CN102071238B - 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 - Google Patents
麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102071238B CN102071238B CN2010105605873A CN201010560587A CN102071238B CN 102071238 B CN102071238 B CN 102071238B CN 2010105605873 A CN2010105605873 A CN 2010105605873A CN 201010560587 A CN201010560587 A CN 201010560587A CN 102071238 B CN102071238 B CN 102071238B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- releasing hormone
- gonadotropin releasing
- binding protein
- aggressiveness
- maltose binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 92
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 claims description 47
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 claims description 46
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 6
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000009987 spinning Methods 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 3
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000155 melt Substances 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 abstract description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 abstract description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 abstract description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000002130 immunocastration Effects 0.000 abstract 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 11
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 5
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 5
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 4
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000004336 spermatogonium Anatomy 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 206010043298 Testicular atrophy Diseases 0.000 description 2
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 2
- 201000010788 atrophy of testis Diseases 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 231100001044 testicular atrophy Toxicity 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O [4-[[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]amino]-2-methylphenyl]methylidene]-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]-ethyl-[(3-sulfophenyl)methyl]azanium Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S(O)(=O)=O)C)C=C1 YVNQAIFQFWTPLQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940035635 anti-gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009329 sexual behaviour Effects 0.000 description 1
- 230000000920 spermatogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，该工艺包括以下步骤：发酵培养基的筛选和发酵条件的优化。发酵培养基包括酵母浸出物、蛋白胨、NaCl等组成，发酵工艺的优化包括培养温度、诱导时机、诱导剂浓度、诱导后培养时间、发酵液酸碱度的调节方式、搅拌速率、通气量等。本发明的发酵工艺生产成本低廉，生产周期短，只需要9-11小时，同时，还提高了单位菌体的目的蛋白表达量，实现了目的蛋白的高效表达。本发明制得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体（MBP-GnRH6）可用于各种哺乳动物的免疫去势。
Description
技术领域
本发明属于基因工程药物制备领域，具体涉及一种生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(GnRH6)的发酵方法。
背景技术
促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，又称促黄体素释放激素(Luteinizing hormone releasing hormone，LHRH)、促性腺释放因子(Gonadotropin-releasing factor，GnRF)，是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)。
促性腺激素释放激素(GnRH)不但通过影响垂体促黄体生成激素(Luteinizinghormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)的分泌，调节性腺功能，而且还直接作用于性腺。但促性腺激素释放激素(GnRH)对性腺的直接作用是抑制性的。在鼠等动物发现，卵巢和睾丸上均存在促性腺激素释放激素(GnRH)受体，促性腺激素释放激素(GnRH)可直接与这些受体结合，对生殖功能有抑制作用，所以通过适当的方法调控促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌或干扰其功能，就能够达到控制动物生殖器官发育和生殖功能的目的。促性腺激素释放激素(GnRH)免疫雄性动物可以使幼龄雄性动物睾丸停止发育和成年雄性动物睾丸退化。用促性腺激素释放激素(GnRH)免疫动物后，机体产生大量的抗促性腺激素释放激素(GnRH)的特异性抗体，与内源性的促性腺激素释放激素(GnRH)结合使其失去生物活性，从而导致下丘脑-垂体-睾丸轴功能的破坏，抑制垂体促黄体生成激素和卵泡刺激素的释放，使被免疫的动物表现睾丸萎缩和重量减轻、血清睾酮水平下降。近年来，国内外学者在多种动物上用促性腺激素释放激素(GnRH)主动免疫的方法使动物体内产生抗体以中和内源的促性腺激素释放激素(GnRH)，取得了一定的效果。这种免疫去势方法简便，安全性高，可替代传统手术去势，控制动物性行为和繁殖能力，达到改善动物肉质，促进动物生长，提高饲料利用率。
目前合成促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗采用化学合成法，即将促性腺激素释放激素(GnRH)偶联到一些载体蛋白上。但是化学合成法促性腺激素释放激素(GnRH)与载体蛋白的连接效率低，造成生产疫苗的成本增加，价格昂贵。另外，通过化学法合成的GnRH疫苗，每一批次激素抗原的分子结构很难保证是完全相同的，这就导致商业化生产时，批次间差异较大。而通过基因工程法生产促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗可克服化学合成法的不足，利用可操纵的表达系统(如大肠杆菌表达系统)生产促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗，表达量高，提取工艺简便，这样才能最终将促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗推向市场。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体发酵优化工艺，筛选出最优的发酵培养基和发酵工艺条件，进而达到外源目的蛋白高效表达。
本发明麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺包括以下操作步骤：(1)平板菌种的准备将大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)划线接种于抗氨苄LB培养基平板，在温度37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；(2)种子液的制备将所述平板菌种直接接种于100mL的液体培养基，装液系数为0.2，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16小时，得种子液；所述液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；(3)10L发酵罐发酵培养取步骤2获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐内的2L发酵培养基上，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基硫代-β-D半乳糖(IPTG)，温度为32℃，继续培养6小时，得诱导表达的菌体；所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化将诱导表达的菌体在温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，在温度-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，在电压200V、工作4s，间隔3s条件下，以工作30次的方式破碎；在温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物；将粗提物进行多糖树脂(amylose resin)亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)。
所述抗氨苄LB培养基平板中含100μg/mL氨苄青霉素。
本发明所指工程菌即促性腺激素释放激素六聚体的大肠埃希氏菌-TB1，它可以表达麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体。麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体与佐剂混合可直接应用于动物去势，而且与目前市场上的其他类似制剂相比，成本较低，同时麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体安全、方便、作用效果温和，与手术去势方法相比，可减少感染、应激等优点。且基因工程大肠杆菌易于产业化生产，具有进一步研发的价值和良好的产业化前景。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：(1)通过在基因工程菌培养过程中控制温度，诱导时机，诱导剂浓度等，优化各项条件，大大提高了促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的表达量。采用本发明的方法，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的表达量可达菌体总蛋白的35％～50％，发酵所得菌液中麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的浓度平均可达1.97g/L。
(2)通过本发明获得麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体，发酵时间短，从接种到发酵结束仅需要9～11小时。
(3)通过本发明获得麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体大大降低了生产成本。利用本发明所得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体制备免疫去势疫苗，按照每头猪两针的剂量，完成免疫去势，仅需10元人民币，而目前国内市场尚无此类产品，国外辉瑞公司生产的免疫去势疫苗目前每支约5美元。
(4)通过本发明获得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体使用方便，可直接用于肌肉注射，操作简单易行。
附图说明
图1为重组蛋白的蛋白免疫印迹(Western blot)分析图。
图2为小鼠睾丸组织学变化图；图2中A、C，实验组；B、D，对照组；a，精原细胞；b，精母细胞；c，精子细胞；d，精子；e，空泡变性；f，生精小管。
图3为免疫组和对照组睾丸图。
图4对照组(a、c)和MBP-GnRH6免疫组(b、d)公猪睾丸组织学观察图；图4中：a，b：睾丸组织整体结构，ST指生精小管；短箭头：精原细胞；长箭头：初级精母细胞；椭圆形：精子细胞；正方形：精子。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
以下实施例所用原料为市场采购产品：氨苄青霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司葡萄糖和IPTG购自索莱宝科技有限公司蛋白胨和酵母提取物购自北京朋利驰科技有限公司以下实施例中，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)表达量测定：将实施例中步骤(3)所得的诱导表达的菌体首先进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用条带扫描软件(bandscan 5.0)测出麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)占菌体总蛋白的百分含量。
麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)浓度的测定：将实施例中步骤(4)所得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)，用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质浓度。
以下实施例中，用于发酵生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)的促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)由安徽农业大学动物遗传育种与繁殖胚胎工程实验室提供。大肠埃希氏菌Escherichia coli保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No：3601；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2010年01月20日。
实施例：麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺包括以下操作步骤：(1)平板菌种的制备划线接种大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)于含100μg/mL Amp氨苄青霉素的抗氨苄LB培养基平板上，在温度为37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；(2)种子液的制备挑步骤1中所得原始种子单菌落于500mL三角瓶的100mL液体培养基上，装液100mL(装液系数为0.2)，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16h，得种子液；液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；(3)10L发酵罐发酵培养发酵放大工艺发酵促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1表达麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)，具体过程如下：取步骤2获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐的2L发酵培养基上，装液2L(装液系数为0.2)，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基硫代-β-D半乳糖(IPTG)，同时将诱导温度设为32℃，继续培养6小时，发酵结束，得诱导表达的菌体；所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化取步骤3诱导表达的菌体于温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于柱缓冲液中，在-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化后，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，按照电压200V，工作4s，间隔3s，工作30次的方式破碎；超声破碎后于温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物。然后将粗提物进行多糖树脂(amylose resin)亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)；(5)促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1发酵生产的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)的反应原性和免疫去势效果检测：A、麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)反应原性鉴定将发酵产生的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)进行纯化处理，经蛋白免疫印迹(Western blot)检测显示，可与GnRH抗体发生特异性反应，其分子量大小为50kDa，见图1。图1中条带1表示麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)与GnRH抗体反应条带；条带2为磷酸盐缓冲液(PBS)作阴性对照，没有特异性条带产生；条带3为标准分子量(Marker)。由此可见，研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体与GnRH抗体具有良好的反应原性；B、麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)对小鼠的免疫去势效果监测20只20日龄的雄性昆明系小鼠，随机分为两组：试验组和对照组，每组10只。试验组小鼠颈部皮下4个位点注射纯化后的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)(纯度为97％)，125？？L/只，对照组小鼠注射麦芽糖结合蛋白。每隔1周免疫1次，共免疫3次。免疫结束后取睾丸组织，进行组织切片观察，如图2。实验组小鼠的睾丸组织发生明显空泡变性(图2，A)。空泡变性的小鼠睾丸生精小管变化明显，精原细胞、精母细胞及精子细胞层次不分明，且无精子产生(图2，B)。对照组小鼠的睾丸生精小管结构正常，生精小管中有正常的精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子，并且层次分明，有大量精子产生(图2，C、D)。可见，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)抑制小鼠睾丸的发育，最终发生萎缩，说明研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)具有很强的免疫原性；C、麦芽糖结合蛋白-GnRH6对公猪的免疫去势效果检测24头初生公猪随机分为对照组和试验组，实验组公猪分别在9周龄和17周龄免疫注射。称取麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)12mg溶于12mL生理盐水，再同12mL的Al(OH)3佐剂充分混匀后给每头试验组公猪颈部肌肉注射2mL；对照组注射相同剂量的麦芽糖结合蛋白与Al(OH)3佐剂的混合物。所有公猪相同饲养管理，24周龄屠宰。
结果表明，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫的公猪屠宰时睾丸重量与大小极显著地低于对照组(图3)。表明麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫可使公猪睾丸重量降低、睾丸萎缩，组织学切片显示，免疫组睾丸曲细精管内生精细胞发育不良，生精小管中无精子，MBP-GnRH6主动免疫可显著破坏睾丸间质细胞的形态，降低了生精细胞的数目(图4)。这表明研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫公猪具有很好的去势作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)平板菌种的准备
将促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(Escherichia coli)划线接种于抗氨苄LB培养基平板，在温度37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(Escherichia coli)的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No：3601；
(2)种子液的制备
将所述平板菌种直接接种于100mL的液体培养基，装液系数为0.2，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16小时，得种子液；
所述液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；
(3)10L发酵罐发酵培养
取步骤(2)获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐内的2L发酵培养基上，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷，温度为32℃，继续培养6小时，得诱导表达的菌体；
所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；
(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化
将诱导表达的菌体在温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，在温度-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，在电压200V、工作4s，间隔3s条件下，以工作30次的方式破碎；在温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物；将粗提物进行直链淀粉树脂亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体。
2.根据权利要求1所述的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，其特征在于：所述抗氨苄LB培养基平板中含100μg/mL氨苄青霉素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105605873A CN102071238B (zh) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010105605873A CN102071238B (zh) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102071238A CN102071238A (zh) | 2011-05-25 |
| CN102071238B true CN102071238B (zh) | 2012-10-31 |
Family
ID=44029997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010105605873A Expired - Fee Related CN102071238B (zh) | 2010-11-26 | 2010-11-26 | 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102071238B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115746146B (zh) * | 2022-08-31 | 2024-05-31 | 安徽农业大学 | 一种GnRH重组蛋白抗原、哺乳动物去势重组蛋白疫苗及制备方法 |
-
2010
- 2010-11-26 CN CN2010105605873A patent/CN102071238B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Fang F.G.等.Immunization of male mice with a new recombinant GnRH fusion protein reduces the testicular function.《Agricultural Sciences in China》.2009,第8卷(第3期),101-105. * |
| 丁炜东等.奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素前体蛋白的克隆与表达.《生物技术》.2005,第15卷(第6期),14-17. * |
| 杨亚萍.GnRH六聚体-麦芽糖结合蛋白_MBP-GnRH6的融合表达及鉴定.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2007, * |
| 王索路等.重组MBP-GnRH6 融合蛋白的表达与鉴定.《农业生物技术学报》.2010,第18卷(第2期),260-264. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102071238A (zh) | 2011-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106540240B (zh) | 抗菌肽融合细胞因子CAMPILs共表达生物制剂的制备和应用 | |
| CN104262488A (zh) | 一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用 | |
| CN109666609A (zh) | 一种赤红球菌发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用 | |
| CN103432578B (zh) | 一种仔猪红痢c型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法 | |
| CN103436499A (zh) | 一种猪圆环病毒样颗粒及其疫苗和制备方法 | |
| CN104498441A (zh) | 鸭甲肝病毒iii型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用 | |
| CN109078178B (zh) | 一种产气荚膜梭菌β毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN102276730A (zh) | 金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白制备方法及其应用 | |
| CN104693310A (zh) | 一种嵌合蛋白、病毒样颗粒及其应用 | |
| CN102796200B (zh) | 一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用 | |
| CN108558998B (zh) | 猪白细胞介素4/6与融合猪抗菌肽共表达重组酵母菌制剂的制备及应用 | |
| CN102071238B (zh) | 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 | |
| CN102604993B (zh) | 免疫佐剂与幽门螺杆菌抗原融合蛋白口服疫苗及其制备方法 | |
| CN107823639A (zh) | 牛病毒性腹泻病毒灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN102533629B (zh) | 禽脑脊髓炎病毒vp1蛋白亚单位疫苗的制备方法 | |
| CN109745554B (zh) | 一种无毒性的产气荚膜梭菌重组ε毒素和α毒素融合蛋白疫苗及其生产方法 | |
| CN103352047A (zh) | 旋毛虫肌幼虫es抗原基因疫苗及其制备方法 | |
| CN109705223A (zh) | 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN116375814A (zh) | 大口黑鲈虹彩病毒mcp-2重组蛋白及其应用 | |
| CN108904791A (zh) | 一种产气荚膜梭菌α毒素重组亚单位疫苗及其生产方法 | |
| CN103830747A (zh) | 一种产气荚膜梭菌ε毒素基因工程疫苗及其应用 | |
| CN102321180B (zh) | 多肽片段组合物及其在制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗中的应用 | |
| CN101838325B (zh) | 猪用抗原呈递蛋白及其编码基因和应用 | |
| CN103122336A (zh) | 一种鹅细小病毒h株及其在小鹅瘟防治中的应用 | |
| CN103396958B (zh) | 草分枝杆菌及其免疫增强剂的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121031 Termination date: 20131126 |