CN104012520A - 一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液及制作方法 - Google Patents

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CN104012520A CN201410218772.2A CN201410218772A CN104012520A CN 104012520 A CN104012520 A CN 104012520A CN 201410218772 A CN201410218772 A CN 201410218772A CN 104012520 A CN104012520 A CN 104012520A
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白元生
张拴林
杨子森
刘晓妮
师周戈
赵宇琼
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Abstract

本发明公开了一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液，包括下列质量份的原料组成：三羟甲基氨基甲烷20~26，柠檬酸三钠10~15，果糖7~15，蒸馏水700~800，新鲜卵黄230~260，亚硒酸钠0.125~0.375，维生素E2~32，甘油90-95，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1~2、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1~2。制备方法包括制备基础缓冲液、制备基础稀释液、制备精液稀释液，然后将制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。本发明较现有技术的牛冷冻精液稀释液的精子活率提高了24.56个百分点，4h精子活率提高了12.39个百分点，精子顶体完整率提高了38.72个百分点，GSH－PX的活性提高了260%，精子畸形率则下降了5.49个百分点。

Description

一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液及制作方法
技术领域
本发明属于动物冷冻精液生产技术，具体涉及到一种添加微量元素硒和维生素E的冷冻精稀释液的制作方法。
背景技术
牛的繁殖是养牛生产过程中的一个重要环节，牛群数量的增加、质量的提高都必须通过繁殖这一过程来实现。人工授精与胚胎移植技术是养牛业生产中两次重大技术革命，能够充分发挥优秀种公牛和母牛的繁殖潜力，显示出很好的应用前景。人工授精与胚胎移植技术应用的前提是牛精液的保存技术的应用。精液冷冻保存的成功是人工授精技术上的一项重大革新，它不但解决了精液长期保存的问题，使精液的应用不受时间、地域和种畜生命的限制，而且提高优良公畜的利用率，加快品种的育成和改良的步伐。牛作为畜牧业生产中自然繁殖率最低的主要畜种之一，应用人工授精与胚胎移植技术提高牛繁殖力的意义更加重大。           
种公牛精液在冷冻保存时，精清对精子的保护能力是有限的，因此，进行精液的冷冻保存就要配合使用稀释液，来最大程度的保护精子，因而稀释液在精液冷冻保存中突显其重要性，成为保证精液品质的主要因素。人工授精已是一门成熟的技术，但使用冷冻精液进行人工授精时，其受精效果比使用新鲜精液的效果较低，其原因在于新鲜精液在制作冷冻精液时，在其冷冻和解冻时精子的质量变化，是影响人工授精成功的重要因素。
现有的冷冻精液稀释液通常是加入稀释剂、营养剂、抗菌、抗冻、防休克和缓冲保护剂等，而对精液在冷冻和解冻过程中的能抗氧化损伤的物质，则局限在维生素E、维生素C和谷胱甘肽等物质上，由于抗氧化损伤能力不足，降低了解冻后的活率、生存率和顶体完整率等，降低了精液质量。
发明内容
本发明是针对现有冷冻精液稀释液的抗氧化能力不足的现状，提供一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液，它是在冷冻精液稀释液常用的组成成分的基础上，添加了一定浓度的微量元素硒和维生素E，提高了冷冻精液稀释液的抗氧化能力，提高了精子活力与顶体完整率，延长了精子生存时间，提高了冷冻精液质量的目的。本发明的另一目的是提供抗氧化的牛冷冻精液稀释液的制作方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明的抗氧化的牛冷冻精液稀释液，包括下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷20~26，柠檬酸三钠10~15，果糖7~15，蒸馏水700~800，新鲜卵黄230~260，亚硒酸钠0.125~0.375，维生素E2~32，甘油90-95，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1~2、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1~2。
本发明的抗氧化的牛冷冻精液稀释液制备方法，包括如下步骤：
（1）制备基础缓冲液 称取20~26份三羟甲基氨基甲烷、10~15份柠檬酸三钠、7~15份果糖混合均匀后，加入700~800份蒸馏水中搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液 称取230~260份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1~2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1~2份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  称取0.125~0.375份的亚硒酸钠、2~32份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再称取90-95份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
本发明的抗氧化的牛冷冻精液稀释液，优选下列质量份的原料组成：三羟甲基氨基甲烷22-24份，柠檬酸三钠12-13份，果糖10-12份，蒸馏水750-780份，新鲜卵黄240-250份，亚硒酸钠0.25-0.3份，维生素E20-25份，甘油92-94份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1.5-2份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1-1.5份。
本发明的抗氧化的牛冷冻精液稀释液制备方法，包括如下步骤：
（1）制备基础缓冲液 取22~24份三羟甲基氨基甲烷、12~13份柠檬酸三钠、10~12份果糖混合均匀后，加入750~780份蒸馏水中搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液 取240~250份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1.5~2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1~1.5份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0. 25~0.3份的亚硒酸钠、20~25份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取92-94份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
牛的精子是一个高度分化、具有活动性并含有遗传物质的细胞，精子质膜表面有脂蛋白性质的薄膜。头部主要由细胞核组成，其中主要含核蛋白与DNA、RNA等组成。核的前面被顶体覆盖。顶体是一个双层的薄膜囊，内含有精子中性蛋白酶、透明质酸酶等，这些酶都与受精有关。顶体相当不稳定，容易变性和从头部脱落，会使精子的受精能力降低或完全散失。在制取冷冻精液时必须要对精液进行冷冻，而在使用冷冻精液时则必须要解冻冷冻精液。精子在冷冻和解冻过程中产生大量活性氧（ROS），活性氧可以氧化不饱和脂肪酸。精子膜和精子中的线粒体膜上富含不饱和脂肪酸，对脂质过氧化非常敏感，过量的活性氧和膜磷脂过氧化可导致冻存精子活力降低。具体表现为精子尾部中段和主段胞膜破裂，轴丝外露，线粒体异常。线粒体为能源物质氧化代谢释放三磷酸腺苷（ATP）的场所，其结构出现异常势必导致功能异常，从而引起稀释液中的能源物质的代谢受阻，ATP产生不足，这样精子的运动受到影响，最终精子游向卵子冲破卵膜的能力降低，无法完成正常的受精过程。所以冷冻精液品质下降，用冻精配种，受胎率不高且很不稳定。
活性氧属于自由基，自由基是在体内代谢过程中产生的。精子内适宜数量的自由基对精子是无害的，它们参与着信号传递等过程。一旦自由基超出本身的清除能力，会造成机体氧化损伤。自由基对精子的损害主要使脂质过氧化而破坏细胞膜和内膜系统，精子质膜遭受自由基的攻击就会失去弹性，对蛋白质巯基、甲硫基或色氨酸残基反应，导致蛋白质分子聚合或交联，导致蛋白质功能或酶活性的丧失；破坏核酸结构，攻击嘌呤与嘧啶碱基，导致碱基的改变和丢失，使基因表达异常，出现突变，从而引起精子发生系统性紊乱，出现衰老。精子本生具有平衡自由基和清除多余自由基的能力，精子内自由基清除系统包括酶类组成的第一道防线：如超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX），第二道防线由低分子清除剂组成：如辅酶Q10、谷胱甘肽、维生素E、胡萝卜素、半胱氨酸，第三道防线是利用DNA和蛋白质的修复、蛋白质巯基的还原、粘膜ATP的恢复及细胞内钙离子的减少来拮抗自由基。
本发明在牛冷冻精液稀释液，除常规应用的组分外，添加了一定浓度的微量元素硒。
硒是谷胱甘肽过氧化物酶等若干抗氧化酶的必需成分，它通过消除精子质膜和线粒体膜上已经产生的脂质过氧化物，阻断活性氧和自由基的致病作用。
本发明在牛冷冻精液稀释液中还添加了维生素E。维生素Ｅ是体内重要的脂溶性阻断型抗氧化剂，精子质膜中脂类的过氧化反应是自由基的连锁反应，其后果是使自由基不断增多，过氧化反应不断加快，最终使脂肪酸链断裂而破坏精子质膜、内膜结构。维生素E能捕捉自由基使其苯并吡喃环上酚基失去一个氢原子而形成生育酚自由基，然后与另一自由基进一步反应形成非自由基产物生育鲲，而防止了脂类链反应的连续进行，保护了精子质膜与内膜。维生素E 与自由基反应后，自己本身被氧化成生育酚羟自由基，即氧化型维生素E。
硒与维生素E同是抗氧化剂，但其存在部位和作用方式不同，维生素E存在于细胞膜内，通过与游离脂肪根结合，制止脂肪酸代谢中产生过氧化物，防止其对脂质膜的损害。硒存在于细胞液中，当维生素E不能完全阻止过多的不饱和脂肪酸所形成的过氧化物时，硒能通过增强GSH-PX的活性，发挥破坏过氧化物的作用，两者不能代替。有资料证明硒和维生素E协同在提高机体抗体水平及防治自由基对机体侵害方面所发挥的作用大于两者分别作用之和。当硒和维生素E添加量不适宜时，尤其是硒的抗氧化需要量与中毒极限量之间差异不大，易造成硒过量中毒，因此，本发明的亚硒酸钠的用量是经过多年的研究得到的参数。
本发明抗氧化的牛冷冻精液稀释液与现有技术比较试验
1.    试验方法
1.1设4个处理  以牛冷冻精液稀释液的常规应用组分(即三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸三钠、果糖、蒸馏水、新鲜卵黄、甘油、注射用青霉素钾和注射用硫酸链霉素)为对照1，在对照组分基础上添加维生素E为对照2，添加亚硒酸钠为对照3，添加维生素E和亚硒酸钠为本发明组。上述组分的质量份分别是：三羟甲基氨基甲烷24，柠檬酸三钠12，果糖10，蒸馏水750，新鲜卵黄250，甘油90，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1，注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1，维生素E20，亚硒酸钠0.25。
1.2 每组随机抽取4头种公牛组成，采精后的原精液按照常规方法稀释、平衡、分装等制成冷冻精液。
1.3 4个处理的牛冷冻精液稀释液制备方法同发明内容已经描述的步骤，只是各个处理的原料组分不同。
1.4 精液品质的测定
1.4.1精子活率和存活时间的检查：解冻后精液立即检查活率，然后37℃恒温箱保存4h后检查活率（存活时间）。
1.4.2 精子顶体完整率检查：采用国标法测定。
1.4.3 精子畸形率的检查：采用国标法测定。
1.4.4 对精子质膜的完整性检查：低渗膨胀法（HOST）。
2. 统计分析
试验数据应用SAS9.0统计分析软件的方差分析和Duncan氏法进行比较。
3. 试验结果
试验结果见表1。
表 1   本发明组与对照组冷冻精液稀释液对精液品质的影响
试验分组 样本数 精子活率（%） 4h精子活率（%） 精子畸形率（%） 精子顶体完整率（%） GSH－PX的活性（U/L）
对照1组 36 22.80C 8.50C 13.10A 33.58 D 645.07c  
对照2组 36 31.57B 13.23B 10.76B 41.94C 864.92C  
对照3组 36 33.16B 15.12B 9.79B 62.96B  901.29 B  
本发明组 36 47.36A 20.89A  7.61C 72.30 A 2322.09 A 
注：同列上标标有相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，标有相间字母表示差异极显著 (P＜0.01)。
试验结果显示，在牛冷冻精液稀释液的常规应用组分中单独添加维生素E(对照2组)和亚硒酸钠(对照3组)后，精子活率、4h精子活率、精子顶体完整率、GSH－PX的活性比对照1均有极显著的提高，精子畸形率呈极显著的下降，说明单独添加维生素E效果显著；其中，单独添加亚硒酸钠(对照3组)比单独添加维生素E(对照2组)处理的精子顶体完整率有极显著的提高，GSH－PX的活性显著提高，说明亚硒酸钠对改善牛冷冻精液稀释液的质量比维生素E更好。然而，将本发明处理与单独添加维生素E(对照2组)和亚硒酸钠(对照3组)比较后发现，本发明处理较单独添加维生素E(对照2组)和亚硒酸钠(对照3组)的精子活率、4h精子活率、精子顶体完整率、GSH－PX的活性比对照1均有极显著的提高，精子畸形率呈极显著的下降，说明加维生素E和亚硒酸钠对牛冷冻精液稀释液质量的改善除自身的作用外，两者之间还有交互作用。
本发明的有益效果是：本发明在稀释液中添加了亚硒酸钠和维生素E，较现有技术极显著提高了冷冻精液解冻后活率、精子顶体完整率、GSH－PX的活性，因此，有效消除了活性氧对精子的损害，有效保护了精子质膜的完整性，用低渗膨胀实验的结果表明，该稀释液能有效保护精子质膜的完整性；与此同时，精子畸形率则较现有技术极显著下降。经比较试验，本发明较现有技术的牛冷冻精液稀释液的精子活率提高了24.56个百分点，4h精子活率提高了12.39个百分点，精子顶体完整率提高了38.72个百分点，GSH－PX的活性提高了260%，精子畸形率则下降了5.49个百分点。
具体实施方式
实施例1
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷20份，柠檬酸三钠10份，果糖7份，蒸馏水700份，新鲜卵黄230份，亚硒酸钠0.125份，维生素E2份，甘油90份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取20份三羟甲基氨基甲烷、10份柠檬酸三钠、7份果糖混合均匀后，加入蒸馏水700份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取230份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.125份的亚硒酸钠、2份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取90份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
实施例2
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷26份，柠檬酸三钠15份，果糖15份，蒸馏水800份，新鲜卵黄260份，亚硒酸钠0.375份，维生素E32份，甘油95份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）2份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）2份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取26份三羟甲基氨基甲烷、15份柠檬酸三钠、15份果糖混合均匀后，加入蒸馏水800份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取260份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和2份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.375份的亚硒酸钠、32份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取95份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
实施例3
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷24份，柠檬酸三钠12份，果糖10份，蒸馏水750份，新鲜卵黄240份，亚硒酸钠0.25份，维生素E15份，甘油92份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1.5份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1.5份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取24份三羟甲基氨基甲烷、12份柠檬酸三钠、10份果糖混合均匀后，加入蒸馏水750份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取240份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1.5份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1.5份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.25份的亚硒酸钠、15份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取92份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
实施例4
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷20份，柠檬酸三钠15份，果糖7份，蒸馏水800份，新鲜卵黄230份，亚硒酸钠0.375份，维生素E2份，甘油95份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）2份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取20份三羟甲基氨基甲烷、15份柠檬酸三钠、7份果糖混合均匀后，加入蒸馏水800份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取230份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和2份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.375份的亚硒酸钠、2份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取95份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
实施例5
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷26份，柠檬酸三钠10份，果糖15份，蒸馏水700份，新鲜卵黄260份，亚硒酸钠0.125份，维生素E32份，甘油90份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）2份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取26份三羟甲基氨基甲烷、10份柠檬酸三钠、15份果糖混合均匀后，加入蒸馏水700份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取260份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.125份的亚硒酸钠、32份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取90份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
实施例6
抗氧化的牛冷冻精液稀释液，由下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷22-24份，柠檬酸三钠12-13份，果糖10-12份，蒸馏水750-780份，新鲜卵黄240-250份，亚硒酸钠0.25-0.3份，维生素E20-25份，甘油92-94份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1.5-2份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1-1.5份。
制备抗氧化的牛冷冻精液稀释液步骤如下：
（1）制备基础缓冲液 取22-24份三羟甲基氨基甲烷、12-13份柠檬酸三钠、10-12份果糖混合均匀后，加入蒸馏水750-780份搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液  取240-250份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1.5-2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1-1.5份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.25-0.3份的亚硒酸钠、20-25份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取92-94份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。

Claims (2)

1.一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液，其特征在于，抗氧化的牛冷冻精液稀释液包括下列质量份的原料组成： 三羟甲基氨基甲烷20~26，柠檬酸三钠10~15，果糖7~15，蒸馏水700~800，新鲜卵黄230~260，亚硒酸钠0.125~0.375，维生素E2~32，甘油90-95，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1~2、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1~2；
抗氧化的牛冷冻精液稀释液制备方法，包括如下步骤：
（1）制备基础缓冲液 取20~26份三羟甲基氨基甲烷、10~15份柠檬酸三钠、7~15份果糖混合均匀后，加入700~800份蒸馏水中搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液 取230~260份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1~2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1~2份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0.125~0.375份的亚硒酸钠、2~32份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取90-95份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
2.一种抗氧化的牛冷冻精液稀释液，其特征在于，抗氧化的牛冷冻精液稀释液包括下列质量份的原料组成：三羟甲基氨基甲烷22-24份，柠檬酸三钠12-13份，果糖10-12份，蒸馏水750-780份，新鲜卵黄240-250份，亚硒酸钠0.25-0.3份，维生素E20-25份，甘油92-94份，注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）1.5-2份、注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g）1-1.5份；
抗氧化的牛冷冻精液稀释液制备方法，包括如下步骤：
（1）制备基础缓冲液 取22~24份三羟甲基氨基甲烷、12~13份柠檬酸三钠、10~12份果糖混合均匀后，加入750~780份蒸馏水中搅拌均匀，备用：
（2）制备基础稀释液 取240~250份新鲜卵黄与 (1)制备的基础缓冲液均匀混合，再加入1.5~2份的注射用青霉素钾（规格为160万单位/g）和1~1.5份注射用硫酸链霉素（规格为100万单位/g），搅拌均匀，备用；
（3）制备精液稀释液  取0. 25~0.3份的亚硒酸钠、20~25份的维生素E加入(2)制备好的基础稀释液中，搅拌均匀后再取92-94份甘油加入基础稀释液，混合均匀，备用；
（4）将(3)制备好的精液稀释液移至4℃条件下平衡5-20min，制得抗氧化的牛冷冻精液稀释液。
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