WO2013100215A1 - 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금 치료제 - Google Patents

초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금 치료제 Download PDF

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cells
amniotic fluid
muscle
fluid stem
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임정옥
권태균
전소영
제이 유제임스
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경북대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a urethral sphincter regenerative cell therapy comprising pre-differentiated Amniotic Fluid Stem Cells, and more specifically to amniotic fluid stem cells in vitro, such as muscle, neurons,
  • the present invention relates to an urethral sphincter regenerative cell therapy comprising an initial differentiation into endothelial cells and a combination of the three types of cells as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a composition for the prevention and treatment of urinary incontinence comprising early differentiated amniotic fluid stem cells.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Totipotent stem cells pluripotent stem cells, Can be classified as multipotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a single complete individual. Cells up to 8 cells after fertilization of eggs and sperm have this property. If you transplant it into a single, complete entity. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. Inner cells located inside the blastocyst appear 4-5 days after fertilization. mass, which are called embryonic stem cells, differentiate into a variety of other tissue cells, but do not form new life.
  • Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into specific cells that form tissues and organs that contain these cells. Pluripotent stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al., Nature, 418: 41, 2002) and subsequently identified in other adult tissues (CM Verfaillie, Trends Cell Biol., 12: 502, 2002). In other words, pluripotent stem cells have also been identified from skin, blood vessels, muscles and brain in addition to bone marrow (JG Toma et al., Nat. Cell Biol., 3: 778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301 : 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30: 896, 2002). However, stem cells in adult tissues such as bone marrow are very rare, and these cells are difficult to culture in an undifferentiated state, so pluripotent stem cells are difficult to preserve in vitro after separation.
  • the amniotic fluid of human cells surrounding the fetus can be easily obtained during pregnancy or childbirth, can be proliferated in large quantities and do not form tumors when transplanted into animals like embryonic stem cells.
  • embryonic stem cells since there are no ethical problems with embryonic stem cells, various researches using them as promising stem cells with high possibility of being used for cell therapy have been conducted.
  • autologous muscle tissue, bone marrow, fat, bone, etc. are used as cell sources of stem cells, but most of them are collected by invasive methods, and stem cells that can be obtained by non-invasive methods are accompanied by sequelae caused by bleeding, infection, and damage to organs. A circle is required.
  • amniotic stem cells which do not form a tumor when transplanted into an animal, have no ethical problem in harvesting, and have differentiation capacity, can be differentiated to all organs of the human body, which is an ideal stem for disease treatment. It can be called a cell source.
  • stem cell injection methods have been actively studied as a method of improving urinary incontinence by easily regenerating the urethral sphincter without requiring general anesthesia.
  • the present inventors have made efforts to develop a treatment for urinary incontinence, and as a result, it was confirmed that early differentiated amniotic fluid stem cells are effective for the treatment of urinary incontinence, and in particular, the early differentiation of amniotic fluid stem cells into muscle, nerves and endothelial cells in vitro,
  • the present invention was completed by confirming that there was an excellent urinary incontinence treatment effect when various kinds of cells were combined at an appropriate ratio.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for muscle tissue regeneration including early differentiated amniotic fluid stem cells.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of urinary incontinence comprising initial differentiated amniotic fluid stem cells.
  • the present invention provides a muscle tissue regenerative cell therapy comprising an initial differentiated amniotic fluid stem cells.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of urinary incontinence comprising initial differentiated amniotic fluid stem cells.
  • composition containing amniotic fluid stem cells of the present invention has an excellent muscle tissue regeneration effect and is useful as a therapeutic agent for incontinence.
  • Figure 1 shows the characteristics of the antigenic factors of human amniotic stem cells.
  • FIG. 2 shows the results of initial differentiation of amniotic stem cells into muscle, nerve, and endothelial cells by real-time PCR.
  • Figure 3 is the result of confirming the LPP in the urethral sphincter animal model.
  • Figure 5 is a result of confirming the capillary vessels of the limbic layer regeneration and the urethral sphincter region through H & E and IHC staining in the urethral sphincter animal model.
  • Figure 6 is a result of confirming the expression of genes associated with muscle, nerve, endothelial cell differentiation through real-time PCR in the urethral sphincter animal model.
  • Figure 7 shows the results of confirming the immune response of the initial differentiated amniotic fluid stem cells.
  • Figure 9 confirms in vivo tracking results of the initial differentiated amniotic fluid stem cells through MNPs @ SiO2 labeling.
  • the present invention provides a therapeutic agent for muscle tissue regeneration comprising early differentiated amniotic fluid stem cells.
  • the muscle tissue includes a urethral sphincter.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of urinary incontinence comprising initial differentiated amniotic fluid stem cells.
  • amniotic fluid stem cells are characterized in that the initial differentiation into muscle, nerve, endothelial cells in vitro and then mix them in order to achieve the optimum efficiency.
  • the ratio of the muscle, nerve, and endothelial cells is not particularly limited, but is preferably 6: 1: 1 to 10: 1: 1 in proportion to the number of cells, and more preferably 8: 1: 1.
  • stem cells refers to master cells that can be regenerated without limitation to form specialized cells of tissues and organs.
  • Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells.
  • Stem cells can divide into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one derived (transit) cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.
  • the term 'differentiation' refers to a phenomenon in which a structure or a function is specialized while a cell divides and grows, that is, a cell or a tissue of an organism has a shape or function to perform a task given to each. It means to change.
  • a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems. For example, qualitatively between parts of a biological system that were initially nearly homogeneous, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in population development, or cells such as myocytes or neurons. Phosphorus difference, or as a result, is a state divided into subclasses or subclasses that can be distinguished qualitatively.
  • the term 'cell therapeutic agent' is a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture and special chewing from humans, and functions of cells or tissues. It refers to a medicine that is used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of actions such as proliferating and screening living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or otherwise changing the biological characteristics of the cells in order to restore them.
  • Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to amniotic fluid stem cell therapy.
  • compositions of the present invention can be used to treat urinary incontinence by administration to a patient or animal.
  • urinary incontinence includes, but is not limited to, stress incontinence, urge incontinence, first-class incontinence, and reflective incontinence.
  • the therapeutic composition comprising muscle, nerve, and endothelial cells differentiated initially from the amniotic fluid stem cells or amniotic fluid stem cells of the present invention may be injected into the patient's body in a culture alone or in an incubator, for example Clinical methods published by Lindwald et al. (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) or Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998 can be used.
  • the preparation may include a conventionally pharmaceutically acceptable carrier, in addition to the muscle, nerve and endothelial cells initially differentiated from the amniotic fluid stem cells or amniotic fluid stem cells, and in the case of injections, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers And the like, and in the case of a topical formulation, base, excipient, lubricant or preservative may be included.
  • a conventionally pharmaceutically acceptable carrier in addition to the muscle, nerve and endothelial cells initially differentiated from the amniotic fluid stem cells or amniotic fluid stem cells, and in the case of injections, preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers And the like, and in the case of a topical formulation, base, excipient, lubricant or preservative may be included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the cell therapy of the present invention are those commonly used in the preparation of lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid. Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It is not.
  • the cell therapy agent of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • the cell therapy of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. Or by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulations may then be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oil or aqueous media, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • compositions of the present invention can be administered parenterally, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical application, and preferably in the form of periurethral injection injections.
  • Compositions for parenteral administration of the compositions according to the invention are injected in vivo by dispersing and / or dissolving in pharmaceutically acceptable carriers such as sterile purified water, buffers of about pH 7, or physiological saline. And, if necessary, include conventional additives such as preservatives, stabilizers and the like.
  • the amount of stem cells to be injected in the present invention is not limited thereto, but may be administered as 10 5 to 10 6 cell / sphincter, preferably about 10 6 cell / sphincter may be administered.
  • the dose may be prescribed in various ways, such as by the method of formulation, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to the patient.
  • prevention means any action that inhibits or delays progression of urinary incontinence by administration of a composition of the present invention.
  • treatment and “improvement” refer to all actions in which urinary incontinence is improved or beneficially altered by administration of a composition of the present invention.
  • compositions of the present invention can be administered in combination with therapies conventionally used to treat, prevent or treat urinary incontinence.
  • passage 3 amniotic cells showed a strong positive response to mesenchymal markers (CD44, CD73, CD90 and CD105) and weakly to SSEA-4, and hematopoietic stem marker (CD45) and MHC. It showed a negative response to Class II antigen (HLA-DR) (FIG. 1).
  • HLA-DR Class II antigen
  • c-kit fractionation was performed to obtain one type of stem cell, thereby obtaining about 98.40% of the positive stem cell group in the second round of the fraction.
  • human amniotic fluid stem cells hAFSCs
  • CM conditioned medium
  • Gibco-Invitrogen's medium Gibco-Invitrogen's medium (Grand island, NY) was used for differentiation into myocytes (myogenesis) in conventional media, and ScienCell's medium (Carlsbad, CA) was used for differentiation into neurons.
  • Lonza's medium (Walkersville, MD) was used for endothelial differentiation.
  • CM was obtained from a culture culture primary in human muscle tissue or blood vessels and used to culture neurons purchased from ScienCell.
  • Amniotic stem cells were cultured in each medium for 7 days for initial pre-differentiation.
  • real-time PCR and immunocytostaining were performed according to known methods.
  • mice were treated according to the National Institutes of Health Animal Care Guidelines, which were approved by the Animal Ethics Committee of Kyungpook National University Medical School. All experiments used a total of 40 to 25 mg female ICR mice.
  • All animals underwent aseptic surgery under general anesthesia. Lower midline abdominal incisions were performed, the bladder and urethra were exposed, and the genital nerves on both sides were identified, followed by transection. Another 10 mice were subjected to a Sham operation as a control.
  • the leak point pressure (LPP) and the urethral closing pressure (CP) were measured using a vertical tilt / intravesical pressure clamp model, which is a method known in the art.
  • spinal cord amputation was performed at T9 to T10 levels to eliminate reflex bladder action with increased bladder internal pressure.
  • the bladder was exposed through a midline incision.
  • 50ml of saline was connected to PE-90 tube, and saline was gradually injected to increase the pressure in the bladder.
  • the pressure at the start of the yaw leakage was defined as LPP.
  • the pressure at the point where the urinary leakage stopped due to the decrease in bladder pressure was defined as CP.
  • Three LPPs and CPs were measured and averaged for each experimental animal.
  • LPP values after 2 weeks of cell injection of the ctrl (+), M, MN, MNE and ctrl (-) groups were 36.13 ⁇ 0.38, 36.96 ⁇ 2.60, 31.30 ⁇ 1.38, and 30.84 ⁇ , respectively. 1.79 and 20.75 ⁇ 2.89 cm H 2 O.
  • LPP values were 36.54 ⁇ 1.17, 38.43 ⁇ 1.85, 35.88 ⁇ 0.26, 43.08 ⁇ 0.07 and 26.58 ⁇ 1.87 cm H 2 O, respectively.
  • CP values after 22 weeks of cell injection in the ctrl (+), M, MN, MNE and ctrl ( ⁇ ) groups were 22.68 ⁇ 0.43, 21.84 ⁇ 1.50, 19.89 ⁇ 1.17, 17.20 ⁇ 1, .28 And 10.98 ⁇ 2.46 cm H 2 O.
  • CP values after 4 weeks of cell injection were 25.73 ⁇ 1.08, 28.38 ⁇ 3.09, 23.80 ⁇ 0.86, 28.91 ⁇ 0.58 and 16.83 ⁇ 1.74 cm H 2 O, respectively.
  • mice were sacrificed after LPP and CP measurements to obtain urethral sphincter tissue. Tissue samples were subjected to normal hematoxylin / eosin staining and immunohistochemical staining (IHC) using MyoD, ß-tubulin III and CD31 antibodies. In addition, genes related to differentiation of muscle cells (Pax7, Myf5, MyoD, Myogenein), neurons (vimentin, nestin, Map2, ß-tubullin III) and endothelial cells (Cd34, Cd31, Vegfr2, vWF) through real-time PCR Expression was confirmed.
  • muscle cells Pax7, Myf5, MyoD, Myogenein
  • neurons vimentin, nestin, Map2, ß-tubullin III
  • endothelial cells Cd34, Cd31, Vegfr2, vWF
  • H & E staining confirmed normal rotatory layer regeneration and capillaries of the urethral sphincter region, and particularly, the regeneration of the urethral sphincter was accelerated in a group (MNE) mixed with muscle, nerve, and endothelial cells.
  • MNE group
  • IHC staining FIG. 5
  • the MNE group differentiates muscle cells ( Pax7, Myf5, MyoD and Myogenin ), neurons ( Vimentin, Nestin, Map2 and ß-tubullin III) and endothelial cells (Cd34, Cd31, Vegfr2 and vWf) in real-time PCR results.
  • tissues were isolated two weeks after cell injection and IHC staining was performed using cytotoxic T cell markers (CD8, BD Pharmigen, San Jose, CA). Was performed.
  • the group injected with human fibroblasts as a positive control was used as the apparent surgical group as a negative control.
  • Cell bodies were transplanted by selecting subcapsular kidney as a suitable environment for confirming the therapeutic safety of cells in raw vegetables.
  • Amniotic stem cells were pre-diferentiated for 7 days in vitro and cell bodies (1 ⁇ 10 6 ) were implanted in the left renal subcapsular space of ICR mice. Four weeks later, samples were taken and subjected to normal H & E staining.
  • mice For in vivo tracking of the injected cells, cells labeled with nanoparticles were used. 0.5 x 10 6 cells per group were injected into the urethral sphincter site of female nude mice (weight 20-25 gm, purchased from CB), and 14 days later with a set of filters (Omega Optical, Brattleboro, VT) for FITC attached. Images were confirmed by a Pro imaging system (Princeton Instrument, Trenton, NJ). Images were analyzed using Princeton Instrument software (winview / 32 Metavue) and spectral un-mixing algorithms were used to remove nonspecific auto-fluorescence. As a control group, mice not injected with cells were used, and no fluorescence signal appeared in vivo.
  • mice injected with FITC are easily visualized through the injection site. Fluorescence intensity in the urethral sphincter tissue gradually decreased over time. Compared to the single cell injection group, the composite group injected with a mixture of muscle, nerve and endothelial cells showed a strong and concentrated image. At 14 days after the injection, the fluorescence signal was lost in the single cell injection group, whereas the fluorescence signal was present in the complex group in which the two or more cells were mixed (FIG. 9).
  • the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
  • composition containing amniotic fluid stem cells of the present invention has an excellent muscle tissue regeneration effect and is useful as a therapeutic agent for incontinence.

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Abstract

본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포 (Pre-differentiated Amniotic Fluid Stem Cells)를 포함하는 근조직 재생 세포치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 줄기세포를 체외에서 근육, 신경, 내피로 초기 분화시켜, 상기 세 종류의 세포를 배합한 것을 유효성분으로 포함하는 요도 괄약근 재생 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 조성물은 뛰어난 근조직 재생 효과가 있어, 요실금 치료제로서 유용하다.

Description

초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금 치료제
본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포 (Pre-differentiated Amniotic Fluid Stem Cells)를 포함하는 요도 괄약근 재생 세포치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 양수 줄기세포를 체외에서 근육 (muscle), 신경 (neuron), 내피 (endothelial)세포로 초기 분화시켜, 상기 세 종류의 세포를 배합한 것을 유효성분으로 포함하는 요도 괄약근 재생 세포치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cells)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cells), 전능성(전분화능) 줄기세포 (pluripotent stem cells), 다능성 (다분화능) 줄기세포 (multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포 (totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로, 난자와 정자의 수정 이후 8 세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 속세포 덩이(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.
다능성 줄기세포 (multipotent stem cells)는 이세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다. 다능성 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고 (Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다 (C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 다능성 줄기세포는 골수 이외에 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다 (J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직 내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 미분화 상태로 배양하기 어려워 다능성 줄기세포들은 분리 후 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
한편, 태아를 둘러싸고 있는 사람의 양수줄기세포는 임신 중 또는 출산 시에 손쉽게 얻을 수 있고 대량으로 증식이 가능하고 배아줄기세포처럼 동물에 이식하였을 때 종양을 형성하지 않는다. 특히, 배아줄기세포가 가진 윤리적인 문제가 없어 세포치료에 쓰일 수 있는 가능성이 매우 높은 유망한 줄기세포로서 이를 이용한 다양한 연구가 수행되고 있다. 현재 줄기세포의 세포원으로 자가 근조직, 골수, 지방, 뼈 등이 이용되고 있으나 대부분 침습적 방법으로 채취되어 출혈, 감염, 채취장기의 손상 등에 의한 후유증이 수반되어 비침습적인 방법으로 얻을 수 있는 줄기세포원이 요구되고 있다. 따라서 배아줄기세포와 비교하였을 때, 동물에 이식 시 종양을 형성하지 않고, 채취에 윤리적인 문제가 없으며, 전분화능을 지니고 있어 궁극적으로 인체 모든 장기로 분화가 가능한 양수줄기세포는 질병치료에 이상적인 줄기세포원이라 할 수 있다.
한편, 여성 요실금은 출산과 노령에 따른 골반근육의 지지 약화에서 오는 요도 및 방광의 처짐이 원인이 된다. 현재 국내 여성 요실금 환자 수는 400~500만 명으로 추정되며, 노년층 여성의 급격한 증가로 인하여 매년 환자수가 증가 추세에 있다. 이에 현재 여성 요실금은 전 세계적으로 발생하는 심각한 사회적 문제의 하나로 대두되고 있다. 요실금 환자를 치료하기 위해 요도 및 방광을 지지하기 위한 수술요법과 주사요법이 사용되고 있다. 현재 수술요법은 침습적인 방법으로 합병증이 발생할 수 있다는 문제점이 있고, 주사요법은 고가 물질이어서 환자에게 용이하게 쓰일 수 없을 뿐만이 아니라, 성공률이 50~60% 밖에 되지 않아 재주사 및 재수술이 요구되는 문제점이 있다.
따라서 전신마취가 필요하지 않고 손쉽게 요도 괄약근을 재생시켜 요실금을 개선할 수 있는 방법으로 줄기세포의 주사방법이 활발하게 연구되고 있다.
이러한 줄기세포를 이용한 요도 괄약근 재생방법의 일례로 대한민국 공개특허 제10-2009-0056925호에서는 지방 유래 줄기세포를 이용한 요실금의 치료에 대하여, 대한민국 공개특허 제10-2010-0018655호에서는 분화된 미성숙 지방세포를 포함하는 괄약근 장애 치료에 대하여 개시하고 있지만 만족할 만한 정도의 치료효과를 보이고 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 요실금 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 초기 분화된 양수 줄기세포가 요실금의 치료에 효과적이라는 것을 확인하였으며, 특히 양수 줄기세포를 체외에서 근육, 신경, 내피로 초기 분화시켜, 세 종류의 세포를 적정비로 배합하였을 때, 뛰어난 요실금 치료 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 근조직 재생 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 근조직 재생 세포치료제를 제공한다.
또한 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 양수 줄기세포를 포함하는 조성물은 뛰어난 근조직 재생 효과가 있어, 요실금 치료제로서 유용하다.
도 1은 사람양수줄기세포의 항원 인자에 대한 특성을 나타낸 것이다.
도 2는 양수줄기세포의 근육, 신경, 내피세포로의 초기 분화를 Real-time PCR을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 요도괄약근 동물모델에서 LPP를 확인한 결과이다.
도 4는 요도괄약근 동물모델에서 CP를 확인한 결과이다.
도 5는 요도괄약근 동물모델에서 H&E 및 IHC 염색을 통해 윤근층 재생 및 요도 괄약근 부위의 모세혈관을 확인한 결과이다.
도 6은 요도괄약근 동물모델에서 Real-time PCR을 통해 근육, 신경, 내피세포 분화와 관련된 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 7은 초기 분화된 양수줄기세포의 생체 내 면역 반응을 확인한 결과이다.
도 8은 초기 분화된 양수줄기세포의 생체 내 안전성을 확인한 결과이다.
도 9는 MNPs@SiO2 표지를 통해 초기 분화된 양수줄기세포의 생체 내 추적결과를 확인한 것이다.
이하 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
한 양태로서 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 근조직 재생 세포치료제를 제공한다.
상기 근조직은 요도 괄약근을 포함한다.
또 다른 양태로서 본 발명은 본 발명은 초기 분화된 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기 양수 줄기세포는 최적의 효율을 내기 위하여, 체외에서 근육, 신경, 내피세포로 각각 초기 분화시킨 후 이를 배합하여 포함되는 것을 특징으로 한다.
상기 근육, 신경, 내피세포의 배합비는 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 세포수 비례로써 6:1:1 내지 10:1:1 이며, 보다 바람직하게는 8:1:1이다.
본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달 가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래(전이(transit)) 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.
본 발명에서 사용된 용어 ‘분화 (differentiation)’는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포 또는 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 양수 줄기세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 요실금 환자 또는 동물에게 투여함으로써 요실금을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 요실금에는 복압성 요실금, 절박성 요실금, 일류성 요실금, 반사성 요실금이 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 양수 줄기세포 또는 상기 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포를 포함하는 치료용 조성물은 세포 단독 혹은 배양기에서 배양된 상태로 환자의 생체 내로 주입될 수 있는데, 예를 들어 린드발 등 (1989, Arch. Neurol. 46: 615-31) 또는 더글라스콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상방법을 이용할 수 있다. 상기 제제에는 상기 양수 줄기세포 또는 상기 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포 외에 약학적으로 허용 가능한 통상의 담체를 포함할 수 있고, 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제등이 포함될 수 있다.
본 발명의 세포치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 세포치료제는 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소 적용이 가능하며, 바람직하게는 요도 주입용(periurethral injection) 주사제 형태로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 멸균 정제수, 약 pH 7 의 완충액, 또는 생리식염수 중에 분산 및/또는 용해시켜 생체 내에 주입될 수 있으며, 필요할 경우, 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 주입되는 줄기세포의 양은 이에 크게 제한되지 않으나, 105 내지 106 cell/sphincter으로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 약 106 cell/sphincter 이 투여될 수 있다. 상기 용량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 요실금을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 요실금이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물은 요실금을 치료, 예방 또는 처리하는데 통상적으로 사용되어온 치료법과 병용하여 투여될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사람 양수 줄기세포의 분리 및 특성
경북대학교 의과대학의 윤리위원회는 본 연구와 관련하여 사람 양수의 사용을 승인하였다. 양수는 임신 15~19주의 통상적인 양수천자 (amniocentesis)를 수행한 임산부로부터 동의를 얻고 제공받았다. 수득된 양수를 원심분리를 통해 상등액을 제거하였다. 세포덩이에 포함된 세포는 18% Chang B 및 2% Chang C (Irvine Scientific, Irvine, CA)를 포함한 Chang Medium (a-MEM, embryonic stem cell-fetal bovine serum (Gibco-invitrogen, Grand island, NY( 15% ES-FBS, 1% glutamine 및 1% penicillin/streptomycin, Gibco)을 이용하여 페트리디쉬 상에서 배양하였다. 부착되지 않은 세포는 1주일째에 제거하였으며, 부착된 세포는 배양기 표면을 80% 이상 차지 않도록 유지하고, 배양액은 3일 마다 교체하였다.
배양된 양수 세포들 (계대 3)의 표면항원은 Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS, BD Biosciences, San Jose, CA) 시스템으로 분석하였다. 세포들의 특성은 중간엽 (mesenchymal) 줄기세포 (SSEA4, CD44, CD73, CD 90 and CD105), 조혈모세포 (hematopoietic stem cell) (CD45) 및 세포 표면 항원 인자 (HLA-DR) (BD Biosciences, San Jose, CA)표지자를 이용하여 분석하였다. 줄기 세포 분획은 다능성 (pluripotency) 표지자인 C-kit (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 이용하여 세포 분류 시스템 (cell sorting system) (MACS, MiltenyiBiotec, Germany)을 통해 수행하였다.
실험 결과, FACS 분석을 통하여, 계대 3의 양수 세포는 중간엽 표지자(CD44, CD73, CD90 and CD105)에 강한 양성 반응을, SSEA-4에 약한 양성을 보였으며, 조혈모 표지자 (CD45) 및 MHC Class II 항원 (HLA-DR)에 음성 반응을 보였다 (도 1). 여러 종류의 세포로 이루어진 양수 세포군에서 한 종류의 줄기세포 수득을 위해 c-kit 분획을 실시하여 분획 2회차에 약 98.40%의 양성 줄기세포군을 수득하였다. 상기 실험을 통하여 최종적으로 사람 양수 줄기세포(hAFSCs, human amniotic fluid stem cells)를 수득하였다.
실시예 2: 양수줄기세포의 근육, 신경 및 내피세포로의 초기 분화 (Pre-differentiation)
양수줄기세포로부터 세 개의 다른 세포로의 초기 분화(pre-differentiation)을 위한 최적화된 조건을 확립하기 위하여, 기존 시판 배지 및 상층액 배지 (conditioned medium, CM)를 배지를 비교하였다. 기존 시판 배지 중 근육세포로의 분화 (myogenesis)를 위하여 Gibco-Invitrogen사의 배지(Grand island, NY) 를 이용하였으며, 신경 세포로의 분화 (neurogenesis)를 위해 ScienCell사의 배지 (Carlsbad, CA)를 이용하였으며, 내피세포로의 분화 (endothelialgenesis)를 위해 Lonza사의 배지(Walkersville, MD)를 이용하였다. CM은 사람 근육조직 또는 혈관에서 1차 배양한 배양액로부터 수득하였고 ScienCell에서 구입한 신경세포를 배양하여 이용하였다. 초기 분화(pre-differentiation)를 위하여 양수 줄기세포는 7일 간 각각의 배지에서 배양되었다. 양수 줄기세포의 근육, 신경 및 내피세포로의 분화를 확인하기 위하여 공지된 방법에 따라real-time PCR과 면역세포염색법을 수행하였다.
Real-time PCR 분석 결과, 초기-근세포 분화 (MYOD), 신경세포 분화 (MAP2) 및 내피세포 분화 (CD31)표지자의 발현이 CM 배지에서 기존 시판 배지 (control)를 이용한 것에 비하여 현저하게 증가함을 확인하였다. 유전자 발현은 면역세포염색법을 통해 확인하였으며 (도 2), 상기 결과를 통하여 양수줄기세포가 근육, 신경 및 내피세포로의 각각 초기 분화가 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 3: 동물 실험
3-1. 요도 괄약근 손상 동물 모델 수립
실험동물을 National Institutes of Health Animal Care Guidelines에 따라 처리하였고, 상기 가이드라인은 경북대학교 의과대학 동물윤리위원회의 승인을 받았다. 모든 실험들은 20 내지 25 mg의 암컷 ICR 마우스 총 40마리를 사용하였다. 요도 괄약근이 손상된 마우스 모델을 제작하기 위하여, 모든 동물은 일반적인 마취 상태에서 무균 수술을 수행하였다. 정중선 복부 수직절개 (lower midline abdominal incision)를 수행하고, 방광과 요도를 노출시키고, 양쪽에 있는 음부신경을 확인한 후, 이를 절단(transection)하였다. 또 다른 10 마리의 마우스는 대조군으로써, 대조군수술 (Sham operation)을 수행하였다.
수술 1주일 후, 마우스는 무작위로 분리하여, 다섯 개의 그룹으로 나누었다. 양성 대조군 수술군 (sham-operation) [ctrl(+)]; 음부 신경 절단 (pudendalneurectomy) 및 식염수 (saline) 를 주입한 음성 대조군[ctrl(-)]; 음부 신경 절단 (pudendalneurectomy) 및근육세포로 초기 분화된 (pre-differentiated) 양수줄기세포를 주입한 단독군(M); 근육세포와 신경세포로 초기 분화된 양수줄기세포를 혼합한 복합 주입군 (MN,muscle/neuron ratio 9:1), 근육세포, 신경세포 및 내피세포로 초기 분화된 양수줄기세포를 혼합한 복합 주입군 (MNE,muscle/neuron/endothelium ratio 8:1:1) (각 그룹의 마우스 수=5). 각각 준비된 세포 0.5x106를 26G Hamilton microsyringe (Hamilton Company, Reno, NV)를 사용하여 요도 괄약근 부위에 주입하였다.
3-2. 요역동학 검사
세포 주입 2 주 및 4주에 종래 공지된 방법인 vertical tilt/intravesical pressure clamp model를 사용하여 요누출압(leak point pressure, LPP) 및 요도폐쇄압(closing pressure, CP)을 측정하였다. 측정 전, 척수 절단을 T9 내지 T10 수준에서 수행하여, 방광 내압의 증가에 따른 반사 방광 작용을 제거하였다. 일반적인 마취 상태에서, 정중선 절개를 통해 방광을 노출시켰다. PE-90 tube에 생리식염수50ml를 연결하고, 생리식염수를 점차적으로 주입하여 방광 내의 압력을 증가시켰다. 요누출이 시작될 때의 압력을 LPP로 정의하였다. 그 후, 방광 압력이 감소하여 요누출이 멈추는 시점의 압력을 CP로 정의하였다. 각 실험 동물마다 세 차례의 LPP 및 CP를 측정하여 평균을 취하였다.
실험 결과, 도 3 에 나타낸 바와 같이, ctrl(+), M, MN, MNE 및 ctrl(-) 그룹의 세포 주입 2주 후 LPP값은 각각 36.13±0.38, 36.96±2.60, 31.30±1.38, 30.84±1.79 및 20.75±2.89 cm H2O로 나타났다. 또한, 세포 주입 4주 후 LPP 값은 각각 36.54±1.17, 38.43±1.85, 35.88±0.26, 43.08±0.07 및 26.58±1.87 cm H2O로 나타났다. 상기 결과를 통해 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포를 혼합한 MNE 그룹의 LPP 값이 다른 그룹에 비해 유의적으로 높은 것을 확인하였으며 (p=0.0005), 이를 통해 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포를 혼합한 MNE 그룹이 유의적인 요실금 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, ctrl(+), M, MN, MNE 및 ctrl(-) 그룹의 세포 주입 2주 후 CP값은 22.68±0.43, 21.84±1.50, 19.89±1.17, 17.20±1, .28 및 10.98±2.46 cm H2O로 나타났다. 또한, 세포 주입 4주 후 CP 값은 각각 25.73±1.08, 28.38±3.09, 23.80±0.86, 28.91±0.58 및 16.83±1.74 cm H2O로 나타났다. 상기 결과를 통해 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포를 혼합한 MNE 그룹의 CP 값이 ctrl(+) 그룹에 비해 유의적으로 높은 것을 확인하였으며 (p=0.0004), M 그룹의 CP값은 ctrl(+)그룹과 유의적인 차이를 보이지 않았다(p=0.1078). 이를 통해 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포를 혼합한 MNE 그룹이 가장 유의적인 요실금 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
3-3. 조직학적, 면역조직화학 및 분자학적 분석
LPP 및 CP 측정 후 마우스를 희생하여 요도 괄약근 조직을 수득하였다. 조직 시료는 일반적인 헤마톡실린/에오신 염색 및 MyoD, ß-tubulin III 및 CD31 항체를 이용한 면역조직화학 염색 (IHC)을 수행하였다. 또한, real-time PCR을 통해 근육세포(Pax7, Myf5, MyoD, Myogenein), 신경세포(vimentin, nestin, Map2, ß-tubullin III) 및 내피세포(Cd34, Cd31, Vegfr2, vWF)분화와 관계된 유전자의 발현을 확인하였다.
실험 결과, H&E 염색을 통해 정상적인 윤근층 재생 및 요도 괄약근 부위의 모세혈관을 확인하였으며, 특히 근육, 신경, 내피 세포를 혼합한 그룹 (MNE)에서 요도 괄약근의 재생이 가속화됨을 확인하였다. 이러한 결과는 IHC 염색을 통해 다시 한번 확인되었다 (도 5). 또한, real-time PCR 결과에서도 MNE 그룹은 근육세포(Pax7, Myf5, MyoD 및 Myogenin), 신경세포(Vimentin, Nestin, Map2 및 ß-tubullin III) 및 내피세포(Cd34, Cd31, Vegfr2 및 vWf)분화와 관련된 유전자의 발현이 다른 그룹에 비하여 증가함을 확인하였다 (도 6). 상기 실험결과를 통해 MNE 그룹에서 가장 윤근층 재생 효과가 있으며, 이를 통해 요실금의 치료 효과가 있음을 확인하였다.
3-4. 생체 내 면역반응 및 안전성
초기 분화된 (pre-differentiated) 세포의 생체 내 면역 반응을 확인하기 위하여, 세포 주입 2주 후 조직을 분리하고 세포독성T 세포 표지자(CD8, BD Pharmigen, San Jose, CA)를 이용하여 IHC 염색을 수행하였다. 양성 대조군으로 사람 섬유아세포를 주입한 군을, 음성 대조군으로 겉보기 수술군을 이용하였다. 생채 내에서 세포의 치료 안전성을 확인하기 위한 적합 환경으로 신장 피막하를 선택하여 세포체를 이식하였다. 생체 외에서 양수 줄기세포를 7일간 초기 분화 (pre-diferentiation) 시켜 ICR 마우스의 왼쪽 신장 피막 하에 (left renal subcapsular space)에 세포체(1x106)를 이식하였다. 4주 후, 시료를 채취하여 일반적인 H&E 염색을 수행하였다.
IHC 염색 결과, 세포를 주입한 그룹의 요도 괄약근 조직에서 CD8 림프구 (lymphocyte)가 거의 발견되지 않았으며, 그 발현 정도는 음성대조군과 같은 수준이었다. 반면, 사람 섬유아세포를 주입한 그룹 (ctrl(+))에서는 현저하게 발현이 증가된 CD8 림프구 (lymphocyte) 가 발견되었다 (도 7). 생체 내 안전성 분석에서, 조직학적 분석을 통해 세포 주입 2주 후 기형종(teratoma) 형성이 없는 것으로 확인되었다 (도 8). 따라서 상기 실험을 통하여 본 발명의 양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포는 면역학적으로 생체 내에서 안전하여, 치료제로 이용될 수 있음을 확인하였다.
3-5. MNPs@SiO2 표지를 통한 생체 내 추적
주입 세포의 생체 내 추적을 위하여, 나노 입자로 표지된 세포를 이용하였다. 각 그룹당 0.5 x106개의 세포를 암컷 누드 마우스 (무게 20 내지 25gm, 중앙실험동물에서 구입)의 요도 괄약근 부위에 주입하고, 14일 후 FITC 를 위한 필터 (Omega Optical, Brattleboro, VT) 세트가 부착된 Pro imaging system (Princeton Instrument, Trenton, NJ)을 통해 이미지를 확인하였다. 이미지는 Princeton Instrument software (winview/32 Metavue)를 이용하여 분석하였으며 nonspecific auto-fluorescence를 제거하기 위하여 spectral un-mixing algorithms을 이용하였다. 대조군으로는 세포를 주입하지 않은 마우스를 이용하였으며, 생체 내에서 어떠한 형광 신호도 나타나지 않았다.
FITC가 주입된 마우스는 주입 위치를 통해 쉽게 시각화된다. 요도 괄약근 조직에서의 형광(fluorescence) 강도는 시간이 경과함에 따라 점차적으로 감소하였다. 단일세포 주입군에 비하여, 근육, 신경 및 내피세포를 모두 혼합하여 주입한 복합군에서는 강하고 집중된 이미지를 보였다. 주입 후 14일째에, 단일세포 주입군에서는 형광 신호를 상실하였는데 반해, 두 가지 이상세포를 혼합한 복합군에서는 형광 신호가 존재하였다 (도 9).
이하 본 발명의 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
1. 주사제의 제조
양수 줄기세포로부터 초기 분화된 근육, 신경 및 내피세포105 내지 106 cell/sphincter
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 정량
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
본 발명의 양수 줄기세포를 포함하는 조성물은 뛰어난 근조직 재생 효과가 있어, 요실금 치료제로서 유용하다.

Claims (7)

  1. 양수 줄기세포를 포함하는 근조직 재생 세포치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 근조직은 요도 괄약근인 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 양수 줄기세포는 체외에서 근육, 신경 또는 내피 세포로 초기 분화 (Pre-differentiation)시킨 것을 특징으로 하는 세포치료제.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 근육, 신경 또는 내피세포는 8:1:1의 비로 배합되는 것을 특징으로 하는 세포치료제.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 양수 줄기세포는 하기와 같은 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 세포치료제.
    (a) CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (b) SSEA4 에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;
    (c) CD45에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄; 및
    (d) MHC Class II 항원 (HLA-DR) 에 대하여 음성의 면역학적 특성을 나타냄;
  6. 양수 줄기세포를 포함하는 요실금의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 양수 줄기세포는 체외에서 근육, 신경 또는 내피 세포로 초기 분화시킨 것을 특징으로 하는 조성물.
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