WO2006077899A1 - Ｏｃｔ４を発現する細胞を含む細胞群、その取得方法及びその培養方法 - Google Patents

Ｏｃｔ４を発現する細胞を含む細胞群、その取得方法及びその培養方法 Download PDF

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WO2006077899A1
WO2006077899A1 PCT/JP2006/300682 JP2006300682W WO2006077899A1 WO 2006077899 A1 WO2006077899 A1 WO 2006077899A1 JP 2006300682 W JP2006300682 W JP 2006300682W WO 2006077899 A1 WO2006077899 A1 WO 2006077899A1
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cell
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amniotic
oct
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PCT/JP2006/300682
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Inventor
Shigeru Yasumoto
Toshiki Minami
Hiroyasu Nakamura
Tomoko Echigoya
Masakatsu Takeuchi
Original Assignee
Shigeru Yasumoto
Toshiki Minami
Hiroyasu Nakamura
Tomoko Echigoya
Masakatsu Takeuchi
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Application filed by Shigeru Yasumoto, Toshiki Minami, Hiroyasu Nakamura, Tomoko Echigoya, Masakatsu Takeuchi filed Critical Shigeru Yasumoto
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly

Definitions

  • the present invention relates to a cell fresh containing cells expressing Oct 4, a method for obtaining the same, and a method for culturing the same. More specifically, the present invention relates to an Oct4-expressing cell collected from an amniotic epithelial layer, a method for obtaining each cell, and a method for culturing the same. Background art
  • All living organisms are composed of the smallest unit called cells, and in the case of humans, the number of cells is said to be more than 200 types, about 60 trillion. Many of these praises can be traced back to the fertilized egg ⁇ cell, a part of the J »early stage after fertilization (blast cyct) It differentiates from the (ICM inner cell mass) into all functional cells that make up the adult. Such cells that retain the ability to produce many types of cells are called stem cells. Many cells also differentiate from stem cells as many branches separate from the trunk and grow into large trees, and change into various cells that form the organs of the body. Stem cells include embryonic stem cells and adult stem cells. Embryonic stem cells are called ES cells because they are called (Embryonic Stem Cell) in English.
  • ES cells are generally taken and obtained from embryos, which are the early stages in which a fertilized egg continues to grow.
  • the fertilized egg repeats division in the process of growing into a fetus, and the 5th and 60th order is called a blastocyst.
  • the anal wall has a spherical shape with a diameter of about 0.1 mm, and contains the outer vegetative ectoderm and the inner cell mass that is the group of cells that will form the body in the future. It consists of a blastocoel.
  • the lumbar cell mass eventually grows into endoderm, mesoderm, and ectoderm to form all the cells of the body, and the nutritive ecto-vegetables form their placenta and isolate the embryo from the outside world. Form.
  • the cells After loosening the inner cell mass, the cells are taken out, and when these cells proliferate, they do not differentiate. When cultured in an environment, ES cells are obtained.
  • Human ES cells are the original cells that can be transformed into any cell that forms the human body, and have the property that they can divide and increase themselves as many times as they are before they are transformed. Since such human ES cells can be obtained, it is expected that the necessary necessary cells, tissues, and organs will be intentionally created by successfully inducing human ES cells. Therefore, human ES cells have great potential for various treatments, especially in the field of regenerative medicine, and are important cells for basic research on various cells, tissues, and organs. In Japan, from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology Ministry and the establishment about the "human ES cells indicated guidelines J force s on the use, permission of the studies that have interest ffl human ES cells have been issued under certain conditions.
  • Patent Document 1 discloses that stem cells that can be stably supplied and that do not have a problem of compatibility at the time of transplantation are separated from a human amnion mesenchymal cell layer and are subjected to Oc in RT-PCR. Expression of t-4 gene, Sox-2 gene, FGF-4 gene, Rex1 gene, and side population cells positive for vimentin and CK19 in immunocytostaining Yes.
  • Patent Document 1 JP 2004-254682 A Patent Document 1 JP 2004-254682 A
  • Patent Document 1 describes the possibility of obtaining Oct-4 expressing cells from the human amnion mesenchymal cell layer
  • Patent Document 1 cells have a very low density (specifically, The ratio of Oct 4 positive cells to the total collected cells (Oct 4+ (%)) measured by immunostaining method is less than 0.01%)), and the cells obtained by collagenase Due to digestion of the cell stroma, it is inevitable that the epithelial cells and the mesenchymal cells are mixed and collected. Therefore, it was impossible to use the collected cells with the same lepel as embryo-derived ES cells.
  • Patent Document 1 That is, the invention described in Patent Document 1 has the following problems.
  • Oc t 4 expressing cells cannot be maintained in an undifferentiated state for a long time (3 months or more) under culture conditions.
  • an object of the present invention is to establish a technique for obtaining an Oct 4 expressing cell at a level equivalent to that of an ES cell conventionally obtained from an embryo from other than the embryo.
  • the present inventors have formed a high-density population of 0ct4-expressing cells at a specific site in the amnion epithelial layer around the placenta at the time of delivery at an average of 4'0 weeks. And found that these 0ct4-expressing cells can be obtained by selective enrichment. At the same time, early miscarriage (before the 20th week) In the amniotic membrane, it was found that 04 cells were present at high density throughout the amniotic membrane, and these 0ct4-expressing cells were arrested and arrested. I found out that I can do it. The present invention was created based on such knowledge.
  • the present invention provides the following (1) to (12).
  • the proportion of Oc t-positive cells collected from the amniotic epithelial layer, including Oc t 4 expressing cells, as measured by the immunostaining method (Oc t 4+ (%) ) Is in the range of 0.001 to: L 00%, a cell group containing Oct4-expressing cells.
  • the term amniotic membrane used in the present invention is characterized by the use of amniotic cells collected from amniotic membranes at the time of full-term birth (average 40 weeks). This means that it may be collected from the amniotic membrane (before 20 weeks).
  • the amniotic membrane at the time of full-term delivery, and the cell group is collected from the amniotic epithelial layer of the category up to 10% of the placenta side.
  • a cell group comprising the Oc t 4 expressing cell according to any one of the above.
  • amniotic membrane according to any one of claims 1 to 3, wherein the amniotic membrane is an amniotic membrane before 20 weeks and is collected from an anterior region of the amniotic membrane that does not limit the castle.
  • (1) to (3) In any one of (1) to (3), a cell group containing 1G-loaded Oct 4 expressing cells.
  • the cell group is collected from a region continuously increasing toward the Kr disc direction and continuing from the placenta to the base of the umbilical cord.
  • a cell group comprising the O c t4 expressing cell according to any one of the above.
  • amniotic membrane is an amniotic membrane at full-term delivery and includes Oct-4 expressing cells collected from the amniotic membrane / umbilical cord junction.
  • the cell group is obtained by specifically and selectively separating an amniotic epithelial cell and an amniotic connective tissue with a light-white degrading enzyme disperse.
  • a cell group comprising the Oct-4 expressing cell according to any one of (7). .
  • a method for culturing 'Oc t 4 expressing cells comprising a step of culturing a cell group containing the Oc t 4 expressing cells according to (1) to (8) on a medium.
  • the above-mentioned medium is a mixture of Dulbecco's modified medium and Ham MCDB 3 medium, 'Hydrocortisone, epithelial augmentation factor,
  • FIG. 1A is a drawing showing the state of immunohistochemical detection of a 0ct4-expressing cell subset in human amniotic membrane.
  • FIG. 2 is a drawing showing the results of Example 4.
  • 3A to D are drawings showing 0ct4 positive cells present in the 18-week amniotic epithelium detected by immunostaining.
  • Figure 4 shows various cell type-specific marker molecules mRNA detected by PCR in primary cultures of amnion-derived HAE cells at 40 weeks (4 specimens) and 16 weeks (1 specimen), each with 0ct4 (undifferentiated stem cells), It shows traits that differentiate into many types of cells such as nestine (neural stem cells), albumin (hepatocytes), and CK19 (epithelial cells).
  • FIG. 5 shows detection of hepatocyte amylase tnRNA in 40-week amnion-derived HAE cultured cells by RT-PCR.
  • Figure 6 shows the expression of CgA and glut2 related to glucose metabolism detected in 40-week HAE cultured cells.
  • FIG. 7 shows that 0ct4-positive cells are identified immunohistochemically not only in the membrane epithelium but also in the amniotic mesenchymal tissue and amniotic fluid.
  • A 0ct4-positive cells in amniotic fluid (arrow a). Absence marks b and c are 0ct4-positive and negative cells, respectively, present in the monolayer of amniotic epithelium.
  • B 0ct4-positive cells present in amniotic fluid cells (arrow b). Arrow a is 0ct4-positive cells of the amnion epithelial layer.
  • C 0ct4-positive mesenchymal cells present in the amnion mesopoise layer. Figures a and b on the right correspond to territories a and b on the left, respectively, and are 0ct4-positive interstitial cells with nuclei stained brown in the stromal tissue.
  • Fig. 8 shows undifferentiated cell-specific genes expressed by amniotic epithelial cells at 18 and 40 weeks of pregnancy (immediately after delivery) detected by RT-PCR. All seven types of expression common to human ES are confirmed.
  • Fig. 9 shows a tissue section (eosin-stained) of the area including the umbilical cord (Unbilical cord) and amniotic membrane (Placenta) immediately after childbirth (40 weeks of gestation).
  • the immunohistochemical staining of Oc-positive cells shown in Fig. 1 is in accordance with Amniotic epithelium arrow a. 0ct 14 cells are detected particularly frequently in the amniotic epithelium in the region from arrow b to a, and the umbilical cord (epithelium) is distinguished from the placenta.
  • FIG. 10 shows the results regarding the recovery rate of 0ct4-expressing cysts from amniotic membrane.
  • FIGS. 11A to D are diagrams S showing the method for evaluating an Oct-4 expressing cell of the present invention.
  • mi 2 A is a photograph showing the cell mass in a culture dish obtained by acquiring progenitor cells capable of inducing neuronal differentiation obtained by high-density culture of amniotic epithelial cells and coating the amniotic epithelial cells with collagen IV.
  • B is a micrograph of microscopic photographs when cells are seeded by the drop-plate method and maintained for a long-term culture while maintaining a cell sheet shape that retains cell-cell interactions.
  • Fig.1 3 A continues to grow for 4 weeks while maintaining the cell density. Dispase enzyme solution is added to the culture dish so that it becomes 40% and the cell progresses into a sheet.
  • -Fig. 1 3 B and 1 3 C show the cell group of Fig. 1 3 A with retinoic acid. This is a microscope when treated at a concentration of 0 ⁇ M for 6 hours or more.
  • Figures 1 to 3D include elongated protrusions.Neuron-specific enolase is detected by immunostaining in all protrusion-forming cells. It is a photomicrograph at the time of UJ Best mode for carrying out the invention
  • Oct4-expressing cell means a cell that is positive when Oct4, which is a marker protein related to maintaining an undifferentiated state of a cell having multipotency, is measured by immunostaining.
  • Oct 4 is the most commonly used in the art to identify ES cells or ES-like cells, so Oct 4 expressing cells means including these ES cells or ES-like cells is doing.
  • Oct 4 expressing cells are other strengths such as those described in Patent Document 1 It does not mean to exclude ES cells identified using.
  • ⁇ ⁇ ct 4+ (%) '' means the ratio of the Oct 4 positive cells measured by immunostaining to the total number of collected cells. Specifically, as described later, Oc t 4 is used as a marker for immunostaining. Cells stained by the method were photographed under a microscope, and the ratio of the area of Oct 4 ⁇ 3 ⁇ 4 cells in the photographed image (area of Oct 4 expressing cells) / (total cell area) X 100 Is.
  • the intensity of O ct 4 expression represents the range of K values (black density values) when cells measured by the above immunostaining method are imported as RGB image data and converted to CMYK values. None ( n) “Lower than 1 000”, weak (m) “1000 or higher, less than 500 000” Medium (m) “5000 or higher but lower than 9000”, strong (s) “Four or higher” is indicated in four grades. '
  • the cell group of the present invention is a cell group containing Oct 4 expressing cells collected from the amniotic epithelial layer, wherein Oct 4+ (%) is in the range of 0.001 to 100%. Yes (hereinafter referred to as the present invention cell).
  • the cell of the present invention was obtained from the amniotic epithelial layer at a specific location (around the placenta) of a human at full term or other animal (eg, mouse, rat, etc.).
  • the density (Oc t 4+ (%)) tends to become sparse (% decreases) as the animal moves away from the placenta side, and the range up to 10% on the placenta side From the amnion epithelial layer of the cerebral cell line, it is possible to obtain a cell group containing Oct 4 expressing cells at a very high density (high / 0 ), and the human fetal amniotic membrane of 20 weeks -It was found by repeated experiments that 0ct4 embryonic cells can be obtained in 90% or less.
  • the amniotic epithelial layer is usually continuous with the umbilical epithelium located within 5 cm from the placenta, and the amniotic membrane is located 10 cm or less from the umbilical epithelium.
  • the cell group of the present invention is obtained from the epithelial layer, preferably from the amniotic epithelial layer located 10 cm or less from the placenta iU umbilical cord base.
  • a cell group containing Qc t 4 expressing cells at a very high O c t 4+ (%) is obtained from the amnion / umbilical cord junction.
  • the inventors of the present invention have shown that the ratio of the Oct 4 3 ⁇ 4 cells to the placenta continuously increases and the amniotic membrane joins (associates) with the placenta / umbilical cord through repeated experiments. We found that there are multiple (more than 2) sites where 0ct4 + cells are layered and dense, and this is universal and consistent across individuals.
  • cells obtained by a method known in the technical field are first immunostained, and the stained cells are computer-read image data (RGB data) via a microscope. Convert to The obtained image data (RGB data) is converted to a CMKY image by software such as Adobe Photoshop (registered trademark).
  • Oc t 4 immunostained sites that is, Oc t 4 expressing cells are usually displayed in the displayed color. When this image is subtracted from blue, only the Oc t 4 expressing cells in the area image are black elements ( K) is included.
  • the cell group of the present invention includes Oct 4 expressing cells in the range of 0.001 to 100% (especially about 10 to 50% at the amnion / umbilical cord junction) as a result of measurement by such a technique. I found out.
  • the present invention is a method for determining the content of Oc t 4 expressing cells from a group of cells immunostained using Oc t 4, wherein the immunostained cells are computer-readable image data (RGB data) through a microscope.
  • the image data (RGB data) obtained is converted to CMYK image by software,
  • the method is extended to a method for determining the ratio of Oct 4 expressing cells, which is characterized by subtracting the blue color from both CMYK-converted images and determining the ratio of K values from the entire image (screening method for acquired cells). .
  • CMYK is represented by the color components of cyan (C), magenta (M), yellow (Y) and black (K).
  • the K value of this sample is 58 to 60% for the former and 22 to 24 3 ⁇ 4 for the latter. Select and click on the “Black” channel from the “Window” menu to display the screen in black and white. Select all images from the "Selection” menu and copy them to the clipboard using the "Edit” or "Copy” function.
  • the present inventors further investigated in detail the O ct 4 expressing cells expressed as O ct 4 expressing cells based on the strength of the black element K in this way. We found that the behavior of the expressed cells is different. That is, in the present invention, the black element measurement value is none (n) “less than 1 0 0 0”, weak (m) “more than 1 0 0 0, less than 5 0 0 0”, medium ( ⁇ ) “5 0 0 0 or more, but less than 9 0.0 0 ”, strong.
  • the cell group of the present invention significantly includes Oct4-expressing cells having moderate strength and exhibiting excellent peristalsis as such ES cells or ES-like cells. And analytically understood.
  • Patent Document 1 has not come to an argument regarding the importance of Oct4-expressing cells as cells of ES 3.
  • the present invention provides a method for determining the proportion of Oct 4 expressing cells, wherein a plurality of black element measurement value ranges in which a K value (black element measurement) is set in advance are set, and each set black element is set.
  • the ratio of the measured value range (as a percentage of the whole or as the ratio of each black element measured value range in the K value) is extended to a method for screening the behavior of the acquired cells.
  • the present efforts are made up of the cell group of the present invention (or other Oct 4 expressing cells), a container for storing and storing the cell group, and an Oct 4 expressing cell system constructed in a powerful manner. Therefore, the distribution of k value (K value range) evaluated by the screening method (evaluation method) (for example, none ( ⁇ > less than ⁇ ⁇ 0 0 0), weak (m) “1 0 0 0 or more, less than 5 0 0 0 ”, Medium (m) ⁇ 5 0 0 0 or more, but less than 9 0 0 0”, Strong (s) “Distribution including the field shown in the four-step evaluation of“ 9 0 0 0 or more ”
  • the cell line to which the label indicating is attached is also within the scope of the present invention.
  • K value range the distribution of K value (K value range)
  • the obtained amniotic membrane is physically peeled from the placenta tissue with tweezers, etc., and cut by a cutting means such as a scalpel or a surgical scissor-
  • the obtained sample can be separated using a general proteolytic enzyme such as trypsin or collagenase.
  • a general proteolytic enzyme such as trypsin or collagenase.
  • the protein ⁇ dispase as an enzyme (dispase) It is particularly preferred to use
  • the recovery rate is very high compared to general proteolytic enzymes such as trypsin or collagenase.
  • the recovered cells are mixed with epithelial cells and connective tissue cells.
  • sorting becomes easier.
  • a sample is obtained from the region where the amniotic membrane joins (associates) with the placenta Z umbilical cord, and this is used to dispose the cell group of the present invention using Dispase. Although it is preferable to obtain.
  • This method does not limit the application to amniotic membranes during early childbirth that is less than 40 weeks.
  • a proteolytic enzyme Dispase that selectively degrades the basal layer is used to selectively recover only the amniotic epithelial cells from the amnion connective tissue basal layer lining the amniotic epithelium.
  • Amnion tissue is sharp, for example, 10-2 O cni 2 size to facilitate enzyme invasion Fragmented by Convenient surgical scalpel or scissors, to so that such a amnion 1 0 cm 2 per 1 ml, for holding the temperature at immersion for two 5 Dispase solution diluted to 4 0% 3 0-4 0 min HEBS .
  • the cells do not disperse as single cells, but are separated from the basal layer as epithelial cell masses, so that only the dermal cell mass can be easily selectively collected by appropriate vibration.
  • this cell mass Suspend this cell mass in the culture medium and repeat the cell mass sediment washing several times, for example, 3 times in 1 G (natural standing) for 1 to 5 minutes. It may be derived from blood cells, lymphocytes, or interstitial tissues that may be contaminated. Remove single cells such as fibroblasts.
  • the collected cell mass is cultured as it is, or it is not dispersed and remains in the same state (0 0 1 5) in the medium of (1 0), eliminating animal tissue and cell crude extract, 0 with albumin. It can be suspended in vesicle freezing medium added at a concentration of DMS0 10% to 1% added medium and stored semi-permanently in liquid nitrogen. If necessary, the cell mass can be dispersed in a single cell by stirring for 1-2 minutes in a 0.1% trypsin solution containing 0.01% EDTA, and cultured or frozen.
  • the cell mass can be dispersed and cultured as a single cell by stirring for 1-2 minutes in a 0.13 ⁇ 4 trypsin solution containing 0.01% EDTA.
  • high-density culture by droplet (droplet) culture is preferable.
  • the separation of the cell group of the present invention from the amniotic epithelial cells using dispase is the recovery rate of amniotic cells including 0ct4 + (approx. 500 million cells: other enzymes were used) 1 0-1 0 0 times) and ⁇ I purity (99. 9 3 ⁇ 4 higher) to achieve a purification of the case - found that.
  • a material cut to a predetermined size (amniotic tissue cut to 10 to 2 O cm 2 ) is immersed in a light white ⁇ enzyme solution of a predetermined concentration to apply ultrasonic waves, vibrations, or the like. Together, the desired cells are detached or dispersed in the solution.
  • the treatment conditions at this time are not particularly limited as long as they are the upper limit that does not damage the target cells.
  • the epithelial cell mass is released when the amniotic tissue is shaken after the treatment with the above-mentioned paleolytic enzyme such as Dispase.
  • a pale white enzyme solution preferably a dispase solution, it is possible to recover desired cells, that is, the cell group of the present invention with high yield.
  • the present invention further relates to a method for culturing the obtained cell population of the present invention.
  • the cell group of the present invention comprises Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's MCDB153 medium ⁇ , mixed with hydrocortisone, epidermal growth factor, ethanolamine, 0-phosphoethanolamine, transferrin, insulin. It can be grown by culturing in a medium containing bFGF and bovine pituitary extract.
  • 0ct4-expressing cells grow on top of other cells (divided cells). Cells can be concentrated.
  • the mixing ratio of Dulbecco's modified Eagle medium and Ham MCDB153 medium is not particularly limited as long as it is within the range in which cells expressing 04 can be grown, but the volume ratio of the former and the latter is 9 : 1 to 1: 9 is preferable, and about 1: 4 is most preferable.
  • hydrocortisone is not particularly limited as long as 0ct4-expressing cells can be grown.
  • hydrocortisone is 0.:! ⁇ 0.2 M
  • epithelial proliferation is 5-10 ng / l
  • ethanolamine is 2.5-10 ⁇
  • 0-phosphoethanolamine is 2.5-10 ⁇
  • Insulin is preferably 5 to 10 ig / nil
  • bFGF is 5 to 10 ng / ml
  • bovine pituitary extract is 75 to 150 g / ml.
  • a medium containing 1-100% of Conditioned Medium isolated from amniotic membrane, placenta and umbilical connective tissue is suitable for the growth of 0ct4 cells.
  • the undifferentiated state of 0ct4-expressing amniotic epithelium ES-like cells can be maintained for a long time under culture conditions without using bovine pituitary extract It becomes possible to do.
  • habituation media or the usual mouse 11 bud (MEF) feeder.
  • bFGF fibroblast-derived basic growth factor
  • the medium at this time can be any ratio between 1: 9 and 1: 1 in the Dulbecco's modified Eagle medium and Ham MCDB153 medium, although a ratio of about 1: 4 is preferred.
  • Addition is hydrocortisone, epidermal growth factor, ethanolamine, 0-phosphoethanolamine, transferrin, insulin, bFGF, as well as bFGF plus glutathione 0.2 mM, cysteine 0.05 mM, heparin 10-40 ⁇ Add at a g / ral concentration, preferably 20 ⁇ g / ml. Glutathione and cysteine prevent bFGF activity from being degraded by acid, and heparin increases the affinity between bFGF and the receptor.
  • Glutathione and cysteine prevent bFGF activity from being degraded by acid, and heparin increases the affinity between bFGF and the receptor.
  • the high-density culture method is particularly effective in maintaining the undifferentiated state of ES-like cells.
  • the method is necessary to ensure a close interaction between cells, whereby the undifferentiated state of the cells is stably maintained over a long period of time under culture conditions.
  • the expression of 0ct4, Conexin45, Conexin43, Rex, DpA5, Progalanin, UTF1, and Nanog which are indicators of the undifferentiated state of ES-like cells, is effective and is performed as follows.
  • the culture method is not particularly limited as long as the conditions for seeding the cells at a cell density that always ensures mutual contact of the cells are satisfied.
  • the cells When culturing is started from a small number of cells, the cells are placed in a culture vessel at a density of 10 2 to 10 3 ⁇ 1 as a culture droplet of 5 to 10 0.1 and supersaturated humidity is maintained. After maintaining the culture apparatus at 37 for 30 minutes to 2 hours, preferably 50 to 90 minutes, the culture dish is filled with the above culture solution. Meanwhile, the cells adhere to a limited range corresponding to the amount of culture droplets on the surface of the culture dish, so that the cells can be seeded at a density that ensures cell contact.
  • This method is usually applied to cell populations that have been collected in a single dispersion of tryptic amnion cell mass, which is usually 0, and it is necessary to determine the exact number of cells, or 0ct4 from a cell population that has advanced senescence or differentiation. 3 ⁇ 4f This is especially effective for cells that have been fractionated with a cell sorter to purify the main cells.
  • Cell-cell interactions are essential to maintain the properties of 0ct4-positive ES or ES-like cells.
  • a single cell is required. It is preferable to use Dispase, which allows cells to adhere to each other without being dispersed in the cell population, and to be separated as a cell mass of a fixed size. In this case, it is not necessary to perform high-density culture with droplets, and it is Several cells can be dispersed and seeded in a culture vessel. This method is suitable for culturing human amnion epithelial cells containing 0ct4-expressing cells, but is not limited to amniotic cells and can be applied to any dermis cells including stem cells. In addition, these culture methods are also applied when subcultured cultured cells.
  • the cell group of the tree invention described above has the following excellent advantages as compared with that according to Patent Document 1.
  • Separation using dispase as a proteolytic enzyme can separate the 0ct4 cells of the amniotic epithelium and the dermis separately.
  • 0ct4 cells can be maintained in an undifferentiated state for a long period (more than 3 months) under culture conditions (concentrated culture).
  • amniotic epithelial cells containing only 100% of 0ct4 cells can be separated, and these can be cultured and amplified.
  • Amnion can collect 0ct4 cells almost frequently.
  • the amniotic area can be specified (amniotic root area).
  • amniotic membrane obtained at the time of delivery is stored frozen (or obtained at the time of delivery).
  • the cell group of the present invention obtained from the above is cryopreserved), so that it can be used for the same individual and can be used effectively for future regenerative medicine.
  • Human amnion material was obtained from 5 subjects after normal delivery (40 weeks of pregnancy) and 5 or more cases of abortion (gestation 16-18 weeks) after informed consent. Amniotic membranes were stored in HEPES-buffer for 4 3 ⁇ 4 until further treatment (over 24 hours). The amniotic tissue was physically detached from the placental tissue with forceps, cut into a size of approximately 100 cm 3 with a scalpel or surgical scissors, and washed 5-6 times with HBSS buffer. The amniotic sheet was incubated for 37 hours in a 0, 1% trypsin solution containing 0.01% EDTA for 2 hours.
  • HAE Human amniotic membrane: h skin (HAE) cells were collected by scraping the amnion epithelial layer with a pig brush (or tooth: lashi), transferring to a tube, and collecting by centrifugation at 1500 rpm for 5 minutes. Precipitated cells were treated in a 0.1% trypsin solution containing 0.01% EDTA for 2 to 3 minutes to disperse the cell mass into single cells, which were collected by filtration through a 100 m diameter hole size filter.
  • Amniotic epithelial cells were cultured in the following culture medium suitable for most epithelial cells (Ota et al., 1997; Kunimura et al., 1998): Dulbecco's modified monodal medium mixed at a volume ratio of 1: 4 (DMEM) and Ham in MCDB153 medium, hydrocortisone (0.2 M), epidermal growth factor (EGF) (10 ng / ml), ethanolamine (5 ⁇ ), ⁇ -phosphoethanolamine (5 juM), Lanceferin (10 ⁇ ), insulin (5 wg / ml) and bFGF (5-10 ng / ml) supplemented with bovine pituitary extract (150 ig / ml protein) were used.
  • DMEM Dulbecco's modified monodal medium mixed at a volume ratio of 1: 4
  • DMEM epidermal growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • ethanolamine ⁇
  • ⁇ -phosphoethanolamine 5 juM
  • the high-cultivation method is preferable for maintaining long-term viable cells such as adult stem cells (Patent Document 2), but this method is preferable and extremely effective for maintaining the undifferentiated state of ES and ES-like cells.
  • Patent Document 2 The high-cultivation method is preferable for maintaining long-term viable cells such as adult stem cells (Patent Document 2), but this method is preferable and extremely effective for maintaining the undifferentiated state of ES and ES-like cells.
  • [0 033] It is particularly preferred to be used in combination with the culture solution described in [0 0 3 7] and [0 0 4 3], where any of the culture media described here is used. However, it is not limited to these.
  • Total cell RNA was extracted from the cultivated HAE cells according to the method provided by the manufacturer.
  • Target mRNA was amplified by the PdR method using the following primer combinations.
  • sequence of each target gene mRNA sequence increased primer set is as follows (Wei JP, Zhang TS, Kawa S et al., Transplantation 2003; 12: 545-552).
  • Cytokeratin (CK) 19 reverse: TCCAAGGCAGCTTTCATGCT (SEQ ID NO: 6)
  • albumin forward: CGTCGAGAGCACACAAGAG (SEQ ID NO: 7)
  • albumin reverse: CAGCAGTCAGCCATTTCACC (SEQ ID NO: 8)
  • ChromograninA forward: CCGCTGTCCTGGCTCTTCT (allocated U number 1 1).
  • ChromograninA reverse: CCGCTGTGTTTCTTCTGCTG (SEQ ID NO: 1 2)
  • primer combinations were used for each target gene-mRNA expressed in undifferentiated human ES cell lines.
  • the sequence of the primer set is as follows (Bhattacharyaet al. Blood 2004; 103: 2956-2964).
  • the present human amylase gene is based on Hokari et al. (Hokari S, Miura K, Koyama I et. Al.) Using three types of primer sets (# 1, # 2, # 3) that distinguish three types of tissue isozymes. , Cl in Chira Acta 2002; 322: 113-116).
  • the sequences of the primer sets used are as follows.
  • primer ifl, forward GCTGTGAGTGCAGGAACMG (SEQ ID NO: 2 5)
  • primer # 1 everse: TTGAATTCAGTCACCCGGCC (SEQ ID NO: 2 6)
  • primer # 2 forward: AATTGATCTGGGTGGTGAGC (SEQ ID NO: 2 7)
  • primer «3 forward: ACTTGTGGCAATGACTGG (SEQ ID NO: 2 9)
  • primer # 3 reverse: GAGGATATGCATTTAATTTT (SEQ ID NO: 30)
  • the cDNA product amplified by RT-PCT? was separated by electrophoresis on a Tris-Borate-EDTA 2 3 ⁇ 4 agarose gel and visualized and determined in the presence of ethimubu mouth amide.
  • Amnion tissue samples for immunostaining were prepared with 10% formalin for a whole day and night and prepared through a normal paraffin embedding process. Tissue sections with a thickness of 4 ju ra were prepared and treated by the usual histological procedure, and the immuno-histologic staining process described below was advanced.
  • tissue or cell specimens were fixed with 10% formalin, subjected to membrane permeabilization with 0, 2 Triton X-100 for 5 minutes, and immersed in 33 ⁇ 4 0 2 for 30 minutes.
  • streptoavidin-biotin SAB 3 ⁇ 4 using Histofine SAB-P0 kit (Nichirei) was adopted.
  • Visualization of antigen-antibody complex is amplified by nickel catalyst. 3, 3 -diaminobenzidine reaction (conducted by Sigmaj. 0ct4 body was mouse monoclonal antibody (clone C10, SC-5279; Santa Cruz Biotechnology).
  • Rabbit anti-nestin polyclonal antibody (H-85, SC-20978) was used as the anti-nestin antibody.
  • the cultured HAE cells were washed with phosphate buffer (PBS). Fix with 43 ⁇ 4 paraformaldehyde for 10 minutes, treat with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes, wash with 0.2% Tween-PBS, and press with Dako Protein Block Serum Free (DAK0 Japan Co.).
  • the primary antibody used was used at the following dilutions: mouse anti-human CK19 monoclonal (1: 100) (Sigma) and sheep ant i -human albumin polyclonal (1: 50) ( SeroLic) 0
  • Each secondary is Cy TM 3 — conjugated goat an ti -mouse IgG (1: 100) (Jackson Inununo Research Labo.) and Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep TgG (1: 200) (Molecular Probes) 0
  • Immunohistochemical staining with 0ct4 antibody was performed to identify Oct 4 positive cells surviving human amnion obtained after normal delivery (equivalent to 40 weeks of gestation).
  • 0ct4-positive cells are present in the amniotic epithelial layer around the placenta.
  • cells expressing various levels of 0ct4 protein constituted a group of amnion epithelial cells together with cells in which 0ct4 was not detected ( Figure 1, upper left). It is expressed in various repenoles.
  • the 0ct4 protein becomes clearer when its enlarged regions are scrutinized (la, b, c). In these enlarged views, s, m, w, and n each represent strong, medium, weak, and no detection.
  • FIG. 1 A. Distribution of 0ct4-positive cells in monolayer amniotic epithelium.
  • HAE cells In order to investigate the characteristics of HAE cells, the present inventor attempted to recover HAE cells efficiently and as much as possible from human amnion after normal TH delivery, and the level of x lO 7 -xlO 8 per specimen was almost as high as possible. HAE cells could be collected with good reproducibility.
  • the present inventors used a mixture of two basic media as a convenient medium for the growth of HAE cells. This medium was able to increase the number of HAE cells over a period of 6 weeks, and the total number of cells that had increased to about 30 times. Compared to other media such as RPMI1640, it was much more suitable for HAE cell growth. However, the growth of cells stopped at the limit of 5-6 passages.
  • the tree inventor then examined whether 04-positive cells were recovered and present under culture conditions.
  • the primary cultured HAE cells were similarly immunocytochemically stained with 0ct4 antibody.
  • 0ct4-positive cells were scattered in the HAE cell population several days after the primary culture.
  • the present inventor found that the expression level of 0ct4 protein varies among 0ct4-positive cells, which is the same as the 0ct4 expression state found in the amnion epithelium »0ct4 expression in cultured cells It became clear that there was strength.
  • the size of the micro-coloe varied, but the number of 0ct4-positive cells in the micro-colony was 9 on the first day of culture (average of 14 on the 2nd day), 1 on the secondary ⁇ 7th day. 4 (maximum 19), and on the 8th day of the third culture, the average was 10 (maximum 16).
  • 0ct4-expressing amniotic cells were also present in the fetal amniotic membrane in the early stage of development.
  • Immunohistochemical staining of amniotic membranes at 16-16 weeks of pregnancy revealed that 0ct4-positive cells were present in a single amniotic epithelial layer and were widely distributed in any region of the amniotic membrane. It was.
  • HAE cells recovered from these amniotic membranes proliferate actively under the culture conditions described above. When this cell cultured for 2 weeks was immunostained with Oct4 antibody, 0ct4-positive cells forming a considerable number of populations among the 0ct4-negative HAE cell population were identified (Fig. 3).
  • amniotic cells at 18 weeks Comparing the proliferative capacity of amniotic cells at 18 weeks of gestation and postpartum, the amniotic cells at 18 weeks showed much stronger proliferation activity than those at 40 weeks. However, as these cells continue to grow, the total number of sputum cells increases as Oct4 The percentage of positive cells decreased, but this was presumed to be due to the accumulation of differentiated cells in culture and not the absolute number of 0ct4 cells.
  • FIG. 3 A cloth of 0ct4-positive cells of monolayer amniotic epithelium.
  • B Primary culture 1 0ct4-positive cell population in 2 days of HAE cells. The right figure is an enlarged view of one of the Oct4 positive cell concentrators (white box) in the left figure.
  • C Image of post-mitotic immunostaining of 0ct4-positive cells found in 18-week HAE cell population.
  • D Comparison of the proliferative capacity of HAE cells recovered from amnion at 18 and 40 weeks. Each HAE cell is seeded in a collagen cocoon culture dish at a density of 1 ⁇ 10 5 cm 2 (day 0), then passage-cultured, and the number of proliferating cells accumulated until the third generation (day 27) is shown.
  • Example 4 Gene expression as an index related to the pluripotency of HAE cells
  • several factors such as nestin, gal, bumin, CK19, etc.
  • RT-PCR was performed to examine these cell-specific differentiation indices at the raRNA level. The result is that cultured HAE cells form a variety of different cell types, possibly accompanied by differentiation into neurons and liver cells.
  • Nestin mRM expression was detected only slightly, although there were individual differences, but there was no difference in the fetal growth process (eg, comparison between weeks 16 and 40). The immunostaining revealed that only a few nestin-positive cells were detected.
  • the increase curve shows the presaturated cell density (95%) of HAE cells dispersed with C trypsin and 0.01 3 ⁇ 4 EDTA, subcultured repeatedly, and the total number of accumulated cells blotted. Each point is the average value of 3 culture dishes and the deviation value is 5% or less.
  • p ⁇ 5 is the time of passage (the horizontal axis is the number of days from the start of culture). , ⁇ . 0ct4-positive cells under culture conditions. Immunocytochemically detected 0ct4-positive HAE cells.
  • ⁇ S, in, w, and n represent 0ct4 positive degree, strong, medium, weak, and none by immunostaining, respectively.
  • the present invention ⁇ also relates to cultured neuronal embryonic cell markers, Whether aray 1 ase, chromogr aninnA (CgA) and glut2 were expressed.
  • amylase three IsQzymes are known in humans and are of the submandibular gland, knee and liver types. The corresponding genes are Ainyi, Amy2A and Amy2B, respectively. Since the cDNA amplified using primer sets # 1 and # 2 could be distinguished from the liver type by the restriction digestion by Haell, liver cells that differentiate could be present in the culture ( Figure 5A). , B). In order to investigate other differentiation indices, the present inventors tried to identify gene expression specific to spleen cells.
  • FIG. 5 A. Detection of hepatocyte-type amylase mRNA in 40-week-old amnion cultured cells by RT-PCR.
  • the cell type is determined by whether or not the three types of amplified cDNA (a, b, c) as shown in Fig. B are cleaved by three different types of restriction enzymes and enzymes.
  • CgA and glut2 niRNAo B Induction of CgA and glut2 niRNAo B. CgA and glut2 induced by the concentration of glucose in the presence of A. ni cotinamide depend on the induction time.
  • CgA was weak, expression of nicotinamide and high glucose levels was increased in one week when glucose was present.
  • a typical enlarged view in the second region of a and b shows 0ct4-positive cells isolated in the stroma of the mesenchymal tissue between the amniotic epithelial layer and the placental tissue (Fig. 7). a and b). These immunohistochemical observations have many possibilities for human amnion 0ct4 It is shown that there are amnion epithelial cell subsets that express at various levels.
  • 0ct4-positive cells are identified immunohistochemically not only in the amniotic epithelium but also in the amnion mesophyll tissue and amniotic fluid. Because of light hematoxylin staining, the nucleus is blue or purple for negative cells and brown or brown for positive cells. 0ct4-positive cells (arrow a) that appear to have fallen from the amniotic epithelium into the amniotic cavity. Arrows b and c are 0 4 positive and negative cells, respectively, present in monolayer amniotic epithelium. B. Amniotic fluid cells: 0ct4-positive cells present as medium (arrow b).
  • Arrow a is an Oc positive cell on the amniotic epithelial layer.
  • C 0ct4-positive mesenchymal cells present in the amniotic mesenchymal tissue layer.
  • Figures a and b on the right correspond to areas a and b on the left, respectively, and 0ct4 positive mesenchymal cells with nuclei brown in the interstitial tissue are clear.
  • Example 7 Specific induction of nerve cells by sputum density culture method
  • Fig. 1 3 A Cells that have been cultured for more than 4 weeks and grown in a sheet shape are added to the culture dish so that the Dispase enzyme solution is 40%, and after the cell layer that has progressed in the form of a sheet is detached, the culture dish remains in an island shape.
  • Fig. 1 3 A These cells are treated with retinoic acid at a concentration of 10 to: 1 0 0 ⁇ ⁇ for more than 6 hours. Projection formation was observed (Fig. 13B, 0, neuron-specific enolase was detected by immunostaining in all projection-forming cells, including the extended projections (Fig. 13D).
  • Example 8 the type of undifferentiated cell-specific expression gene (expressed in ES cells) expressed by amniotic epithelial cells at 1.8 and 40 weeks of pregnancy (immediately after delivery) was confirmed by fiT-PCK. . All seven types of expression common to human ES were confirmed (see Fig. 8).
  • Example 9 photographs were taken of stained tissue sections (eosin-stained) of the umbilical cord (Unbilical cor, amniotic membrane, and placenta (Placenta) immediately after childbirth (40 weeks of pregnancy).
  • Fig. 9 The immunohistochemical staining of Oc-positive cells described in Fig. 1 is the part indicated by arrows A.
  • the 0ct4-positive cells are particularly frequently detected from arrows b to a.
  • the umbilical cord epithelium of the region, the umbilical cord (epithelium) is distinguished from the placenta Example 10. Results on the recovery rate of 0ct4-expressing cells from the amniotic membrane in Example 10.
  • the collected amniotic epithelial cells were once cultured, and then the proportion of 0ct4 cells in the total cells was examined.
  • the percentage of 0ct4-positive cells was 90% in the 16-week amniotic membrane, 70-80% in the 18-week amniotic membrane, and about 20% in the 40® amniotic membrane.
  • ⁇ 7 indicates the proportion of cells in the growth phase in amniotic cells. * Ki67 cell count not measured.
  • the percentage of 0ct4-expressing cells before cultivation is estimated to be about 1-5% in the 40-week amnion. Cultures enriched 0ct4-positive cells.
  • Oct 4 positive cells measured by immunostaining from a specific site in the tissue other than the embryo, that is, the amnion epithelial layer have the same level of Oct 4 expressing cells as ES cells obtained from conventional embryos. It is possible to obtain a cell group containing a high density of cells (Oc t 4+ (%)) of 0.001 to 100% with respect to the total collected cells. In addition, the obtained cells can be cultured without changing their properties.
  • 0ct4 is a marker protein related to maintaining the undifferentiated state of cells having multipotency
  • cells expressing this protein can be used for regenerative medicine and the like.

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Abstract

従来胚から取得されていたES細胞と同等のレベルのOct4発現細胞を胚以外から入手する技術を確立し同時に、取得された細胞を培養する技術を確立する。羊膜上皮層から採取されたOct4発現細胞を含む細胞群であって、免疫染色法により測定したOct4陽性細胞の採取細胞全体に対する割合(Oct4+(%))が0.001～100%の範囲であることを特徴とするOct4発現細胞を含む。

Description

明細書
O c t 4を発現する細胞を含む細胞群、 その取得方法及びその培養方法 産業 の利用分野
本発明は、 O c t 4を発現する細胞を含む細胞鮮、 その取得方法及びその培赛 方法に関する。 より詳しく述べると羊膜上皮層かち採取された O c t 4発現細胞、 ぞの取得方法及びその培養方法に関する。 背景技術
すべての生物は細胞という最小単位によって構成され、 ヒトの場合はその細胞 の数は 2 0 0種類以上、約 6 0兆個あるといわれている。 このような撣めて多数 の細胞も、 もとをたどれば受精卵という ^の細胞に行き着く力、受精後の J» 生初期の特定の段階 （blast cyct廃盤胞） の一部の細胞塊 (ICM内部細胞塊） か ら成体を構成する全ての機能細胞に分化していく。 このような多種類の細胞を産 み出す能力を保持する細胞を幹細胞 (steni cell) と呼んでいる。 幹から多くの 枝が分かれ大きな木へと成長していくように幹細胞からも多くの細胞が分化し、 身体の組 器官を形作るさまざまな細胞へと変ィ匕を遂げていく。幹細胞には胚 幹細胞と成体幹細胞とがあり、 胚幹細胞は英語で （Embryonic Stem Cell) と呼 ばれるため E S細胞と呼ばれている。
E S細胞は、一般に受精卵が成長を続ける初期の段階である胚から取り出され て ·取得される。 受精卵は胎児へと成長していく過程で分裂を繰り返し 5、 6 0 目 は胚盤胞と呼ばれる状態となる。 肛«は直径 0 . 1ミリほどの球状の形を しており、 外側の細胞層である栄養外胚葉と、 将来、 体を構成するもととなる細 胞の集団である内部細胞塊を抱く胞胚腔とから構成されている。 內側の細胞塊は いずれ内胚桀、 中胚葉、外胚葉へと成長し体のあらゆる細胞を形作っていく部分 で、栄養外胚菜はそれらの胎盤を形成し、 また胚を外界から隔離する袋を形成す る。
この内部細胞塊をほぐした後細胞を取り出し、 これらの細胞をある細胞が増殖 しても分化しな 、環境で培養すると E S細胞が得られる。
ヒ ト E S細胞は人体を形づくるあらゆる細胞にへと変ぼうすることのできる 大元の細胞であるとともに、変貌する前の状態のまま自らをいくらでも分裂させ て増やすことができる特性を持っている。 このようなヒト E S細胞を取得可能と ったので、 ヒト E S細胞を上手く誘導することによって、 目的とする必要な細 胞、 耝織、 器官を意図的に作り出すことが期待される。 そのため、 ヒト E S細胞 は、種々の治療、 特に再生医療分野への髙ぃ応用可能性を有しており、 また各種 細胞、 組織、 器官の基礎研究に重要な細胞である。 日本においても、文部科学省から 「ヒ ト ES細胞に関する樹立と使用に関する 指針 J 力 s示され、 一定の条件のもとでヒト ES細胞を利 fflした研究の許可が出さ れている。
このようなヒ ト ES細胞は、再生医療分野において注目されているが、細胞の 安全性の問題及ぴ細胞の入手に関する問題がある。 すなわち、 ヒトの ES細胞株 を樹立するためにはヒトの受精卵が必要である。
現在、 日本国では， 人工体外受精をする際に余った受精卵の中から承諾を得た' ものを用いて実験が勧められている。
このことや細胞核を用いた遺伝子操作など、倫理問題にふれる'問題が数多く含 まれているのでこれらに対する法律の整備が急務となっている。
これに対して、 特許文献 1には、 安定供給が可能であり、 移植の際の適合性が 問題にならない幹細胞を提供する目的で、 ヒト羊膜間葉細胞層から分離され、 R T— PCRにおいて Oc t—4遺伝子、 Sox— 2遺伝子、 FGF— 4遣伝子、 Re x一 1遗伝子の発現が認められ、免疫細胞染色においてビメンチン陽性及ぴ CK19陽性であるサイドポピュレーション細胞が開示されている。
なお、 ES細胞を同定するために種々のマーカが開発されているが、 RT— P CRによる Oc t 4遣伝子の発現が最も一般的である。
(特許文献 1 特開 2004— 254682号公報）
特許文献 1に記載の細胞は、 ヒト羊膜間葉細胞層から Oc t— 4発現細胞を取 得できる可能性について記載さ ているものの、 特許文献 1 細胞は、 非常に低 密度 （具体的には、 免疫染色法により測定した O c t 4陽性細胞の採取細胞全体 対する割合 （Oc t 4+ (%)) は、 0. 01%未満)） であり、 また取得され る細胞は羊膜組織をコラゲナーゼによる細胞間質の消化によるため上皮細胞と 間葉細胞が混在して回収されることを避けることができない。従って採取される 細胞を用いて、胚由来の E S細胞と同等のレペルで取り极うことは不可能であつ た。
すなわち、 特許文献 1に記載の発明は、 下記のような問題点を有していた。
(1) 羊膜上 と真皮の各々の oc t 4発現細胞を別々に純化できない。
(2) Oc t 4発現細胞だけを高い頻度で分離できない。
(3) Oc t 4発現細胞を未分化状態で長期間 （3ヶ月以上）培養条件下で維 持出来ない。
(4) 16~20週胎児の羊膜上皮からは O c t 4発現細胞だけをほぼ 10 0 %含む羊膜上皮細胞を分離出来ない。
(5) 得られた細胞を培養して增幅できない。
(6) ヒトも場合には出産時である約 4 Οϋ羊膜ではほぼ高い頻度で Oc t 4 努現細胞を回収できない。 したがって、本発明の課題は、従来胚から取得されていた ES細胞と同等のレ ベルの Oc t 4発現細胞を胚以外から入手する技術を確立することである。
同時に、 取得された細胞を培養する技術を確立することにある。 発明の開示
本発明者等は、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、平均 4' 0週満 期出産時胎盤の周辺の羊膜上皮層の特定部位に 0ct4発現細胞が高密度に集団を 形成して存在することを見出し、.そして、 これらの 0ct4発現細胞を選択的に濃 縮して取得できることを見出した。 同時に、 早期流産 （20週期以前） 羊膜にお いては羊膜全域にわたって 0 4発 細胞が高密度に存在することを見出し、 そ して、 これらの 0ct4発現細胞を逮択的に漉縮して取 できることを見出した。 本発明は、 このような知見に基づいて創作されたものである。
すなわち、 本発明は、 以下の （1) 〜 （12) を提供するものである
(1) 羊膜上皮層から採取された Oc t 4発現細胞を含む細胞群であって、免 疫染色法により測定した O c t- 陽性細胞の採取 胞全体に対する割合（Oc t 4+ (%)) が 0. 001〜： L 00%の範囲であることを特徴とする O c t 4発現 細胞を含む細胞群。 、 なお、本発明において使用する用語羊膜とは羊膜細胞は通常、満期出産時期（平 均 40週）.の羊膜から採取されたものを使用することを特徴とするが、利用可能 な早期流産 （20週以前） の羊膜から採取してもよいことを意味している。
(2 ) 前記 O c t 4陽性細胞の採取細雎全体に対する割合が 1. 00〜10 - 0%の範囲であることを特徴とする （1) に記載め Oc t 4発現細胞を含む細胞 群。
(3) 前記免疫染色法により測定した細胞を RGB画像データとして取り込み、 CMYK値に変換した際の K値の範囲が 5000以上、 9000未満の範囲にあ る OCT 4発現細胞が全 0 c t 4発現細胞の 10%から 100%の範囲である ことを特徴とする （1) 又は （2) に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群。
( ) 前記羊膜が満期出産時の羊膜であって、前記細胞群が胎盤側 10 %まで の範闲の羊膜上皮層から採取したものであることを特徵とする請求項 1から請 求項 3のいずれか 1項に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群。
( 5 ) 前記羊膜が 20週以前の羊膜であって領城を限定しない羊膜の前領域か ら採取されたものであることを特徴とする請求項 1から請求項 3のいずれか 1 項に記載の Oc t 4発現細胞を含む （1) から （3) のいずれか 1項に 1G載の O c t 4発現細胞を含む細胞群。
(6) 前記細胞群が Kr盤方向に向かって連続的に増加し胎盤から臍帯基部に連 続する領域から採取したものであることを特徴とする請求項 1から請求項 3の 2006/300682
4
いずれか 1項に記載の O c t 4発現細胞を含む細胞群。
(7) 前記羊膜が満期出産時の羊膜であ て、 羊膜/臍帯接合部から採取され た Oc t— 4発現細胞を含む （1) から （3) のいずれか 1項に記載の細胞群。
(8) 前記細胞群が淡白分解酵素ディスパ一ゼにより羊膜上皮細胞と羊膜結合 組織を特異的選択的に分離して得られたものであることを特徴とする （1) か
(7) のいずれか 1項に記載の Oc t—4発現細胞を含む細胞群。.
(9) (1) 力^ (8) に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群を取得する 0 c t 4発現細胞を含む細胞群の取得方法であって、タンパク質分解酵素ディスパ ーゼにより羊膜上皮細胞と羊膜結合組織を特異的選択的に分離する工程を含む ことを とする O c t 4発現細胞を含む細胞群の取得方法。
(10) (1) から （8) に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群を培地上で t咅養する工程を含む、' Oc t 4発現細胞の培養方法。
(1 1) 前記培地がダルべッコ変法ィ 培地とハム MCDB 3培地とを混合 し、 'ヒ ドロコルチゾン、 上皮增殯因子、一ダル
エタノールァミン、 o -ホスホェタノ一ル ァミン、 トランスフェリン、 インシュリン、 bPGF、 及ぴ Zまたは牛脳下垂体抽出 液を加えたものであることを特徴とする （10) に記載の培桊方法。
(12) 前記ダルベッコ変法イーグル培地とハム MCDB153培地との混合比が 1 ： 9〜1 ： 4であることを特徴とする請求項 1 1に記載の培養 法。 ^面の簡単な説明
図 1Aはヒト羊膜中の 0ct4発現細胞サブセットの免疫組織学的検出の様子を - 示す図面である。 、 図 2は、 実施例 4の結果を表す図面である。
図 3 Aから Dは免疫染色によって検出した 18週羊膜上皮に存在する 0ct4陽 性細胞を示す図面である。
図 4は 40週 （4標本） および 16週 （1標本） の羊膜由来の HAE細胞 の初代 培養で PCRによって検出される色々な細胞種特異的マーカー分子 mRNAで、 各々 0ct4 (未分化幹細胞）、 nestine (神経幹細胞）、 albumin (肝細胞）、 CK19 (上皮 細胞） など多種類の細胞に分化する形質を示す。
図 5は RT-PCRによって 40週羊膜由来 HAE培養細胞中の肝細胞型アミラーゼ tnRNAの検出を示す |¾而である。
図 6は 40週 HAE培養細胞に検出された糖代謝関連遺伝子 CgAと glut2の発現 を示す図面である。
図 7 は膜上皮のみならず羊膜間葉組織および羊水中にも免疫組織化学的に 0ct4陽性細胞が同定されることを示す図面である。 A.羊水中の 0ct4陽性細胞 (矢 印 a)。欠印 bおよび c は各々単層の羊膜上皮に存在する 0ct4陽性と陰性細胞。 B. 羊水細胞中として存在する 0ct4陽性細胞（矢印 b)。矢印 aは羊膜上皮層十-の 0ct4陽性細胞。 C. 羊膜間菜袓織層に存在する 0ct4陽性間葉細胞。 右の図 aお よび b は各々左図の領城 aと bに対応しており、間質組織中に核が褐色に染色さ れた 0ct4陽性間棄細胞である。
. 図 8は RT-PCRによって検出される妊娠 1 8週と 4 0週 （出産直後） の羊膜上 皮細胞が発現している未分化細胞特異的発現遺伝子を示す。ヒ ト ESと共通する 7 種類全ての発現が確認される。
図 9はヒトの出産直後（妊娠 4 0週）の臍带 (Unbilical cord)、羊膜（Amniotic membrane) . 胎盤 （Placenta) を含む領域のの組織切片像 （ェォシン染色） を示 す。図 1に記載した Oc 陽性細胞の免疫組繊染色は Amniotic epithelium矢印 a の都分。 0ct 14細胞が特に高頻度に検出されるのは、矢印 bから aの領域の羊 膜上皮で、 臍带 （上皮） と胎盤とは区別される。
図 1 0は羊膜からの 0ct4発現粞胞の回収率に関する結果を示す。
図 1 1 A〜Dは本発明の O c t 4発現細胞の評価方法を示す図 Sである。
m i 2 Aは羊膜上皮細胞の高密度培養によって得られる神経分化誘導可能な' 前駆細胞の取得し、 羊膜上皮細胞をコラーゲン IVでコーティングした培凝皿に 細胞塊を示す写真であり、図 1 2 Bはドロプレツト法によって細胞を播種し細胞 間相互作用を保持した 胞シート状を維持させながら長期培養に供した際の顕 , 微鏡写真である。
図.1 3 Aは細胞密度を保持しつつ 4週間以上培養を継続しシ"ト状に成長し た細胞を、 Dispase酵素液を 4 0 %になるように培養皿に加え、 シート状に進展 - した細胞層を剥離後、 培養皿に島状に残存した際の細胞群の顕微鏡写真であり、 図 1 3 B , 1 3 Cは図 1 3 Aの細胞群を retinoic acidで 1 0~ 1 0 0 · Mの濃度 で 6時間以上処理した際の顕微鏡'与真であり、図 1 3 Dは伸長した突起部分も含 め、全ての突起形成細胞に神経細胞特異的エノラーゼが免疫染色によって検 UJし た際の顕微鏡写真である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
なお、 本明細書中で使用する用語は、 以下の意義を有する。
O c t 4発現細胞とは、多分化能力を持つ細胞の未分化状態の維持に関係する マーカータンパク質である O c t 4を免疫染色法により測定して陽性である細 胞を意味する。 O c t 4は、 当該技術分野で E S細胞又は E S様細胞の同定に最 •も一般的に用いられているので、 O c t 4発現細胞とはこれらの E S細胞又は E S様細胞を含むことを意味している。
なお、 O c t 4発現細胞とは、他のマ一力、 例えば特許文献 1に 15載のマ一力 を用いて同定された ES細胞を排除することを意味するものではない。
ΓΟ c t 4+ (%)」 とは、 免疫染色法により測定した Oc t 4陽性細胞の採取 細胞全体に対する割合を意味し、具体的には後述する通り、 Oc t 4をマーカと して免疫染色法により染色した細胞を、 顕微鏡により撮影し、 撮影した画像にお ける O c t 4 ί¾細胞の面積の割合 （Oc t 4発現細胞の面積） / (全体の細胞 の面積） X 1 00で示したものである。
O c t 4発現の強度とは、前記の免疫染色法により測定した細胞を RGB画像 データとして取り込み、 CMYK値に変換した際の K値 （黒色濃度値） の範囲を 表したものであり、 無し （n) 「1 000未満」、 弱 (m) 「1000以上、 50 00未満 中 (m) 「5000以上 9000未満」、 強 （s) 「9000以上」 の 四段階評価で示す。 '
[Oc t 4発現細胞〕
本発明の細胞群は、羊膜上皮層から採取された O c t 4発現細胞.を含む細胞群 であって、 Oc t 4+ (%) が 0. 00 1〜100%の範囲である細胞群である (以下、 本発明細胞という）。
'本発明細胞は、満期出産時ヒト又はそれ以外の動物 （例えば、 マウス、 ラット 等） の特定箇所 （胎盤周辺） における羊膜上皮層.から取得されたものである。 本 明者等によると、 一般的には動物の胎盤側かち遠ざかるのに従って密度 (Oc t 4+ (%)) が疎になる （％が低くなる） 傾向にあり、 胎盤側 10%まで の範囲の羊膜上皮層からは、'非常に高密度で （高い。 /0で） Oc t 4発現細胞を含 む細胞群が得られること、及び 20週期ヒト胎児羊膜には領域を限定せず高頻度 - (90%以ヒ） に 0ct4発镍細胞が得られることを繰り返しの実験により見出し たものである。
満期出産時ヒ ト新生児の場合には、通常、胎盤から 5 cm以内の位置に存在す る臍帯上皮に連続する羊膜上皮層であって、前記臍帯上皮から 10 cm以內の位 置に存在する羊膜上皮層を、 好適には、胎盤 iU臍帯基部から 10 c m以內の位置 に存在する羊膜上皮層から本発明の細胞群が取得される。特に好ましくは羊膜/ 臍帯接合部から非常に高い Oc t 4+ (%) で Qc t 4発現細胞を含む細胞群が 得られる。
より具体的には、 本発明者等は、 繰り返しの実験により、 Oc t 4 ¾現細胞の 割合は胎盤方向に向かって連続的に増加し、 羊膜が胎盤/臍帯に接合 （会合） す る領域には 0ct4+細胞が重層し密集する複数 （2以上） の部位が存在し、 これは 個体の違いを超えて変わらず普遍的であることを見出した。
本発明において、 本発明の細胞群を、 特定するのに当たって、 まず当該技術分 野に公知の方法により取得した細胞を免疫染色し、染色した細胞を顕微鏡を介し てコンピュータ 読画像データ （RGBデータ） に変換する。 得られた画像データ （RGBデータ） をソフトウェア例えば Adobe Photoshop (登録商標名）により CMKYイメージ変換する。 Oc t 4を免疫染色した箇所、 すなわち、 Oc t 4発現細胞は、 通常掲色で表されているので、 この画像かち青 色を減色すると、面像中 Oc t 4発現細胞だけが黒色要素 （K) を含んでいるこ ととなる。
従って、 これを例えば画像解析ソフトウェア例えば Clontech ImageQuaiiL (登 録商標名） により定量化することによって、 細胞全体における Oc t 4発現細胞 の割合 （Oc t4+ (%)) を求めることが可能となる。
本発明の細胞群には、 このような手法により測定した結果、 0. 001〜10 0%の範囲で （特に、 羊膜/臍帯接合部では約 10〜50%) Oc t 4発現細胞 が含まれることを見出した。
このことは、 特許文献 1に記載の細胞が 0. 001 %に満たない誤差範囲であ ることから比較すると、 本発明の細胞群が非常に有用であることが判る。
' このように、 Oc t 4発現細胞を含む細胞群から O c t 4発現細胞の割合を求 める手法は新規である。 したがって、本発明は、 Oc t 4を用 て免疫染色した 細胞群から Oc t 4発現細胞の割仓を求める方法であって、免疫染色した細胞を 顕微鏡を介してコンピュータ可読画像データ （RGBデータ） に変換し、得られ た画像データ （RGBデータ） をソフトウェアにより CMYKイメージ変換し、
CMYK変換した両像から青色を減色し、全体の画像中から K値の割合を求める ことを特徴とする O c t 4発現細胞の割合を求める方法（取得細胞のズクリー二 ング方法) まで拡張される。
- 具^的には手順を図 11に基づいて説明する。
DAB (3, 3' -diaminobennzidine)反応よつて得られた 0 c t 4蛋白の褐色 の画像ファイルを ¾像処理ソフト、 例えば Photpshopによって開き， "イメージ'' メニューかち"モード"の" CMYKカラー" を選択する。 CMYKはシアン（C)、 マジェンタ （M)、 黄色 (Y) .黒色 (K) の色成分で表現される。
次いで、 画像処理ソフトのスポィトツールを選択して DAB 褐色部分 （こ の場合は細胞核内で機熊する遣伝子転写因子 O c t 4であるため、褐色の染色を 示す細胞核） を選択する。
次に、描画色のパレットをクリックしカラーピッカーのウィンドウを開き CM
YKの K値 （黒色％値） を確認し、 さらに DAB陰性細胞核 （細胞質及び細胞膜 に存在する D ABの非特異的発色含む青色が便勢な部分） を選択しカラーピツカ 一で同様に K値を測定する。
前者が後者より K値（％) が十分高い％値であることを確認しカラ一ピツカ一 のウィンドウを閉じる。 この時の前者と後者の K値 （%) 差が人きくない場合は 非特異的 DAB発色の占める割合が高いと判定されるため、 より信頼できる K値 を得るためには非特異的染色が少ない良質の免疫染色標本を再度得る；とが好 ましい。
例えば本標本の K値は前者が 5 8〜 6 0 %、後者が 2 2〜 2 4 ¾となる。 "ウイ ンドウ" メニューから 「ブラック」 のチャンネルを選択クリックし画面を白黒 で表現する。 "選択範囲" メニューから画像全てを選択し "編集" かち "コピー" 機能によってクリップボードにコピーする。
"ファイル" メニューから 「新規」 を選択し、 モードをグレースケールとする (図 1 1、 図面 1 「これを図 1 ι~ とする」 、 冈 1 1 "φの下に挿入、 例えば図 1 1 -®左上図 4 O Am - 4 0週羊膜基部羊膜ト.皮層. 同様に左下図 40 Pri - 培桊した 4 0収容幕細胞)。 0Kをクリックする。 "編集"メニューから "ペースト" 機能によって新規ファイルに DAB発色の画像を移チ。 "ウィンドウ，， メニューか ら "レイヤー" を表示し、 背景レイヤ一とペースト,画像の二つが確認されたら、 プルダウンメニューから "画像の統合"選択し画像を統合する。 ·
"ファイル" メニューから保存を選択し、 ファイルタイプを、 例えば TIFF (拡 f. tif) とし保存する。例えば、画像解析ソフト ClontechlraageQuant (TM)での 0ct4染色値を測定する場合， 「色調捕正」 から 「階調の反転」 を選択し白黒画像 を反転しておく。本解析で例示される ClontechltnageQuant (T )で与えられた個々 の細胞核の .色濃度の測定値はほぼ 3 0 0〜 2 0 0 0 0までの任意の値を記録 した。 この実際の測定値 (Value) は異なった標本 （組織、 培養細胞） におけ O c t 4の D A B発色による免疫染色標本ごとでほぼ一定の域値を得ることが出来 ることから、 再現性が認められる。
- 本発明者等は、 さらに、 このようにして黒色要素 Kの強度により、 O c t 4発 現細胞として表された O c t 4発現細胞を詳細に調査した所、 その K値により、 O c t 4発現細胞の挙動が異なることを見出した。すなわち、本発明においては、 黒色要素測定値が、 無し （n ) 「1 0 0 0未満」， 弱 （m) 「 1 0 0 0以上、 5 0 0 0未満」、 中 （πι) 「5 0 0 0以上 9 0 .0 0未満」、 強 .（ s ) 「9 0 0 0以上」 の 四段階評価で示した場合、 無し （n ) 又は弱 （w) の場合、 £ 3細胞又は5 3様 細胞としての挙動をまったくあるいはほとんど示さず、 逆に強 （s ) の場合には 上皮表層に分布し羊水中へ脱落する傾向にあり、 E S細胞又は E S様細胞として、 未分化ではなくむしろ分化傾向または終末期であった。 これに対して中 （πι) の 場合には上皮基底層側に位 eする傾向にあり長期生存に有利である E S細胞又 は E S様細胞として、未分化状態の維持という優れた挙動を保証する。 したがつ て、単に 0ct4陽性細胞の存在のみならず、 0ct4の発現程度に幅がある 0ct4陽性 細胞集団が ES又は ES様細胞の存在を保証する。
本発明の細胞群には、 このような E S細胞又は E S様細胞として優れた举動を 示す中程度の強度を有する O c t 4発現細胞が有意に含まれることが実験的及 び解析的に判った。
これに対して、 特許文献 1では、 E S ¾の細胞としての O c t 4発現細胞の重 要性に関する論拠を持つに至っていない。
このように、 O c t 4発現細胞を含む細胞群から O c t 4発現細胞の挙動をス クリーニングする方法 ·評価方法も同悸にして新規である。
したがって、.本発明は、 前記 O c t 4発現細胞の割合を求める方法において、 K値 (黒要素測定ィ直） を予め定めた複数の黒要素測定値範囲を設定し、 各設定し た黒要素測定値範囲の割合（全体に対する割合として又は K値における各黒要素 測定値範囲の割合として） 求めて、 取得細胞の挙動をスクリーニングする方法ま で拡張される。
さらに、 本努明は、 本発明の細胞群 （又は他の O c t 4発現細胞） と、 前記細 胞群を収納し、保存するだめの容器と力 ^構成された O c t 4発現細胞系であつ て、 前記保存容器には、 前記スクリーニング法 （評価方法） で評価した k値 （K 値範囲） の分布 （例えば、 無し （η〉 Γ Γ0 0 0未満」、 弱 （m) 「1 0 0 0以上、 5 0 0 0未満」、 中 （m) Γ 5 0 0 0以上 9 0 0 0未満」、 強（s ) 「9 0 0 0以上」 の四段階評価で示した場含の分布） を示すラベルが付与された細胞系でも本発明 の範囲內である。
このように、 K値 （K値範囲） の分布を示すことによって、 細胞の培赛、 その 他の研究用途に非常に有効となる。
本発明の細嗨胖を取得するに当たって、例えば取得した羊膜を、 ピンセット等 で胎盤組織から物理的に剥離し、 メスまたは外科用ハ ミ等の切断手段によって - '所定のサイズに切断して得られたサンプル （羊膜シート） を、 トリプシン、 コラ ーゲナーゼ等の一般的蛋白分解酵素を使用して分離することが可能であるが、本 発明においては、 特に蛋白: ^酵素としてディスパ^ "ゼ （Dispase) を用いるこ とが特に好ましい。
ディスパ一ゼ （Dispase) 用いた場合、 トリプシンあるいはコラーゲナーゼ 等の一般的蛋白分解酵素と比較して、 回収率が非常に高く、 また、 回収した細胞 - は上皮細胞、 結合組織細胞が混合し細胞の分別が容易になると言う利点がある。 特に前述の通り、満期出産時の羊膜においては羊膜が胎盤 Z臍帯に接合（会合） する領域からサンプル （羊膜シート） を取得し、 これをデイスパーゼ （Dispase) を用いて、本発明の細胞群を入手することが好ましいが。.本方法は 4 0週に満た ない早期出産時の羊膜にも適用する.ことを制限するものではない。
すなわち、本発明の特定の実施形態において、 羊膜上皮を裏打ちする羊膜結合 組織基底層から羊膜上皮細胞のみを選択的に回収するために基底層を選択的に 分解する蛋白分解酵素 Dispaseを用いる。
羊膜組織は酵素の浸襲を容易にするため、 例えば 1 0〜2 O cni2のサイズに鋭 利な外科手術用メス又はハサミによって断片化し、 羊膜 1 0 cm2当たり 1 mlとな るように、 HEBSで 4 0 %に希釈した Dispase液に浸し 2 5 で 3 0〜 4 0分間保 温する。
本条件下では細胞は単一細胞として分散せず、上皮細胞塊として基底層から剥 離した状態になるため適度な振動によって容易にト-皮細胞塊だけを選択的に回 収できる。
この細胞塊を培養液に懸濁し 1 G (自然放置） 1〜 5分で細胞塊沈澱洗浄を数 回、 例えば 3回操り返し、 混入の可能性がある血球、 リンパ球、 間様組織由来の 繊維芽細胞などの単一細胞を除去する。
冋収した細胞塊はそのまま一定量培養するか、 分散せず其の状態のまま [ 0 0 1 5 ]の （1 0 ) の培地から動物組蛾や細胞の粗抽出物を排除し、 緩衝作用を持 つアルブミンを 0。 1 %添加した培地に DMS0 1 0 %の濃度で加えだ胞凍結培地に 懸濁し液体窒素中で半永久的に保存できる。必要ならば細胞塊は 0. 01%EDTAを含 む 0. 1%トリプシン溶液中で 1〜 2分 拌し単一細胞として分散し培養または凍 結保存することが可能である。
.必要ならば細胞塊は 0. 01%EDTAを含む 0. 1¾トリプシン溶液中で 1 -2分攪拌し 単一細胞として分散し培養することが可能である。 この場合は後述するように、 ドロップレット （液滴） 培養による高密度培養が好適である。
本発明者等の実験によると、デイスパーゼを用いた羊膜上皮細胞からの本発明 の細胞群の分離上程は、 0ct4+を含む羊膜細胞の回収率 （概算で 5億個：他の酵 素を用いた場合の 1 0〜1 0 0倍） と髙ぃ純度 （99.9¾以上） の純化を実現する - ことを見出した。
これにより各々 なった細胞型に分化する傾向を示す結合組織中の幹細胞と 上皮系由来幹細胞の分別が可能になるため、ほん手法は羊膜間葉組織中に含まれ る ra菜系幹細胞を純化することにまで適用される。
すなわち、 所定のサイズに切断した材料 （1 0〜 2 O cm2に切断した羊膜組織） を、所定濃度の淡白^酵素液中に浸溃し、超音波 ^理、 振動の付与またはこれ らを祖合わせて所望の細胞を剥離または溶液中に分散させる。■ '
この際の処理条件は、ターゲットとする細胞に損傷を与えない上限であれば特 に限定されるものではない。 本発明者等の寒験によると、 前述したデイスパーゼ (Dispase) 等の淡白分解酵素により処理し後、 羊膜組織を震盪すると、 上皮細 胞塊が遊離してくる。 この際に、 淡白^ f酵素溶液、 好ましくはデイスパーゼ溶 液中で震盪することによって、高い収量で所望の細胞、すなわち本発明の細胞群 を回収することが可能である。
〔培養〕 ； 本発明は、 さらに取得した本発明の細胞群を培養する方法に関する。 〔培養方法〕 · 本発明の細胞群は、ダルべッコ変法イーグル培地とハム MCDB153培地 ίを混合 し、 ヒ ドロコルチゾン、 上皮増殖因子、 エタノールァミン、 0-ホスホエタノール ァミン、 トランスフェリン、 インシュリン、 bFGF、 牛脳下垂体抽出液を加えた培 地で培養することにより、増殖させることができる。 また、 羊膜上皮屑から採取 された細胞を ^記培地中で培養した場合、 0ct4発現細胞が他の細胞（分ィヒした細 胞） に傻先.して埤殖するので、 培養により 0ct4発現細胞を濃縮することができ る。
fiiia培地において、ダルべッコ変 ¾イーグル培地とハム MCDB153培地の混合比 は、 0 4発現細胞を増殖させることができる範囲内であれば特に限定されないが、 前者と後者の容量比が、 9 ： 1~ 1 : 9であることが好ましく、 約 1 ： 4であるこ とが最も好ましい。
^ίΠするヒドロコルチゾン、 上皮増殖因子、 エタノールァミン、 0-ホスホエタ ノールァミン、 トランスフェリン、 ィンシュリン、 bFGF、 牛脳下垂体抽出液の量 は 0ct4発現細胞を増殖させることができる範囲内であれば特に限定されないが、 ヒドロコルチゾンは 0.：!〜 0. 2 M,上皮增殖冈子は 5 〜 10ng/ l、エタノール アミンは 2. 5 〜 10 μ Μ、 0-ホスホエタノールアミンは 2. 5 〜 10 μ Μ、 インシュ リンは 5〜10 i g/nil、bFGFは 5 〜10 ng/ml、牛脳下垂体抽出液は 75 〜 150 g/ml になるように ¾¾Dするのが好ましい。
羊膜、 胎盤、 臍带の結合組織から分離したファイブロブラストを培養した Conditioned Medium (訓化培地） を 1〜100%を含む培地が 0ct4細胞の増殖により -適している。
〔高密度： 方法〕
高密度培養法とディスパ一ゼによる上皮細胞塊の培養法を併用することによ り 0ct4発現羊膜上皮 ES様細胞の未分化状態を牛脳下垂体抽出液を使用せず培養 条件下で長期維持することが可能になる。訓化培地や通常用いるマウス 1 1芽細 胞 （MEF) のフィーダ一を用いる必要は無い。 その代替として繊維芽細胞由来塩 基性增殖因子（bFGF)を用いることができる。この時の培地は前記培地において、 ダルベッコ変法イーグル培地とハム MCDB153培地の混合! が 1 ： 9 ~ 1 ： 1の間 のどの比率も取り得るが約 1 ： 4の比率が好ましい。 添加はヒドロコルチゾン、 上皮増殖因子、 エタノールァミン、 0-ホスホエタノールァミン、 トランスフェリ ン、インシュリン、 bFGF、を基本とする力 bFGFと共にさらにグルタチオン 0. 2mM, システィン 0. 05mM, へパリン 10-40 · g/ralの锒度,好ましくは 20 · g/mlで加える. グルタチオン及びシスティンは bFGFの活性が酸ィ によって劣化することを防止 し、 へパリンは bFGFと受容体の親和性を高めることが知られている。
高密度培養方法は ES様細胞の未分化状態を維持するのに特に有効で、 この方 法は細胞間の密な相互作用を保証するために必要で、それにより細胞の未分化状 態が培養条件下で長期間にわたって安定に維持される。 この時、 ES様細胞の未分 化状態の指標である、 0ct4, Conexin45, Conexin43, Rex, DpA5, Progalanin, UTF1, Nanogの発現が維持されるために有効で以下のように実施される。 高密度培養は 細胞の相互の接触が常に保証されるような細胞密度で細胞を播種する条件を満 たしていれば特に培養方法を限定するものではない。少数の細胞から培養を開始 する場合は培養容器に細胞を 1 0 2〜 1 0 3Ζ · 1の密度で 5〜 1 0 0 . 1の培養 液滴として、過飽和の湿度を保った 3 5〜3 7での培養装置 で 3 0分〜 2時間、 好ましくは 5 0〜 9 0.分、保持した後上記培養液で培養皿を満たす。 その間に細 胞が培赛皿表面の培養液滴の量に見合った限定されたに範囲に細胞が付着する ため細胞接触が保証される密度に細胞を播種することが出来る。 この方法は通常 0収した羊膜細胞塊をトリプシンによって単一に分散した細胞集団に適用する のが好ましく、厳密な細胞数を決定する必要が生じる場合や、 老化や分化が進行 した細胞集団から 0ct4 ¾f主細胞を純化するためにセルソーター,で分画した細胞 をなどで特に有効である。
0ct4陽性の ESまたは ES様の細胞の特性を維持するためには細胞間相互作用が 不可欠である. 複数の細胞が常に接触を保持した状態で羊膜上皮細胞を回収する ためには細胞を単一の細胞集団に分散せず相互に細胞が接着して -定の大きさ の細胞塊として分離できる Dispaseを用いることが好ましく、 この場合は液滴に よる高密度培養を実施する必要は無く、一定数の細胞 を培養容器に分散して播 種することが出来る。 この方法は 0ct4発現細胞を含む人量の羊膜上皮細胞の培 養に好適であるが、羊膜細胞に限定するものではなく幹細胞を含むどの.ヒ皮細胞 にも適用される。 さらに、 これらの培赛法は培養された細胞を継代する場合にも 適用される。
以上説明した木発明の細胞群は、特許文献 1によるものと比較して下記の優れ た利点を有している。
蛋白分解酵素としてディスパーゼを使用して分離するこどによって、羊膜上皮 と真皮の各々の 0ct4細胞を別々に純ィヒ出来る。
0ct4発現細胞だけを高い頻度で分離出来る （高密度培養で濃縮出来る）。
0ct4細胞を未分化状態で長期間 （ 3ヶ月以上）培養条件下で維持出来る （髙密 度培養)。
1 6〜2 0週胎児の羊膜上皮からは 0ct4細胞だけをほぼ 1 0 0 %含む羊膜上 皮細胞を分離出来、 これらを培養して増幅できる。
現実的な 4 0週 （出産時） 羊膜ではほぼ高い頻度で 0ct4細胞を回収できる。 羊膜領域を特定できる （羊膜根元領域)。
さらには、 出産時に取得した羊膜を凍結保存する （あるいは出産時に取得した から得られた本発明の細胞群を凍結保存する） ことによって、 同一個体に使用す ることが 能となり、将来の再生医療 iこ向けて有効に使用することが可能となる。 実施例
以下、 実施例により本発明を更に詳細に説明する。
最初に本実施例において用いた実験材料及び実験方法について説明する。
ί細胞調製法 Λ〕
ヒ ト羊膜材料はインフォームド コンセントを実施した正常分娩後（妊 4 0 週） 5 0例以ト_と人工妊娠中絶 （妊娠 1 6 - 1 8週) 5例の対象例から得た。 羊 膜は処置を進めるまで （24時間以內） は HEPES-緩衝液中で 4 ¾に保管した。 羊 膜組織はピンセットを用いて胎盤組織から物理的に剥離し、メスまたは外科用ハ サミによって約 1 0 0 cm3のサイズに切り、 HBSS緩衝液で 5 - 6回洗浄した。 羊膜 シートは 0. 01%EDTAを含む 0， 1%トリプシン溶液中で 37 、 2時間保温した。 ヒト 羊膜： h皮 （HAE) 細胞は羊膜上皮層をブタ毛刷毛 （または歯: ラシ） 用いて搔 き落として回収し、 チューブに移し 1500回転、 5分間の遠心によって集めた。 沈査の細胞は 0. 01%EDTAを含む 0. 1%トリプシン溶液中で 2 - 3分処理し細胞塊を 単一の細胞に分散し、 100 m径穴サイズのフィルターでろ過して回収した。
〔細胞調製法 B〕
1 6 2 0週 4例、 4 0 w 5例について以下のように実施した。
羊膜上皮を裏打ちする羊膜結合組織基底層から羊膜上皮細胞のみを選択的に 回収するために碁底層を選択的に分解する蛋白分解酵素 Dispaseを用いた。羊膜 袓織は酵素の浸襲を容易にするため 1 0— 2 O cin2のサイズに鋭利な外科手術用 .メス又はハサミによって断片化し羊膜 1 0 cm 2当たり l ml となるように、 HEBS で 4 0 %に希釈した Dispase液に浸し 2 5Cで 3 0-4 0分間保温した。本条件下 .では細胞は単一細胞として分散せず、上皮細胞塊として基底層から剥離した状態 になるため適度な振動によって容易に上皮細胞塊だけを選択的に回収できた。 こ の細胞塊を培養液に懸濁し 1 G (自然放置） 1 - 5分で細胞塊沈澱洗浄を 3回繰り • 返し、 混入の可能性がある血球、 リンパ球、 間様組織由来の繊維芽細胞などの i}i ー 胞を除去した。 純ィヒした羊膜上皮細胞は 5- 1 5 0個 （Ψ-均 8 5の細胞集団 (細胞塊〉 として分離されるが、 細胞塊のサイズは例えば先端開口部が 3- 5删 径のチップを装着したピぺットによる溶液中での機械的細胞分散によって調製 できる。細胞塊はまた目的に応じて 0. 01%EDTAを含む 0. 1%トリプシンによって単 —の細胞に分散して得ることが可能である。本方法によって高度に純ィ匕した 0ct4 発現細胞を含む羊膜上皮細胞粲団を準備することが出来る。
〔細胞培養〕
羊膜上皮細胞は殆どの上皮細胞に適した次に記 る培養液で培養した（太田 等， 1997 ; 国村等， 1998)：容量比 1 ： 4で混合したダルベッコ変法ィ一ダル培地 (DMEM)とハム MCDB153培地に'、ヒドロコルチゾン（0.2 · M)、上皮增殖因子（EGF) (10 ng/ml), エタノールァミン（5 μΜ)、 ο-ホスホエタノールァミン（5 juM)、 ト ランスフェリン（10 μ Μ)、 インシュリン（5 w g/ml)、 bFGF(5- 10 ng/ml〉牛脳下垂 体抽出液 （150 ig/mlタンパク量） を補充したものを用いた。 、
[髙密度培養〕
高^度培桊法ば成体幹細胞などの長期生存細胞の維持に好ましいが（特許文献 2〉、 この方法は ES及び ES様細胞の未分化状態の維持にも好ましく極めて有効 である。 この手法は [0 033]— [0 0 3 7]に記載、及び [0 0 4 3]に記載の培 養液との組み仓わせで用いるのが特に好ましく、 ここ fこ記載した培養液のいずれ も使用出^るがこれらに限定されるものではない。
[RT PCRとプライマー〕
培荬した HAE細胞から TRIZOULife Technolgies)を製造会社の提供する方法に 従って全細胞 RNAを抽出した。 標的 mRNAは次のプライマーの組み合わせを用い て PdR法で增幅した。
各標的遣伝子 mRNA配列增幅プライマーセットの配列は下記の通りである（Wei JP,. Zhang TS, Kawa S et al. , Transplantation 2003; 12:545-552〉。
nest in, forward: AGAGGGGAATTCCTGGAG (配列番号 1 )
nestin, reverse: CTGAGGACCAGGACTCTCTA (配列番号 2)
0ct4, forward: GAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG (配列番号 3 )
0ct4, .reverse: CAAGGGCCGCAGCTTACACACATGTTC (配列番号 4)
cytokeratin (CK) 19, forvrard: ATGAGGAGGAAATCAGTACG (配列番号 5)
•cytokeratin (CK) 19, reverse : TCCAAGGCAGCTTTCATGCT (配列番 6)
albumin, forward: CGTCGAGAGCACACAAGAG (配列番号 7)
albumin, reverse: CAGCAGTCAGCCATTTCACC (配列番号 8)
glut-2, forward: CCTGTTTATGCAACCATTGG (配列番号 9)
glut-2, reverse: GCAGCAGGACGTGGTCCTTG (配列番号 1 0)
ChromograninA, forward: CCGCTGTCCTGGCTCTTCT (配歹 U番号 1 1 ).·
ChromograninA, reverse: CCGCTGTGTTTCTTCTGCTG (配列番号 1 2)
未分化ヒト ES細胞株で発現する各標的遗伝了- mRNAは次のプライマーの組み合 わせを用いた。 プライマーセットの配列は以下の通りである（Bhattacharyaet al. Blood 2004； 103:2956-2964)。
hCx43 forward, TACCATGCGACCAGTGGTGCGCT (配列番号 1 3)
hCx43 reverse, GAATTCTGGTTATCACGGGGAA (配列番号 1 4)
hCx45 forward, CTATGCAATGCGCTGGAAACAACA (配列番号 1 5)
hCx45 rcvcrase, CCCTGATTTGCTACTGGCAGT (配列番号 1 6)
Pro-galanin forward, AAGGAAAAACGAGGCTGGAC (配列番 g.l 7) lJro-galanin reverse, . GGACCTGTCAMGCTTCCTG (配列番 1 8 )
Nanog forward, AGTCCCAAAGGCAAACAACCCACHC (配列番号 ,1 9 )
Nanog reverse, ATCTGCTGGAGGCTGAGGTATTTCTGTCTC (配列番号 2 0 )
ABCG2 forward, GTTTATCCGTGGTGTGTCTGG (配列番号 2 1 )
ABCG2 reverse, CTGAGCTATAGAGGCCTGGG (配列番号 2 2 )
hRexl forward, TGAAAGCCCACATCCTMCG (配列番号 2 3 )
hRexl reverse, CMGCTATCCTCCTGCTTTGG (配列番号 2 4 )
ヒ トアミラーゼ遣伝子の 現は三種類の組織型アイソザィムを区別する三種 類のプライマーセット（#1, #2, #3)を用いる Hokari等（Hokari S， Miura K, Koyama I et. al. , Cl in Chira Acta 2002； 322: 113-116) の手法に準じて解析した。 使用したプライマーセットの配列は下記の通りである。
primer ifl, forward: GCTGTGAGTGCAGGAACMG (配列番号 2 5 )
primer #1, everse: TTGAATTCAGTCACCCGGCC (配列番号 2 6 )
primer #2, forward: AATTGATCTGGGTGGTGAGC (配列番号 2 7 )
primer ί!2, reverse: CTTATTTGGCGCCATCGATG (配列番号 2 .8〉
primer «3, forward: ACTTGTGGCAATGACTGG (配列番号 2 9 )
primer #3, reverse: GAGGATATGCATTTAATTTT (配列番号 3 0 )
RT-PCT?によって增幅した cDNA産物は Tris-Borate- EDTA 2¾ァガロースゲル上 で電気泳動によって分離し、ェチジゥムブ口マイドの存在下で視覚化し決定した。 〔免疫染色と蛍光測定顕 «〕 ： 免疫染色用の羊膜組織検体は 1 0 %ホルマリンによって一昼夜 ©定し通常の -パラフィン包埋過程を経て準備した。 4ju raの厚さの組織切片を作製し、通常の組 織学的手法による手順で処置し、 次に述べる免疫祖織学的染色過程を進めた。膜 透過性処理を施す場合は組織または細胞標本を 1 0 %ホルマリンで固定し 0, 2 Tri ton X- 100で 5分間膜透過処置を経て 3¾ 02に 30分浸した。 免疫組織化 学的染色法は Histof ine SAB-P0 kit (Nichirei)を用いる streptoavidin- biotin SAB ¾を採用した。 抗原-抗体複合休の視覚化はニッケル触媒で増幅する 3, 3 -diaminobenzidine reaction (Sigmajで行つ rこ。 0ct4 体はマウスモノクロ ーナル抗体（clone C10, SC-5279; Santa Cruz Biotechnology)を使用した。 抗ネ 'スチン抗体は rabbit anti-nestin polyclonal antibody (H- 85, SC- 20978〉を使 用した。 CK19とアルブミンの二重染色は、培養した HAE細胞をリン酸緩衝液（PBS) で洗浄し 4¾ paraformaldehydeで 1 0分間固定し、 0. 2%Triton X- 100で 5分処理 し、 さ に 0. 2%Tween-PBSで洗净し Dako Protein Block Serum Free (DAK0 Japan Co. )でプロッキングを行った。使用した一次抗体は次のような希釈率で使用した。 mouse anti-human CK19 monoclonal (1 : 100) (Sigma) およひ sheep ant i -human albumin polyclonal (1 :50) (SeroLic)0 各々の二次 体は Cy™3— conjugated goat an ti -mouse IgG (1： 100) (Jackson Inununo Research Labo. ) and Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep TgG (1 : 200) (Molecular Probes) 0
〔実施例 1〕 ヒト羊膜上皮の 0ct4-発現細胞サブセット
正常分娩後 （妊娠 4 0週に相当） に得られたヒト羊膜に生存している Oct4陽 性細胞を同定するために 0ct4抗体による免疫組織化学的染色を行った。 その結 釆、 驚いたことに非常に多くの 0ct4陽性細胞が胎盤の周辺の羊膜上皮層に存在 していることを見い出した。 その場所には 0ct4タンパクを色々なレベルで発現 する細胞が 0ct4が検出されない細胞と共に一群の羊膜上皮細胞集団を構成して いた （図 1左上）。 色々なレぺノレで発現する.0ct4タンパクはその拡大したそれら の領域を精査するとよりはっきりする （ l a、b、c)。 これらの拡大図中の s, m， w, および nは各々、 強く、 .中程度、 弱く、 そして検出なし、 を表す。
これらの 0ct4陽性細胞は、 胎盤がら離れた羊 では稀にしか見つからなか つた （結果示さず)。 本発明者が知る限りこのような 0ct4発現細胞がヒト羊膜に 存在することを免疫組織学的観察によつて直接示す明瞭な証拠を提供したのは 初めてのケースである。 これは直ちに全能性を持つ 0ct4発現幹細胞がヒ トの羊 膜からさらに容易に分離できるかも知れないことを示唆している。それが J能に なると結果的には発生中のヒ ト初期胚の ICM由来の相同な細胞を作製する場合に 比べの様々な倫理的問題点が軽減されることになる。
図 1において、 A. 単層の羊膜上皮の 0ct4陽性細胞の分布。 B. 初代培養 1 2日の》AE細胞中の 0ct4陽性細胞集団。右図は左図中の 0ct4陽性細胞集落部位 の一つ（白の囲い込み部分） の拡大図。 18週 HAE培養細胞集団中に見い出さ -れる 0ct4賜性細胞の分裂直後の免疫染色像。 D. 18週と 4 0週の羊膜から回収 した HAE細胞の增殖能力の比較。 各々の HAE細胞を 1 X 105 / era2の密度でコラ 一ゲンコート培養皿に播種 （0日） した後、継代培養し三代目 （27日） までの増 殖紬胞の集積数を各々示す。
〔実施例 2〕 0ct4陽性細胞の培赛
HAE細胞の特性を調べるために、本発明者は TH常分娩後のヒト羊膜から HAE細 胞を効率良くしかも可能な限り多く回収することを試み、ほぼ一検体当たり x lO7 -xlO8レベルの HAE細胞を再現性よく集めることができた。 回収された 胞の増 殖特性を調べるために本 明者は HAE細胞の増殖に都合の良い培地として二つの 基本培地を混合したものを使用した。 この培地は HAE細胞を 6週間にわたって増 瘫させることができ、 その問の增えた全細胞数はほぼ 3 0倍に達した。 RPMI1640 などの他の培地に比べはるかに HAE細胞の増殖には適していた。 し力 しながら、 細胞の増殖は 5 - 6回の継代を限界として全細胞数の增大は停止した。 次に木発 明者は， 0 4陽性の細胞が回収され培養条件下に存在するかどうかを調べるため に初代培養 HAE細胞に 0ct4抗体を用いて同様に免疫細胞化学的に染色した。 そ の結果、 初代培養数日後の HAE細胞集団のなかに 0ct4陽性細胞が散在すること が認められた。 さらに本発明者は 0ct4タンパクの発現レベルが 0ct4陽性細胞間 で様々であることに気がついたが、 これは羊膜上皮 »中で見い出した 0ct4発 現状態と同じで、 培養された細胞でも 0ct4の発現に強弱のあることが明らかに なった。
0ct4細胞の培養条件下での運命を調べるために、 養継代時ごとの HAE細胞に 対して 0ct4抗体による免疫染色をおこなった。 その結果、 0ct4陽性細胞は継代 培養期間屮にも失われず培養条件下で維持されることがわかった。 さらに與味あ ることに Oc 陽性細胞はクローンを形成するように増殖し、 0ct4を発現しない HAE細胞集団中で小さなコロニーを形成しているようであった。このことは、 0ct4 陽性 ΠΑΕ細胞は培養条件下である程度自己増幅できる能力があることを強く示唆 するものである。
微少コロエーのサイズはまちまちであつたが、 微少コロニー中の 0ct4陽性細 胞の数は初代培養 1 2日目では平均 9個 （最大 1 4個)、 二次 ^養 7 H目では平 均 1 4個 （最大 1 9個）、 そして三次培赛 8日目では'平均 1 0個 （最大 1 6俩） であった。 これらの結果 0ct4発現 HAE細胞は継代培養期間を通じて少なくとも 1ヶ月は分裂能力を 持していることを示している。
〔実施例 3〕 初期胎児期 I,こおける羊膜上皮細胞での 0ct4発現細胞
次に本発明者はより発生の初期の胎児の羊膜にも同様に 0ct4発現羊膜細胞が 存在しているかどうかを調べることにした。妊娠 1 6— 1 8週の羊膜の免疫染色 をしたところ、 0ct4陽性細胞が単層の羊膜上皮層に存在し、 しかも調べた限り羊 膜ト.皮層のどの領域にも広く分布することを見いだした。 これらの羊膜から回収 した HAE細胞は前述した培養条件下で活発に増殖しだ。 2週間培養したこの細胞 の Oct4抗体による免疫染色を施すと 0ct4陰性の HAE細胞集団の中にかなりの数 の集団を形成している 0ct4陽性細胞を同定した（図 3 )。 さらに、 0ct4陽性細胞 の細胞分裂像 （分裂後期） が認められたことから、 培養された 0ct4発現羊膜上 皮細胞は生体內と同様に細胞分裂する能力があることを示してい.る （図 30。 注 目すべき点は分裂後期にある細胞核は両方とも同等に 0ct4 ド主であることで、 このことは 0ct4発現羊膜細胞は培養条件下で等分裂することも示している （図 3 C矢印〉。これらの結果は Oct4発現羊膜上皮細胞は 0ct4発現に関して言え^ ί自 己再生能力を持ち、培養条件下で幹細胞の増幅をもたらすはずであるということ を意味している。
妊娠 1 8週と分娩後の羊膜細胞の増殖能力を比較してみると 1 8週の羊膜細 胞は 4 0週期の羊膜細胞より遥カ こ強い増殖活性を示した。 しかしながら、 これ' らの細胞の継続的な培養にともなって全体の ΗΑΕ細胞の数が増えるに従い Oct4 陽性細胞の比率が減少したが、 これは培養中の分化細 USが蓄積したためであり、 0ct4細胞の絶対数が滅少したためではないと推定された。
なお、 図 3において、 A. 単層の羊膜上皮の 0ct4陽性細胞の^^布。 B. 初代 培養 1 2日の HAE細胞中の 0ct4陽性細胞集団。右図は左図中の Oct4陽性細胞集 蔡部位の一つ （白の囲い込み部分） の拡大図。 C. 18週 HAE培養細胞集団中に見 い出される 0ct4陽性細胞の分裂寐後め免疫染色像。 D. 18週と 4 0週の羊膜か ら回収した HAE細胞の増殖能力の比較。 各々の HAE細胞を 1 X 105ゾ cm2の密度 でコラーゲンコー卜培養皿に播種 ( 0日） した後、維代培養し三代目 （27日） ま での増殖細胞の集積数を各々示す。
〔実施例 4〕 HAE細胞の多分化能力に関連した指標となる遣伝子発現 培養された HAE細胞の分化の特性を調べるために、 0ct4に加え、ネスチン、 ァ ル、ブミン、 CK19などのいくつかの細胞特異的な分化指標を raRNAレベルで検討す るため RT- PCRを実施した。 その結果は、 培養した HAE細胞は色々な異なった細 胞種を構成するようになるが、それはおそらく神経細胞や肝臓細胞への分化が伴 つている。 ネスチン mRMの発現は個体差があるもののほんのわずかしか検出さ れなかったが、胎児の成長過程（例えば 1 6週と 4 0週の比較） においてもその 差はなかった。免疫染色によってもネスチン陽性細胞はほんのわずかしか検出さ れなかったこととも一 IH*る。それに比べ、 0ct4raR Aの発現レベルは 1 6週の羊 膜由来の HAE細胞では 4 0週に比べ 5 - 6倍高かったが、おそらく回収ざれた HAE 細胞屮の 0ct4発現細胞の数の差を反映しているものと考えられる（図 2を参照)。 免疫染色はまたアルブミン生成細胞を同定したが、こ は肝臓細胞の存在を示唆 している。 し力-しながら、 アルブミン陽性細胞にはサイトケラチン（CK) 19を同 時に発現していることが共焦点レーザー顕微鋭によって示されたので、おそらぐ アルブミン産生細胞は肝細胞そのものではなく胆管上皮細胞であると考えられ 50
図 2において、增潲曲線は前飽和細胞密度（9 5 %) の HAE細胞を C トリプ シン一 0. 01¾EDTAで分散し継代培養くり返し、 集積した全細胞数をブロットした もの。各点は培養皿 3枚の平均値で偏差値 5 %以內。 p卜 5は継代した時点 （横軸 は培養開始からの日数)。 ,Β. 培養条件下での 0ct4陽性細胞。 免疫細胞化学的に. 検出された 0ct4-陽性 HAE細胞。 · s, in, w, nは各々免疫染色による 0ct4陽性 の程度、 強い、 中程度、 弱い、 なし、 を表す。 C. 各継代時 （P1-P3) 9 5 %飽和 細胞密度時のコ口ニー状に增雍した 0ct4陽性細胞紫団。（詳細は本文参照)。 D. 各 継代時 (PI- P3〉の 1 2個の 0ct4陽性コロニーに含まれる 0ct4陽性細胞数の平均値 を各々示す。 .
〔実施例 5〕 神経内胚葉性細胞の指標の発現
本発明^はまた培養した HAE細胞に神経內胚葉性の細胞マ一カー、 すなわち aray 1 aseや chromogr aninnA (CgA)および glut2などが発現させられるかを,ベた。 amylaseに関してはヒトでは 3つの IsQzymesが知られており顎下腺、膝臓および 肝臓タイプのものである。それに対応する遣伝子はそれぞれ Ainyi, Amy2Aと Amy2B である。 プライマーセット #1と #2を用いて増幅される cDNAは Haellによる制限 消化によって膝臓タイプから肝臓タイプを区別できたので、培赛 では分化する 肝臓細胞が存在していてもよい（図 5 A、 B)。その他の分化指標を調べるために、 本発明者は陴臓細胞特異的な遣伝子発現を同定することを試みた。 しかしながら、 インスリンもグルカゴンも検出できなかったので、成熟した脾臓の 0細胞と α細 胞の証拠は'得られなかった。 そのかわりとして、 共に神経内胚葉細胞の指標とさ ' れる CgAと glut2の発現を検出した。 これらの二つの遺伝子はニコチンアミ ド存 在下で高いグルコース濃度（8mM以上）で誘導をかけた後に検出された（図 6八)。 さらに、 CgAと glut2の mRNAは共に 5 - 6日間の培養の後に検出されたので、睇 臓への分化は、不完全ながら、 時間と共に進むと考えられる。 この誘導の過程は -コチンアミドと高いグルコース濃度による効果に依存しない。
なお，図 5において、 A. RT-PCRによって 4 0週羊膜由來 ΗΑ 培養細胞中の肝 細胞型ァミラーゼ mRNAの検出。図 Bに示すような增幅される三種類の cDNA (a, b, c) が異なつた三種類の制 P及酵素によって切断されるかどうかによって細胞型を 決定される。 B. 特異的な種類の細胞型 mRNAの決定には異なった二種類のブラ イマ セットによって增幅される三つの cDNA部域 （#1, #2, #3; 図 A中の 各々 a, b, cに対応する） が各々矢印で示した Pstl, Haell, BamHl部位で切断された かどうか （oまたは X) で判定し、 HAE細胞は肝臓型であると決定された。
- また、 図 6において、 4 0週 HAE培養細胞に検出された CgAと glut2の発現。
A. ni cotinamideが存在する条件でグルコースの濃度に依存して誘導された CgA と glut2の niRNAo B. CgAおよぴ glut2の誘導はともに誘導時間依 的である。
CgAは弱いながらも ni cotinamideと高い港度の glucoseが存在すると一週間で発 現の亢進が認められた。
〔実施例 6〕 . 羊膜中に存在する 0ct4陽性細胞の起源と運命
ヒト羊膜中の 0ct4陽性細胞の運命は実際のところ不明であるが、 その幾らか は羊膜上皮層から剥がれて羊膜腔にあるのが分かるように羊水細胞になる （図 7 A) o そのまたいくらかは羊水中に Oc 陽性細胞として長く生きる能力を残して いるかもしれない （図 7 B右図)。 本発明者はこれらの羊膜上皮層中の 0ct4発現 細胞の他にも胎盤と区別されるヒト羊膜間菜組織中にも 0ct4陽性細胞が含まれ ていることが、 上皮眉程ではないが、 確認した （図 7 C, 四角で区切った領域)。 典型的なこれらの a, bの二つめ領域にある拡大した図は羊膜上皮層と胎盤組織 の間にある間葉組織の間質の中に孤立して存在する 0ct4陽性細胞を示す（図 7 a と b)。 これらの免疫組織化学的観察はヒト羊膜には多くの可能性を秘めた 0ct4 を色々なレベルで発現する羊膜上皮細胞サブセッ卜が存在することを示したも のである。
なお、 図 7において、 羊膜上皮のみならず羊膜間菜組織および羊水中にも免疫 組織化学的に 0ct4陽性細胞が同定される。 軽くへマトキシリン染色がしてある ため細胞核が陰性細胞では青または紫で、 陽性細胞は茶または褐色である。 ん 羊膜上皮層から羊膜腔に脱落したように見える 0ct4陽性細胞 (矢印 a)。 矢印 b および c は各々単層の羊膜上皮に存在する 0 4陽性と陰性細胞。 B. 羊水細胞 ：中として存在する 0ct4陽性細胞（矢印 b)。矢印 aは羊膜上皮層上の Oc 陽性細 胞。 C. 羊膜間葉組織層に存在する 0ct4陽性閒葉細胞。右の図 aおよび bは各々 左図の領域 aと bに対応しており、 間質組織中に核が褐色に 色された 0ct4陽 性間葉細胞が明瞭である。 [実施例 7 ] 髙密度培養法による神経細胞の特異的誘導
羊膜上皮細胞の高密度培養によって得られる神経分化誘導可能な前 ite細胞の 取得。 [ 0 0 4 5 ]に記載の方法により取得した羊膜上皮細胞を [ 0' 0 4 3 ]に記載 の方法によってコラーゲン IVでコーティングした培養皿に細胞塊（図 1 2 A) ま たはドロプレツ卜法によって細胞を播種し細胞間相互作用を保持した細胞シ ト状を維持させながら長期培養に供した （図 1 2 B)。細胞がシート状に高鈉胞密 度を保持して増殖状態を維持しているいずれの段階にかかわらず分化誘導は可 能であるが、特に例示されるのは、高細胞密度を保持しつつ 4週間以上 養を継 続しシー卜状に成長した細胞を、 Dispase酵素液を 4 0 %になるように培養皿に 加え、 シート状に進展した細胞層を剥離後、 培養皿 島状に残存した細胞群が見 いだされるが （図 1 3 A) これらの細胞群は retinoic acid を 1 0〜： 1 0 0 · Μ の濃度で 6時間以上処理することによって髙頻度に神経細胞特有の突起形成が 認められ （図 1 3 B、 0、 伸長した突起部分も含め、 全ての突起形成細胞に神経 細胞特異的ェノラ一ゼが免疫染色によって検出された（図 1 3 D)。
[実施例 8 - 1 0 ]
実施例 8において、 妊娠 1.8週と 4 0週 （出産直後） の羊膜上皮細胞が発現し ている未分化細胞特異的発現遗伝子 （ES細胞で発現） の種類を fiT-PCKで確認し た。 ヒ ト ESと共通する 7種類全ての発現が確認された （図 8参照)。
実施例 9において、 ヒ トの出産直後 （妊娠 4 0週） の臍帯 （Unbilical cor 、 羊膜 （Amniotic membrane)、 胎盤 (Placenta) の組織切片像 （ェォシン染色） を 染色してた写真を撮影した （図 9 )。 図 1に記載した Oc 陽性細胞の免疫組織染 色は Amn i ot i c epi the 1 ium矢印 aの部分。 0ct4陽性細胞が特に高頻度に検出され るのは、矢印 bから aの領域の羊膜上皮で、臍帯（上皮）と胎盤とは区別される。 実施例 1 0において、 羊膜からの 0ct4発現細胞の回収率に関する結果。 回 収した羊膜上皮細胞を一度培養した後、 全細胞中に占めるに 0ct4発¾細胞の割 合を調べた。その結果、 0ct4陽性細胞の割合は 16週の羊膜で 90%、 18週の 羊膜で 70〜80%、 40®の羊膜で約 20%であった。 Κίβ7は羊膜細胞中の増 殖期の細胞の割合を示す。 *Ki67細胞数未測定。 培赛前の 0ct4発現細胞の割合 は 40週の羊膜で 1〜5%程度であると推定される。 培養により 0ct4陽性細胞 が濃縮された。 産業上の利用可能性
本発明によると、従来胚から取得されていた ES細胞と同等のレベルの O c t 4発現細胞を胚以外の組織、すなわち羊膜上皮層の特定部位から免疫染色法によ り測定した Oc t 4陽性細胞の採取細胞全体に対する割合 （Oc t 4+ (%)) が 0. 001〜 100 %という高密度で含む細胞群を得ることが可能となる。 . また、得られた細胞をその性質を変化させることなく培養することが可能とな る。
0ct4 は多分化能力を持つ細胞の未分化状態の維持に関係するマーカータンパ ク質であることから、このタンパク質を発現する細胞は再生医療などに利用する ことができる。

Claims

誚求の範囲
1, 羊膜上皮層から採取された Oc t 4発現細胞を含む細胞群であって、 免疫染色法により旗 0定した O c t 4 |4細胞の採取細胞全体に対する割合（O {： 14+ (%)) が0. 001 100%の範囲であることを特徴とする Oc t 4 発現細胞を含む細胞群。
2. Oc t 4陽性細胞の採取細胞全体に対する割合が 1. ひ 0〜： I 00 %の範 囲であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の Oc t 4発現細胞を含む 細胞群。
3. 前記免疫染色法により測定した細胞を RGB画像データとして取り込み、 CMYK値に変換した際の K値の範囲が 5000以上、 9000未満の筘囲にあ る OCT 4発現細胞が全 Oc t 4発現細胞の 10%から 100%の範囲である ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群。
4. 前記羊膜が満期出産時の羊膜であって、 前記細胞群が胎盤側 10%までの 範囲の羊膜上皮眉から採取したものであることを特徴とする請求の範囲第 1項 に記載の O c t 4発現細胞を含む細胞鮮。 ，
5. 前記羊膜が 20週以前の羊膜であって領域を限定しない'羊膜の前領域から 採取されたも であることを特徴とする請求項 1から請求項 3のいずれか 1項 に記載の Oc t 4発現細胞を含む請求の範囲第 1項に記載の Oc t '4発現細胞 を含む細 群。
6 前記細胞群が胎盤方向に向かって連続的に増加し胎盤から臍帯基部に連続. する領域から採取したものであることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の Oc t 4発現細胞を含む細胞群。
7 前記羊膜が満期出産時の羊膜であって、羊膜 Z臍帯接合部から採取された◦ c ΐ - 4発現細胞を含む請求項 1から請求項 3のいずれか 1項に記載の細胞群。
8 前記細胞群が淡白分解酵素ディスパーゼにより.羊膜上皮細胞と羊膜結合組 織を特異的選択的に分離して得られたものであることを特徴とする請求の範囲 第 1項に記載の◦ c t— 4発現細胞を含む細胞群。
9 請求の範囲第 1項に記載の O c t 4発現細胞を含む細胞群を取得する O c t 4発現細胞を む細胞群の取得方法であって、タンパク質分解酵素ディスパー ゼにより羊膜上皮細胞ど羊膜結合組織を特異的選択的に分離する丁-程を含むこ とを特徴とする Oc t 4発現細胞を含む細胞群の取得方法。
10 請求の範囲第 1項に記載の記載の O c t 4発現細胞を含む細胞群を培地 上で培養する丁-程を含む、 Oc t 4発現細胞の培養方法。
1 1 前記培地がダルべシコ変法ィ一ダル培地とハム MCDB153培地とを混合し、 ヒ ドロコルチゾン、 上皮増殖因子、 エタノールァミン、 0-ホスホエタノールアミ ン、 トランスフ リン、 インシュリン、 bFGF、及び/または。 牛脳下垂体抽出液 を加えたものであることを特徴とする請求の範囲第 1 0項に記載の培養方法。
1 2 前記ダルべ V 変法ィ一グル培地とハム MCDB153培地との混合比が 1 ： 9 〜1 ： 4であることを特徴とする請求の範囲第 1 1項に記載の培養方法。
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