组抗原还包括接头序列，所述接头序列包括柔性接头序列和双赖氨酸，所述柔性接头序列设于所述双靶点重组抗原的长表位肽之间，所述双赖氨酸设于所述双靶点重组抗原的短肽链之间。

可选的，所述双靶点重组抗原按照5’～3’的顺序包括霍乱毒素B亚基、顶膜抗原1和杆状决定蛋白。

可选的，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

可选的，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

第二方面，本申请提供了一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗体，所述重组抗体由第一方面所述的双靶点重组抗原制备得到。

第三方面，本申请提供了一种制备第二方面所述的双靶点重组抗体的方法，所述方法包括：

设计第一方面所述的双靶点重组抗原的目的基因序列；

合成所述目的基因序列，并采用设计的引物组对所述目的基因序列进行PCR扩增，后导入表达载体的可表达区域，得到含目的基因的表达载体；

向感受态细胞中导入所述目的基因的表达载体，以使所述基因序列转化并表达，得到重组抗原；

采用所述重组抗原免疫鸟类动物模型，得到双靶点重组抗体。

可选的，所述引物组的上游引物如SEQ ID NO.4所示，所述引物组的下游引物如SEQ ID NO.5所示。

本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本申请实施例提供的一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原，通过引入牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，再引入牛链球菌的杆状决定蛋白，并使得二者串联在一起，因此可以得到包含牛球虫和牛链球菌双靶点的重组融合蛋白抗原，并可以利用该重组融合蛋白抗原得到对应的IgY抗体，进而有利于对易感动物提供细菌和寄生虫两个方面的免疫保护，相比现有的依赖于管理措施、抗球虫药和抗菌药的控制感染措施，该重组融合蛋白抗原可以避免只能采用单一病原体的疫苗和抗体来预防和治疗这两类病原体感染的情况，因此更具有实用性。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理。

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本申请实施例提供的一种制备所述双靶点重组抗体方法的流程示意图；

图2为本申请实施例提供的六种融合蛋白的特征参数中结构示意图；

图3为本申请实施例提供的pET28a(+)-CARR表达载体示意图；

图4为本申请实施例提供的BL21空菌和重组pET28a+转化BL21涂布于含卡那霉素的抗性LB平板18h生长状况示意图，其中，左侧为BL21空菌，右侧为重组pET28a+；

图5为本申请实施例提供的重组质粒pET28a(+)/CARR的酶切鉴定结果图；

图6为本申请实施例提供的BL21工程菌目的基因所测序列与原始序列对比图；

图7为本申请实施例提供的重组工程菌与空载质粒菌表达蛋白电泳图，其中，1为蛋白Marker，2为已知蛋白BCA(牛血清白蛋白)：66kd，3为含目的基因质粒的BL21表达蛋白条带，4为空质粒BL21表达蛋白条带；

图8为本申请实施例提供的重组工程菌与空载质粒菌表达蛋白组氨酸抗体的westernblot检测结果示意图，其中，1为空载上清，2为空载沉淀，3为重组上清，4为重组沉淀，5为纯化后蛋白；

图9为本申请实施例提供的牛链球菌和牛球虫双基因融合重组蛋白抗原的设计表达流程图；

图10为本申请实施例提供的牛链球菌和牛球虫双基因融合重组蛋白特异性IgY抗体的收蛋时间和抗体效价的关系图。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有特别说明，本申请中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

本申请的创造性思维为：

西藏地区牛养殖业的最主要部分是牦牛养殖。牦牛是高寒地区的特有牛种，也是西藏牧区主要家畜，牦牛养殖作为西藏的特色畜牧业，在当地的畜牧业经济乃至整个地区的农业经济中占有重要的地位，但是西藏牦牛传染病严重危害牦牛健康，近年来牦牛的牛链球菌病及牛球虫病等疾病的发生呈多发增长趋势。牛链球菌是瘤胃(反刍动物第一胃)中常见的一种兼性厌氧菌，革兰染色阳性，为非β－溶血性链球菌，该细菌能使牛发生酸中毒，并能导致奶牛乳腺炎、犊牛肺炎，同时还能感染人类引发感染性心内膜炎、菌血症、脑膜炎等疾病，其危害不容忽视，不仅对养殖业造成损失，还对牧区居民和养殖业工作人员的健康造成了严重威胁。牛艾美耳球虫是一种细胞内顶复门寄生虫，是牛球虫病中最具致病性的艾美耳球虫之一，感染该虫的犊牛可能会出现严重的腹泻甚至死亡，以上两种病原分属细菌和原虫，它们在易感动物间的流行不仅对畜牧业造成损失，还对牧区居民和牧区工作人员的健康造成了严重威胁，将会带来较大的经济损失。

重组疫苗的制备是基于基因工程技术，通过将筛选出来的目标病原体关键基因导入到宿主系统中，宿主系统能够表达病原体抗原并且该抗原能够诱发机体免疫反应，对相应病原体产生一定的抵抗作用。常用的宿主系统包括细菌、酵母、病毒载体等，重组抗原疫苗在畜牧业中可应用于畜禽疫病的预防和控制，且这些重组疫苗能够提供免疫保护，减少畜禽中相应疾病的发生和传播，从而降低养殖业的损失。

IgY抗体是一种特殊类型的抗体，它是由鸟类(特别是鸡)产生的免疫球蛋白Y(IgY)；IgY抗体在免疫应答中起着重要的作用，IgY抗体可以针对感染性病原体产生特异性抗体，例如细菌、寄生虫等。这些抗体可以中和、结合或阻断病原体，从而减少或抑制它们对宿主的侵袭和复制。并且在一些特定的应用领域中受到广泛关注。相比于哺乳动物产生的IgG抗体，IgY抗体产量丰富，鸟类能够产生大量的IgY抗体，因此可以通过鸡蛋收集大量的抗体；特异性高，IgY抗体可以高度特异地识别和结合抗原，这使其在生物医学研究和诊断中具有很高的准确性；相对于其他动物(如小鼠、兔子)产生的抗体，IgY抗体的制备成本相对较低，这使其在大规模应用中具备优势。此外，该抗体具有较小的交叉反应：由于IgY抗体与哺乳动物的免疫球蛋白结构有所差异，因此其在某些情况下表现出较小的交叉反应性，这对于特定的应用可能很有益，IgY抗体在人类医学领域应用非常广泛，近年来，在动物医学领域的应用也在不断发展，面对某些细菌，寄生虫抗生素耐药性逐步上升，IgY抗体展现出了独特的优势，是治疗某些大规模养殖的畜禽动物相应感染性疾病的潜在手段。

目前的重组疫苗大多数只针对某一种特定的病原体，或者针对某一病原体的多种亚型，很少同时针对两种或者两种以上病原体，对于单一病原体重组疫苗的制作包括以下几个步骤：

1.首先，在确定目标病原体如细菌、病毒或其他微生物以后、需要对目标病原体进行详细研究，确定其中潜在引起免疫反应的抗原；然后通过基因数据获得相应病原体靶抗原的基因序列，通过生物合成或者从目标病原体中克隆出特定抗原的基因，来得到目标病原体特定抗原的基因序列。

2.然后通过将目标基因插入到适当的表达载体中，这些载体通常是一种环状DNA分子(例如质粒)；在这个过程可以使用限制性内切酶和DNA连接酶。

3.转入宿主细胞：将构建好的表达载体转入宿主细胞，如细菌、酵母、哺乳动物细胞等。

4.通过转染、电穿孔或转化等技术，使宿主细胞接受表达载体，特定的表达载体和宿主细胞对导入目的基因的后续加工不一样，该技术应采用能够表达目的基因的载体和宿主细胞，即导入的目的基因能够复制，转录、翻译和翻译后加工最终形成相应的抗原蛋白。

5.通过去除其他细胞成分和杂质纯化出该蛋白抗原，最终制备成适当的疫苗形式，这与所选的目标病原体特定抗原具有相同的免疫原性，可以比较好地控制病原体的副作用，并提供更稳定、持久的免疫保护。而IgY抗体的制备首先是进行免疫原注射，即选择目标抗原将其注射到禽类的体内，如鸡或鸭。注射可以在合适的时间间隔和剂量下进行，以激发禽类产生特异性抗体；在注射免疫原后，采集禽类的蛋或者血液样本；然后使用柱层析、电泳或其他适当的纯化方法对抗体进行提纯，这可去除其他非特异性成分和杂质；最后使用ELISA、免疫印迹等方法进行检测和定量纯化后的特异性IgY，确保安全性和有效性后用于相应病原体感染疾病的治疗。

因此设计牛链球菌和牛球虫双基因融合蛋白的重组疫苗及其特异性抗体有利于从细菌和原虫两个方面减少易感动物所受到的威胁，进而减少易感动物受到的威胁，在利于牧业发展的同时也保障了人类的健康。

如图1所示，本申请实施例提供一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原，所述双靶点重组抗原包括牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，以及牛链球菌的杆状决定蛋白，所述顶膜抗原1与所述杆状决定蛋白之间串联，或，所述免疫定位蛋白1与所述杆状决定蛋白之间串联。

在一些可选的实施方式中，所述双靶点重组抗原还包括霍乱毒素B亚基，所述霍乱毒素B亚基设于所述顶膜抗原1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述免疫定位蛋白1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述杆状决定蛋白的N端或C端。

在一些可选的实施方式中，所述霍乱毒素B亚基具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本申请实施例中，通过双靶点重组抗原中顶膜抗原1、免疫定位蛋白1和杆状决定蛋白的N端或C端引入霍乱毒素B亚基，可以有效地提高该重组抗原的免疫反应性，从而可以得到特异性强的重组抗体。

在一些可选的实施方式中，所述双靶点重组抗原还包括接头序列，所述接头序列包括柔性接头序列和双赖氨酸，所述柔性接头序列设于所述双靶点重组抗原的长表位肽之间，所述双赖氨酸设于所述双靶点重组抗原的短肽链之间。

本申请实施例中，通过在双靶点重组抗原中引入柔性接头序列和双赖氨酸，可以利用柔性接头序列使得抗原上较长的表位肽肽链更好的折叠，同时双赖氨酸进行连接可以使得双靶点重组抗原的等电点更偏向碱性，以便于蛋白酶的剪切，从而方便双靶点重组抗原刺激鸡类动物模型产生IgY抗体。

在一些可选的实施方式中，所述双靶点重组抗原按照5’～3’的顺序包括霍乱毒素B亚基、顶膜抗原1和杆状决定蛋白。

在一些可选的实施方式中，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在一些可选的实施方式中，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

本申请实施例中，通过细化具体的双靶点重组抗原的组成顺序，并提供对应的核苷酸序列和氨基酸序列，可以明确此时的双靶点重组抗原的具体序列信息，因此可以明确该双靶点重组抗原对易感动物提供细菌和寄生虫两个方面的免疫保护。

基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗体，所述重组抗体由所述双靶点重组抗原制备得到。

该双靶点重组抗体是基于上述双靶点重组抗原来实现，该双靶点重组抗原的具体组成及序列信息可参照上述实施例，由于该双靶点重组抗体采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

基于一个总的发明构思，本申请实施例提供了一种制备所述双靶点重组抗体的方法，所述方法包括：

S1.设计所述双靶点重组抗原的目的基因序列；

S2.合成所述目的基因序列，并采用设计的引物组对所述目的基因序列进行PCR扩增，后导入表达载体的可表达区域，得到含目的基因的表达载体；

S3.向感受态细胞中导入所述含目的基因的表达载体，以使所述基因序列转化并表达，得到重组抗原；

S4.采用所述重组抗原免疫鸟类动物模型，得到双靶点重组抗体。

该方法是针对上述双靶点重组抗体的制备方法，该双靶点重组抗原的具体组成及序列信息可参照上述实施例，由于该方法采用了上述实施例的部分或全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果，在此不再一一赘述。

需要说明的是，该表达载体一般是质粒。

在一些可选的实施方式中，所述引物组的上游引物如SEQ ID NO.4所示，所述引物组的下游引物如SEQ ID NO.5所示。

本申请实施例中，通过细化PCR扩增的引物组，可以使得含有双靶点重组抗原的基因序列的表达载体可以扩增完全，从而得到足够多的扩增产物。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例1

如图9所示，本申请的制备流程：

一、牛链球菌和牛球虫双基因融合蛋白重组抗原的设计及特性分析：

通过对比筛选(蛋白关键性、抗原性、可获得性、理论有效性)最终选择了顶膜抗原1(apical membrane antigen-1，AMA-1)或免疫定位蛋白1(immune mapped protein 1，IMP-1)(牛球虫)和杆状决定蛋白(rodshape-determining protein，RodA)(牛链球菌)作为重组蛋白抗原的靶蛋白，在NCBI上获取了相应靶蛋白氨基酸序列和对应的基因序列，利用工具对3个靶蛋白进行T、B细胞表位筛选，并将以上抗原表位进行串联(由于牛链球菌RodA的表位较少，为放大信号将其整体串联两次)，为使长肽链较好折叠，在长肽间用柔性接头(GGGGS)*3进行连接；短的表位肽间用KK进行连接，使融合蛋白的等电点更偏向碱性并便于蛋白酶的剪切，为提高机体的免疫反应性还可在上述表位前N端或后C端接入霍乱毒素B基(CholeraToxinB subunit，CTB)，所得基因序列的组成如下，得到总计6个融合蛋白：

融合蛋白1：IMP-1—RodA—RodA(IRR)；

融合蛋白2：AMA-1—RodA—RodA(ARR)；

融合蛋白3：CTB—IMP-1—RodA—RodA(CIRR)；

融合蛋白4：CTB—AMA-1—RodA—RodA(CARR)；

融合蛋白5：IMP-1—RodA—RodA—CTB(IRRC)；

融合蛋白6：AMA-1—RodA—RodA—CTB(ARRC)；

霍乱毒素B亚基(CholeraToxinB subunit，CTB)基因序列如下：

ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATG

CACATGGAACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAA

ATACATACGCTAAATGATAAGATATTGTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAG

AGAGATGGCTATCATTACTTTTAAGAATGGTGAAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAG

GTAGTCAACATATAGATTCACAAAAAAAAGCGATTGAAAGGATGAAGGATACCCTG

AGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCGAAAAGTTATGTGTATGGAATAATAA

AACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT(SEQ ID NO.1)

对融合蛋白的理化性质进行分析：

在Expasy上输入融合蛋白的一级结构，对融合蛋白的分子量、亲水性等进行预测，其结果显示：

融合蛋白1(IRR)：肽链的总氨基酸数为601个；相对分子质量为：64.78kDa；理论等电点为：9.87；不稳定指数(Instabilityindex)：45.27；Grandaverageofhydropathicity(GRAVY):-0.849(负值代表融合蛋白的亲水性较好)。

融合蛋白2(ARR)：肽链的总氨基酸数为646个；相对分子质量为：70.13kDa；理论等电点为：9.77；不稳定指数(Instabilityindex)：44.86；Grandaverageofhydropathicity(GRAVY):-0.890。

融合蛋白3(CIRR)：肽链的总氨基酸数为740个；相对分子质量为：79.65kDa；理论等电点为：9.77；不稳定指数(Instability index)：44.52；Grand average ofhydropathicity(GRAVY):-0.729。

融合蛋白4(CARR)：肽链的总氨基酸数为785个；相对分子质量为：85.00kDa；理论等电点为：9.69；不稳定指数(Instability index)：44.23；Grand average ofhydropathicity(GRAVY):-0.769。

融合蛋白5(IRRC)：肽链的总氨基酸数为740个；相对分子质量为：79.65kDa；理论等电点为：9.77；不稳定指数(Instability index)：44.72；Grand average ofhydropathicity(GRAVY):-0.729。

融合蛋白6(ARRC)：肽链的总氨基酸数为785个；相对分子质量为：85.00kDa；理论等电点为：9.69；不稳定指数(Instability index)：44.42；Grand average ofhydropathicity(GRAVY):-0.769。

结果显示6种融合蛋白的分子量均足够大，且水溶性都较好、等电点均远离裂解液的pH，因此适合作为候选疫苗蛋白。

再对融合蛋白进行了二级结构的预测，具体步骤为：

在Jpred(http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred4/)上对融合蛋白的二级结构进行预测，其结果如下(由于Jpred无法预测长度超过800个氨基酸残基的肽链二级结构， 因此此处仅预测了融合蛋白1、融合蛋白2的完整二级结构，融合蛋白3则显示删去了C端的9 个氨基酸残基后的二级结构，未对融合蛋白4进行二级结构预测)：

融合蛋白1(IRR)：

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融合蛋白2(ARR)：

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融合蛋白3(CIRR)：

--HHHHHHHHHHHHHHH--------HHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----EEEEE---------HHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHEEEE--------EEEEEE------------------EEHHHHHHHHHHHH-------------------HHHHHHHHHHHHHHHH-------------------------------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-------EEE------------------------HHHHHH---HHHHHHHHHHHHHHH-------------------EEEEE-----------------------------------------EEEEEE----------HHHHHHHHH----------EEE----------------EEE---------------HHHHHHHHHHHH-----EEEEE----HHHHHH---------HHHHHHHHHHH-----EEE-----HE-----EEEHHHHHHHHHHH----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHHHHHHHHHH-HHHHH------EEEEE-----HHH----EEEHHHHHHHHHHH----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHHHHHHHHHH-HHHHHHHH-------；

融合蛋白4(CARR)：

---HHHHHHHHHHHHHH--------HHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----EEEEE----------HHHHHHHHHHHHHHHH---HHHEEEE--------EEEEEE------------------EEHHHHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHHHHHH---------------------------EEE------------EEEEEEEEEE------------------------------------------------------HHHHHHHHHH--------------------------------------EEEE---HHHHH---------------HH------HHHH-------------------------------EEEE---------------------------------------------------------HHHHHHH-------HHHHHH--------------------EEEEEE-----------------HHHHHHHHHH-----HHH-----HEE------------------------------HHH----EEHHHHHHHHHHH-----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHHHHHHHHHH-HHHHH------EEEEE-----HHH----EEHHHHHHHHHHH-----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHHHHHHHHHH-HHHHHHHH-------；

融合蛋白5(IRRC)：

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融合蛋白6(ARRC)：

--HHHHHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHHHHH-----------------------------E-------------EEEEEEEEEE------------------------------------------------------HHHHHH-HH----------------------------EE---------EEEE----HHH--------------HHHHHHH--HHHH--------------------------------EEE----------------------------EEEE--------------------------HHHHHHH-------HHHHHH--------------------EEEEEE-----------------HHHHHHHHHH-----HHHH----HEE-----------------------------HHHH----EEHHHHHHHHHHH-----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---HHHHHHHHHHHH-HHHHH------EEEEE-----HHH----EEEHHH---HHHHH----HHHHH-----------HHHHHHHHHHHHHHHHHH---H---H------HHHHHHHHHH---HHHH-H----EEEE--------------EEEEEHHHHHHHHHHHHH--------HHHHHHHH------HHHHHHHHHHHHH----EEEEEEE----EEEEE----------HHHHHHHHHHHHHHHH---HHHEEEE--------EEEEE---；

注：H:helices，E:sheets，-:others。

和三级结构的预测，并在常见生物种群及目标生物基因组内进行BLAST同源性分析(先去除CTB序列)，其结果显示6个融合蛋白都有很高的种属特异性，在人类、啮齿动物、鸟类、牛、肠道菌群、芽孢杆菌或乳杆菌或链球菌群、顶复门原虫等生物类别中基本无预防目标生物(球虫、链球菌)外的交叉。所筛选出的融合蛋白基因长度如下：

融合蛋白1(IRR)：1803bp；

融合蛋白2(ARR)：1938bp；

融合蛋白3(CIRR)：2220bp；

融合蛋白4(CARR)：2355bp；

融合蛋白5(IRRC)：2220bp；

融合蛋白6(ARRC)：2355bp。

分别对其三维稳定性、分子量、等电点、表位个数、亲水性、特异性等多参数综合分析，具体分析标准如下，结果如表1和图2所示。

三维稳定性：融合蛋白中的ɑ螺旋越多，则其三维稳定性越高，使用过程越不容易异常降解，因此根据其三维结构中的ɑ螺旋和β折叠的比例综合Expasy分析中的不稳定指数(Instabilityindex)分别计0-10分；

分子量：当融合蛋白的分子量过小时，其免疫原性较差，因此合适的抗原蛋白应有较大的分子量；当融合蛋白分子量<35kDa时计0分，当融合蛋白分子量>350kDa时计1-10分；

等电点：常用裂解液的pH为7.4～8.0，因此融合蛋白的等电点(PI)应远离此区间；当融合蛋白PI<6.0或>10.0时计10分，当6.0<融合蛋白PI<7.0或10.0>融合蛋白PI>9.0时计5分，当7.0<融合蛋白PI<9.0时计0分；

B细胞表位个数：理论上融合蛋白中的B表位个数越多，其免疫原性越好，因此融合蛋白中每含有一个B细胞表位则计1分，上不封顶；

T细胞表位个数：理论上融合蛋白中的T表位个数越多越好，因此融合蛋白中每含有一个T细胞表位则计1分，上不封顶；

亲水性：融合蛋白的亲水性越好，则其越容易发挥作用。因此根据其亲水性不同分别计0-10分；

特异性：融合蛋白的特异性越好，则发生不良反应的概率越低。因此根据其特异性分别计0-10分。

表1各融合蛋白的综合分析结果表

由表1和图2可知，CARR(CTB-AMA-1-RodA-RodA)和ARRC(AMA-1-RodA-RodA-CTB)更适合作为目标融合蛋白基因序列，由于CARR前端含有CTB的信号肽，分泌表达的可能性高，因此优先选择CARR作为目标蛋白。

二、融合蛋白基因表达载体的构建与表达：

选取pET28a(+)作为表达载体质粒，大肠杆菌(BL21)作为表达菌，表达载体的示意图如图3所示，根据大肠杆菌中的密码子偏好对融合蛋白基因序列进行优化以提高融合蛋白的产量(所选体系为E.colistrK12 substrMG1655)。并对融合蛋白基因中可能存在的酶切位点进行分析，选用BamHI和HindIII双酶切能将目的基因完整地连接到表达载体上。针对优化后的基因设计目的基因的扩增引物，并在正向引物前加BamHI酶切位点和保护序列，在反向引物前加HindIII酶切位点和保护序列，得到如下引物组合：

CARR：

上游引物：5’-CGCGGATCCGCGATGATTAAATTGAAATTC-3’(SEQ ID NO.4)；

下游引物：5’-CCCAAGCTTGGGAATTGAGATCATGCCCTG-3’(SEQ ID NO.5)；

CARR完整基因序列如SEQ ID NO.2所示，所表达出的重组抗原的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

三、BL21(DE₃)感受态制备：

取BL21菌液100μL划线接种于LB琼脂平板上，过夜培养(18h)，次日取大肠杆菌单菌落接种于2mL的LB液体培养基中，于37℃以及200rpm条件下过夜培养，取1mL的菌液接种于100mL的LB液体培养基中，于37℃以及200rpm条件下培养3h(OD600nm等于0.432)，菌液分装于冰浴预冷的50mL的离心管中，每管25mL，冰浴30min，随后在4℃和4100rpm条件下离心10min，弃上清；50mL的离心管中加入10mL的冰浴预冷的0.1M的CaCl₂溶液，重悬细菌，冰浴30min，然后于4℃、4100rpm条件下离心10min,弃上清，离心管中加入含15％甘油的预冷0.1M的CaCl₂溶液(质量之比50％甘油：0.15M的CaCl＝1:2)5mL，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，冰上分装至1.5mL的离心管中，每管100μL，-80℃贮存备用。

四、质粒提取及目的基因转化和融合蛋白诱导表达：

将含有目的基因的pET28a(+)质粒的甘油菌活化增菌后按照质粒提取试剂盒抽提质粒，BL21感受态细胞从-80℃拿出，待菌块融化，加入1μL带目的基因的pET28a质粒，拨打EP管底轻轻混匀，冰浴30min后转至42℃水浴锅中热激90s，向EP中加入800μL的LB培养基，于37℃和200rpm的条件下培养1h，取50μL的菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板(工作浓度50μg/mL)，挑选阳性克隆培养于含卡那霉素的LB液体培养基中(同时进行测序及酶切工程菌验证，结果如图5和图6，说明得到了正确的重组表达载体，同时测定的序列与设计序列100％一致)，于37℃和200rpm培养8h，然后按1％接种量于新的含卡那霉素培养基中培养，当菌液长到OD₆₀₀到0.4～0.6时，加入IPTG(相对分子质量：238，先配置成50mg/mL，5mL培养基需加入48μL的IPTG溶液)至终浓度为2mmol/L，37℃诱导5h后离心收集细菌。细菌沉淀可于-20℃保存。

细菌总蛋白提取及WB验证：裂解液配置(50mM的Tris-HCl，2mM的EDTA，100mM的NaCl，0.5％的TritonX-100，调pH值至8.5～9.0备用；用前加入100μg/mL溶菌酶，1μL/mL的蛋白酶抑制剂)，将40mL菌液在12000g，4℃下离心15min收集菌体，沉淀用生理盐水悬浮洗涤2遍，沉淀加入1mL裂解液悬浮菌体。超声粉碎(采用300w，10s超声/10s间隔，超声20min)并反复冻融至菌液变清或者变色，离心取上清液和沉淀分别进行组氨酸抗体的westernblot验证，并将验证成功的蛋白原液进行目的蛋白纯化(组氨酸标记纯化)，聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图7、westernblot结果如图8。

五、CARR蛋白特异性IgY抗体的制备与验证：

蛋鸡的免疫：选择3只120日龄产蛋鸡，2只用于CARR抗原免疫制备IgY，1只不免疫作为阴性对照。免疫及收蛋程序如表2所示，免疫方式为翅根部皮下及胸部肌肉多点注射法进行免疫。

表2免疫及收蛋程序表

采用间接ELISA对进行抗原免疫后的鸡蛋进行IgY抗体提取测定效价(实验表明剂量组2免疫效果更佳，故以剂量组2鸡蛋进行实验)

抗原包被：将牛链球菌破碎抗原(1mg/mL)固定在微孔板上，37℃作用1h后4℃过夜；洗涤；封闭；洗涤；待测样品加入：各浓度稀释倍数(100；200；400；800；1600)的IgY抗体(作用1h)；洗涤；酶标抗体加入：加入酶标抗鸡IgY二抗37℃孵育2h，与待检测抗体结合，并形成一个酶标记复合物。加入底物液后，进行显色，在450nm处测样其吸光度值，以实验组OD450nm/对照组OD450nm≥3作为实验结果阳性,将每组OD450nm/对照组OD450nm≥3的最大IgY抗体稀释倍数最为该组的抗体效价，绘制收蛋时间和抗体效价图，如图10所示。

由图10可以看出在初次抗原免疫后三到四周，IgY抗体效价可达到1：800，具有比较理想的抗原免疫原性。

综上所述，本申请实施例提供的一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原，通过引入牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，再引入牛链球菌的杆状决定蛋白，并使得二者串联在一起，因此可以得到包含牛球虫和牛链球菌双靶点的重组融合蛋白抗原，该重组融合蛋白抗原可以避免只能采用单一病原体的疫苗和抗体来预防和治疗这两类病原体感染的情况，因此更具有实用性。

本申请的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。

在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”和“下”具体为附图中的图面方向。另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”“包含”等是指“包括但不限于”。在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。在本文中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。在本文中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原包括牛球虫的顶膜抗原1或免疫定位蛋白1，以及牛链球菌的杆状决定蛋白，所述顶膜抗原1与所述杆状决定蛋白之间串联，或，所述免疫定位蛋白1与所述杆状决定蛋白之间串联。

2.根据权利要求1所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原还包括霍乱毒素B亚基，所述霍乱毒素B亚基设于所述顶膜抗原1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述免疫定位蛋白1的N端或C端，或，

所述霍乱毒素B亚基设于所述杆状决定蛋白的N端或C端。

3.根据权利要求2所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述霍乱毒素B亚基具有如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原还包括接头序列，所述接头序列包括柔性接头序列和双赖氨酸，所述柔性接头序列设于所述双靶点重组抗原的长表位肽之间，所述双赖氨酸设于所述双靶点重组抗原的短肽链之间。

5.根据权利要求4所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原按照5’～3’的顺序包括霍乱毒素B亚基、顶膜抗原1和杆状决定蛋白。

6.根据权利要求5所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求6所述的双靶点重组抗原，其特征在于，所述双靶点重组抗原具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

8.一种含牛链球菌和牛球虫的双靶点重组抗体，其特征在于，所述重组抗体由如权利要求1-7任一项所述的双靶点重组抗原制备得到。

9.一种制备如权利要求8所述的双靶点重组抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：

设计如权利要求1-8任一项所述的双靶点重组抗原的目的基因序列；

合成所述目的基因序列，并采用设计的引物组对所述目的基因序列进行PCR扩增，后导入表达载体的可表达区域，得到含目的基因的表达载体；

向感受态细胞中导入所述含目的基因的表达载体，以使所述基因序列转化并表达，得到重组抗原；

采用所述重组抗原免疫鸟类动物模型，得到双靶点重组抗体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述引物组的上游引物如SEQ ID NO.4所示，所述引物组的下游引物如SEQ ID NO.5所示。