CN1927226A - 一种奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液 - Google Patents
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Abstract
本发明属于奶牛繁殖技术领域，具体涉及奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。本发明的要点是将所述的精液稀释液分别制备成A、B、C、D液，然后按照适当的比例混合，在所述的C液(稀释液1)和D液(稀释液2)中分别加入了5％～20％猪精清，既明显提高了奶牛性控精液的精子顶体完整率和精子的活率，又有助于降低精液的密度，从而节约了精液制备成本。经检测，本发明的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液的精子活率分别达到50.88－62.88％，平均数为57.41％，比对照组平均提高了15.13个百分点；精子顶体完整率分别达到50.80－53.20％，平均数为51.90％，比对照组平均提高了7.0个百分点。
Description
技术领域
本发明属于奶牛繁殖技术领域，具体涉及奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液的制备。
技术背景
自1989年Johnson等首次报道用流式细胞检索分离仪成功地分离了兔子活的X精子和Y精子，用分离的精子受精后产下了活的后代，使流式细胞检索分离仪分离精子技术的研究取得了突破性的进展(Johnson L A，Flook J P，Hawk H W.Sex prpmeselection in rpmabbits：live birpmth frpmom X and Y sperpmmseparpmated by DNA and cell sorpmting.Biol RPMep rpmod，1989，41：199-203)。此后，利用该技术分离有活性的X精子和Y精子已经成功地应用于人工授精、体外受精(IVF)及胞质内单精子显微注射(ICSI)等研究，并在家畜猪、牛、羊以及人相继获得成功，产下了后代。此法在国内已用于畜牧业生产中，并产生了很好的效益，应用前景良好。但是，此种分离精液的方法也存在一些缺陷：性别分离精子比非分离精子授精后怀孕率低；性别分离精子在雌性生殖道中有效受精能力的时间短；解冻后的活力和顶体完整率低，奶牛等动物需要在接近排卵时间、在子宫深部(靠近受精地点)授精效果才好。Maxwell等对公猪的研究发现：精子性别分离后有“获能样”变化(与公羊精子解冻后类似)，会缩短精子有受精能力的时间(MaxwellWM，Johnson LA.Chlorpmtetrpmacycline analysis of boarpm sperpmmatozoa afterpm incubation，flowcytometrpmic sorpmting，cooling，orpm crpmyoprpmeserpmvation.Mol RPMeprpmod Dev.1997，46(3)：408-418)。精液的性别分离对膜的稳定性有影响，因此，影响精子存活时间和受精率；据曾有权等报道，向染色液中加入精浆有助于预防膜的不利变化，当加到收集液中时，有助于恢复分离后的公猪精子的去能状态，延长精子维持受精力的时间(曾有权等，精子分离及其在畜牧业中的应用.畜牧与兽医.2006，38(1).-58-61)。精浆的这种有益作用可能是因为其蛋白质成分(如肝素结合蛋白等)的关系。
经检索，迄今为止尚未见到与本发明类似的专利。
为此，申请人根据猪精清的生理生化特点，进行了一系列奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液配方的筛选试验，旨在筛选出一种提高奶牛性控精子冷冻保存效果的精液稀释液。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有技术的缺陷，制备一种能够有效地提高奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，以期提高奶牛性控精液人工授精的受胎率，降低奶牛性控精液生产成本，促进奶牛性控精液的推广应用。
本发明通过以下技术方案实现：
一种奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将20～26g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，10～15g/L柠檬酸，9～13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500-1000IU/mL青霉素和500-1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将80％～95％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将66％～81％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将20～26g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，10～15g/L柠檬酸，9～13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至11，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500-1000IU/mL青霉素和500-1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将80％～95％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将66％～81％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为800-1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；
(8)用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
本发明的有益效果是：
(1)本发明的生产工艺中改进了稀释液1和稀释液2的制备方法，在稀释液1和稀释液2中均增加了猪精清成分，明显区别于现有工艺，对减少原始精液的用量和保证精液的质量上起到关键的改良作用。
(2)本发明的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液中精子密度为800-1000万/ml情况下其精子的活率分别达到50.88-62.88％，平均数为57.41％，比对照组的42.28％平均提高了15.13个百分点；精子顶体完整率分别达到50.80-53.20％，平均数为51.90％，比对照组的44.90％平均提高了7.0个百分点，发明效果明显优于对照组。
(3)本发明在配方中加入了猪精清，既明显提高了奶牛性控精液的精子顶体完整率和精子的活率，提高了精液的品质，又有助于降低精液的密度，从而降低了奶牛性控精子的精液生产成本，有利于奶牛性别控精液的推广应用。
附图说明
图1：是本发明的技术流程图
具体实施方式
实施例1
(1)制备A液(基础缓冲液)：将20g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，15g/L柠檬酸，9g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将95％的B液和5％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将81％的B液和5％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为800万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将20g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，15g/L柠檬酸，9g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将95％的B液和5％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将81％的B液和5％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为800万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；
(8)用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
实施例2
(1)制备A液(基础缓冲液)：将26g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，10g/L柠檬酸，13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将90％的B液和10％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将76％的B液和10％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将26g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，10g/L柠檬酸，13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将90％的B液和10％精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将76％的B液和10％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；
(8)用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
实施例3
(1)制备A液(基础缓冲液)：将23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将85％的B液和15％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先71％的B液和15％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将85％的B液和15％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将71％的B液和15％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；
(8)将步骤(7)的精液稀释液用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
实施例4
(1)制备A液(基础缓冲液)：将23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将80％的B液和20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将66％的B液和20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(基础缓冲液)：将23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(基础稀释液)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将80％的B液和20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先将66％的B液和20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液；
(8)将步骤(7)的精液稀释液用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
实施例5(应用实施例)
奶牛性控精液商购自中国XY种畜(天津)有限公司提供分离好的奶牛性别控制精液(仅仅分离了X和Y精子的半成品精液，未进一步加工成商用性控精液)。
一、实验分组与对照组奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液的制备：
(一)实验分为本发明组与对照组
本发明组采用本发明实施例1-4制备的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，对照组按照常规使用的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液配方和步骤制备。
(二)对照组奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液及其制备：
配方如下：
按重量/体积计：
A液(缓冲液)：23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)+13g/L柠檬酸+11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释
至1L；
B液(稀释液1)：20％的新鲜卵黄+80％的A液均匀混合+1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均
混合；
C液(稀释液2)：86％的B液+14％的甘油(未加猪精清)。
其制备步骤如下：
(1)制备A液(缓冲液)：将23g/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液(稀释液1)：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液2)：先将86％的B液与14％的甘油均匀混合，得到所述的C液；
(4)将步骤(2)的B液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(5)将C液加入到步骤(4)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将C液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(6)将步骤(5)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的B液和C液，使奶牛性控精子密度为1000万/毫升左右，得到奶牛性控精液冷冻保存液；
(7)用分装机装管，在-196℃下冷冻，并贮藏在液氮中。
2、奶牛性控精液品质的测定：
本试验测定了解冻后奶牛性控精子活率(采用伊红-苯胺黑活体染色法测定，杨利国主编，动物繁殖学，北京，中国农业出版社，2003，120)、精子顶体完整率(采用姬姆萨染色法测定，参见中华人民共和国国家标准GB4143-84)两个主要指标，每样品制作2个抹片，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右2个区)，取2片的平均值，2片的变异系数不得大于20％，若超过应重新制片。
3、统计分析
采用x2检验分析试验组与空白对照组精液品质的差异显著性。
4、实验结果如表1所示：
表1 本发明的奶牛性控精子的冷冻保存精液稀释液与对照组对奶牛性控精液品质影响
| 实验分组 | pH | 精子密度(万/ml) | 精子活率(％) | 精子顶体完整率(％) |
| 实施例1实施例2实施例3实施例4 | 6.957.017.017.05 | 8009009001000 | 53.7662.1462.8850.88 | 50.8052.6453.2050.99 |
| 对照 | 6.92 | 1000 | 42.28 | 44.90 |
以添加本发明的奶牛性控精子的冷冻保存精液稀释液的奶牛精液为实验组，添加常规奶牛性控精子冷冻保存稀释液(其制备见本实施例)的奶牛精液为对照组，分别制成细管精液，按照常规方法检测精液品质。结果显示，按本发明制备的奶牛性控精子冷冻保存稀释液的精子的活率分别达到50.88-62.88％，平均数为57.41％，比对照组的42.28％，平均提高了15.13个百分点；精子顶体完整率分别达到50.80-53.20％，平均数为51.90％，比对照组的44.90％平均提高了7.0个百分点，其效果明显优于对照组。
Claims (5)
1、一种奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，其特征在于，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液：将20～26g/L三羟甲基氨基甲烷，10～15g/L柠檬酸，9～13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500-1000IU/mL青霉素和500-1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液：将80％～95％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液：先将66％～81％的B液和5％～20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为800-1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
2、根据权利要求1所述的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，其特征在于，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液：将20g/L三羟甲基氨基甲烷，15g/L柠檬酸，9g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液：将95％的B液和5％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液：先将81％的B液和5％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为800万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
3、根据权利要求1所述的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，其特征在于，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液：将26g/L三羟甲基氨基甲烷，10g/L柠檬酸，13g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液：将90％的B液和10％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液：先将76％的B液和10％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
4、根据权利要求1所述的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，其特征在于，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液：将23g/L三羟甲基氨基甲烷，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液：将85％的B液和15％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液：先71％的B液和15％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为900万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
5、根据权利要求1所述的奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液，其特征在于，按重量/体积计的配比为：
(1)制备A液：将23g/L三羟甲基氨基甲烷，13g/L柠檬酸，11g/L葡萄糖混合，加蒸馏水稀释至1L，得到所述的A液；
(2)制备B液：先将20％的新鲜卵黄和80％的A液均匀混合，再加入1000IU/mL青霉素和1000IU/mL链霉素，均匀混合，得到所述的B液；
(3)制备C液(稀释液1)：将80％的B液和20％猪精清均匀混合，得到所述的C液；
(4)制备D液(稀释液2)：先66％的B液和20％猪精清均匀混合，再与14％的甘油均匀混合，得到所述的D液；
(5)将步骤(3)的C液稀释奶牛性控精液至离心前总体积的一半，4℃平衡1.5h，得到混合液1；
(6)将D液加入到步骤(5)的混合液1中至离心前总体积的3/4，4℃平衡15min，得到混合液2，再将D液加入混合液2中至离心前总体积的4/4，得到混合液3；
(7)将步骤(6)的混合液3在3000rpm下离心浓缩15min，去上清，根据浓缩精液的密度，添加等量体积的C液和D液，使奶牛性控精子密度为1000万/毫升左右，得到奶牛性控精子冷冻保存精液稀释液。
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