JP2023513370A - 線維芽細胞を用いた脳性麻痺の治療 - Google Patents

Abstract

【課題】線維芽細胞またはその誘導体を用いた脳性麻痺の治療または予防のための方法および組成物を提供する。【解決手段】いくつかの態様において、本明細書で開示されるのは、線維芽細胞またはその誘導体を用いた脳性麻痺の治療または予防のための方法および組成物である。本明細書で開示されるのは、対象において神経新生を誘導し、及び／又は炎症を軽減することができる線維芽細胞及びその誘導体である。いくつかの態様において、開示された方法は、条件付き線維芽細胞を使用することを含んでいる。線維芽細胞は、治療効果を高めることができる薬剤、例えばオキシトシン及び／又はヒト絨毛性ゴナドトロフィン（ｈＣＧ）で条件付けすることができる。【選択図】なし

Description

本出願は、２０２０年２月１３日に出願された米国仮特許出願連続番号６２／９７６、０４８の優先権を主張し、この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。

本開示の実施形態は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、及び医学の分野を包含する。

脳性麻痺（ＣＰ）と呼ばれる状態は、周産期（出生前、出生時、または出生前後）、または脳がまだ発達中の乳児の最初の数年の間に起こる脳損傷に起因する身体障害をもたらす一連の障害に与えられる総称である。神経細胞の健康に悪影響を及ぼすＣＰの危険因子としては、例えば、新生児脳低酸素虚血、脳実質内出血または脳室内出血、新生児敗血症が挙げられる。ＣＰの症状は、このグループの障害を持つ人の間で非常に異なる場合がある。症状は、軽度または重度、体の片側のみまたは両側、腕または脚のどちらかで顕著、または腕と脚の両方が関与しているケースがある。症状は通常、子供が３歳になる前に見られ、場合によっては、出生時に存在するか、または特定されることもある。

ＣＰには、痙性、ジストニック、運動障害、失調、低張性、および混合を含むいくつかの異なるタイプがある。最も一般的なタイプである痙性ＣＰの症状には、伸びない固い筋肉（時間の経過とともにさらに固まることがある）、異常な歩行および姿勢運動（腕を側面に向かって倒す、膝を組むまたは触れる、脚は「はさみ」運動をする、つま先で歩く）、固くて全開しない関節（関節拘縮と呼ぶ）、筋力低下または一群の筋肉の運動喪失（麻痺）、がある。症状は、片腕または片足、体の片側、両足、または両腕と両足のいずれかに現れる。現時点では、ＣＰの主要な危険因子である新生児の脳低酸素虚血に対する唯一の有効な介入方法は、治療的低体温法（頭部または身体の冷却）である。現在、治療法がないため、医師は主に産科医療を改善し、未熟児、低出生体重児、周産期感染症などのＣＰ前および周産期の主要危険因子を最小限に抑えることによってＣＰを予防しようと試みている。硫酸マグネシウムは、最近、超早産児のＣＰリスクを減少させることが示されたが、まだ臨床に導入されていない。従って、硫酸マグネシウムの実際の有効性はまだ知られていない。

ＣＰは、小児期における重度の運動障害の最も頻繁な原因であり、その背景となる有病率は、生児１０００人当たり２人であると認識されている。この状態は、発達中の胎児又は乳児の脳に生じた非進行性の障害に起因する、活動制限を引き起こす運動及び姿勢の発達の永久的障害と定義される。大多数の場合、元の「障害」は、脳室周囲の脳白質に対する虚血性－低酸素性損傷の発生であり、これは成人の虚血性損傷と原理的に類似している。

ＣＰ患者の剖検標本では、白質損傷、脳室内進展を伴う胚軸出血、大脳皮質、及び大脳基底核、視床の損傷が確認されている。原因因子としては、直接的な虚血・低酸素障害や、場合によっては母体感染などが考えられ、いずれも胎児ＣＮＳにおける炎症性サイトカインの活性化、脱髄、興奮毒性などを引き起こす。ＣＰ誘導のこれらの機構は、周産期における虚血／低酸素、グルタミン酸興奮毒性、又は細菌／ウイルス病原体のメディエーターの誘導が、ＣＰと同様の神経行動異常を誘発する動物モデルによって支持される。

現在、ＣＰの治療は対症療法であり、ＣＰに伴う筋緊張亢進を抑えるために筋弛緩剤としてバクロフェン（Ｌｉｏｒｉｓｏｌ（登録商標））の投与が行われている。さらに、場合によっては、治療的電気刺激（ＴＥＳ）を用いて、弱った筋肉への血流を増加させ、損傷した組織を修復するために成長因子や栄養素をより多く体内に送り込むことができるようにする。もうひとつの方法は、選択的脊髄後根切断術（ＳＤＲ）で、筋肉から脊髄に入る感覚神経線維の一部を外科的に切断するものである。これにより、脊髄のバランスが良くなり、けいれんを抑えることができるが、治療後に理学療法に取り組む必要がある。

本開示は、個体における脳性麻痺の治療又は予防、又はその発症の遅延及び／又はその重症度の低減のための方法及び組成物に向けられる。特定の実施形態では、個体の寿命は、方法及び組成物を使用しない場合と比較して延長される。本明細書に開示される、いくつかの実施形態では、有効量の線維芽細胞を対象に提供することを含む、対象における脳性麻痺を治療又は予防する方法である。いくつかの実施形態では、対象は、約４歳以下である。いくつかの実施形態では、対象は、約２歳以下である。いくつかの実施形態では、対象は新生児である。いくつかの実施形態では、新生児は早産の新生児である。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、胎盤、臍帯血、末梢血、網、毛包、皮膚、骨髄、脂肪組織、またはウォートン・ゼリーから単離された線維芽細胞である。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、細胞増殖あたり１４時間から２１時間の速度でインビトロで増殖することができる。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、インビトロで培養した場合にインターロイキン－１（ＩＬ－１）を分泌することが可能である。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、約７５％のコンフルエントで培養された場合に、１００万個の線維芽細胞あたり１ｐｇ～７７ｐｇのＩＬ－１を分泌することができる。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、インビトロで培養した場合、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ－１）を分泌する。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、約７５％のコンフルエントで培養された場合、１００万個の線維芽細胞あたり１ｐｇ～５００ｐｇのＦＧＦ－１を分泌することが可能である。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、混合リンパ球反応におけるＴ細胞増殖を低減させることができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖を減少させることは、対照の混合リンパ球反応と比較して２０％より大きいＴ細胞増殖を減少させることを含んでいる。

いくつかの実施形態では、本方法は、提供の前に、線維芽細胞をヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）で培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞あたり１ｎＭ～１μＭの間の濃度でｈＣＧと共に培養される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、１００万個の線維芽細胞あたり１０ｎＭ～１００ｎＭの間の濃度でｈＣＧとともに培養される。いくつかの実施形態では、本方法は、提供の前に、線維芽細胞をオキシトシンとともに培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、提供の前に、線維芽細胞をメトホルミンで培養することをさらに含む。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、ＩＬ－１を発現しない。いくつかの実施形態では、本方法は、被験体に神経保護剤を提供することをさらに含む。いくつかの実施形態では、神経保護剤は、エリスロポエチン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、メトホルミン、ＧＬＰ－１、ジメチルスルホキシド、フェルバメート、ＴＧＦ－β、オーリントリカルボン酸、アムロジピン、ＭＫ－８０１、メマンチン、イルベサルタン、エブセレン、緑茶エキス、ＢＭＰ－６、ミノサイクリン、ドキシサイクリンまたはセフトリキソンなどである。

上記は、以下の詳細な説明がより良く理解されるように、本開示の特徴及び技術的利点をむしろ大まかに概説した。以下、本明細書の特許請求の範囲の主題を形成する追加の特徴及び利点が記載されるであろう。開示された着想及び特定の実施形態は、本意匠の同じ目的を遂行するための他の構造を修正又は設計するための基礎として容易に利用され得ることが、当業者には理解されるはずである。また、そのような同等の構造は、添付の特許請求の範囲に規定されるような精神および範囲から逸脱しないことも、当業者によって理解されるべきである。 本明細書に開示された意匠の特徴と考えられる新規な特徴は、組織および動作方法の両方に関して、さらなる目的および利点とともに、以下の説明からより良く理解されるであろう。しかしながら、詳細な説明は、例および説明の目的のみのために提供され、本開示の限界の定義として意図されないことが、明示的に理解されるものとする。

脳性麻痺（ＣＰ）発症は、例えば母体感染によるものであれ、虚血／低酸素症によるものであれ、共通の特徴を有しているように思われる。１つの具体例は、ＣＰ患者における局所的又は全身的な炎症である。ＣＰ患者では、ＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインの全身的な上昇や、ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒシグナルへの応答性が報告されている。ＣＰに関連するその他の炎症性サイトカインには、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２が含まれる。ＣＰ患者に見られるその他の共通点としては、慢性脱髄、白質減少、神経細胞喪失を引き起こす興奮毒性などの証拠がある。ＣＰの炎症仮説は、様々な神経学的障害を誘発し、共通の疾患表現型をもたらす動物モデルでの研究によって裏付けられている。具体的には、グルタミン酸作動薬であるイボテン酸の新生児皮質内注射による興奮毒性障害、片側または両側の頸動脈閉塞による虚血・低酸素障害、エンドトキシン単独または虚血・低酸素・グルタミン酸作動薬との併用による炎症性傷害などがある。これらの動物モデルは、いずれも脳損傷、脱髄、神経行動異常など、互いに、また臨床のＣＰと類似した症状を呈する。いくつかの臨床報告では、間葉系幹細胞が神経再生を誘導する可能性が示唆されており、ＣＰ患者にとって有益である可能性がある。このことは、幹細胞で治療され回復したＣＰの動物モデルにおける研究によって裏付けられている。さらに、間葉系幹細胞の抗炎症作用により、通常は炎症によって阻害されるはずの内因性の修復過程が起こるようになる可能性がある。本明細書において認識されるのは、例えば、抗炎症特性を有する細胞治療薬など、脳性麻痺の根本原因を治療することができる治療薬に対する必要性である。

本明細書に開示されるのは、いくつかの実施形態において、脳性麻痺を含む新生児脳損傷及びその後遺症の治療に有用な方法、手段、及び物質の組成物である。本開示の実施形態は、脳性麻痺に罹患している、または脳性麻痺を発症する危険性がある患者への線維芽細胞（例えば、再生線維芽細胞）の投与を提供するものである。線維芽細胞は、単独で、または１つ以上の追加の療法と組み合わせて提供されてもよい。例えば、線維芽細胞は、神経刺激の手段と一緒に提供されてもよい。神経刺激の手段の例としては、内因性神経幹細胞を活性化する薬剤の投与、経頭蓋磁気刺激などが挙げられる。

ＩＩ．定義の例
長年の特許法の慣例に従い、特許請求の範囲を含め、本明細書でｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇという単語と一緒に使用される場合、単語「ａ」及び「ａｎ」は、「１つ又は複数」を表す。本開示のいくつかの実施形態は、本開示の１つ以上の要素、方法ステップ、及び／又は方法から構成されてもよいし、本質的に構成されてもよい。本明細書に記載される任意の方法又は組成物は、本明細書に記載される任意の他の方法又は組成物に関して実施することができ、異なる実施形態が組み合わされてもよいことが企図される。

本明細書で使用される場合、用語「又は」及び「及び／又は」は、互いに組み合わせて又は排他的に複数の成分を記述するために利用される。例えば、”ｘ、ｙ、及び／又はｚ”は、”ｘ”単独、”ｙ”単独、”ｚ”単独、”ｘ、ｙ、及びｚ”、”（ｘ及びｙ）又はｚ”、”ｘ又は（ｙ及びｚ）”、又は”ｘ又はｙ又はｚ”を指すことが可能である。ｘ、ｙ、またはｚは、実施形態から具体的に除外され得ることが特に企図される。

本出願を通じて、用語「約」は、値を決定するために採用される装置又は方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために、細胞及び分子生物学の領域におけるその平易かつ通常の意味に従って使用される。

本明細書で使用する「同種異系」とは、自然環境下では免疫学的に不適合である、又は免疫学的に不適合となり得る、別の身体からの組織又は細胞又は他の材料を指し、同じ種の１又は複数の個体からのものであるが、このような材料は、免疫学的に不適合である。

本明細書で使用する場合、「細胞株」は、一次細胞培養の１回以上の再培養によって形成された細胞集団のことを指す。再培養の各ラウンドは継代と呼ばれる。細胞が継代培養された場合、その細胞は継代されたものとみなされる。特定の細胞集団や細胞株は、継代回数によって参照されたり特徴づけられたりすることがある。例えば、１０回継代した培養細胞集団は、Ｐ１０培養と呼ばれることがある。一次培養、すなわち組織から細胞を分離した後の最初の培養をＰ０とする。一次継代培養後の細胞は二次培養（Ｐ１または継代１）と表現される。第二次継代培養の後、細胞は第三次培養（Ｐ２または継代２）となり、以下同様である。継代期間中に多くの集団倍加があり得ることは当業者に理解されよう；したがって、培養物の集団倍加の数は継代数よりも大きい。継代間の期間中の細胞の拡大（すなわち、集団倍加の数）は、播種密度、基質、培地、増殖条件、及び継代間の時間を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。

本明細書で使用する「条件培地」は、特定の細胞又は細胞集団が一定期間培養され、その後除去されて、細胞又は細胞から分離された培地をいう。細胞が培地中で培養されると、他の細胞に栄養学的支援を与えることができる細胞因子が分泌されることがある。このような栄養因子には、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、顆粒などが含まれるが、これらに限定されるものではない。この例では、細胞因子を含む培地は、条件培地である。

本明細書で使用する場合、「栄養因子」は、細胞の生存、成長、増殖及び／又は成熟を促進及び／又は支援する物質を意味する。代替的に又は追加的に、栄養因子は、細胞の活性の増加を刺激する。

「包含する」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である用語「含む」は、包括的又は開放的であり、追加の、言及されていない要素又は方法ステップを排除しない。「からなる」という語句は、指定されていない要素、手順、または成分を除外する。「から本質的になる」という表現は、記載された主題の範囲を、指定された材料またはステップと、その基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えないものに限定する。用語”ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”（含む）の文脈で説明される実施形態は、用語”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ”（からなる）又は”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ”（から実質的になる）の文脈でも実施され得ることが企図される。

治療された対象に対する未治療の対象における任意の症状の発現に言及する場合の用語「低減」、「阻害」、「減衰」、「抑制」、「減少」、「防止」及び文法的同等物（「低い」、「小さい」等を含む）は、任意の医学的訓練を受けた人員によって臨床的に関連すると認識される任意の量だけ未治療対象における症状よりも治療対象における症状の量及び／又は大きさが低いことを意味している。一実施形態では、処置された対象における症状の量及び／又は大きさは、未処置の対象における症状の量及び／又は大きさよりも少なくとも１０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低い、及び／又は少なくとも９０％低いである。

本明細書で使用する場合、用語「治療上有効な量」は、「有効量」、「治療上有効な用量」、及び／又は「有効量」と同義であり、それを必要としている個体において当業者が求めている生物学的、美容的又は臨床的反応を誘発する化合物の量を意味する。一例として、有効量は、細胞群の免疫原性を低下させるのに十分な量である。開示された方法の特定の用途のために投与されるべき適切な有効量は、本明細書に提供されるガイダンスを用いて、当業者によって決定され得る。例えば、有効量は、本明細書に記載されるように、インビトロ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイから外挿することができる。当業者は、治療の経過を通じて個体の状態を監視することができ、投与される本明細書に開示される化合物又は組成物の有効量をそれに応じて調整することができることを認識するであろう。

本明細書で使用する場合、用語「治療」、「処置」、又は「治療する」は、治療される個体又は細胞の自然経過を変更する試みにおける介入を指し、予防のため又は疾患又は状態の病理学的経過の間のいずれでも実施され得る。治療は、例えば、疾患の発生又は再発の防止、症状の緩和、及び疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解又は予後の改善を含む、様々な所望の結果の１以上を達成するために役立つことがある。

本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある実施形態」、「追加の実施形態」、または「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態と関連して説明される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味している。したがって、本明細書中の様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わされてもよい。

本開示の様々な態様は、範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能なすべてのサブ範囲を、明示的に書き出されたかのように具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１から６までのような範囲の記述は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までのような下位範囲と、例えば１、２、３、４、５、６のようなその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと見なされるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。範囲が存在する場合、範囲は範囲の終点を含んでもよい。

本明細書で使用される「対象」という用語は、「個体」という用語と互換的に使用することができ、一般に、治療を必要とする個体を指す。対象は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、又はげっ歯類であることができる。対象は、患者、例えば、脳性麻痺を有するか又はその疑いがある、又はその恐れがある者であり得る。対象は、疾患を有していてもよいし、疾患が疑われていてもよい。対象は、無症状であってもよい。対象の性別は問わない。対象は、ある年齢、例えば、４歳以下、３歳以下、２歳以下、１歳以下、１１ヶ月以下、１０ヶ月以下、９ヶ月以下、８ヶ月以下、７ヶ月以下、６ヶ月以下であってもよい。５ヶ月以下、４ヶ月以下、３ヶ月以下、２ヶ月以下、１ヶ月以下、３週間以下、２週間以下、１週間以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下、１日以下、又は胎内であってもよい。対象が胎内の場合、２０週齢、２１週齢、２２週齢、２３週齢、２４週齢、２５週齢、２６週齢、２７週齢、２８週齢、２９週齢、０３０週齢、３１週齢、３２週齢、３３週齢、３４週齢、３５週齢、３６週齢、３７週齢、３８週齢、３９週齢、又は４０週齢であってもよい。

ＩＩＩ. 疾患治療又は予防の方法及び組成物
本開示の態様は、脳性麻痺を処置または予防するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、個体の脳性麻痺を処置または予防することができる線維芽細胞が本明細書中に開示される。本開示の線維芽細胞は、例えば、脳性麻痺を罹患しているまたは脳性麻痺のリスクがある個体における炎症の低減、血管新生の刺激および／または神経発生の刺激において使用され得る。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、有効量の線維芽細胞を個体に提供して、脳性麻痺を処置もしくは予防するかまたはその重症度および／もしくは発症の延期を低減する工程を含む。

先天性脳性麻痺の危険因子としては、例えば、低出生体重（５、４または３ポンド未満）；早産（３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１または３０週目より前）；多子出産（双子、三つ子、四つ子など）；補助生殖医療不妊症治療；妊娠中の感染症（例えば、妊娠中の赤ん坊の脳内および血液中のサイトカインを増加させるもの；例としては、水疱瘡、風疹、サイトメガロウイルス、細菌感染症などが挙げられる）；黄疸；核黄疸；母体に甲状腺の問題があること、母体に知的障害があること；および／または出生時の合併症（例えば、胎盤剥離、子宮破裂、臍帯の問題）が挙げられる。後天性脳性麻痺（生後２８日より後に生じる脳損傷）の危険因子は、通常、髄膜炎などの感染症または頭部損傷に関連し、それらとしては、脳への血流に関連する問題、例えば、脳血管障害、脳卒中、血液凝固の問題による脳出血、正しく形成しなかった血管、出生時に存在している心臓欠損、または鎌状赤血球症が挙げられる。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、その線維芽細胞の治療的な特性を高めることができる１つ以上の作用物質とともに培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、その線維芽細胞の免疫調節特性を高めることができる作用物質とともに培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、その線維芽細胞の神経発生特性を高めることができる作用物質とともに培養される。線維芽細胞は、その線維芽細胞を個体に提供する前に１つ以上の作用物質とともに培養されてもよい。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、有効量のオキシトシンとともに培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、有効量のヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とともに培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、有効量のメトホルミンとともに培養される。

本開示の線維芽細胞は、１つ以上の血管新生ホルモンを分泌するために使用されることがあり、その血管新生ホルモンとしては、血管成長因子、内皮細胞成長因子、それらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。線維芽細胞は、様々な前駆細胞が存在する組織内で血管新生を誘導するために使用され得る。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、線維芽細胞を用いて組織内で新生血管形成を促進する方法を提供する。線維芽細胞は、その線維芽細胞が血管新生ホルモンを産生するのに十分な条件下において所望の組織に導入され得る。その組織内にそのホルモンが存在することにより、その組織内での新生血管形成が促進され得る。

いくつかの実施形態において、中枢神経系（ＣＮＳ）への投与によって線維芽細胞が個体に提供される。ＣＮＳへの正確な投与様式は、疾患のタイプ、個体の年齢などをはじめとした因子に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、脳内移植または血管内移植によってＣＮＳに投与される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、直接注射によって所望の部位に導入される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、直接移植によって個体の脳に投与される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、単純な注射によって個体のＣＮＳ（例えば、脊髄）に投与される。

線維芽細胞の投与は、ＣＰを処置するために間葉系幹細胞を使用した例に基づいて利用され得る。例えば、Ｃｈｅｎらは、エキソビボ分化プロトコルを利用して、自己の間葉系幹細胞から神経様幹細胞を作製し、続いて、それらのＣＰ患者への影響を評価した。中等度から重度の脳性麻痺を有する６０人の患者を、６ヶ月間の追跡調査を含む、オープンラベル非ランダム化観察者盲検対照臨床試験に登録した。移植群では、合計３０人の脳性麻痺患者に、自家ＮＳＣ様細胞の移植（くも膜下腔に１～２×１０^７細胞）およびリハビリテーション処置を行い、対照群では３０人の患者に、リハビリテーション処置だけを行った。移植群の粗大運動能力測定スコアは、ベースラインスコアと比べて、処置後３ヶ月目（スコアの上昇は４２．６だった。９５％ＣＩ：９．８～７５．３、Ｐ＝．０１１）および６ヶ月目（スコアの上昇は５８．６だった。９５％ＣＩ：２５．８～９１．４、Ｐ＝．００１）において有意に高かった。コントロール群における粗大運動能力測定スコアの上昇は、有意でなかった。処置後１、３および６ヶ月目の言語指数（ｌａｎｇｕａｇｅ ｑｕｏｔｉｅｎｔｓ）の上昇は、両群のベースラインの指数と比べたとき、統計学的に有意でなかった。６０人の患者がすべて生存し、どの患者も重篤な有害事象または合併症を発症しなかった。Ｗａｎｇらは、臍帯由来間葉系幹細胞の投与が、ＣＰに対して治療効果を有するかをさらに明らかにするために、ＣＰを有する８組（１６人）の一卵性双生児を募集し、くも膜下注射を用いて同種異系の臍帯由来間葉系幹細胞を投与した。処置前ならびに処置の１および６ヶ月後に、粗大運動能力尺度（ＧＭＦＭ）および微細運動機能尺度（ＦＭＦＭ）を測定して、治療前後、一卵性双生児の２個体間および双子ペア間において、個体の結果を解析した。反復測定データ分散（Ｒｅｐｅａｔｅｄ－ｍｅａｓｕｒｅｄ ｄａｔａ ｖａｒｉａｎｃｅ）を用いて、治療前ならびに治療の１および６ヵ月後の患者のＧＭＦＭおよびＦＭＦＭスコアを解析した。この研究は、８組（１６人）の小児全員が、治療後１ヶ月目および６ヶ月目の終わりに、治療前と比べてＧＭＦＭの有意な改善を有したのに対して、ＦＭＦＭの回復は、統計学的に有意ではなかったことを報告した。一卵性双生児の２個体間の運動機能の改善には相関があったが、双子ペア間では相関がなかった。この著者らは、ＣＰを有する小児における間葉系幹細胞媒介性の運動機能改善機構に遺伝的因子が寄与しているという仮説を立てることによって結論づけた。間葉系幹細胞によるＣＰの処置について、いくつかの症例報告が公開された。第１の症例報告では、１１歳男児が、難産および出生後の仮死の明らかな病歴を有した；６月齢のとき、家族が、男児の視線が動き回ることに気がつき、注意力の欠如を示すことを認めた。７歳のときの脳ＭＲＩ検査によって、当該小児が、視力障害（すなわち、背側視覚路損傷）を伴う脳性麻痺を有することが示された。当該患者を２０日間入院させ、当該患者に自己の骨髄由来の間葉系幹細胞を４回、静脈内に注入した。移植前ならびに移植の１、６および１２ヶ月後に、視覚誘発電位検査、心電図、通例の血液検査ならびに肝機能検査および腎機能検査を行った。当該患者は、入院中または手術後の追跡調査中にいかなる有害反応も有しなかった。退院後、当該患者は、移植前よりも順調に歩行できた；さらに、移植の６ヶ月後には、視力が有意に改善した（これは電気生理学的検査によっても裏付けられた）。報告された第２の症例は、臍帯由来間葉系幹細胞の投与を含んだ。小児が６月齢のとき、１回目の幹細胞移植における患者の長期追跡調査を行い、５年間追跡調査した。その患者に、臍帯由来間葉系幹細胞を各クールにおいて４回、静脈内注入し、全体として４クールの移植を行った。１回目の移植の前に、臨床検査、ＣＤＣＣ Ｉｎｆａｎｔ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＳｃａｌｅおよびＧｒｏｓｓ Ｍｏｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅ－８８（ＧＭＦＭ－８８）をはじめとした一連の評価を行った。次いで、年１回の臨床検査に加えて、ＧＭＦＭ－８８、Ａｓｈｗｏｒｔｈ攣縮評価および包括的機能評価尺度を用いた年１回の評価を行った。さらに、移植の前および追跡調査の段階において、脳波記録法および脳磁気共鳴画像法を行った。リハビリテーションおよび安全性の追跡調査は、現在までの５年間、継続されている。入院中または手術後の追跡調査中に有害作用に関する訴えはなかった。スケール評価によると、運動機能は、正常レベルに回復した。言語機能は、有意に改善した。さらなる改善のために言語リハビリテーション療法を強化した。この報告は、いくつかのパラメータの改善を示すだけでなく、間葉系幹細胞治療と有効なリハビリテーションプログラムとの間に潜在的な相乗作用があることを示唆しているので、重要である。第３の症例報告は、ＣＰを有する５歳女児を、その妹由来のＭＳＣの静脈内および髄腔内投与で複数回処置し、２８ヶ月間追跡調査したことを説明するものだった。粗大運動機能不全が改善された。他の利点としては、免疫の強化、体力の増大ならびに発声および理解の調整が挙げられた。一時的な微熱が、この処置中の唯一の副作用だった。この著者らは、間葉系幹細胞が、脳性麻痺を有する小児において症状を改善するのに安全かつ有効な治療であり得ると結論づけた。

いくつかの実施形態において、本開示の方法は、虚血イベント後の個体に線維芽細胞を静脈内投与して、その個体における虚血ペナンブラ（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）を減少させ、それにより、細胞死および脳性麻痺発症を予防する工程を含む。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上の神経保護化合物とともに提供され、１つ以上の神経保護化合物の活性を高める。神経保護化合物の例としては、カルシウムチャネルアンタゴニスト、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターアンタゴニスト、フリーラジカルスカベンジャー、抗細胞間接着分子１抗体、ＧＭ－１ガングリオシド、ガンマ－アミノ酪酸アゴニストおよび／またはナトリウムチャネルアンタゴニストが挙げられる。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上のＴＮＦ－α阻害剤と組み合わせて提供される。ＴＮＦ－α阻害剤は、ＴＮＦ－αがＴＮＦ－αレセプターに結合しないようにするまたはＴＮＦ－αレセプターを活性化させないようにすることができる任意の作用物質であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α阻害剤は、シクロヘキシミド、オーラノフィン、金チオリンゴ酸ナトリウム、ロイコトリエンＢ４、インターロイキン－４、インターロイキン－１３、ポリミキシンＢ、胆汁酸、インターロイキン－６、ラクツロース、オキスペンチフィリン、モメタゾン、糖質コルチコイド、コルヒチン、クロロキン、ＦＫ－５０６、ベルベリン、リスベラトロール、プテロスチルベン（ｐｔｅｒｏｓｔｉｌｂｅｎｅ）、ビタミンＡ、ビタミンＣ、シクロスポリン、ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えば、ビンポセチン、ミルリノン、ＣＩ－９３０、ロリプラム、ニトロクアゾン（ｎｉｔｒｏｑｕａｚｏｎｅ）、ザプリナスト、合成リピドＡ、アムリノン、Ｎ－アセチルシステイン、ジチオカルバメートおよび金属キレート剤、ｅｘｏｓｕｒｆ合成界面活性剤、デヒドロエピアンドロステロン、デルタ－テトラヒドロカンナビノール、ホスファチジルセリン、ＴＣＶ－３０９、ＰＡＦアンタゴニスト、サリドマイド、シトクロムｐ４５０阻害剤、サイトカラシンＤ、ケタミン、ＴＧＦ－ベータ、インターロイキン－１０、ペントキシフィリン、ＢＲＬ６１，０６３、カルシウム拮抗薬、クルクミン、カッパー選択的オピオイドアゴインストＵ５０，４８８Ｈ（ｔｒａｎｓ－３，４－ジクロロ－Ｎ－メチル－Ｎ－［７－（１－ピロリジニル）シクロヘキシル］ベンゼン－アセトアミドメタンスルホネート）、アレンドロネート、テトランドリン、スルファサラジン、エピネフリン、ＢＭＳ－１８２１２３、アデノシン、Ｅ３３３０、ニコチン、ＩＶＩＧ、カルジオトロピン－１、ＫＢ－Ｒ７７８５、ＣＧＲＰ、リグストラジン（ｌｉｇｕｓｔｒａｚｉｎｅ）、デキサナビノール、イロプロスト、活性化プロテインＣ、成長ホルモン、スペルミン、ＦＲ－１６７６５３、ｇｍ－６００１、エストラジオール、アスピリン、アミオダロンまたはそれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、ＴＮＦ－αに対する応答性を阻害できる１つ以上の作用物質と組み合わせて被験体に提供される。ＴＮＦ－αに対する応答性を阻害できる作用物質は、被験体において、ＴＮＦ－α刺激によって引き起こされる免疫応答を低減することまたは防ぐことができる任意の作用物質であり得る。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αに対する応答性を阻害できる作用物質は、イブプロフェン、インドメタシン、ネドクロミルナトリウム、クロモリン（クロモグリク酸ナトリウム）、脾臓由来因子、ペントキシフィリン、ＮＧ－メチル－Ｌ－アルギニン、デキサメタゾン、クロルプロマジン、活性化アルファ２マクログロブリン、血清アミロイドＡタンパク質、好中球由来タンパク分解酵素、フェントラミン、プロプラノロール、ロイコトリエン阻害剤、ノルジヒドログアヤレチン酸、ゲニステイン、ブチルヒドロキシアニソール、ＣＮＩ－１４９３、ケルセチン、ガベキサートメシル酸塩、ＳＭ－１２５０２、モノクローナル非特異的抑制因子（ＭＮＳＦ）、ピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）および／またはアプロチニンである。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上の神経保護薬とともに被験体に提供される。神経細胞死および／または神経細胞損傷から保護することができる作用物質としては、ミノサイクリン、エリトロポイエチン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、メトホルミン、ＧＬＰ－１、ジメチルスルホキシド、フェルバメート、ＴＧＦ－ベータ、アウリントリカルボン酸、アムロジピン、ＭＫ－８０１、メマンチン、イルベサルタン、エブセレン、緑茶抽出物、ＢＭＰ－６、ミノサイクリン、ドキシサイクリンおよびセフトリアキソンが挙げられる。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、内在性の神経前駆細胞の活性を刺激できる１つ以上の作用物質とともに提供される。内在性の神経前駆細胞の活性を刺激できる作用物質としては、例えば、メトホルミンが挙げられる。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、投与前に、メトホルミンで処置されるか、またはメトホルミンとともに培養される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、血管新生能を増強するためにメトホルミンとともに培養される。線維芽細胞の血管新生能の強化は、代替サイトカイン（例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＰＧＦ）の計測によって評価され得る。線維芽細胞の血管新生能の強化は、虚血発作に苦しんでいる動物への細胞の直接注射によって評価され得る。メトホルミンによるプレコンディショニングの治療効果を評価するための他の方法としては、例えば、ａ）アポトーシスに対する抵抗性；ｂ）神経栄養因子の産生；ｃ）スーパーオキシドジスムターゼなどの抗酸化酵素の誘導；およびｄ）ＳＤＦ－１などの化学誘引物質に向かう走化性アッセイ、またはケモカインレセプターＣＸＣＲ４の発現によって直接評価されるホーミング活性についてアッセイすることが挙げられる。

本開示の実施形態は、脳性麻痺を処置する方法を包含し、その方法は、ａ）必要に応じて、脳性麻痺を有する個体（例えば患者）を特定する工程；およびｂ）治療的に有効な数の線維芽細胞を、例えば治療的に十分な頻度で、投与する工程を含む。さらなる実施形態は、脳性麻痺のリスクがある個体（例えば、患者または被験体）における脳性麻痺の可能性を低下させる方法を包含し、その方法は、ａ）必要に応じて、脳性麻痺を有する患者を特定する工程；およびｂ）治療的に有効な数の線維芽細胞を、治療的に十分な頻度などで、投与する工程を含む。追加の実施形態は、白質傷害を処置する方法、または白質傷害が脳性麻痺をもたらす可能性の低下を必要とする患者もしくは被験体において、白質傷害が脳性麻痺をもたらす可能性を低下させる方法を含み、その方法は、治療有効量の線維芽細胞を、治療的に十分な頻度などで、投与する工程を含む。その頻度は、１日に１回、１日に２回、１日に３回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１ヶ月に１回、２週間に１回などであり得る。

いくつかの場合において、患者または被験体は、約４歳以下の新生児、乳児または小児であり得る。具体的な場合において、患者または被験体は、約２歳以下の乳児または小児である。具体的な場合において、患者または被験体は、早産新生児を含む新生児である。線維芽細胞は、任意の種類であってよく、それらとしては、ａ）脂肪組織；ｂ）皮膚組織；ｃ）骨髄；ｄ）末梢血；ｅ）ワルトンゼリー；ｆ）胎盤；ｇ）網；ｈ）動員末梢血；およびｉ）それらの混合物からなる組織の群から選択されるものが挙げられる。具体的な場合において、線維芽細胞は、例えば、１回の細胞増殖あたり１４～２１時間の速度で増殖中である。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、１つ以上のインターロイキンを含む１つ以上の特異的なサイトカインを分泌する。特定の実施形態において、線維芽細胞は、７５％コンフルエントの表面において１００万個の線維芽細胞培養物あたり約０．１ｐｇ～７７ｐｇのインターロイキン１を分泌する。具体的な場合において、線維芽細胞は、７５％コンフルエントの表面において１００万個の線維芽細胞培養物あたり約１ｐｇ～５００ｐｇのインターロイキンＦＧＦ－１を分泌する。

具体的な実施形態において、任意の種類および機能の線維芽細胞が、本開示において利用され得る。具体的な場合において、線維芽細胞は、混合リンパ球反応においてＴ細胞に応答して増殖する能力を実質的に低下させる。具体的な場合において、増殖の減少（有意な減少を含む）は、例えば線維芽細胞が加えられていないコントロールの混合リンパ球反応と比べて、２０％超の減少を含む。

本開示の方法において利用される線維芽細胞は、任意の目的で、任意の種類のいずれか１つ以上の作用物質で処置され得るかまたはそれに曝露され得る。具体的な実施形態において、線維芽細胞は、その線維芽細胞の免疫調節活性を増強する１つ以上の作用物質で処置される。具体的な場合において、線維芽細胞は、免疫調節活性を増強するためにヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）で処置される。特定の実施形態において、線維芽細胞１００万個あたり１ｎＭ～１μＭの濃度でｈＣＧが細胞に投与される。ｈＣＧは、線維芽細胞１００万個あたり１０ｎＭ～１００ｎＭの濃度で細胞に投与され得る。線維芽細胞は、免疫調節活性を増強するために有効量のオキシトシンで処置され得る。
ＩＶ．線維芽細胞および培養細胞

本開示の態様は、治療的な方法および組成物において有用な細胞を含む。本明細書中に開示される細胞としては、例えば、線維芽細胞、幹細胞（例えば、造血幹細胞または間葉系幹細胞）および内皮前駆細胞が挙げられる。所与のタイプの細胞（例えば、線維芽細胞）が、単独で、または他のタイプの細胞と組み合わせて、使用され得る。例えば、線維芽細胞が、単離され、単独でまたは１種以上の幹細胞と組み合わせて、被験体に提供され得る。一例において、線維芽細胞が、単離され、１つ以上の内皮前駆細胞とともに被験体に提供される。いくつかの実施形態において、組織再生、免疫調節、血管新生および／または神経発生を刺激できる線維芽細胞が、本明細書中に開示される。いくつかの実施形態において、神経発生を刺激できる線維芽細胞が、本明細書中に開示される。

本開示の組成物は、増殖でき、かつ外胚葉、中胚葉または内胚葉に分化できる、単離された線維芽細胞またはその集団から入手され得る。いくつかの実施形態において、単離された線維芽細胞は、Ｏｃｔ－４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ－２、ＫＬＦ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｒｅｘ－１、ＧＤＦ－３、ＬＩＦレセプター、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ３４４またはＳｔｅｌｌａマーカーのうちの少なくとも１つを発現する。いくつかの実施形態において、単離された線維芽細胞は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４５、ＣＤ１３、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ７３、ＣＤ１０５またはＣＤ９０細胞表面タンパク質のうちの少なくとも１つを発現しない。そのような単離された線維芽細胞は、条件培地の供給源として使用され得る。それらの細胞は、単独で培養されてもよいし、条件培地における成長因子の産生をさらにアップレギュレートするために、他の細胞の存在下において培養されてもよい。

線維芽細胞は、拡大され、それら自体の投与によって利用され得るか、または条件培地を得るために成長培地中で培養され得る。成長培地という用語は、一般に、線維芽細胞の培養にとって十分な培地のことを指す。特に、本発明の細胞の培養にとって現在好ましい培地の１つとしては、ダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）が挙げられる。特に好ましいのは、ＤＭＥＭ－低グルコース（本明細書中ではＤＭＥＭ－ＬＧとも）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）である。ＤＭＥＭ－低グルコースには、好ましくは、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（例えば、規定ウシ胎児血清，Ｈｙｃｌｏｎｅ^ＴＭ，Ｌｏｇａｎ Ｕｔａｈ）、抗生物質／抗真菌薬（好ましくは、ペニシリン（１００単位／ミリリットル）、ストレプトマイシン（１００ミリグラム／ミリリットル）およびアンホテリシンＢ（０．２５マイクログラム／ミリリットル）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．））および０．００１％（ｖ／ｖ）２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ（登録商標），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｍｏ．）が補充される。いくつかの場合において、種々の成長培地が使用されるか、または種々の補充物が提供され、これらは、通常、成長培地への補充として示される。また、本発明に関して、本明細書中で使用される標準成長条件という用語は、５％ＣＯ_２を含む標準的な雰囲気における３７℃での細胞の培養のことを指す（相対湿度は約１００％で維持される）。前述の条件は、培養にとって有用であるが、そのような条件は、細胞を培養するために当該分野において利用可能な選択肢をよく理解する当業者が変更できること（例えば、温度、ＣＯ_２、相対湿度、酸素、成長培地などの変更）が理解されるべきである。

培養細胞も本明細書中に開示される。培養下の細胞を説明するために様々な用語が使用される。細胞培養物とは、一般に、生存している生物から採取され、制御された条件下において生育される細胞（「培養下」の細胞または「培養」細胞）のことを指す。初代細胞培養物は、１回目の継代培養の前の、生物から直接採取した細胞、組織または器官の培養物である。細胞は、細胞の成長および／または分裂を促進する条件下で成長培地中に入れられたとき、培養液中で拡大し、より大きな細胞集団がもたらされる。細胞が培養液中で拡大するとき、細胞増殖の速度は、その細胞の数が２倍になるのに必要な時間の長さ、すなわち「倍加時間」によって計測されることがある。

本開示の方法において使用される線維芽細胞は、老化状態に達するまでに少なくとも２５、３０、３５または４０回の倍加を起こすことができる。１０^１４個以上に到達するまで倍加できる細胞を誘導するための方法が提供される。例は、培養液中に約１０^３～約１０^６細胞／ｃｍ^２で播種されたとき、少なくとも約１０^１４、１０^１５、１０^１６もしくは１０^１７個またはそれ以上の細胞を生成するのに十分に倍加できる細胞を誘導する方法である。好ましくは、これらの細胞数は、８０、７０または６０日以内またはそれより早く得られる。１つの実施形態において、使用される線維芽細胞は、単離および拡大され、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１４１、ＰＤＧＦｒ－アルファ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃからなる群より選択される１つ以上のマーカーを有する。いくつかの実施形態において、その線維芽細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１４１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰまたはＨＬＡ－ＤＱのうちの１つ以上を産生しない。

線維芽細胞および椎骨細胞を含む培養細胞について言及するとき、老化（「複製老化」または「細胞老化」もまた）という用語は、有限の細胞培養に起因し得る特性；すなわち、集団倍加の有限回数を超えて増殖できない特性（ヘーフリック限度と称されることがある）のことを指す。細胞老化は、最初に線維芽細胞様細胞を用いて説明されたが、培養下で首尾良く増殖できるほとんどの正常なヒト細胞型が、細胞老化を起こす。細胞型によってインビトロ寿命は異なるが、最大寿命は、通常、１００回未満の集団倍加である（これは、培養下の全細胞が老化するがゆえに、その培養物が分裂できなくなる倍加の回数である）。老化は、経時的な時間に依存するのではなく、むしろ培養物が起こした細胞分裂の回数、すなわち集団倍加の回数によって計測される。したがって、必須の成長因子を除去することによって静止状態にした細胞は、成長因子を再導入したとき、成長および分裂を再開することができ、その後、連続的に増殖した同等の細胞と同じ回数の倍加を行うことができる。同様に、様々な回数の集団倍加の後、細胞を液体窒素中で凍結し、その後、解凍して培養したときも、それらの細胞は、凍結せずに培養液中で維持された細胞と実質的に同じ回数の倍加を起こす。老化細胞は、死んだ細胞または死にかけている細胞ではなく；プログラム細胞死（アポトーシス）に抵抗性であり、３年もの長い間、非分裂状態で維持され得る。これらの細胞は、生存しており、かつ代謝的に活性であるが、分裂しない。

いくつかの場合において、線維芽細胞は、生検材料から入手され、その生検材料を提供するドナーは、処置される個体であってもよいし（自己）、そのドナーは、処置される個体と異なってもよい（同種異系）。同種異系線維芽細胞を個体に対して利用する場合、その線維芽細胞は、１人または複数のドナーに由来し得る。

線維芽細胞は、真皮線維芽細胞；胎盤線維芽細胞；脂肪線維芽細胞；骨髄線維芽細胞；包皮線維芽細胞；臍帯線維芽細胞；毛嚢由来線維芽細胞；爪由来線維芽細胞；子宮内膜由来線維芽細胞；ケロイド由来線維芽細胞；およびそれらの組み合わせからなる群より選択される起源から入手され得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、真皮線維芽細胞である。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、１種以上の因子を産生するように操作または刺激される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ－６、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ＩＦＮ－γ、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ－２）、ＩＧＦＢＰ－６、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ－１）、単核食細胞コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、神経栄養因子（ＮＴ３）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質（ＴＩＭＰ－１）、ＴＩＭＰ－２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－β）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｄ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子レセプター（ｕＰＡＲ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、ＩＬ１－ａ、ＩＬ－３、レプチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質細胞由来因子－１（ＳＤＦ－１）、血小板由来成長因子－ＢＢ（ＰＤＧＦＢＢ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦβ－１）および／またはＴＧＦβ－３を産生するように操作または刺激される。操作または刺激された線維芽細胞からの因子は、条件培地中に存在することがあり、治療で使用するために回収され得る。

いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、神経修復を促進する能力を高めるために１つ以上の血管新生遺伝子をトランスフェクトされる。「血管新生遺伝子」は、培養系、組織または生物において血管新生を刺激または増強することができるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子のことをいう。線維芽細胞のトランスフェクションにおいて有用であり得る血管新生遺伝子の例としては、アクチビンＡ、アドレノメデュリン、ａＦＧＦ、ＡＬＫ１、ＡＬＫ５、ＡＮＦ、アンジオゲニン、アンジオポエチン－１、アンジオポエチン－２、アンジオポエチン－３、アンジオポエチン－４、ｂＦＧＦ、Ｂ６１、ｂＦＧＦ誘導活性、カドヘリン、ＣＡＭ－ＲＦ、ｃＧＭＰアナログ、ＣｈＤＩ、ＣＬＡＦ、クローディン、コラーゲン、コネキシン、Ｃｏｘ－２、ＥＣＤＧＦ（内皮細胞由来の成長因子）、ＥＣＧ、ＥＣＩ、ＥＤＭ、ＥＧＦ、ＥＭＡＰ、エンドグリン、エンドセリン、エンドスタチン、内皮細胞増殖抑制因子、内皮細胞生存能維持因子、内皮分化スフィンゴ脂質Ｇタンパク質共役レセプター－１（ＥＤＧ１）、エフリン、Ｅｐｏ、ＨＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＰＤ－ＥＣＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＩＬ８、成長ホルモン、フィブリン断片Ｅ、ＦＧＦ－５、フィブロネクチン、フィブロネクチンレセプター、第Ｘ因子、ＨＢ－ＥＧＦ、ＨＢＮＦ、ＨＧＦ、ＨＵＡＦ、心臓由来の血管細胞増殖阻害因子、ＩＬ１、ＩＧＦ－２ ＩＦＮ－ガンマ、α１β１インテグリン、α２β１インテグリン、Ｋ－ＦＧＦ、ＬＩＦ、平滑筋腫由来増殖因子、ＭＣＰ－１、マクロファージ由来成長因子、単球由来成長因子、ＭＤ－ＥＣＩ、ＭＥＣＩＦ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ９、ウロキアーゼプラスミノーゲン活性化因子、ニューロピリン、ニューロセリン（ｎｅｕｒｏｔｈｅｌｉｎ）、一酸化窒素供与体、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、ノッチ、オクルディン、帯オクルディン（ｚｏｎａ ｏｃｃｌｕｄｉｎｓ）、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦレセプター、ＰＤＧＦＲ－β、ＰＤ－ＥＣＧＦ、ＰＡＩ－２、ＰＤ－ＥＣＧＦ、ＰＦ４、Ｐ１ＧＦ、ＰＫＲ１、ＰＫＲ２、ＰＰＡＲ－ガンマ、ＰＰＡＲ－ガンマリガンド、ホスホジエステラーゼ、プロラクチン、プロスタサイクリン、プロテインＳ、平滑筋細胞由来成長因子、平滑筋細胞由来遊走因子、スフィンゴシン－１－リン酸－１（ＳＩＰ１）、Ｓｙｋ、ＳＬＰ７６、タキキニン、ＴＧＦ－ベータ、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、ＴＧＦ－β、ＴＧＦ－βレセプター、ＴＩＭＰｓ、ＴＮＦ－α、トランスフェリン、トロンボスポンジン、ウロキナーゼ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ（１６４）、ＶＥＧＩおよびＥＧ－ＶＥＧＦが挙げられる。１つ以上の血管新生因子をトランスフェクトされた線維芽細胞は、脳性麻痺を処置または予防する本開示の方法において使用され得る。

適切な条件下において、線維芽細胞は、インターロイキン－１（ＩＬ－１）および／または他の炎症性サイトカインを産生できる場合がある。いくつかの実施形態において、本開示の線維芽細胞は、ＩＬ－１または他の炎症性サイトカインの発現を防ぐまたは低減するように改変される（例えば、遺伝子編集によって）。例えば、いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、その線維芽細胞がＩＬ－１を発現できないようにＩＬ－１遺伝子が欠失したまたは機能的でない線維芽細胞である。そのような改変された線維芽細胞は、被験体に提供されたとき、限られた炎症促進能力を有することによって、本開示の治療的な方法において有用であり得る。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、ＴＮＦ－αで処置される（例えば、ＴＮＦ－αと培養される）ことにより、成長因子の発現および／または線維芽細胞の増殖を誘導する。

いくつかの実施形態において、本開示の線維芽細胞は、個体（例えば、個体のＣＮＳ）に導入した後、分化する前駆体細胞として使用される。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、個体（例えば、ＣＮＳ）に導入される前に、異なる細胞型（例えば、神経細胞）への分化に供される。例えば、線維芽細胞は、ＣＮＳに特有の少なくとも１つのタンパク質を発現する細胞に分化され得、そのタンパク質としては、クラスＩＩＩ β－チューブリン、ニューロフィラメントのＭサブユニット、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧｌｕＲ１～４およびＧｌｕＲ６クラスのグルタメートレセプターサブユニット、グリア線維性酸性タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、脳因子１、ＮｅｕＮ、ＮＦ－Ｍ、ＮＳＥ、ネスチンおよびｔｒｋＡが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書中に開示されるように、線維芽細胞は、個体に導入する前または後に、１種以上の因子を分泌し得る。そのような因子としては、成長因子、栄養因子およびサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、分泌される因子は、個体において治療効果を有し得る。いくつかの実施形態において、分泌される因子は、同じ細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、分泌される因子は、隣接するおよび／または遠位の内在性細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、分泌される因子は、細胞増殖および／または細胞分化を刺激した。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、ヒト成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、インスリン様成長因子、造血幹細胞増殖因子、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー、血管細胞または内皮細胞成長因子、およびＴＧＦβファミリーのメンバーから選択されるサイトカインまたは成長因子を分泌する。

いくつかの実施形態において、本開示は、線維芽細胞に由来するエキソソームを治療様式として利用する。線維芽細胞に由来するエキソソームは、本明細書中に開示される様々な方法および組成物における線維芽細胞に加えて、またはその代わりに、使用され得る。エキソソームを単離、定量および標準化するための方法は、説明されている（１４２－１６４）。
Ｖ．治療的組成物の投与

本明細書中に提供される治療は、治療薬の単独または併用での投与を含み得る。治療は、当該分野で公知の任意の好適な様式で投与され得る。例えば、第１の処置と第２の処置とが、連続的に（異なる時点において）投与されてもよいし、同時に（同じ時点において）投与されてもよい。いくつかの実施形態において、第１の処置と第２の処置は、別個の組成物として投与される。いくつかの実施形態において、第１の処置と第２の処置は、同じ組成物として投与される。

本開示の実施形態は、治療的組成物を含む組成物および方法に関する。それらの異なる治療は、１つの組成物として、または１つより多い組成物（例えば、２つの組成物、３つの組成物または４つの組成物）として投与され得る。作用物質の様々な組み合わせが使用され得る。

本開示の治療薬は、同じ投与経路または異なる投与経路によって投与され得る。いくつかの実施形態において、癌治療は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、植え込みによって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に、または鼻腔内に投与される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、植え込みによって、吸入によって、髄腔内に、脳室内に、または鼻腔内に投与される。適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、疾患の重症度および経過、個体の臨床的な状態、個体の病歴および処置に対する応答、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。

処置は、様々な「単位用量」を含み得る。単位用量は、所定の量の治療的組成物を含むと定義される。投与される量ならびに特定の経路および製剤は、臨床分野の当業者の決定スキルの範囲内である。単位用量は、単回注射として投与される必要はなく、所定の期間にわたる持続注入を含み得る。いくつかの実施形態において、単位用量は、単回投与可能な用量を含む。

処置の回数と単位用量の両方に係る、投与されるべき量は、所望の処置効果に依存する。有効な用量は、特定の効果を達成するために必要な量のことを指すと理解される。実施に際して、ある特定の実施形態において、１０ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの範囲内の用量は、これらの作用物質の保護能力に影響し得ることが企図される。したがって、用量には、約０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５および２００、３００、４００、５００、１０００μｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、μｇ／日もしくはｍｇ／日という用量またはこれらの中で導き出せる任意の範囲が含まれることが企図される。さらに、そのような用量は、１日の間に複数回で、および／または複数日数、複数週間もしくは複数月の間に複数回で投与され得る。

ある特定の実施形態において、薬学的組成物の有効な用量は、約１μＭ～１５０μＭという血中濃度を提供できる量である。別の実施形態において、有効な用量は、約４μＭ～１００μＭ；または約１μＭ～１００μＭ；または約１μＭ～５０μＭ；または約１μＭ～４０μＭ；または約１μＭ～３０μＭ；または約１μＭ～２０μＭ；または約１μＭ～１０μＭ；または約１０μＭ～１５０μＭ；または約１０μＭ～１００μＭ；または約１０μＭ～５０μＭ；または約２５μＭ～１５０μＭ；または約２５μＭ～１００μＭ；または約２５μＭ～５０μＭ；または約５０μＭ～１５０μＭ；または約５０μＭ～１００μＭ（またはこれらの中で導き出せる任意の範囲）という血中濃度を提供する。他の実施形態において、その用量は、被験体に投与される治療薬に起因する、以下の作用物質の血中濃度を提供できる：約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００μＭ、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００μＭ、または多くとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００μＭ、あるいはこれらの中で導き出せる任意の範囲。ある特定の実施形態において、被験体に投与される治療薬は、身体内で被代謝治療薬（ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）に代謝され、その場合、血中濃度は、その被代謝治療薬の量のことを指し得る。あるいは、治療薬が被験体によって代謝されない限り、本明細書中で論じられる血中濃度は、未代謝治療薬のことを指し得る。

治療的組成物の正確な量は、施術者の判断にも依存し、各個体に固有である。用量に影響する因子としては、患者の身体的および臨床的状態、投与経路、意図する処置目標（症状の軽減対治癒）、ならびに特定の治療的物質または被験体が受けている可能性がある他の治療の効力、安定性および毒性が挙げられる。

μｇ／ｋｇ体重またはｍｇ／ｋｇ体重といった投与量の単位は、μｇ／ｍｌまたはｍＭ（血中濃度）といった匹敵する濃度単位、例えば、４μＭ～１００μＭに換算および表現され得ることが当業者によって理解および認識されるだろう。取り込みは、種依存的および器官／組織依存的であることも理解される。適用可能な変換係数、ならびに取り込みおよび濃度測定に関して行われる生理学的仮定は、周知であり、それらによって、当業者が、ある濃度測定値を別のものに換算すること、ならびに本明細書中に記載される用量、有効性および結果に関して妥当な比較を行い、結論を出すことが可能になるだろう。

本開示は、本開示の細胞をヒトに移植するために、その細胞を本明細書中に記載されるように調製し得ることを包含する。いくつかの実施形態において、その細胞は、スクリーニングされたドナーに由来し、そのドナーは、細胞を移植される患者と遺伝的に異なる（すなわち、同種移植）。細胞が患者由来でない場合、いくつかの実施形態において、血液型またはハプロタイプ適合性は、ドナー細胞と患者との間で決定される。細胞は、静脈内に投与され得るか、またはいくつかの状況においては、局所的に投与され得る。Ｂｒｏｗｎ－Ｒｏｂｅｒｔｓ－Ｗｅｌｌｓコンピュータ断層撮影（ＣＴ）定位ガイドを用いて、手術が行われ得る。この場合、患者の頭皮領域に局所麻酔を行い、ミダゾラムを静脈内投与する。患者のＣＴスキャンを行って、移植片を受け取る領域の座標を確定する。注射カニューレは、通常、１９ゲージの内側スタイレットを有する１７ゲージのステンレス鋼外側カニューレからなる。これを脳の正確な座標に挿入し、次いで、約３０μｌの組織懸濁液を予め充填した１９ゲージの注入カニューレと交換する。カニューレを引き抜きながら、細胞を約３μｌ／分の速度でゆっくり注入する。関心領域全体におよそ４ｍｍ間隔で定位針を複数回通す。手術後にＣＴスキャンによって出血または浮腫について患者を検査する。移植した細胞の代謝活性を測定するためのＰＥＴスキャンのみならず、神経学的な評価を手術後の様々な間隔で行う。

１つの実施形態において、１回の注入につき約１０^５～約１０^１３細胞／１００ｋｇがヒトに投与される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１．５×１０^６～約１．５×１０^１２細胞が注入される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１×１０^９～約５×１０^１１細胞が注入される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約４×１０^９～約２×１０^１１細胞が注入される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約５×１０^８細胞～約１×１０^１細胞が注入される。いくつかの実施形態において、細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続３～７日間にわたって複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続３～７日間にわたって３～７回の投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続５日間にわたって５回の投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１０^５～約１０^１３細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１．５×１０^８～約１．５×１０^１２細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１×１０^９～約５×１０^１１細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約５×１０^１０細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり１×１０^１０細胞の単回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１０^５～約１０^１３細胞の複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、１００ｋｇあたり約１．５×１０^８～約１．５×１０^１２細胞の複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続３～７日間にわたって１００ｋｇあたり約１×１０^９～約５×１０^１１細胞の複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続３～７日間にわたって１００ｋｇあたり約４×１０^９細胞の複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続３～７日間にわたって１００ｋｇあたり約２×１０^１１細胞の複数回投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続５日間にわたって約３．５×１０^９細胞の５回の投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続５日間にわたって約４×１０^９細胞の５回の投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続５日間にわたって約１．３×１０^１１細胞の５回の投与が提供される。いくつかの実施形態において、連続５日間にわたって約２×１０^１１細胞の５回の投与が提供される。
ＶＩ．本開示のキット

本明細書中に記載される細胞性および／もしくは非細胞性組成物のうちのいずれかまたはそれに類似のものが、キットに含められ得る。非限定的な例では、線維芽細胞またはその誘導体（例えば、線維芽細胞に由来するエキソソーム）を調製するための方法において使用するための１つ以上の試薬が、キットに含められ得る。そのような試薬としては、細胞、ベクター、１つ以上の成長因子、ベクター １つ以上の共刺激因子、培地、酵素、緩衝液、ヌクレオチド、塩、プライマー、化合物などが挙げられ得る。キットの構成要素は、好適な容器手段の中に提供される。

キットのいくつかの構成要素は、水性媒質中にまたは凍結乾燥された形態で、包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、ある構成要素が入れられ得る、好ましくは、適切に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられる。２つ以上の構成要素がキットに存在する場合、そのキットは、通常、追加の構成要素が別々に入れられ得る、第２、第３または他のさらなる容器も含み得る。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、バイアルに含められてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、商業的販売のために厳重に閉じ込められた構成要素を含めるための手段も含む。そのような容器には、所望のバイアルを保持する、射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器が含まれ得る。

上記キットの構成要素が、１つおよび／またはそれ以上の液体溶液として提供されるとき、その液体溶液は、水溶液であり、滅菌された水溶液が特に有用である。いくつかの場合において、容器手段は、それ自体が、シリンジ、ピペットおよび／もしくは他のこのような装置であってもよいし、所望の反応のために複数のコンパートメントを有する基材であってもよい。

キットのいくつかの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／または構成要素が、乾燥粉末として提供されるとき、その粉末は、好適な溶媒を加えることによって再構成され得る。その溶媒も別の容器手段内に提供され得ることが構想される。キットは、滅菌された許容され得る緩衝液および／または他の希釈剤を含めるための第２の容器手段も含み得る。

具体的な実施形態において、試薬および材料には、所望の配列を増幅するためのプライマー、ヌクレオチド、好適な緩衝液または緩衝試薬、塩などが含まれ、いくつかの場合において、それらの試薬には、特定の所望の細胞を単離するための装置または試薬が含まれる。

特定の実施形態において、個体から１つ以上のサンプルを抽出するのに適した１つ以上の装置がキット内に存在する。その装置は、シリンジ、細針、メスなどであり得る。

本開示およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の請求項によって定義される構想の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換および改変が本明細書中で行われ得ることが理解されるべきである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、機械、製造品、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に限定されると意図されていない。当業者は、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすまたは実質的に同じ結果を達成する、現在すでに存在しているまたは後に開発される、プロセス、機械、製造品、組成物、手段、方法または工程が本開示に従って利用され得ることを本開示からすぐに認識するだろう。したがって、添付の請求項は、そのようなプロセス、機械、製造品、組成物、手段、方法または工程をそれらの範囲内に含めるように意図されている。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法は、本開示の方法の実施において十分に機能すると本発明者らが発見した手法であり、ゆえにその実施に対する好ましい形式であると考えることができることが当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される具体的な実施形態において多くの変更を行うことができ、それらの変更は、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、なおも同様または類似の結果をもたらすと認識するだろう。
実施例１：インビボ脳性麻痺モデルの処置における線維芽細胞の神経行動学的評価

体重が２０±５グラムの７日齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、１２時間の昼夜サイクル、（２３～２５）℃の温度、４５～６０％の湿度であり、定期的な消毒および換気を行う部屋において自由に飲食できるようにした。

１２匹のラットの群をシャム群としてランダムに選択する。残りの６０匹のラットの左総頸動脈を結紮し、２時間無酸素にすることによって、脳性麻痺（ＣＰ）のラットモデルを確立する。麻酔ラットの腹腔内に麻酔のために１％ペントバルビタールナトリウムを注射する。実験ラットを手術皿の上で仰臥位にし、手足および頭を固定し、頚部の前面をヨードフォールで消毒する。胸鎖乳突筋の内側と頚部の前部との接合部における三角形の領域に左総頸動脈が見られ、切開部をＮｏ．０ワイヤーで縫合する。実験ラットを直ちに３７℃の無酸素チャンバー内に入れる。８％酸素と９２％窒素との混合物を１Ｌ／分の流速で２時間、連続的に満たす。この無酸素のプロセス全体を酸素濃度計で連続的にモニターする。シャム群では、総頸動脈を引き出すが、低酸素処置なしで結紮は行わない。

細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地中で生育し、細胞をマウス１匹あたり５００，０００細胞の総濃度で投与する。

ラットを各群１２匹ずつ５つの群に分ける：
１．ＣＰ群（他の処置なしで虚血性かつ無酸素のＣＰのラットモデルを確立）、
２．ＣＰ＋ＰＢＳ群（モデル化後３日目に、ＣＰラットの左側脳室に２μＬのＰＢＳを定位注射）、
３．ＣＰ＋ＢＭＳＣ群（モデル化後３日目に、ＣＰラットの左側脳室に２μＬのＢＭＳＣを定位注射）、
４．ＣＰ＋脂肪ＭＳＣ群（モデル化後３日目に、ＣＰラットの左側脳室に２μＬの脂肪ＭＳＣを定位注射）および
５．ＣＰ＋線維芽細胞群（モデル化後３日目に、ＣＰラットの左側脳室に２μＬの線維芽細胞を定位注射）。

モデル化の３週間後にラットの神経行動学的評価を行う。
Ａ）モーリス水迷路試験：水を取り囲む壁に面したラットを、水への４つの入口点から数回水中に入れ、水面下の隠されたプラットフォームを発見するまでの時間、すなわち脱出潜時を記録する。
Ｂ）懸垂試験：ラットの前肢で０．５ｃｍのガラス棒をつかませ、落下するまでの時間を観察する：＜１０秒は１点、１０～３０秒は２点、３１～１１９秒は３点、２～５分は４点、＞５分は５点である。
Ｃ）スロープ試験：ラットを４５°のスロープに置き、方向転換する時間を観察する。
Ｄ）オープンフィールド試験：長さおよび幅が３６ｃｍの覆われた箱の底を９等分の格子に分割し、ラットの活動を記録する。ラットの身体部分の１／２超が隣接するグリッドに入った場合は１点、ラットの後肢が立っていた場合は１点である。その２つの点の合計を総スコアとする。

一例において、食塩水を投与されたマウスでは改善は観察されず、間葉系幹細胞のレシピエント（骨髄および脂肪）では軽微な改善が観察され、線維芽細胞を投与されたマウスでは有意な改善が観察される。

Claims (25)

1. 有効量の線維芽細胞を対象に提供することを含む、対象の脳性麻痺を治療または予防する方法。
2. 前記対象が約４歳以下である、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象が約２歳以下である、請求項２記載の方法。
4. 前記対象が新生児である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記新生児が早産の新生児である、請求項４記載の方法。
6. 前記線維芽細胞が、胎盤、臍帯血、末梢血、網、毛包、皮膚、骨髄、脂肪組織、またはウォートン・ゼリーから得られた線維芽細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記線維芽細胞が、１細胞増殖あたり１４～２１時間の速度でインビトロで増殖可能なものである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記線維芽細胞が、インビトロで培養された場合にインターロイキン－１（ＩＬ－１）を分泌する能力を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記線維芽細胞が、約７５％のコンフルエントで培養した場合に、１００万個の線維芽細胞あたり１ｐｇ及び７７ｐｇの間でＩＬ－１を分泌する能力を有する、請求項８に記載の方法。
10. 前記線維芽細胞が、インビトロで培養したときに線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ－１）を分泌する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記線維芽細胞が、約７５％のコンフルエントで培養した場合に、１００万個の線維芽細胞あたり１ｐｇ及び５００ｐｇの間でＦＧＦ－１を分泌することができる、請求項１０に記載の方法。
12. 前記線維芽細胞が、混合リンパ球反応におけるＴ細胞の増殖を減少させることができる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. Ｔ細胞増殖を減少させることが、コントロールの混合リンパ球反応と比較して２０％より大きいＴ細胞増殖減少を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 提供の前に、線維芽細胞をヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）と共に培養することをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記線維芽細胞を、線維芽細胞１００万個当たり１ｎＭ及び１μＭの間の濃度でｈＣＧと共に培養する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記線維芽細胞を、線維芽細胞１００万個当たり１０ｎＭ及び１００ｎＭの間の濃度でｈＣＧとともに培養する、請求項１５に記載の方法。
17. 提供する前に、線維芽細胞をオキシトシンと共に培養することをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 提供する前に、線維芽細胞をメトホルミンと共に培養することをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 提供する前に、線維芽細胞をヒト絨毛性ゴナドトロフィンとともに培養することをさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
20. 提供する前に、線維芽細胞をオキシトシン、メトホルミン及びヒト絨毛性ゴナドトロフィンと共に培養することをさらに含む、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 線維芽細胞がＩＬ－１を発現しない、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記対象に１つまたは複数の神経保護剤を提供することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記神経保護剤が、エリスロポエチン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、メトホルミン、ＧＬＰ－１、ジメチルスルホキシド、フェルバメート、ＴＧＦ－β、オーリントリカルボン酸、アムロジピン、ＭＫ－８０１、メマンティン、イルベサルタン、エブセレン、緑茶エキス、ＢＭＰ－６、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、セフトリキソンまたはそれらの組み合わせである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記脳性麻痺が先天性である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記脳性麻痺が後天性である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。