CN102071238B - 麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 - Google Patents
麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，该工艺包括以下步骤：发酵培养基的筛选和发酵条件的优化。发酵培养基包括酵母浸出物、蛋白胨、NaCl等组成，发酵工艺的优化包括培养温度、诱导时机、诱导剂浓度、诱导后培养时间、发酵液酸碱度的调节方式、搅拌速率、通气量等。本发明的发酵工艺生产成本低廉，生产周期短，只需要9-11小时，同时，还提高了单位菌体的目的蛋白表达量，实现了目的蛋白的高效表达。本发明制得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体（MBP-GnRH6）可用于各种哺乳动物的免疫去势。
Description
技术领域
本发明属于基因工程药物制备领域，具体涉及一种生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(GnRH6)的发酵方法。
背景技术
促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)，又称促黄体素释放激素(Luteinizing hormone releasing hormone，LHRH)、促性腺释放因子(Gonadotropin-releasing factor，GnRF)，是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是控制脑下垂体前叶细胞合成和分泌促黄体激素(LH)及促卵泡激素(FSH)。
促性腺激素释放激素(GnRH)不但通过影响垂体促黄体生成激素(Luteinizinghormone，LH)和卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)的分泌，调节性腺功能，而且还直接作用于性腺。但促性腺激素释放激素(GnRH)对性腺的直接作用是抑制性的。在鼠等动物发现，卵巢和睾丸上均存在促性腺激素释放激素(GnRH)受体，促性腺激素释放激素(GnRH)可直接与这些受体结合，对生殖功能有抑制作用，所以通过适当的方法调控促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌或干扰其功能，就能够达到控制动物生殖器官发育和生殖功能的目的。促性腺激素释放激素(GnRH)免疫雄性动物可以使幼龄雄性动物睾丸停止发育和成年雄性动物睾丸退化。用促性腺激素释放激素(GnRH)免疫动物后，机体产生大量的抗促性腺激素释放激素(GnRH)的特异性抗体，与内源性的促性腺激素释放激素(GnRH)结合使其失去生物活性，从而导致下丘脑-垂体-睾丸轴功能的破坏，抑制垂体促黄体生成激素和卵泡刺激素的释放，使被免疫的动物表现睾丸萎缩和重量减轻、血清睾酮水平下降。近年来，国内外学者在多种动物上用促性腺激素释放激素(GnRH)主动免疫的方法使动物体内产生抗体以中和内源的促性腺激素释放激素(GnRH)，取得了一定的效果。这种免疫去势方法简便，安全性高，可替代传统手术去势，控制动物性行为和繁殖能力，达到改善动物肉质，促进动物生长，提高饲料利用率。
目前合成促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗采用化学合成法，即将促性腺激素释放激素(GnRH)偶联到一些载体蛋白上。但是化学合成法促性腺激素释放激素(GnRH)与载体蛋白的连接效率低，造成生产疫苗的成本增加，价格昂贵。另外，通过化学法合成的GnRH疫苗，每一批次激素抗原的分子结构很难保证是完全相同的，这就导致商业化生产时，批次间差异较大。而通过基因工程法生产促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗可克服化学合成法的不足，利用可操纵的表达系统(如大肠杆菌表达系统)生产促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗，表达量高，提取工艺简便，这样才能最终将促性腺激素释放激素(GnRH)疫苗推向市场。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体发酵优化工艺，筛选出最优的发酵培养基和发酵工艺条件，进而达到外源目的蛋白高效表达。
本发明麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺包括以下操作步骤：(1)平板菌种的准备将大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)划线接种于抗氨苄LB培养基平板，在温度37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；(2)种子液的制备将所述平板菌种直接接种于100mL的液体培养基，装液系数为0.2，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16小时，得种子液；所述液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；(3)10L发酵罐发酵培养取步骤2获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐内的2L发酵培养基上，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基硫代-β-D半乳糖(IPTG)，温度为32℃，继续培养6小时，得诱导表达的菌体；所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化将诱导表达的菌体在温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，在温度-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，在电压200V、工作4s，间隔3s条件下，以工作30次的方式破碎；在温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物；将粗提物进行多糖树脂(amylose resin)亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)。
所述抗氨苄LB培养基平板中含100μg/mL氨苄青霉素。
本发明所指工程菌即促性腺激素释放激素六聚体的大肠埃希氏菌-TB1，它可以表达麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体。麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体与佐剂混合可直接应用于动物去势，而且与目前市场上的其他类似制剂相比，成本较低，同时麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体安全、方便、作用效果温和，与手术去势方法相比，可减少感染、应激等优点。且基因工程大肠杆菌易于产业化生产，具有进一步研发的价值和良好的产业化前景。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：(1)通过在基因工程菌培养过程中控制温度，诱导时机，诱导剂浓度等，优化各项条件，大大提高了促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的表达量。采用本发明的方法，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的表达量可达菌体总蛋白的35％～50％，发酵所得菌液中麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的浓度平均可达1.97g/L。
(2)通过本发明获得麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体，发酵时间短，从接种到发酵结束仅需要9～11小时。
(3)通过本发明获得麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体大大降低了生产成本。利用本发明所得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体制备免疫去势疫苗，按照每头猪两针的剂量，完成免疫去势，仅需10元人民币，而目前国内市场尚无此类产品，国外辉瑞公司生产的免疫去势疫苗目前每支约5美元。
(4)通过本发明获得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体使用方便，可直接用于肌肉注射，操作简单易行。
附图说明
图1为重组蛋白的蛋白免疫印迹(Western blot)分析图。
图2为小鼠睾丸组织学变化图；图2中A、C，实验组；B、D，对照组；a，精原细胞；b，精母细胞；c，精子细胞；d，精子；e，空泡变性；f，生精小管。
图3为免疫组和对照组睾丸图。
图4对照组(a、c)和MBP-GnRH6免疫组(b、d)公猪睾丸组织学观察图；图4中：a，b：睾丸组织整体结构，ST指生精小管；短箭头：精原细胞；长箭头：初级精母细胞；椭圆形：精子细胞；正方形：精子。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。
以下实施例所用原料为市场采购产品：氨苄青霉素购自上海生工生物工程技术服务有限公司葡萄糖和IPTG购自索莱宝科技有限公司蛋白胨和酵母提取物购自北京朋利驰科技有限公司以下实施例中，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)表达量测定：将实施例中步骤(3)所得的诱导表达的菌体首先进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再用条带扫描软件(bandscan 5.0)测出麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)占菌体总蛋白的百分含量。
麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)浓度的测定：将实施例中步骤(4)所得的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)，用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质浓度。
以下实施例中，用于发酵生产麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)的促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)由安徽农业大学动物遗传育种与繁殖胚胎工程实验室提供。大肠埃希氏菌Escherichia coli保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No：3601；保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期2010年01月20日。
实施例：麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺包括以下操作步骤：(1)平板菌种的制备划线接种大肠埃希氏菌-TB1(GnRH6-E.coli TB1)于含100μg/mL Amp氨苄青霉素的抗氨苄LB培养基平板上，在温度为37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；(2)种子液的制备挑步骤1中所得原始种子单菌落于500mL三角瓶的100mL液体培养基上，装液100mL(装液系数为0.2)，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16h，得种子液；液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；(3)10L发酵罐发酵培养发酵放大工艺发酵促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1表达麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)，具体过程如下：取步骤2获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐的2L发酵培养基上，装液2L(装液系数为0.2)，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基硫代-β-D半乳糖(IPTG)，同时将诱导温度设为32℃，继续培养6小时，发酵结束，得诱导表达的菌体；所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化取步骤3诱导表达的菌体于温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于柱缓冲液中，在-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化后，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，按照电压200V，工作4s，间隔3s，工作30次的方式破碎；超声破碎后于温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物。然后将粗提物进行多糖树脂(amylose resin)亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)；(5)促性腺激素释放激素六聚体大肠埃希氏菌-TB1发酵生产的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)的反应原性和免疫去势效果检测：A、麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)反应原性鉴定将发酵产生的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)进行纯化处理，经蛋白免疫印迹(Western blot)检测显示，可与GnRH抗体发生特异性反应，其分子量大小为50kDa，见图1。图1中条带1表示麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)与GnRH抗体反应条带；条带2为磷酸盐缓冲液(PBS)作阴性对照，没有特异性条带产生；条带3为标准分子量(Marker)。由此可见，研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体与GnRH抗体具有良好的反应原性；B、麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)对小鼠的免疫去势效果监测20只20日龄的雄性昆明系小鼠，随机分为两组：试验组和对照组，每组10只。试验组小鼠颈部皮下4个位点注射纯化后的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)(纯度为97％)，125？？L/只，对照组小鼠注射麦芽糖结合蛋白。每隔1周免疫1次，共免疫3次。免疫结束后取睾丸组织，进行组织切片观察，如图2。实验组小鼠的睾丸组织发生明显空泡变性(图2，A)。空泡变性的小鼠睾丸生精小管变化明显，精原细胞、精母细胞及精子细胞层次不分明，且无精子产生(图2，B)。对照组小鼠的睾丸生精小管结构正常，生精小管中有正常的精原细胞、精母细胞、精子细胞及精子，并且层次分明，有大量精子产生(图2，C、D)。可见，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)抑制小鼠睾丸的发育，最终发生萎缩，说明研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)具有很强的免疫原性；C、麦芽糖结合蛋白-GnRH6对公猪的免疫去势效果检测24头初生公猪随机分为对照组和试验组，实验组公猪分别在9周龄和17周龄免疫注射。称取麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)12mg溶于12mL生理盐水，再同12mL的Al(OH)3佐剂充分混匀后给每头试验组公猪颈部肌肉注射2mL；对照组注射相同剂量的麦芽糖结合蛋白与Al(OH)3佐剂的混合物。所有公猪相同饲养管理，24周龄屠宰。
结果表明，麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫的公猪屠宰时睾丸重量与大小极显著地低于对照组(图3)。表明麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫可使公猪睾丸重量降低、睾丸萎缩，组织学切片显示，免疫组睾丸曲细精管内生精细胞发育不良，生精小管中无精子，MBP-GnRH6主动免疫可显著破坏睾丸间质细胞的形态，降低了生精细胞的数目(图4)。这表明研制出的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体(MBP-GnRH6)主动免疫公猪具有很好的去势作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)平板菌种的准备
将促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(Escherichia coli)划线接种于抗氨苄LB培养基平板，在温度37℃条件下培养24小时，得平板菌种作为原始种子；促性腺激素释放激素六聚体重组的大肠埃希氏菌-TB1(Escherichia coli)的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No：3601；
(2)种子液的制备
将所述平板菌种直接接种于100mL的液体培养基，装液系数为0.2，在温度为37℃、摇瓶转速为200rpm条件下培养16小时，得种子液；
所述液体培养基包括下列重量配比的原料：葡萄糖2g/L，酵母浸粉10g/L，胰蛋白胨16g/L，氯化钠5g/L，氨苄青霉素100mg/L；
(3)10L发酵罐发酵培养
取步骤(2)获得的种子液，按照3％的接种量接种于10L发酵罐内的2L发酵培养基上，在温度为37℃，通气量为8L/min，转速为500rpm，用浓度1mol/L的磷酸盐缓冲液调节pH值为7.0，培养4h，加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷，温度为32℃，继续培养6小时，得诱导表达的菌体；
所述发酵培养基配方与液体培养基配方相同；
(4)麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的分离纯化
将诱导表达的菌体在温度4℃、转速4000r/min条件下，离心分离20min，弃去上清液，将诱导表达的菌体重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，在温度-70℃冷冻菌液或于-20℃冷冻菌液20～24小时，再将其放于冰水上融化，将其放入塑料管中，放置于冰水浴上，用超声波细胞破碎仪，在电压200V、工作4s，间隔3s条件下，以工作30次的方式破碎；在温度4℃、转速12000r/min条件下，离心分离20min，取上清液即为粗提物；将粗提物进行直链淀粉树脂亲和层析分离提纯，得到目的蛋白浓度可达1.97g/L的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体。
2.根据权利要求1所述的麦芽糖结合蛋白-促性腺激素释放激素六聚体的发酵工艺，其特征在于：所述抗氨苄LB培养基平板中含100μg/mL氨苄青霉素。
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