KR100818213B1 - 파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 FBS 함유 배지에서 8~15% CO₂의 조건으로 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포 및 그 제조방법을 제공한다: (a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐; 및 (d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명에 따른 성체 줄기세포는 인간 제대혈 유래로, 파골세포 기반 적소 유사 구조와 결합하여 기존의 성체 줄기세포에 비하여 미분화 단계에서 오랜 기간동안 왕성한 세포 성장을 하여, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 신경세포, 골형성세포 및 지방세포 등 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 신경계 질환, 골격계 질환 등의 치료에 효과적이다.

제대혈, 다분화능 줄기 세포, 파골세포, 적소, 증식

Description

파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법{Human Cord Blood Multipotent Stem Cell Having Enhanced Proliferation Ability With Osteoclast-based Niche-like Structure and Method for Preparing the Same}

도 1은 인간 제대혈 유래 세포를 분리한 후, 각각 3일째 및 14일째 세포 성장 형태를 나타낸 사진(A 및 B) 및 새로운 용기에 옮긴 후 각각 3일째 및 10일째 세포 성장을 나타낸 사진이다(C 및 D).

도 2는 본 발명에 따른 줄기 세포를 배양한 다음, 새로운 용기로 옮기고, 세포의 개수를 세는 과정을 나타낸 그림이다.

도 3은 제대혈 유래 줄기 세포의 시간에 따른 세포 증식을 나타낸 그래프이다 ((A): 계대배양에 따른 각 배양접시별 세포의 증식 (B): 세포의 산술적 총 증식된 세포의 수).

도 4는 본 발명에 따른 둥근형 세포가 줄기 세포 마커를 발현함을 분석한 결과이다 (A: 세포집락 내 Oct4 발현사진, B: 세포집락 광학 이미지, C: Oct4 및 광학 이미지의 합성, D: Oct4 발현, E: SH4의 발현사진, F: SH4와 Oct4의 발현 합성 사진).

도 5는 본 발명에 따른 대형 다핵 세포의 파골세포 특성을 분석한 TRAP 염색 결과를 나타낸 것이다 (A: TRAP 염색사진 및 B: hochest 염색사진).

도 6은 파골세포 및 선형 세포 모두 본 발명에 따른 다분화능 줄기세포의 증식능에 기여하고 있음을 나타낸 세포 사진이다 (A: 선형 또는 내피 세포 유사 세포로 둘러싸인 대형의 다핵 세포에 위치한 세포 콜로니를 나타낸 사진, B: 트립신 처리후의 사진, 및 C: 다핵세포가 콜로니로부터의 단일 세포들을 지지함을 나타내는 사진).

도 7은 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기세포가 각각 골형성세포, 지방 세포 및 신경 전구세포로 분화되었음을 나타내는 것이다 (A: 골형성 세포로 분화한 Von Kossa 염색 사진, B: 지방세포로 분화한 Oil-red O 염색 사진, C: 신경 세포로 분화한 GAFP 발현 사진, 및 D: 신경 세포 분화후의 광학 사진).

도 8은 본 발명에 따른 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포와 파골세포 기반 적소 유사 구조가 결합되어 있는 형태를 개략적으로 나타낸 그림이다.

본 발명은 파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 FBS 함유 배지에서 8~15% CO₂의 조건으로 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포 및 그 제조방법을 제공한다: (a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐; 및 (d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

줄기 세포들은 자기 재생(self-renewing), 분화, 영구성(immortal) 등의 특징을 가지고 있으며, 이러한 독특한 성질을 이용하여 다양한 퇴행성 질병의 치료를 위한 해결방법 뿐만 아니라 세포들의 biology에 대한 깊은 통찰을 할 수 있다. 다양한 조직으로부터의 성체 줄기 세포는 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 훨씬 더 매력적이다. 제대혈로부터의 줄기세포는 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에, 다른 성체 줄기세포들보다 더 큰 장점을 가지고 있다.

in vitro에서 제대혈 다분화능 줄기세포는 성공적으로 신경 세포, 간세포, 골세포와 같은 다양한 종류의 세포에 성공적으로 도입되었다(Sun, W. et al ., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al ., Tissue Engineering, 11:1407, 2005). 또한, in vivo에서, 제대혈 다분화능 줄기세포를 이용한 상처, 당뇨병, 심장 경색(heart infraction) 등에 성공적인 이식이 여러 논문들을 통해 보고되어 왔다 (Nonome, K. et al ., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al ., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al ., Circulation, 112:96, 2005). 전염병의 전달 위험이 적고, 이식 대 숙주 병(graft-versus-host disease)에 걸릴 위험이 낮아, 제대혈 다분화능 줄기세포 이식은 소아, 성인환자 모두에게 급속히 시술되고 있다 (Claudio G. B. et al ., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006). 제대혈 이식이 몇몇 질병, 특히 조혈모 결함(hematopoietic defection)과 관련된 병들에 시술할 수 있는 접근으로써 받아들여졌다 할지라도(Grewal, SS. et al ., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al ., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al ., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al ., Blood, 103:489, 2004), 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 임상적 적용에 관한 연구는 여전히 제한되어 있다. 예를 들어, 척수 손상된 여성 및 버거병(buerger's disease) 환자에서 완전한 회복은 아니지만, 부분적으로 성공한 보고들이 있다 (Kim, SW. et al ., Stem Cells, 2006; Kang, KS. et al ., Cytotherapy, 7:368, 2005). 그러나, 이러한 세포들의 발달 메커니즘 뿐만 아니라, 이 세포들을 어떻게 잘 배양하고 증식하는지에 대해서는 여전히 잘 알려져 있지 않다.

한편, 줄기 세포 적소(stem cell niche)는 , TGF 베타, Wnts Families와 같은 분비된 인자들, notch pathway와 같은 내재성 막단백질(integral membrane proteins)에 의해 중재되는 세포간 상호작용, 많은 신호 경로들과 관련있는 인테그 린(integrin)과 세포외 기질을 통해 줄기 세포의 미세환경을 총체적으로 보완하고, 줄기세포의 유지, 자기 재생 및 분화를 조절하는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포를 위한 분비된 인자를 축적할 수 있다 (Watt FM. et al ., Science, 287:1427, 2000). 줄기 세포 적소를 잘 이해하면 줄기 세포 자체를 더 잘 알 수 있어 연구에 도움을 주고, 의학적으로 이용할 수 있는 줄기세포의 증식방법을 찾는데 도움을 주기때문에, 줄기 세포 적소에 관한 연구는 줄기 세포 생물학에서 또 다른 초점이 되는 분야이다. 줄기세포 적소 중 활발히 연구가 된 분야는 조골세포(osteoblast)가 중요한 역할을 할 것으로 여겨지는 조혈모 줄기 세포 적소이다 (Zhang J. et al ., Nature, 425:836, 2003; Calvi LM. et al ., Nature, 425:841, 2003; Jung Y. et al., Bone in press, 2005). 상기 연구에 관해서는, Russel St 및 최근 Wilson A. et al.에 의해 잘 재고되었다 (Russell ST., Blood, 105:2631, 2005; Wilson A. et al., Nature reviews, 6:93, 2006). 그러나, 조골세포가 아닌 파골세포(osteoclast)와 줄기 세포 증식과의 관련성에 대한 연구는 미비하였다.

이에 본 발명자들은, 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 FBS 함유 배지에서 기존의 일반적인 5%의 CO₂ 조건과는 달리 8~15% CO₂의 조건으로 배양하여 수득되는 모조 자기 재생 유형의 적소(mimic self-renewing type niche), 즉 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 확인하고, 줄기 세포의 생존과 증식을 유지할 수 있도록 하는 배양 시스템에서 파골세포(osteoclast)가 중요한 역할을 한다는 사실을 발 견하고, 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 미분화 단계에서 장기간 왕성한 증식능을 가지고, 다음과 같은 특징을 가지는 인간 제대혈 유래 다분화능 성체 줄기세포 및 그 제조방법을 제공하는데 있다:

(a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

(c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐; 및

(d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 FBS 함유 배지에서 8~15% CO₂의 조건으로 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법을 제공한다:

(a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

(c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐; 및

(d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 DMEM이고, 1∼30% FBS 및 bFGF를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 파골세포는 상기 제대혈 유래 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)로부터 유래한 선구체(progenitor)로부터 생성되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 제조되고, 다음과 같은 특성을 가지는 성체 줄기세포를 제공한다:

(a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

(b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

(c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐;

(d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

(e) 미분화상태로 오랜기간 왕성한 증식능을 가짐.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

Full term UCB 샘플(n=8)은 산모 동의하에 24시간 이내에 수집하였다. 단핵 세포들은 골수에서의 방법과 마찬가지로 피콜상(ficoll gradient)에서 분리하였다. 2mM/L 글루타민, 1000U 스트렙토마이신, 100U 페니실린, 10ng/mL의 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor; R&D SystemsMinneapolis, MN)를 함유한 20% FBS(Hyclone, Logan, UT) 및 DMEM(Gibco, grand island, NY)으로 채워진 75cm² 플라스크에 1×10⁸ 세포를 시딩하였다.

상기 분리 후, CO₂ 10% 조건에서 배양한 지 7~10일째에, 세포들은 거의 confluence되고, 몇몇 cluster들이 형성되었다. digestion한 다음, 세포들을 10⁴/ml의 농도로 DMEM 배지가 있는 새로운 용기로 옮겼다. 처음 용기로부터 부유한 세포(floating cells)들은 새로운 용기로 옮겨졌다. 또한, 도 2에서 나타난 방식대로, 세포를 이동시켰다.

동일한 양의 배지를 7일마다 첨가해주었고, 새로운 용기에 이동시킨 다음, 4주 후에, 배지를 회수하여 원심분리하였다. 배지에 현탁되어 있는 세포들은 10⁴/ml농도의 DMEM 배지가 있는 용기에 다시 시딩되었다.

또한, 첫번째 용기는 배지를 첨가해줌으로써 유지되었고, 현탁된 세포들은 2주 후에 다시 회수되었다. 각각의 75cm²의 플라스크에, 10⁵개의 세포들은 2주마다 수득되었다. 플라스크는 2달동안 유지하면서 배양하였다.

상기 인간 제대혈 유래 다분화능 성체 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int . Immunol ., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다분화능 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol ., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다분화능 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. 어떠한 방법도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다.

플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다.

각종 표면 항원으로서는 조혈관련항원, 중간엽계 세포의 표면 항원 또는 신경계 뉴런의 특이항원 등을 들 수 있다. 상기 조혈관련 항원으로는 CD34, CD45 등이 있고, 중간엽계 세포의 표면 항원으로는 SH-2, SH-3 등을 들 수 있으며, 신경계 뉴런의 특이항원으로는 NSE, GFAP 등을 들 수 있다. 전술한 각종 표면 항원을 인식하는 항체를 단독 혹은 조합하여 사용함으로서, 목적하는 세포를 취득할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 골형성 세포, 지방 세포 및 신경 전구 세포로의 분화 실험만을 하였으나, 이에 제한되지 않고, 본 발명에 따른 성체 줄기세포를 다른 세포로의 분화에 적용하는 것은 당업자에게 용이할 것이다. 또한, 하기 실시예에서 는 CO₂ 10% 조건에서 배양하였으나, 8~15% 내의 CO₂ 조건에 본 발명에 따른 성체 줄기세포의 제조방법을 적용하는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 배양 및 증식능 조사

Full term UCB 샘플(n=8)은 산모 동의하에 24시간 이내에 수집하였다. 단핵 세포들은 골수에서의 방법과 마찬가지로 피콜상(ficoll gradient)에서 분리하였다. 2mM/L 글루타민, 1000U 스트렙토마이신, 100U 페니실린, 10ng/mL의 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor; R&D SystemsMinneapolis, MN)를 함유한 20% FBS(Hyclone, Logan, UT) 및 DMEM(Gibco, grand island, NY)으로 채워진 75cm² 플라스크에 1×10⁸ 세포를 시딩하였다.

상기 분리 후, CO₂ 10% 조건에서 배양한 지 7~10일째에, 세포들은 거의 confluence되고, 몇몇 cluster들이 형성되었다. 상기 cluster들을 digestion한 다음, 세포들을 10⁴/ml의 농도로 DMEM 배지가 있는 새로운 용기로 옮겼다. 4~7일이 더 지난후, 세포는 70% heterogenously confluence되었다(도 1A 및 1B). 도 1에 나타난 바와 같이, A 및 B는 각각 분리후 3일째 및 14일째의 세포의 morphology를 나타낸 것이다 (A: 3일, B: 14일, C: 이들로부터 분리된 세포를 계대배양한 후 3일, D: 10일째의 사진). 처음 용기로부터 부유한 세포(floating cells)들은 새로운 용기로 옮겨졌다.

도 2에서 나타난 방식대로, 세포를 이동시켰다. 도 2에서 각각의 줄은 하나의 플라스크가 존재하고, 세포수는 각각의 지점에서 세었으며, 가는 가로줄은 2주를 나타내고, 두꺼운 가로줄은 4주를 나타낸다. 화살표는 세포 옮김을 의미한다.

동일한 양의 배지를 7일마다 첨가해주었고, 콜로니는 확장되었으며, 몇몇 세포들은 escape되고, 배지에 현탁되었다. 새로운 용기에 이동시킨 후 4주 후에, 배지를 회수하여 원심분리하였다. 배지에 현탁되어 있는 세포들은 10⁴/ml농도의 DMEM 배지가 있는 용기에 다시 시딩하였다. 이 경우에도, 반복적으로, 상기와 같은 구가 형성되었다. 또한, 두번째 용기의 배지내에 세포 현탁물은 4주 후에 새로운 용기에 다시 시딩하였다(도 1C 및 D). 도 1C 및 D는 새로운 용기에 옮긴 후 3일째 및 10일째 각각 이 세포들의 특성을 나타낸 사진이다. 세포 콜로니는 선 형태(spindle-shaped)의 세포들에 둘러싸인 대형의 다핵 세포(large multinuclear cell)상에 형성되었다(도 1B, 1C, 1D, 및 도 2A). 아울러, 첫번째 용기에 배지를 첨가하여 유지하였고, 현탁된 세포들을 2주 후에 다시 회수하였다. 각각의 75cm²의 플라스크에서, 10⁵개의 세포들이 2주마다 수득되었다. 플라스크는 2달동안 유지되었다.

도 3은 A, A2B, A1B1C의 세 개의 플라스크에서의 시간에 따른 세포수를 기록한 것이다. 도 2의 표를 참고하여, A2B의 세포들은 A1의 2주째에서 나온 것이고, A1B1C0는 4주째의 A1B로부터 나온 것이다. 각각 플라스크의 세포들은 매 2주마다 약 1×10⁵개로 자랐고, 다른 시간 및 플라스크로부터 얻은 세포들(예를 들어, 플라 스크 A 세포들은 원시적으로 부착된 세포, A2B에 세포들은 2주후 A로부터 나온것들)은 유사한 성장 곡선을 나타냈다. 도 3A에서는 각 세대에도 같은 방법을 통해서 세포들이 자랄 수 있고, 안정적으로 stemness를 유지하고 있음을 나타내준다. 또한, 세포는 도 2(피보나치 수로 늘어남)의 방식으로 증가하기 때문에, 대수적으로 세포들의 총 수율을 계산할 수 있는데, 이것은 도 3B에 점선으로 나타나있다. 안정적인 증식은 2달동안 유지되고, 그 후 수율이 급감하기 때문에, 이동 후 처음 두달동안의 자료를 이용하여 본 발명의 배양 시스템의 총 생산량을 나타내는 커브를 만들었다. 이와 같이, 전형적인 방법(the line with round mark the cell number)과 비교하여, 본 배양 시스템에 의해 다분화능 줄기세포가 효과적으로 증가하였다.

실시예 2: 본 발명에 따른 현탁한 둥근 형태의 세포들 및 선형의 세포들의 특성 분석

배지내에 현탁한 세포들을 특성을 분석하는 flow cytometry 실험을 하였다. 세포 표면 항원 phenotyping을 위해, 3-4 계대 세포들은 분리되어 fluorescein 또는 phycoerythrin이 결합된 항체로 염색하고, FACS Caibur (Becton Dickinson, NY)으로 분석하였다.

일반적으로 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)로 간주되는 선형의 세포들 및 배지내에 현탁한 세포들의 특성을 분석하기 위해, CD4(T세포 마커), CD20(B세포 마커), CD29(단핵 세포 마커), CD31(endothelial cell 내피 세포 및 줄기 세포 마커), CD34 (조혈모 줄기세포 마커), CD44 (조혈모 세포 마커), CD45 (hemato-lineage 세포 마커), CD51/61 (파골 세포 마커), CD73 (중간엽 줄기 세포 마커), CD90 (단핵 세포 마커), CD105 (중간엽 줄기 세포 마커), CD133 (조혈모 줄기세포 마커)을 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석에 적용하였다. 선형 및 둥근형태의 세포들은 유사한 표현형을 갖고있다. 두 종류의 세포들 모두 CD4, CD20, CD34 및 CD51의 lineage marker에 대해서는 음성을 나타내었다. 둥근형 세포들은 CD29, CD44, CD31 및 CD105를 강력하게 발현하였다(표 1).

서로 다른 형태의 세포의 CD 항원에 대한 양성 세포 비율

CD 시리즈 항체들	양성으로 염색된 세포 / 총 세포 (%)
	부유하는 둥근형 세포	부착된 선형 세포
CON	11	13.56
34	6.56	2.2
4	7.08	12.3
51	8.74	6.22
90	6.1	1.71
45	76.56	42.74
105	45.76	17.72
133	12	11.4
20	11.8	15.24
29	70.7	46.42
31	90.68	56.49
44	93.02	73.82
73	9.28	17.18

이 결과는 둥근형의 세포들이 선형의 세포들보다 좀 더 primititive하다는 것을 나타낸다.

POU family transcription factors와 같은 Oct3/4 유전자들은 분화된 조직에서는 존재하지 않고, 높은 증식능을 함유하는 미분화된 줄기 세포들에서 특별히 발현되는 것으로 알려져 있다 (Tai M-H. et al ., Carcinogenesis 26:495, 2005; Tondreau T. et al ., Stem cells, 23:1105, 2005). stemness의 마커로서 Oct4를 사용하여 세포 콜로니를 염색한 결과, 결합한 것은 현탁한 둥근형태의 세포들의 소스이고, 파골세포 위에 있으며, 부착된 선형의 세포들이 동시에 결합되었다. 도 4는 둥근 세포 콜로니들이 줄기 세포 마커를 발현하는 OCT4 염색에 양성을 나타내는 것은 둥근형태의 세포들인 선형의 세포들보다 초기단계라는 것을 의미하며, 이로써, 둥근형태의 세포들이 줄기세포임을 알 수 있었다.

세포내 단백질(intracellular proteins)의 염색을 위해, 세포들은 4℃에서 4% 포름알데히드로 하룻밤동안 고정하고, 0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich)로 10분동안 permeabilize하였다. 슬라이드와 접시는 인간 Oct4(1:50), 인간 SH4(1:50), 인간 GFAP(glial fibrillary acidic protein; Santa Cruz Biotechnology, CA)에 대한 마우스 1차 항체로 1시간동안 인큐베이션한 다음, PBS(phosphate buffered saline; Gibco)로 세척하고, fluorescein- 또는 phycoerythrin- 결합된 goat 항마우스 IgG 2차 항체(Dako; Carpinteria, CA)로 1시간동안 인큐베이션 하여 면역염색을 실시하였다.

도 4에서 나타난 바와 같이, Oct4 염색 결과, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 마커로 알려져 있는 SH4, F는 세포가 Oct4 및 SH4 모두를 발현하는 것을 나타낸다. C는 Oct4 염색과 광학 이미지의 merge 사진이다.

실시예 3: 본 발명의 제대혈 유래 다분화능 줄기세포와 결합되어 있는 파골세포 기반 적소 유사 구조

본 발명에 따른 상기 파골 세포 기반 적소 유사 구조(ostoclast-based niche-like structure)는 둥근형태의 다분화능 줄기세포와 결합되어 있는 대형의 다핵 세포 및 상기 다핵세포와 결합되어 바닥에 부착되어 있는 선형의 세포로 구성되어 있다.

(1) 대형 다핵 세포의 파골세포 특성 분석

상기 대형 다핵 세포가 파골세포의 특성을 나타내지를 알아보기 위해, 부유하는 세포들(suspending cells) 및 둥근 형태의 세포들(round cells)을 제거한 후에 TRAP 염색(A) 및 hochest 염색(B)을 실시하였다. TRAP(tartrate-resistant acid phosphate) 염색은 Sigma의 TRAP 염색 kit의 프로토콜에 따라 수행하였다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 대형의 다핵 세포들(B, 삼각형)은 TRAP 양성 세포들(A, 화살표)이고, 단핵 선형 세포(B, 삼각형)는 TRAP 염색에 음성반응(A, 화살표)이었다. 이로써, 대형의 다핵 세포는 파골세포(osteoclast)의 성질을 가지고 있음을 나타내는 TRAP 염색에 양성이었다(도 5).

(2) 선형태 세포가 줄기 세포의 증식능에 미치는 영향

상기 대형 다핵세포인 파골세포는 최소한 다분화능 줄기세포와 부착하고 있으므로 줄기세포 증식능을 증가시키는 이 구조에서 필요하다는 것이 분명하다. 그래서, 다분화능 줄기세포의 증식에 선형태 세포 또한 영향을 미치는 지를 알아보기 위해, 트립신 처리후에, 선형태의 세포들을 제거하고, 파골세포(osteoclast)만 플라스크내에 여전히 남아있도록 하였다. 도 6에서 나타난 바와 같이, (A)는 세포 콜로니가 일반적으로 선형태 또는 내피 세포 유사 세포들에 의해 둘러싸인 대형 다핵 세포에 위치해 있는 것을 나타낸 것이고, 트립신 처리(B)후, 다핵 세포는 여전히 콜로니로부터 단일 세포를 지지해주고 있다(C, 화살표 참조). 그러나, 10일 정도 후에는 세포 콜로니가 더 이상 성장하지 않았다. 적은 수의 둥근형태의 세포들은 파골세포(osteoclast)에 여전히 붙어있었으나(도 6B), 10일 이내에는, 둥근형태의 세포들은 계속적으로 작은 콜로니를 형성하기 위해 증식한 다음, 멈춘 것이다. 이 결과, 선형태 세포들 또한, 다분화능 줄기세포가 오랜 기간 증식능을 유지하도록 하는데 영향을 준다는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 본 발명에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 골형성 세포로의 분화

골형성 세포로 분화를 위해, 부유한 세포들을 1주일에 두번씩 배지를 갈면서 3주동안 0.2mM 아스코르브산(Sigma-Aldrich) 및 0.1M 덱사메타손(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 함유한 DMEM배지인 골형성 배지에 처리하였다. 골형성(osteogenesis)은 1주 간격으로 측정하였다. 골형성세포로 분화되었는 지 여부를 알아보기 위해, 칼슘 축적에 따른 Von Kossa법을 실시한 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이, 칼슘이 축적된 둥근형태의 골형성 세포는 어두운 갈색을 나타내었다.

실시예 5: 본 발명에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 지방 세포로의 분화

지방 세포로 분화를 유도하기 위해, 10% FBS, 1μM 하이드로코르티손(Sigma-Aldrich), 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine; Sigma-Aldrich)을 함유한 IMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Media; Gibco)으로 구성된 지방세포 형성 배지에 3주동안 처리하였다. 배지는 일주일에 두번씩 갈아주고, 지방세포 형성(adipogenesis)은 1주 간격으로 측정하였다. 지방세포로 분화되었는지 알아보기 위해, oil-red O staining을 실시하였다. 세포들을 4% 포름알데하이드로 고정하고, 10분동안 oil-red O(Sigma-Aldrich)로 고정한 다음, 1분동안 Mayer hematoxylin(Sigma)으로 counterstain하였다. 지방 줄기세포로의 분화를 거치는 세포들은 oil red O에 의해 염색되었을 때 붉은 색을 나타내는데, 도 7B에서 나타난 바와 같이, 붉은 색으로 염색되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 본 발명에 따른 제대혈 유래 다분화능 줄기세포의 신경 세포로의 분화

신경 세포로 분화하기 위해, 다음과 같은 다단계 프로토콜을 이용하였다. 5000cells/cm²의 밀도로 시딩된 부유한 세포들을 3일동안 1mM 멀캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 0.5μM retinoic(Sigma-Aldrich), 5ng/ml bFGF를 보충한 IMDM 배지에 처리한 다음, 100μM AsA, 1mM cAMP(cyclic adenosine monophosphate;Sigma-Aldrich)를 함유한 IMDM 배지에 3일동안 처리하였다. 그 다음으로, 10μM 하이드로코르티손 및 1mM cAMP를 함유한 IMDM 배지에 3일동안 처리하였다. 마지막으로, 20nM PMA (phorbol myristate acetate;Sigme-Aldrich), 10μM forskolin(Sigma-Aldrich), 0.1mM IBMX, 100μM AsA, 25ng/ml vitronectin(Sigma-Aldrich), 10ng/ml NGF(nerve growth factor), 10ng/ml SHH(sonic hedgehog;R&D system), 20ng/ml aFGF(acid fibroblst growth factor; R&D system)을 함유한 IMDM 배지에 3일동안 배양하였다. 신경세포 형성(nerogenesis)은 6일째 및 10일째에 측정하였고, 칼슘 이미징(calcium imaging)은 12일째 수행하였다.

신경 전구 세포에는 제대혈 유래 다분화능 세포의 분화를 측정하는데 GFAP 염색이 사용되었다. 도 7C에서 보는 바와 같이, 분화된 신경 전구 세포는 항체가 결합된 FITC(fluorescein isothiocyanate)로 염색한 후 녹색을 나타내었다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 성체 줄기세포는 인간 제대혈 유래로, 8~15% CO₂의 조건으로 배양하면, 파골세포 기반 적소 유사 구조와 결합하여 기존의 성체 줄기세포에 비해 미분화 단계에서 오랜 기간동안 왕성한 세포 성장을 하며, 불치병 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 신경세포, 골형성세포 및 지방세포 등 여러 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 신경계 질환, 골격계 질환 등의 치료에 효과적이다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (4)

1. 인간 제대혈 유래 혈액에서 분리한 단핵 세포를 FBS 함유 배지에서 8∼15% CO₂의 조건으로 배양하여 수득되는 것을 특징으로 하고, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법:

   (a) CD29, CD44, CD31 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD4, CD20, CD34, 및 CD51에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;

   (b) Oct4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;

   (c) 플라스틱 바닥에 부착된 선형태(spindle-shape)의 세포에 둘러싸여진 파골세포(osteoclast) 위에 둥근 형태의 줄기 세포가 접촉된 구조를 가짐;

   (d) 내배엽, 외배엽 및 중배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐; 및

   (e) 미분화 상태로 12주 내지 13주까지 줄기세포 증식능 유지함.
2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 DMEM이고, 1∼30% FBS 및 bFGF를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 파골세포는 상기 제대혈 유래 조혈모 줄기세포(hematopoietic stem cell)로부터 유래한 선구체(progenitor)로부터 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 삭제

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