CN103558200A

CN103558200A - 对虾精子成活率和质量的评价方法

Info

Publication number: CN103558200A
Application number: CN201310550438.2A
Authority: CN
Inventors: 杨春玲; 陈秀荔; 赵永贞; 陈晓汉; 李咏梅; 彭敏
Original assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明公开一种对虾精子成活率和质量的评价方法。适用于利用化学方法处理后的对虾成活率和精子损伤程度的评价，利用伊红和苯胺黑的混合生物染料，在光学显微镜下清晰区分出死活精子，统计精子成活率；利用单细胞凝胶固定GelRed染色的单个精子，通过电泳将精子DNA分散，可在荧光显微镜下观察到损伤精子DNA的迁移轨迹，再通过CASP分析软件统计彗星率、损伤系数，进而评价对虾精子的损伤程度和质量。本发明采用比较合适的混合生物染色液，细胞经染色后区别清晰，背景色对观察干扰减小，染色结果易于快速读取，结果准确而特异，并且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子损伤情况，有效准确获得更多对虾精子成活率和质量的评价信息。

Description

对虾精子成活率和质量的评价方法

技术领域

本发明属于生物细胞活力分析技术领域，涉及一种基于生物染色和核酸染色对虾精子成活率和质量的评价方法。

背景技术

对虾属于节肢动物门、有鳃亚门、甲壳纲、软甲亚纲、十足目、游泳亚目、对虾科、对虾属。凡纳滨对虾是甲壳纲对虾属的主要种类之一。凡纳滨对虾的精子不具有鞭毛，不能运动，由于其所具有的的特征，使对其质量和活力的评价成为一个难题，为此许多研究者正积极完善和发展可靠的甲壳动物精子质量和成活率的评价方法。这些方法包括：精子数目及形态、生物染色、低渗外吐、精卵相互作用、生化分析、精子顶体反应、核酸染色等。

目前，精子生物染色最常用的是台盼蓝染料排斥实验。正常的精子能排斥染料，不被台盼蓝染色；质量差、活力弱或细胞膜完整性被破坏后，台盼蓝会弥散到细胞中。除台盼蓝以外，还有其它的染料，如曙红和苯胺黑等。近年来，染色法已被用于评价甲壳动物精子活力，柯夫亚等（1996）采用台盼蓝和曙红B染料对冷冻保存的中国对虾精子进行评价。Jeyalectunmie（1989）采用曙红和苯胺黑染色对青蟹精荚中精子活力进行了评价，精荚中的死精子细胞呈现粉红色，而活力精子细胞在苯胺黑的红色背景下不着色。Wang等（1995）比较了精子形状、台盼蓝染色、亚丁醇染色及卵水诱导顶体反应这四种技术，未能得到确定的结论，却发现精子形态和亚丁醇染色之间具有很好的相关性。有时将台盼蓝和吉姆萨联合使用，可同时达到区分精子死活、鉴别精子顶体反应的目的。

总的来说，染色相斥实验是一种粗略的估计精子成活率的方法，无法区分10%～20%的存活率差异，此外排斥实验后的精子存活力将受到影响。生物染色和形态评价对精子活力的生理和生化功能提供的信息有限，生物染色可能过高估计了活精子的比例，这可能与精荚、精子膜的通透能力及不同色素的通透能力之间存在着差异有关。

发明内容

本发明的目的：为克服现有对虾精子质量和成活率评价方法中存在误差大、评价效果差、评价信息有限等缺点，提供一种基于生物染色和核酸染色对对虾精子成活率和质量的评价方法。该方法采用比较合适的混合生物染色液，背景色对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果快速准确、特异，而且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子的损伤比率，可区分10%~20%的存活率差异，获得更多信息。

本发明的技术方案如下：一种对虾精子成活率和质量的评价方法，该方法步骤包括挑选精荚成熟度好的雄虾精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液。具体操作为：采用1g/L胰蛋白酶消化获得游离的精子，5mL离心管中加入3mL胰蛋白酶溶液和3个精荚，37℃水浴消化5min后，加入1mL15% (V/V)的胎牛血清终止消化反应，500r/min离心10min，收集上清平均分配于3个1.5mL的离心管中，2000r/min离心5min，吸弃上清，每管中加入1mL灭菌天然海水轻轻吹打均匀，获得游离的对虾精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的对虾精子。

该方法还包括以下步骤：

步骤1）生物染色及精子成活率计算：

使用灭菌天然海水分别配制4~6g/L伊红生物染色液和90~100g/L的苯胺黑的生物染色液，并通过定量滤纸过滤后置于棕色瓶中备用，使用前将伊红生物染色液和苯胺黑的生物染色液等体积混合得到混合染色液，按照混合染色液：精子悬液体积比例为1~2ul：8~9ul分别取混合染色液和化学处理后精子悬液置于载玻片上混匀，然后在载玻片上盖上盖玻片，室温静置1~5min后，置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率。

步骤2）单细胞凝胶电泳：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取化学处理后精子悬液50~100ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液2~3次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至4~6×10⁶个/mL，取50~100μl稀释精液与350μL 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4℃放置5~10min，加入0.5~1.5mL细胞裂解液在4℃裂解1~2h，吸弃细胞裂解液，加入0.5~1.5mL细胞消化液，52~55℃度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶。

b、铺片：pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后在70℃水浴加热3~5min，使含有精子的低熔点琼脂糖融化成液态得到含有精子的液态凝胶液，取100μL含有精子的液态凝胶液加在载玻片上制备双层凝胶。

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中，4℃条件下放置20~30min后，在电压15~17V、电流100~130mA条件下电泳40~60min后停止电泳。

d、中和、染色：用pH=7.0的0.4 mol/L Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片10~15min，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后于双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品。

e、观察记录：将步骤d得到的样品加盖盖玻片置于Nikon 80i型荧光显微镜下，汞灯激发波长为510~560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照50~100个细胞。

步骤3）精子质量评价：

步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的各种参数：彗星拖尾长度L tail（以像素大小表示）、彗星尾部DNA的相对含量Tail DNA、尾距TM、Olive尾距OTM。尾距TM：L tail×Tail DNA，Olive尾距OTM：Tail DNA×迁移DNA中心密度，彗星拖尾长度L tail、彗星尾部DNA的相对含量Tail DNA、尾距TM、Olive尾距OTM这些参数用CASP软件分析时可直接得到。

根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数，计算公式：彗星率=（彗星细胞数目/拍照细胞总数目）×100%；损伤系数=[（0级损伤的细胞个数×0）+（Ⅰ级损伤的细胞个数×1）+（Ⅱ级损伤的细胞个数×2）+(Ⅲ级损伤的细胞个数×3)+( Ⅳ级损伤的细胞个数×4)]。

作为本发明的进一步限定，所述的彗星细胞为彗星拖尾长度＞3像素的细胞，，根据彗星尾部DNA的相对含量大小，并结合彗星图像中彗星拖尾、细胞形态情况，将化学法处理后的凡纳滨对虾精子的核 DNA损伤程度分5级：0级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量＜5%，无损伤，精子核完整、呈圆形；Ⅰ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量5%～20%，轻度损伤，精子核缩小，可见少许彗尾；Ⅱ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量20%～40%，中度损伤，精子核进一步缩小，彗尾明显延长；Ⅲ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量40%～95%，重度损伤，精子核明显缩小，彗尾较长、荧光信号强而密；Ⅳ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量＞95%，完全损伤，精子核模糊或基本消失，彗尾长、荧光信号强而密。

根据光学显微镜下观察统计的精子成活率与单细胞凝胶电泳检测的精子DNA损伤程度的比率进行比较，最终确定精子的质量。

作为本发明的进一步限定，所述的细胞裂解液含有2.5mol/LNaCl、100mmol/LNa₂EDTA、10mmol/L Tris、10g/L肌氨酸钠，pH10，临用前加1%Triton X-100和10%DMSO。

作为本发明的进一步限定，所述的细胞消化液含有2.5mol/L NaCl、5mmol/Ltris、0.05%肌氨酸钠，pH7.4，临用前加入蛋白酶K，终浓度0.5mg/mL。

作为本发明的进一步限定，所述的制备双层凝胶为：制备双层凝胶为：吸取100μL1%正常熔点的液态琼脂糖凝胶加在普通的载玻片上，盖上22㎜×22㎜盖玻片，4℃下放置10min，待第一层胶凝固后轻轻去除盖玻片，吸取100μL含有精子的液态凝胶液滴在第一层凝胶上，加盖玻片于4℃下冷凝10min得到双层凝胶。

作为本发明的进一步限定，所述的碱性电泳液含有300mmol/L乙酸钠、100mmol/LTris，pH10。

作为本发明的进一步限定，所述的GelRed稀释液为用双蒸水将GelRed10000×储液稀释3300倍到0.1mol/L NaCl中。

本发明对虾精子质量活力评价方法取得了以下良好效果：由于采用比较合适的混合生物染色液（伊红eosin和90~100g/L的苯胺黑nigrosin），细胞经染色后区别清晰，背景色对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果快速准确、特异，而且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证损伤精子的损伤情况，可区分10%~20%的存活率差异，有效准确获得更多对虾精子质量的评价信息，这是传统的对虾精子质量和成活率检测方法所不能实现的。

具体实施方式

以下结合实施例描述本发明一种对虾精子成活率和质量的评价方法，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。以下实施例中用到的试剂如无特别说明，可通过商业手段获得，实施例中用到的溶液组成成分及相关常规实验操作如下：

细胞裂解液：2.5mol/L NaCl、100mmol/LNa₂EDTA、10mmol/L Tris、10g/L肌氨酸钠，pH10，临用前加1%Triton X-100和10%DMSO。

细胞消化液：2.5mol/LNaCl、5mmol/LTris、0.05%肌氨酸钠，pH7.4，临用前加入蛋白酶K，终浓度0.5mg/mL。

制备双层凝胶：制备双层凝胶为：吸取100μL1%正常熔点的液态琼脂糖凝胶加在普通的载玻片上，盖上22㎜×22㎜盖玻片，4℃下放置10min，待第一层胶凝固后轻轻去除盖玻片，吸取100μL含有精子的液态凝胶液滴在第一层凝胶上，加盖玻片于4℃下冷凝10min得到双层凝胶。

碱性电泳液：300mmol/L乙酸钠、100mmol/LTris，pH10。

GelRed稀释液：用双蒸水将GelRed10000×储液稀释约3300倍到0.1mol/L NaCl中。

实施例1

步骤1、首先利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液，即采用1g/L胰蛋白酶消化获得游离的精子，具体操作步骤为：5mL离心管中加入3mL胰蛋白酶溶液和3个精荚，37℃水浴消化5min后，加入1mL15% (V/V)的胎牛血清终止消化反应，500r/min离心10min，收集上清平均分配于3个1.5mL的离心管中，2000r/min离心5min，吸弃上清，每管中加入1mL灭菌天然海水轻轻吹打均匀，获得游离的对虾精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的对虾精子。

步骤2、然后进行生物染色及观察统计：使用灭菌天然海水配制染色液，染色液含有5g/L的伊红eosin和100g/L的苯胺黑nigrosin，使用前将染色液充分混匀，并通过定量滤纸过滤后置于深色瓶中备用，按照染色液：精子悬液体积比例为2ul：8ul分别取两种溶液置于载玻片上混匀，然后在载玻片上盖上盖玻片，室温静置5min后，置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率信息。

步骤3、其次进行单细胞凝胶电泳，具体操作包括步骤：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取精子悬液100ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液3次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至4~6×10⁶个/mL，取100μl稀释精液与350μL 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4℃放置5~10min，加入1.5mL细胞裂解液在4℃裂解2h，吸弃细胞裂解液，加入1.5mL细胞消化液，55℃度下水浴2h得到含有精子的凝胶。

b、铺片：pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后在70℃水浴加热3min，使含有精子的低熔点琼脂糖融化成液态，取100μL加在已有一层正常熔点琼脂糖凝胶的载玻片上制备双层凝胶。

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中，4℃条件下放置30min后，在电压15V、电流130mA条件下电泳60min后停止电泳。

d、中和、染色：用pH=7.0的0.4 mol/L Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片15min，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后于双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品。

e、观察记录：将步骤d得到的载玻片加盖盖玻片置于Nikon 80i型荧光显微镜下，汞灯激发波长为510~560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照50个细胞。

步骤4、最后质量活力评价：步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的各种参数：彗星拖尾长度L tail、彗星尾部DNA的相对含量Tail DNA、尾距TM、Olive尾距OTM。根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数，计算公式：彗星率=（彗星细胞数目/总细胞数目）×100%；损伤系数=[（0级损伤的细胞个数×0）+（Ⅰ级损伤的细胞个数×1）+（Ⅱ级损伤的细胞个数×2）+(Ⅲ级损伤的细胞个数×3)+( Ⅳ级损伤的细胞个数×4)]。

本实施例样品经过生物染色后置于光学显微镜下观察经化学处理的对虾精子，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，其中158个活精子、42个为死精子，在显微镜下细胞经染色后区别很清晰，背景色干扰减小，死精子着色很深，很容易的在显微镜下将死精子和活精子区分开来，在3分钟之内就可以统计完200个精子，最终精子成活率为79%。

核酸染色液染色后经荧光显微镜拍照记录了50个细胞观察，彗星细胞8个，其中Ⅰ级损伤的细胞6个，Ⅱ级损伤的细胞个数2个，Ⅳ级损伤的细胞1个，经计算本实施例样品彗星率为16%，损伤系数为14，可区分10%~20%的精子的损伤程度，综合2种方法可以有效准确获得更多对虾精子质量和成活率的评价信息。

实施例2

步骤1、首先利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子，然后用化学方法得到损伤程度不一的精子悬液，操作步骤同实施例1。

步骤2、然后进行生物染色及观察统计：本实施例染色液含有6g/L的伊红eosin和95g/L的苯胺黑nigrosin，将染色液充分混匀，染色液：精子悬液体积比例为1ul：9ul分别取两种溶液置于载玻片上混匀，室温静置4min，其余步骤操作用实施例1。

步骤3、其次进行单细胞凝胶电泳，具体操作包括步骤：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取精子悬液50ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液2次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至最初体积50ul，取50μl稀释精液与350μL 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4℃静止10min,加入0.5mL细胞裂解液在4℃裂解1h，吸弃细胞裂解液，加入0.5mL细胞消化液，52℃度下水浴2h得到含有精子的凝胶。

b、铺片：pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子裂解溶液，然后在70℃水浴加热5min，使含有精子的低熔点琼脂糖融化成液态，取100μL加在已有一层正常熔点琼脂糖凝胶的载玻片上制备双层凝胶。

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中，4℃条件下放置20min后，在电压17V、电流100mA条件下电泳40min后停止电泳。

d、中和、染色：用pH=7.0的0.4 mol/L Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片10min，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后于双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品。

e、观察记录：将步骤d得到的载玻片加盖盖玻片置于Nikon 80i型荧光显微镜下，汞灯激发波长为510~560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照100个细胞。

步骤4、最后质量活力评价：评价方法与实施例1相同。

本实施例样品经过生物染色后置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，其中172个活精子、28个为死精子，在显微镜下细胞经染色后区别清晰，背景色干扰减小，精子成活率为86%；荧光显微镜拍照记录了100个细胞观察，彗星细胞25个，其中Ⅰ级损伤的细胞20个，Ⅱ级损伤的细胞个数3个，Ⅲ级损伤的细胞2个，经计算本实施例样品彗星率为25%，损伤系数为32，可区分10%~20%的精子的损伤程度，有效准确获得更多对虾精子质量活力的评价信息。

实施例3

步骤1、首先利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子，再利用化学方法处理精子获得损伤程度不一的对虾精子悬液，操作步骤同实施例1。

步骤2、然后进行生物染色及观察统计：本实施例染色液含有4g/L的伊红eosin和90g/L的苯胺黑nigrosin，使用前将染色液充分混匀，精子悬液体积比例为1.5ul：8.5ul分别取两种溶液置于载玻片上混匀，室温静置1min，其余步骤操作用实施例1。

步骤3、其次进行单细胞凝胶电泳，具体操作包括步骤：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取精子悬液80ul，用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS离心洗涤精子悬液3次，再用pH=7.4的磷酸缓冲液PBS稀释游离精子至最初体积80ul，取80μl稀释精液与350μL 1%的液态低熔点琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，4℃静止10min，加入1.0mL细胞裂解液在4℃裂解2h，吸弃细胞裂解液，加入1.0mL细胞消化液，54℃度下水浴3h得到含有精子的凝胶。

b、铺片：pH=7.4的磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子裂解溶液，然后在70℃水浴加热4min，使含有精子的低熔点琼脂糖融化成液态，取100μL加在已有一层正常熔点琼脂糖凝胶的载玻片上制备双层凝胶。

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中，4℃条件下放置25min后，在电压16V、电流120mA条件下电泳50min后停止电泳。

d、中和、染色：用pH=7.0的0.4 mol/L Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片13min，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后于双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品。

e、观察记录：将步骤d得到的载玻片加盖盖玻片置于Nikon 80i型荧光显微镜下，汞灯激发波长为510~560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照80个细胞。

步骤4、最后质量活力评价：评价方法与实施例1相同。

本实施例样品经过生物染色后置于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，期中166个活精子、34个为死精子，在显微镜下细胞经染色后区别清晰，背景色干扰减小，精子成活率为83%；荧光显微镜拍照记录了80个细胞观察，彗星细胞12个，其中Ⅰ级损伤的细胞7个，Ⅱ级损伤的细胞个数3个，Ⅲ级损伤的细胞2个，经计算本实施例样品彗星率为15%，损伤系数为19，可区分10%~20%的精子的损伤程度，有效准确获得更多对虾精子质量活力的评价信息。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求内。本发明是经过多位对虾精子质量和成活率评价控制技术人员长期科学研究经验积累，并通过创造性劳动创作而出，该方法采用比较合适的混合生物染色液（4~6g/L的伊红eosin和90~100g/L的苯胺黑nigrosin），细胞经染色后区别清晰，背景色对计数人员的干扰减小，使得染色结果易于读取，结果准确、特异，而且单细胞凝胶电泳法能够进一步的验证精子的损伤系数、成活比率，可区分10%~20%的存活力差异，有效准确获得更多对虾精子质量和成活率的评价信息，这是传统质量活力检测方法所不能实现的。

Claims

1.一种对虾精子成活率和质量的评价方法，该方法步骤包括挑选成熟度好的雄虾的精荚放入装有灭菌天然海水的离心管中，利用胰蛋白酶消化法分离出游离的对虾精子得到精子悬液，再利用化学方法处理精子悬液，获得损伤程度不一的化学处理后精子悬液，其特征在于，该方法还包括以下步骤：

步骤1）生物染色及精子成活率计算：

使用灭菌天然海水分别配制4~6g/L伊红生物染色液和90~100g/L的苯胺黑的生物染色液，然后等体积混合得到混合染色液，将混合染色液和化学处理后精子悬液按照体积比例为1~2ul：8~9ul混匀并置于载玻片上，于光学显微镜下观察，根据活精子不着色、死精子呈紫红色，记录200个精子着色情况，计算得出精子成活率；

步骤2）单细胞凝胶电泳：

a、稀释、裂解和消化蛋白：取化学处理后精子悬液50~100ul，用磷酸缓冲液PBS离心洗涤后稀释游离精子至4~6×10⁶个/mL，取50~100μl稀释精液与350μL 1%的液态琼脂糖凝胶置于离心管中混匀，加入细胞裂解液裂解1~2h，离心弃细胞裂解液，加入0.5~1.5mL细胞消化液，52~55℃度下水浴2~4h得到含有精子的凝胶；

b、铺片：磷酸缓冲液PBS洗涤步骤a的含有精子的凝胶，然后水浴加热得到含有精子的液态凝胶液，取100μL液态凝胶液加在的载玻片上制备双层凝胶；

c、DNA双链解旋和电泳：将具有双层凝胶的载玻片水平放入碱性电泳液中进行DNA双链解旋，在电压15~17V、电流100~130mA条件下电泳40~60min后停止电泳；

d、中和、染色：用Tris-HCl中和步骤c中电泳后的载玻片，再将载玻片浸入GelRed稀释液中染色，然后双蒸水浸泡脱色，得到可用于荧光显微镜观察的精子DNA样品；

e、观察记录：将步骤d得到的样品加盖盖玻片置于荧光显微镜下，汞灯激发波长为510-560nm绿光，10×40倍下随机观察、拍照50~100个细胞；

步骤3）精子质量评价：

步骤e拍照所得彗星图像用CASP分析软件分析测量DNA迁移的参数：彗星拖尾长度、彗星尾部DNA的相对含量；彗星拖尾长度＞3像素的细胞为彗星细胞，彗星尾部DNA的相对含量＜5%的为0级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量5%～20%的为Ⅰ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量20%～40%为Ⅱ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量40%～95%的为Ⅲ级损伤的细胞，彗星尾部DNA的相对含量＞95%的为Ⅳ级损伤的细胞；

根据所测参数数据计算彗星率与损伤系数进行精子质量评价，计算公式：彗星率=（彗星细胞数目/拍照细胞总数目）×100%；损伤系数=[（0级损伤的细胞个数×0）+（Ⅰ级损伤的细胞个数×1）+（Ⅱ级损伤的细胞个数×2）+(Ⅲ级损伤的细胞个数×3)+( Ⅳ级损伤的细胞个数×4)]。

2.根据权利要求1所述的对虾精子质量评价方法，其特征在于：所述的细胞裂解液含有2.5mol/LNaCl、100mmol/LNa₂EDTA、10mmol/L Tris、10g/L肌氨酸钠，pH10，临用前加1%Triton X-100和10% DMSO。

3.根据权利要求1或2任一项所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的细胞消化液含有2.5mol/L NaCl、5mmol/Ltris、0.05%肌氨酸钠，pH7.4，临用前加入蛋白酶K，终浓度0.5mg/mL。

4.根据权利要求3所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的制备双层凝胶为：吸取100μL1%正常熔点的液态琼脂糖凝胶加在普通的载玻片上，盖上22㎜×22㎜盖玻片，4℃下放置10min，待第一层胶凝固后轻轻去除盖玻片，吸取100μL含有精子的液态凝胶液滴在第一层凝胶上，加盖玻片于4℃下冷凝10min得到双层凝胶。

5.根据权利要求4所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的碱性电泳液含有300mmol/L乙酸钠、100mmol/LTris，pH10。

6.根据权利要求4或5任一项所述的对虾精子成活率和质量的评价方法，其特征在于：所述的GelRed稀释液为用双蒸水将GelRed10000×储液稀释3300倍到0.1mol/L NaCl中。