KR20200127039A

KR20200127039A - 다능성 간세포에 의한 주산기 뇌장애의 개선 및 치료

Info

Publication number: KR20200127039A
Application number: KR1020207030619A
Authority: KR
Inventors: 요시아키 사토; 토시히코 스즈키; 시노부 시미즈; 마사아키 미즈노; 마사히로 하야카와; 마리 데자와
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도우카이 고쿠리츠 다이가쿠 기코우; 가부시키가이샤 세이메이카가쿠 인스티튜트
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2020-11-09
Also published as: CN109152801A; AU2017267809B2; WO2017199976A1; KR20180130578A; JP6994200B2; EP3459553A4; SG11201810188VA; EP3459553A1; CA3024518A1; CA3024518C; JPWO2017199976A1; AU2017267809A1; US20190290702A1

Abstract

재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는, 학습장애나 운동장애 등의 주산기 뇌장애를 개선 및 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물을 제공한다. 본 발명의 세포제제는, 상기 장애를 가지는 대상에 대하여, Muse 세포를 투여함으로써, 장애뇌조직에 생착시켜, 상기 장애를 개선 및 치료하는 기구에 근거한다.

Description

다능성 간세포에 의한 주산기 뇌장애의 개선 및 치료{Amelioration and Treatment of Perinatal Brain Damage with Pluripotent Stem Cells}

본 발명은, 재생의료에 있어서의 세포제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 다능성 간세포를 함유하는 주산기 뇌장애의 치료에 유효한 세포제제 및 신규 치료방법에 관한 것이다.

주산기 뇌장애는, 태아기와 신생아기에 발생한 어떤 이상에 기인한 뇌성마비, 신경발달지연, 간질, 지각장애 등의 뇌장애를 말하는데, 그 발생원인이나 병태에 대하여 명확하지 않은 점이 많다. 요즘에는, 주산기 의학에 있어서, 태아의 저산소증에 관한 연구가 진행되어, 저산소가 장애인자로서 중요시되어 왔다. 이러한 저산소증이 진행되면, 태아는 다양한 대사반응을 나타내고, 더욱이는 대사부전에 빠져, 뇌를 비롯한 장기장애가 발생하여, 사망에 이르는 케이스도 상정된다. 그래서, 분만시에 있어서의 저산소증을 예방하는 것이, 나아가서는 뇌성마비를 비롯한 주산기 뇌장애의 예방으로 이어진다고 생각되고 있다. 하지만, 분만시의 저산소증을 예방하는 것은 어렵기도 하고, 뇌성마비 중 약 20%가 저산소증을 발병한다고도 한다(비특허문헌 1).

최근, 재생의료분야에 있어서, 간세포를 이용한 세포요법이 다양한 질환에 대하여 연구가 이루어지고, 임상으로의 응용도 이루어지고 있는 가운데, 주산기 뇌장애의 개선이나 치료에 간세포의 적용이 기대되고 있다(비특허문헌 2). 주산기 뇌장애에 관련한 중추신경질환에 있어서, 임상응용으로의 가능성이 기대되고 있는 간세포로서, 배아 간세포(ES 세포), 신경간/전구세포(NSPC), 인공다능성 간세포(iPS 세포), 제대혈 간세포(UCBC)가 알려져 있다. 지금까지, 본 발명자들은, 주산기 저산소성 허혈성 뇌증(HIE) 모델 래트에, 래트태자뇌로부터 배양하고, 증식시킨 NSPC와 콘드로이틴 황산분해효소의 공투여를 뇌실내에 행한 바, 경색면적은, 무처리군 및 신경간세포 단독투여군에 비하여 유의하게 감소하는 것을 발견하였다(비특허문헌 3). 더욱이, 본 발명자들에 의하여, HIE 모델 래트의 복강내에 UCBC를 투여한 바, 저산소성 허혈성 뇌장애를 일시적으로 저하하는 것이 확인되고 있다.

또한, 골수간엽계 세포 획분(MSC)은, 성체로부터 단리되어, 예를 들어 뼈, 연골, 지방세포, 신경세포, 골격근 등으로 분화하는 능력을 가지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4 및 5). 하지만, MSC는 다양한 세포를 포함하는 세포군으로, 그 분화능의 실체가 알려져 있지 않으며, 치료효과에 편차가 크다. 또한, 성체 유래의 다능성 간세포로서 iPS 세포(특허문헌 1)가 보고되어 있는데, iPS 세포의 수립에는, 간엽계 세포인 피부선유아세포 획분에 특정 유전자나 특정 화합물을 체세포에 도입한다라고 하는 매우 복잡한 조작을 필요로 하는 것에 더하여, iPS 세포가 높은 종양형성능력을 가지는 것으로부터, 임상 응용으로의 매우 높은 허들이 존재하고 있다.

본 발명자들 중 한 사람인 데자와씨의 연구에 의하여, 간엽계 세포 획분에 존재하고, 유도조작없이 얻어지는 SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3)을 표면항원으로서 발현하고 있는 다능성 간세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells; Muse 세포)가 간엽계 세포 획분이 가지는 다능성을 담당하고 있어, 조직재생을 목표로 한 질환치료에 응용할 수 있을 가능성이 있는 것을 알 수 있었다. 또한, Muse 세포는, 간엽계 세포 획분을 다양한 스트레스로 자극함으로써 농축할 수 있는 것도 알 수 있었다(특허문헌 2; 비특허문헌 6). 하지만, 주산기 뇌장애의 개선 및/또는 치료에 Muse 세포를 사용하여, 기대되는 치료효과가 얻어지는 것을 명확하게 한 예는 없다.

특허문헌 1: 일본특허공보 제4183742호 특허문헌 2: 국제공개공보 제2011/007900호

비특허문헌 1: 이케다 토모아키, 뇌와 발달, 43권, 206-210페이지, 2011년 비특허문헌 2: 사토 요시아키, 주산기의학, 41권, 1531-1536, 2011년 비특허문헌 3: Sato, Y., et al., Report Sci., Vol. 15, p.613-620(2008) 비특허문헌 4: Dezawa, M., et al., J. Clin. Invest., Vol. 113, p.1701-1710(2004) 비특허문헌 5: Dezawa, M., et al., Science, Vol. 309, p.314-317(2005) 비특허문헌 6: Wakao, S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 108, p.9875-9880(2011)

본 발명은, 재생의료에 있어서, 다능성 간세포(Muse 세포)를 이용한 새로운 의료용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, Muse 세포롤 포함하는 주산기 뇌장애의 치료에 유효한 세포제제 및 의약조성물, 및 신규 의료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 주산기 저산소성 허혈성 뇌증(hypoxic-ischemic encephalopathy; HIE) 모델 래트를 제작하고, 저산소처리로부터 72시간 후에 정맥주사에 의하여 Muse 세포를 투여함으로써, 주산기 뇌장애(예를 들어, 학습장애, 운동장애)가 개선되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은, 이하와 같다.

[1] 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 주산기 뇌장애를 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제.

[2] 외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가, 농축된 세포 획분을 포함하는 상기 [1]에 기재된 세포제제.

[3] 상기 다능성 간세포가 CD105 양성인 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 세포제제.

[4] 상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[5] 상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD 146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD271 음성인 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[6] 상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성 및 Dct 음성인 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[7] 상기 다능성 간세포가, 이하의 성질 모두를 가지는 다능성 간세포인 상기 [1]~[6] 중 어느 하나에 기재된 세포제제:

(i) 텔로머레이즈 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐.

[8] 주산기 뇌장애가 학습장애, 운동장애, 뇌성마비, 행동이상, 신경발달이상, 지각장애, 언어장애, 간질, 연하장애, 및 호흡조절이상으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 상기 [1]~[7] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[9] 상기 다능성 간세포가 뇌조직에 생착하는 능력을 가지는 상기 [1]~[8] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[10] 사람 신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 약 1×10⁵세포/개체 ~ 약 1×10⁸세포/개체로 투여하는 상기 [1]~[9] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

[11] 사람 신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서, 그 대상 1개체당 약 약 3×10⁴세포/kg ~ 약 3×10⁷세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여하는 상기 [1]~[10] 중 어느 하나에 기재된 세포제제.

본 발명은 주산기 뇌장애를 앓고 있는 대상(소아)에 대하여, Muse 세포를 정맥 등으로부터 투여함으로써, 장애뇌조직에 선택적으로 집적시키고, 그 조직 내에서 Muse 세포가 뇌조직을 구성하는 세포로 분화한다고 하는 뇌조직 재생 메커니즘에 의하여, 주산기 뇌장애를 극적으로 축소시킬 수 있다.

도 1은 HIE 모델 래트에 투여된 Muse 세포의 뇌조직으로의 생착을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 운동기능에 대하여 로타로드 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 3은 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 정동행동(다동성 등)에 대하여 오픈필드 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 4는 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 학습장애의 개선에 대하여 셔틀어보이던스 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 5는 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 기억학습이나 시각적 인지기억의 개선에 대하여 신기한 대상 인식 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 6의 (a)는 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 운동기능 개선에 대하여 실린더 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 6의 (b)는 Muse 세포 투여군('Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 운동기능 개선에 대하여 실린더 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 7은 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 운동기능에 대하여 로타로드 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 8은 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 정동행동(다동성 등)에 대하여 오픈필드 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 9는 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 학습장애의 개선에 대하여 셔틀어보이던스 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 10은 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 기억학습이나 시각적 인지기억의 개선에 대하여 신기한 대상 인식 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 11은 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse'), 세포현탁액(생리식염수)만을 첨가한 군('비히클'), 및 샴 오퍼레이션군('샴')의 HIE 모델 래트의 운동기능 개선에 대하여 실린더 시험을 행한 결과를 나타낸다.
도 12는 Muse 세포 투여군('Muse'), 비Muse 세포 투여군('no Muse')의 HIE 모델 래트에 투여한 후 2주 후의 각 조직에서의 생착량을 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 주산기 뇌장애를 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물, 및 신규 치료방법에 관한 것이다. 본 발명을 이하에 상세하게 설명한다.

1. 적용질환과 그 진단

본 발명은, SSEA-3 양성의 다능성 간세포(Muse 세포)를 포함하는 세포제제 또는 의약조성물을 이용하여, 주산기 뇌장애의 개선 및 치료를 목표로 한다. 일반적으로는, '주산기 뇌장애'란, 주산기(사람에서는 임신 22주에서 출생 후 7일 미만의 시기)에 발생한 뇌장애를 말하며, 예를 들어 분만시의 저산소성 허혈성 뇌증, 또는 바이러스 혹은 세균감염 등에 속발하는 전신염증반응 증후군 등에 관련되는 뇌장애를 의미한다. 하지만, 본 발명에서는, 저산소성 허혈성 뇌증에 기인한 뇌성마비가 증상으로서 구현화되는 시기(예를 들어, 사람에서는 만 2~3세)도 적용 범위로 한다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 따르면, 주산기 뇌장애로서, 사람 신생아(생후 28일 이내), 영아(생후 1년 미만), 및 유아(생후 1~6년)에게 발생한 뇌장애를 개선 및 치료의 대상으로 한다.

'저산소 허혈성 뇌증'이란, 동맥혈의 저산소와 혈류저하에 따른 뇌장애를 말하며, 신생아 사망, 뇌성마비, 정신지체의 원인이 된다. 원인은, 태아기의 모체의 마비, 심부전, 일산화탄소중독에 따른 저산소증, 요추마비나 자궁에 의한 하대동맥압박의 저혈압, 옥시톡신(진통유발제) 과량투여에 따른 자궁이완부전, 제대혈류장애, 태반기능부전, 태반조기박리 등에 의한다. 또한, 출생 후의 심한 출혈, 쇼크상태, 뇌장애, 마비, 외상, 선천성심질환, 폐기능부전 등의 저산소증에 의한다. 성숙아(사람에서는, 모태 내에서 10개월을 경과 후, 태외에서 생활할 수 있는 상태로 발육하고나서 출생한 체중 약 3,000g, 신장 약 50cm 정도의 신생아를 가리킴.)에서는, 대뇌피질괴사나 방실상성조혈, 미숙아에서는, 뇌실주위성연화나 뇌실내출혈을 일으킨다. 중증예에서는, 뇌부종을 수반한다. 피부의 창백, 치아노제, 무호흡, 서맥, 근긴장 저하, 자극에 대한 무반응은 본 질병의 징후이다. 생후 24시간 이내에 뇌부종이 발생하고, 뇌간부압박을 초래하는 경우도 있다. 예후는 나쁘며, 사망, 뇌성마비, 정신발달지체, 중증심신장애를 남긴다.

'뇌성마비'란, 뇌의 발육기(사람에서는, 임신 13일부터 생후 48일을 가리킴.)에 발생한 불가소성의 뇌장애를 말하며, 비진행성 병변을 가지고, 그 징후는 운동계의 기능장애를 기본으로 하여, 대부분이 3세까지 발병한다. 구체적으로는, 신생아기까지 발생하는 뇌장애를 일반적으로 가리킨다. 그 원인에 대하여는, 장애가 발생하는 시기에 따라 나누어져 있으며, (a) 출생전 원인으로는, 태내감염, 태반기능부전, 태아기의 뇌혈관장애, 유전성 등, (b) 출생기 원인으로는, 분만시의 기계적 손상, 뇌출혈, 무산소증, 저산소증, 뇌순환장애 등, (c) 출생후 원인으로는, 중증황달(핵황달), 두개내감염증, 뇌출혈 등이 있다. 분류는 마비의 내용에 따라 이루어진다. 근긴장의 내용에는, 강(경)직, 강강(强剛), 실조, 아테토제(어느 자세를 유지하거나, 운동을 하려고 할 때에 나타나는 불수의운동), 무긴장 등이 있으며, 마비의 확산에는, 사지마비, 편마비, 양마비, 대마비, 이중편마비, 단마비 등이 있다. 합병증후에는, 지능장애(학습장애를 포함), 간질발작, 뇌신경장애, 언어장애 등이 있다. 성숙아의 저산소성 허혈성 뇌증에 따른 뇌의 병변으로는, 대뇌피질층상괴사, 기저핵괴사, 뇌경색, 백질연화, 교구상회괴사가 많고, 뇌간의 괴사도 보인다고 하며, 임상적으로는, 기저핵괴사는 아테토제형 뇌성마비의 원인, 뇌경색은 경성사지마비, 편마비의 원인이 된다. 뇌간괴사는, 예후 불량으로 영아기에 사망하는 경우가 많고, 생존하여도 연하장애나 호흡조절이상을 초래한다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 의한 개선 및 치료의 적용질환의 진단은, 신생아의 저산소성 허혈성 뇌증에 저체온요법이 유효하다고 여겨지므로, 우선 저체온요법 엔트리 기준 플로챠트에 준거하여 의사에 의하여 행하여진다. 보다 구체적으로는, 출생시의 신경학적 증상이, 기준 A(전신저산소·허혈의 객관적 소견), 이어서 기준 B(뇌증의 주관적 소견)에 기재된 각 판단항목에 해당하는지 여부로 진단된다. 기준 A 및 기준 B에 해당되는 경우에, 주산기 뇌장애가 있다고 진단할 수 있다.

기준 A: 재태 36주 이상으로 출생하고, 적어도 이하 중 하나를 만족하는 것

- 생후 10분의 아프가 점수가 5점 이하

- 10분 이상의 지속적인 신생아 소생(기관삽관, 양압환기 등)이 필요

- 생후 60분 이내의 혈액가스(제대혈, 동맥, 정맥, 말초모세관)로 pH가 7.0 미만

- 생후 60분 이내의 혈액가스(제대혈, 동맥, 정맥, 말초모세관)로 Base deficit가 16mmol/L 이상

적응기준 A를 만족한 것은, B의 신경학적 진찰의 이상 유무에 대하여 평가한다.

기준 B: 중등증에서 중증의 뇌증(Sarnat 분류 2도 이상에 상당), 즉 의식장애(졸림, 감각둔화, 혼수) 및 적어도 이하 중 하나를 인정하는 것(신생아 저산소성 허혈성 뇌증에 상세한 신생아과의 혹은 소아신경과의가 진찰하는 것이 바람직함)

- 근긴장 저하

- "인형의 눈" 반사 혹은 동공반사 이상을 포함하는 이상반사

- 흡철의 저하 혹은 소실

- 임상적 경련

더욱이, 필요에 따라서, 뇌의 생리학적 소견을 얻기 위하여, 예를 들어 두부초음파 화상진단, MRI, CT, 뇌파, 및 레이저 도플러 혈류계를 이용할 수 있다. 이들 장치를 이용하여 이상한 소견이 얻어진 경우, 주산기 뇌장애가 있다고 진단할 수 있다. 또한, 대상에 있어서의 학습장애나 운동장애를 직접 관찰함으로써 적용 질환인지 아닌지를 진단할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 적용질환을 치료하기 위하여, 후술하는 세포제제 및 의약조성물을 대상에 투여(이하, 대체로 '이식'이라고 기술하는 경우가 있음.)하고, 적용질환의 개선 및/또는 치료를 가능하게 한다. 여기에서, '개선'이란, 주산기 뇌장애에 수반하는 각종 증상의 완화 및 진행의 억제를 의미하고, 바람직하게는, 일상생활에 지장이 없을 정도까지 증상을 완화하는 것을 의미한다. 또한, '치료'란, 주산기 뇌장애에 수반하는 각종 증상을 억제하는 것 또는 완전히 소실시키는 것을 말한다.

2. 세포제제 및 의약조성물

(1) 다능성 간세포

본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 다능성 간세포는, 전형적으로는, 본 발명자들의 한사람인 데자와씨가, 사람 생체 내에 그 존재를 발견하고, 'Muse(Multilineage-differentiating Stress Enduring) 세포'라고 명명한 세포이다. Muse 세포는, 골수액, 지방조직(Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Nov 20, 2013(Epud)(published on Jan 17, 2014))이나 진피결합조직 등의 피부조직으로부터 얻을 수 있고, 각 장기의 결합조직에도 산재한다. 또한, 이러한 세포는, 다능성 간세포와 간엽계 간세포의 양쪽 성질을 가지는 세포이며, 예를 들어 각각의 세포표면마커인 'SSEA-3(Stage-specific embryonic antigen-3)'과 'CD105'의 더블 양성으로서 동정된다. 따라서, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 이들의 항원마커를 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있다. 또한, Muse 세포는 스트레스 내성이고, 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 다양한 스트레스 자극에 의하여 농축할 수 있다. 본 발명의 세포제제에는, 스트레스 자극에 의하여 Muse 세포가 농축된 세포 획분을 이용할 수도 있다. Muse 세포의 분리법, 동정법, 및 특징 등의 상세는, 국제공개공보 WO2011/007900호에 개시되어 있다. 또한, Wakao 등(2011, 상술)에 의하여 보고되어 있는 바와 같이, 골수, 피부 등으로부터 간엽계 세포를 배양하고, 그것을 Muse 세포의 모집단으로서 이용하는 경우, SSEA-3 양성 세포의 전체가 CD105 양성 세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서의 세포제제 및 의약조성물에 있어서, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 간세포로부터 Muse 세포를 분리하는 경우에는, 단순히 SSEA-3을 항원마커로서 Muse 세포를 정제하여, 사용할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서는, 주산기 뇌장애를 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제 및 의약조성물에 있어서 사용될 수 있는 SSEA-3을 항원마커로 하여, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직으로부터 분리된 다능성 간세포(Muse 세포) 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 단순히 'SSEA-3 양성 세포'라고 기재하는 경우가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서는, '비Muse 세포'란, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 조직에 포함되는 세포로서, 'SSEA-3 양성 세포' 이외의 세포를 가리킨다. 후술하는 실시예에 있어서는, 사람 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개공보 WO2011/007900호에 기재된 방법에 준하여, MSC로부터 SSEA-3 및 CD105 양성 세포를 제외한 세포집단을 비Muse 세포로서 이용하였다.

간단하게는, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 세포표면마커인 SSEA-3에 대한 항체를 단독으로 이용하거나, 또는 SSEA-3 및 CD105에 대한 각각의 항체의 양쪽을 이용하여, 생체조직(예를 들어, 간엽계 조직)으로부터 분리할 수 있다. 여기에서, '생체'란, 포유동물의 생체를 말한다. 본 발명에 있어서, 생체에는, 수정란이나 포배기보다 발생 단계가 앞인 배아는 포함되지 않지만, 태아나 포배를 포함하는 포배기 이후의 발생단계의 배아는 포함된다. 포유동물에는, 한정되지 않지만, 사람, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트 등의 설치류, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 말, 당나귀, 염소, 페렛 등을 들 수 있다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 생체의 조직으로부터 직접 마커를 이용하여 분리되는 점에서, 배성간세포(ES 세포)나 iPS 세포와 명확하게 구별된다. 또한, '간엽계 세포'란, 뼈, 활막, 지방, 혈액, 골수, 골격근, 진피, 인대, 힘줄, 치수(齒髓), 제대, 제대혈 등의 조직 및 각종 장기에 존재하는 조직을 말한다. 예를 들어, Muse 세포는, 골수나 피부, 지방조직으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 생체의 간엽계 조직을 채취하고, 이 조직으로부터 Muse 세포를 분리하여 이용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 분리수단을 이용하여, 선유아세포나 골수간엽계 간세포 등의 배양간엽계 세포로부터 Muse 세포를 분리하여도 좋다. 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 있어서는, 사용되는 Muse 세포는, 수혈자에 대하여 자가여도 좋고, 또는 타가여도 좋다.

상기와 같이, Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단은, 예를 들어 SSEA-3 양성, 및 SSEA-3과 CD105의 이중 양성을 지표로 하여 생체조직으로부터 분리할 수 있는데, 사람 성인 피부에는, 다양한 타입의 간세포 및 전구세포를 포함하는 것이 알려져 있다. 하지만, Muse 세포는 이러한 세포와 같지 않다. 이와 같은 간세포 및 전구세포에는, 피부 유래 전구세포(SKP), 신경제간세포(NCSC), 멜라노블라스트(MB), 혈관주위세포(PC), 내피전구세포(EP), 지방 유래 간세포(ADSC)를 들 수 있다. 이들 세포에 고유 마커의 '비발현'을 지표로 하여서, Muse 세포를 분리할 수 있다. 보다 구체적으로는, Muse 세포는, CD34(EP 및 ADSC의 마커), CD117(c-kit)(MB의 마커), CD146(PC 및 ADSC의 마커), CD271(NGFR)(NCSC의 마커), NG2(PC의 마커), vWF 인자(폰 빌레브란트 인자)(EP의 마커), Sox10(NCSC의 마커), Snai1(SKP의 마커), Slug(SKP의 마커), Tyrp1(MB의 마커), 및 Dct(MB의 마커)로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 11개의 마커 중 적어도 1개, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다. 예를 들어, 한정되지 않지만, CD117 및 CD146의 비발현을 지표로 분리할 수 있고, 더욱이 CD117, CD146, NG2, CD34, vWF 및 CD271의 비발현을 지표로 분리할 수 있으며, 더욱이 상기 11개의 마커의 비발현을 지표로 분리할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 이하:

(i) 텔로머레이즈 활성이 낮거나 또는 없음;

(ii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;

(iii) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및

(iv) 셀프리뉴얼능을 가짐

으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 1개의 성질을 가져도 좋다. 본 발명의 일국면에서는, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 상기 성질을 모두 가진다. 여기에서, 상기 (i)에 대하여, '텔로머레이즈 활성이 낮거나 또는 없음'이란, 예를 들어 TRAPEZE XL telomerase detection kit(Millipore사)를 이용하여 텔로머레이즈 활성을 검출한 경우, 낮거나 또는 검출할 수 없는 것을 말한다. 텔로머레이즈 활성이 '낮다'란, 예를 들어 체세포인 사람 선유아세포와 같은 정도의 텔로머레이즈 활성을 가지고 있거나, 또는 Hela 세포에 비하여 1/5 이하, 바람직하게는 1/10 이하의 텔로머레이즈 활성을 가지고 있는 것을 말한다. 상기 (ii)에 대하여, Muse 세포는, in vitro 및 in vivo에 있어서, 삼배엽(내배엽계, 중배엽계, 및 외배엽계)으로 분화하는 능력을 가지며, 예를 들어 in vitro에서 유도배양함으로써, 간세포, 신경세포, 골격근세포, 평활근세포, 골세포, 지방세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, in vivo에서 정소(精巢)로 이식한 경우에도 삼배엽으로 분화하는 능력을 나타내는 경우가 있다. 더욱이, 정맥주사에 의하여 생체에 이식함으로써 손상을 받은 장기(심장, 피부, 척수, 간, 근육 등)에 유주(遊走) 및 생착하여, 조직에 따른 세포로 분화하는 능력을 가진다. 상기 (iii)에 대하여, Muse 세포는, 부유배양으로는 증식속도 약 1.3일로 증식하는데, 부유배양에서는 1세포에서 증식하고, 배양체양세포 덩어리를 만들어 14일간 정도에서 증식이 멈춘다고 하는 성질을 가지지만, 이들 배양체양세포 덩어리를 접착배양으로 가져가면, 다시 세포증식이 개시되어, 세포 덩어리에서 증식한 세포가 확산되어 간다. 더욱이, 정소로 이식한 경우, 적어도 반년 동안은 암화하지 않는다는 성질을 가진다. 또한, 상기 (iv)에 대하여, Muse 세포는, 셀프리뉴얼(자기복제)능을 가진다. 여기에서, '셀프리뉴얼'이란, 1개의 Muse 세포로부터 부유배양으로 배양함으로써 얻어지는 배양체양세포 덩어리에 포함되는 세포로부터 3배엽성의 세포로의 분화를 확인할 수 있는 동시에, 배양체양세포 덩어리의 세포를 다시 1세포로 부유배양으로 가져감으로써, 다음 세대의 배양체양세포 덩어리를 형성시키고, 그로부터 다시 3배엽성의 분화와 부유배양에서의 배양체양세포 덩어리를 확인할 수 있는 것을 말한다. 셀프리뉴얼은 1회 또는 복수 회의 사이클을 반복하면 좋다.

그리고, 본 발명의 세포제제에 사용되는 Muse 세포를 포함하는 세포 획분은, 생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포에 외적 스트레스 자극을 주고, 그 외적 스트레스에 내성의 세포 이외의 세포를 사멸시켜, 살아남은 세포를 회수하는 것을 포함하는 방법에 의하여 얻어지는, 이하의 성질의 적어도 1개, 바람직하게는 모두를 가지는 SSEA-3 양성 및 CD105 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포 획분이어도 좋다.

(i) SSEA-3 양성;

(ii) CD105 양성;

(iii) 텔로머레이즈 활성이 낮거나 또는 없음;

(iv) 삼배엽으로 분화하는 능력을 가짐;

(v) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및

(vi) 셀프리뉴얼능을 가짐.

상기 외적 스트레스는, 프로테아제 처리, 저산소 농도에서의 배양, 저인산 조건 하에서의 배양, 저혈청 농도에서의 배양, 저영양 조건에서의 배양, 열쇼크로의 폭로 하에서의 배양, 저온에서의 배양, 동결처리, 유해물질 존재 하에서의 배양, 활성산소 존재 하에서의 배양, 기계적 자극 하에서의 배양, 진동처리 하에서의 배양, 압력처리 하에서의 배양 또는 물리적 충격의 어느 것 또는 복수의 조합이어도 좋다. 예를 들어, 상기 프로테아제에 의한 처리시간은, 세포에 외적 스트레스를 주기 위하여 합계 0.5~36시간 행하는 것이 바람직하다. 또한, 프로테아제 농도는, 배양용기에 접착한 세포를 벗길 때, 세포 덩어리를 단일 세포로 분해할 때, 또는 조직으로부터 단일 세포를 회수할 때에 이용되는 농도이면 좋다. 프로테아제는, 세린 프로테아제, 아스파라긴산 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 금속 프로테아제, 글루타민산 프로테아제 또는 N말단 트레오닌 프로테아제인 것이 바람직하다. 더욱이, 상기 프로테아제가 트리푸신, 콜라게나아제 또는 디스파아제(dispase)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 세포제제에 사용되는 상기 특징을 가지는 Muse 세포는, 후술하는 바와 같이, 정맥투여 등에 의하여 생체에 투여 후, 장애뇌조직에 생착한다. 그 후, Muse 세포는, 그 조직을 구성하는 세포로 분화하여, 주산기 뇌장애를 개선 및/또는 치료하는 것으로 생각된다.

(2) 세포제제 및 의약조성물의 조제 및 사용

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 한정되지 않지만, 상기 (1)에서 얻어진 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 생리식염수나 적절한 완충액(예를 들어, 인산 완충생리식염수)으로 현탁시킴으로써 얻어진다. 이 경우, 자가 또는 타가의 조직으로부터 분리한 Muse 세포수가 적은 경우에는, 투여 전에 세포를 배양하여, 소정의 세포농도가 얻어질 때까지 증식시켜도 좋다. 한편, 이미 보고되어 있는 바와 같이(국제공개공보 WO2011/007900호 팸플릿), Muse 세포는, 종양화하지 않으므로, 생체조직으로부터 회수한 세포가 미분화인 상태로 포함되어 있어도 암화의 가능성이 낮아 안전하다. 그리고, 회수한 Muse 세포의 배양은, 특별히 한정되지 않지만, 통상의 증식배지(예를 들어, 10% 송아지 혈청을 포함하는 α-최소필수배지(α-MEM))에 있어서 행할 수 있다. 보다 상세하게는, 상기 국제공개공보 WO2011/007900호를 참조하여, Muse 세포의 배양 및 증식에 있어서, 적절히 배지, 첨가물(예를 들어, 항생물질, 혈청) 등을 선택하여, 소정 농도의 Muse 세포를 포함하는 용액을 조제할 수 있다. 사람 대상으로 본 발명의 세포제제 또는 의약조성물을 투여하는 경우에는, 사람의 장골로부터 수 mL 정도의 골수액을 채취하여, 예를 들어 골수액으로부터의 접착 세포로서 골수간엽계 간세포를 배양하여 유효한 치료량의 Muse 세포를 분리할 수 있는 세포량에 도달할 때까지 늘린 후, Muse 세포를 SSEA-3의 항원 마커를 지표로 하여서 분리하고, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다. 또는, 예를 들어 Muse 세포를 SSEA-3의 항원 마커를 지표로서 분리 후, 유효한 치료량에 도달할 때까지 세포를 배양하여 늘린 후, 자가 또는 타가의 Muse 세포를 세포제제로서 조제할 수 있다.

또한, Muse 세포의 세포제제 및 의약조성물로의 사용에 있어서는, 그 세포를 보호하기 위하여 디메틸술폭시드(DMSO)나 혈청알부민 등을 세균의 혼입 및 증식을 방지하기 위하여 항생물질 등을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 더욱이, 제제상 허용되는 기타 성분(예를 들어, 담체, 부형제, 붕괴제, 완충제, 유화제, 현탁제, 무통화제, 안정제, 보존제, 방부제, 생리식염수 등)이나 간엽계 간세포에 포함되는 Muse 세포 이외의 세포 또는 성분을 세포제제 및 의약조성물에 함유시켜도 좋다. 당업자는 이들 인자 및 약제를 적절한 농도로 세포제제 및 의약조성물에 첨가할 수 있다.

상기에서 조제되는 세포제제 및 의약조성물 중에 함유하는 Muse 세포수는, 주산기 뇌장애의 개선 및/또는 치료에 있어서 원하는 효과(예를 들어, 학습장애의 개선, 운동장애의 개선)가 얻어지도록, 대상의 성별, 연령, 체중, 환부의 상태, 사용하는 세포의 상태 등을 고려하여, 적절히 조정할 수 있다. 후술하는 실시예 3에 있어서는, 주산기 저산소성 허혈성 뇌증(HIE) 모델 래트를 이용하여, Muse 세포 이식에 따른 각종 효과를 검토하였는데, 체중 약 15~20g의 그 모델 래트에 대하여는, SSEA-3 양성 세포를 1×10⁴세포/마리(1개체당)로 투여함으로써, 매우 뛰어난 효과가 얻어졌다. 이러한 효과로부터 사람 신생아(생후 28일 이내), 영아(생후 1년 미만), 또는 유아(생후 1~6년)의 1개체당 약 3×10⁴세포/kg ~ 약 3×10⁷세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여함으로써 뛰어난 효과가 얻어지는 것이 기대된다. 예를 들어, 영아의 체중을 약 3,000g으로 한 경우, 투여량으로는 대략 약 1×10⁵세포/개체 ~ 약 1×10⁸세포/개체가 유효하다고 생각된다. 한편으로, 혈관으로의 세포투여에 따른 폐색을 방지하기 위하여, 1회 투여분량으로, 예를 들어 SSEA-3 양성 세포를 1×10⁷세포/개체 이하로 세포제제에 함유시키면 좋다. 여기에서, 개체는 래트, 사람을 포함하는데 이것으로 한정되지 않는다. 그리고, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 원하는 치료 효과가 얻어질 때까지 복수 회(예를 들어 2~10회), 적절히 간격(예를 들어, 1일에 2회, 1일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 1회, 2주일에 1회)을 두고 투여되면 좋다. 따라서, 대상의 상태에도 따르지만, 치료상 유효량으로서는, 예를 들어 1개체당 1×10⁴세포 ~ 1×10⁷세포로 1~10회의 투여량이 바람직하다. 1개체에 있어서의 투여 총량으로는, 한정되지 않지만, 1×10⁵세포 ~ 1×10⁸세포, 1×10⁵세포 ~ 5×10⁷세포, 1×10⁵세포 ~ 1×10⁷세포, 1×10⁵세포 ~ 5×10⁶세포, 1×10⁵세포 ~ 1×10⁶세포, 5×10⁵세포 ~ 1×10⁸세포, 5×10⁵세포 ~ 5×10⁷세포, 5×10⁵세포 ~ 1×10⁷세포, 5×10⁵세포 ~ 5×10⁶세포, 5×10⁵세포 ~ 1×10⁶세포, 1×10⁶세포 ~ 1×10⁸세포, 1×10⁶세포 ~ 5×10⁷세포, 1×10⁶세포 ~ 1×10⁷세포, 1×10⁶세포 ~ 5×10⁶세포 등을 들 수 있다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 학습장애 및 운동장애 등의 주산기 뇌장애를 개선 및 치료 대상으로 하는데, 투여시기로는, 출생시의 신경학적 증상, 두부초음파 화상진단이나 MRI 등에 의하여 주산기 뇌장애로 진단된 후이며, 진단 직후부터 수개월 이내여도 좋다. 한편, 본 발명에 따르면, 그 세포제제 등은, 손상 직후에 투여되는 것이 바람직한데, 손상 후의 늦은 시기, 예를 들어 손상으로부터 1시간 후, 1일 후, 1주일 후, 1개월 후, 3개월 후, 6개월 후여도 본 발명의 세포제제 등의 효과를 기대할 수 있다. 또한, 사용되는 Muse 세포는, 타가 유래의 경우에도 면역 응답을 야기하지 않는 것이 본 발명자들의 실험으로 확인되어 있으므로, 주산기 뇌장애의 개선 및 치료에 있어서 원하는 효과가 얻어질 때까지 적절히 투여되어도 좋다. 한편, 후술하는 실시예 3에 있어서 나타나는 바와 같이, HIE 모델 래트를 이용한 Muse 세포에 의한 주산기 뇌장애의 개선에 있어서, 행동학적 평가를 행하면, 주산기 뇌장애의 개선은, 단기(생후 1개월)의 치료 효과보다 장기(생후 5~6개월)의 치료 효과가 현저한 경향이 있다.

3. 주산기 저산소성 허혈성 뇌증(HIE) 모델 래트의 제작

본 명세서에 있어서는, 본 발명의 세포제제에 따른 주산기 뇌장애(예를 들어, 학습장애, 운동장애)의 개선 및 치료 효과를 검토하기 위하여 HIE 모델 래트를 구축하여 사용할 수 있다. 그 모델로서 사용되는 래트에는, 한정되지 않지만, 일반적으로 Wistar/ST계 래트, Spraugue Dawley(SD)계 래트를 들 수 있다. HIE 모델 래트를 제작하는 방법은 공지이며, 예를 들어 Rice(Ann. Neurol., vol. 9, 131-141(1981), 참조에 의하여 본 명세서에 원용됨)의 방법에 따라서 HIE 모델 래트를 제작할 수 있다. 또한, 상기 방법에 의하여 제작된 모델 래트가, 저산소성 허혈성 뇌장애를 가지는지 여부를 2차원 화상 레이저 혈류계나 MRI에 의하여 경색소 평가를 행할 수 있다.

본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는, 질환부위에 집적하는 성질을 가진다. 따라서, 세포제제 또는 의약조성물의 투여에 있어서, 그들의 투여부위(예를 들어, 복강내, 근내, 질환부위), 투여되는 혈관의 종류(정맥 및 동맥) 등은 한정되지 않는다. 또한, 투여된 Muse 세포가 질화부위에 도달하여, 생착한 것을 확인하는 방법으로는, 예를 들어 미리 형광단백질(예를 들어, 녹색형광단백질(GFP))을 발현하도록 유전자 도입된 Muse 세포를 제작하고, 생체에 투여 후, 형광을 검출할 수 있는 시스템(예를 들어, IVIS(등록상표) Imaging System(Summit Pharmaceuticals International Corporation))에 의하여 관찰하여, Muse 세포의 동태를 확인할 수 있다. 한편, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물에 사용되는 Muse 세포는 사람 유래이므로, 래트와는 이종(異種)의 관계에 있다. 모델 동물에 있어서 이종의 세포 등이 투여되는 실험에서는, 이종세포의 생체 내에서 거절반응을 억제하기 위하여, 이종세포의 투여 전 또는 동시에 면역억제제(시클로스포린 등)가 투여되어도 좋다.

4. HIE 모델 래트에 있어서의 Muse 세포에 의한 개선 및 치료효과

본 발명의 실시형태에서는, 본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, 사람을 포함하는 포유동물에 있어서의 주산기 뇌장애 및 그에 따르는 각종 증상을 개선 및/또는 치료할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기에서 제작한 HIE 모델 래트를 이용하여, 실험적으로 주산기 뇌장애의 래트에 있어서의 Muse 세포에 따른 증상의 개선 등을 검토하여, 그 Muse 세포의 효과를 평가할 수 있다. 구체적인 평가방법으로는, 래트를 이용한 뇌기능을 평가하는 일반적인 실험계를 이용하여 행할 수 있으며, 예를 들어 행동학적 평가로서 로타로드 시험(Rota Rod Test), 오픈필드 시험(Open Field Test), 셔틀어보이던스 시험(Shuttle Avoidance Test), 신기한 대상 인식 시험(Novel Object Recognition Test), 실린더 시험(Cylinder Test), 캣워크 테스트(Cat Walk Test), 모리스 수중미로 시험 등을 들 수 있다.

'로타로드 시험'은, 피험동물이 가지는 운동기능의 협조성과 평균감각을 측정하는 장치를 이용한 시험이다. 구체적으로는, 일정한 가속이 가능한 회전봉을 가지는 장치에 피험동물을 태우고, 느린 회전에서 서서히 가속하여 간다. 그 상태에서 피험동물이 회전봉으로부터 낙하하지 않고, 회전에 맞추어 걸을 수 있는 시간을 조사한다. 반복테스트함으로써, 운동학습기능에 대하여도 검사하는 것이 가능하다.

'오픈필드 시험'은, 신기한 일정 공간(예를 들어, 60(W)×60(D)×40(H)cm의 박스)에 피험동물을 넣고, 피험동물의 탐색행동 등의 정동행동을 관찰하는 것에 근거한다. 관찰자가 피험동물의 행동을 실제로 기록하는 동시에, 비디오카메라로도 촬영하여, 데이터를 추출하고, 활동성/정동성의 지표(예를 들어, 이동거리, 정지시간, 중심에서의 체재율)를 평가할 수 있다.

'셔틀어보이던스 시험'은, 소리나 빛에 대한 피험동물의 조건반응행동을 관찰하는 장치를 이용한 시험으로, 학습장애를 평가할 수 있다. 이것은, 피험동물이 하나의 방에 소리를 내고, 또한 빛을 점등시킨 후에, 바닥에 전류를 흘려, 이 전기자극을 회피하기 위하여 피험동물은 다른 방으로 피난한다. 이러한 반복에 의하여, 피험동물에 있어서의 학습장애의 유무를 평가할 수 있다.

'신기한 대상 인식 시험'은, 피험동물을 2개의 물체를 둔 공간에서 자유 탐색시킨 후, 한쪽을 신기한 물체로 치환하고, 피험동물의 새로운 물체에 대한 탐색시간의 증감을 측정함으로써, 기억학습이나 시각적 인지기억을 평가할 수 있다.

'실린더 시험'은, 피험동물을 실린더 내에 넣고, 탐색적으로 실린더의 벽에 앞발을 걸치는 자발동작의 좌우 차이를 관찰하여, 운동기능장애를 평가할 수 있다.

'캣워크 시험'은, 내부에 LED를 조사한 투명한 글라스판의 위를 피험동물에게 걷게 하고, 내부전반사의 원리로 접촉면만을 비춘 발자국을 밑에서 비디오 촬영한 화상에 의하여, PC의 소프트웨어로 해석하여, 피험동물의 다리의 움직임이나 보행상태의 평가를 행할 수 있다.

이하의 실시예에 의하여, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 의하여 전혀 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1: 주산기 저산소성 허혈성 뇌증(HIE) 모델 래트의 제작과 Muse 세포의 투여

본 연구에 사용된 실험동물에 관한 프로토콜은, 나고야대학 의학부 동물실험 위원회에 의하여 승인된 것이다. Wistar/ST 래트(쥐)를 일본에스엘씨 주식회사(일본, 시즈오카현)로부터 입수하여, 먹이와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 한 케이지에 넣고, 12시간의 명암사이클 하에서 사육하였다. 동물실과 실험공간을 항상 23℃로 유지하였다.

HIE 모델 래트는, Wistar/ST 래트(생후 7일)를 이용하고, Rice(Ann. Neurol., vol. 9, 131-141(1981))에 기재된 수법에 준한 방법으로 제작하였다. 각 래트에 이소플루레인 흡입에 의하여 마취를 실시하였다. 그 후, 좌경동맥을 이중으로 결찰하고, 결찰 사이를 절리하였다. 어미의 곁에서 1시간 휴식 후, 37℃로 60분간, 8% O₂의 저산소 환경 하에 두고, 이어서 23℃로 유지된 동물실의 어미에게 돌려보냈다. 72시간 후, 처리군에 대하여는, Muse 세포(1×10⁴세포/개체)를 우경동맥으로부터 투여하였다. 대조군은, 처리군과 마찬가지로 좌경동맥을 결찰하고, 저산소 상태에 두었는데, Muse 세포 대신에, 같은 체적의 생리식염수만이 투여되었다. 샴군은, 좌경동맥 결찰과 저산소 상태에 놓지 않았다.

실시예 2: Muse 세포의 조제와 뇌조직으로의 생착확인

사람 Muse 세포의 분리 및 동정에 관한 국제공개공보 WO2011/007900호에 기재된 방법에 준하여, Muse 세포를 얻었다. 이식에 사용되는 Muse 세포는, 뇌조직에 생착한 것을 확인하기 위하여, 녹색형광단백질(GFP)을 발현하고, 세포가 이에 따라 표식되도록, 미리 렌티바이러스-GFP 유전자를 Muse 세포에 도입하였다. GFP로 표식된 Muse 세포 또는 Muse 세포를 포함하는 세포집단을 GFP와 SSEA-3의 이중 양성 세포로서 FACS로 분리하였다. 그 후, 실시예 1에 기재한 바와 같이, Muse 세포를 투여하였다.

다음으로, Muse 세포가 투여된 생후 20일된 래트의 뇌에 있어서, Muse 세포가 뇌조직에 생착한 것을 확인하였다. 래트를 안락사시킨 후, 뇌를 절제하여, 통상법에 따라서 뇌조직의 절편을 제작하였다. GFP에 대한 1차 항체를 반응시키고, 이어서 페록시다아제 표식한 2차 항체를 반응시켰다. 페록시다이제에 대한 기질(사염산3,3'-디아미노벤지딘)을 첨가하고, 발색에 의하여 뇌조직에 생착한 Muse 세포를 검출하였다(도 1). 도 1의 염색화상은 각각, 절편으로 한 뇌조직(장애를 입은 좌뇌)의 다른 영역(1과 2)을 관찰한 것이다. 상단의 화살표로 나타난 세포는, 이식된 Muse 세포이다. 하단은, 항체에 의한 반응을 행하지 않은 음성 대조이다. 이들 결과로부터, 래트의 경동맥으로부터 이식된 Muse 세포는, 뇌장애를 입은 뇌조직에 생착한 것이 확인되었다. 또한, 마찬가지로 하여서 Muse 세포 및 비Muse 세포를 투여한 후 2주 후에 래트를 안락사시키고, 각 조직에 있어서의 생착한 Muse 세포를 검출하였다(도 12). 다른 MSC를 투여한 계과 비교하여, Muse 세포가 상해뇌조직에 의하여 현저하게 생착하고 있는 것을 알 수 있다.

실시예 3: Muse 세포 이식에 의한 주산기 뇌장애 개선의 평가

Muse 세포가 이식된 HIE 모델 래트의 행동학적 평가를 이하와 같이 행하였다.

(1) 로타로드 시험

피험동물이 가지는 운동기능의 협조성과 평균감각을 측정하는 장치로서 일반적으로 알려진 장치(UGO Basile사 제품 Rat Rota-Rod 47700)를 이용하여, Muse 세포 등의 이식에 의한 주산기 뇌장애의 개선을 조사하였다. 이러한 시험평가는, 회전하는 테이블 상에서 래트가 낙하할 때까지의 시간을 측정하고, 반복(합계 4회)함으로써, 낙하할 때까지의 시간이 장기화에 의하여 운동학습기능의 개선이 보인 것을 지표로 하는 것이다. 시험한 HIE 래트는, Muse 세포를 투여한 군, 생리식염수만을 투여한 군, 및 샴군의 3개에 대하여인데, 단기(생후 1개월)와 장기(생후 5~6개월)의 각각에 대하여 평가를 행하였다. 결과를 도 2에 나타낸다. 단기 및 장기의 어디에서도, Muse 세포 투여군은 생리식염수만을 투여한 군(비히클)과 비교하여, 운동학습장애기능의 개선이 보였는데(도 2 좌측), 단기보다 장기가 그 개선효과가 현저하였다(도 2 우측). 이러한 결과로부터, Muse 세포가 주산기 뇌장애의 하나로서 운동학습장애기능을 개선할 수 있는 것이 시사되었다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 군, 비히클군, 샴군 이외에, 비Muse 세포를 투여한 군을 더하여, HIE 래트(생후 5개월)에 대하여 로타로드 시험을 행하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. Muse 세포를 투여한 군에서는, 운동학습장애기능의 개선이 보였는데, 새롭게 더한 비Muse 세포를 투여한 군에 있어서는, 비히클과 같은 정도로 운동학습장애기능의 개선은 보이지 않았다. Muse 세포는, 비Muse 세포와 비교하여, 이와 같은 운동학습장애기능의 개선에 뛰어난 효과를 나타내는 것이 시사되었다.

(2) 오픈필드 시험

각종 래트를 신기한 일정 공간을 가지는 박스에 넣고, 피험동물의 정동행동(다동성 등)을 관찰하였다. 피험동물의 행동을 비디오카메라(무로마치기계 주식회사 제품 ANY-maze Video Tracking Software)로 촬영하고, 일정 시간에 있어서의 피험동물의 이동거리, 부동시간, 및 중심부에서의 체재시간을 계측하였다(각각 도 3의 상단, 중간단, 하단). 신기한 공간에 놓인 래트는, 불안에 따라 이동하는 거리가 길어지는데, 그 공간에서의 적용에 의한 이동거리가 작아진다. 각 래트군을 비교하면, 단기에서는 비히클과 Muse군에서는 유의한 차이는 보이지 않았는데, 장기에서는 비히클군과 비교하여, Muse군에서는 활동성의 저하가 인정되고, 샴군에서도 마찬가지의 경향이 보였다. 이것은, Muse 세포의 투여에 의하여, 피험동물의 정동행동을 개선할 수 있는 것을 시사하였다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 군, 비히클군, 샴군 이외에, 비Muse 세포를 투여한 군을 더하여, HIE 래트(생후 5개월)에 대하여 오픈필드 시험을 행하였다. 결과를 표 8에 나타내는데, 새롭게 피험동물의 평균속도에 대하여도 측정하였다. 이러한 평균속도에 대하여는, 신기한 공간에 놓인 래트가 이동하는 속도는, 불안에 따라 높아지고, 한편으로 불안이 없거나 또는 작은 경우에는 속도가 낮아진다. Muse 세포를 투여한 군에서는, 모든 시험계에 있어서도 현저한 개선이 보였는데, 새롭게 더한 비Muse 세포를 투여한 군에 있어서는, 비히클과 같은 정도로 정동행동의 개선은 보이지 않았다. Muse 세포는, 비Muse 세포와 비교하여, 이와 같은 정동행동의 개선에 뛰어난 효과를 나타내는 것이 시사되었다.

(3) 셔틀어보이던스 시험

각종 래트에 있어서의 학습장애 개선을 평가하기 위하여 셔틀어보이던스 시험을 행하였다. 평가에 사용한 장치는, Med Associates Inc. 제품 MED-PC Version IV/MED-APA-DIM이며, 통상법에 따라서, 래트에 의한 전기자극의 회피율을 합계 5회 측정하였다(도 4). 모든 군의 래트도 자극에 대하여 이것을 회피하도록 학습하였는데, 단기 및 장기의 어디에서도 Muse 세포군에서는 비히클군과 비교하여 유의한 차이가 인정되었다. 또한, Muse 세포군의 회피율은, 샴군과 같은 정도였다. 이러한 것으로부터, Muse 세포의 투여에 의하여, 피험동물의 학습장애가 개선되는 것이 시사되었다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 군, 비히클군, 샴군 이외에, 비Muse 세포를 투여한 군을 더하여, HIE 래트(생후 5개월)에 대하여 셔틀어보이던스 시험을 행하였다. 결과를 도 9에 나타낸다. Muse 세포를 투여한 군에서는, 학습장애의 개선이 보였는데, 새롭게 더한 비Muse 세포를 투여한 군에 있어서는, 비히클과 같은 정도로 학습장애의 개선은 보이지 않았다. Muse 세포는, 비Muse 세포와 비교하여, 이와 같은 학습장애의 개선에 뛰어난 효과를 나타내는 것이 시사되었다.

(4) 신기한 대상 인식 시험

신기한 대상 인식 시험에 대하여, 일반적으로 사용되고 있는 장치(무로마치기계 주식회사제품 ANY-maze Video Tracking Software)를 이용하여 행하였다. 각종 래트를 2개의 물체(친숙한 물체)를 놓은 공간에서 일정 시간, 자유롭게 탐색하게 하고, 그 후 한쪽을 신기한 물체로 치환하고, 그 차이의 래트의 새로운 물체에 대한 탐색시간을 측정하였다. 평가의 지표로서 DI(Discrimination Index)(탐색지향성)를 이용하였다. 구체적으로는, DI=(TN-TF)/(TN+TN)(식 중, TF: 친숙한 물체에 대한 탐색시간, TN: 신기한 물체에 대한 탐색시간)에 의하여 산출하였다. DI의 수치가 높을수록 그 물체에 대한 흥미도가 높은 것을 나타낸다. 단기에서는 Muse 세포군은 비히클군과 비교하여 유의한 차이가 있는데, DI가 0 미만도 있어, 신기한 물체에 대한 흥미를 나타내지 않는 경우도 많다. 한편, 장기에서는 Muse 세포군은 비히클군과 비교하여 유의한 차이가 있으며, 샴군과 같은 정도로 신기한 물체에 대한 흥미도가 높았다(도 5). 이러한 결과로부터, Muse 세포의 투여에 의하여, 기억학습이나 시각적 인지기억이 개선될 가능성이 시사되었다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 군, 비히클군, 샴군 이외에, 비Muse 세포를 투여한 군을 더하여, HIE 래트(생후 5개월)에 대하여 셔틀어보이던스 시험을 행하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. Muse 세포를 투여한 군에서는, 신기한 물체에 대한 흥미도가 높은 것이 나타났는데, 새롭게 더한 비Muse 세포를 투여한 군에 있어서는, Muse 세포를 투여한 군만큼 현저한 효과는 보이지 않았다. Muse 세포는, 비Muse 세포와 비교하여, 이와 같은 신기한 물체에 대한 흥미도를 높이는 효과를 나타내는 것이 시사되었다.

(5) 실린더 시험

각종 래트를 실린더 내(직경 20cm)에 넣고, 건강한 쪽(좌측 앞다리)과 아픈 쪽(우측 앞다리)에 대하여 탐색적으로 앞다리를 벽에 걸치는 동작의 좌우 차이를 확인함으로써 행하였다. 평가의 지표로서 '비손상 앞다리 기호성(non-impaired paw preference)'을 이용하였다. 구체적으로는, 비손상 앞다리 기호성(%)=(R-L)/(R+L+B)×100(식 중, R: 우측 앞다리의 사용횟수, L: 좌측 앞다리의 사용횟수, B: 양쪽 양다리의 사용횟수)에 의하여 산출하였다. 그 값이 높을수록 직립시에 우측 앞다리(아픈 쪽)를 사용하는 빈도가 높은 것을 나타낸다. 장기에 대한 결과를 도 6의 (a)에 나타낸다. 이 결과는, Muse 세포군은, 비히클군과 비교하여 유의한 차이가 있으며, 우측 앞다리(아픈 쪽)를 사용하는 빈도가 매우 높은 것을 나타낸다. 이에 따라, Muse 세포의 투여에 의하여, 운동기능 개선이 사시되었다.

도 6의 (a)를 논문 등에서 사용되는 보다 일반적인 표시로 하면 도 6의 (b)가 된다. 구체적으로는, 비손상 앞다리 기호성(%)=(L-R)/(R+L+B)×100(식 중, R: 우측 앞다리의 사용횟수, L: 좌측 앞다리의 사용횟수, B: 양쪽 양다리의 사용횟수)에 의하여 산출하였다. 그 값이 높을수록 직립시에 좌측 앞다리(건강한 쪽)를 사용하는 빈도가 높은 것을 나타낸다.

상기와 마찬가지로, 새롭게 Muse 세포를 투여한 군, 비히클군, 샴군 이외에, 비Muse 세포를 투여한 군을 더하여, HIE 래트(생후 5개월)에 대하여 실린더 시험을 행하였다. 이러한 시험에서는, 래트에 있어서, 건강한 쪽이 우측 앞다리로 하고, 아픈 쪽이 좌측 앞다리로 하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. Muse 세포를 투여한 군에서는, 운동기능 개선이 보였는데, 새롭게 더한 비Muse 세포를 투여한 군에 있어서는, 비히클과 같은 정도로 운동기능 개선은 보이지 않았다. Muse 세포는, 비Muse 세포와 비교하여, 이와 같은 운동기능 개선에 뛰어난 효과를 나타내는 것이 시사되었다.

[산업상의 이용가능성]

본 발명의 세포제제 및 의약조성물은, HIE 모델 래트에 투여함으로써, 학습장애나 운동장애 등의 주산기 뇌장애의 개선 및 치료에 응용할 수 있다.

본 명세서에 인용하는 모든 간행물 및 특허문헌은, 참조에 의하여 전체적으로 본 명세서 중에 원용된다. 한편, 예시를 목적으로 하여, 본 발명의 특정 실시형태를 본 명세서에 있어서 설명하였는데, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않고, 다양한 개변이 이루어지는 경우가 있는 것은, 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.

Claims

생체의 간엽계 조직 또는 배양간엽계 세포로부터 분리된 SSEA-3 양성의 다능성 간세포를 포함하는 주산기 저산소성 허혈성 뇌장애를 개선 및/또는 치료하기 위한 세포제제로, 여기서, 상기 다능성 간세포는, 이하의 성질 모두를 가지는 것인 세포제제:
(i) CD105 양성임;
(ii) 텔로머레이즈 활성이 낮거나 또는 없음;
(iii) 삼배엽 중 어느 배엽의 세포로 분화하는 능력을 가짐;
(iv) 종양성 증식을 나타내지 않음; 및
(v) 셀프리뉴얼능을 가짐.
제 1 항에 있어서,
외부 스트레스 자극에 의하여 SSEA-3 양성의 다능성 간세포가 농축된 세포 획분을 포함하는 세포제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성 및 CD146 음성인 세포제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD117 음성, CD146 음성, NG2 음성, CD34 음성, vWF 음성, 및 CD217 음성인 세포제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 CD34 음성, CD117 음성, CD146 음성, CD271 음성, NG2 음성, vWF 음성, Sox10 음성, Snai1 음성, Slug 음성, Tyrp1 음성, 및 Dct 음성인 세포제제.
제 1 항에 있어서,
주산기 저산소성 허혈성 뇌장애가 학습장애, 운동장애, 뇌성마비, 행동이상, 정신발달이상, 지각장애, 언어장애, 간질, 연하장애, 및 호흡조절이상으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 세포제제.
제 1 항에 있어서,
상기 다능성 간세포가 뇌조직에 생착하는 능력을 가지는 세포제제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
사람 신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서 1×10⁵세포/개체 ~ 1×10⁸세포/개체로 투여하는 세포제제.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
사람 신생아, 영아 또는 유아 대상으로 상기 다능성 간세포를 치료상 유효량으로서, 그 대상 1개체당 3×10⁴세포/kg ~ 3×10⁷세포/kg을 체중 환산한 세포량을 투여하는 세포제제.