BR102013026625B1 - Vacina de peptídeos recombinantes para o controle de carrapatos e sequências de nucleotídeos codificadoras dos peptídeos recombinantes - Google Patents

Abstract

VACINA DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES PARA O CONTROLE DE CARRAPATOS E SEQUÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS CODIFICADORAS DOS PEPTÍDEOS RECOMBINANTES. A presente invenção está relacionada com o campo da biotecnologia e da engenharia genética e, particularmente, com a expressão de peptídeos recombinantes. A inoculação destes em bovinos resulta na produção de uma resposta imune capaz de lesar os carrapatos Rhipicephalus microplus, que se alimentam sobre os bovinos inoculados, diminuindo o número e a capacidade reprodutiva desta espécie de carrapato. Tal o imunógeno recombinante pode ser usado como uma vacina eficaz para o controle do carrapato. O objetivo técnico consiste no desenho e na construção de dois genes sintéticos constituídos com códons preferenciais para Pichia pastoris e a expressão dos mesmos de um peptídeo recombinante constituído em sequência contínua e de um peptídeo recombinante, respectivamente, e a composição medicamentosa a base do(s) dito(s) polipeptídeos recombinantes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção esta relacionada com o campo da biotecnologia e da engenharia genética e, particularmente, com a expressão de peptídeos recombinantes. A inoculação destes em bovinos resulta na produção de uma resposta imune capaz de lesar os carrapatos Rhipicephalus microplus, que se alimentam sobre os bovinos inoculados, diminuindo o número e a capacidade reprodutiva desta espécie de carrapato. Tal o imunógeno recombinante pode ser usado como uma vacina eficaz para o controle do carrapato.

O primeiro objeto deste pedido de patente trata-se de duas sequências nucleotídicas codificadoras de dois peptídeos recombinantes. O segundo objeto de pedido de patente é as sequências de aminoácidos que conformam os peptídeos recombinantes. O terceiro objeto deste pedido trata-se de duas apresentações diferentes de uma vacina a base de peptídeos recombinantes contra carrapatos, contendo os peptídeos recombinantes produzidos em Pichia pastoris, adicionados de saponina como adjuvante. As sequências de nucleotídeos, os peptídeos recombinantes e as vacinas aqui descritas, podem ser empregadas na imunização de animais em programas de controle de carrapatos parasitas de bovinos e representam alternativas às vacinas disponíveis no mercado. Estes produtos mencionados acima poderão ser utilizados em indústrias farmacêuticas ou da área de sanidade animal.

ESTADO DA TÉCNICA

O carrapato comum dos bovinos, pertencente à família Ixodidae, é o principal ectoparasita de bovinos no Brasil e em todos os países tropicais e subtropicais. É um parasita extremamente bem adaptado às condições de clima de grande parte do país, e aliado à presença de seus hospedeiros distribuídos por mais de 90% do território nacional, torna-se um problema de grandes proporções à bovinocultura brasileira. Os prejuízos associados não se limitam somente à queda de produção decorrente da intensa hematofagia, mas também a outros danos, como o efeito da saliva do parasita no sistema imune do bovino, depreciação do couro, influência na capacidade produtiva dos animais e, principalmente, a transmissão de diversos micro-organismos causadores de doenças de importância na pecuária nacional, tais como Babesia bovis e Babesia bigemina, tendo participação na epidemiologia da anaplasmose causada por Anaplasma marginale.

O dano direto causado pela hematofagia intensa realizada principalmente pelas fêmeas, podendo chegar a uma quantidade de 0,6 a 3 ml por teleógina (ARTHUR, Ticks and disease. London: Pergamon Press, 1961. 150p), reflete em perda de produção. HOLROYD et al. (Australian Journal Experimental Agriculture. 28: p. 1-10, 1987) observaram que animais que não tinham contato com carrapatos tinham ganhos de 17Kg em média, num período de três anos, quando comparado com aqueles que estavam expostos ao parasita. No Brasil, BRANCO et al. (Coletanea de Pesquisa EMBRAPA, p. 229-234, 1987) encontraram média de ganho de peso de 34,5Kg em bovinos das raças Hereford. Em 1996, FURLONG et al. (XV CONGRESSO PANAMERICANO DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS. Campo Grande APCV: p. 340), observaram um pequeno declínio da produção de leite em infestações crescentes e sucessivas. JONSSON et al. (Veterinary Parasitology 78: 65-77, 1998), na Austrália, estimaram que cada teleógina (fêmea adulta), seria responsável pela queda de produção diária de 8,9 mL de leite e de 1,0g de peso corporal.

Deve-se também contar como prejuízos à bovinocultura brasileira os gastos referentes ao controle direto do carrapato e das doenças por este transmitidas. HORN e ARTECHE (A Hora Veterinária 4: 12-32,1985) estimaram em 800 milhões de dólares os prejuízos diretos e indiretos. O Ministério da Agricultura, em trabalho realizado no biênio de 1983/1984, eleva esse valor à cifra de US$ 1 bilhão, sendo que 40% desse montante são relativos às perdas na produção leiteira.

Tendo em conta os dados calculados em 1985, Grissi et al. (A Hora Veterinária. 21: 8-10, 2002), atualizou as perdas causadas chegando-se à cifra de US$ 2 bilhões ano, logicamente este cálculo compreende danos diretos e indiretos, incluindo doenças transmitidas. Assim, o que poderia ser denominado o complexo Rhipicephalus m/crop/us/hematozoários daria uma perda média anual de US$ 11,76 por bovino. Atualmente a população bovina no País esta calculada em 200 milhões de cabeças, o que teoricamente chegaria a R$ 2,3 bilhões anuais.

O método de controle mais empregado a nível mundial é o químico, baseado em acaricidas (pesticidas) de diferentes bases. Porém, implicações de diferentes ordens têm sido notadas, principalmente o desenvolvimento de resistência por parte dos carrapatos aos princípios ativos empregados. Por outro lado o uso constante destes produtos, dada a resistência, tem levado à contaminação de ecossistemas e à presença resíduos em derivados alimentícios de origem animal. Pensando-se no mercado externo de carne e leite, este deverá sofrer barreiras sanitárias sobre resíduos em carne e leite e derivados dos mesmos. Recentemente, teve-se o embargo de toneladas de derivados cárneos por resíduos de lactonas macrocíclicas usadas como endectocidas.

No Brasil, de acordo com FREIRE (Boletim da Direção de Produção Animal. 9: 3-31, 1953), a resistência aos arsenicais foi documentada pela primeira vez no ano de 1950. Este mesmo pesquisador (Boletim Direção de Produção Animal. 13: 62-80,1956) relatou os primeiros casos de resistência a compostos clorados, ocorridos no Rio Grande do Sul. A resistência aos organofosforados no Brasil foi descrita por SHAW et al. (Journal Economic Entomology 61:1590-1594, 1968); AMARAL et al. (Journal Economic. Entomology 67:387-389, 1974): WHARTON (Wild Animal Review .20:8-15, 1976); PATARROYO & COSTA (Tropical Animal Health Production.12:6-10, 1980) e OLIVEIRA et al. (Arquivos. Brasileiros de Medicina. Veterinária e Zootecnia. 38:205-214,.1986). FLAUSINO et al. (Revista. Brasileira de Parasitologia. Veterinária 4:45,.suplementei. 1995), trabalhando no estado do Rio de Janeiro, demonstraram os fatores de resistência com respeito a DL50 para a base química amitraz como sendo de 50,7 e variando de 8,5 a 20,9, com respeito aos piretróides alfametrina, deltametrina e lambda(X) cialotrina. Os mesmos pesquisadores na região nordeste do pais e especificamente no estado de Pernambuco constataram resistência aos compostos que têm como base química a amidina e aos piretróides sintéticos cypermetrina e deltametrina. MARTINS E FURLONG (Veterinary Record 149: 64,2001) pesquisando amostras brasileiras de R. microplus, encontraram resistência a moxidectina, doramectina e invermectina indicando o aparecimento de resistência cruzada ao grupo químico das avermectinas. Tais publicações mostram que todas as bases químicas existentes no mercado já causaram resistência em populações deste parasita, sendo necessário o aumento de doses do produto ou o aumento da freqüência no tratamento, aumentando a contaminação.

Em todo o mundo existem várias linhas de pesquisas de métodos alternativos de controle do carrapato R. microplus. Medidas alternativas de controle são propostas como modo de minimizar os obstáculos derivados do uso de parasiticidas químicos, que além da resistência, trazem problemas de resíduos para os produtos de origem animal e para o meio ambiente.

Dentre tais medidas alternativas, destaca-se a utilização de pastagens ou o uso rotacional das mesmas, que dificultam o acesso de larvas ou que liberem agentes voláteis (LABRUNA e VERÍSSIMO, Arquivos Instituto Biológico 68: 115120, 2001; FERNANDEZ-RUVALCABA et al., Experimental and Applied. Acarology. 32: 293-299, 2004). Outra medida que tem sido abordada é o banho dos animais com extratos fitoterápicos que inibem o acesso das larvas (HEIMERDINGER et al., Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 15: 37-39, 2006.; BROGLIO-MICHELETTI et al, Revista. Brasileira. De Parasitologia Veterinária 18: 44-48, 2009). O emprego de entomoparasitas é outra técnica sob avaliação. Entre os entomoparasitas pode-se destacar a mosca Megaselia scalaris que reduz o número de ovos das teleóginas (ANDREOTTI, Embrapa Gado de Corte, Artigo Didático 2002). Nematóides entomopatogênicos são promissores agentes biológicos no controle de diversas espécies de carrapatos, entre elas R. microplus, destruindo a hemocele dessas espécies (SAMISH e GLAZER, Trends Parasitology. 17: 368-371, 2001; VASCONCELOS et al., Parasitology Research. 94: 201-206, 2004).

O melhoramento animal na seleção de raças mais resistentes ao carrapato ainda é um processo polêmico. Há controvérsia sobre estimativas de valores de herdabilidade e questiona-se a correlação da característica de resistência aos carrapatos com a produtividade do animal (JONSSON et al., Veterinary Parasitology, 89: 297-305 2000; FRISCH et al., International Journal for Parasitology. 30: 253-264 2000). O que se sabe é que bovinos com maior grau de sangue zebuíno (Bos indicus) possuem maior resistência a parasitas, e mesmo dentro desse grupo há diferenças de raças. Os animais Nelore, por exemplo, são mais resistentes do que os Gir ou Guzerá (VERÍSSIMO et al., Arquivos do Instituto Biológico. 71: 630-632. 2004; JONSSON, Veterinary Parasitology.137: 110 2006).

Apesar da pesquisa contínua acerca de alternativas não poluentes e não químicas para o controle do carrapato, ainda se sabe muito pouco sobre as interações ecológicas e o impacto que a introdução de espécimes estranhos, seja de vertebrados ou invertebrados, causaria no meio ambiente. Enquanto não se chega a uma solução definitiva nesse campo, a alternativa que sobra para o produtor ainda é o uso de fármacos acaricidas, porem os problemas de seu emprego, sucintamente relatados anteriormente levam a uma realidade em que urge a descoberta e desenvolvimento de uma alternativa de combate a este parasita.

Pesquisas e avanços científicos na área de imunologia, como a compreensão cada vez maior sobre biologia de parasitas, uso de modernas ferramentas como a biologia molecular e alta escala de produção permitem que vacinas antiparasitárias sejam uma grande possibilidade (DALTON e MULCAHY, Veterinary Parasitology.98: 149 - 167 2001). O desenvolvimento de vacinas contra carrapatos representa uma clara alternativa de controle.

A identificação de antígenos protetores para bovinos contra o R. microplus é crescente visto o impacto econômico e as dificuldades, já mencionadas, no controle desse parasita.

Em 1994, na Austrália, foi liberada a primeira vacina comercial contra R. microplus, utilizando clonagem do gene bm86 em Escherichia coli e a produção da proteína recombinante Bm86 (rBm 86), recebendo o nome de TickGARD® (Hoeschst Animal Health, Austrália) e subsequentemente denominada TickGARD Plus® (SMITH et al., The development of TickGard a commercial vaccine against the cattle tick Boophilus microplus. Indooroopilly: Biotec Autralia-CSIRO, 17 p., 1995; WILLADSEN, Veterinary Parasitology 71: 209-222 1997). Com as bases do mesmo antígeno foi formulada em Cuba a vacina Gavac® (Heber Biotec AS, Havana, Cuba) e Gavac Plus®’ porém essa rBm 86 foi produzida em Pichia pastons (GARCÍA-GARCÍA et a/., Vaccine. 16; 1053-1055, 1998).

A eficácia destas vacinas tem variado entre 50 e 91%. Esses valores são avaliados pela redução da viabilidade e do número de ovos, consequentemente diminuindo o número de carrapatos nas gerações subseqüentes, tendo todos os estágios de desenvolvimento comprometidos (RODRIGUEZ et al., Journal of Biotechnology 33: 135-143, 1994; JONSSON et al., Veterinary Parasitology 88: 275-285, 2000).

Algumas amostras de R. microplus, entretanto, mostraram-se menos susceptíveis à vacina recombinante Bm86 (rBm86). A ineficiência foi determinada numa população argentina denominada posteriormente de Cepa A, a qual mostrou que tinha um gene diferente, o gene bm95, que foi, em seguida clonado, expresso na levedura P. pastoris e utilizado como outra vacina recombinante, controlando a população que era resistente a rBm86 (GARCÍA-GARCÍA et al., Vaccine. 18: 2275-2287, 2000).

O isolamento geográfico de cepas de R. microplus pode levar a essas diferenças genéticas e fisiológicas, remetendo a uma resposta negativa ao controle pela vacinação (GARCÍA-GARCÍA et al., Experimental and Aplied Acarology 23: 883-895 1999). Dessa forma, existe a constante busca por um imunógeno ou a combinação de antígenos que cubram o maior número possível de populações, protegendo o rebanho das infestações por R. microplus.

O documento de patente WO2012041260 trata do controle de ectoparasitas e doenças transmitidas. São várias sequências de proteínas ribosomais (PO) que formam quimeras com proteínas diferentes. No que tange a carrapatos e, especificamente ao R. microplus, se usou como antígeno a proteína íntegra denominada Bm86 eliminando os fragmentos gênicos do peptídeo sinal e a região de transmembrana para construir uma proteína quimérica (Bm86-pPO). A mesma foi inoculada em bovinos usando como adjuvante o Montanide. Não tem similaridade com o pedido atual de patenteamento porque não se trata de peptídeo recombinante e as reivindicações não têm similaridade com nossas reivindicações.

No documento de patente W02009127766 são utilizados peptídeos da proteína denominada Bm95 do R. microplus para serem fusionados à região N- terminal da proteína de superfície denominada MSP 1a de Anaplasma marginale. Não é similar ao presente pedido de patente, pois não é um peptídeo recombinante expressado por transfecção de genes sintéticos em leveduras para o controle do carrapato comum dos bovinos o R. microplus.

O documento de patente ZA9901320 está relacionado com o campo da biotecnologia de vacinas, isto é, para o desenvolvimento de vacinas de peptídeos (mimotopes) para controlar o carrapato bovino. A referida vacina tem aplicação potencial devido ao fato de que as proteínas do carrapato são reconhecidas pelo soro de ratos inoculados com o peptídeo de fusão-fagos que expressam, e também pelo fato de que teleóginas de carrapatos apresentaram uma cor enegrecida sugerindo danos hemorrágicos em ensaios de desafio. Dado a existência de uma grande necessidade de novos métodos para controlar Rhipicephalus microplus, uma potencial vacina pode ser desenvolvida usando peptídeos isolados, em conjunto ou associada com antígenos existentes para um controle eficaz de carrapatos. Para o anterior, se usou a técnica de phage display, que é muito ampla e seleciona muitos possíveis peptídeos com possibilidade de serem usados porque é um mapeamento. O referido processo consiste em ciclos sucessivos de seleção, a lavagem de eluição, e a amplificação de fagos filamentosos que expressam as sequências de peptídeos aleatórios que se ligam com afinidade para várias moléculas, incluindo imunoglobulinas. Não tem similaridade com nosso pedido de patenteamento porque não se trata de um peptídeo recombinante único expressado por transfecção de genes sintéticos e com comprovada ação para o controle do R. microplus em bovinos.

O documento de patente CA1339466 de vacinas de carrapatos, especificamente do R. microplus, refere-se ao gene que codifica a proteína denominada de Bm86 que é composta de 650 aminoácidos. A proteína se encontra em estado natural no carrapato citado e não tem sofrido nenhuma modificação por se tratar da proteína encontrada naturalmente no parasita. Não é similar ao atual pedido de patente por se tratar de uma proteína íntegra e é diferente deste pedido, porque este se refere a um peptídeo recombinante produzido por transfecção de genes sintéticos na levedura P. pastoris cepa km71.

Os documentos de patente PI 0001717-5, AU 779537, MX 270574, PT 1289545, ES 236043, US 8,110,202 apresentam uma vacina sintética para o controle do Rhipicephalus (B.) microplus. Foi demonstrado de que a vacina desenvolvida, elicita uma resposta imune completa como qualquer antígeno mais complexo. É interessante notar que a vacina estimula uma resposta imune T- dependente. (PATARROYO et al., Veterinary Parasitology 166: 333-339. 2009).

Estudos de variabilidade genética analisando 20 amostras de distintos locais e condições geográficas de regiões brasileiras e outros países sul- americanos demonstraram que a sequência patenteada, SBm7462, manteve-se conservada entre todas as populações (SOSSAI et al., Experimental and Applied Acarology 37:199-214 2005; PECONICK et al., Experimental Parasitology 119: 37-43 2008), concluindo que não há variabilidade nessas seqüências que possam interferir na eficiência vacinai. Isso reforçou o conceito de antígeno ou imunógeno universal. Isso significa também que os determinantes antigênicos da vacina desenvolvida estão presentes em todas as populações estudadas.

A vacina sintética SBm7462, controla de forma eficiente o R. microplus, porém, apresenta limitações para produzir o peptídeo sintético em grandes quantidades.

Tendo em conta as necessidades de controlar o parasita e a eficiência do imunógeno desenvolvido, SBm7462, é necessária uma forma alternativa para produzir o mesmo. Assim, desenvolveu-se uma nova forma de produção da mesma a partir da fermentação por transfecção em leveduras de genes sintéticos que codificassem o peptídeo sintético.

Por meio da técnica de DNA recombinante a vacina pode ser produzida de forma mais eficiente (menor custo, menor tempo e grande escala de produção), sendo eficaz para os carrapatos do Brasil, bem como desenvolver um produto atóxico, sem resíduos e que não impacte negativamente o meio ambiente.

A ação da vacina após aplicação no rebanho funciona da seguinte maneira: as proteínas são inoculadas nos bovinos e induzem a reação do sistema de defesa do organismo, que cria anticorpos específicos contra a proteína. Ao parasitar o animal vacinado, os carrapatos sugam o sangue contendo anticorpos contra as suas próprias células intestinais. O resultado é uma destruição intestinal, que mata os carrapatos ou, no mínimo, reduz sua capacidade de se alimentar adequadamente e reproduzir-se.

Ao aplicar a vacina com os antígenos, o gado desenvolverá uma imunidade protetora contra os carrapatos, que irá evitar diversos prejuízos diretos e indiretos que podem ser causados por este ácaro.

As vacinas baseadas em antígenos recombinantes não apresentam risco à saúde, são seguras para o ambiente e o desenvolvimento de resistência pelos carrapatos por meio de adaptação seletiva é pouco provável (NUTTALL et al., Parasite Immunology 28: 155-163 2006).

Dentre as vantagens do uso de esta vacina, em detrimento aos carrapaticidas, pode-se destacar: ausência de período de carência após a aplicação, pois não deixa resíduos nos alimentos, fator de importância fundamental na pecuária de leite; ação mais sustentável, pois são ecologicamente corretas, uma vez que não são tóxicas ao animal, ao meio ambiente e ao homem; não destroem a microbiota natural, pois é espécie-específica, irão atingir apenas os carrapatos da espécie R. (B.) microplus, sem atacar micro-organismos naturais inerentes aos bovinos; e desenvolvimento de resistência pelos carrapatos por meio da adaptação seletiva é pouco provável.

A vacina de DNA recombinante desenvolvida é adequada aos carrapatos R. (B.) microplus encontrados no Brasil e em outros países sul-americanos. Estudos de variabilidade genética analisando 20 amostras de carrapatos de distintos locais e condições geográficas das regiões brasileiras e na Argentina, Venezuela, Colômbia e Uruguai confirmam a presença dos epitopes antigênicos em essas populações (SOSSAI et al., Experimental and Applied Acarology 37:199-214 2005; PECONICK et al., Experimental Parasitology 119: 37-43 2008).

A vacina desenvolvida é uma vacina de rebanho, no qual a vacinação do rebanho por três ciclos anuais diminui a população de carrapatos o que leva a minimização de perdas já mencionadas, e a evitar o uso de 19 ou 20 banhos carrapaticidas como atualmente vem sendo feito em muitas fazendas do País.

Esta invenção tem alto impacto social e ambiental porque atualmente, há a necessidade de atender as demandas dos consumidores por alimentos livres de produtos químicos, a proteção do meio ambiente e consequentemente dos animais silvestres. Sendo assim, em um mercado onde os produtos para combater ectoparasites são preponderantemente químicos, é necessário investir na pesquisa e fabricação de produtos alternativos para o controle destes agentes.

As vacinas são seguras, possuem uma boa interface com o meio ambiente e são mais facilmente aceitas pelos consumidores, possivelmente pela familiaridade que eles possuem com as vacinas usadas na medicina humana. Com sua utilização há maior aumento da produção e produtividade animal do que o uso de outros medicamentos.

A vacina, por ser de subunidades (não é uma proteína íntegra) e imunologicamente definida, não contém restos de organismos diferentes à sequência de aminoácidos que compõem o peptídeo recombinante, tornando-a segura aos animais e ao meio ambiente.

O desenvolvimento de vacinas para combater carrapatos, ou ectoparasitas em geral, torna-se relevante principalmente por não deixar resíduos nos produtos de origem animal (carne e leite) e não agredirem o meio ambiente, pois suas formulações não possuem componentes químicos como antibióticos e/ou metais pesados dentre outros.

Ao contrário das vacinas, os produtos químicos utilizados hoje para combater os carrapatos são altamente tóxicos. Caso o gado seja tratado com os carrapaticidas e não seja respeitado o período de carência, a carne e o leite não deverão ser destinados ao consumo humano, pois estes estarão sujeitos aos riscos de intoxicações que, por períodos prolongados, podem levar a efeitos nocivos no ser humano.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1- Cinética de anticorpos em animais imunizados com a SEQ ID NO:3. As setas indicam as inoculações e a estrela o momento do desafio com as larvas de Rhipicephalus (B.) microplus. As barras indicam T indicam a diferença por adição de um desvio padrão.

Fig. 2- Cinética de anticorpos em animais imunizados com a SEQ ID NO:4. As setas indicam as inoculações e a estrela o momento do desafio com as larvas de Rhipicephalus (B.) microplus. As barras indicam T indicam a diferença por adição de um desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Obtenção das sequências codificantes

Dois genes denominados de seq1 (SEQ ID NO:1) e seq4 (SEQ ID NO:2) foram desenhados a partir da metodologia de vacinologia reversa usando como base o peptídeo sintético SBm7462, para uso na levedura P. pastoris km71. O gene seq4 foi construído com o objetivo de expressar uma cópia similar do SBm7462. Já o gene seq1 foi desenhado para expressar o peptídeo repetido três vezes, em tandem. Os genes foram desenhados com códons preferenciais para P. pastoris. Para os desenhos dos genes levaram-se em consideração os sítios de clonagem do vetor de expressão utilizado. O vetor utilizado apresenta uma região de inserção de fragmentos heterólogos, compostos de vários sítios de restrição pelas enzimas denominadas (Xhol, SnaBI, EcoRI, Avrll e Notl).

Construção dos cassetes de expressão seq1 (SEQ ID NO:1) e seq4 (SEQ ID NO:2)

As sequências que correspondem aos genes foram clonados no vetor pPIC9, o qual foi submetido a clivagem com enzimas de restrição adequadas. Por meio dessas clivagens foram formadas extremidades coesivas tanto nos vetores quanto nos genes, propiciando a ligação dos genes nas ORFs (Open Reading Frame) corretas em seus respectivos vetores de expressão. Todas as reações de clivagens foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 0,8%. As construções dos cassetes se deram através do uso da enzima T4DNA ligase, cuja função foi catalisar a ligação das extremidades coesivas das fitas 5’-3’ do vetor com a 3’- 5’ dos genes e vice-versa.

Análises dos cassetes de expressão por PCR de colônia e sequenciamento.

Os cassetes de expressão construídos foram multiplicados em E. coli DH5a. Clones de cada gene foram analisados por PCR de colônia e posteriormente sequenciados com o intuito de confirmar a correta presença do gene no cassete de expressão.

Os clones confirmados por sequenciamento foram submetidos ao crescimento em meio LB líquido, a 37°C sob agitação orbital de 250 rpm por 16 5 horas, para posterior extração dos cassetes de expressão que foram utilizados para a transformação das leveduras Pichia pastoris Km71.

Preparações dos cassetes seq1 (SEQ ID NO:1) e seq4 (SEQ ID NO:2) para eletroporação.

Para a transformação da P. pastoris km71 por eletroporação, os cassetes io de expressão foram linearizados com enzima de restrição Scl (WU e LETCHWORTH Drug discovery and genomic technologies, 36: 152-154 2004).

Em cada reação de clivagem utilizou-se aproximadamente 20 μg de DNA plasmidial com excesso de três vezes da enzima, a 37°C e overnight.

O acompanhamento da clivagem foi realizado antes do término da reação 15 através de eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etidio e visualização sob luz UV. Após a verificação da total linearização dos cassetes de expressão, toda a reação foi aplicada em canaletas contíguas em gel de agarose 0,8% e submetida à eletroforese. A extração das bandas contendo o plasmídeo linearizado se deu utilizando kit comercial apropriado. O material extraído foi 20 posteriormente precipitado com etanol com a finalidade de concentrá-lo a 10 μg em 10 μL de água nuclease free, que foi o volume final usado na transformação das leveduras.

Transformações da levedura P. pastoris Km71 com os cassetes de expressão e seleção em meio MD.

A transformação genética da levedura P. pastoris km71 ocorreu por meio da técnica de eletroporação. Para isso, 10 μg de cada plasmídeo, previamente linearizado com a enzima de restrição, foram adicionados a 80 μL de células eletrocompetentes e transferidos para cubetas de eletroporação de 0,2 cm. A mistura DNA e P. pastoris km71 foi mantida em banho de gelo por 5 minutos a fim 30 de permitir o equilíbrio térmico da solução. Após este período as cubetas foram inseridas na cela de eletroporação e submetidas a um pulso elétrico (1,5KV, 25μF e 200Q).

Imediatamente após a eletroporação foi adicionado 1 ml_ de sorbitol 1M na cuba de eletroporação e mantida em banho de gelo por 5 minutos. Após esse período, 200 μL dos transformantes foram plaqueados em meio MD sólido sem histidina (1,34% YNB; 4x10*5% de biotina, 2% de dextrose e 1,5% de Agar bacteriológico). Para todos os clones transformados foram feitos plaqueamentos em duplicatas. As placas foram mantidas a 30°C por 72 horas até o completo crescimento dos clones. A seleção com o meio MD é devido porque somente as leveduras transformadas com o vetor pPIC9 se desenvolvem devido a presença do gene histidinol desidrogenase que sintetiza o aminoácido histidina.

Confirmações dos clones de P. pastoris Km71 por Reação em Cadeia de Polimerase (PCR).

Além da seleção dos clones transformados de P. pastoris km71 através da passagem em meio sem histidina (MD) clones de cada gene foram submetidos à extração do DNA total e amplificação dos mesmos por PCR.

O DNA cromossomal dos clones previamente selecionados foi extraído de culturas crescidas em MD líquido sob agitação de 250 rpm por 48 horas à 30°C. A cultura foi recuperada através da centrifugação por 10 minutos a 5000g a temperatura ambiente. O pellet foi ressuspendido em 400 μL da solução de extração (2% de triton 100x, 1% SDS, 100mM de NaCI, 100mM de Tris-HCI e 10 mM de EDTA, pH 8,0), e transferidas para um tubo de 2 ml_ contendo 300 mg de pérolas de vidro de 0,45 mm de diâmetro utilizadas para lise mecânica das leveduras através de vigorosa agitação orbital por 2 minutos. Posteriormente, foram adicionados 200μL de fenol e 200μL de clorofórmio e novamente procedeu- se à agitação vigorosa por mais dois minutos para potencializar a lise das células e posterior extração do DNA. Terminada esta fase, a solução foi centrifugada por 5 minutos a 5000g. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo e tratada com RNAse (10 μL de uma solução de 10 mg/mL) por 1 hora à 37°C e logo após com proteinase K (20 μL de uma solução de 10 mg/mL) durante 2 horas à 37°C. A precipitação foi realizada com a adição de 1/10 do volume de acetato de sódio pH 5,2 mais 2 volumes de álcool etílico absoluto gelado. A solução foi suavemente agitada e mantida à -20°C durante duas horas para aumentar o rendimento da precipitação do DNA e depois centrifugada por 5 minutos a 5000g. O pellet foi lavado com álcool etílico 70% por duas centrifugações sucessivas e seco à temperatura ambiente. Posteriormente o DNA foi ressuspendido com 100 μL de água nuclease free, quantificado em gel de agarose 1% com DNA lambda e estocado à -20°C até o momento do uso.

Para a determinação das inserções dos genes no cromossomo das leveduras foi utilizada a técnica de PCR e os primers 5’AOX1 (5- GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3') e 3’AOX1(5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC -3’).

Seleções dos clones seq1 (SEQ ID NO:1) e seq4 (SEQ ID NO:2) por blotting de colônia.

Os clones de P. pastoris km71 pré-selecionados pelo meio MD e PCR para a expressão recombinante foram selecionados pela análise da produção de proteínas por Western Blotting de colônia. A técnica foi escolhida pelo fato de as leveduras transformadas com os cassetes SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 exportarem as proteínas expressadas para o meio extracelular. Para isso, clones transformados com SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2 foram escolhidos aleatoriamente. Esses clones foram plaqueados em duas placas de petri contendo o meio sólido YPD até as colônias atingirem o diâmetro médio de 3 mm, em estufa a 30°C. Ao atingir o tamanho requerido, com o auxílio de uma membrana de nitrocelulose, os clones foram coletados por imprint e repassados para outras duas placas contendo o meio de expressão MM (1,34% de YNB, 4 x 10-5% de biotina, 0,5% de metanol e 1,5% de ágar bacteriológico) com uma membrana de nitrocelulose de 0,2 μm previamente equilibrada neste meio, à 30°C por 12 horas. Os imprints foram colocados em contato direto com as membranas de 0,2 μm, tomando-se o cuidado de remover todo o ar existente entre as membranas. As placas foram incubadas a 30°C por 72 horas, tempo necessário para haver uma ótima expressão de proteínas e sua transferência para a membrana.

Após o período de indução dos genes, as membranas de nitrocelulose foram coletadas de forma tal para se evitar ao máximo o arraste das colônias. Posteriormente as membranas de nitrocelulose foram tratadas com metanol 100% por 1 minuto para fixação das proteínas e imediatamente submetidas a 3 lavagens sucessivas, de 20 segundos cada, com água milli Q.

A detecção dos clones produtores foi realizada através da técnica imunoenzimática de dot-blotting. Para isso as membranas foram bloqueadas com PBST 0,05% pH 7,6 (4,25g NaCI; 0,64g Na2HPO4; 0,068g NaH2PO4.H2O; 0,05% de Tween 20 e H2O milli Q q.s.p. 500ml_) por 30 minutos sob agitação lateral. Após esse passo as membranas foram submetidas a três lavagens sucessivas com PBST 0,05% durante 5 minutos cada e posteriormente incubadas por duas horas com soro de coelho anti-peptídeo sintético SBm7462 na diluição de 1:100 (controle positivo) e a outra com soro de coelho normal, ou seja, não imunizado com o peptídeo sintético SBm7462 na diluição de 1:100 (Controle negativo). Imediatamente após a incubação as membranas foram novamente submetidas a três lavagens de 5 minutos cada com PBST 0,05% e posteriormente incubadas com proteína A marcada com peroxidase na diluição de 1:400 por 1 hora.

A revelação da reação se deu após duas lavagens de 5 minutos cada com PBST 0,05% e uma com PBS, pH 7,6. O substrato foi formulado com 10 mg de DAB (diaminobenzidine), 10 mL de Tris-HCI 0,05M pH 7,6; 1 ml_ de NÍCI2 0,3% e 10 μl de H2O2 30%. A solução foi mantida em agitação, juntamente com as membranas até o início do aparecimento do background sobre o controle negativo. Nesse momento a reação foi parada pela lavagem da membrana com água milliQ.

Avaliação da estabilidade dos clones recombinantes

Para avaliar a estabilidade genética dos recombinantes, os mesmos foram transferidos para o meio YPD agar (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona, 20 g/L de glicose, 20 g/L de agar bacteriológico) e incubados a 30°C até o surgimento de colônias isoladas. Em seguida, cinco colônias de cada transformante foram sucessivamente transferidas para meio completo não seletivo, YPD, em um total de dez passagens. A cada passagem as placas foram incubadas a 30°C por 72 horas. No final da quinta passagem, as colônias foram transferidas para meio seletivo MD sem histidina e incubadas a 30°C por mais 72 horas.

Produção dos peptídeos em Fermentador de Bancada Pré-inóculo:

Um clone de P. pastoris, congelado com glicerol numa proporção 70% cultura-30% glicerol, mantido em ultrafreezer (-70 °C), é descongelado em gelo e cultivado em erlernmeyer de 500 mL contendo 250 ml_ de Meio B (Tabela 1), a 30°C e agitação orbital de 250rpm, por 2 dias. A esterilidade da biomassa foi analisada por meio de microscopia de luz.Tabela 1. Composição do Meio B.

Fermentação:

A produção dos antígenos recombinantes, em escala laboratorial, é realizada por processos fermentativos em biorreator. Ao pré-inóculo, é adicionado 21 mL de PTM1 Trace Salts (Tabela 2) e 1 mL de anti-espumante. Essa mistura é colocada em frasco estéril com cânula adaptada para o biorreator e adicionada aos 4,5 L de meio B estéril que já estão no reator, através de pressão positiva. O reator é então ligado e os parâmetros são mantidos constantes: injeção contínua de oxigênio de 2mmHg, rotação de 600rpm e jaqueta de água mantida a 30°C. O pH é mantido entre 5 e 5,5, corrigido com hidróxido de amónia 50% ou ácido fosfórico 50% diluídos em água autoclavada. Os tampões são mantidos em frascos separados ligados a bomba peristáltica programada para correção automática do pH. Tabela 2. Composição do Meio PTM1*.

Alimentação

Como os parâmetros de oxigênio dissolvido no meio são acompanhados, e tendo em conta que os níveis de oxigênio permanecem baixos pelo consumo, durante a fase de crescimento e multiplicação da biomassa, quando este sobe 5 alcançando valores próximos a 90%, o que ocorre aproximadamente 2 dias após o início da fermentação, é adicionado ao meio 400 mL de uma solução estéril contendo Glicerol 50% em água e 6 mL de PTM1/L. Depois disso os valores de oxigênio dissolvido devem cair novamente, indicando retorno ao seu consumo e multiplicação.

Indução

Quando toda a fonte de carbono (glicerol) fornecido houver se esgotado, o parâmetro de oxigênio dissolvido voltará a aumentar o que ocorre aproximadamente 3 dias após a alimentação. Neste momento inicia-se a indução da produção do peptídeo recombinante com metanol puro, em que um volume 15 final de 400 mL de metanol é adicionado à cultura, durante 4 dias em intervalos de 1 hora. Nas duas primeiras horas, um volume de aproximadamente 2 mL é adicionado para adaptação da cultura à nova fonte de carbono e a partir da 3a hora aproximadamente 4 mL/h e assim permanece até o fim do volume total. Também adiciona-se separadamente 1 mL diário de PTM1.

Purificação

Decorrido o período de indução, a cultura é centrifugada a 4°C por 15 minutos a 4500rpm. O sobrenadante é então submetido a filtração tangencial, sendo primeiramente clarificado em filtro de 100kDa, do qual o permeável, ou seja, o conteúdo de peso menor que 100kDa, é recolhido e submetido a nova filtração em filtro de 30kDa, onde novamente todo o permeável é recolhido. O produto da filtração é submetido, pelo mesmo sistema de filtração tangencial, a uma diálise com água milli-Q gelada a 4 °C. A esterilização do produto é feito através de filtração em membranas de 0,45 μm e recolhido em frascos esterilizados. As provas de esterilização são feitas por inoculação em médio Sabureau e Agar sangue mantidos em estufa bacteriológica a 37 °C por 96 horas.

Posteriormente, a proteína é mensurada para quantificar as doses e embalada em frascos de poliuretano e estocada em refrigeração a 4 °C.

Os peptídeos recombinantes, identificados como SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, codificados pelas SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2, respectivamente, foram utilizados como imunógenos para o controle do carrapato Rhipicephalus (B.) microplus.

EXPERIMENTO DE DEMONSTRAÇÃO Avaliação da Eficiência dos Imunógenos Recombinantes SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4

Foram utilizados 20 bovinos machos mestiços (H/Z), média de sangue 7/8, com idade entre 6 e 10 meses, oriundos de fazendas leiteiras do município de Viçosa-MG e mantidos desde o seu nascimento no isolamento de bovinos a prova de artrópodes vetores.

Os animais foram identificados por meio de brincos auriculares numerados. A alimentação foi baseada em ração balanceada e de volumoso (feno) com 17% de proteína, oferecida às 8 horas da manhã e às 16 horas e água ad libitum.

Os animais foram distribuídos, aleatoriamente, em quatro grupos de 04 animais cada. As inoculações foram realizadas em três doses, via subcutânea, sendo: Primeira inoculação: dia 0 (zero); • Segunda inoculação: dia 30; • Terceira inoculação: dia 60.

O esquema de inoculação está descrito abaixo: • Grupo SEQ ID NO:3: 1,5 mg de saponina adicionado de 1 mg do peptídeo recombinante diluído em 4 mL de água milli Q estéril. • Grupo SEQ ID NO:4: 1,5 mg de saponina adicionado de 2 mg do peptídeo recombinante diluído em 4 mL de água milli Q estéril. • Grupo Controle de adjuvante Saponina: 1,5 mg de saponina diluída em 4 ml de água milli Q estéril • Grupo Controle: 4 mL de água milli Q estéril. • Grupo Pichia pastoris: 2 mg de extrato bruto de P. pastoris não transfectada diluído em 4 mL de água milli Q estéril.

Os animais inoculados foram constantemente monitorados duas vezes por dia durante sete dias após a inoculação para verificação de possíveis reações cutâneas de hipersensibilidade aos peptídeos recombinantes e ao adjuvante, alem da inspeção visual diária, foram feitos testes de hematócrito em todos os animais nos sete dias seguintes à inoculação para observar algum efeito hemolítico dos peptídeos recombinantes.

Desafio e Infestação dos bovinos

Após 21 dias da última inoculação dos peptídeos recombinantes, todos os animais foram desafiados com larvas de R. (B.) microplus na quantidade de 1.500 larvas por dia, durante três dias, no início da manhã. • Dia 1 - Região do peito e barbela • Dia 2 - Região escapular e entre os membros anteriores • Dia 3 - Região escrotal e inguinal • s animais foram mantidos em cabresto e com as caudas amarradas por 8 horas, a fim de correta fixação das larvas.

Avaliação dos Parâmetros Biológicos das Teleóginas Desprendidas

Após o desafio com as larvas de carrapato, foram realizadas observações diárias até o décimo oitavo dia, para verificar o desenvolvimento das larvas, ninfas e predizer o provável dia do início do desprendimento de teleóginas dos animais. Aos 21 dias, com o começo da caída das fêmeas, foi iniciado procedimento de coleta manual de todas as teleóginas encontradas no chão das baias, no cocho de alimentação e na grade de escoamento de detritos. Para uma coleta mais fiel, 5 a baia foi lavada duas vezes ao dia e todo o material resultante dessa lavagem foi peneirado, e as teleóginas retiradas foram contadas e identificadas.

Número das Teleóginas

Foram contabilizadas as teleóginas desprendidas naturalmente e também as pisoteadas.

Peso das Teleóginas

As fêmeas coletadas foram lavadas em água corrente e pesadas em balança analítica, com precisão de 3 casas decimais, a fim de determinar a porcentagem de redução de seu peso médio.

Peso da Postura

Após a pesagem as fêmeas coletadas foram acondicionadas individualmente e identificadas e deixaram-se em ovipostura durante quinze dias em estufa a 27 °C e 80% de umidade relativa (OBA Revista da Faculdade de Veterinária e Zootecnia Universidade de São Paulo 13:409-420 1976). Após o término da postura, foi avaliado o peso total de postura de cada grupo.

Relação Peso Larva/grama de ovos

Do total de ovos, foram separadas vinte alíquotas de 0,5 g (10.000 ovos) por grupo em tubos de centrífuga, perfazendo um total de 10 gramas de ovos por grupo. Os tubos foram tampados com chumaço de algodão e os ovos incubados por 26 dias em estufa 28 °C e 80% de umidade relativa. As alíquotas foram feitas 25 em mais de um dia de pesagem dos ovos. Para a obtenção dos resultados, foram empregadas as técnicas descritas por (MASSARD et. al. Revista Brasileira Medicina Veterinária 17: 167-173 1995).

Fórmulas para Avaliação dos Parâmetros Biológicos

Com o objetivo de avaliar o efeito dos imunógenos sobre os parâmetros 30 biológicos do carrapato, foram empregadas as fórmulas preconizadas por DE LA FUENTE (Recombinant Vaccines for the control of cattle tick. Habana: Elpos Scientae, 280p.,1995) utilizadas para os grupos vacinais e para os grupos controle, como mostrado a seguir: DT(%) = 100[1-(NTV/NTC)] Onde: DT(%) - Porcentagem de redução do número de teleóginas NTV- n2 teleóginas para cada grupo vacinai NTC - n2 teleóginas grupo Controle. DR(%) = 100[1-(PMTV/PMTC)] Onde: DR(%) - Porcentagem de redução do peso médio das teleóginas PMTV - Peso médio das teleóginas para cada grupo vacinai; PMTC - Peso médio das teleóginas grupo Controle. DO(%) = 100(1-(PMOV/PMOC)] Onde: DO(%) - Porcentagem de redução do peso médio dos ovos PMOV - Peso médio dos ovos para cada grupo vacinai PMOC - Peso médio dos ovos grupo Controle. DF(%) = 100[1-PPLOV/PPLOC] Onde: DF(%) - Redução na fertilidade dos ovos PPLOV - Peso médio das larvas por grama de ovos em cada grupo vacinai PPLOC - Peso médio das larvas por grama de ovos no grupo 25 Controle EF(%) = 100[1-(CRTxCROxCRF) Onde: EF(%) - Eficácia do imunógeno CRT - Redução no número de fêmeas adultas (1 - DT) CRO - Redução na capacidade de ovipostura (1 - DO) CRF - Redução na fertilidade (1- DF)

Os valores obtidos para cada grupo vacinai foram analisados estatisticamente pelo teste de Tukey.

Estudo da cinética humoral

A coleta de sangue dos animais foi feita semanalmente a partir da semana 0 até a 14a semana, sendo que a primeira coleta foi realizada antes da primeira inoculação. O soro obtido de cada amostra foi aliquotado em tubos eppendorfa - 20 °C. A cinética foi mensurada usando o teste imunoenzimático ELISA.

As placas de Maxisorp® foram sensibilizadas com uma solução de Tampão Carbonato pH 9,6 (0,159g Na2CC>3; 0,293g NaHCOa; HzO milli Q q.s.p. 100mL), na qual se diluiu 0 peptídeo na quantidade de 2pg/poço, deixando-se adsorver a 4 °C overnight. Decorrido este período, as placas foram lavadas duas vezes com solução Tampão de Lavagem (9,0g de NaCI; 0,5ml Tween 20, H2O dd q.s.p. 1000ml) e adicionada a solução de bloqueio - Caseína 2% em PBS pH 7,6 (4,25g NaCI; 0,64g Na2HPO4; 0,068g NaFfePO^FW; H2O milli Q q.s.p 500mL) por uma hora à temperatura ambiente. Lavou-se as placas duas vezes e, posteriormente, adicionou-se lOOmL/poço dos soros dos animais do experimento diluídos 1:100 em solução Tampão de Incubação (87,5 mL de PBS pH 7,6; 12,5 mL de caseína 2% em PBS pH 7,6; 50ml de Tween 20) e deixou-se incubar por duas horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas seis vezes com solução Tampão de Lavagem e procedeu-se à incubação, por duas horas à temperatura ambiente, do anticorpo secundário - IgG de coelho anti-lgG bovina conjugada com peroxidase, diluída em solução Tampão de incubação, no volume de 100ml/poço. Lavaram-se as placas seis vezes com Tampão de Lavagem e adicionou-se a solução reveladora no volume de 100ml/poço composta de 20mL de Tampão Substrato (7,19g Na2HPO4, 5,19g ácido cítrico e H2O milli Q q.s.p. 1000mL), 4mg de O. P. D. (q-fenildiaminobenzeno) e 2,5mL de H2O2, por um período de 20 minutos em local escuro. A reação foi parada com 30ml/poço de ácido sulfúrico 1:20. A leitura foi realizada em leitor de ELISA a 492nm.

Para discriminar o ponto de corte entre positivo e negativo para a resposta sorológica mensurada no teste de ELISA, usou-se a adição de dois desvios padrão aos controles negativos.

Análise Estatística

Utilizou-se do teste de Análise de Variância (ANOVA) para comparação entre os diversos ensaios. Para isto, foi verificado se os dados atendiam as pressuposições de normalidade e variância das amostras, e dessa forma, foi feito o teste de Tukey.

Todas as análises estatísticas foram feitas utilizando o software estatístico Sigmastat® Versão 2006.

Resultados

O conjunto de dados dos parâmetros biológicos analisados após a contagem, e pesagem de teleóginas, pesagem de ovos e de larvas, assim como os parâmetros de redução do número e do peso das teleóginas, do peso dos ovos, da fertilidade e da eficácia são mostrados na Tabela 3. Pode se observar que o número de carrapatas adultas (teleóginas) desprendidas dos grupos controle foi maior que nos grupos imunizados com os peptídeos recombinantes, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, mostrando um número menor desprendido dos grupos imunizados, sendo estatisticamente significativas as reduções quando comparados com os controles e também estatisticamente diferentes a redução das teleóginas entre os animais imunizados com os dois peptídeos recombinantes. Pode-se observar também, que as teleóginas desprendidas, tanto dos grupos controle como dos imunizados com os peptídeos recombinantes obtidos a partir das sequências, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre si no que se refere ao peso médio.

Ao analisar o peso médio dos ovos encontrou-se de que não houve diferença estatisticamente significativa entre os diferentes grupos controle entre si, nem tampouco quando comparados estes com os resultados obtidos para o grupo de animais imunizados com o peptídeo recombinante SEQ ID NO:4; porém quando comparados os resultados dos diferentes controles com os obtidos do grupo de animais imunizados com o peptídeo recombinante SEQ ID NO:3 estes foram significativamente menores mostrando diferença estatística, igualmente houve resultados estatisticamente significativos entre os dos grupos de animais imunizados sendo menor o peso médio dos ovos no grupo imunizado com o peptídeo recombinante SEQ ID NO:3.

Tabela 3. Parâmetros biológicos de Rhipicephalus (B.) microplus provenientes de animais imunizados com os peptídeos recombinantes SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:3 e dos grupos controle de P. pastoris, controle de adjuvante, controle de água MilliQ. As letras diferentes (a, b, c) indicam diferença estatística significativa ao nível de significância de 0,01% no teste de Tukey.

Na pesagem da relação larvas/grama de ovos, observara-se de que não houve diferença estatisticamente significativa entre os diferentes grupos controle, 5 porem ao comparar estes resultados com os obtidos nos grupos de animais imunizados com os peptídeos recombinantes SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:3 houve uma diminuição na pesagem da relação, com diferença estatisticamente significativa; entre os grupos de animais imunizados a relação foi menor nos animais imunizados com o peptídeo recombinante SEQ ID NO:3 mostrando 10 diferença estatística significativa entre os grupos imunizados. Ao comparar os fatores percentuais de diminuição de peso dos ovos, da quantidade de teleóginas e da redução da fertilidade chega-se á conclusão de os peptídeos recombinantes obtidos a partir das sequências descritas obtiveram um nível significativo de redução e eficiência. A cinética de anticorpos (IgG) anti-peptídeos recombinantes, apresenta-se como uma resposta imune típica de IgG produzida por uma proteína integra usada como antígeno e estes resultados estão apresentados nas Figuras 1 e2.

Os peptídeos recombinantes SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4, quando inoculadas em bovinos não causaram nenhum tipo de reação adversa nem desconforto nos animais inoculados.

CONCLUSÃO

Uma vacina para o controle do carrapato Rhipicephalus (B.) microplus tendo como base os peptídeos recombinantes obtidos das sequências descritas tem vantagens porque a vacina desenvolvida é uma vacina de rebanho, no qual a vacinação do rebanho por três ciclos anuais diminui a população de carrapatos o que leva a minimização de perdas já mencionadas, e a evitar o uso de 19 ou 20 banhos carrapaticidas como atualmente vem sendo feito em muitas fazendas do País.

Esta invenção tem alto impacto social e ambiental porque atualmente, há a necessidade de atender as demandas dos consumidores por alimentos livres de produtos químicos, a proteção do meio ambiente e consequentemente dos animais silvestres. Sendo assim, em um mercado onde os produtos para combater ectoparasitas são preponderantemente químicos, é necessário investir na pesquisa e fabricação de produtos alternativos para o controle destes agentes.

As vacinas são seguras, possuem uma boa interface com o meio ambiente e são mais facilmente aceitas pelos consumidores, possivelmente pela familiaridade que eles possuem com as vacinas usadas na medicina humana. Com sua utilização há maior aumento da produção e produtividade animal do que o uso de outros medicamentos.

Ao contrário das vacinas, os produtos químicos utilizados hoje para combater os carrapatos são altamente tóxicos. Caso o gado seja tratado com os carrapaticidas e não seja respeitado o período de carência, a carne e o leite não deverão ser destinados ao consumo humano, pois estes estarão sujeitos aos riscos de intoxicações que, por períodos prolongados, podem levar a efeitos nocivos no ser humano.

A metodologia de produção dos peptídeos recombinantes usados como vacina é mais fácil ao nível industrial, permite a completa reprodutibilidade em 5 larga escala e é mais econômica pelo baixo custo de produção ao nível industrial.

Claims (4)

1. SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO CODIFICADORA DE PEPTÍDEO RECOMBINANTE caracterizada por ser a SEQ ID N 02.

2. PEPTÍDEO RECOMBINANTE caracterizado por ser a SEQ ID N 04.

3. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA DA VACINA CONTRA CARRAPATOS caracterizada por compreender o peptídeo recombinante definido na reivindicação 2 associado a um ou mais adjuvantes e/ou diluentes fisiologicamente adequados.

4. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA DA VACINA CONTRA CARRAPATOS, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por induzir resposta imune em animais, mais especificamente em bovinos, contra o carrapato Rhipicephalus (B.) microplus.

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