CN115463260A - 一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 - Google Patents
一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115463260A CN115463260A CN202211316651.2A CN202211316651A CN115463260A CN 115463260 A CN115463260 A CN 115463260A CN 202211316651 A CN202211316651 A CN 202211316651A CN 115463260 A CN115463260 A CN 115463260A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- collagen sponge
- amniotic
- amniotic epithelial
- chemotherapy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000515 collagen sponge Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 210000003425 amniotic epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 48
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 206010036601 premature menopause Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 208000017942 premature ovarian failure 1 Diseases 0.000 claims abstract description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 30
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 27
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 claims description 26
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 claims description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 26
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 22
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 12
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims description 8
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 claims description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 6
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 abstract description 10
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000036512 infertility Effects 0.000 abstract description 6
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 abstract description 5
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 2
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 abstract description 2
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 6
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 4
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 4
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 4
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 4
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
- A61L27/24—Collagen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，涉及生物技术领域，包括以下步骤：羊膜组织的处理；羊膜上皮细胞的培养；羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备。上述制备方法操作简单、成本较低且可控性强，羊膜上皮细胞外泌体能显著增加化疗损伤卵巢卵泡数量，抑制化疗药物诱导的卵巢急性血管损伤及颗粒细胞凋亡，部分抑制化疗药物诱导的原始卵泡激活，因此可用于修复化疗损伤后的卵巢功能、减轻化疗药物对卵巢的损伤、防治化疗药物引起的卵巢早衰或防治化疗引起的不孕不育。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用。
背景技术
源于胎盘羊膜组织，表达干细胞标志分子及相关基因，但不表达端粒酶基因，具有非致瘤性，同种异体移植后不发生免疫排斥反应，同时还可分泌免疫抑制因子，防止移植后炎性反应的发生，因此可以看作是免疫赦免细胞。羊膜上皮细胞具有多能干细胞特性和向三胚层细胞分化的潜能，免疫原性低，移植后无致瘤性，伦理道德问题少，取材方便、来源丰富、是细胞治疗较理想的种子细胞来源。
羊膜上皮细胞胶原海绵复合体不同过静脉注射，也无需手术，操作难度小，可由患者在家独立完成，风险相对较小且CK-19、bFGF、Nanog、GFAP、mRNA、Nestin表达均呈上调趋势，其中Nestin表达上调的差异有统计学意义。
羊膜上皮细胞胶原海绵复合体是一种具有生物活性的填塞物，其保存环境要求高，效期短，目前的保存想达到最佳的治疗效果，仍然只能采取个性化预定的模式。另外，部分对胶原蛋白过敏的患者可能会引起局部的过敏反应。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
本发明解决技术问题采用如下技术方案：
本发明提供了一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到70％-80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
优选地，所述S8接种到培养瓶中4-6％CO2，35-38℃培养。
优选地，所述S9细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min。
优选地，所述完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
优选地，所述S9中细胞融合度达到70％-80％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
优选地，所述S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本发明还提供了一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明人羊膜上皮细胞外泌体能显著增加化疗损伤卵巢卵泡数量，抑制化疗药物诱导的卵巢急性血管损伤及颗粒细胞凋亡，部分抑制化疗药物诱导的原始卵泡激活，因此可用于修复化疗损伤后的卵巢功能、减轻化疗药物对卵巢的损伤、防治化疗药物引起的卵巢早衰或防治化疗引起的不孕不育。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到70％-80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中4-6％CO2，35-38℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到70％-80％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
实施例1.
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到70％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到70％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中4％CO2，35℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到70％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到70％-80％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
实施例2.
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到780％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞3min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中4-6％CO2，35-38℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到80％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
实施例3.
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到75％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到75％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到75％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2.5min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到75％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
实施例4.
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到70％-80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到72％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中5％CO2，36℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到72％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到72％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
实施例5.
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到78％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到79％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
本实施例的S8接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养。
本实施例的S9细胞融合度达到78％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞3min。
本实施例的完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
本实施例的S9中细胞融合度达到78％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
本实施例的S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
本实施例的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
接种到胶原海绵后，细胞充满胶原海绵支架上及孔洞中，仍然呈扁平多角形，轮廓清晰，细胞及细胞核成长梭形，与传统培养相比细胞直径变小，在胶原海绵中沿支架孔洞表面生长良好，于孔洞中可见“悬浮”细胞，细胞伸出突起与胶原支架相连，覆盖在支架孔洞表面的细胞大多胞体隆起成球形，更贴近体内生长环境。在支架及孔洞中生长的细胞均呈较活跃的有丝分裂状。
胶原海绵后与传统培养相比CK-19、bFGF、Nanog、GFAP、mRNA、Nestin表达均呈上调趋势，其中Nestin表达上调的差异有统计学意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将足月健康产妇的羊膜组织用手术剪剪下后收集到离心管中；
S2、用生理盐水漂洗3遍；
S3、用手术剪将羊膜组织剪成靡状；
S4、按1：1的比例加入0.25％胰酶消化30min；
S5、加入胰酶等体积的完全培养基终止消化；
S6、200目滤网过滤收集滤液到新的离心管中；
S7、1500rpm/min离心10分钟，去上清；
S8、完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶培养，3天换液一次；
S9、当细胞融合度达到70％-80％时，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到培养瓶中5％CO2，37℃培养；
S10、将胶原海绵平铺于D15cm培养皿中，加入30ml完全培养基充分浸润备用；
S11、待S9中细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min，等体积完全培养基终止消化，离心去上清，完全培养基重悬沉淀，接种到S10中浸润好的胶原海绵培养皿中5％CO2，37℃培养，4天后收集胶原海绵为羊膜上皮细胞胶原海绵复合体。
2.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，所述S8接种到培养瓶中4-6％CO2，35-38℃培养。
3.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，所述S9细胞融合度达到70％-80％时，用0.25％胰酶消化贴壁细胞2-3min。
4.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，所述完全培养基配方为：Hyclone MEMα95％+HELIOS血替5％。
5.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，所述S9中细胞融合度达到70％-80％时，Keratin染色呈阳性胞浆棕黄色，苏木素复染的核呈蓝色，培养的细胞为上皮细胞。
6.根据权利要求1所述的一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法，其特征在于，所述S11获取羊膜上皮细胞胶原海绵复合体前取完全培养基内毒素、无菌检测均为阴性。
7.一种如权利要求1-6任一项所述羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法在卵巢早衰的治疗、化疗后卵巢血管损伤的修复、化疗后卵巢功能的修复中应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211316651.2A CN115463260A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211316651.2A CN115463260A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115463260A true CN115463260A (zh) | 2022-12-13 |
Family
ID=84337992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211316651.2A Pending CN115463260A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115463260A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100266553A1 (en) * | 2007-11-09 | 2010-10-21 | Rnl Bio Co., Ltd. | Method for isolating and culturing adult stem cells derived from human amniotic epithelium |
| US20120141595A1 (en) * | 2009-08-25 | 2012-06-07 | Tissuetech, Inc. | Umbilical cord amniotic membrane products |
| CN111053949A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-24 | 杭州恩格生物医疗科技有限公司 | 一种宫内膜干细胞复合脱细胞羊膜的制备方法及应用 |
| CN111593017A (zh) * | 2019-02-19 | 2020-08-28 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用 |
-
2022
- 2022-10-26 CN CN202211316651.2A patent/CN115463260A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100266553A1 (en) * | 2007-11-09 | 2010-10-21 | Rnl Bio Co., Ltd. | Method for isolating and culturing adult stem cells derived from human amniotic epithelium |
| US20120141595A1 (en) * | 2009-08-25 | 2012-06-07 | Tissuetech, Inc. | Umbilical cord amniotic membrane products |
| CN111593017A (zh) * | 2019-02-19 | 2020-08-28 | 中国福利会国际和平妇幼保健院 | 人羊膜上皮细胞外泌体在制备修复卵巢功能药物中的应用 |
| CN111053949A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-24 | 杭州恩格生物医疗科技有限公司 | 一种宫内膜干细胞复合脱细胞羊膜的制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王颖倩等, 中国临床解剖学杂志, vol. 30, no. 5, pages 533 - 538 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20110217385A1 (en) | Method for extracting mesenchymal stem cell from human or animal embryo and for extracting the secretion product thereof | |
| P De Miguel et al. | Cornea and ocular surface treatment | |
| CN109627315B (zh) | 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 | |
| CN107349418B (zh) | 一种碱性成纤维细胞生长因子组合物及其制备方法、生发剂及其制备方法和使用方法 | |
| CN107384857A (zh) | 自体脂肪间充质干细胞的培养方法和使用的培养基 | |
| AU2007265862A1 (en) | Soft tissue filler composition comprising autologous dermis-derived cell culture product and hyaluronic acid | |
| CN108004207A (zh) | 从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法 | |
| WO2016114781A1 (en) | Repair and rejuvenation of tissues using platelet-rich plasma | |
| CN107858329A (zh) | 从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法和使用的试液 | |
| CN115322964B (zh) | 一种3d培养羊膜间充质干细胞种子库构建方法 | |
| CN111920828A (zh) | 基于脐带间充质干细胞用于毛发再生的冻干粉、制备方法、生发营养液及毛发再生方法 | |
| CN113041206A (zh) | 一种含间充质干细胞因子的精华液及其制备方法 | |
| WO2019169523A1 (zh) | 一种用于抗衰老修复的干细胞制剂及其制备方法 | |
| CN102552979B (zh) | 一种角膜板层材料的制备方法 | |
| CN107254431B (zh) | 一种新型组织工程皮肤制备方法 | |
| CN113943699A (zh) | 对抗高糖损伤的脐带间充质干细胞诱导液、方法及应用 | |
| CN111821250A (zh) | 抗衰老组合物及其制备方法与应用 | |
| CN102172337B (zh) | 具有皮脂腺样结构的组织工程皮肤及其制备方法 | |
| CN113144221B (zh) | 外泌体制剂及其制备方法和应用 | |
| CN115463260A (zh) | 一种羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的制备方法及应用 | |
| CN116855442A (zh) | 皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用 | |
| CN105695401A (zh) | 一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法 | |
| CN115068593A (zh) | 一种长保质期的高活性间充质干细胞提取液及其制备方法 | |
| WO2022056991A1 (zh) | 脐带来源的间充质干细胞及其制备方法和应用 | |
| CN114469855A (zh) | 一种人脐带间充质干细胞诱导分化为成纤维细胞组合应用技术 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221213 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |